ES2273335T3

ES2273335T3 - Uso de un anticuerpo no neutralizante especifico para la subunidad beta de la hormona luteinizante para aumentar la fertilidad.

Info

Publication number: ES2273335T3
Application number: ES95911043T
Authority: ES
Inventors: William R. Moyle
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2015-02-17
Also published as: AU1878795A; EP0751782B1; JPH11263799A; ATE342061T1; EP0839831A3; EP0751782A1; ES2251731T3; DE69534723D1; AU695111B2; ATE314392T1; EP0839831A2; PT751782E; DK0751782T3; CA2183564C; CA2183564A1; JPH09509418A; EP0751782A4; WO1995022340A1; EP1849802A2; DE69535260T2

Abstract

METODO PARA MEJORAR LA FERTILIDAD MEDIANTE LA REDUCCION DE LA ACTIVIDAD Y/O NIVELES DE CIRCULACION DE HORMONAS DE GLICOPROTEINA QUE TIENEN ACTIVIDAD LUTROPINICA (LH). LAS MOLECULAS AQUI REFERIDAS SON ANTICUERPOS U OTROS AGENTES DE UNION QUE REDUCEN LAS ACTIVIDADES BIOLOGICAS DE LH. TAMBIEN SE APORTAN NUEVOS METODOS PARA DESARROLLAR Y/O SELECCIONAR ANTICUERPOS EN PARTES ESPECIFICAS DE PROTEINAS ENTRE LAS QUE SE INCLUYEN LH Y GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA (HCH) PARA PODER REDUCIR SU ACTIVIDAD BIOLOGICA A NIVELES DESEABLES. TAMBIEN SE HACE REFERENCIA A LA PREPARACION DE UNA SOLA SUBUNIDAD DE GONADOTROPINAS Y ANTAGONISTAS DE GONADOTROPINA PARA SU USO EN LA ESTIMULACION E INHIBICION DE LA FERTILIDAD Y PARA CONTROLAR LA HIPERESTIMULACION OVARICA. SE TRATA FUNDAMENTALMENTE DE UN METODO PARA ESTIMULAR LA FERTILIDAD EN LOS MAMIFEROS REDUCIENDO LA ACTIVIDAD DE LAS HORMONAS DE GLICOPROTEINA QUE TIENEN ACTIVIDAD HORMONAL LUTEINIZANTE EN CIRCULACION Y DE ESTE MODO ESTIMULAR LA PRODUCCION DE LA HORMONAESTIMULADORA DEL FOLICULO MEDIANTE LO QUE SUPONE LA ADMINISTRACION EN CANTIDAD EFECTIVA TERAPEUTICAMENTE A UN MAMIFERO DE UN AGENTE DE UNION PARA LIGAR LA HORMONA LUTEINIZANTE.

Description

Uso de un anticuerpo no neutralizante específico para la subunidad \beta de la hormona luteinizante para aumentar la fertilidad.

La presente invención se refiere al uso de un anticuerpo no neutralizante que se une a la subunidad \beta de la hormona luteinizante y disminuye pero no elimina la actividad de hormonas glicoproteicas sobre el receptor para la hormona luteinizante incluso cuando está en una concentración en la que se une a la totalidad de dicha hormona glicoproteica presente, en la preparación de una composición farmacéutica para estimular la fertilidad en mamíferos hembras estimulando la producción de la hormona estimulante del folículo.

A las divulgaciones aquí citadas para ilustrar los antecedentes de la invención y para proporcionar detalles adicionales con respecto a su práctica, por comodidad, se les ha asignado una referencia numérica en el texto que viene a continuación y aparecen agrupadas respectivamente en la bibliografía adjunta.

La familia de hormonas glicoproteicas (1) consiste en tres glicoproteínas \alpha,\beta-heterodiméricas que se han encontrado en la adenohipófisis en donde se fabrican. Las hormonas glicoproteicas son la hormona luteinizante (también conocida como lutropina o LH), la hormona estimulante del folículo (folitropina o FSH) y la hormona estimulante del tiroides (también conocida como tirotropina o TSH). Estas hormonas, procedentes de seres humanos, se conocen como hLH, hFSH y hTSH respectivamente. En algunas especies, una hormona glicoproteica estructuralmente similar a la LH, denominada gonadotropina coriónica o CG, se fabrica en la placenta y se libera en la circulación. En seres humanos, esta hormona glicoproteica se denomina hCG. En primates, se han encontrado también cantidades significativas de todas estas hormonas en forma de productos de excreción en orina. Después de la menopausia, cuando la secreción de LH y FSH por la adenohipófisis está enormemente incrementada, se encuentran cantidades significativas de LH y FSH en la orina. Los extractos de orina que contienen gonadotropinas procedentes de mujeres menopáusicas se denominan gonadotropinas menopaúsicas humanas (hMG). A diferencia de la hCG, que interacciona al igual que la LH con los receptores para LH pero que interacciona sólo débilmente con los receptores para FSH, la hMG interacciona tanto con receptores para LH como con receptores para FSH. Esta actividad dual de la hMG se debe a la presencia de hLH, hFSH y sus metabolitos en el extracto de orina. Las orinas procedentes de mujeres embarazadas y de mujeres menopáusicas son las principales fuentes de actividades de gonadotropina y presentan importantes usos comerciales.

Las gonadotropinas tales como FSH, LH y, en algunas especies, CG, desempeñan un papel importante en el proceso reproductivo (1-6), mientras que la hormona TSH, estructuralmente relacionada, es importante para la función tiroidea (1). Tanto la LH como la FSH son esenciales para la pubertad y para la función reproductora normal. La deficiencia de FSH, LH o hCG en momentos adecuados, produce esterilidad o la terminación de un embarazo. Cantidades excesivas de estas hormonas pueden producir una pubertad prematura o una hiperestimulación de las gónadas. En el macho, la FSH es esencial para el inicio y mantenimiento de la espermatogénesis (7, 8). La inmunoneutralización de FSH da lugar a una disminución de la espermatogénesis y a una pérdida de fertilidad. En la hembra, la FSH es esencial para el desarrollo folicular que da lugar a la producción del gameto femenino en la ovulación. La enfermedad ovárica poliquística es una causa común de esterilidad en mujeres y es un estado caracterizado por un desarrollo folicular incompleto. Normalmente la fertilidad se puede restablecer con la administración de FSH o hMG. La fertilidad también se puede restablecer muchas veces mediante tratamientos con antiestrógenos, compuestos que inhiben el efecto de retroinhibición de los estrógenos sobre la secreción de FSH permitiendo de esta manera que los niveles de FSH suban. En los machos, la LH se requiere para la pubertad y, en su ausencia, se produce un defecto en la adquisición de los atributos sexuales y la fertilidad de un adulto. La LH es sobre todo responsable de la síntesis de andrógenos en los testículos. Estos esteroides ejercen una influencia beneficiosa sobre la espermatogénesis y niveles anormalmente altos de andrógenos pueden mantener la espermatogénesis una vez que ésta se ha iniciado (9). En las hembras, la LH es esencial para la ovulación y la formación del cuerpo lúteo. La LH también ejerce una influencia sinergística junto con la FSH sobre el desarrollo del folículo (4) y se sabe que promueve la síntesis de andrógenos foliculares. Estos andrógenos actúan como precursores para la formación de estrógenos estimulada por FSH. La LH también puede multiplicar el efecto de FSH sobre las células de la granulosa, en particular en las fases tardías de la maduración del folículo cuando las células de la granulosa han adquirido receptores para LH. La hCG fabricada por el trofoblasto es importante para el mantenimiento de la secreción de progesterona por el cuerpo lúteo durante las primeras etapas de un embarazo en seres humanos. Las actividades clínicas de estas hormonas y sus usos han sido objeto de extensas revisiones en varios libros de texto convencionales que incluyen el de Yen y
Jaffe (2).

Las diferencias en los efectos de FSH y LH y las complejas interacciones endocrinas entre estas dos hormonas las hacen que presenten acciones sinergísticas sobre el desarrollo folicular y sobre la síntesis de estradiol (4). Por ejemplo, la producción normal de estrógenos por los ovarios se debe al efecto de la LH sobre la formación de andrógenos y a la influencia de la FSH sobre la conversión de andrógenos a estradiol. A su vez, el estradiol puede suprimir la secreción de FSH por la hipófisis. Durante el ciclo menstrual normal, los niveles de FSH descienden a medida que el folículo aumenta de tamaño y secreta cantidades crecientes de estradiol. Cuando los niveles de estradiol alcanzan una cantidad suficiente durante la fase folicular, pueden provocar un aumento en la secreción de LH por la hipófisis que hace que se produzca la ovulación. El cociente de las actividades de LH/FSH así como los niveles absolutos de las hormonas en sangre son importantes para las funciones reproductoras tales como la maduración de los folículos y la ovulación del número idóneo de oocitos durante los ciclos menstrual y estral.

Mientras que la secreción tanto de LH como de FSH puede ser inhibida por hormonas esteroides, la secreción de FSH normalmente es más sensible que la de LH a la regulación por retroinhibición ejercida por los estrógenos. De hecho, en muchas especies, los niveles altos de estrógenos pueden aumentar la secreción de LH, en particular si los niveles de progesterona son bajos. La administración de anti-estrógenos, compuestos que alteran la regulación normal por retroinhibición del estradiol sobre la secreción de FSH, frecuentemente da lugar a una liberación de FSH aumentada y a una producción de gametos aumentada. Clínicamente, los anti-estrógenos son ampliamente utilizados para aumentar la probabilidad de ovulación en mujeres que padecen la enfermedad ovárica poliquística. Desgraciadamente, debido a que los efectos negativos del estradiol sobre la secreción de la FSH son parcialmente responsables del control del número de folículos que se desarrollan hasta alcanzar el punto de la ovulación, la interrupción del bucle normal de retroinhibición de estrógenos-FSH puede dar como resultado que se desprendan cantidades inadecuadas de óvulos. Un mecanismo que produjese una secreción de FSH aumentada sin que eliminase el control de retroinhibición de la secreción de FSH, tendría un uso apreciado para aumentar la fertilidad.

La FSH purificada es capaz de estimular el desarrollo folicular en mujeres, en particular cuando algo de LH endógena está también presente. El cociente FSH/LH es más alto en el momento del ciclo menstrual en el que se inicia el desarrollo folicular. Sin embargo, ambas hormonas son esenciales para la fertilidad. La inmunoneutralización de la LH da ligar a esterilidad en machos y hembras (10-12). Asimismo se demostró que la inmunoneutralización de CG, hormona que actúa a través de los receptores para LH, bloqueaba la fertilidad en primates (13-16). No se ha demostrado previamente que anticuerpos contra LH estimulen la fertilidad.

Se ha demostrado que anticuerpos monoclonales dirigidos contra hCG (denominados hCG-mAb) inhiben la unión de hCG a su receptor in vitro (17). Dependiendo de la posición de sus epítopos, los hCG-mAb presentan diferentes capacidades para inhibir la unión de hCG a receptores para LH. B105 y B110 son ejemplos de anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos sobre hCG y LH que quedan expuestos cuando estas hormonas se unen a receptores para LH (17). Los complejos de estas hormonas con estos anticuerpos monoclonales se unen a receptores para LH, aunque con una menor afinidad que las hormonas libres. Por consiguiente, estos anticuerpos inhiben la unión de las hormonas a los receptores para LH. Sin embargo, el grado máximo de la inhibición observada en presencia de un exceso de anticuerpo es de menos del 100% y menor que el de los anticuerpos que forman complejos con las hormonas que no se unen a receptores para LH. En presencia de una cantidad suficiente de B105 o B110, la cantidad de hormona necesaria para inducir una respuesta biológica aumenta. Así, incluso un exceso masivo de cualquiera de los dos anticuerpos, suficiente para unir virtualmente toda la hCG o LH libre en el ensayo, no es capaz de impedir una respuesta contra cualquiera de las dos hormonas cuando las concentraciones de los complejos hormona-anticuerpo excedieron un nivel umbral.

Según se ha comentado anteriormente, hace unos años se demostró que la inmunoneutralización de LH previene la fertilidad. Este fenómeno tiene lugar debido a que los antisueros que se usaron en estos estudios neutralizaron la actividad biológica de LH. Sin embargo, cuando se usan antisueros o anticuerpos adecuados como B105 o B110, la actividad biológica de LH no se elimina. Más bien, esta actividad disminuye en una cantidad predeterminada. Cuando esto sucede, la síntesis de andrógenos disminuye. Ya que los andrógenos son precursores de los estrógenos, la síntesis de estrógenos también disminuye. El descenso en estradiol tiene un impacto mayor sobre la secreción de FSH que sobre la secreción de LH. La secreción de FSH aumentará y esto dará lugar a un incremento en el cociente FSH/LH y a un aumento en el desarrollo folicular. En hembras, este cociente FSH/LH dará lugar a un aumento en el desarrollo folicular. En machos, este cociente FSH/LH dará lugar a un aumento en la función en las células de Sertoli y a un aumento en la espermatogénesis.

Una estrategia para aumentar la fertilidad que esté basada en disminuir los niveles de LH no se ha usado con anterioridad. En parte, esto se debe a los muchos informes existentes sobre que los anticuerpos contra LH inhiben la fertilidad y a que los métodos para fabricar y seleccionar anticuerpos que disminuyan pero que no neutralicen la actividad de LH no eran conocidos anteriormente. Por lo tanto, no era de esperar que esta estrategia para incrementar la fertilidad tuviera éxito. Como se tratará más adelante, esta estrategia para incrementar la fertilidad presenta varias ventajas con respecto a las técnicas actuales, principalmente en mujeres que fabrican y liberan LH y FSH por sus hipófisis. Debido a que disminuir los niveles de LH no altera las interrelaciones normales de autorregulación endocrina entre el estradiol y la FSH sobre la función hipofisaria, esta disminución tiene una probabilidad mucho menor de inducir una hiperestimulación ovárica que las técnicas existentes. Esto significa que habrá una menor necesidad de realizar a las pacientes controles costoso y que exigen un gran esfuerzo. Además, se requerirán sólo uno o a lo sumo unos cuantos tratamientos para inducir la fertilidad.

Otro método nuevo para aumentar la fertilidad es utilizar un antagonista de LH durante la fase folicular del ciclo menstrual. Desde hace algunos años se sabe que las cadenas de oligosacáridos presentes en las hormonas glicoproteicas son esenciales para la capacidad que tienen estas hormonas para inducir la transducción de señales (1). Las hormonas glicoproteicas que carecen de residuos de carbohidratos tienen capacidades disminuidas para inducir una respuesta biológica. Estos análogos se pueden usar para bloquear la unión de LH a sus receptores. Esto disminuirá la actividad de la LH circulante y con ello favorecerá la fertilidad. Se ha descubierto que las gonadotropinas desglicosiladas tienen semividas biológicas cortas y se encontró que no eran útiles para el uso originalmente planeado de las mismas, en concreto, para inhibir la fertilidad disminuyendo la síntesis luteínica de progesterona y produciendo el aborto. Trasladando los residuos de carbohidrato a otras porciones de la hormona mediante la retirada de las señales de glicosilación (es decir, las secuencias de aminoácido Asparagina-X-Treonina o Asparagina-X-Serina, en las que X es cualquier aminoácido excepto Prolina) de un sitio y creando señales de glicosilación en sitios alternativos de las subunidades \alpha y \beta, es posible diseñar análogos con una actividad agonista disminuida y que posean semividas suficientemente largas para poder ser útiles. Además, preparando gonadotropinas monocatenarias en las que las subunidades \alpha y \beta están unidas covalentemente es posible aumentar la estabilidad de las hormonas circulantes. Esto es debido a que las actividades de unión a los receptores y las semividas plasmáticas de las gonadotropinas heterodiméricas son mayores que las de cualquiera de las dos subunidades. La unión covalente previene la disociación de las dos subunidades cuando se encuentran en la circulación.

Aunque la estimulación de la fertilidad es importante para restablecer la fertilidad en parejas estériles, la inhibición de la fertilidad es muchas veces deseada como método de planificación familiar. Además, la inhibición de la fertilidad sería útil en la producción comercial de ganado ya que eliminaría la necesidad de castración o prevendría el desarrollo del celo en ganado vacuno apresado en el comedero. La inhibición de la fertilidad en otros animales incluyendo perros y gatos sería también conveniente como sustitutiva a extirparles los ovarios o castrarles. La inhibición de la fertilidad en caballos también sería preferible a la capadura, en particular si puede ser reversible. Según se ha indicado anteriormente, la fertilidad se puede inhibir mediante la administración de anticuerpos neutralizantes contra LH o FSH. También se puede inhibir usando una vacuna para inducir la formación de estos anticuerpos. Debido a la acción de la hCG en el mantenimiento del embarazo, los tratamientos que dan lugar a una hiposecreción o hipoactividad de la hCG, se esperaría también que produjeran esterilidad. En las mujeres, esto sería más conveniente para inhibir la fertilidad, inhibiendo la hCG mejor que hLH o hFSH. Esto es porque los tratamientos que neutralizasen hLH o hFSH provocarían el cese de la función ovárica y acelerarían la aparición de los problemas asociados con la menopausia. En ganado vacuno y en otros animales domésticos, sería más importante inhibir la LH para prevenir la pubertad o interrumpir el celo. Según se ha indicado en trabajos previos, anticuerpos adecuados dirigidos contra la gonadotropina coriónica son capaces de inhibir la fertilidad en primates y en mujeres, y el desarrollo de anticuerpos contra hCG durante muchos años ha sido reconocido como un importante método potencial de anticoncepción (18). Debido a que la hCG es producida por gran número de cánceres humanos y debido a que los anticuerpos contra la hCG pueden afectar a estos tumores, la inmunización tendría también un impacto beneficioso sobre el tratamiento o prevención del cáncer (19).

Se han realizado varios intentos para diseñar una vacuna anticonceptiva de ese tipo, basada en la hCG, teniendo en cuenta las diferencias entre la hCG y las otras hormonas glicoproteicas (14, 18). Desgraciadamente, el desarrollo de la vacuna ha sido obstaculizado por las homologías estructurales habidas entre todas las hormonas glicoproteicas. El inmunógeno preferido debe ser altamente antigénico aunque sin embargo no induzca la formación de anticuerpos que presenten reacciones cruzadas con las otras glicoproteínas tales como la FSH, LH o TSH humanas. Sobre la base del conocimiento de las actividades de las hormonas glicoproteicas anteriormente descritas, una vacuna que indujese la formación de anticuerpos que interaccionasen con LH, FSH o TSH, provocaría también esterilidad y/o la inhibición de la función tiroidea. Desgraciadamente, la neutralización de LH o FSH produciría también el cese de los ciclos menstruales normales y la pérdida de la producción de estrógenos que está asociada con la fertilidad en las mujeres. La terminación de la función ovárica produciría probablemente un desarrollo prematuro de osteoporosis y de otros problemas asociados con la menopausia. La inhibición de la función tiroidea daría lugar a hipotiroidismo. Las similitudes de las estructuras de hCG y hLH han hecho particularmente difícil diseñar un inmunógeno adecuado que no genere anticuerpos que den reacciones cruzadas. Se han dedicado muchos esfuerzos a fabricar anticuerpos contra el único extremo C-terminal de la subunidad \beta de hCG debido a que esta porción de la molécula no se encuentra en hLH (1). Sin embargo, esta región no es muy antigénica. Los intentos realizados para diseñar inmunógenos también han utilizado péptidos obtenidos de la subunidad \beta (14), conjugados de la subunidad \beta con otras proteínas (20), o conjugados de subunidades \beta de hCG que contienen heterodímeros, y subunidades \alpha ovinas (18). Desgraciadamente, la mayoría de estos inmunógenos no son muy eficaces y se necesita un inmunógeno mejor para hacer que este método sea factible.

La dificultad para diseñar una vacuna basada en hCG se puede apreciar mediante conocimiento de las estructuras de las hormonas glicoproteicas. Todas las hormonas glicoproteicas contiene una subunidad \alpha común. Aunque la conformación de partes de la subunidad \alpha difieren en todas las hormonas y pueden ser reconocidas por anticuerpos monoclonales seleccionados (21), porciones de la subunidad \alpha presentan la misma conformación en cada una de las hormonas glicoproteicas. Por lo tanto, muchos anticuerpos dirigidos contra la subunidad \alpha reconocen LH, FSH, hCG y TSH. Debido a que los anticuerpos anti-subunidad \alpha con frecuencia son capaces de bloquear las actividades de las hormonas (22), un inmunógeno que induzca una respuesta contra la subunidad \alpha es probable que tenga efectos secundarios no deseados. Por lo tanto, la mayoría de las estrategias para diseñar una vacuna anticonceptiva están dirigidas a la subunidad \beta hormona-específica de la hCG.

La subunidad \beta de hCG es la más estrechamente relacionada con la subunidad \beta de hLH. Muchos de los anticuerpos dirigidos contra la subunidad \beta intacta de hCG se unirán también con la subunidad \beta de LH. Aunque las subunidades \beta de las otras hormonas difieren considerablemente de la de hCG, algunos de los residuos de todas las subunidades \beta son idénticos y existe la posibilidad, aunque pequeña, de que algunos anticuerpos anti-subunidad \beta presenten también reacciones cruzadas con estas hormonas. Los 31 aminoácidos carboxi terminales de la subunidad \beta de hCG (CTP) (del inglés, " Carboxi Terminal Peptide") no están relacionados con ninguno de los residuos de las otras hormonas glicoproteicas. En teoría, los anticuerpos dirigidos contra esta región no son capaces de inducir reacciones cruzadas con las otras hormonas. Según lo esperado, cuando esta región se usa como inmunógeno, se forman anticuerpos que no presentan reacciones cruzadas con ninguna de las demás hormonas glicoproteicas. Desgraciadamente, los anticuerpos que se producen contra péptidos CTP sintéticos no se unen con una afinidad alta a hCG. En parte, esto es debido a la observación de que esta región de hCG contiene cuatro sitios de glicosilación potenciales ligados a serina y está altamente glicosilada. Además, gran parte de esta región de hCG no es esencial para la interacción con los receptores para LH. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra el CTP de hCG se unen a complejos de receptor-hCG y son en su mayoría de tipo no neutralizante. Por consiguiente, estos anticuerpos no inhiben la acción de hCG, al igual que anticuerpos como el B101 (22) que impiden que hCG se una a los receptores para LH.

Se han hecho intentos para diseñar anticuerpos dirigidos contra otras porciones de la subunidad \beta de hCG. Una de las regiones que ha sido extensamente investigada es la región que se encuentra entre los residuos de cisteína 38 y 57. Se sabe que esta porción de la proteína forma un gran bucle y existen estudios que han demostrado que este bucle es capaz de estimular una esteroidogénesis (23, 24). Por lo tanto, se podría prever que los anticuerpos dirigidos contra este bucle serían de tipo neutralizante. De hecho, B101, un anticuerpo que se ha demostrado que reconoce residuos contenidos en este bucle (22, 25, 26) es capaz de neutralizar la actividad de hCG. El problema existente con el uso de esta estructura en bucle es que los anticuerpos que se producen son frecuentemente de baja afinidad. Además, debido a que la hCG y la hLH son similares en esta región de la molécula (es decir, tienen solamente tres aminoácidos que difieren), es de esperar que la inmunización efectuada con este bucle provoque la producción de anticuerpos contra hLH. De hecho, B101, un anticuerpo que se une a esta región de la molécula, presenta una afinidad inaceptablemente alta por hLH.

Intentos recientes realizados para identificar la estructura terciaria de las hormonas glicoproteicas han dependido de la caracterización de los sitios de unión de grupos de anticuerpos monoclonales(26). Se han identificado anticuerpos que previenen la actividad biológica de hCG o que neutralizan sólo parcialmente su actividad biológica. Según se describe en el ejemplo 7 de la presente memoria descriptiva, estos anticuerpos y anticuerpos similares se pueden usar para diseñar inmunógenos que posean el potencial para neutralizar hCG pero no hLH usando el procedimiento de selección positiva y un procedimiento de selección negativa descritos en los ejemplos 6 y 7 que se exponen más adelante. Aunque la hormona ha sido cristalizada y una estructura cristalina sería valiosa para determinar los tipos de inmunógenos que pudieran producir una inmunorrespuesta con un título alto contra partes concretas de la molécula, las dificultades encontradas en la resolución de la estructura cristalina han impedido esta estrategia. Por lo tanto, en el presente estado del conocimiento de la estructura de hCG, no existe ningún método aceptable que pueda usarse para predecir el tipo de inmunógeno que fuese más eficaz.

Otro método útil para aumentar la fertilidad es aumentar los niveles de actividad de FSH. Uno de los modos de llevar esto a cabo es administrar dosis pequeñas de folitropinas de acción prolongada. Estas folitropinas se pueden fabricar acoplando moléculas con actividad de folitropina a moléculas con semividas plasmáticas largas (es decir, inmunoglobulinas) o preparando análogos monocatenarios de gonadotropinas que tienen actividad de folitropina (Tablas 1 y 2). Solas, o en combinación con anticuerpos contra LH y/o con antagonistas de LH, estas hormonas facilitan el desarrollo de folículos en mujeres con la enfermedad ovárica poliquística.

La inmunización pasiva contra LH tiene el potencial de estimular una superovulación en especies de animales domésticos, aunque, a concentraciones de anticuerpo más altas, tanto la inmunización pasiva como la inmunización activa contra LH bloquean la ovulación (66).

La Figura 1 es una gráfica que ilustra la influencia de anticuerpos y antisueros sobre la unión de hLH marcada radiactivamente a receptores para LH.

La Figura 2 es una gráfica que ilustra la influencia de anticuerpos y antisueros sobre la capacidad de hLH para inducir la esteroidogénesis in vitro.

La Figura 3 es una gráfica que ilustra la influencia de anticuerpos y antisueros sobre la capacidad de hLH para inducir la esteroidogénesis in vivo.

La Figura 4 muestra vectores que se pueden usar en estrategias de selección basadas en moldes/exclusión.

La Figura 5 muestra los tipos de inmunógenos que poseen una antigenicidad aumentada para usar en la inmunización activa contra LH, hCG o FSH.

La Figura 6 ilustra la secuencia codificadora del análogo n.º 1 monocatenario de gonadotropinas y de los cebadores (subrayados).

La Figura 7 ilustra la secuencia codificadora del análogo n.º 2 monocatenario de gonadotropinas y de los cebadores (subrayados).

La Figura 8 ilustra la secuencia codificadora del análogo n.º 3 monocatenario de gonadotropinas y de los cebadores (subrayados).

La Figura 9 ilustra la preparación de una región que codifica una subunidad alfa y que carece de secuencias señal oligosacáridas.

La Figura 10 ilustra la preparación de una región que codifica una subunidad beta y que carece de secuencias señal oligosacáridas ligadas a asn.

La Figura 11 ilustra la secuencia codificadora del análogo n.º 1a monocatenario de gonadotropinas.

La presente invención se refiere al uso de anticuerpos no neutralizantes que se unen a la subunidad \beta de la hormona luteinizante para aumentar la fertilidad disminuyendo, pero no eliminando, las actividades de las hormonas glicoproteicas circulantes que poseen actividad de lutropina (LH). Debido a que las moléculas con actividad de lutropina son esenciales para la fertilidad, sería de esperar que el bloqueo de sus actividades disminuya la fertilidad en lugar de aumentarla. Sin embargo, normalmente se encuentra que las lutropinas aumentan la producción de esteroides que pueden disminuir la secreción de folitropinas (FSH), hormonas que ejercen importantes papeles en la fertilidad. Por consiguiente, la disminución de las actividades de lutropinas da lugar a un aumento en los niveles de folitropinas y/o de los cocientes folitropina/lutropina. Cuando la actividad de LH se disminuye pero no se suprime, el aumento de la actividad de FSH y/o del cociente FSH/LH da lugar a una producción aumentada de gametos y a una fertilidad elevada en seres humanos y en animales. La presente invención también describe nuevos métodos para diseñar y/o seleccionar anticuerpos dirigidos contra porciones específicas de proteínas que incluyen LH y la gonadotropina coriónica humana (hCG) que permiten que sus actividades biológicas disminuyan hasta alcanzar los grados deseados. En este documento se presentan ejemplos que ilustran como diseñar anticuerpos e inmunógenos contra porciones específicas de gonadotropinas seleccionadas, que incluyen aquellos anticuerpos e inmunógenos que tienen una estructura muy similar. Esos anticuerpos e inmunógenos tendrán usos para aumentar la fertilidad. La presente invención también se refiere a la preparación de moléculas que se pueden unir a receptores para LH y de FSH y que presentan acciones que aumentan la fertilidad o que inhiben la fertilidad dependiendo del tiempo que dure la administración. Algunas de ellas son moléculas que se unirán a receptores para LH y bloquearán la acción de LH. Cuando estas moléculas se administren en la fase folicular, suprimirán la actividad de LH suprimiendo con ello la secreción de andrógenos y estrógenos. Por consiguientes, los niveles de FSH subirán y aumentará la fertilidad. Cuando estas moléculas se administren después de la ovulación durante la fase luteínica del ciclo menstrual, suprimirán la actividad de hCG y provocarán el final del embarazo. Además, la presente invención se refiere a la preparación de moléculas que presentan la capacidad para inhibir las acciones de FSH y de tanto FSH como LH. Estas moléculas serán útiles para tratar a mujeres que tienen un tejido ovárico hiperactivo, muchas veces como resultado de un tratamiento con gonadotropinas. La hiperestimulación del ovario es potencialmente mortal y estos análogos se unen a los receptores para FSH o a los receptores tanto para FSH como para LH, para suprimir el posterior desarrollo ovárico.

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan usos para mejorar la fertilidad en seres humanos y en animales con el nuevo método para inhibir la actividad de lutropina usando una inmunización activa o pasiva. Estudios previos han demostrado que el bloqueo de las acciones de LH da lugar a la inhibición de la fertilidad. En el presente documento se muestra que se pueden usar anticuerpos contra LH apropiados para restablecer o para estimular la fertilidad. Esta estrategia debe disminuir el riesgo de una hiperestimulación y debe permitir una regulación más normal de la fertilidad con un seguimiento menor. Se proporcionan varios métodos para producir y realizar ensayos de los anticuerpos o antisueros necesarios para promover la fertilidad.

Se encuentran disponibles otros métodos para alterar el cociente FSH/LH que incluyen métodos para administrar FSH o para proporcionar antiestrógenos. Sin embargo, el procedimiento que aquí se describe, basado en el uso de anti-LH presenta importantes ventajas sobre estos otros métodos. El grado de inhibición máxima se puede determinar como precaución para cada uno de los anticuerpos mediante realización de ensayos in vitro. Así pues, independientemente de la cantidad de anticuerpo administrado, se podría prevenir la inhibición de la actividad de LH por debajo de un nivel predeterminado mediante la elección adecuada del anticuerpo. Por ejemplo, B105 disminuiría los niveles eficaces de hLH en un factor de aproximadamente 4 mientras que B110 disminuiría los niveles eficaces de hLH en un factor de aproximadamente 2. La disminución de los niveles de LH permitirá que los niveles de FSH suban. A medida que los niveles de FSH suben, provocarán el desarrollo folicular y la producción de estrógenos. Cuando estos niveles hayan alcanzado las concentraciones fisiológicas características de un desarrollo folicular adecuado, inhibirán negativamente la secreción de más FSH. Por lo tanto, el tratamiento que aquí se describe mantiene los aspectos valiosos de una autorregulación que se pierden en los métodos existentes que dependen de la administración de FSH o de anti-estrógenos para estimular la fertilidad. Además, a diferencia de la inducción de la ovulación con GnRH (hormona liberadora de gonadotropina) (del inglés, " Gonadotropine Releasing Hormone") o con análogos de GnRH, el método basado en anti-LH no requiere la infusión pulsátil de una hormona o de un análogo hormonal. Este tratamiento ofrece la ventaja potencial de realizar un único tratamiento o como mucho unos pocos tratamientos a lo largo de algunos días. Esto será particularmente importante para regular la ovulación en seres humanos o animales. En seres humanos, este método debe ser más adecuado para el tratamiento de la enfermedad ovárica poliquística que frecuentemente se caracteriza por unos niveles de LH inapropiadamente elevados. A medida que los niveles de LH disminuyan, los niveles de FSH subirán y tendrá lugar el desarrollo folicular. Sin embargo, a medida que el desarrollo folicular tiene lugar, los niveles crecientes de estrógenos bloquearán la secreción de FSH adicional. Por lo tanto, se minimizará la tendencia a promover el desarrollo de demasiados folículos con sus peligrosas consecuencias potenciales.

En el presente documento se proporcionan también métodos para producir un inmunógeno específico que se basa en el uso de un molde y de anticuerpos de exclusión. El uso de estos anticuerpos permitirá diseñar una inmunorrespuesta específica dirigida contra dominios particulares de una proteína. Este método tendrá usos en la inducción o inhibición de la fertilidad según aquí se ilustra. Debido a que los anticuerpos contra hCG son capaces de inhibir el crecimiento tumoral, este método debe también ser útil para diseñar vacunas necesarias para inhibir el desarrollo o progresión de tumores que secretan hCG. El método debe también tener aplicación en cualquier sistema en el que se necesite un inmunógeno específico.

No hay nada que sea exclusivo en la estructura de los anticuerpos que los haga útiles para inducir la fertilidad a parte del hecho de que se unen a hLH o a otra LH. Por lo tanto, se podría esperar que porciones de anticuerpos que conservan la capacidad para unirse a LH tuvieran también una actividad similar. Estos anticuerpos incluirían los fragmentos Fab, los fragmentos (Fab')_{2} o anticuerpos monocatenarios. El fragmento Fab es una porción de un anticuerpo que contiene el sitio de unión a antígeno y que se genera mediante digestión con papaína. El fragmento (Fab')_{2} es una
porción de un anticuerpo que contiene dos sitios de unión a antígeno y que se genera mediante digestión con pepsina.

Preferiblemente, las administraciones de la composición farmacéutica para aumentar la fertilidad se llevan a cabo durante la fase folicular en el mamífero, y más preferiblemente durante la fase folicular del ciclo menstrual.

La hormona glicoproteica que ha de ser regulada en la presente invención es uno de los reaccionantes en una reacción que tiene lugar entre partes contrarias de una unión. Las partes contrarias de una unión son proteínas que presentan una afinidad de unión específica de la una por la otra. Una de las partes contrarias de la unión es un agente unible, que se selecciona entre el grupo que consiste en un antígeno y un hapteno. El agente unible preferido es un antígeno. La otra parte contraria de la unión es un agente que une, que se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo y una proteína de unión específica. El agente que une preferido es un anticuerpo.

Los antígenos son sustancias que en condiciones adecuadas son capaces de inducir la formación de anticuerpos y de reaccionar específicamente de una manera detectable con los anticuerpos así inducidos. Los antígenos pueden ser sustancias solubles, tales como toxinas y proteínas extrañas, o pueden ser sustancias en partículas, tales como bacterias o células de tejidos. En general, los antígenos son sustancias de alto peso molecular tales como proteínas y carbohidratos simples y conjugados.

Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulinas que poseen una secuencia de aminoácidos específica que les permite interaccionar únicamente con el antígeno que indujo su síntesis en el tejido linfático o con un antígeno estrechamente relacionado con ese antígeno. Las inmunoglobulinas son proteínas constituidas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas.

Los anticuerpos no neutralizantes usados en la presente invención se pueden administrar a mamíferos, p. ej., animales o seres humanos, en cantidades eficaces para proporcionar la actividad deseada. Debido a que la actividad de los compuestos y el grado del efecto terapéutico deseado varían, el nivel de dosificación del compuesto empleado también variará. La dosificación real administrada se determinará también por medio de factores generalmente reconocidos tales como el peso corporal del paciente y la hipersensibilidad individual del paciente particular. Así, la dosificación unitaria para un paciente particular (un hombre) puede variar desde aproximadamente 0,1 \mug por kg de peso corporal como mínimo, unidad de dosificación que el facultativo puede titular hasta conseguir el efecto deseado. Una dosis mínima preferida para la titulación es 1 \mug/kg de peso corporal.

La presente invención se ilustra más ampliamente por medio de los siguientes ejemplos que no tiene intención de limitar el alcance efectivo de las reivindicaciones. Todas las partes y porcentajes que aparecen en los ejemplos y a lo largo de esta memoria descriptiva están expresados por peso de la composición final salvo que se especifique lo contrario.

Aunque los métodos de vacunación y los métodos para diseñar una vacuna para estimular la fertilidad en mamíferos no están comprendidos en la presente invención, los Ejemplos referentes al desarrollo de antígenos eficaces en la inducción de la producción de anticuerpos contra LH, incluyendo los Ejemplos referentes a análogos útiles como uno de los compuestos de partida para el diseño de vacunas, se mantienen ya que una divulgación así es ilustrativa del diseño de los inmunógenos que inducen la producción de los anticuerpos útiles en la presente invención.

Agentes de unión que disminuyen las actividades biológicas de la hormona luteinizante y de la gonadotropina coriónica humana para permitir que sus actividades biológicas disminuyan hasta las proporciones deseadas Ejemplo 1 Uso de anticuerpos anti-LH para inducir fertilidad

Debido a que algunos anticuerpos anti-hormona inhiben la actividad biológica de las hormonas ya sea impidiendo que la hormona se una a los receptores o ya sea aumentando su metabolismo, estos anticuerpos serán útiles para disminuir el nivel de la hormona circulante activa. Los anticuerpos contra LH son capaces de aumentar el cociente de la FSH biológicamente activa entre la LH biológicamente activa circulantes. En parte, esto es porque estos anticuerpos disminuyen la actividad de LH. Además, debido a que la LH es una hormona que estimula la síntesis de sustratos esteroides que pueden ser convertidos en estrógenos (4), el descenso en la actividad de LH estará acompañado por un descenso en estrógenos. El descenso en los niveles de estrógenos disminuirá la inhibición de la secreción de FSH y los niveles de FSH subirán. A consecuencia de ello, en la hembra, el desarrollo folicular aumentará. En el macho, la espermatogénesis se multiplicará. No todos los anticuerpos tienen la capacidad para disminuir los niveles de LH de una manera no neutralizante. Los anticuerpos que neutralizan las acciones de LH en su totalidad restringirán la fertilidad a menos que se administren de una manera limitada (es decir, que la cantidad total de anticuerpo administrado sea menor que la cantidad total de LH circulante) y no están por lo tanto incluidos en el alcance de la presente invención. Para aumentar la fertilidad se prefieren anticuerpos no neutralizantes ya que se pueden administrar en exceso sobre la cantidad total de LH. Los anticuerpos no neutralizantes están incluidos en el alcance de la invención. Así pues, incluso cuando la mayor parte de LH pueda encontrarse unida a los anticuerpos, la actividad de LH disminuye pero no se neutraliza. Debido a que hay una cantidad de LH más que suficiente para el desarrollo folicular, la disminución parcial de la actividad de LH no impide el desarrollo folicular. Además, el aumento de estrógenos que se produce a medida que el folículo aumenta su desarrollo, imitarán el control de autorregulación normal de la secreción de FSH para prevenir una hiperestimulación ovárica. La administración de 10 \mug - 10 mg de un anticuerpo de alta afinidad (es decir, Ka > 5 x 10^{7} M^{-1}) será suficiente para inducir la fertilidad en mujeres que padecen la enfermedad ovárica poliquística. La identificación y caracterización de los anticuerpos convenientes se ilustra en el Ejemplo 2.

Ejemplo 2 Identificación y selección de los mejores anticuerpos contra LH

No todos los anticuerpos que inhiben la actividad de LH serán igualmente útiles para el tratamiento de la esterilidad. Por ejemplo, altas concentraciones en exceso de anticuerpos como B101 que se unen a hCG y a LH (aunque con menor afinidad) pueden impedir que estas hormonas se unan a los receptores para LH (22). Cuando están presentes en exceso, los anticuerpos que impiden la unión de LH o de hCG a sus receptores "neutralizan" la actividad biológica de la hormona. Aunque la neutralización de LH fuera seguida por un descenso de los niveles de andrógenos y estrógenos y por una subida de los niveles de FSH, debido a que la LH es necesaria para la fertilidad, la disminución de la actividad de LH por debajo del nivel mínimo necesario para la fertilidad impediría la fertilidad siempre y cuando hubiera un exceso de anticuerpo. De hecho, los anticuerpos neutralizantes o los antígenos que inducen la producción de anticuerpos neutralizantes se ha demostrado que inhiben la fertilidad en animales (10). Sería posible administrar cantidades limitadas de anticuerpos neutralizantes para disminuir las concentraciones de LH hasta un nivel predeterminado o para revertir el efecto inhibidor de un anticuerpo neutralizante administrando un anticuerpo anti-idiotipo. Sin embargo, debido a las variaciones interindividuales, sería difícil determinar cuanto anticuerpo se necesitaría para obtener el efecto deseado a menos que conviniera una inhibición casi completa de la actividad de LH o a menos que se realizaran medidas de FSH y/o de la función gonadal (p. ej., determinando los niveles de esteroides en plasma). Aunque estas medidas son posibles, la necesidad de realizar estas medidas disminuye el interés de usar anticuerpos que neutralizan por completo la actividad de LH con el fin de multiplicar la fertilidad. Los anticuerpos neutralizantes también se podrían administrar para prevenir temporalmente la acción de LH hasta que los niveles de FSH hayan subido. Entonces el exceso de anticuerpo neutralizante podría retirarse mediante la administración de un anticuerpo anti-idiotipo que neutralice los anticuerpos anti-LH para restablecer la fertilidad, o venciendo el efecto del anticuerpo usando LH o CG, o usando una cantidad de anticuerpo que estuviera lo suficientemente degradado como para permitir la acción de la subida intermenstrual de LH. Sin embargo, esta estrategia es más compleja que el uso de anticuerpos no neutralizantes, que se ilustra más delante.

Los anticuerpos usados en la presente invención inhiben la actividad de LH pero no son capaces de bloquear completamente su acción incluso cuando se administran en concentraciones suficientes para unir toda la LH presente en la circulación. Estos anticuerpos normalmente son capaces de unirse a toda la hormona libre así como a los complejos hormona-receptor. Inhiben la acción de la hormona bajando la afinidad de la hormona por su receptor, disminuyendo la actividad de la hormona unida y/o aumentando el aclaramiento de la hormona. Ejemplos de estos anticuerpos incluyen B105 y B110. Estos anticuerpos disminuyen las actividades biológicas de las hormonas en diferentes medidas (17) y se pueden adquirir procedentes de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, o procedentes de la UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, NJ. Otros anticuerpos comercialmente disponibles incluyen 518B7 (disponible procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de California en Davis, Davis, CA) y ZMCG7 (disponible procedente de la Pierce Chemical Co., 3747 North Meridian Road, Rockford, IL). Debido a que los complejos de estos anticuerpos con hCG pueden unirse a receptores, el grado de inhibición es limitado incluso en presencia de un exceso masivo de anticuerpos. La cantidad de inhibición se puede determinar con simples ensayos in vitro antes de usar estos anticuerpos in vivo. Por ejemplo, se ha demostrado que un exceso masivo de B110 disminuye la actividad de la hCG en sólo aproximadamente la mitad, mientras que un exceso masivo de B105 disminuye la actividad de hCG en aproximadamente sus tres cuartas partes. Cada uno de estos anticuerpos se une a hLH y sería de esperar que tuvieran la misma influencia sobre la actividad de hLH.

La identificación de los anticuerpos apropiados entre un grupo de anticuerpos monoclonales preparados contra hLH se puede realizar de la siguiente manera. Estos anticuerpos se pueden obtener por medio de procedimientos estándar (22, 27-32) inmunizando ratones con hLH, hCG o LH procedentes de otras especies, con fragmentos de LH o hCG, con LH o hCG parcial o totalmente desglicosiladas, o con análogos de LH o de hCH capaces de inducir una inmunorrespuesta frente a las especies de LH deseadas. Estos anticuerpos se podrían obtener haciendo una selección de anticuerpos fabricados por el hombre (33-36). Esta misma estrategia se podría usar para identificar anticuerpos contra una LH procedente de virtualmente cualquier otra especie. También se podrían usar para identificar antisueros que tuvieran propiedades similares. Estos antisueros se podrían prepara en respuesta a análogos de LH o de hCG o se podrían obtener mediante inmunoadsorción o mediante la retirada de componentes no deseados de los anticuerpos.

Los anticuerpos que poseen las características inhibidoras deseadas se pueden identificar midiendo sus capacidades para inhibir la unión de LH a receptores para LH. Este tipo de ensayo lo puede realizar un experto en la técnica de medir la unión a receptores y el siguiente ejemplo se refiere a cómo se seleccionarían anticuerpos contra hLH. Evidentemente, esto sería también aplicable a cualquiera de las especies de LH para las que existieran anticuerpos disponibles. Ya que la hLH se une perfectamente a receptores para LH de roedores, no es necesario usar receptores humanos para LH en este ensayo, aunque los receptores para LH humanos también servirían. Una primera etapa fácil es determinar la influencia del anticuerpo sobre la unión de hLH marcada radiactivamente a receptores para LH luteínicos de ovario de rata. La hLH marcada radiactivamente se puede preparar incubando 10 \mug de hLH con 500 \muCi de Na^{125}I durante 30 segundos a 4ºC, en un tubo de vidrio pequeño que ha sido revestido con 1,5 \mug de Iodo-Gen® (Pierce Chemical Co.). La ^{125}I-hLH y el ^{125}I que no ha reaccionado se separan mediante filtración en gel. Los receptores se pueden preparar administrando 50 IU de gonadotropina de suero de yeguas preñadas, también conocida como PMSG (del inglés, " Pregnant Mares Serum Gonadotropin") o de CG equina (obtenida procedente de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a ratas hembra Sprague-Dowley de 23-26 días de edad. La PMSG estimula el desarrollo folicular. Aproximadamente 56-65 horas después, a los animales se les administra 25 IU de hCG (también obtenida procedente de Sigma Chemical Co.) para provocar la formación de cuerpos lúteos. Los ovarios altamente luteinizados se extirpan una semana después y se homogeneizan en un tampón que contiene Tris 40 mM (pH 7,4) y MgCl_{2} 5 mM. Una fracción nuclear y de membranas en crudo de los homogeneizados se recoge centrifugando el homogeneizado a 1.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Esta fracción se lava una vez resuspendiéndola en el tampón de Tris-MgCl_{2} y sedimentándola de nuevo a 1.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. El sedimento final (denominado "sedimento de homogeneizado de ovario") se resuspende en el tampón de Tris-MgCl_{2} usando un volumen de 2 ml por cada uno de los ovarios presentes al comienzo de la homogeneización. Una cantidad de sedimento de homogeneizado de ovario aproximadamente igual a 1/20 parte de un ovario (es decir, más o menos 5 mg de material en 100 \mul de tampón) se añade a los tubos que contienen aproximadamente 1-2 ng de hLH marcada radiactivamente con yodo (es decir, aproximadamente 100.000 cpm) y diferentes cantidades de anticuerpo (es decir, cantidades que varían desde 1 pg hasta 10 \mug o más). Después de que los tubos se hayan incubado el tiempo suficiente para permitir que la LH marcada radiactivamente se una a los receptores (es decir, 30-60 min a 37ºC o toda la noche a temperatura ambiente), el receptor unido y los marcadores radiactivos libres se separan diluyendo la mezcla de reacción hasta 2 ml con una disolución de NaCl al 0,9%, centrifugando la mezcla y aspirando el sobrenadante. La cantidad de hLH marcada radiactivamente y unida a receptores para LH de ovario de rata se determina analizando el sedimento en un contador gamma. Se esperaría observar los tipos de inhibición mostrados en la Figura 1. Algunos anticuerpos inhibirán totalmente la unión de la hLH marcada radiactivamente en la misma medida que un exceso masivo de hLH o de hCG no marcadas, mientras que otros anticuerpos no inhibirán la unión o pueden incluso potenciar la unión cuando están presentes en un amplio exceso en moles en comparación con la hLH marcada radiactivamente. Estos dos tipos de anticuerpos son menos convenientes que los anticuerpos que suprimen la unión de hLH en un nivel intermedio (cónfer, Figura 1). Por lo tanto, los anticuerpos más útiles inhibirán la unión de la LH marcada radiactivamente pero no en la misma medida que un exceso masivo de LH no marcada. Los anticuerpos que inhiben la unión de la LH marcada radiactivamente en la misma medida que un exceso masivo de LH no marcada, serán también útiles pero se necesitará un cuidado mayor para tener la seguridad de que el anticuerpo no suprimirá demasiado la actividad de LH cuando se use in vivo. Si una cantidad excesiva de actividad de LH es neutralizada en la oleada de LH, se producirá esterilidad.

Otro procedimiento útil para identificar anticuerpos que presentan la capacidad deseada para disminuir la actividad de LH es realizar un ensayo in vitro para determinar si los anticuerpos inhiben el efecto de la hLH sobre la biosíntesis de esteroides. En este ensayo se pueden utilizar testículos de roedores macho. Un ejemplo típico en el que se usa hLH se ilustra en la Figura 2. Se prepara una suspensión en crudo de células de Leydig usando colagenasa según se encuentra descrito (37) y las células se incuban con cantidades variables de LH y de los anticuerpos que se han de ensayar. Después de aproximadamente 2-4 horas a 37ºC, el contenido en testosterona de los tubos se mide mediante radioinmunoensayo. Cuando concentraciones crecientes de hLH se incuban con las células de Leydig, estas concentraciones provocan una producción aumentada de testosterona y darán lugar a una curva típica de dosis-respuesta en la que concentraciones de hLH de 1 pM - 10 pM serán suficientes para elevar la producción de esteroides en aproximadamente el 50% del nivel máximo (véase Figura 2, curva A). Los anticuerpos más útiles se identifican por sus capacidades para inhibir la esteroidogénesis inducida por LH. Cuando diferentes anticuerpos monoclonales se añaden a la LH antes de que la hormona se añada a las células, se encontrará que algunos de ellos disminuyen la capacidad de la LH para estimular la formación de testosterona. Los anticuerpos inhibidores más útiles desplazarán la cuerva de dosis-respuesta hacia valores menos sensibles (véase la Figura 2, curvas B y C). Aunque el grado del desplazamiento dependerá inicialmente de la concentración de anticuerpo, un exceso masivo de anticuerpo (es decir, más de 100 veces mayor que la cantidad máxima de hLH usada) no impedirá la formación de testosterona inducida por LH. Los anticuerpos menos útiles impedirán la estimulación de la formación de testosterona cuando el anticuerpo está presente en un exceso de 100 veces en moles (véase la Figura 2, curva D). Este tipo de ensayo detectará anticuerpos que inhiben la actividad de LH disminuyendo su unión a receptores para LH y detectará también anticuerpos que inhiben la actividad de la LH unida. Ejemplos de anticuerpos útiles incluyen B105, B110, 518B7 y ZMCG7, anteriormente indicados. Estos anticuerpos necesitarán ser modificados según se describe más adelante antes de que puedan ser utilizados repetidas veces en mujeres.

Una vez que se han seleccionado los anticuerpos o antisueros y que se ha encontrado que satisfacen los criterios anteriormente descritos e ilustrados en las Figuras 1 y 2, se deben ensayar sus capacidades para inhibir las acciones de LH in vivo. Se administra a ratas macho un gran exceso de anticuerpo (es decir, 100 \mug o más). Veinte minutos después algunas de las ratas son tratadas con vehículo solo (controles) y a otras se les administra hLH o una LH que tenga una estructura igual o similar a la del animal en el que el anticuerpo se va a utilizar. Una hora después, los niveles de testosterona en plasma se miden mediante radioinmunoensayo. Un ejemplo típico se ilustra en la Figura 3. Los anticuerpos o antisueros útiles en la presente invención disminuirán la potencia de la hLH pero no impedirán su actividad ni siquiera cuando están presentes en un exceso sobre la cantidad total de LH administrada. Este ensayo detectará anticuerpos que disminuyen la actividad de la hormona inhibiendo la unión de LH a los receptores, inhibiendo la actividad de la LH unida, y/o aumentando el aclaramiento de LH. Independientemente de la causa de la inhibición in vivo, los anticuerpos útiles en la presente invención no impedirán la actividad de niveles elevados de LH ni siquiera cuando esos anticuerpos están presentes en exceso sobre la cantidad de LH circulante. Esto se puede detectar midiendo la capacidad del suero para unir hLH marcada radiactivamente con yodo después de la administración del anticuerpo. Una muestra de suero (0,01 \mul - 1 \mul) se diluye hasta 25 \mul con una disolución que contiene NaCl al 0,9%, albúmina de suero bovino en concentración de 1 mg/ml y tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2). A esto se añaden 25 \mul de LH marcada radiactivamente con yodo (aproximadamente 50 nCi que contienen aproximadamente 1 ng). La disolución resultante se incuba 30 minutos a 37ºC. Se añade una disolución de inmunoglobulina G (IGg) anti-ratón, procedente de cabra, (disponible procedente de Cappel, Organon Teknia Corp., West Chester, PA) que contiene 2 \mug de IgG en 50 \mul de la disolución de NaCl-albúmina anteriormente descrita, y la disolución resultante se incuba 90 minutos a 37ºC o durante toda la noche a 4ºC. A esta disolución se añaden 100 \mul de IgGsorb al 1% (obtenida procedente de The Enzyme Center, Inc., 36 Franklin St., Malden, MA) reconstituida en agua. Esta suspensión se mezcla durante 30 minutos a 22ºC y a continuación se diluye mediante adición de 3 ml de la disolución de NaCl-albúmina que está enfriada en hielo. La mezcla se centrifuga durante 10 minutos a 2.000 x g a 4ºC. El sobrenadante se aspira y la radiactividad del sedimento se mide en un contador gamma. Como control negativo, se usa suero de un animal que no ha sido sometido a inmunización ni activa ni pasiva. Como control positivo, se usa 0,1 ng - 1 ng del anticuerpo que se había inyectado al principio en el animal. La radiactividad medida en el sedimento del control negativo se resta de la radiactividad medida en el del control positivo y de la radiactividad medida en los sedimentos de las muestras de suero que están siendo ensayadas. Cuando se comparan los valores resultantes del control positivo y de las muestras de suero, el suero que contiene anticuerpo en exceso sobre LH será capaz de inmunoprecipitar al menos el 1%-10% de la LH marcada radiactivamente con yodo al igual que el control positivo.

La administración de anticuerpos contra hLH en seres humanos disminuirá las concentraciones eficaces de LH circulante. La cantidad máxima de disminución depende de lugar del sitio de unión del anticuerpo sobre la LH. La disminución de la actividad de LH baja la secreción de hormonas ováricas y testiculares y con ello disminuye la retroinhibición de FSH. En consecuencia, los niveles de FSH suben y la fertilidad se aumenta. Los anticuerpos contra hLH que presentan reacciones cruzadas con una LH procedente de otras especies o los anticuerpos que han sido seleccionados por sus capacidades para unirse a LH procedente de otras especies y para disminuir pero no suprimir la actividad de la hormona, tendrán efectos similares en esas otras especies. Los anticuerpos más adecuados para uso en seres humanos serán los que tienen regiones estructurales y regiones constantes que son similares a las de las inmunoglobulinas humanas y que son por sí mismo no antigénicos o sólo débilmente antigénicos cuando se inyectan en seres humanos. Se pueden preparar anticuerpos adecuados "humanizando" anticuerpos monoclonales de ratón (es decir, reemplazando las regiones estructurales y las regiones constantes de ratón con secuencias similares encontradas en inmunoglobulinas humanas). Los procedimientos para llevar esto a cabo son muy conocidos en la técnica (38-40). Otros métodos para fabricar anticuerpos adecuados incluyen la inmunización de primates tales como el mono Cynomolgus (41), seguida del aislamiento y clonación de linfocitos aislados (42). Las inmunoglobulinas de estos primates tienen regiones estructurales similares a las de las inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos monoclonales preparados a partir de estos animales deberían servir como un buen punto de partida de anticuerpos que se pueden usar en seres humanos.

Ejemplo 3 Métodos alternativos para obtener y seleccionar anticuerpos deseados

Muchos anticuerpos que son capaces de una inhibición parcial de la actividad de hLH presentan tendencia a unirse a hLH o a otras moléculas de LH que han sido adsorbidas en plástico o en otras superficies. Por lo tanto, el escrutinio de anticuerpos deseados muchas veces se facilita detectando las capacidades de los anticuerpos para unirse a hLH o a otras LH que se encuentran adsorbidas en placas de microtitulación de plástico, o a LH que se encuentra unida a complejos LH-receptor. El escrutinio de anticuerpos que se unen a la hLH que está adsorbida en una superficie de plástico se puede llevar a cabo de la siguiente manera. Los pocillos de una placa de microtitulación de plástico se revisten con 50 \mul de una disolución que contiene 0 \mug ó 1 \mug de hLH en NaCl al 0,9% - tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2). Esto permite que la hLH se adsorba en la superficie de la placa de microtitulación. Después de 1 hora a 37ºC, las disoluciones se retiran y se sustituyen con 200 \mul de NaCl al 0,9% - tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2) que contiene 200 \mug de albúmina sérica bovina, durante más de 1 hora a 37ºC. Esto rellena la mayoría de los sitios de adsorción restantes. La disolución de albúmina se retira y se sustituye con 50 \mul de NaCl al 0,9% - tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2) que contiene 50.000 dpm - 100.000 dpm del anticuerpo monoclonal a ensayar, marcado con ^{125}I. El marcaje del anticuerpo monoclonal se realiza usando Iodo-Gen u otro agente oxidante (22, 43), según se ha descrito en lo que antecede para el caso de LH, usando 10 \mug de anticuerpo y 500 \muCi de Na^{125}I, excepto que el tiempo de reacción se prolonga a 1-5 minutos. Después de una hora a 37ºC, el fluido se retira y la radioactividad que está adherida a la superficie de la placa de microtitulación se mide en un contador gamma. Los anticuerpos que presentan una alta probabilidad de ser útiles para inhibir la actividad de hLH se encontrarán unidos a los pocillos revestidos con hLH en cantidades mayores que los anticuerpos unidos a los pocillos no revestidos con hLH. Este ensayo asimismo detectará también otros tipos de anticuerpos y se debe realizar un nuevo escrutinio de los anticuerpos positivos según se describe más adelante o según se explica en el Ejemplo 2.

Aunque la unión a complejos LH-receptor no garantiza que un anticuerpo sea útil para neutralizar parcialmente la actividad de LH, muchos de los anticuerpos usados en la presente invención se unen a complejos LH-receptor. Por lo tanto, es posible realizar en principio un escrutinio con respecto a los anticuerpos convenientes midiendo sus capacidades para unirse a complejos LH-receptor. Este ensayo es esencialmente el mismo que el ensayo Bio-IRMA que ha sido descrito en trabajos previos (44) y se puede llevar a cabo de manera secuencial o simultánea. En el ensayo Bio-IRMA simultáneo, 0,025 \muCi - 0,1 \muCi del anticuerpo a ensayar marcado radiactivamente con yodo (es decir, preparado según se ha descrito anteriormente), se añade a un homogeneizado de ovarios de rata (es decir, preparado según se ha descrito anteriormente), y a cantidades crecientes de LH que incluyen 0 ng, 0,01 ng, 0,1 ng, 1,0 ng, 10 ng, 100 ng y 1.000 ng. Después de una hora a 37ºC, la parte membranosa del homogeneizado se precipita en forma de un sedimento mediante centrifugación a 1.000 x g durante 10-20 minutos, el sobrenadante se aspira y la radiactividad del sedimento se determina en un contador gamma. Los anticuerpos que se unen a complejos LH-receptor se detectarán por su capacidad aumentada para unirse a las membranas incubadas con al menos una de las concentraciones de LH, superior a la del blanco del ensayo (es decir, en ausencia de LH añadido). En el ensayo Bio-IRMA secuencial, las membranas se incuban con la LH primero durante a 1 hora a 37ºC, se lavan mediante centrifugación y aspiración según se ha descrito anteriormente y se incuban luego con 50.000 dpm - 100.000 dpm de anticuerpo marcado radiactivamente con yodo. Después de una incubación adicional de 1 hora a 37ºC, las fracciones que contienen el anticuerpo unido y el anticuerpo libre se separan mediante centrifugación y aspiración según se ha descrito anteriormente y se miden las cuentas del sedimento en un contador gamma. La mayoría de los anticuerpos útiles se unirán a los complejos LH-receptor. Sin embargo, este procedimiento es solamente un método de escrutinio útil y un ensayo más concluyente de un anticuerpo implica el uso de un ensayo biológico in vitro tal como el ensayo basado en la formación de testosterona que se describe en el Ejemplo 2.

La tendencia de la mayoría de los anticuerpos útiles a unirse a superficies que contienen LH o a complejos de LH y de receptores para LH también puede facilitar el aislamiento de linfocitos después de la inmunización de monos o ratones usando un procedimiento de revestimiento de superficies (del inglés "panning procedure"). En este procedimiento, los linfocitos se añaden a superficies de plástico que han sido revestidas con albúmina sérica humana o con otra proteína que previene la unión inespecífica exponiéndolas a disoluciones que contienen 1 mg/ml de albúmina sérica humana en NaCl al 0,9% - tampón de fosfato sódico 0,02 M (pH 7,2) durante más de 1 hora a 37ºC. Los linfocitos que no se unen a estas superficies se añaden luego a superficies que se revisten exponiéndolas a hLH y luego a albúmina sérica humana como en el caso anterior. La cantidad de hLH usada no es crítica siempre y cuando se haya adsorbido material suficiente en el plástico. Esto se puede conseguir usando 20 \mug - 50 \mug de hLH/ml. Sin embargo, también servirán cantidades mayores y cantidades menores. Los linfocitos que se adhieren a las superficies revestidas con LH se seleccionan y, o se fusionan con células de mieloma para preparar hibridomas (30), o se transforman con el virus de Epstein-Barr u otros virus, o se someten a clonación en el fago lambda (36), o se seleccionan células aisladas para clonación mediante reacción en cadena de la polimerasa (42). Los anticuerpos que se producen se someten a escrutinio según se ha descrito en el ejemplo 2. Estas estrategias aumentan el porcentaje de los anticuerpos
convenientes.

Muchos anticuerpos que son capaces de producir una inhibición parcial de LH se pueden también seleccionar a través de un procedimiento que depende de sus capacidades para unirse a LH que está unida a receptores para LH. Después de la inmunización de ratones o de monos con hLH, los esplenocitos y otros linfocitos se aíslan y se extienden sobre monocapas de células eucariotas que expresan receptores para LH. Estas monocapas celulares se pueden preparar transfectando células con vectores de expresión capaces de expresar el cDNA de receptores para LH de rata (45), humanos (46), porcinos (47), o de otras especies, mediante métodos estándar en la técnica (48, 49). Los linfocitos que se adhieren a las monocapas se desechan. Los linfocitos que no se adhieren a las monocapas se añaden a monocapas similares de células que expresan receptores para LH que contienen hLH u otra LH. Estas monocapas se pueden preparar añadiendo 100 ng de hLH o de otra LH a las monocapas durante toda la noche a 4ºC y retirando mediante lavado la hormona que no se unió. Los linfocitos que se adhieren a estas células se seleccionan y, o se fusionan con células de mieloma para preparar hibridomas (30), o se transforman con el virus de Epstein-Barr u otros virus, o se someten a clonación en el fago lambda (36), o se seleccionan células aisladas para clonación mediante reacción en cadena de la polimerasa (42). Los anticuerpos que se producen se someten a escrutinio según se ha descrito en el ejemplo 2. Estas estrategias también aumentarán el porcentaje de los anticuerpos convenientes. Aunque esta estrategia basada en receptores es más tediosa que una estrategia basada en el escrutinio de linfocitos sobre superficies de plástico revestidas con LH, rendirá un porcentaje más alto de anticuerpos útiles.

Ejemplo 4 Uso de un anticuerpo para tratar el síndrome del ovario poliquístico

El síndrome del ovario poliquístico (PCO) (del inglés, " PolyCystic Ovarian") se caracteriza por un desarrollo folicular incompleto y por una incapacidad de la mujer para ovular con normalidad. Este ovario contiene muchos folículos pequeños e inmaduros, de los cuales unos pocos si acaso alguno, progresan hasta el punto de la ovulación en ausencia de intervención clínica. Estas mujeres a menudo presentan andrógenos elevados y un cociente LH/FSH alto en comparación con las mujeres fértiles que tienen ciclos normales. Existen dos procedimientos principales para la inducción de la ovulación en mujeres con PCO. Estos procedimientos incluyen la administración de FSH para reforzar el desarrollo folicular o la administración de anti-estrógenos para facilitar la secreción de FSH por la adenohipófisis. Aunque ambos tratamientos son capaces de inducir la ovulación, presentan el riesgo de inducir ovulaciones múltiples debido a que evitan el bucle normal de la retroinhibición producida por estrógenos que regula la secreción de FSH. Como resultado de ello, las mujeres tratadas con estos agentes normalmente son cuidadosamente vigiladas para evitar una hiperestimulación, efecto secundario potencialmente letal del tratamiento.

La administración de 10 \mug - 10 mg de un anticuerpo no neutralizante contra LH que produce una subida transitoria y autolimitante de la secreción de FSH producirá la ovulación con menos riesgo de una hiperestimulación que el tratamiento con gonadotropina. El efecto es transitorio porque el anticuerpo será metabolizado o será eliminado de la circulación de alguna otra manera y su eficacia se perderá al cabo de 1-2 semanas después de la administración. El tratamiento es autolimitante porque el efecto de retroinhibición del estradiol sobre la secreción de FSH no será eliminado. Por lo tanto, a medida que los niveles de FSH suben y estimulan el desarrollo folicular, la secreción de estradiol subirá e inhibirá posteriores aumentos de la secreción de FSH.

Ejemplo 5 Inducción de la ovulación mediante tratamiento de una o dos dosis

No existen métodos buenos que se puedan usar para inducir la ovulación en mujeres con PCO y que impliquen solamente un tratamiento único o doble. La mayoría de los tratamientos de este síndrome requieren tratamientos múltiples con FSH, FSH más LH o hCG, hMG, anti-estrógenos, GnRH, o distintas combinaciones de estos agentes. Algunas estrategias han empleado también antagonistas de GnRH para disminuir los niveles circulantes tanto de LH como de FSH de manera que esa ovulación pudiera inducirse mediante tratamiento con hormonas exógenas. Una administración única de una concentración elevada del anticuerpo del tipo del que aquí se describe y se usa es capaz de inducir la ovulación. Esto es debido a que el anticuerpo se puede administrar sin riesgo en un exceso enorme y, ya que los anticuerpos tienen semividas plasmáticas largas, el anticuerpo seguirá siendo eficaz en el aumento de los niveles de FSH durante varios días. Debido al afecto de autorregulación natural del estradiol sobre la secreción de FSH, la secreción de FSH será controlada por los estrógenos fabricados por el folículo a medida que el folículo se desarrolla. Cuando llega el momento en que el folículo dominante se ha seleccionado y los niveles de estradiol han aumentado, gran parte del anticuerpo habrá sido eliminado de la circulación. El anticuerpo no interferirá con las acciones de la oleada de LH necesaria para la ovulación por una o más de varias razones. Primero, la cantidad de LH liberada está en exceso sobre la cantidad necesaria para la ovulación. Segundo, el anticuerpo únicamente disminuirá la actividad de LH, no la neutralizará. Y tercero, cuando llega el momento de la oleada de LH, gran parte del anticuerpo habrá sido eliminado de la circulación. Por lo tanto, al tratamiento con el anticuerpo le seguirá el desarrollo folicular y la ovulación.

Ejemplo 6 Antígenos que inducen antisueros inhibidores adecuados

La administración de anticuerpos apropiados ilustrada en el Ejemplo 1 se puede usar para aumentar la fertilidad. Sin embargo, debido a que ésa es una inmunización pasiva, se requerirá la administración repetida de anticuerpo para mantener altos los niveles de anticuerpo durante más de unos pocos días o semanas. Una elevación a corto plazo (p. ej., de días) es suficiente para inducir la ovulación en mujeres o para aumentar el número de ovulaciones en animales en uno solo o en unos cuantos ciclos. Cuando se desea suprimir parcialmente la actividad de LH y con ello aumentar la fertilidad durante períodos de tiempo más largos o durante varios ciclos, es útil inducir una inmunorrespuesta que provoque la formación activa de anticuerpos contra LH. Para obtener los anticuerpos más útiles, es necesario diseñar un inmunógeno capaz de inducir una respuesta contra a una porción de la molécula de LH similar a la reconocida por los anticuerpos B105, B110 o por otros anticuerpos que forman complejos con LH que conservan algo de actividad de LH. Los inmunógenos apropiados derivan de la subunidad \beta de LH debido a que esta subunidad es exclusiva para LH. La subunidad \alpha es común para LH, TSH y FSH. Su conformación parece diferir ligeramente en estas hormonas (21) y, por lo tanto, también se pueden preparar anticuerpos útiles frente a la subunidad \alpha. Sin embargo, el uso de los mismos no está comprendido en la presente invención debido a que los anticuerpos contra la subunidad alfa poseen el potencial de inhibir las acciones de las tres hormonas. Si la inmunorrespuesta se dirige contra hFSH, puede que no aumente la fertilidad y puede que produzca esterilidad. Cuando lo que se desea es someter a las mujeres una inmunización activa contra la hLH para aumentar la fertilidad, debe tenerse cuidado de evitar la inducción de anticuerpos contra hCG. Los anticuerpos contra hCG poseen el potencial de disminuir la fertilidad (véase más adelante). Esto normalmente no es un problema con la inmunización pasiva anteriormente descrita ya que los anticuerpos contra LH administrados normalmente son eliminados de la circulación antes del momento en el que la hCG es necesaria para la fertilidad.

Los antígenos capaces de inducir la formación de anticuerpos contra una porción de LH que no neutraliza su actividad (es decir, la inmunorrespuesta deseada) contienen una secuencia derivada de una porción de la subunidad \beta de LH. Frecuentemente ésta es una región de la subunidad \beta que queda expuesta después de que la LH se una a receptores para LH. Para ser más antigénicos, los inmunógenos deben contener también secuencias que son extrañas para la persona o animal que va a ser inmunizado. Si para la inmunización se usa la subunidad \beta completa de LH, se puede obtener una producción de anticuerpos que inhiben por completo la actividad de LH. Títulos altos de anticuerpos neutralizantes pueden producir esterilidad o pueden tener otras consecuencias negativas tales como inducir una menopausia prematura o una pérdida de tamaño o de función de los testículos. La mejor elección de los residuos de la subunidad beta de LH que se deberían incluir en el inmunógeno son los residuos que quedan expuestos cuando la hormona se une a los receptores para LH. Estos residuos incluyen la porción de la hormona cercana a los residuos 74-77, una región de la hormona que es reconocida por anticuerpos que se unen a las subunidades \beta de hLH o hCG y a los complejos hLH-receptor o hCG-receptor (26, 50). Las regiones de la subunidad \beta que no se deben usar para la inmunización incluyen las secuencias cercanas a los residuos 89-92 y 47-51. Éstos son los lugares de los sitios de unión de anticuerpos que neutralizan la actividad.

El diseño de un antígeno sintético mínimo incluye los residuos de la subunidad \beta de hLH que quedan expuestos cuando la LH se une a receptores para LH. Algunos de estos residuos incluyen Pro73-Arg74-Gly75-Val76-Asp77-Pro78-Val79-Val80-Ser81. Se pueden acoplar péptidos sintéticos que contienen estas secuencias a moléculas transportadoras grandes y se pueden usar para la inmunización empleando métodos muy conocidos en la técnica (14-16, 51-53). Los anticuerpos no neutralizantes producidos se unirán con hLH e inhibirán su actividad biológica.

Con frecuencia la capacidad de antígenos peptídicos pequeños para inducir una inmunorrespuesta con título alto es baja. A continuación se ilustra cómo crear un antígeno que sea más eficaz en la inducción de anticuerpos contra regiones de hLH que quedan expuestas cuando la hormona se une a receptores para LH. Una estrategia similar se podría utilizar para diseñar inmunógenos de cualquier proteína, incluyendo otras LH de vertebrados. Es de sobra conocido que los mejores inmunógenos son aquellos que difieren sustancialmente de las proteínas encontradas en un animal aunque todavía conservan la configuración terciaria del epítopo o de los epítopos para los que se desea inducir una inmunorrespuesta. Se puede fabricar un inmunógeno adecuado modificando la subunidad \beta de hLH de manera que i) conserve la capacidad para unirse a B105 y/o a otros anticuerpos que inhiben parcialmente las acciones de hLH, ii) pierda la capacidad de unirse a anticuerpos que neutralizan la actividad de LH, y iii) sea antigénico. También se pueden diseñar inmunógenos adecuados partiendo de una proteína distinta de la subunidad beta de LH y modificándola para que adquiera la capacidad de unirse a B105 y/o a otros anticuerpos que inhiben parcialmente las acciones de hLH. Los anticuerpos que inhiben parcialmente las acciones de hLH se denominan anticuerpos "molde" y se utilizan para detectar y/o realizar una selección positiva con respecto a la retención de los epítopos deseados. Son buenos ejemplos de anticuerpos "molde" aquellos anticuerpos que se ha encontrado que son eficaces para aumentar la fertilidad según se ha explicado en el ejemplo 2. Otros anticuerpos que se denominan anticuerpos de "exclusión" se usan para seleccionar frente a análogos de antígenos que contienen epítopos no deseados. Son ejemplos de anticuerpos de exclusión aquellos anticuerpos que neutralizan por completo la actividad biológica de hLH y/o los que impiden a la hormona unirse a su receptor.

Existen dos estrategias globales diferentes que se denominarán "A" y "B" para construir estos antígenos usando una estrategia de selección positiva/negativa basada en anticuerpos molde y anticuerpos de exclusión. En la estrategia "A", se parte de la subunidad \beta de LH y se usa una mutagénesis al azar para hacer substituciones en regiones de la molécula situadas fuera del epítopo reconocido por el anticuerpo "molde". Las nuevas moléculas que se producen son expresadas (véase más adelante) y se detectan sus capacidades para unirse al anticuerpo molde. Aquellas moléculas que siguen uniéndose al anticuerpo molde y que contienen mutaciones en otras regiones de la molécula se utilizan en una segunda ronda de mutagénesis realizada sobre una porción diferente de la molécula. Este procedimiento continúa hasta que todas las regiones de la proteína excepto la región implicada en el sitio de unión al anticuerpo (p. ej., a B105) han sido modificadas. Los análogos finales se unirán a los anticuerpos molde pero no a los anticuerpos de exclusión. En una variante de este procedimiento, se comienza con una quimera de hormonas que se une al anticuerpo molde. Estas quimeras se pueden preparar partiendo de una especie de LH diferente que se sabe que no se une a anticuerpos molde o que induce una inmunorrespuesta neutralizante contra hLH. Son ejemplos de este tipo de inmunógenos las quimeras de las subunidades \beta de LH humana y LH bovina. Estas quimeras incluyen las subunidad \beta de la LH bovina que ha sido modificada sustituyendo la prolina 74 con arginina, residuo encontrado en la subunidad \beta de la LH humana en esta posición. Regiones homólogas de la especie de LH diferente son sustituidas por residuos de hLH para crear el sitio de unión para los anticuerpos molde. Las regiones homólogas se identifican alineando las secuencias de la hLH y de la otra LH por las posiciones de sus residuos de cisteína altamente conservados según lo mostrado por Pierce y Parsons (1).

En la estrategia "B", se usa una molécula de región estructural que no está relacionada o que es sólo levemente similar a la estructura de las subunidades \beta de las hormonas glicoproteicas. Esta molécula puede incluir cualquier proteína que contenga estructuras en bucle tales como las que se encuentran en los pliegues de las inmunoglobulinas o entre las hélices de proteínas reunidas en un haz de cuatro hélices. La secuencia de uno de estos bucles es sustituida por la secuencia de hLH comprendida entre los residuos 65-85 mediante procedimientos estándar de mutagénesis. Cuando esta proteína se prepara en un vector de expresión en E. coli adecuado (p. ej., uno de los vectores T7 obtenible procedente de Novagen) se puede a ensayar con respecto a su capacidad para unirse a anticuerpos monoclonales que se unen a los complejos hLH-receptor. Debido a que solamente una porción de los residuos que forman el epítopo estará presente en la proteína expresada, su afinidad por el anticuerpo será más baja que la de la hLH.

Para mejorar la selectividad y la afinidad de las proteínas fabricadas en las estrategias "A" o "B", se puede usar un sistema de expresión en bacterias o en bacteriófagos (34, 36, 55-58). En cada uno de los casos, se preparan bibliotecas de análogos mutantes y se selecciona el mutante que presenta la afinidad más alta por B105, B110 o por otro anticuerpo molde similar que en el ejemplo 2 se haya encontrado que es útil. Además, se puede utilizar también una selección negativa usando anticuerpos o antisueros neutralizantes que en el ejemplo 2 se hayan encontrado que son útiles. Esto minimizará la capacidad del antígeno para inducir la producción de anticuerpos no deseados cuando el antígeno se usa en una vacuna.

La siguiente descripción se refiere a un método de selección basado en la presentación en fagos pero un experto en la técnica de fabricación y escrutinio de bibliotecas podría adaptarlo fácilmente a casi cualquier sistema de expresión. Uno de los sistemas que es susceptible a la selección es el basado en la transferencia de proteínas (59). También se pueden usar varios sistemas diferentes de presentación en fagos. Uno de esos sistemas implica el uso de un vector (es decir, pX-M13gIII) similar a phGH-M13gIII (34). Cuando se usa la estrategia "A" anteriormente tratada, este nuevo vector denominado pA-M13gIII contiene o una subunidad \beta de hLH o una quimera de hLH-subunidad \beta de LH en lugar de las secuencias que codifican la hormona de crecimiento de phGH-M13gIII (Figura 4). Cuando se usa la estrategia "B" anteriormente tratada, las secuencias que codifican la hormona de crecimiento de phGH-M13gIII son reemplazadas con un gen que codifica una molécula no relacionada con la subunidad \beta de hLH excepto por la inclusión de las secuencias que codifican la subunidad \beta de la hLH cercanas al residuo 74 para obtener un nuevo vector denominado pB-M13gIII. La secuencia codificadora de la región del vector que codifica las secuencias "B" también contiene sitios de restricción que permiten realizar una mutagénesis de casete u otros tipos de mutagénesis para permitir la introducción de secuencias aleatorias. Cuando se introducen secuencia aleatorias en las regiones codificadoras de los vectores pA-M13gIII o pB-M13gIII y estos vectores se usan para transformar E. coli, se creará una biblioteca de mutantes. Estas proteínas mutantes pueden ser expresadas sobre la superficie de partículas del fagómido M13 en forma de proteínas de fusión con el gen III añadiendo el fago auxiliar M13KO7 a la E. coli. Estas partículas de fagómido se unirán al anticuerpo en una proporción relativa a las afinidades que las proteínas "A" o "B" modificadas presentan por el anticuerpo. Uno de los métodos convenientes para seleccionar las partículas de fagómido que se unen a los anticuerpos molde es usar un protocolo de ensayo en fase sólida. En este ensayo, el anticuerpo molde se usa para revestir una superficie según se encuentra descrito (22) y seguidamente se añade una disolución que contiene las partículas de fagómido. Las partículas de fagómido que no se unan a la superficie se pueden desechar. Las partículas que se unen al anticuerpo sobre la superficie se pueden separar del anticuerpo mediante la adición de tampones de pH bajo (es decir, de pH 3) y se usa para transformar de nuevo E. coli. Cuando se desea realizar una selección negativa, se pueden sustituir los anticuerpos de molde por los anticuerpos de exclusión sobre la superficie. En este caso las partículas que se adhieren a la superficie se desechan. Este procedimiento se repite varias veces y a continuación las regiones codificadoras de los varios genes de las proteína "A" y "B" se someten a secuenciación de DNA. De esta manera se pueden identificar secuencias que son críticas para la unión del anticuerpo molde. Además, si se usan anticuerpos de exclusión, se puede realizar una selección contra epítopos no deseados. Asimismo, se pueden identificar sustituciones en otras porciones de la molécula que tengan un efecto escaso o nulo sobre la conformación de la región de unión del anticuerpo deseado. Cuando las moléculas codificadas por estas secuencias se usan para inmunizar animales o seres humanos, inducirán la formación de anticuerpos que presentan reacciones cruzadas con hLH. Ya que estos anticuerpos reconocerán una porción de la molécula que se sabe que está expuesta después de que la hLH se una a sus receptores, serán capaces de inhibir las acciones de hLH pero no pero impedirán por completo su actividad biológica.

En algunos casos puede no poder disponerse de anticuerpos molde y anticuerpos de exclusión. En estos casos se pueden crear un antisuero molde y un antisuero de exclusión los cuales pueden sustituir a esos anticuerpos usando la siguiente estrategia. Se preparan cuerpos lúteos de ovario de rata mediante tratamiento de ratas hembras con PMSG y hCG según se ha descrito anteriormente. Estos cuerpos lúteos se incuban con hLH para permitir que la hormona se una a los receptores para LH presentes en las membranas. Después las membranas se lavan para retirar la hLH libre y las membranas se incuban con el antisuero. Los anticuerpos que se quedan unidos a la hLH que está unida a los receptores para LH de la membrana se separan luego del resto del antisuero lavando las membranas. Estos anticuerpos son liberados mediante tratamiento de las membranas a un pH inferior a 5. Este tratamiento libera de los receptores tanto a los anticuerpos como a la hLH. Los anticuerpos se separan de la hLH mediante filtración en gel o mediante otro método y pueden luego usarse como moldes. Los anticuerpos que permanecen en el suero desprovisto de anticuerpos molde pueden utilizarse como anticuerpos de exclusión.

Ejemplo 7 Aumento de la actividad inmunológica

Durante una inmunización activa contra LH se está creando una respuesta autoinmunitaria dirigida a un sitio específico. Por lo tanto, es esencial usar proteínas que sean altamente antigénicas. Esto se puede facilitar usando la estrategia basada en molde/exclusión descrita en el ejemplo 6, para hacer al inmunógeno lo más extraño posible. Además, es conveniente hacer la molécula multivalente para aumentar las probabilidades de que interaccione con el sistema inmunológico. Un buen método para hacer la molécula multivalente es añadir residuos al extremo C-terminal o al extremo N-terminal que ocasionarán la formación de una hélice \alpha que puede formar una superhélice con otras moléculas. Las reglas para diseñar secuencias peptídicas que forman superhélices son muy conocidas en la técnica (60, 61). Además, también es posible usar secuencias presentes en la naturaleza, procedentes de proteínas que se sabe que forman superhélices tales como las encontradas en la proteína hemaglutinina del virus de la gripe, laminina, GCN4 o cualquiera de varias otras proteínas. También es posible añadir residuos al extremo C-terminal o al extremo N-terminal que darán como resultado la formación de una triple hélice similar a la encontrada en el colágeno. Estas triples hélices permitirán que tres o más moléculas de antígeno se unan. También se pueden utilizar otras estrategias para aumentar la antigenicidad del inmunógeno, que incluyen acoplar los inmunógenos por los extremos para fabricar una poliproteína. Según se ha descrito (Figura 5), es posible diseñar una proteína que tenga un número cualquiera de unidades repetidas usando esta estrategia.

Los anticuerpos usados en la presente invención que proporcionan una inhibición no neutralizante de la actividad de LH, normalmente interaccionan bien con la subunidad \beta libre y con el heterodímero. Por lo tanto, en la preparación de inmunógenos para inducir la formación de estos anticuerpos, generalmente es conveniente partir de la subunidad \beta libre. Por el contrario, muchos anticuerpos preferidos que proporcionan una inhibición neutralizante de la actividad de la hCG, se unen al heterodímero \alpha,\beta mejor que a la subunidad \beta libre de hCG. Para inducir la formación de estos anticuerpos, muchas veces es útil partir de un inmunógeno que sea una proteína de fusión preparada acoplando el extremo C-terminal del péptido que comprende los residuos 1-114 de la subunidad \beta de hCG al extremo N-terminal de una proteína enlazadora flexible compuesta por seis unidades repetidas de glicina y serina que se repiten. El extremo C-terminal de esta proteína de fusión se acopla luego al extremo N-terminal de los residuos 1-96 de la subunidad \alpha bovina. Esto proporciona un único polipéptido que posee la conformación global de los residuos de la subunidad \beta encontrados en hCG y que se puede usar directamente para la inmunización o que se puede usar como compuesto de partida en el ejemplo 6. La administración de este antígeno se puede llevar a cabo de alguna manera que sea muy conocida en la técnica.
Esta manera incluye la inyección, inyección en adyuvantes y el acoplamiento del antígeno a un virus.

Ejemplo 8 Detalles de la estrategia de ensayo de la presente invención para hCG

1. Se obtienen anticuerpos neutralizantes o bien fabricando anticuerpos monoclonales o bien adquiriéndolos. También se pueden obtener antisueros neutralizantes inmunizando conejos u otros animales contra hCG. También es útil obtener anticuerpos o antisueros contra hLH.

2. Estos anticuerpos o antisueros se usan como moldes positivos y negativos para escrutar bibliotecas de mutantes de la subunidad \beta de hCG. Estas bibliotecas se pueden preparar mediante mutagénesis al azar de la subunidad \beta de hCG en regiones concretas de esta molécula. Nótese que es preferible usar una subunidad \beta de hCG que tiene perdido el extremo C-terminal o que tiene una secuencia diferente de esta parte de la molécula, para evitar seleccionar inmunógenos que sean no neutralizantes. Uno de los procedimientos convenientes implica el uso de técnicas de presentación en fagos, también listados más adelante. Sin embargo, la presentación en fagos no es esencial para que esta técnica sea efectiva.

3. Se permite que los mutantes se unan primero a los anticuerpos de selección negativa. En el ejemplo presente, concretamente el desarrollo de una vacuna contra hCG, esto implicaría la unión a los anticuerpos contra LH o a los antisueros contra LH para retirar los mutantes que son estructuralmente idénticos a LH.

4. Los mutantes que no se unieron a los anticuerpos de selección negativa, se permite luego que se unan a los anticuerpos de selección positiva, concretamente a los que se generaron mediante inmunización con hCG. Durante el procedimiento de selección positiva, se añade también la subunidad \beta libre de hCG para eliminar los anticuerpos que se unen a la subunidad libre y para limitar el procedimiento de selección a aquellos anticuerpos que son específicos para el dímero. Los mutantes que no se unen a los anticuerpos de selección positiva se desechan. En el caso de proteínas expresadas en fagos, los fagos se eluyen de los anticuerpos de selección positiva y se usan para infectar E. coli.

5. Este procedimiento se repite durante varias rondas para eliminar los potenciales inmunógenos que son capaces de unirse a los anticuerpos contra hLH y para excluir además a los inmunógenos que presentan una baja afinidad por los anticuerpos contra hCG. Las secuencias de DNA que codifican los inmunógenos se secuencian. Los inmunógenos que más difieren de la hCG aunque conservan la capacidad para unirse a anticuerpos o antisueros específicos para hCG con una afinidad alta, se usan posteriormente.

6. En caso necesario, se realiza una segunda ronda de mutagénesis para aumentar el número de diferencias entre el potencial inmunógeno y la hCG. El objetivo es diseñar un inmunógeno que difiera de la hLH y que difiera lo más posible de la hCG aunque conserve los aspectos clave de la estructura de la hCG que le permiten inducir la producción de anticuerpos neutralizantes con un título alto. Estos inmunógenos incluyen las regiones de la subunidad \beta diferentes al extremo C-terminal, que más difieren de la subunidad \beta de hLH.

7. Una vez que se han seleccionado los determinantes antigénicos mayores y únicos, el inmunógeno se hace multivalente. Existen varios métodos para llevar esto a cabo. Uno de estos métodos consiste en fusionar el determinante a una proteína que ya es multivalente por sí misma o que forma multímeros (p. ej., las inmunoglobulinas). Otro de los procedimientos es fusionar a la proteína residuos que forman superhélices y que promoverán la asociación. Siempre que sea posible, estos residuos procederán de proteínas naturales que sean conocidas por inducir una inmunorrespuesta (p. ej., proteínas asociadas con la gripe).

8.A. Es esencial conseguir títulos altos contra la molécula intacta de hCG si se desea prevenir la fertilidad. Esto puede requerir unir la hCG con una molécula que sea similar a una subunidad \alpha. La subunidad \alpha de otras glicoproteínas de mamíferos es adecuada como material de partida.

8.B. Una molécula que es también adecuada como punto de partida es una molécula que posea las propiedades convenientes de ser un péptido individual y que conserve la estructura del heterodímero. En este caso, es conveniente hacer también mutaciones en la porción de la molécula derivada de la subunidad \alpha.

8.C. Los inmunógenos se pueden producir usando cualquier método conveniente tal como la expresión en E. coli, levaduras o células de mamífero. No se requiere que los inmunógenos estén glicosilados. Los inmunógenos también pueden ser DNA o RNA. También pueden encontrarse integrados en las cubiertas de virus.

8.D. Tampoco se requiere partir de la subunidad \beta de hCG. Se puede partir de cualquier proteína. La clave es usar la estrategia basada en un molde para seleccionar las proteínas que se desean. Por ejemplo, se puede partir de un haz de cuatro hélices e incorporar las secuencias de aminoácidos procedentes de porciones de la subunidad \beta de hCG que están cerca de los residuos 38-57 y 91-92. Se puede también partir de una inmunoglobulina incluyendo una inmunoglobulina que sea un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo, dirigido contra un anticuerpo específico contra hCG.

La Figura 1 es una gráfica que ilustra la influencia de anticuerpos y antisueros sobre la unión de hLH marcada radiactivamente a receptores para LH. La Figura 1 ilustra la influencia de tres tipos diferentes de anticuerpos o antisueros sobre la unión de hLH a los receptores para LH. El anticuerpo "A" tiene un efecto escaso o nulo sobre la unión de la hormona a los receptores. Su principal influencia inhibidora potencial in vivo sería sobre el metabolismo de la hormona. En anticuerpo "B" tiene la capacidad de bloquear parcialmente la unión de hLH a los receptores para LH. Por lo tanto, aunque este anticuerpo sería inhibidor in vivo, ni siquiera un exceso muy grande de este anticuerpo en comparación con el nivel de LH sería incapaz de disminuir su actividad por debajo del 40% según aquí se demuestra. Nótese que se pueden producir anticuerpos diferentes que tienen capacidades diferentes para bloquear las actividades de LH, (p. ej., B105 y B110). El anticuerpo "B" es un ejemplo del tipo general de anticuerpo que es más útil in vivo. El anticuerpo "C" es un anticuerpo neutralizante debido a que a concentraciones altas es capaz de impedir la actividad de hLH. Debido a su potencial para impedir la actividad de LH, un exceso de este anticuerpo inhibiría la fertilidad.

La Figura 2 es una gráfica que ilustra la influencia de anticuerpos y antisueros sobre la capacidad de hLH para inducir la esteroidogénesis in vitro. La Figura 2 ilustra los efectos de tres anticuerpos sobre la capacidad de LH para inducir la síntesis de testosterona (es decir, la esteroidogénesis) en suspensiones de células de Leydig de testículos de rata. La curva "A" ilustra la capacidad de hLH para inducir la esteroidogénesis en ausencia de anticuerpos. La curva "B" ilustra la capacidad de la hLH para inducir la esteroidogénesis en presencia de un exceso masivo de un anticuerpo que es capaz de disminuir la actividad de hLH en aproximadamente 3 veces. La curva "C" ilustra la capacidad de la hLH para inducir la esteroidogénesis en presencia de un exceso masivo de un anticuerpo que es capaz de disminuir la actividad de hLH en aproximadamente 20 veces. La curva "D" ilustra la capacidad de la hLH para inducir la esteroidogénesis en presencia de un exceso masivo de un anticuerpo que es capaz de neutralizar la actividad de la hLH. La decisión de usar un anticuerpo "B" o "C" in vivo dependerá del cociente LH/FSH y de la medida en que se desea suprimir la actividad de LH. Cuando los niveles de hLH son altos y necesitan ser disminuidos al máximo, un anticuerpo "C" sería el preferido. Cuando los cocientes hLH/hFSH están sólo ligeramente elevados, un anticuerpo "B" sería el preferido. El uso de un anticuerpo "D" a dosis muy altas produciría la esterilidad. Se prevé que se descubrirá que muchos de los anticuerpos útiles poseerán la capacidad para disminuir la actividad de hLH o de otra LH en células de ovario igual que sucede en células de testículos.

La Figura 3 es una gráfica que ilustra la influencia de anticuerpos y antisueros sobre la capacidad de hLH para inducir la esteroidogénesis in vivo. La Figura 3 ilustra los efectos de tres anticuerpos diferentes sobre la formación de testosterona en machos cuando cantidades masivas de los anticuerpos se administran por vía i.v. antes de administrar diferentes cantidades de hLH también por vía i.v. En todos los ejemplos ilustrados, la cantidad de anticuerpo administrado excede enormemente a la cantidad de hLH en una relación en moles. Se esperaría encontrar efectos similares de estos anticuerpos sobre la esteroidogénesis en hembras. La curva "A" muestra el efecto de hLH sobre la esteroidogénesis en hembras en ausencia de anticuerpo. La curva "B" ilustra el efecto de una cantidad masiva de un anticuerpo que es capaz de inhibir la actividad de hLH en el 40% como máximo. La curva "C" ilustra la influencia de una cantidad masiva de anticuerpo que es capaz de inhibir la actividad de hLH en el 95% como máximo. La curva "D" ilustra los efectos de una cantidad masiva de un anticuerpo neutralizante.

La Figura 4 muestra vectores que se pueden usar en las estrategias de selección basadas en molde/exclusión. Estos vectores tienen un diseño similar al descrito por Bass y col. (34) y se preparan reemplazando las secuencias codificadoras de la hormona de crecimiento humana por secuencias de una quimera de hLH usando procedimientos de mutagénesis mediante reacción en cadena de la polimerasa, que son procedimientos estándar en la técnica, tal como el procedimiento SOEing descrito por Ho y col. (63). En esta Figura, "lac p" representa el promotor lac, stII representa la secuencia conductora, "hLH beta" representa la secuencia que codifica la subunidad beta de la LH humana desde el codón 1 hasta el codón 114, "M13 gen III" representa la secuencia codificadora de los codones 198-410 del gen de la proteína de M13 en el mismo marco de lectura que los codones de stII y de la subunidad beta de LH humana. "Resistencia a Amp" es el gen procedente de pBR322 que codifica la enzima \beta-lactamasa, "322 ori" es el origen de replicación procedente de pBR322 y "f1 ori" es el origen de replicación procedente de M13. Las mutaciones se harían en la porción "hLH beta" de este vector.

La Figura 5 muestra los tipos de inmunógenos que poseen una antigenicidad aumentada para su uso en la inmunización activa contra LH. Algunos de estos inmunógenos presentan la repetición en heptada que se sabe que forma una superhélice (recuadro A). Otros de estos inmunógenos presentan una repetición que se sabe que forma una triple hélice (recuadro B). Estos inmunógenos proporcionan una antigenicidad aumentada debido a que son poliméricos. Otros métodos para fabricar inmunógenos poliméricos incluyen preparar proteínas de fusión o con el extremo C-terminal (recuadro C) o con extremo N-terminal de las inmunoglobulinas (recuadro D). Un inmunógeno monocatenario que comprende una proteína de fusión de la subunidad \alpha bovina y de las subunidades \beta de hCG y de hFSH tendría una antigenicidad aumetada en seres humanos.

Ilustración A: Los codones de dos o más repeticiones en heptada se insertan en el marco de lectura entre el codón 114 y el codón de terminación de la subunidad \beta de LH o de una subunidad \beta análoga. El diseño de la repetición en heptada es similar al que se describe en la referencia 60. Cada repetición contiene 7 aminoácidos señalados en orden "A, B, C, D, E, F, G" que tienen las siguientes propiedades. Los aminoácidos A y D son hidrófobos y son leucina, isoleucina o valina. Los aminoácidos E y G son aminoácidos con carga. El aminoácido E debe tener la carga contraria a la del aminoácido G para formar homodímeros. Así, si E es glutamato, G debe ser lisina. Los aminoácidos "B, C, F" pueden ser prácticamente de cualquier tipo que favorezca la formación de hélices. Por lo tanto, deben contener un número bajo, si acaso alguno, de prolinas o glicinas.

Ilustración B: Los codones de 6 o más repeticiones de tripletes de aminoácidos se insertan en el marco de lectura entre el codón 114 y el codón de terminación de la subunidad \beta. Estos tripletes codifican los aminoácidos glicina, X, Y, de los que X e Y son cualquier aminoácido que se sabe que forma parte de la secuencia del colágeno que forma una triple hélice.

Ilustración C: Los codones correspondientes a la cadena pesada de la IgG se insertan inmediatamente en 5' con respecto al codón 1 de la subunidad \beta. Cuando estos genes se coexpresan con los de la cadena ligera lambda o kappa de IgG, provocarán la producción de una IgG que contiene dos subunidades \beta en su extremo C-terminal.

Ilustración D: Los codones correspondientes a la región de cadena pesada de IgG que carecen de la región variable y de la primera región constante se insertan en el marco de lectura entre el codón 114 y el codón de terminación de la subunidad \beta.

Ilustración E: Los codones correspondientes a una secuencia de repetición glicina-serina (es decir, la repetición GS), tal como la secuencia serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina-serina-glicina, se insertan en el marco de lectura entre el codón 114 y el codón de terminación de un análogo de subunidad \beta. El último codón de este análogo se convierte en el 126. A continuación, los codones 1-96 de la subunidad \alpha bovina o de otra subunidad \alpha, o los codones 1-92 de la subunidad \alpha humana, se insertan en el marco de lectura entre el codón 126 y el codón de terminación de la construcción de la subunidad \beta que contiene la cola de poli(glicina-serina). Esto da lugar a una gonadotropina de una sola subunidad que lleva en sí la estructura del heterodímero de la hormona glicoproteica.

Ilustración F: Los codones correspondientes a la subunidad \alpha humana, bovina, o de otras especies de vertebrados, o una secuencia análoga, se añaden entre el último codón y el codón de terminación de un gen que codifica una repetición en heptada que contiene solamente aminoácidos con carga positiva en las posiciones E y G de la repetición en heptada (es decir, Repetición en heptada n.º 1) usando métodos conocidos por toda persona experta en las técnicas estándar del DNA recombinante para la preparación y expresión de genes. Cuando este gen se expresa en células bacterianas o en levaduras, o en otras células u organismos eucariotas, producirá una proteína que llevará la repetición en heptada con carga positiva en su extremo amino terminal y una subunidad \alpha o un análogo de subunidad \alpha en su extremo carboxi terminal. Los codones de una repetición en heptada que codifica los aminoácidos con carga negativa de las posiciones E y G (es decir, Repetición en heptada n.º 2) se añaden entre el último codón y el codón de terminación de un análogo de subunidad \beta. Cuando este gen se expresa en bacterias o levaduras, o en otras células u organismos eucariotas, producirá una proteína que llevará una subunidad \beta o un análogo en su extremo amino terminal y la repetición en heptada con carga negativa en su extremo carboxi terminal.

Ilustración G: Esta ilustración muestra el heterodímero que se forma cuando las proteínas que tienen la forma descrita en la ilustración F se mezclan. Las secuencias de la repetición en heptada n.º 1 y de la repetición en heptada n.º 2 se eligen para propiciar la formación de heterodímeros y disminuir la formación de homodímeros.

Ilustración H: Se forman multímeros cuando los compuestos de las ilustraciones F y G se mezclan, debido a la combinación de las subunidades \alpha y \beta y a las repeticiones en heptada. En las ilustraciones A-H, "N" y "C" hacen referencia al extremo amino terminal y al extremo carboxi terminal de las proteínas. La "i" hace referencia a una unidad individual que se puede repetir varias veces. Nótese también que aunque las repeticiones en heptada aquí ilustradas son idénticas, el uso de repeticiones idénticas no es esencial. Existe una gran cantidad de proteínas que contienen repeticiones en heptada no idénticas y que son capaces de formar homodímeros o heterodímeros (60).

Gonadotropinas monocatenarias con actividad de lutropina Ejemplo 9 Preparación y uso del Análogo nº 1 (cónfer, Tabla 1), una gonadotropina monocatenaria con actividad de lutropina (Véase la Figura 6)

Las secuencias codificadoras del análogo n.º 1 listadas en la Tabla 1 se pueden sintetizar usando la estrategia basada en la ligación de bloques que se encuentra descrita (54) o se pueden preparar partiendo de las secuencias codificadoras de la subunidad \beta de hCG y de la subunidad \alpha humana. Estas secuencias se pueden clonar procedentes de una biblioteca de cDNA de placenta humana. Las secuencias que codifican el péptido señal procedentes de la subunidad \alpha humana se delecionan y las secuencias codificadoras de las proteínas se empalman entre sí utilizando la técnica SOEing (63) de la siguiente manera: Un cebador nº 1 (100 ng)que tiene la secuencia 5'-ATGAAATCGACGGAAT
CAGACTCGAGCCAAGGATGGAGATGTTCCAGGGGCTGCT-3' y un cebador nº 2 (100 ng) que tiene la secuencia 3'-GGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGACCATCG-5' se mezclan con el cDNA de la subunidad \beta de hCG (1 \mug) que hace de molde y se realiza una PCR durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa adquirida procedente de Stratagene, LaJolla, CA, y trifosfatos de los didesoxinucleótidos y un tampón para PCR según se encuentra descrito (63). Un cebador nº 3 (100 ng) que tiene la secuencia 5'-GGATCCGGTAGCGGATCTGGTAGCGCTCCTGATGTG
CAGGATTGCCCA-3' y un cebador nº 4 (100 ng) que tiene la secuencia 3'-ACGTCATGAACAATAATAGTGTT
TAGAATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5' se mezclan con el cDNA de la subunidad \alpha humana (1 \mug) que hace de molde y se realiza una PCR durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa y trifosfatos de los didesoxinucleótidos y un tampón para PCR según se encuentra descrito (63). Estas dos reacciones de PCR dan lugar a productos que sirven como moldes intermediarios en una tercera (y última) reacción de PCR que da lugar a las construcciones deseadas en una forma adecuada para clonar. La reacción de PCR final se realiza mezclando 1 \mul de los productos procedentes de las dos primeras reacciones de PCR junto con un cebador n.º 5 que tiene la secuencia 5'-ATGAAATCGACGGAATCA
GACTCGAGCCAAGG-3' y un cebador n.º 6 que tiene la secuencia 3'-ATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGAT
TAGGCCT-5' durante 25 ciclos de temperaturas de 94ºC (30 segundos), 50ºC (60 segundos), 72ºC (60 segundos) usando la Pfu-DNA-polimerasa, trifosfatos de los didesoxinucleótidos adicionales y un tampón para PCR. El producto de la PCR final se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BglII y se liga en el pSVL (vector de expresión obtenido procedente de Pharmacia (Piscataway, NJ) que se había digerido con XhoI y BamHI para crear un vector que dirigirá la síntesis del Análogo 1. El sitio XhoI del producto de la PCR se ligará al sitio XhoI del pSVL y el sitio de la BglII del producto de la PCR se ligará al sitio BamHI del pSVL. El sitio XhoI se regenerará y los sitios BglII y BamHI serán eliminados. Las secuencias de las regiones codificadoras (es decir, las situadas entre los sitios XbaI y KpnI, cónfer, Figura 6) de varias construcciones se determinan hasta que se encuentra una de ellas que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos deseada, ilustrada en la Figura 6. Esto se hace para eliminar los posibles errores que surgen como resultado de la PCR y demás manipulaciones del DNA y es una precaución estándar para estar seguros de que se obtiene la secuencia deseada. Se espera que la proteína expresada carezca de los residuos de aminoácidos MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que son la parte de la secuencia señal encontrada en la subunidad \beta de hCG y que son retirados por la célula durante la síntesis de proteínas. Este vector se expresa en células COS-7 según se encuentra descrito (64) y la proteína liberada en el medio se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir la unión de la hCG marcada radiactivamente con yodo a anticuerpos monoclonales o a anticuerpos preparados contra hCG. La proteína fabricada por las células COS-7 competirá con la hCG marcada radiactivamente con yodo por la unión a uno o más de los siguientes anticuerpos: B101 (obtenido procedente de Columbia University), B105 (obtenido procedente de Columbia University), B07 (obtenido procedente de Columbia University), B109 (obtenido procedente de Columbia University), A201 (obtenido procedente de Columbia University), HCU061 (obtenido procedente de Hybritech), HCZ107 (obtenido procedente de Hybritech), o HCO514 (obtenido procedente de Hybritech), ZMCG18 (obtenido procedente de Pierce), ZMCG13 (obtenido procedente de Pierce) o ZMCG7 (obtenido procedente de
Pierce) o 518B7 (obtenido procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG marcada radiactivamente por unirse a receptores dispuestos sobre el cuerpo lúteo según lo descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Sería de esperar que esto estimule la formación de testosterona en un ensayo con células de Leydig realizado de manera similar al descrito por Moyle y col. (37) y que estimule la ovulación en animales hembra y que estimule la formación de testosterona en mamíferos macho. También sería de esperar que este análogo fuera un buen punto de partida para usar en una vacuna anticonceptiva usando la estrategia basada en moldes descrita en el Ejemplo 11. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como Análogo nº 1 y contiene una secuencia enlazadora de GSGSGSGS. Esta secuencia enlazadora se puede modificar digiriendo el vector de expresión con las enzimas endonucleasas de restricción ApaI y Eco47III, desechando el trozo corto, ligando una casete de un DNA bicatenario sintético con los codones de aminoácidos deseados que contiene cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos en el sitio ApaI/Eco47III mediante métodos estándar, secuenciando la región situada entre el ApaI/Eco47III para confirmar que las mutaciones deseadas se han realizado, y expresando la proteína en células COS-7. Esto se puede realizar para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que esta proteína actúe como un monómero o se combine para formar homodímeros activos. Además, se esperaría que varias copias de la proteína se unieran para formar multímeros.

Ejemplo 10 Preparación y uso del Análogo nº 2, una gonadotropina monocatenaria con actividad de lutropina (Véase la Figura 7)

Las secuencias codificadoras correspondientes al Análogo nº 2 que aparecen listadas en la Tabla 1 se pueden sintetizar usando la estrategia basada en la ligación de bloques que se encuentra descrita (54) o se pueden preparar mediante PCR usando como molde los cebadores nº 1 y nº 7 y la construcción de expresión descrita en el Ejemplo 9 y en la Figura 6. La secuencia del cebador nº 7 es 3'-TGGTGGGGAACTGGACACTACTGGGCGCCCCTAGGCCATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se liga con el fragmento mayor del DNA obtenido digiriendo la construcción de expresión descrita en el Ejemplo 12 con XhoI y BamHI. Las secuencias de las regiones codificadoras situadas entre los sitios XhoI y BamHI de varias construcciones se determinan hasta que se obtiene una que se encuentra que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 7. Esto asegurará que no existen artefactos de clonación en la región que ha sido alterada. Se espera que la proteína expresada carezca de los residuos de aminoácidos MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA que son la parte de la secuencia señal que se encuentra en la subunidad \beta de hCG, y que son retirados por la célula durante la biosíntesis de proteínas. Este vector se expresa en células COS 7 y la proteína liberada en el medio se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir la unión de la hCG marcada radiactivamente con yodo a los anticuerpos monoclonales o a los antisueros preparados contra hCG. La proteína fabricada por las células COS-7 competirá con la hCG marcada radiactivamente con yodo por la unión a uno o más de los siguientes anticuerpos: B101 (obtenido procedente de Columbia University), B105 (obtenido procedente de Columbia University), B07 (obtenido procedente de Columbia University), B109 (obtenido procedente de Columbia University), A201 (obtenido procedente de Columbia University), HCU061 (obtenido procedente de Hybritech), o HCO514 (obtenido procedente de Hybritech), ZMCG18 (obtenido procedente de Pierce), ZMCG13 (obtenido procedente de Pierce) o ZMCG7 (obtenido procedente de Pierce) o 518B7 (obtenido procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG marcada radiactivamente por unirse a receptores dispuestos sobre el cuerpo lúteo según lo descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Sería de esperar que esto estimule la formación de testosterona en un ensayo con células de Leydig realizado de manera similar al descrito por Moyle y col. (37) y que estimule la ovulación en animales hembra y que estimula la formación de testosterona en mamíferos macho. También sería de esperar que este análogo fuera un buen punto de partida para usar en una vacuna anticonceptiva usando la estrategia basada en moldes descrita en el Ejemplo 8. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como el Análogo n.º 2 y contiene una secuencia enlazadora de GSGSGSGS. Esta secuencia enlazadora se puede modificar digiriendo el vector de expresión con las enzimas de restricción endonucleasas SstII y Eco47III, desechando el trozo corto, ligando una casete de un DNA bicatenario sintético que lleva los codones de aminoácidos deseados que contienen cualquier número de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos, en el sitio SstII/Eco47III mediante métodos estándar, secuenciando la región situada entre el SstII/Eco47III para confirmar que las mutaciones deseadas se han realizado, y expresando la proteína en células COS-7. Esto se puede realizar para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que esta proteína actúe como un monómero o se una para formar homodímeros activos. Además, se esperaría que varias copias de la proteína se unieran para formar multímeros.

Ejemplo 11 Preparación y uso del Análogo nº 3, una gonadotropina monocatenaria con actividad de lutropina (Véase la Figura 8)

Las secuencias codificadoras del Análogo nº 3, listadas en la Tabla 1, se pueden sintetizar usando la estrategia basada en la ligación de bloques que se encuentra descrita (54) o se pueden preparar de la manera descrita para el Análogo nº 2 en el Ejemplo 10 a excepción de que los cebadores nº 1 y nº 7 se reemplazan con los cebadores nº 8 y nº 9, y de que el cDNA de la subunidad \beta de hLH se usa como molde en lugar del cDNA de la subunidad \beta de hCG. El cDNA de la subunidad \beta de hLH se puede obtener mediante escrutinio de una biblioteca de hipófisis humana. La secuencia del cebador nº 8 es 5'-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGAATGGAGATGCTCCAGGGGCTGCT-3' y la secuencia del cebador nº 9 es 3'-GTGGGGAACTGGACACTGGTGGGGGTTCCTAGGCCATCGCCTAGAC
CATCG-5'. El producto final de la PCR se digiere con las enzimas de restricción XhoI y BamHI y se subclona en los sitios XhoI/BamHI del vector de expresión creado como se describe en el Ejemplo 9. Las secuencias de las regiones codificadoras situadas entre los sitios XhoI y BamHI de varias construcciones se determinan hasta que se encuentra una que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 8. Se espera que la proteína expresada carezca de los residuos de aminoácidos MEMLQGLLLLLLLSMGGAWA que son la parte de la secuencia señal encontrada en la subunidad \beta de hLH, y que son retirados por la célula durante la biosíntesis de proteínas. Este vector se expresa en células COS 7 y la proteína liberada en el medio se ensaya con respecto a su capacidad para inhibir la unión de la hCG marcada radiactivamente con yodo a los anticuerpos monoclonales o a los antisueros preparados contra hCG. La proteína fabricada por las células COS-7 competirá con la hCG marcada radiactivamente con yodo por la unión a uno o más de los siguientes anticuerpos: B101 (obtenido procedente de Columbia University), B105 (obtenido procedente de Columbia University), A201 (obtenido procedente de Columbia University), HCU061 (obtenido procedente de Hybritech), ZMCG7 (obtenido procedente de Pierce) o 518B7 (obtenido procedente de la Dra. Janet Roser, Universidad de California en Davis). La proteína liberada en el medio competirá con la hCG marcada radiactivamente por unirse a receptores dispuestos sobre el cuerpo lúteo según lo descrito por Campbell, Dean-Emig y Moyle (64). Sería de esperar que esto estimule la formación de testosterona en un ensayo con células de Leydig realizado de manera similar al descrito por Moyle y col. (37) y que estimule la ovulación en animales hembra y que estimula la formación de testosterona en mamíferos macho. También sería de esperar que este análogo constituya un buen punto de partida para usar en el diseño de vacunas para aumentar o inhibir la fertilidad usando el procedimiento basado en moldes anteriormente descrito. Este análogo se muestra en la Tabla 1 como el Análogo nº 3 y contiene una secuencia enlazadora de GSGSGSGS. Esta secuencia enlazadora se puede modificar digiriendo el vector de expresión con las enzimas endonucleasas de restricción BamHI y Eco47III, desechando el trozo corto, ligando una casete de un DNA bicatenario sintético que lleva los codones de aminoácidos deseados que contienen un número cualquiera de codones de glicina o serina u otros codones de aminoácidos, en el sitio BamHI/Eco47III mediante métodos estándar, secuenciando la región situada entre el BamHI/Eco47III para confirmar que las mutaciones deseadas se han realizado, y expresando la proteína en células COS-7. Esto se puede hacer para optimizar la actividad de la gonadotropina monocatenaria. Se espera que esta proteína actúe como un monómero o se una para formar homodímeros activos. Además, cabría esperar que varias copias de la proteína se unieran para formar multímeros.

Ejemplo 12 Preparación de un análogo de subunidad \alpha que carece de sitios de glicosilación (Véase la Figura 9)

Se espera que los análogos 1-3 contengan 4 oligosacáridos ligados a asparagina ya que contienen 4 grupos de codones para la secuencia Asparagina-X-Treonina-Serina en la que X es cualquier aminoácido excepto prolina. La retirada de los oligosacáridos ligados a asparagina, en particular los de la subunidad \alpha, se ha observado que disminuye la eficacia de la hormona. Las señales de glicosilación ligadas a asparagina se pueden retirar de la porción de la subunidad \alpha de las gonadotropinas monocatenarias usando una PCR según aquí se describe. Un cebador 16 de PCR que tiene la secuencia: 5'-TGCTTCTCTAGAGCATATCCCACTCCACTAAGGTCCAAGAAGACGATGTTGGTCCAAAAGCAAGTCACCT-3' y un cebador 17 de PCR que tiene la secuencia: 3'-CAAAGTTTCACCTCGTTGTGTGCCGCACGGTGACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTCCATGGCCATG-5' se usan en una reacción de PCR con el vector que es capaz de dirigir la expresión del Análogo 1 y que se describió en el Ejemplo 9 y en la Figura 6. Después de 25 ciclos en las condiciones descritas en el Ejemplo 9, el producto de la PCR y el vector de expresión se digieren con XbaI y KpnI. El fragmento pequeño producido en la digestión del vector se desecha y el producto de la PCR digerido se liga en el vector en su sitio. Esto produce un vector de expresión que codifica el Análogo 11, un análogo que contiene únicamente 2 señales de glicosilación ligadas a Asn pero que se espera que conserve su afinidad por los anticuerpos y antisueros que se unen a hCG. Se espera también que conserve su afinidad por los receptores para LH, mostrada mediante su capacidad para competir con hCG por la unión a membranas procedentes de cuerpos lúteos de rata. Sin embargo, se espera que presente una capacidad disminuida para inducir la transducción de señales, especialmente cuando se determine su capacidad para inducir una acumulación de AMP cíclico (37). Es posible crear derivados similares de los Análogos 2 y 3 en los que los oligosacáridos se han retirado de la porción de la proteína derivada de la subunidad \alpha, digiriendo cada uno de los vectores de expresión con BamHI y KpnI, desechando el fragmento más pequeño, y ligando el fragmento pequeño BamHI/KpnI obtenido mediante digestión del Análogo 11. De esta manera, el Análogo 2 se convertiría en el Análogo 12 y el Análogo 3 se convertiría en el Análogo 13. Nótese que también sería posible retirar sólo una de las dos señales de glicosilación presentes en la porción de la gonadotropina monocatenaria, derivadas de la subunidad \alpha, simplemente cambiando las secuencias de los cebadores 16 y 17 durante su síntesis y siguiendo el protocolo aquí descrito. Cada uno de estos análogos exhibiría la misma unión a anticuerpo y a receptor que sus precursores. Presentarían una eficacia disminuida y a consecuencia de ello, inhibirían la transducción de señales. Los análogos 11, 12 y 13 disminuirían la actividad de LH y estimularían la fertilidad cuando se administraran en la primera parte de la fase folicular del ciclo menstrual. Disminuirían la actividad de hCG e impedirían la fertilidad cuando se administrasen cerca del momento en el que se espera la menstruación.

Ejemplo 13 Preparación del Análogo 1a que carece de oligosacáridos ligados a asparagina (Véanse las Figuras 10 y 11)

La eficacia de las gonadotropinas es proporcional a su contenido en carbohidratos y aunque los Análogos 11, 12 y 13 poseen una eficacia más baja, es posible disminuir aún más su eficacia eliminando todas las cadenas de oligosacárido. Las cadenas de oligosacárido ligadas a asparagina se pueden eliminar del Análogo 11 mediante una PCR SOEing (63) usando los cebadores 1 y 18 en una de las reacciones y los cebadores 2 y 19 en una segunda reacción. El vector de expresión del Análogo 11 se utiliza como molde en ambas reacciones. La secuencia del cebador nº 18 es 5'-CGGGGTAGGTTCGGTGGGACCGACACCTCTTCCTCCCGACGGGG-3' y la secuencia del cebador nº 19 es: 3'-GTGGAGAAGGAGGGCTGCCCCGTGTGCATCACCGTCAACACCACCATC-5'. Después de 25 ciclos a 94ºC (30 s), 55ºC (60 s) y 72ºC (60 s), 1 \mul de cada una de las reacciones de PCR se mezcla con el cebador nº 5 y con el cebador adicional nº 2, con tampón recién preparado, con enzima y con los trifosfatos de los desoxinucleótidos. El producto de la reacción después de 25 ciclos adicionales se corta con XhoI y BamHI y con él se sustituye el DNA original que se encuentra entre los sitios XhoI/BamHI del vector que codifica el Análogo 11. Esto se lleva a cabo digiriendo el vector con XhoI y BamHI, desechando el fragmento pequeño y ligando luego el fragmento grande con el producto de la PCR digerido con Xho/BamHI. Unos cuantos clones se someten a secuenciación del DNA hasta que se obtiene el clon que codifica el análogo descrito en la Figura 11, denominado Análogo 1a. Cuando este análogo se expresa en células COS-7, la proteína que se fabrica será reconocida por los mismos anticuerpos y antisueros que el Análogo 1. El Análogo 1a se unirá también a los receptores para lutropina pero tendrá una eficacia disminuida en comparación con la hCG. Por lo tanto, será útil para disminuir la función de LH o hCG. Cuando se administre en las primeras etapas de la fase folicular del ciclo menstrual, el Análogo 1a disminuirá la síntesis de andrógenos. A consecuencia de ello, disminuirá la síntesis de estradiol, los niveles de FSH subirán y se estimulará la fertilidad. El Análogo 1a también será útil para inhibir la luteinización prematura del folículo. Cuando se administre en la fase lútea en aproximadamente el momento en el que se espera la menstruación, el análogo bloqueará las acciones de la hCG y servirá como inductor de la menstruación y como inhibidor de la fertilidad. El análogo 1a también servirá como un buen compuesto de partida para diseñar vacunas usando la estrategia basada en moldes anteriormente descrita.

Ejemplo 14 Preparación de otras gonadotropinas que carecen de oligosacáridos ligados a asparagina

El vector que codifica el Análogo 2a se prepara fácilmente a partir del Análogo 1a y del Análogo 12. El Análogo 1a se digiere con KpnI y MstII y el fragmento pequeño se desecha. El fragmento grande se liga por separado al fragmento pequeño preparado mediante digestión con KpnI-MstII del vector que codifica el Análogo 12. El Análogo 2a se unirá a los mismos anticuerpos y receptores que el Análogo 2. Sin embargo, sus capacidades para inducir la transducción de señales disminuirán. Por consiguiente, servirán como inhibidores. El Análogo 2a será eficaz principalmente para bloquear la unión de las hormonas a receptores para LH. Dependiendo del momento en el que se administra, el Análogo 2a inducirá fertilidad (es decir, cuando se administre en la primera fase del ciclo menstrual), o inhibirá la fertilidad (es decir, cuando se administre cerca del momento de la implantación o cerca del momento en el que se espera la menstruación). En este sentido los Análogos 1a y 2a presentarán actividades similares.

El vector que codifica el Análogo 3a se puede fabricar mediante una PCR SOEing (63) en la que el Análogo 13 hace de molde. La estrategia para el diseño de los cebadores es similar a la que se describe para la preparación de los cebadores usados para modificar el vector de expresión del Análogo 1a. Cuando el Análogo 3a se expresa en células COS-7, las proteínas que se fabrican será reconocidas por los mismos anticuerpos y antisueros que el Análogo 3. El Análogo 3a será útil para inhibir la actividad de las hormonas que se unen a receptores para LH. Como tal estimulará la fertilidad cuando se administre al principio de la fase folicular. El análogo 3a será útil como molécula de partida para diseñar la vacuna que se ha de usar para aumentar la fertilidad usando la estrategia basada en moldes y los anticuerpos capaces de neutralizar parcialmente la actividad de LH. El Análogo 3a será también útil como molécula de partida para diseñar la vacuna para prevenir la fertilidad usando la estrategia basada en moldes y los anticuerpos que son capaces de neutralizar la actividad de LH.

Ejemplo 15 Procedimiento típico para introducir un sitio de glicosilación en una gonadotropina

Debido a la influencia positiva de los residuos de oligosacárido sobre la estabilidad de las hormonas circulantes, frecuentemente es útil añadir cadenas de oligosacárido extra a las proteínas. La adición de oligosacáridos también se puede usar para prevenir interacciones no deseadas con anticuerpos o receptores. Las superficies de la proteína que no interaccionan con receptores son lugares útiles para añadir las cadenas de oligosacáridos que se van a usar para estimular la función de la hormona. Esto puede tener un efecto importante para modular las actividades de hormonas glicoproteicas monocatenarias o para modular las actividades de las hormonas glicoproteicas \alpha,\beta-heterodiméricas. Por ejemplo, la adición de una señal de glicosilación a la subunidad \beta de FSH en los residuos 71-73 para originar la creación de un oligosacárido ligado a asparagina en el residuo 71, dará lugar a una hormona con una actividad más alta. Por el contrario, la adición de un residuo de glicosilación en esta región de la proteína después de que los otros sitios de glicosilación hayan sido retirados, aumentará su actividad inhibidora. Los métodos para llevar a cabo la mutagénesis son métodos estándar en la técnica y varían desde la síntesis completa de las secuencias codificadoras mediante ligación de bloques de oligonucleótidos sintéticos (54) hasta la PCR SOEing (63). Ya se han proporcionado varios ejemplos de mutagénesis mediante PCR SOEing.

Ejemplo 16 Uso de secuencias diferentes de las derivadas de subunidades humanas

Los Análogos 1-3 y, en particular, los Análogos 1-3a se utilizarán como compuestos de partida para el diseño de vacunas dirigido con moldes. Para el desarrollo de vacunas específicas de hormonas, de uso en seres humanos, es útil fabricar análogos similares a los listados en la Tabla 1, con una subunidad \alpha no humana en lugar de la subunidad \alpha humana. Esto es debido a que la subunidad \alpha bovina hace a las proteínas más desemejantes a las hormonas humanas que los análogos listados en la Tabla 1. La estrategia para diseñar hormonas glicoproteicas monocatenarias es similar a la listada en los Ejemplos 9-11, a excepción de que las secuencias que codifican la subunidad \alpha humana ilustradas son sustituidas por las secuencias que codifican las subunidades \alpha no humanas. De manera similar, las señales de glicosilación se pueden retirar modificando cambiando los codones que codifican asparagina o serina o treonina, o insertando una prolina entre la asparagina y la serina o treonina.

Además, cuando para diseñar inmunógenos se utiliza la estrategia basada en moldes, con frecuencia es conveniente partir de una molécula no humana que tenga una afinidad baja, si no nula, por los moldes usados en la selección positiva, e introducir residuos que den como resultado la selección. Estos análogos se pueden preparar haciendo sustituciones con las secuencias de las subunidades \beta de FSH, LH o TSH procedentes de fuentes no humanas, poniéndolas en lugar de la secuencia de la CG humana ilustrada en los Ejemplos 9-15 y en la Tabla 1.

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TABLA 1 Estructuras de gonadotropinas monocatenarias

Análogo	Composición

1	n-hCG\beta(1-145)-Secuencia enlazadora-\alphahumana(1-92)-c
2	n-hCG\beta(1-114)-Secuencia enlazadora-\alphahumana(1-92)-c
3	n-hLH\beta(1-114)-Secuencia enlazadora-\alphahumana(1-92)-c
1a	n-hCG\beta(1-145)[N13X,N30X]-Secuencia enlazadora-\alphahumana (1-92)[N52X,N78X]-c
2a	n-hCG\beta(1-114)[N13X,N30X]-Secuencia enlazadora-\alphahumana (1-92)[N52X,N78X]-c
3a	n-hLH\beta(1-114)[N30X]-Secuencia enlazadora-\alphahumana(1-92) [N52X,N78X]-c

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Definiciones de las letras y secuencias de la Tabla 1

"n-" se refiere al extremo N-terminal de la proteína.

"-c" se refiere al extremo C-terminal de la proteína.

"hCG\beta(1-145)" se refiere a los residuos 1-145 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hCG:

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1

"hCG\beta(1-114)" se refiere a los residuos 1-114 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hCG:

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2

"hLH\beta(1-114)" se refiere a los residuos 1-114 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta de hLH:

3

"N13X" se refiere a la sustitución del residuo de asparagina 13 de la subunidad \beta de hCG por glutamina u otro aminoácido y análogos.

"N30X" se refiere a la sustitución del residuo de asparagina 30 de la subunidad \beta de hCG o de hLH por glutamina u otro aminoácido y análogos.

"N52X" se refiere a la sustitución del residuo de asparagina 52 de la subunidad \alpha humana por glutamina u otro aminoácido y análogos.

"N78X" se refiere a la sustitución del residuo de asparagina 78 de la subunidad \alpha humana por glutamina u otro aminoácido y análogos.

"\alphahumana(1-92)" se refiere a los residuos 1-92 de la secuencia de la subunidad \alpha humana:

4

"Secuencia enlazadora" se refiere a una secuencia que contiene los aminoácidos glicina y serina que se repiten tal como GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGDS, GSGSGSGSGS o cualquier otra secuencia de aminoácidos que permite que las secuencias de las subunidad \alpha y de la subunidad \beta de la gonadotropina monocatenaria formen un complejo en el que las porciones de la subunidad \alpha y de la subunidad \beta se unen con las porciones de la subunidad \alpha y de la subunidad \beta de la misma molécula o de otra molécula.

Notas referentes a la Tabla 1

1. El orden de los componentes de izquierda a derecha en la tabla es el orden en el que los componentes están presentes en la proteína desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxi terminal.

2. Debido a la alta conservación de la secuencia de todas las gonadotropinas de vertebrados, que se puede observar con el alineamiento de sus residuos de cisteína, se pueden preparar gonadotropinas monocatenarias mediante sustitución de las correspondientes porciones de las subunidades \beta de hCG, hLH y hFSH por cualquiera de los residuos homólogos.

3. La secuencia \alphahumana(1-92) puede ser sustituida por la secuencia de las otras subunidades \alpha de gonadotropinas de vertebrados. Esto incluye, pero no se limita a ellos, los residuos 1-96 de la subunidad \alpha bovina.

4. Como puede observarse, el orden de los componentes es que las secuencias derivadas de la subunidad \beta están en posición amino terminal con respecto a las secuencias derivadas de la subunidad \alpha. El orden de los componentes en la tabla se puede ser invertir de manera que las secuencias de las subunidades \alpha estén en posición amino terminal con respecto a las secuencias de las subunidades \beta.

5. Las secuencias de aminoácidos se muestran en forma del código estándar de una sola letra excepto cuando se indique.

6. Las secuencias codificadoras de todos estos análogos se pueden fabricar mediante métodos estándar del DNA recombinante que son muy conocidos en la técnica. Uno de los procedimientos para componer estas secuencias es el proporcionado por Campbell y col. (54). Estas secuencias se pueden expresar en células eucariotas mediante métodos muy conocidos en la técnica usando vectores que han sido diseñados para expresión en eucariotas y que se encuentran disponibles procedentes de In-Vitrogen, San Diego, CA. Los vectores que no contienen cadenas de oligosacáridos también se pueden fabricar en E. coli mediante métodos muy conocidos en la técnica usando vectores tales como los vectores pET que se pueden obtener procedentes de Novagen.

7. Los sitios de glicosilación situados en las asparaginas 13 y/o 30 de la subunidad \beta de hCG pueden ser destruidos mediante sustitución de esa asparagina según se ha ilustrado, y/o mediante sustitución de los residuos 14 y/o 31 con una prolina, y/o mediante sustitución de los residuos 15 y/o 32 con cualquier otro aminoácido distinto de serina o treonina.

8. El sitio de glicosilación situado en la asparagina 30 de la subunidad \beta de hLH puede ser destruido mediante sustitución de esa asparagina según se ha ilustrado, y/o mediante sustitución del residuo 31 con una prolina, y/o mediante sustitución del residuo 32 con cualquier otro aminoácido distinto de serina o treonina.

9. Los sitios de glicosilación situados en las asparaginas 52 y/o 78 de la subunidad \alpha humana pueden ser destruidos mediante sustitución de esa asparagina según se ha ilustrado, y/o mediante sustitución de los residuos 53 y/o 79 con una prolina, y/o mediante sustitución de los residuos 54 y/o 80 con cualquier otro aminoácido distinto de serina o treonina.

10. Los sitios de glicosilación situados en las asparaginas 56 y/o 82 de subunidades \alpha no humanas pueden ser destruidos mediante sustitución de esa asparagina con cualquier otro aminoácido, y/o mediante sustitución de los residuos 57 y/o 83 con una prolina, y/o mediante sustitución de los residuos 58 y/o 84 con cualquier otro aminoácido distinto de serina o treonina.

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TABLA 2 Propiedades y usos de los análogos ilustrados en la Tabla 1

Análogo	Actividad	Uso

1	LH	Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad en machos.
2	LH	Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad en machos.
3	LH	Induce la ovulación; Aumenta la fertilidad en machos.
1a	Anti-LH	*Facilita la ovulación; Pone fin a un embarazo;
		Disminuye la secreción de andrógenos.
2a	Anti-LH	*Facilita la ovulación; Pone fin a un embarazo;
		Disminuye la secreción de andrógenos.
3a	Anti-LH	*Facilita la ovulación; Pone fin a un embarazo;
		Disminuye la secreción de andrógenos.

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Los compuestos de la presente invención se pueden administrar a mamíferos, p. ej., animales o seres humanos, en cantidades efectivas para proporcionar el efecto terapéutico deseado. Debido a que la actividad de estos compuestos y el grado del efecto terapéutico deseado varían, el nivel de dosificación del compuesto empleado también variará. La dosificación real administrada vendrá también determinada por factores generalmente conocidos tales como el peso corporal del paciente y la hipersensibilidad individual del paciente particular.

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A lo largo de esta solicitud, se ha mencionado la referencia de diversas publicaciones.

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Claims

1. Uso de un anticuerpo no neutralizante que se une a la subunidad \beta de la hormona luteinizante y disminuye pero no elimina la actividad de hormonas glicoproteicas sobre el receptor para la hormona luteinizante incluso cuando está presente en una concentración que une la totalidad de dicha hormona glicoproteica presente, en la preparación de una composición farmacéutica para estimular la fertilidad en mamíferos hembra estimulando la producción de la hormona estimulante del folículo.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el mamífero es un ser humano y la hormona luteinizante es la hormona luteinizante humana.

3. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 2, en el que el anticuerpo se une a la subunidad \beta de la hormona luteinizante cuando la hormona luteinizante está unida a un receptor para hormona luteinizante.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo se une a uno de los residuos situados entre las posiciones 70-80 de la subunidad \beta de la hormona luteinizante.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo se une a uno de los residuos situados entre las posiciones 74-77 de la subunidad \beta de la hormona luteinizante.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que el anticuerpo se usa para regular la ovulación en hembras humanas.