BR102019004147A2 - Gonadotrofina coriônica equina recombinante (recg) biologicamente ativa e processo para obtenção da mesma, composição veterinária e uso - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se refere à produção de uma gonadotrofina coriônica equina recombinante (recg) biologicamente ativa, à uma composição veterinária compreendendo a recg, e ao uso da recg ou da composição compreendendo recg. a recg da presente invenção possui perfil de glicosilação semelhante àquele das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis e exibe nível de atividade in vivo correspondente ao ecg e semelhante ao dos hormônios fsh e lh. a presente invenção tem aplicação no campo da biotecnologia, mais especificamente, no campo de reprodução assistida veterinária, sendo especialmente adequada para ser utilizada para o tratamento de condições veterinárias relacionadas à reprodução e à ovulação de mamíferos, bem como para a fabricação de kits de diagnóstico ou como suplemento para o cultivo de células.
Description
[0001] A presente invenção se refere a um processo aperfeiçoado de produção da gonadotrofina coriônica equina recombinante biologicamente ativa, aqui referidas como reCG ou reCGα+β, à reCG produzida através do processo da presente invenção, a uma composição veterinária compreendendo a reCG, e ao uso da reCG ou da composição compreendendo reCG.
[0002] A reCG produzida apresenta perfil de glicosilação semelhante ao das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis, e exibe nível de atividade in vivo semelhante ao do hormônio luteinizante (LH, acrônimo em inglês para Luteinizing Hormone) e hormônio folículo-estimulante (FSH, acrônimo em inglês para Follicle Stimulating Hormone).
[0003] A presente invenção tem aplicação no campo da biotecnologia, mais especificamente, no campo de reprodução assistida veterinária, sendo especialmente adequada para ser utilizada no tratamento de condições veterinárias relacionadas à reprodução e à ovulação de mamíferos, para a fabricação de kits de diagnóstico ou como suplemento para o cultivo de células.
[0004] Atualmente, o Brasil encontra-se na privilegiada posição de maior produtor e exportador mundial de carne bovina, tornando a pecuária uma das atividades econômicas nacionais mais importantes e rentáveis. Este dado enfatiza a importância da pesquisa básica e tecnológica em reprodução bovina, especialmente na área de hormônios estimuladores da ovulação, tais como a gonadotrofina coriônica equina (eCG).
[0005] Diversos hormônios são utilizados em técnicas de reprodução assistida veterinária e, nos últimos anos, a gonadotrofina coriônica equina tem despontado como primeira opção na indução da ovulação em vacas em anestro gestacional, nos protocolos de Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF), visando melhorar os índices de fertilidade de fêmeas bovinas criadas em regime extensivo (SÁ FILHO et al., Equine chorionic gonadotropin and gonadotropin-releasing hormone enhance fertility in a norgestomet-based, timed artifical insemination protocol in suckled Nelore (Bos Indicus) cows. Theriogenology 2010; 73(5):651-8; FERREIRA et al.,Effect of different doses of equine chorionic gonadotropin on follicular and luteal dynamics and P/AI of high-producing Holstein cows. Anim Reprod Sci 2013; 140(1-2) 26-33; CARVALHO et al. Equine chorionic gonadotropin improves the efficacy of a timed artificial insemination protocol in buffalo during the nonbreeding season. Theriogenology 2013;79(3):423-8; BARREIROS et al., Dynamics of follicular growth and progesterone concentrations in cyclic and anestrous suckling Nelore cows (Bos indicus) treated with progesterone, equine chorionic gonadotropin, or temporary calf removal. Theriogenology 2014; 81 (5):651-6).
[0006] A eCG é especialmente utilizada em vacas de corte criadas em manejo extensivo, e vem sendo utilizada, também, em tratamentos superovulatórios de vacas e novilhas como uma opção eficaz de tratamento em animais irascíveis (MAPLETOFT et al., Recent advances in the superovulation in cattle. Reprod Nutr Dev 2002; 42(6):601 -11), visto que os tratamentos hormonais convencionais em bovinocultura adotam a utilização de oito doses de preparações comerciais purificadas do FSH porcino - Folltropin-V©, Bioniche© (dados obtidos na bula do produto).
[0007] A eCG é secretada pelo útero equino, mais especificamente pelos cálices endometriais, que são formados ao redor do quadragésimo dia de gestação, permanecendo até ao redor do octogésimo quinto dia. A secreção deste hormônio, que possui ação biológica semelhante tanto ao FSH quanto ao LH, estimula o desenvolvimento de folículos ovarianos na égua gestante. Alguns destes folículos ovulam, mas a maioria transforma-se em folículos luteinizados devido à ação semelhante ao LH. Tais corpos lúteos acessórios produzem a progesterona necessária para manter a prenhez na égua (HAFEZ E HAFEZ, Reprodução Animal. Editora Manole 2004; volume único).
[0008] A eCG utilizada atualmente para reprodução animal é purificada a partir de plasma de éguas gestantes (CHRISTAKOS E BAHL, Pregnant mare serum gonadotropin. Purification and physicochemical, biological, and immunological characterization. J Biol Chem 1979; 254(10):4253-61; MAPLETOFT et al., Recent advances in the superovulation in cattle. Reprod Nutr Dev 2002; 42(6):601-11), sendo comercializada como Folligon (Intervet); SincroeCG (Ourofino) e Novormon (Coopers), não existindo uma eCG recombinante comercialmente disponível.
[0009] Esta gonadotrofina única possui a capacidade de, em espécies heterólogas, ligar-se aos receptores tanto de FSH quanto de LH, e provocar o estímulo da foliculogênese (STEWART et al., Pregnant mare serum gonadotrophin: ratio of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone activities measured by radioreceptor assay. J Endocrinol 1976; 71(3):471-82; COMBARNOUS, Original hypothesis on the specificity of the binding of glycoprotein hormones to their receptors. C R Seances Acad Sci III 1981). Sua prolongada meia-vida plasmática, decorrente de sua alta quantidade de açúcares (MCINTOSH et al., Pregnant mare serum gonadotrophin: rate of clearance from the circulation of sheep. J Reprod Fertil 1975; 44(1):95-100), permite que uma única aplicação deste hormônio seja eficiente para induzir ovulação, poupando, deste modo, o tempo gasto com manejo, e, ainda, diminuindo possíveis estresses dos animais submetidos ao tratamento superovulatório (KIMURA et al., Successful superovulation of cattle by a single administration of FSH in aluminum hydroxide gel. Theriogenology 2007; 68(4):633-9).
[0010] Além da extração de gonadotrofinas ser uma tarefa laboriosa e dispendiosa, a falta de biossegurança do material resultante é bastante preocupante, visto que qualquer tentativa de purificação que preserve os hormônios glicoproteicos demonstra uma limitada capacidade de destruição de vírus resistentes (THARASANIT et al., Effects of recombinant human follicle stimulating hormone on follicle development and ovulation in the mare. Theriogenology 2006; 65(6):1071 -81). Além disso, pelo fato de ser um extrato biológico, existe uma grande variabilidade na atividade da glicoproteína entre os lotes de eCG, contribuindo, desta maneira, para a variabilidade na resposta e na qualidade dos embriões obtidos (WILSON et al., Superovulation of cattle with a recombinant-DNA bovine follicle stimulating hormone. Animal Reproduction Science 1993;33(1-4):71-82).
[0011] Considerando-se o que foi exposto acima, e tomando-se em consideração o fato de que a fonte de origem da eCG é limitada (sangue de éguas prenhes), e, ainda, que existem fatores bioéticos relacionados à obtenção deste material, procura-se uma fonte de eCG que seja ilimitada, ética, e de obtenção mais prática e reprodutível, assegurando o fornecimento ininterrupto a um mercado consumidor crescente deste hormônio.
[0012] As gonadotrofinas recombinantes apresentam máxima biossegurança, melhor performance nos resultados, nenhuma interferência de outros hormônios e poucos contaminantes, sendo, desta maneira, usadas amplamente na Medicina Reprodutiva humana, representando grande interesse para a reprodução assistida veterinária. A tecnologia recombinante provou ser possível a produção de proteínas complexas de modo reprodutível. No entanto, a estrutura das gonadotrofinas é de difícil reprodução, pois, além de serem compostas por duas cadeias transcritas e traduzidas de maneira independente, existe a presença de várias modificações pós-traducionais, particularmente a glicosilação, que no caso da eCG tem um papel fundamental na sua atividade biológica (LOUMAGEL et al., Human follicle-stimulating hormone produced by recombinant DNA technology: a rewiew for clinicians. Human Reproduction 1995; v. 1 p. 188-199; MARTINUK et al., Effects of carbohydrates on the pharmacokinetics and biological activity of equine chorionic gonadotropin in vivo. Biol Reprod. 1991 Oct;45(4):598-604).
[0013] Ao longo das últimas décadas, foram desenvolvidos inúmeros processos que permitiram a manipulação genética de células em cultura de tal forma que estas células passassem a produzir uma grande variedade de proteínas e glicoproteínas de interesse farmacêutico. Estes processos envolvem a utilização da tecnologia do DNA recombinante para a preparação de vetores de expressão contendo o material genético que codifica uma determinada proteína ou glicoproteína. Ao se introduzir o vetor de expressão numa determinada linhagem celular em cultura, este material genético passa a instruir a maquinaria biossintética celular de tal forma que ocorra a síntese de uma proteína ou glicoproteína específica.
[0014] Entretanto, existem vários obstáculos associados à produção de glicoproteínas em uma determinada linhagem celular geneticamente modificada. O processo de glicosilação associado à produção de glicoproteínas consiste na adição de carboidratos às cadeias polipeptídicas, que é um evento pós-traducional que resulta na adição de cadeias de açúcar à resíduos de aminoácidos específicos de asparagina (glicosilação N-ligada) ou de serina/treonina (glicosilação O-ligada) numa determinada sequência polipeptídica. Numa glicoproteína, enquanto a porção polipeptídica é codificada por uma determinada sequência genética, sendo, desta forma, constante, as estruturas de carboidratos são variáveis, uma característica que é conhecida como micro- e macro-heterogeinidade. O processo de glicosilação é o produto de uma complexa sequência de reações enzimáticas que adicionam, clivam e modificam a porção de carboidratos de uma glicoproteína. Antecipar o resultado da ação coordenada destas enzimas que participam do processo de glicosilação não é uma atividade intuitiva ou direta, sendo muito difícil predizer os perfis de glicosilação que podem ser obtidos a partir de determinado tipo celular, ou ainda, o impacto que flutuações do perfil de expressão gênica ou manipulações nos regimes de cultivo podem ter sobre o perfil final de glicosilação (Al-Rubeai, Cell Engineering. Springer 2009; pág. 247-279). Portanto, várias linhagens celulares comumente utilizadas para a produção heteróloga de proteínas de interesse terapêutico possuem capacidades variáveis de promover a glicosilação de glicoproteínas. Entretanto, apesar destas células possuírem tais capacidades, a maquinaria celular de glicosilação não é controlada pelo vetor de expressão da proteína de interesse. Desta forma, a glicoproteína produzida por uma determinada linhagem celular geneticamente manipulada pode possuir uma estrutura de glicanos diferente daquela apresentada pela glicoproteína natural, codificada pelo vetor de expressão.
[0015] As cadeias polissacarídicas modulam a atividade biológica das glicoproteínas de várias formas, promovendo, por exemplo: a) a diminuição do “clearance” plasmático e o consequente aumento do tempo de meia-vida; b) mediação de processos de reconhecimento molecular; c) estabilização da conformação da cadeia polipeptídica; e d) a proteção quanto a degradação proteolítica (Al-Rubeai, Cell Engineering. Springer 2009; pág. 247-279).
[0016] Assim como outras gonadotrofinas, eCG é uma glicoproteína heterodimérica, composta por duas subunidades polipeptídicas, as cadeias α e β. Em equídeos, o hormônio luteinizante (eLH) e a eCG possuem cadeias polipeptídicas idênticas, sendo que é a divergência quanto à estrutura dos N- e O-glicanos que determina a diferença entre os pesos moleculares e a atividade biológica destes dois hormônios: eCG apresenta uma excepcional meia-vida circulatória em comparação ao eLH (BOUSFIELD et al., Identification of twelve O-glycosylation sites in equine chorionic gonadotropin beta and equine luteinizing hormone ss by solid-phase Edman degradation. Biol Reprod. 2001 Jan;64(1):136-47). A arte anterior ensina que a remoção dos resíduos terminais de ácido siálico das cadeias de glicanos da eCG diminui dramaticamente a atividade in vivo desta glicoproteína, visto que sua meia-vida é reduzida de seis dias para aproximadamente 1-2 horas (MARTINUK et al., Effects of carbohydrates on the pharmacokinetics and biological activity of equine chorionic gonadotropin in vivo. Biol Reprod. 1991 Oct;45(4):598-604). A subunidade α da eCG, composta de 96 aminoácidos, exibe duas complexas cadeias oligossacarídicas N-ligadas, localizadas nos resíduos das asparaginas 56 e 82. Entretanto, as cadeias de carboidratos dos dois hormônios, eLH e eCG, exibem diferenças em suas estruturas: a subunidade α do eLH possui dois N-glicanos biantenários finalizados em N-acetilgalactosaminas sulfatadas (SO4-4-GalNAc), enquanto que os N-glicanos anexados à subunidade α da eCG são finalizados em ácido siálico nas ligações α2,3 e α2,6 (DAMM et al., Structure determination of the major N- and O-linked carbohydrate chains of the beta subunit from equine chorionic gonadotropin. Eur J Biochem. 1990 Apr 20;189(1):175-83.), possivelmente estendido com repetições de lactosamina (BOUSFIELD et al., Differential effects of alpha subunit Asparagine56 oligosaccharide structure on equine lutropin and follitropin hybrid conformation and receptor-binding activity. Biochemistry. 2004 Aug 24;43(33):10817-33). A subunidade β da eCG, composta de 149 resíduos de aminoácidos (SUGINO et al., Structural studies on equine glycoprotein hormones. Amino acid sequence of equine chorionic gonadotropin beta-subunit. J Biol Chem. 1987 Jun 25;262(18):8603-9), possui uma única cadeia de N-glicano localizada na Asn13, terminando com GalNAc sulfatada em eLH e a2,3Gal sialilada em eCG (SMITH et al., Equine lutropin and chorionic gonadotropin bear oligosaccharides terminating with SO4-4-GalNAc and Sia alpha 2,3Gal, respectively. J Biol Chem. 1993 Jan 15;268(2):795-802; MATSUI et al., Structural analysis of N-linked oligosaccharides of equine chorionic gonadotropin and lutropin beta-subunits. Biochemistry. 1994 Nov 29;33(47):14039-48). Ambas subunidades β possuem até 12 O-glicanos estendidos com poli N-acetil-lactosamina sialilada (a2,3) localizados nas serinas ou treoninas do carboxi-peptídeo terminal (CTP) de 28 resíduos de aminoácidos (HOKKE et al., Structure determination of the disialylated poly-(N-acetyllactosamine)-containing O-linked carbohydrate chains of equine chorionic gonadotropin. Glycoconj J. 1994 Feb;11(1):35-41; BOUSFIELD et al., Identification of twelve O-glycosylation sites in equine chorionic gonadotropin beta and equine luteinizing hormone ss by solid-phase Edman degradation. Biol Reprod. 2001 Jan;64(1):136-47).
[0017] Na literatura, diversos autores tentaram obter a gonadotrofina coriônica equina recombinante, principalmente uma variante artificial da reCG, consistindo de uma proteína de fusão entre as cadeias β e a, sendo que esta foi clonada e expressa em células de inseto (LEGARDINIER et al., Biological activities of recombinant equine luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (eLH/CG) expressed in Sf9 and Mimic insect cell lines. Journal of Molecular Endocrinology 2005; 34:47-60); secretada em leite de coelhas transgênicas (GALET et al., Expression of an in vitro biologically active equine LH/CG without C-terminal peptide (CTP) and/or beta26-110 disulphide bridge. J Endocrinol, 2001; 167(1 ):117-24); expressa em células de camundongos (GALET et al., Expression of a single betaalpha chain protein of equine LH/CG in milk of transgenic rabbits and its biological activity. Mol Cell Endocrinol, 2001; 174(1-2):31-40); e modificada e expressa como formas desglicosiladas em células CHO (células de ovário de Hamster Chinês). Somente para os dois primeiros sistemas citados acima foram realizados ensaios de atividade biológica in vivo, resultando em nenhuma atividade tipo eCG, fato este provavelmente decorrente da diferença nas cadeias de glicanos adicionados à eCG por estes sistemas de expressão.
[0018] Adicionalmente, o estado da técnica ensina métodos de produção de gonadotrofinas recombinantes, mas carece em propor uma maneira eficaz de se obter a reCG em grandes quantidades, e, ao mesmo tempo, com o perfil de glicosilação similar à eCG selvagem que garanta atividade in vivo da reCG similar àquela observada para a eCG selvagem.
[0019] HESSER (HESSER, A survey of heterologous expression systems for the production of bovine follicle stimulating hormone and luteinizing hormone. All Dissertations 2011; Paper 692) descreve a produção de gonadotrofinas, mais especificamente, de hormônios folículo-estimulante em células CHO.
[0020] FURUHASHI et al. (FURUHASHI et al., Fusing the carboxyterminal peptide of the chorionic gonadotropin (CG) betasubunit to the common alphasubunit:retention of Olinked glycosylation and enhanced in vivo bioactivity of chimeric human CG. Mol Endocrinol. 1995 Jan;9(1):5463) descreve um análogo de hCG com uma cauda polipeptídica do tipo CTP (acrônimo em inglês para Carboxy Terminal Peptide), e relaciona a importância da glicosilação para a atividade biológica do análogo.
[0021] SUGAHARA et al. (SUGAHARA et al., Biosynthesis of a biological active single peptide chain containing the human common a and chorionic gonadotropin β subunits in tandem. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:20412045) descreve a atividade biológica de uma cadeia polipeptídica única com atividade biológica, contendo uma subunidade β da hCG fusionada a uma subunidade a das gonadotrofinas.
[0022] Posteriormente, SUGAHARA et al. (SUGAHARA et al., Expression of biological active fusion genes enconding the common alpha subunit and the follicle-stimulating hormone beta subunit: Role of a linker sequence. J Biol Chem 1996; 271:10445-10448) descreveu a conversão de um heterodímero de FSH para uma estrutura de cadeia única, e o impacto da ausência da sequência ligante na taxa de secreção e de ligação da dita proteína. Ainda, mostra que o alinhamento dos domínios α e β diferem do apresentado na forma de heterodímero.
[0023] NARAYAN et al. (NARAYAN et al., Functional expression of yoked human chorionic gonadotropin in baculovirus-infected insect cells. Mol Endocrinol. 1995; 9(12):1720-6) descreve a expressão simultânea das subunidades α e β da eCG em células de insetos, cuja expressão é controlada por diferentes promotores, em um mesmo baculovirus recombinante, dando origem a proteínas que são biologicamente ativas apenas in vitro.
[0024] SHIOTA et al. (SHIOTA et al., Production of recombinant eCG with potent FSH-like activity by site-directed mutagenesis. Nippon Yakurigaku Zasshi 1997; 110(1):59P-62P) descreve gonadotrofinas recombinantes com estruturas diferentes em vista dos oligossacarídeos acoplados, e relaciona a atividade biológica dos mutantes ou variantes.
[0025] O documento EP0974599 descreve uma variante da eCG recombinante e sua sequência de DNA correspondente, além de uma composição farmacêutica da dita eCG recombinante para utilização como droga veterinária. A forma variante da eCG recombinante revelada possui as cadeias α e β da eCG fusionadas em uma única cadeia polipeptídica, possuindo atividade do tipo FSH e LH apenas in vitro. Os inventores sugerem a sua utilização como um medicamento para animais, mas não demonstram: a) a similaridade entre o perfil de glicosilação da forma recombinante obtida e aquele da forma selvagem; e b) a atividade biológica in vivo da forma da eCG recombinante obtida.
[0026] O documento US 5.767.251 descreve métodos para gerar gonadotrofinas humanas recombinantes, dentre as quais hCG, hLH e hFSH, em que os hormônios compostos por duas subunidades diferentes são sintetizados na mesma célula por pelo menos um vetor de expressão, no qual a expressão de cada subunidade é controlada por um promotor diferente. Neste caso, a atividade biológica de hCG é facilmente diferenciada da atividade de LH, pois, diferentemente do que ocorre em equinos, em humanos, as cadeias β destas duas gonadotrofinas são codificadas por genes distintos.
[0027] O documento US 5.047.335 descreve um processo para controlar a glicosilação de proteínas recombinantes envolvendo a utilização de células da linhagem CHO geneticamente modificadas de modo a passarem a produzir sialiltransferases, uma classe de glicosiltransferases. Esta produção suplementar de sialiltransferases permite, por exemplo, que glicoproteínas recombinantes, produzidas nesta linhagem das células CHO modificadas geneticamente, possuam uma estrutura de glicanos mais próxima das glicoproteínas humanas naturais. Entretanto, o documento US 5.047.335 não descreve qual combinação de glicosiltransferases seria necessária para a obtenção da eCG recombinante com atividade biológica.
[0028] Os documentos US 6.103.501, US 6.238.890 e US 6.987.172 descrevem variantes artificiais de cadeia única de gonadotrofinas que são naturalmente encontradas sob a forma de heterodímeros, como, por exemplo, CG, TSH, LH e FSH, e que podem fornecer efeitos ou funções, ou podem se comportar como agonistas ou antagonistas dos hormônios nativos. Também neste caso, a atividade biológica da CG humana é facilmente diferenciada da atividade do LH humano, pois, diferentemente do que ocorre em equinos, em humanos as cadeias β destas duas gonadotrofinas são codificadas por genes distintos. Adicionalmente, esses documentos não descrevem quais condições seriam necessárias para obtenção da eCG recombinante com atividade biológica.
[0029] O documento US 2010/120677 descreve métodos para a produção de análogos de eFSH recombinante biologicamente ativo e métodos para melhorar a reprodução em mamíferos com o uso de análogos de eFSH recombinante.
[0030] O documento CA 2183564 descreve métodos para aumentar a fertilidade através da redução da atividade ou dos níveis dos hormônios com atividade LH, e métodos para selecionar anticorpos para porções específicas de certas proteínas, incluindo LH e hCG, para reduzir a sua atividade biológica.
[0031] O documento WO2016178087A1 descreve métodos para a produção de formas não modificadas de eCG, ou de variantes da eCG fusionadas à porção Fc (acrônimo em inglês para “Fragment crystallizable region”) no leite de animais transgênicos, mas falha em demonstrar atividade biológica in vivo das formas de eCG produzidas.
[0032] O estado da técnica citado acima mostra os constantes esforços direcionados para o desenvolvimento de novas gonadotrofinas recombinantes e de processos para produzi-las com segurança, qualidade e de forma ilimitada, enfatizando, ainda mais, a necessidade de novas soluções e a importância da Pesquisa & Desenvolvimento nesse campo de atuação.
[0033] Permanece, desta forma, a necessidade de aperfeiçoamentos no processo de produção da eCG recombinante, de forma que esta seja produzida em grandes quantidades e, ao mesmo tempo, que dita eCG recombinante possua o perfil de glicosilação necessário para sua atividade biológica in vivo.
[0034] Assim, a partir deste conhecimento, com a presente invenção foi possível aprimorar métodos para produção da eCG recombinante, garantindo a produção de grandes quantidades da eCG recombinante que apresentem um perfil de glicosilação semelhante àquele das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis e, consequentemente, apresentem atividade biológica in vivo também semelhante àquela da eCG selvagem. Tais gonadotrofinas coriônicas recombinantes são produzidas através da seleção de fenótipos celulares específicos a partir de um sistema biotecnologicamente preparado para a alta expressão dessas estruturas.
[0035] Apesar de muitas gonadotrofinas heterodiméricas recombinantes terem sido produzidas com sucesso, envolvendo a utilização de técnicas de biologia molecular e celular, ainda não se alcançou a obtenção de uma forma biologicamente ativa in vivo da eCG recombinante. Adicionalmente, desconhece-se qual sistema de expressão heterólogo baseado em células de mamífero é capaz de promover as modificações pós-traducionais do tipo glicosilação N-ligada e O-ligada em grandes quantidades da eCG recombinante, necessárias para se diferenciar a atividade biológica da eCG daquela do eLH.
[0036] Em éguas, a forma selvagem da eCG é produzida por um tipo celular diferenciado e altamente especializado, as células dos cálices endometriais, e ainda, num momento da vida destes animais muito particular, entre o quadragésimo e o octogésimo quinto dias de gestação. Os detalhes dos eventos moleculares associados à promoção das modificações pós-traducionais da eCG, particularmente o processo de glicosilação, os quais são essenciais para a sua atividade biológica, são desconhecidos. Assim, não é possível antecipar, com precisão, que tipos celulares, condições e fatores estão associados à obtenção de tal perfil de glicosilação compatível com uma atividade biológica do tipo eCG, destacando-se: 1) qual sistema de expressão heterólogo mimetizaria a combinação de enzimas e fatores encontrados nas células do cálice endometrial; ou ainda 2) quais são as condições de geração de um sistema heterólogo e quais são as condições de cultivo do sistema heterólogo associadas com a obtenção de um perfil de glicosilação da reCG compatível com a atividade biológica in vivo.
[0037] A presente invenção diz respeito a um processo aperfeiçoado de produção de uma gonadotrofina coriônica equina recombinante biologicamente ativa, no qual as cadeias polipeptídicas α e β são produzidas em uma mesma célula, e que dita reCG apresenta perfil de glicosilação semelhante àquele das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis. Dito processo aperfeiçoado é baseado no processo descrito no documento PCT/BR2015/050047 da mesma depositante.
[0038] Assim, de maneira surpreendente, a Depositante verificou que, através do emprego de técnicas amplamente difundidas de biologia molecular e celular, aliado ao uso de estratégias apropriadas de seleção fenotípica, é possível selecionar sub-fenótipos de linhagens celulares em cultura associados à obtenção de um perfil de glicosilação similar àquele encontrado na eCG selvagem, garantindo, desta forma, que a eCG recombinante assim obtida possua atividades biológicas in vivo similares aos hormônios FSH e LH.
[0039] Este efeito técnico é ainda mais inesperado já que, até o momento, a arte anterior ensina que para obtenção de tal atividade seria necessário que pelo menos 50% das ramificações terminais das cadeias de glicanos da eCG estivessem sialiladas (MARTINUK et al., Effects of carbohydrates on the pharmacokinetics and biological activity of equine chorionic gonadotropin in vivo. Biol Reprod. 1991 Oct;45(4):598-604). Mais especificamente, a reCG obtida pelo processo aperfeiçoado pode ser completamente glicosilada, caracterizada por conter cadeias de glicanos N- e O-ligados contendo um alto teor de sialilação terminal dos resíduos de galactose, ou, ainda, parcialmente glicosilada, contendo a unidade dissacarídica Gal-(1-4)GlcNAc como resíduo terminal N-ligado e/ou O-ligado, ou, ainda, a unidade monossacarídica GlcNAc como resíduo terminal O-ligado.
[0040] De acordo com um primeiro aspecto, é provido um processo que compreende as etapas de:
- (a) preparo e obtenção de sequências de DNA codificadoras das cadeias α e β da reCG;
- (b) inserção das ditas sequências de DNA codificadoras em vetores de expressão, de tal forma que as ditas sequências de DNA codificadoras estejam funcionalmente ligadas a elementos promotores da transcrição gênica;
- (c) manipulação genética de uma linhagem celular de interesse envolvendo a inserção genômica, em uma mesma célula, de um primeiro vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia α da reCG, e de um segundo vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia β da reCG;
- (d) expressão de forma independente da primeira e da segunda sequências de DNA mencionadas, de tal forma que as cadeias polipeptídicas α e β sejam produzidas como moléculas separadas em uma mesma célula da linhagem celular de interesse mencionada, e, desta forma, ocorra a produção de grandes quantidades do heterodímero formado entre as cadeias α e β com atividade biológica tipo eCG;
- (e) isolamento de clones celulares produzindo a reCG com atividade biológica in vivo;
- (f) cultivo dos clones celulares produzindo a reCG com atividade biológica in vivo; e
- (g) recuperação da reCG com atividade biológica in vivo a partir do meio de cultivo condicionado pelos clones celulares produtores.
[0041] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é provida uma gonadotrofina coriônica equina recombinante, produzida a partir do processo aperfeiçoado da presente invenção, sendo dita reCG produzida a partir de cadeias de cDNA contendo as sequências codificadoras das cadeias α e β separadamente e que ditas cadeias polipeptídicas α e β da reCG são completamente ou parcialmente glicosiladas.
[0042] Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição veterinária compreendendo:
- (a) uma quantidade veterinariamente eficaz da reCG produzida de acordo com a presente invenção;
- (b) opcionalmente aditivos; e
- (c) um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0043] Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere ao uso da reCG da invenção ou da composição da invenção, compreendendo a dita reCG, na fabricação de um medicamento para o tratamento de condições médicas relacionadas à reprodução e ovulação de animais mamíferos, como agente otimizador da fertilização in vitro; na fabricação de kits para diagnósticos de condições veterinárias e protocolos relacionados à ovulação de mamíferos; e na fabricação de suplemento para o cultivo de células.
[0044] A Figura 1 ilustra a sequência codificadora da cadeia α da reCG, juntamente com a sequência polipeptídica correspondente.
[0045] A Figura 2 ilustra a sequência codificadora da cadeia β da reCG, juntamente com a sequência polipeptídica correspondente.
[0046] A Figura 3 ilustra o vetor de expressão da cadeia α da reCG
[0047] A Figura 4 ilustra o vetor de expressão da cadeia β da reCG
[0048] A Figura 5 ilustra a produtividade de reCG após 96h de cultivo da população mista original CHO-DG44 cGMP pcDNA 3.3-βeCG + pNU1-aeCG e das populações enriquecidas derivadas desta estratégia. CHO-EYFP (controle negativo) é o meio condicionado por 96h por células CHO-DG44 cGMP transfectadas com o vetor pNU1 contendo a mensagem codificadora da proteína fluorescente EYFP. A concentração normalizada de reCG nos meios de cultura avaliados está expressa em UI/mL por milhão de células viáveis.
[0049] A Figura 6 ilustra a produtividade de reCG, determinada por ELISA específico, nos meios condicionados pelas populações celulares enriquecidas, que foram geradas durante a segunda etapa de seleção com 30nM de MTX e 750qg/mL de Geneticina (G418). A concentração normalizada de reCG nos meios de cultura avaliados está expressa em UI/mL por milhão de células viáveis.
[0050] A Figura 7 ilustra a produtividade de reCG após 96h de cultivo dos clones isolados através de diluição limitante a partir das populações enriquecidas CHO-DG44 cGMP E9 30/750 (pcDNA3.3-βeCG + pNU1-aeCG) e CHO-DG44 cGMP F9 30/750 (pcDNA3.3-βeCG + pNU1-aeCG). A concentração normalizada de reCG nos meios de cultura avaliados está expressa em UI/mL por milhão de células viáveis.
[0051] A Figura 8 ilustra a caracterização estrutural do heterodímero reCGα+β através da técnica de Western Blot.
[0052] A Figura 9 ilustra o perfil eletroforético típico obtido da reCGα+β purificada, observado após fracionamento por eletroforese em gel de poliacrilamida 12% não desnaturante, seguido de coloração com prata.
[0053] A Figura 10 ilustra o perfil de glicosilação obtido para a proteína recombinante expressa pelo clone D3 (pcDNA3.3-βeCG + pNU1-aeCG).
[0054] As Figura 11, 12 e 13 ilustram a avaliação funcional in vivo em ratas da reCGα+β, realizada a partir da obtenção dos perfis das respostas (peso dos órgãos) ovariana e uterina frente ao estímulo com diferentes doses de reCGα+β.
[0055] A Figura 14 ilustra a avaliação funcional in vivo em vacas da reCGα+β, realizada a partir da obtenção do perfil de resposta ovariano (taxa de superestimulação de folículos) frente ao estímulo com diferentes doses de reCGα+β.
[0056] A presente invenção trata de um processo aperfeiçoado de produção de uma gonadotrofina coriônica equina recombinante (reCG), no qual as cadeias polipeptídicas α e β são produzidas em uma mesma célula e são completamente ou parcialmente glicosiladas. Dita gonadotrofina coriônica equina recombinante apresenta perfil de glicosilação semelhante ao da gonadotrofina coriônica equina natural e apresenta atividade in vivo dos hormônios FSH e LH.
[0057] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, dito processo aperfeiçoado compreende as etapas de:
- (a) preparo e obtenção de sequências de DNA codificadoras das cadeias α e β da reCG;
- (b) inserção das ditas sequências de DNA codificadoras em vetores de expressão, de tal forma que as ditas sequências de DNA codificadoras estejam funcionalmente ligadas a elementos promotores da transcrição gênica;
- (c) manipulação genética de uma linhagem celular de interesse envolvendo a inserção genômica, em uma mesma célula, de um primeiro vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia a da reCG, e de um segundo vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia β da reCG;
- (d) expressão de forma independente da primeira e segunda sequências de DNA mencionadas, de tal forma que as cadeias polipeptídicas α e β sejam produzidas como moléculas separadas em uma mesma célula da linhagem celular de interesse mencionada, e, desta forma, ocorra a produção de grandes quantidades do heterodímero formado entre as cadeias α e β com atividade biológica tipo eCG;
- (e) isolamento de clones celulares produzindo a reCG com atividade biológica in vivo;
- (f) cultivo dos clones celulares produzindo a reCG com atividade biológica in vivo; e
- (g) recuperação da reCG com atividade biológica in vivo a partir do meio de cultivo condicionado pelos clones produtores.
[0058] Os primers utilizados para a amplificação das sequências de cDNAs codificadoras das cadeias α e β da eCG foram desenhados a partir das sequências codificadoras completas de cada subunidade de eCG contidas na base de dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov; National Center for Biotechnology Information, U. S. NLM - U. S. National Library of Medicine, Bethesda, EUA (NM_access number α: 001099763.1, β: 001490342.2). Não se fez uso de um programa computacional para o desenho dos oligonucleotídeos.
[0059] A amplificação das cadeias codificadoras pode ser realizada através da técnica de RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) e os produtos obtidos são separados e purificados por técnicas usualmente conhecidas e empregadas no estado da técnica. Preferencialmente, os amplicons obtidos são detectados por eletroforese em gel de agarose, isolados e purificados através do Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healtcare, Carlsbad, CA, EUA).
[0060] Em outro aspecto da invenção as sequências codificadoras das subunidades α ou β da eCG (SEQ ID NO. 1 e SEQ ID NO. 2, respectivamente) foram subclonadas nos vetores pNU1 e pcDNA 3.3, respectivamente. Para o sequenciamento das regiões codificadoras das cadeias aeCG e βeCG, utilizou-se os vetores pNU1-aeCG e pcDNA3.3β-eCG, respectivamente, e foram utilizados iniciadores que se alinham ao longo dos vetores de expressão pcDNA 3.3 e pNU-1, e também aos insertos aeCG e βeCG. Através dos cromatogramas originados e do programa SeqMan do pacote DNASTAR, foi realizada a montagem das sequências consenso a partir das sequências individuais obtidas. As sequências consenso foram analisadas no programa BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, Basic Local Alignment Search Tool®, NCBI, U. S. NLM), para verificar a similaridade destas com as sequências consenso das aeCG e βeCG de Equus caballus, depositadas no banco de dados do NCBI (NM_001197093.1). As sequências nucleotídicas codificadoras consenso das cadeias αeCG e βeCG estão descritas como SEQ ID NO. 1 e SEQ ID NO. 2, respectivamente. As sequências nucleotídicas e polipeptídicas das cadeias αeCG e βeCG podem ser visualizadas nas Figuras 1 e 2, respectivamente.
SEQ ID NO.1
ATGGATTACTACAGAAAACATGCAGCTGTCATCCTGGCCACATTGTCCGTGTTTCTGCATATTCTCCATTCCTTTCCTGATGGAGAGTTTACAACGCAGGATTGCCCAGAATGCAAGCTAAGGGAAAACAAGTACTTCTTCAAACTGGGCGTCCCGATTTACCAGTGTAAGGGCTGCTGCTTCTCCAGAGCGTACCCCACTCCAGCAAGGTCCAGGAAGACAATGTTGGTCCCAAAGAACATCACCTCAGAATCCACATGCTGTGTGGCCAAAGCATTTATCAGGGTCACAGTGATGGGAAACATCAAGTTGGAGAACCACACCCAGTGCTATTGCAGCACTTGCTATCA CCACAAGATTTAAAGGTTTCACCAAGTG
SEQ ID NO.2
ATGGAGACGCTCCAGGGGCTGCTGCTGTGGATGCTGCTGAGTGTTGGCGGGGTCTGGGCATCCAGGGGGCCACTGCGGCCACTGTGCCGGCCCATCAACGCCACTCTGGCTGCTGAGAAGGAGGCCTGCCCCATCTGCATCACCTTCACCACCAGCATCTGTGCCGGCTACTGCCCCAGCATGGTGCGGGTGATGCCAGCTGCCCTGCCGGCCATTCCCCAGCCAGTGTGCACCTACCGTGAGCTGCGCTTTGCTTCCATCCGGCTCCCCGGCTGCCCGCCTGGTGTGGACCCCATGGTCTCCTTCCCCGTGGCCCTCAGTTGTCACTGCGGGCCCTGCCAGATCAAGACCACTGACTGCGGGGTTTTCAGAGACCAGCCCTTGGCCTGTGCCCCCCAGGCCTCCTCTTCCTCTAAGGATCCCCCATCCCAACCTCTCACATCCACATCCACCCCAACTCCTGGGGCCAGCAGACGTTCCTCTCATCCCCTCCCAATAAAGACTTCTTGA
SEQ ID NO.1
ATGGATTACTACAGAAAACATGCAGCTGTCATCCTGGCCACATTGTCCGTGTTTCTGCATATTCTCCATTCCTTTCCTGATGGAGAGTTTACAACGCAGGATTGCCCAGAATGCAAGCTAAGGGAAAACAAGTACTTCTTCAAACTGGGCGTCCCGATTTACCAGTGTAAGGGCTGCTGCTTCTCCAGAGCGTACCCCACTCCAGCAAGGTCCAGGAAGACAATGTTGGTCCCAAAGAACATCACCTCAGAATCCACATGCTGTGTGGCCAAAGCATTTATCAGGGTCACAGTGATGGGAAACATCAAGTTGGAGAACCACACCCAGTGCTATTGCAGCACTTGCTATCA CCACAAGATTTAAAGGTTTCACCAAGTG
SEQ ID NO.2
ATGGAGACGCTCCAGGGGCTGCTGCTGTGGATGCTGCTGAGTGTTGGCGGGGTCTGGGCATCCAGGGGGCCACTGCGGCCACTGTGCCGGCCCATCAACGCCACTCTGGCTGCTGAGAAGGAGGCCTGCCCCATCTGCATCACCTTCACCACCAGCATCTGTGCCGGCTACTGCCCCAGCATGGTGCGGGTGATGCCAGCTGCCCTGCCGGCCATTCCCCAGCCAGTGTGCACCTACCGTGAGCTGCGCTTTGCTTCCATCCGGCTCCCCGGCTGCCCGCCTGGTGTGGACCCCATGGTCTCCTTCCCCGTGGCCCTCAGTTGTCACTGCGGGCCCTGCCAGATCAAGACCACTGACTGCGGGGTTTTCAGAGACCAGCCCTTGGCCTGTGCCCCCCAGGCCTCCTCTTCCTCTAAGGATCCCCCATCCCAACCTCTCACATCCACATCCACCCCAACTCCTGGGGCCAGCAGACGTTCCTCTCATCCCCTCCCAATAAAGACTTCTTGA
[0061] As sequências polipeptídicas das cadeias αeCG e βeCG estão descritas como SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.
SEQ ID NO: 3:
MDYYRKHAAVILATLSVFLHILHSFPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKI
SEQ ID NO: 4:
METLQGLLLWMLLSVGGVWASRGPLRPLCRPINATLAAEKEACPICITFTTSICAGYCPSMVRVMPAALPAIPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCQIKTTDCGVFRDQPL ACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGASRRSSHPLPIKTS
SEQ ID NO: 3:
MDYYRKHAAVILATLSVFLHILHSFPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKI
SEQ ID NO: 4:
METLQGLLLWMLLSVGGVWASRGPLRPLCRPINATLAAEKEACPICITFTTSICAGYCPSMVRVMPAALPAIPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCQIKTTDCGVFRDQPL ACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGASRRSSHPLPIKTS
[0062] As regiões codificadoras obtidas para as cadeias αeCG e βeCG podem ser clonadas em qualquer vetor plasmideal que contenha um ou mais promotores fortes, incluindo o promotor de β-actina de galinha e o promotor de citomegalovírus, sítio múltiplo de clonagem bacteriana (MCS, acrônimo em inglês para Multiple Cloning Site), sequência de resistência a antibiótico para clonagem bacteriana, sítios de recombinação, e o cDNA codificador da enzima diidrofolato redutase (DHFR) à jusante de um sítio interno para entrada de ribossomos (IRES-international ribosomal entry site). Preferencialmente, o vetor plasmideal de expressão adequado para a invenção é o vetor pNU-1, construído pela própria depositante. Entretanto, outros vetores de expressão, contendo elementos funcionais similares, podem ser utilizados, como, por exemplo, o vetor pcDNA 3.3, ou outros vetores da família pcDNA.
[0063] O vetor pNU1 é derivado do vetor pUC18 (MESSING E VIEIRA, The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 1982 Oct;19(3):259-68), e possui um cassete de clonagem MCS contendo diversos sítios para enzimas de restrição, sendo que as sequências de DNA codificadoras inseridas no MCS estão funcionalmente ligadas e sob o controle de um promotor híbrido contendo elemento enhancer de citomegalovírus e promotor de β-actina de galinha, bem como o cDNA codificador da enzima diidrofolato redutase (DHFR) à jusante de um sítio interno para entrada de ribossomos.
[0064] Esta estrutura permite a expressão concomitante do inserto clonado no MCS, no caso a αeCG, ou a βeCG, e do DHFR, visando a complementação gênica de células CHO duplo negativo para o gene DHFR, que, por sua vez, permite a seleção de células expressando altas quantidades do produto de interesse após amplificação gênica, realizada através de tratamento com doses crescentes de inibidores de DHFR.
[0065] Em uma realização particular da presente invenção, procedeu-se à cotransfecção estável dos vetores pcDNA3.3-βeCG e pNU1-αeCG nas células CHO-DG44 para a geração de clones celulares expressando estavelmente a proteína heterodimérica reCGα+β.
[0066] A inserção dos vetores plasmideais de expressão na célula de interesse (cotransfecção) pode ser realizada por diversas técnicas usualmente empregadas no estado da técnica. Dentre elas, diversos tipos de transfecção, como por exemplo, por meio de moléculas catiônicas, transfecção mediada por cálcio, PEI, eletroporação e nucleofecção.
[0067] Com o objetivo de se obter o heterodímero reCGα+β, pode-se empregar diferentes alternativas para a co-expressão das subunidades αeCG e βeCG. Assim, de forma ilustrativa e não limitativa, pode-se empregar diferentes vetores de expressão para co-expressar as diferentes subunidades da proteína reCG, como, por exemplo, o vetor de expressão pcDNA3.3 para expressar a subunidade βeCG, e o vetor de expressão pNU1 para expressar a subunidade αeCG. Nesse exemplo em particular, os vetores pNU1 e pcDNA3.3 possuem marcas diferentes de seleção de transfectantes celulares estáveis, ou seja: a DHFR, no caso do vetor pNU1, e a Neomicina Fosfotransferase II (NPTII) no caso do vetor pcDNA3.3, o que facilita o processo de seleção de co-transfectantes estáveis positivos, produzindo as duas subunidades simultaneamente. A co-transfecção estável dos vetores pcDNA3.3-βeCG e pNU1-αeCG pode ser executada empregando-se diferentes relações molares dos respectivos vetores, como por exemplo, 2:1, ou ainda 1:2, ou preferencialmente 1:1.
[0068] Como a eCG é uma molécula complexa, apresentando em torno de 45% de sua massa molecular consistindo de modificações pós-traducionais (glicosilação), faz-se necessário o uso de um sistema de expressão robusto que permita a produção de uma eCG recombinante o mais similar possível em comparação com a eCG do tipo selvagem. O sistema de expressão heterólogo da reCG de acordo com a presente invenção foi escolhido por permitir o processamento correto de cadeias polipeptídicas recém-sintetizadas, o dobramento e a montagem de suas subunidades α e β, além da adição de cadeias de glicanos do tipo complexo, o que é fundamental para que o eCG recombinante produzido tenha atividade biológica. No entanto, existe muita variabilidade nos padrões de glicosilação entre diferentes células de mamíferos, e até mesmo numa mesma linhagem celular de mamíferos, devido ao fato da maquinaria enzimática de adição de oligossacarídeos às proteínas diferir entre as linhagens celulares ou entre sub-fenótipos de uma mesma linhagem celular, gerando glicoformas com diferentes graus e tipos de glicosilação e atividades biológicas distintas. Devido à grande variabilidade de sub-fenótipos celulares possíveis quanto a composição da rota biossintética de glicosilação, aliada a complexidade do perfil de glicosilação devido aos fenômenos de micro- e macro-heterogeinidade, faz-se necessário o emprego de uma estratégia eficiente de seleção fenotípica.
[0069] Uma realização particular da presente invenção envolve um método para a identificação de sub-fenótipos celulares produzindo uma molécula de reCG com atividade biológica in vivo a partir de uma população celular mista inicial gerada através da co-transfecção estável dos vetores de expressão das cadeias α e β da reCG. O método proporciona uma ligação direta entre eventos de inserção estável dos vetores de expressão das cadeias α e β da reCG no genoma das células hospedeiras e a produção de formas biologicamente ativas da reCG sem a necessidade de manipulação ou conhecimento prévio sobre o repertório ou o perfil de expressão gênica de enzimas particulares da rota biossintética da glicosilação.
[0070] Em um aspecto particular deste método, de acordo com a presente invenção, a resposta biológica tipo eCG é reconhecida através da observação da indução de um crescimento rápido e vigoroso dos tecidos uterinos e ovarianos em ratas imaturas. Assim, amostras de meio condicionado por clones celulares representando diferentes sub-fenótipos celulares são utilizadas para a determinação da atividade biológica in vivo tipo eCG, e, desta forma, identificar os clones produzindo formas de reCG biologicamente ativas.
[0071] As células utilizadas para a expressão da reCG são células de linhagem mamífera ou células de insetos, ou ainda qualquer linhagem celular que seja capaz de proporcionar perfis de expressão gênica das enzimas da rota biossintética da glicosilação compatíveis com a obtenção de formas biologicamente ativas da reCG, ainda que a exata configuração de tais perfis de expressão seja desconhecida. Portanto, qualquer outra linhagem celular que seja capaz de adicionar as modificações pós-traducionais semelhantes ao obtido para o perfil de reCG definido para a presente invenção, e que tenha o mesmo comportamento quando cultivada in vitro, como por exemplo, capacidade de replicação, capacidade de expressão da proteína, transfectabilidade simples, dentre outros, pode ser utilizada.
[0072] Preferencialmente, foram escolhidas células de linhagem mamífera; mais preferencialmente, células da linhagem CHO, ou delas derivadas. De maneira ainda mais preferida, é utilizada a linhagem CHO-DG44-DHFR-/-. Todavia, outros tipos celulares passíveis do mesmo processo de seleção fenotípica, como por exemplo, células da linhagem CHO, BHK, 293, Vero ou seus derivados, são adequados para a invenção e podem substituir as células da linhagem CHO-DG44-DHFR-/-.
[0073] Para a co-expressão estável das subunidades αeCG e βeCG nas células CHO-DG44, a etapa inicial de seleção dos transfectantes celulares estáveis pode ser realizada, por exemplo, através da utilização de meio de cultivo livre de nucleosídeos suplementado com o antibiótico G418, na faixa de concentrações de 200 μg/mL a 1 mg/mL, mais preferencialmente 500 μg/mL. Posteriormente, as populações celulares mistas inicias podem ser submetidas a ciclos de seleção adicionais, após ou não a seleção prévia de subpopulações celulares expressando níveis mais elevados de reCGα+β, empregando-se concentrações crescentes, no intervalo de 5 nM a 100 μM, de inibidores da enzima DHFR, e do antibiótico G418, no intervalo de concentrações de 500μg/mL a 2mg/Ml.
[0074] Diversos inibidores de DHFR são conhecidos no estado da técnica e podem ser adequados para uso na invenção. Preferencialmente, o inibidor de DHFR, adequado para a invenção é o Metotrexato (MTX).
[0075] Células deficientes na produção da enzima DHFR, como as células CHO-DG44 DHFR-/-, preferencialmente utilizadas na presente invenção, são adequadas pois elas não conseguem sobreviver quando cultivadas na ausência de nucleosídeos, visto que esta enzima catalisa a redução de diidrofolato a tetraidrofolato. Assim, quando estas células são transfectadas com construções obtidas a partir dos vetores da invenção, que possuem a sequência gênica correspondente à enzima DHFR, elas se tornam capazes de crescer na ausência de nucleosídeos.
[0076] As células superprodutoras de reCG podem ser cultivadas em bateladas de produção em monocamadas ou em suspensão. Podem ser empregados diferentes reservatórios, tais como garrafas de cultivo de diferentes tamanhos, placas, frascos T, spinners, bolsas de cultivo descartáveis (bags) e outros tipos de biorreatores com hélices ou pás arredondadas, fibra oca, dentre outras configurações.
[0077] Os meios de cultivo empregados podem variar desde que eles sejam capazes de suprir as necessidades metabólicas das células. Além disso, as células superprodutoras de reCG podem ser cultivadas na presença ou ausência de soro fetal bovino (FCS). A proporção de soro fetal bovino pode ser adaptada de acordo com as condições de cultivo para manter a viabilidade celular e os níveis de expressão da proteína (de 1 a 100 μg/mL) dentro da mesma ordem de magnitude do padrão original.
[0078] Meios de cultivo quimicamente definidos ou livres de soro e proteínas, contendo substitutos do FCS, tais como fatores peptídicos de crescimento e proliferação celular de diversos tipos, albumina, insulina, entre outros; ou soro fetal ou adulto de outras espécies, e suplementados com precursores utilizados nas vias de glicosilação, também são adequados para serem utilizados na produção de reCG. O cultivo deve ocorrer em condições ambientais definidas, tais como, temperatura de cultivo entre 25 e 40 °C, proporção relativa de CO2 entre 1 e 10%, e pH entre 5,0 e 8,0. Preferencialmente, para a produção do heterodímero reCGα+β, os clones celulares produtores são cultivados em suspensão e em meio de cultivo quimicamente definido. Quando o cultivo for realizado em spinners, bags e biorreatores a rotação empregada pode variar entre 10 e 200 rpm.
[0079] Para alcançar maior massa e pureza da proteína de interesse, o produto obtido pode ser parcialmente purificado empregando técnicas conhecidas para purificação de proteínas, sendo que os meios de cultura condicionados contendo reCGα+β são submetidos a pelo menos uma das seguintes técnicas: precipitação de proteínas, como por exemplo, na presença de sulfato de amônio; ultrafiltração; filtração tangencial; ou a dois tipos distintos de cromatografia, cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade.
[0080] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é provida uma gonadotrofina coriônica equina recombinante, produzida a partir do processo da presente invenção. Ao contrário das opções comercialmente disponíveis, a gonadotrofina coriônica equina recombinante da invenção é produzida através de mecanismos biotecnológicos em escala industrial oferecendo uma opção alternativa àquelas que são obtidas do plasma equino e envolvem fatores bioéticos. Além disso, a reCG da invenção não enfrentará os problemas encontrados no estado da técnica relacionados à escassez da fonte de origem, constituindo vantajosamente uma nova fonte de fornecimento ininterrupto de reCG.
[0081] Ao produzirmos uma reCG com padrão de glicosilação similar ao das gonadotrofinas coriônicas comercialmente disponíveis e que apresente o mesmo nível de atividade in vivo dos hormônios FSH e LH proporcionamos a obtenção de um produto com atividade biológica, ao menos, semelhante. Essa característica também não é apresentada pelas gonadotrofinas coriônicas recombinantes conhecidas no estado da técnica, as quais sequer apresentavam atividade biológica in vivo.
[0082] Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição veterinária compreendendo:
- (a) uma quantidade veterinariamente eficaz da reCG produzida de acordo com a presente invenção;
- (b) opcionalmente aditivos; e
- (c) um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0083] A composição da presente invenção pode compreender, além da reCG da invenção, adjuvantes, preservativos, diluentes, emulsificantes, estabilizantes e outros ingredientes farmacologicamente aceitáveis e que são empregados em preparações de gonadotrofinas para uso animal.
[0084] Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere ao uso (a) da reCG ou (b) da composição veterinária da invenção, compreendendo dita reCG, na fabricação de um medicamento para o tratamento de condições veterinárias relacionadas à reprodução e ovulação de animais mamíferos, como agente otimizador da fertilização in vitro; na fabricação de kits para diagnóstico de condições veterinárias e protocolos relacionados à ovulação de mamíferos; e na fabricação de suplemento para o cultivo de células.
[0085] Exemplo 1: Extração de RNA e síntese de cDNA a partir de uma hipófise equina
[0086] Uma glândula hipófise foi obtida através da necropsia de um cavalo (Equus caballus), macho, raça meio-sangue árabe, de 19 anos e imediatamente acondicionada em RNAholder (Bioagency© Biotecnologia), a 4°C, até ser macerada em nitrogênio líquido, utilizando-se cadinho e pistilo. O RNA total foi extraído deste macerado de hipófise utilizando-se o Illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare®, Buckinghamshire, England), seguindo as recomendações do fabricante. A concentração e pureza do RNA obtido foram determinadas através de quantificação em nanoespectrofotômetro (ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, EUA) e leitura da relação de absorbância Abs260/Abs280 e Abs260/Abs230 nm.
[0087] Uma alíquota de 1,ÜMg de RNA total de hipófise equina foi utilizado como molde para uma reação de transcrição reversa, utilizando o kit da enzima ImPromTM-II RT (Promega Corporation, Madison, EUA); Super Script II (Invitrogen), sendo as reações realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Ao final, as amostras foram diluídas 3 vezes em água deionizada, obtendo-se um volume final de 60μL e estocadas a - 80⍛C.
[0088] Exemplo 2: Amplificação das cadeias codificantes para eCG α e β, a partir desta biblioteca de cDNA, por PCR
[0089] Os primers utilizados para amplificação das sequências de cDNA foram desenhados baseando-se nas sequências codificadoras completas de cada uma das duas subunidades de eCG contidas na base de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov; National Center for Biotechnology Information, U. S. N_M - U. S. National Library of Medicine, Bethesda, EUA (NM_access number α: 001099763.1, β: 001490342.2) e sintetizados pela empresa Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM /Thermo Fisher Scientific Inc. Os primers liofilizados foram reconstituídos em solução tampão 10mM Tris-Cl (pH 8,0) para gerar uma solução estoque a 100μM e soluções de uso a 10μM. As sequências dos primers utilizados na amplificação dessas cadeias e seus intermediários obtidos nos passos de Engenharia Genética estão discriminadas na Tabela 1.
[0090] O cDNA total de tecido hipofisário equino foi utilizado para a amplificação das sequências codificadoras de ambas as subunidades de eCG.
[0091] Os primers (9) e (5) foram utilizados para amplificar a sequência codificadora de eCGβ completa, e a sequência codificadora da eCGa completa foi amplificada utilizando-se os primers (6) e (10).
[0092] Para a amplificação, as reações de polimerase em cadeia (PCR) foram realizadas utilizando-se a enzima High Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUATM). A 100 ng de amostras de cDNA de hipófise equina foram adicionados 1X tampão High Fidelity PCR Buffer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 0,2 mM de dNTPs (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 2mM de MgSO4 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 400 nM de primer Forward (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 400 nM de primer Reverse (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EUA), 1,0 U da enzima DNA polimerase descrita acima e água deionizada para completar 50,0μL de volume de reação. A reação foi conduzida sob as seguintes condições: 94⍛C por 1 minuto; 35 ciclos de: 94⍛C por 30 segundos, 55⍛C (eCGα) ou 58⍛C (eCGβ) por 30 segundos e 68⍛C por 1 min; extensão final a 68⍛C por 2 min.
[0093] Os amplicons foram detectados através de géis de agarose a 2,0%, corados com 0,5μg/mL de brometo de etídeo, e o produto de tamanho esperado foi isolado com bisturi e purificado através do GFX DNA and Band Purification Kit (GE Healtcare, Carlsbad, CA, EUA), segundo recomendações do fabricante.
[0094] Exemplo 3: Clonagem das cadeias eCGa e eCGB nos vetores de expressão pcDNA 3.3 e pNU-1 para células de mamífero
[0095] Para a obtenção do vetor de expressão da cadeia alfa da reCG, pNU1-αeCG, digeriu-se o fragmento de DNA purificado, previamente obtido a partir de uma reação de PCR com os primers 5 e 9 descritos na Tabela 1, e contendo a região codificadora da αeCG, com as enzimas de restrição EcoRI e Notl, seguida de inativação térmica das enzimas. Procedeu-se com a ligação do fragmento de DNA αeCG purificado e o vetor pNU1 co-digerido com as enzimas de restrição EcoR\ e NotI. Alíquotas das reações de ligação foram utilizadas para a transformação de bactérias Escherichia coli cepa DH10B por eletroporação. Para a seleção das colônias recombinantes contendo o vetor pNU1-αeCG, utilizou-se o antibiótico ampicilina na concentração de 100 μg/mL.
[0096] A obtenção do plasmídeo recombinante foi confirmada a partir da obtenção do seu perfil de restrição com as enzimas EcoRI e NotI. A construção do vetor pcDNA3.3-βeCG foi realizada através da subclonagem da cadeia βeCG presente originalmente no plasmídeo pNU1-βeCG. Para tanto, digeriu-se o vetor pNU1-βeCG com as enzimas de restrição XbaI e MssI para a liberação da região codificadora da βeCG e sua purificação por eletroforese em gel de agarose e adsorção à sílica. Procedeu-se com a ligação do fragmento de DNA βeCG purificado e o vetor pcDNA3.3 co-digerido com as enzimas de restrição NheI e MssI. Alíquotas das reações de ligação foram utilizadas para a transformação de bactérias Escherichia coli cepa XL1-Blue por eletroporação. Para a seleção das colônias recombinantes contendo o vetor pcDNA3.3-βeCG, utilizou-se o antibiótico ampicilina na concentração de 100 μg/mL. A obtenção do plasmídeo recombinante foi confirmada a partir da obtenção do seu perfil de restrição com a enzima MluI.
[0097] Os vetores pNU1-αeCG e pcDNA3.3-βeCG foram caracterizados por sequenciamento de DNA automatizado, utilizando o kit Big Dye® (Thermo Fisher Scientific™) e o sequenciador ABI Prism 3700 DNA Analyzer (Thermo Fisher ScientificTM), e diversos iniciadores que se alinham ao longo dos vetores de expressão pNU1 e pcDNA3.3, e nos insertos αeCG e βeCG. A montagem das sequências consenso dos vetores pNU1-αeCG e pcDNA3.3-βeCG foi realizada a partir das sequências individuais obtidas, utilizando-se o programa SeqMan do pacote DNASTAR. O mapa esquemático dos vetores de expressão pNU1-αeCG e pcDNA3.3-βeCG estão representados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.
[0098] Exemplo 4: Co-transfecção estável por lipofecção das construções pcDNA 3.3-βeCG e pNU1-αeCG em células CHO-DG44 cultivadas em suspensão e mantidas em meio definido.
[0099] As células CHO-DG44 cGMP utilizadas para a co-transfecção estável das cadeias αeCG e βeCG fazem parte do sistema Freedom DG44 (Invitrogen®). As células foram cultivadas, segundo as recomendações do fabricante, em suspensão e sob agitação (100-120 rpm), em frasco tipo “Spinner” contendo 30mL de meio CD DG44 suplementado com 8mM de L-glutamina e 0,18% de Pluronic, em atmosfera úmida a 37°C e 8%CO2. A cada 3 ou 4 dias, o cultivo celular foi avaliado quanto à sua densidade celular e porcentagem de células viáveis, e subcultivado para uma densidade de cerca de 3x105 células viáveis/mL.
[00100] Os vetores pNU1-αeCG e pcDNA3.3-βeCG foram linearizados com a enzima de restrição PvuI para otimização do processo de inserção dos cassetes de expressão de interesse no genoma das células CHO-DG44. Após linearização, os plasmídeos foram purificados por precipitação e quantificados por espectrofotometria. Para a co-transfecção, 9qg de cada plasmídeo foram misturados a 600μL de meio OptiPro SFM (Invitrogen). Em paralelo, 15 μL do reagente FreeStyle Max Reagent (Invitrogen) foram misturados a 600 μL de meio OptiPro SFM (Invitrogen). Em seguida, as duas misturas foram combinadas e incubadas por 10min à temperatura ambiente, para permitir a formação dos complexos. Posteriormente, a mistura de DNA e reagente FreeStyle foi gotejada nas células (1,15 x 107 células viáveis) agitando-se suavemente a suspensão. Em seguida, o cultivo foi mantido em incubadora à 37°C e 8% CO2.
[00101] Exemplo 5: Seleção dos transfectantes estáveis a partir das células CHO-DG44 co-transfectadas estavelmente com os vetores de expressão pcDNA 3.3-βeCG e pNU1-αeCG
[00102] Cerca de 48h após a co-transfecção as células foram transferidas para o meio de seleção (OptiCHO suplementado com 8mM de glutamina e 500μg/mL de G418). Após cerca de 20 dias de cultivo em meio de seleção, obteve-se uma sub-população celular resistente ao meio de seleção e, portanto, portadoras de pelo menos uma cópia de cada um dos vetores de interesse integrados no seu genoma.
[00103] O meio condicionado por 96h desta população mista original foi coletado para avaliação da produtividade de reCGα+β através de um ELISA específico (kit Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - DRG), seguindo o manual provido pelo fabricante. Os valores de absorbância foram determinados a 450nm por leitura em um espectrofotômetro de placa (SpectraMax M2 - Molecular Devices). Uma curva padrão, fornecida pelo kit, foi utilizada como referência para uma análise logística de 4-parâmetros. Normalizou-se a concentração de reCG nos meios de cultura pelo número de células viáveis no momento da coleta. Obteve-se a produtividade de 1,3UI/mL/milhão de células viáveis na população mista inicial.
[00104] Exemplo 6: Enriquecimento celular a partir da população mista CHO-DG44 eCGα + eCGβ baseado nos níveis de expressão do reCG
[00105] O protocolo de enriquecimento foi realizado por diluição seriada da população mista CHO-DG44 cGMP pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG em meio de cultura (FortiCHO + L-glutamina 6mM + suplemento HT 1X + 10% de meio condicionado por 96 horas pela população celular mista original) até a obtenção de uma concentração teórica de 2 células viáveis em 200μL de meio. Essas células foram semeadas em poços de placa de 96 poços, e colocadas para crescer em incubadora a 37°C e 5% de CO2 por até 25 dias. O protocolo descrito gerou 10 populações, que foram expandidas até a obtenção de cultivos em volume de 5mL. Os meios condicionados por 96h dessas populações foram coletados, e avaliados quanto à sua produtividade por ELISA (kit Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - DRG) para a validação do enriquecimento obtido (Figura 5). O ensaio foi realizado com meios de cultivo condicionados e recém coletados, diluídos 100X no diluente do kit (Zero Standard). Como controle negativo, utilizou-se o meio condicionado por 96 horas pelas células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o vetor pNU1-EYFP. Normalizou-se a concentração de reCG nos meios de cultura pelo número de células viáveis no momento da coleta.
[00106] Na Figura 5, pode-se observar que o protocolo de enriquecimento da população mista CHO DG44 cGMP pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG gerou três populações enriquecidas em células produtoras de reCG, a saber: as populações enriquecidas D7, E9 e F9, que expressam cerca de 2, 2,5 e 5 vezes mais reCG, respectivamente, do que a população mista original.
[00107] Exemplo 7: Enriquecimento de subpopulações celulares com níveis mais elevados de expressão do reCG a partir da seleção das populações celulares enriquecidas CHO-DG44 eCGα + eCGβ E9 e F9 com doses crescentes de MTX e G418
[00108] Efetuou-se uma segunda etapa de seleção das populações mistas enriquecidas CHO DG44 cGMP D7 (pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG), CHO DG44 cGMP E9 (pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG) e CHO DG44 cGMP F9 (pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG) adicionando-se ao meio de cultivo (OptiCHO suplementado com 8mM de Glutamina) 30nM de MTX e 750μg/mL de G418 até a obtenção de populações celulares resistentes a essas doses dessas drogas, ou seja, populações com viabilidade celular superior a 85%.
[00109] A avaliação da produtividade das populações celulares geradas durante o protocolo da segunda etapa de seleção com MTX e G418 foi realizada utilizando-se o kit de ELISA anti-PMSG (Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - Alpco), de acordo com as orientações do fabricante. Como controle negativo, utilizou-se o meio condicionado por 96h pelas células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o vetor pNU1-EYFP. Normalizou-se a concentração de reCG nos meios de cultura pelo número de células viáveis no momento da coleta. Os resultados estão representados na Figura 6.
[00110] Na Figura 6, pode-se observar que a segunda etapa de seleção com MTX e G418 permitiu a seleção de subpopulações celulares com produtividades superiores àquelas das populações enriquecidas originais. Entre elas, destaca-se a subpopulação mista CHO DG44 cGMP E9 (pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG) 30nM MTX + 750μg/mL G418 (30/750), cujo aumento na produtividade foi cerca de 9x em relação à população enriquecida original. As outras subpopulações celulares tiveram incremento na produtividade da ordem de 3x maior que as populações enriquecidas originais.
[00111] Exemplo 8: Isolamento de clones celulares com níveis mais elevados de expressão do reCG a partir das populações celulares enriquecidas CHO-DG44 eCGα + eCGβ E9 e F9 30 MTX/750 G418
[00112] O isolamento de clones celulares foi realizado conforme recomendado no manual do distribuidor do sistema FreedomTM [Freedom™ DG44 Kit - For transfection of CHO DG44 Cells (cGMP banked) and development of stable cell lines for protein production - Publication Part Number MAN0003649 - Revision Date 27 April 2011, pgs 53 a 57]. Foi realizada uma diluição seriada dos cultivos celulares das populações enriquecidas CHO DG44 cGMP E9 30/750 (pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG) e CHO DG44 cGMP E9 30/750 (pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG) de forma que, ao final desse procedimento, obtivéssemos uma suspensão celular de concentração teórica de 37,5 células viáveis/mL.
[00113] Distribuiu-se 20pL dessas suspensões celulares por poço de placas de 384 poços de cultivo não aderente. Dessa forma, a densidade celular por poço ficou, teoricamente, 0,75 célula/poço. O meio de cultivo utilizado durante o isolamento dos clones consistiu de FortiCHO, L-glutamina 6mM, suplemento HT 1X, 1mM de Piruvato de sódio, e 10% de meio condicionado por 96 horas pela respectiva população celular mista. A placa de 384 poços foi mantida em uma incubadora a 37⍛C e 5% CO2.
[00114] Cerca de 2h após o plaqueamento, avaliou-se o número de células por poço ao microscópio, verificando-se que parte dos poços que continham células, possuíam uma única célula. O crescimento celular foi avaliado a cada três ou quatro dias. Os clones que atingiram uma densidade celular na faixa de centenas de células/poço foram inicialmente transferidos para poços de uma placa de cultivo para células não aderentes de 96 poços, posteriormente, para poços de uma placa de cultivo para células não aderentes de 24 poços, e, finalmente para garrafas T25 não aderentes, em condições regulares de cultivo, ou seja, em meio OptiCHO suplementado com 8mM de glutamina, e mantidos a 37°C e 8% CO2. Foram obtidos nove clones a partir da população enriquecida CHO DG44 cGMP E9 30/750 (pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG) e 10 clones a partir da população enriquecida CHO DG44 cGMP F9 30/750 (pNU1-αeCG + pcDNA3.3-βeCG).
[00115] Avaliou-se a produtividade da reCGα+β dos clones isolados por ELISA específico para eCG (Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - Alpco), de acordo com as orientações do fabricante. Para a realização do ensaio, utilizou-se os meios de cultivo condicionados por 96 horas e recém coletados. Como controle negativo, utilizou-se o meio condicionado por 96 horas pelas células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o vetor pNU1-EYFP. Normalizou-se a concentração de eCG nos meios de cultura pelo número de células viáveis no momento da coleta. Os resultados estão representados na Figura 7. Foi obtido um clone com produtividade aproximadamente 28 UI/mL/milhão de células viáveis (clone D3 pnapcb). Exemplo 9: Caracterização estrutural da reCGα+β por Western blot
[00116] A técnica de Western blot foi utilizada para a caracterização estrutural especifica das moléculas de eCG produzidas de forma recombinante, tanto na sua forma fusionada reCGβα, quanto do heterodímero reCGα+β. Amostras de meio condicionado por 96h foram coletados a partir do cultivo das células CHO-DG44 cGMP βαeCG E11-300nM, produtoras da forma fusionada reCGβα, das células CHO-DG44 cGMP a+β D3 pnapcb, produtoras do heterodímero reCGα+β, e de células CHO-DG44 cGMP EYFP (controle negativo). A quantificação de eCG nas amostras foi realizada pelo método de ELISA anti-PMSG (Equine Pregnant Mare Serum Gonadotropin ELISA - DRG). Posteriormente, as amostras e o controle positivo (Novormon) foram concentrados por ultrafiltração (Filtro Amicon Ultra 0,5 10K) para um título final de 8000 UI/mL. O volume de meio condicionado do controle negativo utilizado foi calculado de forma que representasse proporcionalmente o número de células viáveis presentes no momento da coleta das células CHO-DG44 cGMP PαeCG E11-300nM, e o volume utilizado para a análise de 75UI de reCG. Posteriormente, o volume calculado do controle negativo foi concentrado pelo mesmo fator de concentração utilizado para a amostra E11-300nM. Três diferentes quantidades de eCG (25, 50 e 75UI) foram avaliadas por eletroforese (12% SDS-PAGE) em condições não redutoras e sem desnaturação prévia por calor. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose por transferência úmida por duas horas. Após a transferência, a membrana foi bloqueada com solução de 5% de leite desnatado em TBS-Tween 0,05% por uma hora. Em seguida, a membrana foi marcada por uma hora com o anticorpo primário anti-PMSG (AP02036SU-N - Acris) diluído 1:2000 em solução de bloqueio, e incubada a temperatura ambiente. Posteriormente, foram realizadas três lavagens de 10min cada da membrana com solução de TBS-Tween 0,05%, e, posteriormente, incubou-se a membrana por 45min com o anticorpo secundário anti-IgG de coelho (anti-rabbit conjugado com HRP - horseradish peroxidase - Sigma-Aldrich #A4914) diluído em solução de bloqueio na diluição de 1:2.000. Após três lavagens de 10min cada com TBST, a membrana foi incubada por 5min com o substrato da enzima peroxidase, e o sinal luminescente foi registrado em filme radiográfico.
[00117] A reCGβa produzida pelo clone E11-300nM e a reCGα+β produzida pelo clone D3 pnapcb apresentaram imunorreatividade ao anticorpo anti-eCG utilizado (Figura 8). Adicionalmente, determinou-se que a reCGβα produzida pelo clone E11-300nM possui peso molecular aparente de aproximadamente 40 KDa, e que a reCGα+β produzida pelo clone D3 pnapcb apresenta peso molecular aparente de 45 kDa em condições não redutoras e sem desnaturação prévia por calor (Figura 8).
[00118] Exemplo 10: Purificação da reCGα+β por cromatografia de troca catiônica
[00119] A cromatografia de troca catiônica foi realizada a partir do meio de cultivo OptiCHO condicionado por 96h pelo clone celular CHO-DG44 cGMP αeCG + βeCG D3 pnapcb. Antes do início do procedimento de purificação, ajustou-se o pH do meio condicionado para 6,5 através da adição de HCl 10%, que foi então filtrado em filtro de 0,45qm. A cromatografia de troca catiônica foi realizada empregando-se a coluna comercial Hitrap SP Fast Flow (partículas de 90 μm, dimensão de 16 x 25mm, 5mL de volume) com auxílio do sistema cromatográfico Akta Purifier UPC 100 e programa Unicorn 5.31 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). O canal A1 foi alimentado com o tampão NaCl 0,1 M e 8mM Acetato de sódio pH 3,5, o canal A2 com o tampão Na2HPO4 0,1 M pH 4,4, o canal B1 com o tampão NaCl 0,8M e 8mM Acetato de sódio pH 3,5, e o canal B2 com o tampão NaCl 2M e Tris 20mM pH 7. Ao longo da cromatografia, utilizou-se um fluxo de 2 mL/min. Iniciou-se o procedimento com o equilíbrio da coluna com 15 mL de meio OptiCHO com o pH ajustado para 6,6 com HCl 10% v/v. Após injeção da amostra, seguiu-se com a primeira (tampão A1) e a segunda (tampão A2) etapas de lavagem, utilizando 5 volumes de coluna (VC) por lavagem. A eluição foi realizada em regime isocrático, em fluxo de 2 mL/min, utilizando-se 5 VC do tampão na linha B1, e na sequência foi realizada a lavagem e reconstituição da coluna com 3 VC do tampão na linha B2. Durante o procedimento, coletou-se a fração correspondente a segunda fração de 5 mL referente a etapa de eluição. A Figura 9 representa o perfil eletroforético típico obtido da reCGα+β purificada, observado após fracionamento por eletroforese em gel de poliacrilamida 12% não desnaturante, seguido de coloração com prata.
[00120] Exemplo 11: Análise do perfil de glicosilação da reCG
[00121] A metodologia utilizada para avaliação qualitativa do perfil de glicosilação presente na reCGα+β foi adaptada em relação àquela descrita por Legardinier e colaboradores (LEGARDINIER et al., Mammalian-like nonsialyl complex-type N-glycosylation of equine gonadotropins in Mimic insect cells. Glycobiology. 2005 15(8): 776-90), e que se baseia na utilização de um painel de lectinas para detecção de resíduos específicos das cadeias oligossacarídicas na molécula de reCG. Ela envolve, primeiramente, a imobilização das proteínas purificadas a serem analisadas em poços de placa de 96 poços quimicamente tratada para otimização da adsorção proteica (NUNC-Immuno Plate/ MaxiSorp-NUNC) e posterior sondagem por lectinas que reconhecem especificamente diferentes estruturas de glicanos.
[00122] Cerca de 200 μg das proteínas purificadas produzidas pelo clone D3 pnapcb foram diluídos em tampão carbonato de sódio 0,1 M pH 9,6, e dispensados em poços da placa anteriormente mencionada. A imobilização foi realizada em câmera úmida por cerca de 16 horas. Após esta etapa, os poços foram lavados com solução fosfato salina sem Ca2+ e Mg2+ (PBSA), e bloqueados com tampão TBS + 0,05% Tween20 + 2% Polivinilpirrolidona K30 por 2 horas a 4°C.
[00123] Após nova lavagem, foi realizada a etapa de ligação das lectinas a resíduos específicos das cadeias laterais de glicanos. Foi utilizado um painel de cinco lectinas conjugadas à digoxigenina, e que são componentes de um kit comercial (DIG Glycan Differentiation Kit - Roche). As lectinas conjugadas utilizadas, e os respectivos resíduos de glicanos reconhecidos estão resumidos na Tabela 2 abaixo:
[00124] A etapa de ligação das lectinas é seguida por uma etapa de lavagem, e, na sequência, a etapa de incubação com um anticorpo anti-digoxigenina conjugado à enzima fosfatase alcalina, mais uma etapa de lavagem, seguida da etapa de detecção, utilizando-se o substrato da enzima fosfatase alcalina BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato). A reação é interrompida com EDTA e a leitura espectrofotométrica é realizada à 600nm. Como controle negativo, utilizou-se o meio condicionado por 96h pelas células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o vetor pNU1-EYFP, o qual foi submetido ao mesmo protocolo de purificação utilizado para a purificação da reCG, conforme descrito acima. Como controle positivo, utilizou-se 200 ng de eCG (Novormon). O ensaio foi realizado em duplicata para cada lectina. Os resultados estão representados na Figura 10.
[00125] O padrão observado para o controle positivo Novormon indica que a molécula de eCG selvagem apresenta um perfil de glicosilação que inclui sialilação terminal nos resíduos O- e N-ligados (lectinas SNA e MAA), compatível com aquele descrito na literatura (LEGARDINIER et al., Mammalian-like nonsialyl complex-type N-glycosylation of equine gonadotropins in Mimic insect cells. Glycobiology. 2005 15(8): 776-90). Em relação à reCGα+β produzida pelo clone D3 pnapcb, podemos observar um padrão incompleto de glicosilação, com ausência da sialilação terminal nos resíduos O- e N-ligados (lectina DSA), indicando a terminação da cadeia de glicanos na unidade dissacarídica Gal-(1-4)GlcNAc nas cadeias de glicanos N-e/ou O-ligadas, e/ou a terminação da cadeia de glicanos na unidade monossacarídica GlcNAc como resíduo terminal O-ligado.
[00126] Exemplo 12: Avaliação da atividade biológica in vivo da reCGα+β
[00127] Todos os experimentos envolvendo animais, bem como métodos adotados para criação e formas de manutenção e experimentação, seguiram as normas do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA) do Instituto de Química da USP. O estudo foi conduzido através do ensaio recomendado pela Farmacopeia Britânica, descrito por Cole & Erway (Cole and Erway, 1941). Os animais foram organizados em grupos de 5 a 10 animais por caixa, recebendo água e ração esterilizadas e ad libitum, e mantidos em períodos de 12h de luz e 12h de escuridão, a 22°C constantes. O ensaio para avaliação da atividade biológica in vivo da eCG se baseia na determinação do efeito dose-resposta do hormônio nos pesos ovariano e uterino de ratas pré-púberes. Para a avaliação funcional in vivo da reCGα+β recombinante produzida pelo clone celular D3 pnapcb, utilizou-se tanto amostras de meio de cultivo condicionado por 96h por estas células (Figura 11), bem como uma preparação da reCGα+β purificada por cromatografia de troca catiônca a partir de amostra de meio condicionado por 96 pelo clone D3 pnapcb (Figura 12). Adicionalmente, avaliou-se a atividade biológica in vivo da reCG presente em amostras de meio condicionado por 96h por clones produtores adicionais (clones F22, L2, L13, I8D14 e I14D14) (Figura 13). As amostras de meio condicionado foram concentradas por ultrafiltração, utilizando-se colunas Vivaspin 20Ml e de corte de 10kDa (GE Healthcare). Após a etapa de concentração, estimou-se a quantidade reCGα+β por ELISA nas amostras de meio condicionado concentradas e na preparação purificada da reCGα+β, e procedeu-se com a injeção subcutânea da reCGα+β em ratas da linhagem Sprague-Dawley de idade entre 23 e 25 dias. Para obtenção da curva dose-resposta, foram utilizadas as doses de reCGα+β de 1,14, 2,28, 5,71, 11,4, 22,8 e 45,7 μg, diluídas em PBSA (diluente). Para o produto comercial de referência, eCG obtido a partir de plasma de éguas prenhes (Novormon), empregou-se as doses de 1,14, 2,28, 5,71 e 11,4 μg, diluídas em PBSA. Como controle negativo, procedeu-se com a injeção do veículo. As injeções foram realizadas em 5 animais por dose ou grupo experimental, e, cerca de 72 horas após a injeção, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2, e os ovários e úteros foram dissecados, secos e pesados. A resposta final para cada dose foi obtida através da média aritmética do peso dos órgãos (ovários ou úteros) dos cinco animais de cada ponto. O aumento no peso destes órgãos, comparativamente aos controles negativos, corresponde à resposta biológica do animal ao estímulo com eCG. Relativo ao clone D3 pnapcb, as Figuras 11A (amostras de meio condicionado) e 12A (amostras de reCG purificada) representam os perfis das respostas ovariana e uterina frente ao estímulo com diferentes doses de reCGα+β avaliadas, as Figuras 11B (amostras de meio condicionado) e 12B (amostras de reCG purificada) representam os aspectos morfológicos dos ovários e úteros frente as diferentes situações experimentais exploradas, e as Figuras 11C (amostras de meio condicionado) e 12C (amostras de reCG purificada) as curvas dose-resposta obtidas para os ovários, que foram obtidas por regressão logística de 4-parâmetros, realizada pelo software GraphPad Prisma 5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com), e utilizadas para o cálculo da dose efetiva (DE-50 ou ED-50) para a reCGα+β (clone D3 pnapcb) e o Novormon. Pode-se observar que o tratamento com a reCGα+β (clone D3 pnapcb) apresentou um perfil de resposta uterina e ovariana muito similar àquele observado após tratamento com o produto de referência, com uma razão das ED50 dos dois hormônios de aproximadamente 2. Entretanto, o mesmo padrão de respostas ovarianas não foi observado a partir de amostras de meio condicionado de outros clones (Figura 13, clones F22, L2, L13, I8D14 e I14D14), sendo que inclusive, para um deles (clone F22), apesar de apresentar uma produtividade volumétrica de reCG (~20UI/106 células/96 horas) similar à de outros clones, o reCG produzido por este clone não apresentou atividade biológica in vivo alguma. Estes resultados demonstram a heterogeneidade de formas da reCG produzidas por diferentes clones celulares, e como a utilização da ferramenta de varredura clonal baseada na observação da indução de um crescimento rápido e vigoroso dos tecidos uterinos e ovarianos em ratas imaturas é imprescindível para a identificação de configurações da molécula de reCG com atividade biológica in vivo.
[00128] Exemplo 13: Ensaio clínico realizado em vacas em anestro
[00129] Um ensaio clínico foi realizado em vacas em anestro com o produto reCGα+β produzido pelo clone D3 pnapcb. O estudo envolveu 40 fêmeas bovinas Nelore (Bos taurus indicus) e/ou mestiças (Bos taurus taurus X Bos taurus indicus) com idade entre 16 meses e 10 anos, peso compatível com a categoria e escore de condição corpórea (ECC) >2,5 (escala de 1 a 5). Os animais foram mantidos em piquete de Bracharia brizantha com lotação de 1 UA/ha em sistema de pastejo contínuo durante o período experimental e tiveram acesso livre a água e ao sal mineral.
[00130] Foram incluídos no estudo animais que não apresentavam doenças reprodutivas; não receberam nenhum tipo de procedimento reprodutivo (inseminação, cobertura ou colheita de embriões) 28 dias antes do início do experimento; estavam clinicamente saudáveis ao início do período experimental e não receberam quaisquer tratamentos de doenças nos 10 dias anteriores ao estudo; não tinham recebido administração de qualquer produto hormonal nos 30 dias precedentes ao estudo; apresentavam escore de condição corporal acima de 2,5 (escala de 1 a 5, AYRES et. al., Validation of body condition score as a predictor of subcutaneous fat in Nelore (Bos indicus) cows. Livest. Sci. 2009; 123:175-179). Para ser incluído no estudo um dos ovários do animal deveria apresentar folículo dominante.
[00131] As 40 fêmeas recrutadas, foram distribuídas em quatro grupos de tratamentos (CB050-1000 - reCGα+β 1000UI, CB050-2500 - reCGα+β 2500UI, Controle Negativo - salina e Controle Positivo Novormon 1000UI), de forma que cada grupo continha 10 animais. Os animais dos grupos tratados com as formulações CB050, preparada através da concentração da proteína reCG contida no sobrenadante da cultura de células por ultrafiltração, receberam uma dose única de 1000 UI (CB050-1000) ou 2500 UI (CB050-2500) de reCG via intramuscular, oito dias após o início do protocolo de sincronização da ovulação. Os animais do grupo “Controle Positivo” receberam uma única dose de 1000UI/animal, por via intramuscular, 8 dias após o início do protocolo de sincronização da ovulação. Os animais do grupo “Controle Negativo” receberam uma única dose de 5mL de solução fisiológica estéril.
[00132] No dia do início do estudo (D0), os animais foram avaliados quanto ao escore de condição corporal, estado geral de saúde e avaliação reprodutiva via ultrassonografia transretal. Nesse mesmo dia (D0), iniciou-se o protocolo de sincronização da emergência da onda folicular. A sincronização consistiu na administração intramuscular de 2mg de benzoato de estradiol, 530μg de cloprostenol sódico juntamente com a inserção de um dispositivo intravaginal contendo 1g de progesterona. Cinco dias após o início do protocolo (D5) as fêmeas foram homogeneamente distribuídas de acordo com a idade, escore de condição corporal, presença de corpo lúteo e população folicular no D0 em 4 grupos experimentais, com 10 animais cada, conforme descrito acima. Nesse momento, os animais foram distribuídos em grupos, onde receberam os tratamentos (1000UI ou 2500UI de reCG da invenção; 1000UI de Novormon ou 5 mL de controle negativo). Oito dias depois (D8), o dispositivo intravaginal de progesterona foi removido e todos os animais receberam por via intramuscular, 530μg de Cloprostenol sódico (PGF) e 1 mg de cipionato de estradiol.
[00133] As avaliações ultrassonográficas (Kai Xin, KX 5100, Xuzhou KaiXin Electronic Instrument Company Ltd, China; Figura 10) foram realizadas em todos os animais do estudo, nos momentos: seleção dos animais (D0) e no D8 para avaliação da quantidade de folículos grandes, soma da quantidade de folículos médios e grandes, taxa de superestimulação 1 (soma de folículos grades por fêmea) e taxa de superestimulação 2 (soma de folículos médios e grandes por fêmea).
[00134] Pode-se observar na Figura 14, que as respostas quanto à quantidade de folículos grandes, à soma da quantidade de folículos médios e grandes, e às taxas de superestimulação 1 e 2 associadas ao tratamento com 2500UI de reCG foi praticamente idêntica àquela observada nos animais tratados com 1000UI de eCG comercial (Novormon), atestando a atividade biológica in vivo da reCG em uma das espécies-alvo (vacas).
Claims (17)
- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
- (a) preparar e obter sequências de DNA codificadoras das cadeias α e β da reCG,
- (b) inserir as ditas sequências de DNA codificadoras em vetores de expressão, de tal forma que as ditas sequências de DNA codificadoras estejam funcionalmente ligadas a elementos promotores da transcrição gênica,
- (c) manipular geneticamente uma linhagem celular de interesse envolvendo a inserção genômica, em uma mesma célula, de um primeiro vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia α da reCG, e de um segundo vetor de expressão da sequência de DNA que codifica a cadeia β da reCG,
- (d) Co-transfectar estavelmente os vetores de expressão das cadeias α e β da reCG na linhagem celular de interesse de forma a gerar populações celulares mistas expressando independentemente a primeira e a segunda sequências de DNA mencionadas, de tal forma que as cadeias polipeptídicas α e β sejam produzidas como moléculas separadas em uma mesma célula da linhagem celular de interesse mencionada,
- (e) isolar sub-fenótipos ou clones celulares a partir de uma população celular mista inicial gerada através da co-transfecção estável dos vetores de expressão das cadeias α e β da reCG,
- (f) identificar clones ou sub-fenótipos celulares associados à produção de formas biologicamente ativas da reCG através da avaliação da presença de atividade biológica tipo eCG em amostras de meio de cultivo condicionado por clones celulares representando diferentes sub-fenótipos celulares, sendo a atividade biológica tipo eCG reconhecida através da observação da indução de um crescimento rápido e vigoroso dos tecidos uterinos e ovarianos em ratas imaturas,
- (g) cultivar o clone celular geneticamente modificado expressando a reCG biologicamente ativa, e
- (h) recuperar a reCG biologicamente ativa a partir do meio de cultivo condicionado pelo clone celular geneticamente modificado.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências codificadoras das cadeias α e β da reCG estarem definidas nas sequências nucleotídicas SEQ ID NO.1 e SEQ ID NO.2, respectivamente.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências codificadoras das cadeias α e β da reCG estarem clonadas em vetores de expressão diferentes.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão da cadeia α da reCG é o vetor plasmideal pNU1.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão da cadeia β da reCG é o vetor plasmideal pcDNA 3.3.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a linhagem celular de interesse é derivada de células de mamíferos.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a linhagem celular de interesse é a CHO-DG44.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as cadeias polipeptícas α e β da reCG possuem as sequências de aminoácidos definidas nas sequências SEQ ID NO.3 e SEQ ID NO.4 respectivamente, são produzidas pela linhagem celular de interesse, e secretadas pela mesma na forma de um heterodímero com atividade biológica na espécie alvo.
- PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que proporciona uma taxa de expressão de reCG na faixa de 1 a 100 mg/L.
- PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificação é realizada por pelo menos um dentre os seguintes métodos cromatográficos: troca iônica e cromatografia de afinidade, precipitação de proteínas, ultrafiltração ou filtração tangencial.
- GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo processo definido nas reivindicações 1 a 10.
- GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as cadeias polipeptícas α e β da reCG estão completamente ou parcialmente glicosiladas.
- GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as cadeias polipeptícas α e β da reCG estão parcialmente glicosiladas, e contêm a unidade dissacarídica Gal-(1-4)GlcNAc como resíduo terminal N-ligado e/ou O-ligado, e/ou ainda a unidade monossacarídica GlcNAc como resíduo terminal O-ligado.
- COMPOSIÇÃO VETERINÁRIA, caracterizada pelo fato de que compreende:
- (a) uma quantidade veterinariamente eficaz da reCG definida pelas reivindicações 11 a 13;
- (b) opcionalmente aditivos; e
- (c) um veículo farmaceuticamente aceitável.
- USO DA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, definida na reivindicação 11, ou da composição veterinária definida na reivindicação 14 contendo dita gonadotrofina, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de condições veterinárias e protocolos relacionados à reprodução e à ovulação de mamíferos.
- USO DA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, definida na reivindicação 11, ou da composição definida na reivindicação 14 contendo dita gonadotrofina, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de kit de diagnóstico de condições veterinárias e protocolos relacionados à reprodução e à ovulação de mamíferos.
- USO DA GONADOTROFINA CORIÔNICA EQUINA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ATIVA, definida na reivindicação 11, ou da composição definida na reivindicação 14 contendo dita gonadotrofina, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de suplemento para o cultivo de células.
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