ES2274277T3 - Derivados adehido de politilenglicol. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I): (Ver fórmula) en donde R1 se elige del grupo consistente en halógeno, epóxido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, tosilato, iso cianato, hidrazina hidrato, haluro cianúrico, N-succinimidiloxilo, sulfo-N-succinimidiloxilo, 1-benzo-triazoliloxilo, 1-imidazoliloxilo, p-nitrofeniloxilo, y (Ver fórmula) X es O o NH, Y se selecciona del grupo consistente en (Ver fórmula) Z es una cadena lateral de un aminoácido, m es de 1 a 17, n es de 10 a 10, 000, y p es de 1 a 3.
Description
Derivados aldehído de polietilenglicol.
La presente invención se refiere a aldehídos de
polietilenglicol, y a métodos relacionados de elaboración y uso de
tales derivados, como en la pegilación de polipéptidos y otras
biomoléculas.
Polietilenglicol ("PEG") es un poliéter
neutro lineal o ramificado, disponible en varios pesos moleculares.
La estructura de PEG es
HO-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-H,
donde n indica el número de repeticiones de unidades de óxido de
etileno en el PEG.
PEG y derivados de PEG se han empleado para
modificar una variedad de biomoléculas. Cuando está unido a tales
moléculas, el PEG aumenta su solubilidad y aumenta su tamaño, pero
posee un pequeño efecto sobre las propiedades deseables.
Ventajosamente, las biomoléculas conjugadas con PEG pueden presentar
una retención aumentada y un retraso en el metabolismo corporal.
Una variedad de derivados de PEG ha sido
desarrollada para tales solicitudes. Tales derivados de PEG están
descritos, por ejemplo, en Patente Estadounidense 5,252,714; Patente
Estadounidense 5,672,662; Patente Estadounidense 5,959,265; Patente
Estadounidense 5,990,237; y Patente Estadounidense 6,340,742.
Se han utilizado dos aproximaciones generales
para la funcionalización de PEG: (1) cambiando el grupo terminal
hidroxilo, a través de unas serie de reacciones, a un grupo
funcional más activo y/o (2) reacción del PEG bajo condiciones
controladas con compuestos bifuncionales en que uno de sus grupos
funcionales reacciona con el polímero PEG y el otro permanece
activo. En la mayoría de casos, deben realizarse muchos pasos para
alcanzar los derivados PEG deseados. Los derivados PEG deseados se
producen a menudo en pequeñas cantidades y requieren un complicado
proceso de purificación para aislarlos. Además, los derivados PEG
pueden mostrar unión inespecífica a las biomoléculas de interés, que
puede resultar en múltiples PEGs unidos a una biomolécula sencilla
y/o la unión de PEG al sitio activo. Múltiples uniones de PEG pueden
provocar dificultades en la purificación de la biomolécula pegilada.
Múltiples uniones de PEG, y/o pegilación en el sitio activo, puede
también encaminar a un descenso en la actividad de la
biomolécula.
Será, por tanto, ventajoso proporcionar
derivados de PEG mejorados, adecuados para la conjugación con
variedad de otras moléculas, incluyendo polipéptidos y otras
biomoléculas que contienen un grupo \alpha-amino.
Sigue siendo una necesidad proporcionar derivados de PEG que puedan
producirse en grandes cantidades y pureza, y que puedan conjugarse
para proporcionar biomoléculas con mejoradas características de
realización
Estos y otros objetos de la presente invención
están descritos en mayor detalle a continuación.
Los compuestos de la invención son derivados
aldehído de polietilenglicol, que tienen la fórmula general (I):
(I)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CHO
en donde R_{1} se elige entre
halógeno, epóxido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, tosilato,
isocianato, hidrazina hidrato, haluro cianúrico,
N-succinimidiloxilo,
sulfo-N-succini-midiloxilo,
1-benzotriazoliloxilo,
1-imidazoli-loxilo,
p-nitrofeniloxilo,
y
X es O o NH, Y se selecciona del grupo
consistente en
Z es una cadena lateral de un aminoácido, m es
de 1 a 17, n es de 10 a 10,000, y p es de 1 a 3.
La presente invención también proporciona un
compuesto de fórmula (II):
en donde R_{1}, m, n, y p son
como se ha definido
antes.
Otra realización preferida de la presente
invención proporciona un compuesto aldehído de polietilenglicol
bifuncional de fórmula (VIII):
\vskip1.000000\baselineskip
en donde m, n, y p son como se ha
definido
antes.
La presente invención también proporciona
compuestos intermediarios de fórmula (IX):
(IX)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}-CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}
en donde R_{1}, X, Y, Z, m, n, y
p son como se ha definido
antes.
La presente invención además proporciona
compuestos intermediarios de fórmula (X):
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R_{1}, m, n, y p son
como se ha definido
antes.
También se proporciona un compuesto
intermediario de fórmula (XI):
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada m, n, y p es el mismo
o diferente y es como se ha definido
antes.
La presente invención además proporciona un
método de elaborar un aldehído de polietilenglicol que comprende
hidrolizar un compuesto de fórmula (IX):
(IX)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}
\newpage
para producir un aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(I):
(I)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CHO
en donde R_{1}, X, Y, Z, m, n, y
p son como se ha definido
antes.
Si la presente invención se refiere a un
"método de elaboración", quiere decir un "proceso de
elaboración".
La presente invención también proporciona un
método de elaboración de un aldehído de polietilenglicol que
comprende hidrolizar un compuesto de fórmula (X):
para producir un aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(II):
en donde R_{1}, m, n, y p son
como se ha definido
antes.
La presente invención proporciona un método de
elaboración de un aldehído de polietilenglicol que comprende la
hidrólisis de un compuesto de fórmula (XVII):
para producir un aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(VIII):
en donde m, n, y p son como se ha
definido
antes.
La presente invención proporciona una variedad
de compuestos e intermediarios químicos y métodos que pueden
utilizarse en relación con la pegilación de polipéptidos y otras
biomoléculas. La presente invención proporciona una nueva estructura
química para aldehídos de polietilenglicol. Los compuestos de la
invención son derivados de aldehído de polietilenglicol, con la
fórmula general (I):
(I)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CHO
\newpage
en donde R_{1} es como se ha
definido antes, X es O o NH, Y se selecciona del grupo consistente
en
Z es una cadena lateral de un aminoácido, m es
de 1 a 17, n es de 10 a 10,000, y p es de 1 a 3.
R_{1} es un grupo funcional capaz de
reaccionar con algún otro grupo funcional, tal como una amina y/o
sulfhidrilo en un péptido y/o proteína.
R_{1} puede es un grupo funcional que es capaz
de reaccionar fácilmente con grupos electrofílicos o nucleofílicos
sobre otras moléculas, al contrario que aquellos grupos que
requieren fuertes catalizadores o condiciones de reacción altamente
impracticables para poder reaccionar. El aldehído de
polietilenglicol es bifuncional y puede por tanto unirse
covalentemente con dos fracciones químicas.
El término "halógeno" indica flúor, cloro,
bromo, o yodo.
Un grupo de cabeza R_{1} generalmente reactivo
preferido es
En los compuestos de la presente invención X es
O o NH. Preferiblemente, X es O. Además, Y se selecciona del grupo
consistente en
en donde Z es una cadena lateral de
un
aminoácido.
En la presente invención, m es de 1 a 17. En una
realización preferida, m es de 1 a 14. Más preferiblemente m es de 1
a 7, y aún más preferiblemente, m es de 1 a 4. Más preferido, m es
1.
En el caso de un grupo Y con la estructura
general:
El grupo Y presenta una unión al aminoácido a
través de un enlace peptídico. Concordantemente, esta estructura
general resulta en estructuras específicas tan simples como:
cuando una glicina sencilla se
utiliza como aminoácido. Cuando Z es CH_{3}, entonces el
aminoácido es alanina. Si Z es CH_{2}OH, el aminoácido es
serina.
Obviamente, son posibles estructuras más
complejas cuando se utilizan más aminoácidos y más diferentes, tal
como se puede apreciar de un vistazo a las diferentes estructuras de
aminoácidos mostradas más abajo. Preferiblemente, solo se utiliza un
aminoácido.
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\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención, n es de 10 a 10,000.
En una realización preferida de la presente invención n es de 20 a
5,000. Preferiblemente, n es de 50 a 2,500, aún más preferiblemente
n es de 75 a 1,000. Lo más preferible, que n sea de 100 a 750.
En la presente invención, p es de 1 a 3.
Preferiblemente, p es 3.
La presente invención incluye, pero no se limita
a, compuestos de fórmula I que son compuestos de fórmulas
II-VI como sigue:
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\newpage
Los compuestos preferidos de la presente
invención entran dentro del Grupo A anterior. Concordantemente, la
presente invención proporciona un compuesto de fórmula (II):
en donde R_{1}, m, n, y p son
como se ha definido
antes.
Otra realización preferida de la presente
invención proporciona un compuesto aldehído de polietilenglicol
bifuncional de fórmula (VIII):
en donde m, n, y p son como se ha
definido
antes.
La presente invención también proporciona una
variedad de intermediarios químicos que pueden convertirse en los
compuestos aldehído de polietilenglicol de la invención descritos
anteriormente. Estos intermediarios incluyen compuestos de fórmula
(IX):
(IX)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}-CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}
en donde R_{1}, X, Y, Z, m, n, y
p son como se ha definido
antes.
La presente invención además proporciona
compuestos intermediarios de fórmula (X):
en donde R_{1}, m, n, y p son
como se ha definido
antes.
También se proporcionan compuestos
intermediarios de fórmula (XI):
en donde cada m, n, y p es el mismo
o diferente y es definido como
antes.
Los compuestos de la presente invención pueden
producirse mediante cualquier método adecuado, utilizando reactivos
y métodos conocidos. No obstante, la presente invención proporciona
un método específico de elaboración de un aldehído de
polietilenglicol que comprende la hidrolización de un compuesto de
fórmula (IX):
(IX)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}
para producir un aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(I):
(I)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CHO
en donde R_{1}, X, Y, Z, m, n, y
p son como se ha definido antes. Preferiblemente, la hidrólisis está
catalizada por ácidos. Ácidos catalíticos adecuados incluyen: ácido
trifluoroacético, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido
sulfúrico, y ácido nítrico. Preferiblemente, el ácido es ácido
trifluoroacético.
Los compuestos aldehído de polietilenglicol de
fórmula (II) pueden también producirse mediante cualquier método
adecuado. A modo de ejemplo, no obstante, los aldehídos de
polietilenglicol de fórmula (II) pueden producirse como sigue:
primero, el polietilenglicol se seca. Segundo, el polietilenglicol
reacciona con un derivado halogenado de ácido acético. Hidrolizando
la mezcla de reacción resultante resulta en un PEG ácido
carboxílico. Alternativamente, el producto PEG ácido carboxílico
puede también derivarse de la oxidación directa del PEG, tras el
paso de secado. A continuación, el PEG ácido carboxílico es tratado
entonces con un derivado de amina de dietil acetal para producir un
PEG amino acetal, que reacciona con un ácido carboxílico halogenado
para producir un aldehído de polietilenglicol de la fórmula. El
producto aldehído de polietilenglicol se recoge entonces y se
purifica.
El producto aldehído de polietilenglicol puede
recogerse y purificarse de cualquier forma adecuada. A modo de
ejemplo, el producto aldehído de polietilenglicol puede extraerse
con diclorometano. La fase orgánica se seca sobre sulfato sódico, se
filtra, se concentra, y se precipita con dietil éter. El producto,
aldehído de PEG, se recoge por filtración y se seca al vacío.
La presente invención proporciona así un método
de elaboración de un aldehído de polietilenglicol comprendiendo la
hidrólisis de un compuesto de fórmula (X):
para producir un aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(II):
en donde R_{1}, m, n, y p son
como se ha definido
antes.
El compuesto de fórmula (X) puede producirse
mediante la reacción de un compuesto de fórmula (XII):
(XII)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-COOH
con un compuesto de fórmula
(XIII):
(XIII)H_{2}N-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}.
Otro método para elaborar ácido PEG o ácido
carboxílico PEG es por oxidación directa. En este caso, oxidantes
como CrO_{3} o K_{2}Cr_{2}O_{7}/H_{2}SO_{4}, HNO_{3}
en presencia de vanadato de amonio o reactivo de Jone (CrO_{3} y
H_{2}SO_{4}), pueden utilizarse.
El compuesto de fórmula (XII) puede producirse
mediante hidrolización de un compuesto de fórmula (XIV):
(XIV)R_{1}-O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-COOR_{3}
en donde R_{3} es
C_{1}-C_{4} alquilo ramificado o sin
ramificar.
El compuesto de fórmula (XIV) puede producirse
mediante la reacción de un compuesto de fórmula (XV):
(XV)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}-CH_{2}-OH
con un compuesto de fórmula
(XVI):
(XVI)R_{2}-(CH_{2})_{m}-COOR_{3}
en donde R_{2} es halógeno.
Preferiblemente R_{2} es bromo o cloro. Compuestos adecuados de
fórmula (XVI) incluye bromoacetato de t-butilo,
bromoacetato de metilo, bromoacetato de etilo, cloroacetato de
t-butilo, cloroacetato de metilo, y cloroacetato de
etilo. Otros reactivos que pueden utilizarse para este paso de
reacción, es decir, sustitutos para la fórmula (XVI) son, por
ejemplo, bromoacetato de t-butilo, bromoacetato de
metilo, bromoacetato de etilo, cloroacetato de
t-butilo, cloroacetato de metilo, o cloroacetato de
etilo en presencia de t-butóxido potásico, un
hidruro de un metal alcalino tal como hidruro sódico o naftaluro
potásico. Preferiblemente, el compuesto de fórmula (XVI) es
bromoacetato de
t-butilo.
Los compuestos de fórmulas (III) - (VI) (también
identificados como Grupos B-E, respectivamente)
pueden igualmente producirse mediante cualquier método adecuado. A
modo de ejemplo, no obstante, los siguientes esquemas de reacción
pueden utilizarse para producir compuestos de fórmulas (III) - (VI)
(Grupos B-E).
Como con los aldehídos de polietilenglicol
discutidos anteriormente, los aldehídos de polietilenglicol
bifuncionales puede producirse mediante cualquier método adecuado.
La presente invención proporciona un método de elaboración de un
aldehído de polietilenglicol que comprende la hidrólisis de un
compuesto de fórmula (XVII):
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para producir un aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(VIII):
\vskip1.000000\baselineskip
en donde m, n, y p son como se ha
definido
antes.
El compuesto de fórmula (VI) pueden producirse
mediante la reacción de un compuesto de fórmula (XVIII):
(XVIII)HOOC-(CH_{2})_{m}-O-CH_{2}CH_{2}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-COOH
con un compuesto de fórmula
(XIX):
(XIX)H_{2}N-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}.
El compuesto de fórmula (XVIII) puede producirse
mediante la hidrólisis de un compuesto de fórmula (XX):
(XX)R_{3}OOC-(CH_{2})_{m}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-COOR_{3}
en donde R_{3} es un
C_{1}-C_{4} alquilo ramificado o no
ramificado.
\newpage
El compuesto de fórmula (XX) puede producirse
mediante la reacción de un compuesto de fórmula (XXI):
(XXI)HO-CH_{2}CH_{2}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
con un compuesto de fórmula
(XVI):
(XVI)R_{2}-(CH_{2})_{m}-COOR_{3}
en donde R_{2} es
halógeno.
Las composiciones de aldehído de
polietilenglicol de la presente invención discutidos anteriormente
pueden utilizarse para derivar una variedad de moléculas, incluyendo
biomoléculas, utilizando cualquier método adecuado.
Los compuestos aldehído de PEG de la presente
invención son específicos del sitio N-terminal para
la pegilación de péptidos y otras biomoléculas. Los aldehídos de PEG
de la presente invención forman un conjugado con el grupo
\alpha-amino N-terminal de la
biomolécula o proteína formando una unión estable de amina
secundaria entre el PEG y la biomolécula o proteína.
Las biomoléculas pegiladas con aldehídos de PEG
de la presente invención muestran reproducibilidad en el número y
localización de la unión de PEG, resultando en una estrategia de
purificación que es menos complicada. Esta pegilación específica de
sitio puede resultar en un conjugado donde el lugar de pegilación
está lejos del sitio donde la biomolécula o el péptido se unen a los
receptores celulares, que permite a biomoléculas pegiladas,
proteínas, o péptidos retener la totalidad o la mayor parte de su
actividad biológica. Los aldehídos de PEG de la presente invención
pueden reaccionar con cualquier biomolécula que contenga un grupo
amino alfa (\alpha).
Dependiendo del aldehído de polietilenglicol
seleccionado, el polietilenglicol debe estar covalentemente unido a
una biomolécula en un extremo (aldehído de polietilenglicol
monofuncional) o en ambos extremos (aldehído de polietilenglicol
bifuncional).
Tal como se ha dicho, los aldehídos de
polietilenglicol de la presente invención pueden utilizarse para la
pegilación específica de sitio N-terminal. La unión
específica de sitio N-terminal resulta en
polipéptidos pegilados que evitan la unión cruzada y las
derivatizaciones múltiples de un polipéptido simple. Para producir
esta unión covalente específica de sitio, cualquier condición de
reacción adecuada puede ser utilizada. Generalmente, el pH de la
mezcla de reacción es suficientemente acídico para activar el
\alpha-aminoácido del polipéptido a ser pegilado.
Normalmente, el pH es de alrededor de 5,5 a alrededor de 7,4,
preferiblemente alrededor de 6,5.
Concordantemente, un método para unir una
molécula de polietilenglicol a un polipéptido comprende:
reacción de al menos un polipéptido de fórmula
(XXII):
(XXII)NH_{2}B;
con una molécula de aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(I):
(I)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CHO
en donde R_{1}, X, Y, Z, m, n, y
p son como se ha definido
antes;
para producir un compuesto de fórmula
(XXIII):
(XXIII)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-NHB
en donde se proporciona la molécula
aldehído de polietilenglicol que está unida al grupo amino
N-terminal del
polipéptido.
Los compuestos de fórmula (XXII) pueden ser
cualquier polipéptido, incluyendo interferón-alfa,
interferón-beta, interferón consenso, eritropoyetina
(EPO), factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), factor
estimulador de colonias de granulocitos/macrófagos
(GM-CSF), interleucinas (incluyendo
IL-2, IL-10, y
IL-12), y factor estimulador de colonias.
Los compuestos de fórmula (XXII) pueden también
ser inmunoglobulinas, tales como, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, y
subclases de los mismos, y fragmentos de los mismos. El término
"anticuerpo" o "fragmentos de anticuerpo" se refieren a
anticuerpos policlonales y monoclonales, una inmunoglobulina entera
o anticuerpo o cualquier fragmento funcional de una molécula de
inmunoglobina que se une al antígeno diana. Ejemplos de tales
fragmentos de anticuerpos incluyen Fv (fragmento variable), Fv de
cadena sencilla, regiones determinantes de complementariedad (CDRs),
VL (región variable de la cadena ligera), VH (región variable de la
cadena pesada), Fab (fragmento de unión a antígeno),
F(ab)2’, y cualquier combinación de aquellos o
cualquier otro grupo funcional de un péptido de inmunoglobina capaz
de unirse a un antígeno diana.
Tal como se ha dicho, el compuesto pegilado
puede preparase de cualquier forma deseada. Las condiciones, por
ejemplo, pH, se seleccionará para favorecer la pegilación específica
de sitio de los grupos \alpha-amino.
Generalmente, los polipéptidos pueden ser
pegilados con compuestos polietilenglicol de la invención añadiendo
el compuesto de fórmula (XXII), y el reactivo de PEG en un rango de
relación molar de 1:1 a 1:100. La concentración de la reacción puede
entonces colocarse en un tampón borato, fosfato, o tris a
temperatura ambiente o 4 grados Celsius durante 0,5 a 24 horas a un
rango de pH de 5,5 a 9,0. La relación molar del reactivo de PEG a un
péptido/proteína es generalmente de 1:1 a 100:1. la concentración de
péptido/proteínas es generalmente de 1 a 10 mg/ml. La concentración
de tampón es normalmente de 10 a 500 mM.
El compuesto pegilado puede aislarse o
purificarse de cualquier forma deseada. A modo de ejemplo, la mezcla
de reacción resultante puede diluirse con un tampón de equilibrio
(20 mM Tris, pH 7,5) y la mezcla resultante se aplica entonces a una
columna de Q-Sefarosa. Después de aplicar la mezcla
en la columna QA, se lava con el tampón de equilibrio se eluye con
NaCl 75 M; se eluye con NaCl 200 mM; se eluye con 1M NaCl; y se
regenera con HOAC 1M + NaCl 1M y NaOH 0,5. Utilizando HPLC de fase
reversa, es posible separar y aislar el producto monopegilado
N-terminal, de otros subproductos en la mezcla. Cada
producto recogido puede entonces confirmarse mediante espectrometría
de masas con ionización por desorción de láser asistida por matriz
en tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
En una realización preferida del método de
pegilación de la invención, un polipéptido de fórmula (XXII):
(XXII)NH_{2}B;
reacciona con una molécula aldehído
de polietilenglicol de fórmula
(II):
(II)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-CO-NH-(CH_{2})_{p}-CHO
en donde R_{1}, m, n, y p son
como se ha definido
antes;
para producir un compuesto de fórmula
(XXIV):
(XXIV)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-CO-NH-(CH_{2})_{p}-NHB
en donde la molécula aldehído de
polietilenglicol se une al grupo amino N-terminal
del
polipéptido.
Ilustraciones adicionales del uso de los
compuestos de la presente invención se muestran en las Solicitudes
de Patente Estadounidense depositadas tituladas "Pegylated T20
Polypeptide", No de Serie US. 60/398,195 depositado el 24 de
Julio de 2002, y "Pegylated T1249 Polypeptide", No de Serie US
60/398,190 depositado el 24 de Julio de 2002, y No de Serie US
60/439,213 depositado el 10 de Enero de 2003 se incorporan por
referencia como si se describieran completamente.
Se proporciona además, un método para unir una
molécula de polietilenglicol a un polipéptido que comprende:
reacción de un polipéptido de fórmula (XXII):
(XXII)NH_{2}B;
con una molécula de aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(VIII):
en donde cada m, n, y p es el mismo
o diferente y se define como
antes;
para producir un compuesto de fórmula (XXV):
en donde la molécula aldehído de
polietilenglicol está unido al grupo amino de
N-terminal de los
polipéptidos.
En realizaciones preferidas, p es 3, m es 1, y n
es de 100 a 750; o p es 2, m es 1, y n es de 100 a 750; o p es 1, m
es 1, y n es de 100 a 750.
Los polipéptidos pegilados pueden utilizarse en
cualquier forma deseada. No obstante, se usan adecuadamente para
preparar composiciones farmacéuticas, mediante la mezcla con un
excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones
farmacéuticas pueden estar en forma de dosis unitarias. Pueden ser
soluciones inyectables o suspensiones, sistemas de liberación
transdérmicos, o cualquier otra forma deseada.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar mejor la presente invención. Estos ejemplos solo son
ilustrativos.
Cinco gramos de PEG (peso molecular de 1,000 a
60,000 daltons) en 50 a 100 ml de tolueno se secó azeotrópicamente
mediante reflujo durante 1 a 3 horas, seguido por la eliminación de
20 a 30 mL de tolueno. La solución resultante se enfría a
temperatura ambiente luego se añade terc-butóxido
potásico (1 a 10 molar en exceso) en 20-50 ml de
terc-butanol absoluto y 20-50 ml de
tolueno a la solución de PEG. La mezcla resultante se agita entonces
durante dos horas a temperatura ambiente bajo argón.
Se añade bromoacetato de
terc-butilo (exceso 1 a 10 molar) a la reacción
mediante una jeringa y la mezcla de reacción se agitó toda la noche
a temperatura ambiente bajo gas argón. Dependiendo del tamaño
deseado del grupo "m" definido en la fórmula (XVI),
bromoacetato de terc-butilo puede reemplazarse con
otro derivado halogenado de ácido acético, por ejemplo, ácido
propiónico, ácido butírico, etc.
La solución de reacción se condensa entonces
mediante evaporación rotatoria y el residuo precipitó mediante la
adición de dietil éter. El producto precipitado, carboxi éster de
t-butilo PEG, es eliminó por filtración y secado al
vacío.
Se disolvieron entonces (4 g) de carboxi éster
de t-butilo PEG en 50 a 100 ml de 1N hidróxido
sódico y la solución se agitó a temperatura ambiente toda la noche.
El pH de la mezcla se ajusta de 2,5 a 3,0 mediante la adición de
ácido clorhídrico 1N a 6N, y la mezcla se extrae con diclorometano.
La fase orgánica se secó entonces sobre sulfato sódico, se filtró,
se concentró, y precipitó en dietil éter. El producto, ácido
carboxílico PEG, se recogió mediante filtración y se secó al
vacío.
El ácido carboxílico PEG (3 g) se disolvió
entonces en diclorometano anhidro (20-30 ml) seguido
por la adición de dietil acetal
4-aminobutilraldehído (1-5 molar
exceso), 1-hidroxibenzotriazol (1-5
molar exceso), y diciclohexilcarbodiimida (1-5 molar
exceso). Dependiendo del tamaño deseado del grupo "p" definido
en la fórmula (XIII), 4-dietil acetal
aminobutiraldehído puede reemplazarse con otro derivado de amina de
dietil acetal, por ejemplo dietil acetal
3-aminopropionaldehído o dietil acetal
2-aminoacetalaldehído.
La mezcla resultante se agitó toda la noche a
temperatura ambiente bajo gas argón. La mezcla de reacción se
filtró, se concentró, y precipitó con una mezcla de
2-propanol y dietil éter (1:1). El producto PEG
acetal se seca al vacío toda la noche.
El producto PEG acetal se disolvió entonces en
10 - 200 ml de 1 - 90% CF_{3}COOH, y la solución se agitó a
temperatura ambiente toda la noche. El pH de la mezcla se ajustó a
6,0 mediante la adición de una solución 1 N de NaOH, y se añade
entonces cloruro sódico (10% peso) y el pH de la solución se ajusta
a 7,0 mediante la adición de NaOH 1 N. La mezcla se extrae entonces
con diclorometano. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se
filtró, se concentró, y precipitó con dietil éter. El producto, PEG
aldehído, se recogió mediante filtración y se secó al vacío.
A continuación se representa un esquema de
reacción general para preparar
mPEG10k-butanoaldehído:
Esquema de reacción para
mPEG10k-butanoaldehído
Primero, Carboximetil PEG (mPEG) de peso
molecular de 10,000 daltons (30,0 g, 3 mmol) en 300 mL de tolueno se
secó azeotrópicamente mediante reflujo durante 2 horas, seguido de
la eliminación de 100 ml de tolueno. La solución resultante se
enfrió a temperatura ambiente, luego se añadió
terc-butóxido potásico (0,68 g, 6 mmol) en 20 ml de
terc-butanol absoluto y 20 ml de tolueno a la
solución PEG (1). La mezcla resultante se agitó durante dos horas a
temperatura ambiente bajo argón.
Se añadió bromoacetato de
terc-butilo (1,00 mL, 6,75 mmol) a la reacción por
medio de una jeringa y la reacción se agitó toda la noche a
temperatura ambiente bajo argón. La solución de reacción se condensó
mediante evaporación rotatoria. El residuo precipitó mediante la
adición de dietil éter. El producto precipitado se filtró y se secó
al vacío. Rendimiento: 28 g. RMN (d_{6}-DMSO):
1,40 ppm (t, 9H, -CH3); 3,21 ppm (s, -OCH_{3}); 3,50 ppm (s,
-O-CH_{2}CH_{2}-O-); 3,96 ppm
(s, 2H, -O-CH_{2}-COO-).
A continuación, mPEG_{10k} carboximetil éster
de t-butilo (20 g) se disolvió en 200 mL de
hidróxido sódico 1N y la solución se agitó a temperatura ambiente
toda la noche (2). El pH de la mezcla se ajustó a 2,5 mediante la
adición de ácido clorhídrico 6 N, y la mezcla se extrajo con
diclorometano (50 mL, 40 mL, y 30 mL). La fase orgánica se secó
sobre sulfato sódico, se filtró, se concentró, y precipitó con
dietil éter. El producto, ácido
m-PEG_{10k}-carboximetílico, se
recogió mediante filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 18 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 3,21 ppm (s, -OCH_{3}); 3,5
ppm (s, -O-CH_{2}CH_{2}-O-);
3,99 ppm (s, 2H,
-O-CH_{2}-COOH).
El ácido
m-PEG_{10k}-carboximetílico (3 g,
0,3 mmol) se disolvió en diclorometano anhidro (20 mL) seguido por
la adición de dietil acetal 4-aminobutiraldehído (50
mg, 0,3 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (40 mg, 0,3
mmol), y diciclohexilcarbodiimida (80 mg, 0,39 mmol) (3). La mezcla
se agitó toda la noche a temperatura ambiente bajo argón. La mezcla
de reacción se filtró, se concentró, y precipitó con una mezcla de
2-propanol y dietil éter (1:1). El producto,
mPEG_{10k}-butanoacetal, se secó al vacío toda la
noche. Rendimiento: 2,7 g. RMN (d_{6}-DMSO):
1,07-1,12 ppm (t, 6H,
(-O-CH_{2}-CH_{3})_{2});
1,46 ppm (m, 4H, -NHCH_{2}CH_{2}CH_{2}-CH-);
3,08-3,11 ppm (q, 2H,
-NHCH_{2}CH_{2}CH_{2}-CH-); 3,21 ppm (s,
-OCH_{3}); 3,5 ppm (s,
-O-CH_{2}CH_{2}-O-); 3,85 ppm
(s, 2H,
-O-CH_{2}-CO-NH-);
4,44 ppm (t, 1H, -NHCH_{2}CH_{2}CH_{2}-CH-);
7,67 ppm (-NH-).
Finalmente, el
mPEG_{10k}-butanoacetal (5 g, 0,5 mmol) se
disolvió en 50 mL de 10% CF_{3}COOH y la solución se agitó a
temperatura ambiente toda la noche (4). El pH de la mezcla se ajustó
a 6,0 mediante la adición de una solución 1 N de NaOH, y se añadió
cloruro sódico (10% peso) y luego el pH de la solución se ajustó a
7,0 mediante la adición de NaOH 1 N. La mezcla se extrajo con
diclorometano. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico, se
filtró, se concentró, y precipitó en dietil éter. El producto,
mPEG_{10k}-butanoaldehído (5), se recogió mediante
filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 4,1 g (82%). RMN
(d_{6}-DMSO): 3,21 ppm (s, -OCH_{3}); 3,5 ppm
(s, -O-CH_{2}CH_{2}-O); 3,85 ppm
(s, 2H,
-O-CH_{2}-CO-NH-);
7,67 ppm (-NH-); 9,66 ppm (-CHO-).
mPEG_{10k}-acetal aldehído se
preparó mediante la disolución de
mPEG_{10k}-dietil acetal (1 g, Peso Mol. 10,000),
que se preparó de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 1, en 10 ml
de ácido trifluoroacético 80% (Aldrich, 99+%). La solución de
reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente bajo gas
argón. NaOH 1N se añadió entonces gota a gota a la solución de
reacción hasta que se obtuvo un pH de 6,0. A continuación, se añadió
NaCl (10% peso) a la solución anterior. El pH se ajustó entonces a
6,95 \pm 0,05 mediante la adición de NaOH 0,1 N. La solución se
extrajo entonces con cloruro de metileno. La fase orgánica se secó
entonces sobre sulfato sódico, se filtró, se concentró, y precipitó
con dietil éter. El producto, mPEG_{10k}-acetal
aldehído, se recogió mediante filtración y se secó al vacío.
Rendimiento: 0,85 g (85%).
mPEG_{10k}-propionaldehído se
preparó disolviendo mPEG_{10k}-propionacetal (2 g,
Peso Mol. 10,000), que se preparó de acuerdo al procedimiento del
ejemplo 1, en 20 ml de 80% ácido trifluoroacético (Aldrich, 99+%).
La solución de reacción se agitó toda la noche a temperatura
ambiente bajo gas argón. Se añadió entonces NaOH 1N gota a gota a la
solución de reacción hasta obtener un pH de 6,0. A continuación, se
añadió NaCl (10% peso) a la solución anterior. El pH se ajustó
entonces a 6,95 \pm 0,05 añadiendo NaOH 1 N. La solución se
extrajo entonces con cloruro de metileno. La fase orgánica se secó
entonces sobre sulfato sódico, se filtró, se concentró, y precipitó
con dietil éter. El producto,
mPEG_{10k}-propionaldehído, se recogió mediante
filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 1,8 g (90%).
PEG_{20k}-di-butanoaldehído
se preparó disolviendo dietil acetal
PEG_{20k}-di-butiraldehído (3,1 g,
Peso Mol. 20,000), que se preparó de acuerdo al procedimiento del
ejemplo 1, en 20 ml de 80% ácido trifluoroacético (Aldrich, 99+%).
La solución de reacción se agitó toda la noche a temperatura
ambiente bajo gas argón. Se añadió entonces NaOH 1N gota a gota a la
solución de reacción hasta obtener un pH de 6,0. A continuación, se
añadió NaCl (10% peso) a la solución anterior. El pH se ajustó
entonces a 6,95 \pm 0,05 por adición de 0,1 N NaOH. La solución se
extrajo entonces con cloruro de metileno. La fase orgánica se secó
entonces sobre sulfato sódico, se filtró, se concentró, y precipitó
con dietil éter. El producto,
PEG_{20k}-di-butanoaldehído, se
recogió por filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 2,5 g
(81%).
mPEG_{20k}-butanoaldehído se
preparó disolviendo dietil acetal
mPEG_{20k}-butiraldehído (3,0 g, Peso Mol.
20,000), que se preparó de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 1,
en 30 ml de 80% ácido trifluoroacético (Aldrich, 99+%). La solución
de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente bajo argón
gas. Se añadió entonces 1N NaOH gota a gota a la solución de
reacción hasta obtener un pH de 6,0. A continuación, se añadió NaCl
(10% peso) a la solución anterior. El pH se ajustó entonces a 6,95
\pm 0,05 por adición de 1 N NaOH. La solución se extrajo entonces
con cloruro de metileno. La fase orgánica se secó entonces sobre
sulfato sódico, se filtró, se concentró, y precipitó con dietil
éter. El producto, mPEG_{20k}-butanoaldehído, se
recogió por filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 2,5 g
(83,3%).
mPEG_{20k}-butanoaldehído se
preparó disolviendo dietil acetal
mPEG_{20k}-butiraldehído (14,7 g, Peso Mol.
20,000), que se preparó de acuerdo al procedimiento del Ejemplo 1,
en 200 ml de 10% ácido trifluoroacético (Aldrich, 99+%). La solución
de reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente bajo gas
argón. Se añadió entonces NaOH 1N gota a gota a la solución de
reacción hasta obtener un pH de 6,0. A continuación, se añadió NaCl
(10% peso) a la solución anterior. El pH se ajustó entonces a 6,95
\pm 0,05 por adición de 0,1 N NaOH. La solución se extrajo
entonces con cloruro de metileno. La fase orgánica se secó entonces
sobre sulfato sódico, se filtró, se concentró, y precipitó con
dietil éter. El producto,
mPEG_{20k}-butanoaldehído, se recogió por
filtración y se secó al vacío. Rendimiento: 13,1 g (89%).
Claims (20)
1. Un compuesto de fórmula (I):
(I)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CHO
en
donde
R_{1} se elige del grupo consistente en
halógeno, epóxido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, tosilato,
iso cianato, hidrazina hidrato, haluro cianúrico,
N-succinimidiloxilo,
sulfo-N-succinimidiloxilo,
1-benzo-triazoliloxilo,
1-imidazoliloxilo,
p-nitrofeniloxilo, y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
X es O o NH,
Y se selecciona del grupo consistente en
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Z es una cadena lateral de un aminoácido,
m es de 1 a 17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
2. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 con la fórmula (III):
3. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 con la fórmula (IV):
\newpage
4. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 con la fórmula (V):
5. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 1 con la fórmula (VI):
6. Un compuesto de fórmula
(II):
en
donde
R_{1} se elige del grupo consistente en
halógeno, epóxido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, tosilato,
iso cianato, hidrazina hidrato, haluro cianúrico,
N-succinimidiloxilo,
sulfo-N-succinimidiloxilo,
1-benzo-triazoliloxilo,
1-imidazoliloxilo,
p-nitrofeniloxilo, y
m es de 1 a
17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
7. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 6, en donde p es 3.
8. Un compuesto de fórmula (VIII):
en
donde
m es de 1 a 17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
9. Un compuesto de fórmula (IX):
(IX)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}-CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}
en
donde
R_{1} se elige del grupo consistente en
halógeno, epóxido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, tosilato,
iso cianato, hidrazina hidrato, haluro cianúrico,
N-succinimidiloxilo,
sulfo-N-succinimidiloxilo,
1-benzo-triazoliloxilo,
1-imidazoliloxilo,
p-nitrofeniloxilo, y
X es O o NH,
Y se selecciona del grupo consistente en
Z es una cadena lateral de un aminoácido,
m es de 1 a 17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
10. Un compuesto de fórmula (X):
en
donde
R_{1} se elige del grupo consistente en
halógeno, epóxido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, tosilato,
iso cianato, hidrazina hidrato, haluro cianúrico,
N-succinimidiloxilo,
sulfo-N-succinimidiloxilo,
1-benzo-triazoliloxilo,
1-imidazoliloxilo,
p-nitrofeniloxilo, y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
m es de 1 a
17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
11. Un compuesto de fórmula (XI):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
m es de 1 a 17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
12. Un proceso de elaboración de un aldehído de
polietilenglicol que comprende la hidrólisis de un compuesto de
fórmula (IX):
(IX)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-I-NH-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}
para producir un aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(I):
(I)R_{1}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-X-Y-NH-(CH_{2})_{p}-CHO
en
donde
R_{1} se elige del grupo consistente en
halógeno, epóxido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, tosilato,
iso cianato, hidrazina hidrato, haluro cianúrico,
N-succinimidiloxilo,
sulfo-N-succinimidiloxilo,
1-benzo-triazoliloxilo,
1-imidazoliloxilo,
p-nitrofeniloxilo, y
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
X es O o NH,
\newpage
Y se selecciona del grupo consistente en
Z es una cadena lateral de un aminoácido,
m es de 1 a 17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
13. Un proceso de elaboración de un aldehído de
polietilenglicol que comprende la hidrólisis de un compuesto de
fórmula (X):
para producir un aldehído de
polietilenglicol de fórmula
(II):
en
donde
R_{1} se elige del grupo consistente en
halógeno, epóxido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, tosilato,
iso cianato, hidrazina hidrato, haluro cianúrico,
N-succinimidiloxilo,
sulfo-N-succinimidiloxilo,
1-benzo-triazoliloxilo,
1-imidazoliloxilo,
p-nitrofeniloxilo, y
m es de 1 a
17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
13 en donde el compuesto de fórmula (X) es producido mediante la
reacción de un compuesto de fórmula (XII):
(XII)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-COOH
con un compuesto de fórmula
(XIII):
(XIII)H_{2}N-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}.
15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
14 en donde el compuesto de fórmula (XII) es producido mediante la
hidrólisis de un compuesto de fórmula (XIV):
(XIV)R_{1}-O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-COOR_{3}
en donde R_{3} es un
C_{1}-C_{4} alquilo ramificado o sin
ramificar.
16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
15 en donde el compuesto de fórmula (XIV) es producido mediante la
reacción de un compuesto de fórmula (XV):
(XV)R_{1}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
con un compuesto de fórmula
(XVI):
(XVI)R_{2}-(CH_{2})_{m}-COOR_{3}
en donde R_{2} es
halógeno.
17. Un proceso de elaboración de un aldehído de
polietilenglicol que comprende la hidrólisis de un compuesto de
fórmula (XVII):
para producir a polietilenglicol de
fórmula
(VIII):
en
donde
m es de 1 a 17,
n es de 10 a 10,000, y
p es de 1 a 3.
18. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
19 en donde el compuesto de fórmula (VIII) es producido mediante la
reacción de un compuesto de fórmula (XVIII):
(XVIII)HOOC-(CH_{2})_{m}-O-CH_{2}CH_{2}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-COOH
con un compuesto de fórmula
(XIX):
(XIX)H_{2}N-(CH_{2})_{p}-CH-(OCH_{2}-CH_{3})_{2}.
19. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
20 en donde el compuesto de fórmula (XVIII) es producido mediante
la hidrólisis de un compuesto de fórmula (XX):
(XX)R_{3}OOC-(CH_{2})_{m}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-O-(CH_{2})_{m}-COOR_{3}
en donde R_{3} es un
C_{1}-C_{4} alquilo ramificado o sin
ramificar.
20. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
21 en donde el compuesto de fórmula (XX) es producido mediante la
reacción de un compuesto de fórmula (XXI):
(XXI)HO-CH_{2}CH_{2}-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
con un compuesto de fórmula
(XVI):
(XVI)R_{2}-(CH_{2})_{m}-COOR_{3}
en donde R_{2} es
halógeno.
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