ES2269054T3 - Metodo para separar sustancias usando fuerzas dielectroforeticas. - Google Patents
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Abstract
Un método para separar una sustancia compleja de una "molécula espe- cífica" en una muestra y una "sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la molécula específica" que se une a la "molécula específica" de moléculas distintas de la "molécula específica" en la muestra, que comprende - formar la sustancia compleja de la "molécula específica" y la "sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la molécula específica", caracterizado por las etapas de - aplicar la mezcla de reacción resultante que contiene la sustancia compleja a una dielectroforesis usando un campo eléctrico no uniforme, y - separar la sustancia compleja de las moléculas distintas de la "molécula especí- fica" mediante fuerzas dielectroforéticas.
Description
Método para separar sustancias usando fuerzas
dielectroforéticas.
La presente invención se refiere a métodos para
separar dos o más tipos de moléculas usando fuerzas
dielectroforéticas.
Recientemente, el avance en la tecnología de los
semiconductores ha establecido una tecnología de tratamiento de
materiales a escala de nanómetros a micrómetros por medio de una
tecnología de micromaquinarias como fotolitografía, que contenía
avanzando también en la actualidad.
En los campos de la química y la bioquímica, una
nueva tecnología denominada un Sistema de Microanálisis Total
(\mu-TAS) en laboratorio, en el que una pastilla
está creciendo, en el que esta tecnología de micromaquinaria es
empleada para llevar a cabo una serie completa de etapas analíticas
químicas/biológicas de extracción de componente(s)
que van a ser analizados de muestra biológicas (etapa de extracción), análisis del (o de los) componente(s) con reacción(es) química(s)/biológica(s) (etapa de análisis) y posterior separación (etapa de separación) y detección (etapa de detección) usando un dispositivo analítico altamente pequeño integrado en una pastilla, en que cada lado tiene luna longitud de unos pocos centímetros a unas pocas decenas de centímetros.
que van a ser analizados de muestra biológicas (etapa de extracción), análisis del (o de los) componente(s) con reacción(es) química(s)/biológica(s) (etapa de análisis) y posterior separación (etapa de separación) y detección (etapa de detección) usando un dispositivo analítico altamente pequeño integrado en una pastilla, en que cada lado tiene luna longitud de unos pocos centímetros a unas pocas decenas de centímetros.
Los procedimientos del \mu-TAS
se espera que supongan una gran contribución a reducir el tiempo de
análisis, reduciendo las cantidades de muestras que van a ser
usadas y los reactivos para las reacciones químicas/biológicas, y
reducir el tamaño de los instrumentos analíticos y el espacio para
el análisis en el transcurso de todas las etapas analíticas
químicas/bioquímicas.
Para le etapa de preparación en
\mu-TAS, en particular, se han desarrollado
métodos electroforéticos capilares en los que un capilar (tubo
fino) con un diámetro interno de menos de 1 mm que está hecho de
Teflon, sílice o similares como material, es usado como la columna
separadora para conseguir la separación con diferencias de cargas
de sustancias bajo un campo eléctrico elevado, y métodos
cromatográficos de columna de capilaridad en los que un capilar
similar es usado para conseguir la separación con la diferencia de
interacción entre el vehículo en el medio de la columna y las
sustancias.
Sin embargo, los métodos electroforéticos
necesitan un alto voltaje para la separación y tienen un problema
de una baja sensibilidad de detección debido al volumen capilar
limitado en el área de detección y también en estos se encuentra el
problema de que no son adecuados para la separación de sustancias de
peso molecular elevado, aunque son adecuados para la separación de
sustancias de bajo peso molecular, ya que la longitud del capilar
para la separación está limitada en la pastilla capilar en una
pastilla y, por tanto, no se puede preparar un capilar en una
longitud suficiente para separar sustancias de peso molecular
elevado. Además, en los métodos cromatográficos de columnas
capilares, hay un límite en la preparación de la producción del
tratamiento de separación mayor y también es un problema que es
difícil reducir el tratamiento.
Por tanto, un medio de resolver los problemas
anteriormente descritos ha sido indicado ahora mediante métodos de
separación que utilizan un fenómeno en el que la colocación de
sustancias bajo un campo eléctrico no uniforme da lugar a una
polarización positiva y negativa en las sustancias, proporcionando
así una fuerza conductora para desplazar las sustancias, denominada
fuerza dielectroforética [H. A. Pohl, "Dielectrophoresis",
Cambridge Univ. Press (1978); T. B. Jones, "Electromechanics of
Particles", Cambridge Univ. Press (1995) y similares].
Estos métodos de separación se cree actualmente
que son actualmente el método de separación más adecuado en
\mu-TAS desde los siguientes puntos de vista: (1)
puede ser esperada una separación rápida a un bajo voltaje aplicado
sin requerir un voltaje elevado como el de la electroforesis
capilar, ya que un campo eléctrico y su gradiente pueden ser
aumentados hasta un alcance extremo y son empleados los electrodos
tratados con micromaquinaria, porque el grado de fuerzas
dielectroforéticas depende del tamaño y las propiedades dieléctricas
de las sustancias (partículas) y es proporcional al gradiente del
campo eléctrico; (2) puede ser minimizado un aumento de la
temperatura debido a la aplicación del campo eléctrico, y se puede
formar un campo eléctrico elevado, ya que un área de un campo
eléctrico fuerte está localizada en una zona significativamente
pequeña; (3) como la fuerza dielectroforética es una fuerza
proporcional al gradiente del campo eléctrico, la fuerza se
entiende que es independiente de la polaridad del voltaje aplicado,
y por tanto funciona bajo un campo eléctrico AC de una manera
similar a un campo eléctrico D.C. y, por lo tanto, si se emplea una
A.C. de frecuencia elevada, puede ser suprimida una reacción de
electrodos (reacción electrolítica) en una solución acuosa, de forma
que los propios electrodos puedan estar integrados en el canal
(trayectoria de flujo de la muestra); (4) puede ser esperada una
mejora en la sensibilidad de una detección, ya que no hay ninguna
restricción para el volumen de la cámara del componente de detección
como en la electroforesis de capilar, y
similares.
similares.
Como métodos de separación que utilizan fuerzas
dielectroforéticas como se describieron anteriormente, se han
descrito diversos métodos hasta ahora [M. Washizu et al.,
Conf. Rec. The Institute of Electrostastics Japan, '93 Ann. Meet.
(Int. Session), pag. 27-32 (1993); Y. Huang et
al., Biophys. J., vol 73, pag. 1118-1129 (1997)
y N. G. Green et al., J. Phys. D: Appl. Phys. vol 31,
25-30 (1998) y similares].
Por ejemplo, la publicación Journal of Physics
D, British Journal of Applied Physics (J. Phys. D: Appl. Phys.),
27, 2659-2662 (1994) describe que a partir de
suspensiones que contienen células HL-60 y células
sanguíneas normales, pudieron ser separadas las células
respectivas; Microbiology, 140, 585-591 (1994)
describe que a partir de suspensiones que contienen diferentes
microorganismos, los microorganismos pueden ser separados en
diferentes especies de levaduras y bacterias unos de otros; Journal
of Biotechnology, 32, 29-37 (1994) describe que a
partir de suspensiones que contienen células vivas y muertas de
levadura, pueden ser separadas las dos células una de otra; y J.
Phys. D: Appl. Phys., 31, 25-30 (1998) describe que
a partir de suspensiones que contienen partículas de látex que
tienen un diámetro de 93 nm y 216 nm, pueden ser separadas una de
otra las dos partículas por dielectroforesis y fuerzas de
electrofluidos.
electrofluidos.
Adicionalmente, M. Washizu et al., IEEE
Transaction IA, vol 30, nº 4, pag. 835-843 (1994)
informaron que el uso de soluciones que contienen un único
componente biológico como muestras, en que el componente es, por
ejemplo, avidina (68 kDa), concanavalina A (52 kDa),
quimotripsinógeno A (25 kD) o ribunucleasa A (13,7 kDa) es
capturado en el electrodo por fuerzas dielectroforéticas, y también
usando soluciones que contienen un único componente biológico como
muestras, el componente puede ser capturado en el electrodo por
fuerzas dielectroforéticas [la relación de captura fue de 100%
cuando se usó una muestra de DNA de 48,5 kb solo, aproximadamente
60% cuando se usó una muestra de DNA 15 kb solo, y poco % usando
una muestra de avidina (68 kDa solo)].
Sin embargo, los informes sobre métodos de
separación con fuerzas electroforéticas convencionales como se
describió anteriormente están limitados a separar partículas que
tienen una baja solubilidad en una solución, relativos a DNA y
proteínas, como diversas células y partículas de látex, o por lo
demás solamente capturando un único (un tipo de) DNA o proteína, y
ningún informe ha sido presentado todavía sobre la separación de
moléculas respectivas a partir de soluciones en las que están
disueltos dos o más tipos de moléculas de componentes biológicos,
en particular, por ejemplo, DNA y proteínas.
Esto es porque dos tipos o más de moléculas como
proteínas y DNA, que tienen un tamaño físico muy pequeño, en
comparación con las células y las partículas de látex, se considera
que son difíciles de separar uno de otro de la solución en que esas
moléculas están disueltas sobre la base de la diferencia entre el
tamaño de las respectivas moléculas usando fuerzas
dielectroforéticas, ya que la resistencia de las fuerzas
dielectroforéticas depende del tamaño físico de las sustancias, por
lo que las sustancias que tienen un volumen mayor recibirán una
mayor fuerza dielectroforética, y también porque la separación
convencional se h a llevado a cabo a una débil resistencia del
campo eléctrico inferior a 500 KV/m, por lo que la separación no se
puede conseguir.
El documento
EP-A-0.815.942 describe un método de
separación según el preámbulo de la reivindicación 1.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un método para separar dos o más tipos de moléculas
unos de otros usando fuerzas dielectroforéticas. Estos objetivos se
consiguen con un método según la reivindicación 1.
Es también un objeto de la presente invención
proporcionar un método para separar unos de otros dos o más tipos
de moléculas disueltas en una solución, usando fuerzas
dielectroforéticas, separación que había sido hasta ahora
imposible.
Además de ello, es un objeto de la presente
invención proporcionar un método capaz de separar rápida y
fácilmente las moléculas respectivas a partir de una solución en la
que están disueltos dos o más tipos de moléculas, por ejemplo,
moléculas de componentes biológicos como DNA y proteínas, separación
que había sido imposible por fuerzas dielectroforéticas.
La presente invención se lleva a cabo con el fin
de resolver los problemas anteriormente mencionados y, por primera
vez, ha conseguido la separación satisfactoria de dos o más tipos de
moléculas, separación que había sido imposible hasta ahora usando
fuerzas dielectroforéticas por medio de dos tipos de métodos
descritos con posterioridad.
El primer método comprende formar una sustancia
compleja de una "molécula específica" en una muestra y una
"sustancia capaz de cambiar las propiedades dielectroforéticas de
la "molécula específica" que se une a la "molécula
específica" contenida en la misma" y separar así la sustancia
compleja y las moléculas distintas de las moléculas específicas en
la muestra unas de otras. En los métodos de separación conocidos
hasta ahora con fuerzas dielectroforéticas, la separación no ha
sido facilitada en absoluto formando esta sustancia compleja, y
esta idea no ha sido reconocida en absoluto en el pasado.
El segundo método comprende colocar una solución
en el que dos o más tipos de moléculas, en particular, por ejemplo,
moléculas de componentes biológicos como DNA y proteínas, son
disueltas bajo un campo dieléctrico fuerte, es decir, un campo
eléctrico no uniforme que tiene una resistencia del campo eléctrico
de 50 KV/m o mayor. Es un nuevo descubrimiento desconocido hasta la
fecha que las moléculas respectivas puedan ser separadas unas de
otras mediante este método.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
(1)(a) un método para separar una sustancia compleja de una
"molécula específica" en una muestra y una "sustancia capaz
de cambiar las propiedades dielectroforéticas de la molécula
específica" que se une a la "molécula específica" a partir
de moléculas distintas de la "molécula específica" en la
muestra, que comprende formar la sustancia compleja de la
"molécula específica" y la "sustancia capaz de cambiar las
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica", y
aplicar la mezcla de reacción resultante que contiene la sustancia
compleja a la dielectroforesis, y separar la sustancia compleja de
las moléculas distintas de la "molécula específica"; y
(a) un método para medir la "molécula
específica" en la sustancia compleja separada o una molécula
distinta de la "molécula específica" en la muestra; y
(b) un método para separar una sustancia
compleja de una "molécula específica" en una muestra, una
"sustancia que se une a la molécula específica" y una
"sustancia capaz de cambiar las propiedades dielectroforéticas de
la molécula específica" que no está involucrada en la formación
de la sustancia compleja, que comprende poner en contacto la
muestra que contiene la "sustancia específica" con la
"sustancia que se une a la molécula específica", y la
"sustancia capaz de cambiar las propiedades dielectroforéticas de
la molécula específica" para formar la sustancia compleja, y
aplicar la mezcla de reacción resultante que contiene la sustancia
compleja para la dielectroforesis, y separar la sustancia compleja
de la "sustancia que se une a la molécula específica" que no
está involucrada en la formación de la sustancia compleja; y
(c) un método para determinar una cantidad de un
componente en una muestra, que comprende poner en contacto una
muestra que contiene una "molécula específica" con una
"molécula específica marcada por una sustancia marcadora" y
una "sustancia capaz de cambiar las propiedades dielectroforéticas
de la molécula específica" que se une a la "molécula
específica" para formar una sustancia compleja marcada de la
"molécula específica marcada por la sustancia marcadora" que
no está involucrada en la formación de la sustancia compleja, medir
la "molécula específica marcad por la sustancia marcadora" en
la sustancia compleja marcada separada dela "molécula específica
marcada por la sustancia marcadora" que no está involucrada en la
formación de la sustancia compleja, y determinar una cantidad del
componente en la muestra sobre la base del resultado de la medición;
y
(d) un estuche de ensayo para medir un
componente en una muestra para ser usada en los métodos (a) a (c),
que comprende una "sustancia capaz de cambiar las propiedades
dielectroforéticas de la molécula específica" en la muestra, que
puede formar una sustancia compleja con la ``molécula
específica.
Además, en la presente memoria descriptiva (2)
se describe un método que no pertenece a la invención para separar
dos o más tipos de moléculas unas de otras, que comprende colocar
una solución en la que dos o más tipos de moléculas están disueltas
bajo un campo eléctrico no uniforme que tiene una resistencia del
campo eléctrico de 500 KV/m o mayor, formado por electrodos que
tienen una estructura capaz de formar un campo eléctrico no
uniforme.
Más específicamente, se describe un método para
detectar una molécula que va a ser medida en una muestra, que
comprende hacer reaccionar una muestra líquida, en la que está
disuelta una "molécula que va a ser medida", y una solución,
en la que está disuelta una "sustancia que se une específicamente
a la molécula que va a ser medida", para obtener una solución en
la que están disueltas una sustancia compleja de la "molécula que
va a ser medida" y la "sustancia que se une específicamente a
la molécula que va a ser medida", y la "sustancia que se une
específicamente a la molécula que va a ser medida" que no está
involucrada en la reacción, colocando la solución bajo un campo
eléctrico no uniforme que tiene una resistencia del campo eléctrico
de 500 KV/m o mayor, en que el campo eléctrico está formado por
electrodos que tienen una estructura capaz de formar un campo
eléctrico horizontal y verticalmente no uniforme, que separa la
sustancia compleja de la "sustancia que se une específicamente a
la molécula que va a ser medida" que no está involucrada en la
reacción, y medir la "sustancia que se une específicamente a la
molécula que va a ser medida" en la sustancia compleja, o la
"sustancia que se une específicamente a la molécula que va a ser
medida" que no está involucrada en la reacción; y un método para
medir una sustancia que va a ser medida en una muestra, que
comprende hacer reaccionar una muestra líquida que contiene una
"molécula que va a ser medida", una "molécula que va a ser
medida marcada por una sustancia marcadora" y una "sustancia
que se une específicamente a la molécula que va a ser medida",
para obtener una solución que contiene una sustancia compleja de la
"molécula que va a ser medida marcada por una sustancia
marcadora" y la "sustancia que se une específicamente a la
molécula que va a ser medida", una sustancia compleja de la
"molécula que va a ser medida" y la "sustancia que se une
específicamente a la molécula que va a ser medida", y la
"molécula que va a ser medida marcada por una sustancia
marcadora" que no está involucrada en la reacción, colocando la
solución obtenida bajo un campo eléctrico no uniforme que tiene una
resistencia del campo eléctrico de 500 KV/m o mayor, en que el campo
está formado por electrodos que tienen una estructura capaz de
formar un campo eléctrico horizontal y verticalmente no uniforme,
separar la sustancia compleja de la "molécula que va a ser medida
marcada por una sustancia marcadora" y la "sustancia que se
une específicamente a la molécula que va a ser medida" de la
"molécula que va a ser medida marcada por una sustancia
marcadora" que no está involucrada en la formación del complejo,
y seguidamente medir la "molécula que va a ser medida marcada por
una sustancia marcadora" en la sustancia compleja de la
"molécula que va a ser medida marcada por una sustancia
marcadora" que no está involucrada en la formación de la
sustancia compleja, par determinar la cantidad de la molécula que
va a ser medida en la muestra, basándose en los resultados.
Los objetos y ventajas anteriores y otros de la
invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente
descripción.
La Figura 1 es una representación que muestra el
principio de la dielectroforesis.
La Figura 2 es una representación que muestra
ejemplos específicos de electrodos usados en la presente
invención.
La Figura 3 es una representación que muestra
una realización de sustratos de electrodos que tienen la trayectoria
de flujo usada en la presente invención.
La Figura 4 es una vista esquemática del
sustrato de electrodo de dielectroforesis elaborado en el Ejemplo
de Referencia 1.
La Figura 5 es una vista esquemática del
electrodo elaborado en el Ejemplo de Referencia 1.
La Figura 6 es una vista esquemática del
sustrato de electrodo que tiene la trayectoria de flujo elaborado
en el Ejemplo de Referencia 2.
La Figura 7 es una vista esquemática de la
sección a lo largo de la línea a-a' de la Figura
6.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la
relación entre concentraciones de biotina y relaciones de captura
obtenidas en el Ejemplo 1.
La Figura 9 son imágenes fluorescentes en el
electrodo obtenido en el Ejemplo 2, tomadas por microscopio láser
antes y durante la aplicación de un campo eléctrico.
La Figura 10 es un gráfico que muestra la
relación entre concentraciones de AFP en suero y concentraciones en
análisis de imágenes obtenidas en el Ejemplo 2.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la
relación entre concentraciones de AFP en suero y concentraciones de
análisis de imágenes obtenidas en el Ejemplo 2.
La Figura 12 es una vista esquemática del
electrodo antes y durante la aplicación de un campo eléctrico y
fotografías de microscopio de fluorescencia durante la aplicación de
un campo eléctrico obtenido en el Ejemplo 3.
La Figura 13 es un gráfico que muestra los
cambios a lo largo del tiempo de la cantidad de fluorescencia a la
salida de la trayectoria de flujo obtenida usando una solución de
\lambda-DNA marcada en el Ejemplo Experimental
2.
La Figura 14 es un gráfico que muestra los
cambios a lo largo del tiempo de la cantidad de fluorescencia a la
salida de la trayectoria de flujo obtenida usando una solución de
oligonucleótido marcado en el Ejemplo Experimental 2.
La Figura 15 es un gráfico que muestra la
relación entre las resistencias del campo eléctrico y las relaciones
de captura de un \lambda-DNA marcado obtenido en
el Ejemplo 4.
La Figura 16 es un gráfico que muestra la
relación entre las resistencias del campo eléctrico y la relaciones
de captura de una IgM marcada o una BSA marcada obtenidas en el
Ejemplo 5.
La Figura 17 es un gráfico que muestra la
relación entre \lambda-DNA marcado con biotina y
las relaciones de captura obtenidas en el Ejemplo 6.
Las realizaciones de la presente invención se
describirán como sigue.
Las fuerzas de dielectroforesis son fuerzas que
resultan del fenómeno descrito a continuación.
A saber, como se muestra en la Figura 1, una
molécula neutra colocada en un campo eléctrico tiene una carga de
polarización positivamente inducida +q en dirección descendente del
campo eléctrico y una carga de polarización negativamente inducida
-q en dirección ascendente del campo eléctrico, respectivamente, por
lo que +q recibe una fuerza +qE del campo eléctrico E y esta parte
es arrastrada en dirección descendente en el campo eléctrico,
mientras que -q recibe una fuerza -qE del campo eléctrico E y esta
parte es arrastrada en dirección ascendente en el campo eléctrico.
Si la molécula es neutra, +q y -q tienen un valor absoluto igual, y
si el campo eléctrico es uniforme independientemente de las
posiciones, ambas reciben fuerzas que están equilibradas y, por lo
tanto, la molécula no se desplaza. Sin embargo, en el caso en que
el campo eléctrico sea no uniforme como se muestra en la Figura 1,
una fuerza atractiva hacia un campo eléctrico fuerte se hace más
ancha, por tanto la molécula es conducida hacia el lado fuerte del
campo eléctrico. Este fenómeno en el que las moléculas neutras se
desplazan bajo un campo eléctrico no uniforme es denominado
dielectroforesis (DEP), y la fuerza recibida por las moléculas
durante ese tiempo se denomina fuerza dielectroforética. Si las
moléculas son con carga, el modo de desplazamiento es como uno que
comprende fuerzas electroforéticas además de fuerzas
dielectroforéticas.
Las muestras a las que puede ser aplicada la
presente invención incluyen muestras derivadas de un cuerpo vivo
como fluidos corporales que incluyen suero, plasma, fluido
cerebroespinal, fluido sinovial, linfático, etc. excreciones que
incluyen orina, heces, etc. y sus materiales tratados. Los
materiales tratados incluyen soluciones diluidas de estas muestras
derivadas de un cuerpo vivo en agua, tampones o similares, o los
reconstituidos disolviendo o poniendo en suspensión apropiadamente
moléculas como se describe con posterioridad a partir de estas
muestras derivadas del cuerpo en agua, tampones o similares. Las
muestras a las que se aplica la presente invención incluyen también
las que contienen las moléculas anteriormente descritas que están
químicamente sintetizadas.
El primer método según la presente invención
(abreviados a veces en lo sucesivo como realización (1)), se
refiere a un método para separar una molécula específica esta
muestra como en lo que antecede a partir de otras moléculas
co-existentes y, adicionalmente, determinar la
molécula separada, y un estuche de ensayo para ser usado en este
método.
Estas realizaciones de la presente invención
abarcan: (a) una caracterizada por formar una sustancia compleja de
una "molécula específica en una muestra" y una "sustancia
capaz de cambiar las propiedades dielectroforéticas de la molécula
específica" que se une a la "molécula específica", (b) una
caracterizada por formar una sustancia compleja formada por una
"molécula específica en una muestra", una "sustancia que se
une a una molécula específica" y una "sustancia capaz de
cambiar propiedades dielectroforéticas de la molécula específica"
que se une a la “molécula específica”, y (c) una caracterizada por
formar una sustancia compleja en una "molécula específica" en
una muestra o una "molécula específica marcada por una sustancia
marcadora" y "sustancia capaz de cambiar las propiedades
dielectroforéticas de la molécula específica" que se une a la
"molécula específica", y similares.
En cada una de estas realizaciones, una
"molécula específica" incluye una molécula destinada a medir
(también denominada una molécula que va a ser medida) y una
molécula distinta de una molécula destinada a medir (también
denominada una molécula que no va a ser medida).
Moléculas específicas (moléculas que van a ser
medidas) incluyen, por ejemplo, cadenas de nucleótidos (cadenas de
oligonucleótidos o cadenas de polinucleótidos), cromosomas, cadenas
de péptidos (por ejemplo, C-péptido, angiotensina I
y similares), proteínas (por ejemplo, proteínas de suero como
inmunoglobulina A (IgA), inmunoglobulina E (IgE), inmunoglobulina G
(IgG), \beta_{2}-microglubulina, albúmina y
ferritina; proteínas de enzimas como amilasa, fosfatasa alcalina y
\gamma-glutamiltransferasa; anticuerpos
antivirales para virus como Rubella virus, Herpes virus, Hepatitis
virus, ATL virus y virus del SIDA y sustancias antígenas derivadas
de estos virus; anticuerpos para diversos alergenos; lípidos como
lipoproteínas; y proteasas como tripsina, plasmina y serina),
cadenas de azúcares (por ejemplo, cadenas de azúcares de
\alpha-fetoproteína, CA19-9,
antígeno específico de la próstata, antígeno carcinoembriónico,
sustancias que tienen cadenas de azúcares particulares producidos
por células cancerígenas), lecitinas (por ejemplo, concanavalina A,
lecitina de Lens culinaris, lecitina de Phaseolus
vulgaris, lecitina de Dutura stramonium, lecitina de
germen de trigo) y similares.
Adicionalmente, las moléculas específicas
(moléculas que van a ser medidas) incluyen también moléculas que
existen como dos o más tipos de sustancias que tienen la misma
función o moléculas que existen como dos o más tipos de sustancias
que tienen una estructura similar pero que tienen una función
diferente como isozimas y hormonas, por ejemplo, enzimas como
amilasa, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida,
\gamma-glutamiltransferasa
(\gamma-GTP), lipasa, creatina quinasa (CK),
lactato deshidrogenasa (LDH), transaminasa
glutámica-oxaloacética (GOT), transaminasa
glutámica-pirúvica (GPT), renina, proteína quinasas,
tirosino quinasas; sustancias fisiológicamente activas como
hormonas esteroides, gonadotropina coriónica humana (hCG),
prolactina, hormona estimuladora del tiroides (TSH), hormona
luteinizante (LH); antígenos asociados al cáncer como antígeno
específico de la próstata (PSA),
\alpha^{2}-macroglubulina, antígeno
carcinoembriónico (CEA), \alpha-fetoproteína y
similares.
Una "sustancia capaz de cambiar propiedades
dielectroforéticas" en la presente invención (también denominada
una sustancia mejoradora de la separación) incluye una sustancia
que, uniéndose a una molécula específica, provoca diferencias de
comportamiento del funcionamiento dielectroforético entre la
molécula específica y las demás sustancias
co-existentes (moléculas que no van a ser medidas,
por ejemplo, uno o más tipos de sustancias que no estén
involucradas en la formación del complejo): por ejemplo 1) una
sustancia que pueda provocar como resultado que una cualquiera de
las dos sea capturada en el electrodo de dielectroforesis y las
demás no sean capturadas, y más específicamente una sustancia que
pueda proporcionar cambios en la velocidad de movimiento de la
molécula específica y las demás sustancias
co-existentes, por ejemplo, en el caso de emplear un
aparato denominado de cromatografía dielectroforética (aparato de
fraccionamiento del flujo de campo) en el que la separación se
lleva a cabo como se describe a continuación con la interacción
entre fuerzas dielectroforéticas provocadas por las moléculas en el
campo eléctrico y el movimiento molecular y, más preferentemente,
una sustancia mediante la cual una cualquiera de estas pueda ser
capturada en el electrodo y las demás se puedan hacer pasar a
través del electrodo de dielectroforesis sin ser capturadas en el
electrodo; o 2) una sustancia que pueda provocar un resultado que
una cualquiera de las dos reciba fuerzas dielectroforéticas
negativas y las demás reciban fuerzas dielectroforéticas positivas
y, más específicamente, una sustancia que, por ejemplo, pueda
permitir que solamente la molécula específica se una en una posición
particular en el electrodo dielectroforético y, más
preferentemente, una sustancia que pueda permitir que una cualquiera
de estas se una un una zona de fuerte resistencia del campo
eléctrico en el electrodo de dielectroforesis por fuerzas
dielectroforéticas positivas y las otras se unan en una zona de
débil resistencia del campo eléctrico en el electrodo de
dielectroforesis por fuerzas dielectroforéticas negativas; o
similares.
Estas sustancias incluyen óxidos de metales
inorgánicos como sílice y alúmina; metales como oro, titanio,
hierro y níquel; óxidos de metales inorgánicos y similares que
tienen grupos funcionales introducidos mediante un procedimiento de
acoplamiento de silano y similares; seres vivos como diversos
microorganismos y células eucarióticas; polisacáridos como agarosa,
celulosa, dextrano insoluble; compuestos macromoleculares sintéticos
como látex de poliestireno, copolímero de
estireno-butadieno, copolímero de
estireno-metacrilato, copolímero de
acroleína-dimetacrilato de etilenglicol, látex de
estireno-sulfonato de estireno, poliacrilamida,
poli(metacrilato de glicidilo), partículas revestidas con
poliacroleína, poliacrilonitrilo reticulado, compuesto acrílico o
copolímero de éster acrílico,
acrilonitrilo-butadieno, cloruro de vinilo-éster
acrílico y poli(acetato-acrilato de vinilo);
moléculas biológicas como eritrocitos, azúcares, ácidos nucleicos,
proteínas y lípidos, y similares.
Estas sustancias son usadas habitualmente en la
forma de partículas finas a gránulos.
Una "sustancia que se une a una molécula
específica" que puede ser usada en la presente invención, puede
no estar limitada en particular e incluye una sustancia que, desde
una "molécula específica" en una muestra, puede formar una
sustancia compleja de la "molécula específica", una
"sustancia que se une a la molécula específica" y una
"sustancia específica capaz de cambiar propiedades
dielectroforéticas", y no forma sustancialmente una sustancia
compleja de "moléculas distintas de la molécula específica", la
"sustancia que se une a la molécula específica" y la
"sustancia específica capaz de cambiar propiedades
dielectroforéticas". Brevemente, en la medida en que la
sustancia no forme la última sustancia compleja de las sustancias
anteriormente mencionadas, puede ser usada para estos fines incluso
si se une a moléculas distintas de la "molécula específica".
Realmente, es usada preferentemente una ``sustancia que se une
específicamente a la molécula específica.
Una "sustancia que se une a una molécula
específica" se refiere a una sustancia que se une a unas
"moléculas específicas" por reacciones mutuas como una
reacción de "antígeno"-"anticuerpo" y
"proteína"-"cadena de péptido", una reacción de
"cromosoma o cadena de nucleótido"-"cadena de nucleótido".
Si un miembro es una molécula específica (molécula que va a ser
medida) en cada combinación anteriormente descrita, la otra es una
"sustancia que se une a una molécula específica (molécula que va
a ser medida)" como se describió anteriormente. Por ejemplo, si
una molécula específica (molécula que va a ser medida) es un
"antígeno", una "sustancia que se une a la molécula
específica (molécula que va a ser medida)" es un
"anticuerpo", y si una molécula específica (molécula que va a
ser medida) es un "anticuerpo", una "sustancia que se une a
la molécula específica (molécula que va a ser medida)" es un
"antígeno" (otras combinaciones anteriormente descritas tienen
una relación similar).
Es adecuado que la "sustancia que se une a la
molécula específica (molécula que va a ser medida" se una al
menos a la "molécula específica" y no se una de forma
necesariamente específica solamente a la molécula específica. Sin
embargo, en el caso de que una "sustancia que se une a la molécula
específica (molécula que va s ser medida)" no sea una sustancia
que no se una específicamente a la molécula específica, la
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica" que va a ser usada en la combinación es
generalmente una que se une específicamente a la "molécula
específica", o una que tiene propiedades de unirse
específicamente a un nuevo sitio formado mediante la formación de
una sustancia compleja de la "molécula específica" y la
"sustancia que se une a la molécula específica (molécula que va a
ser medida)".
Esta "sustancia que se une a la molécula
específica (molécula que va a ser medida)" es generalmente una
que puede ser medida (detectada) o marcada por una sustancia
marcadora mediante algún método. El uso de una sustancia que tiene
esta propiedad hará posible medir (detectar) una molécula específica
(molécula que va a ser medida) en una muestra. En el caso de que
una molécula específica (molécula que va a ser medida) en sí misma
pueda ser detectada mediante algún método (por ejemplo, una enzima
o similar), o cuando una molécula específica (molécula que va a ser
medida) puede unirse directamente a una sustancia marcadora sin (a
través de) una "sustancia que se une a la molécula
específica", la molécula específica (molécula que va a ser
medida) en una muestra puede ser medida (detectada) incluso si la
"sustancia que se une a la molécula específica" no posee esta
propiedad anteriormente descrita, o la "sustancia que se une a la
molécula específica" no es empleada. Ejemplos de las que pueden
ser detectadas en sí mismas por algún método son enzimas,
colorantes, sustancias fluorescentes, sustancias luminiscentes,
sustancias que tienen absorción en el campo ultravioleta y
similares.
Las sustancias marcadoras que pueden ser usadas
en la presente invención son cualquiera de las sustancias
habitualmente usadas en la técnica, que incluyen inmunoensayo
enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA, fluoroinmunoensayo (FIA),
hibridación y similares, y están ilustrados por enzimas como
fosfatasa alcalina (ALP), \beta-galactosiadasa
(\beta-Gal), peroxidasa (POD), microperoxidasa,
glucosa oxidasa (TOE),
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PDH), malato deshidrogenasa y luciferasa; colorantes como
Coomassie Brilliant Blue R250 y metil orange; radioisótopos como
Tc^{99m}, I^{131}, I^{125}, C^{14}, H^{3}, P^{32} y
S^{35}; sustancias fluorescentes como fluoresceína, rodamina,
dansilo, fluorescamina, cumarina, naftilamina o sus derivados y
europio (Eu); sustancias luminiscentes como luciferina, isoluminol,
luminol y
bis(2,4,6-trifluorofenil)oxalato;
sustancias que tienen absorción en el campo ultravioleta con fenol,
naftol, antraceno y sus derivados; sustancias que tienen
propiedades como agentes marcadores del espín ilustradas por
compuestos con grupos oxilo como
4-amino-2,2,6,6-tetrametilpiperidino-1-oxilo,
3-amino-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina-1-oxilo
y
2,6-di-t-\alpha-(3,5-di-t-butil-4-oxo-2,5-ciclohexadien-1-ilideno)-p-toliloxilo
y similares. El marcado de una molécula específica (molécula que va
a ser marcada) o una "sustancia que se une a la molécula
específica" por una sustancia marcadora se puede realizar
mediante uno cualquiera de los métodos habituales comúnmente usados
en la técnica, como los métodos de marcado conocidos que SE emplean
comúnmente en EIA, RIA, FIA, hibridación o similares, que con
conocidos por sí mismos [por ejemplo Ikagaku Zikken Kosa (Methods
in Medical and Chemical Experiments) vol. 8, editado por Y.
Yamamura, 1ª ed., Nakayama-Shoten, 1971; A. Kawao,
"Illustrative Fluorescent Antibodies", 1ª ed. Softsience Inc.,
1983; "Enzyme Immunoassay", editado por E. Ishikawa, T. Kawai
y K. Mihay, 3ª ed., Igaku-Shoin, 1987; "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed. J. Sambrook, E. F.
Frit6sch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y
similares] y métodos habituales que emplean una reacción de avidina
(o estreptavidina) y biotina.
En la realización (a) anteriormente mencionada,
con el fin de formar una sustancia compleja de una "molécula
específica en una muestra" y una "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica", una
muestra que contiene una "molécula específica" y una
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica" son disueltas, dispersadas o puestas en
suspensión, respectivamente, por ejemplo, en agua o tampones como
tampones de tris(hidroximetilaminometano), tampones de Good,
tampones de fosfato, tampones de borato y similares para
proporcionar materiales líquidos, y los materiales líquidos son
mezclados y puestos en contacto unos con otros. Estas muestras y
sustancias pueden ser disueltas, dispersadas o puestas en
suspensión de una vez. En el caso en que una muestra que contiene
una "molécula específica" sea líquida, una "sustancia capaz
de cambiar propiedades dielectroforéticas de la molécula
específica" puede ser directamente mezclada con la muestra.
La formación de un complejo en las realizaciones
(b) y (c) anteriormente mencionadas de la presente invención se
puede realizar también de una forma similar, como se describió
anteriormente.
En la realización (b) anteriormente mencionada,
con el fin de formar unas sustancias complejas de una "molécula
específica en una muestra", una "sustancia que se une a la
molécula específica" y una "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica", una
muestra que contiene una "molécula específica", una
"sustancia que se une a la molécula específica" y una
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica" pueden ser disueltas, dispersadas o puestas
en suspensión, respectivamente, por ejemplo, en agua o tampones
como tampones de tris(hidroximetilaminometano), tampones de
Good, tampones de fosfato, tampones de borato y similares, para
proporcionar materiales líquidos, y los materiales líquidos son
mezclados y puestos en contacto unos con otros. Estas muestras y
sustancias pueden ser disueltas, dispersadas o puestas en
suspensión de una vez. Alternativamente, una sustancia compleja de
una "sustancia que se une a la molécula específica" y una
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica" se forma en primer lugar de una manera
similar a la anteriormente descrita, y seguidamente un material
líquido que contiene la sustancia compleja es adicionalmente
mezclado y puesto en contacto con un material líquido de una
muestra que contiene una molécula específica preparada como se
describió previamente. Alternativamente, una muestra que contiene
una "molécula específica" y una "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica" es
puesta en contacto una con otra para formar una sustancia compleja
de estas y la resultante se pone seguidamente en contacto con una
"sustancia que se une a la molécula específica".
Si una muestra que contiene una "molécula
específica" es líquida, puede no ser disuelta, dispersada o
puesta en suspensión, por ejemplo, en agua o tampones, como se
describió anteriormente.
En la realización (c) anteriormente mencionada,
con el fin de formar una sustancia compleja de una "molécula
específica en una muestra" o una "molécula específica marcada
por una sustancia marcadora" y una "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica", una
muestra que contiene una "molécula específica", una
"molécula específica marcada por una sustancia marcadora" puede
ser disuelta, dispersada o puesta en suspensión, respectivamente,
por ejemplo, en agua o tampones como
tris(hidroximetilaminometano), tampones de Good, tampones de
fosfato, tampones de borato y similares, para proporcionar
materiales líquidos, y estos materiales líquidos pueden ser
mezclados y puestos en contacto unos con otros. El material líquido
mixto puede ser mezclado y puesto en contacto con un material
líquido obtenido disolviendo, dispersando o poniendo en suspensión
una "sustancia que se une a la molécula específica", por
ejemplo, en agua o tampones como tampones de
tris(hidroximetilaminometano), tampones de Good, tampones de
fosfato, tampones de borato y similares. Alternativamente, esas
muestras y sustancias pueden ser disueltas, dispersadas o puestas en
suspensión de una vez.
Si una muestra que contiene una "molécula
específica" es líquida, como se describió anteriormente, puede
ser disuelta, dispersada o puesta en suspensión, por ejemplo, en
agua o tampones como tris(hidroximetilaminometano) y
tampones de Good.
El complejo que contiene material líquido así
obtenido es seguidamente sometido a dielectroforesis.
El método del momento dipolar equivalente es un
procedimiento para analizar fuerzas dielectroforéticas sustituyendo
un dipolo eléctrico equivalente con cargas inducidas. Según este
método, la fuerza dielectroforética F_{d} que recibe una
partícula esférica con un radio a es colocada en un campo eléctrico
E esta dada por:
\newpage
(1)F_{d} =
2\pi
a^{3}\varepsilon_{m}Re[K\text{*}(\omega)]\nabla(E_{2})
en la que K*(\omega) es expresado
usando la frecuencia angular de voltaje \omega aplicado y la
unidad imaginaria J como
sigue:
(2)K\text{*}(\omega) =
\varepsilon\text{*}-\varepsilon_{m}\text{*}/\varepsilon_{p}\text{*}+2\varepsilon_{m}\text{*}
(3)\varepsilon_{p}\text{*} =
\varepsilon_{p}-j\sigma_{p}/\omega,
\hskip1cm\varepsilon_{m}\text{*}=\varepsilon_{m}-j\sigma_{m}/\omega
en que \varepsilon_{p},
\varepsilon_{m}, \sigma_{p} y \sigma_{m} son
permitividad y conductividad de la partícula y la solución, y las
cantidades complejas son indicadas mediante
*.
La ecuación (1) indica que si
Re[K*(\omega)]>0, la fuerza actúa de forma que el campo
eléctrico atrae a la partícula hacia un lado fuerte
(dielectroforética positiva, DEP positiva) y si
Re[K*(\omega)]<0, la fuerza actúa de forma que el campo
eléctrico arrastra a la partícula hacia un lado débil
(dielectroforética negativa, DEP negativa).
Puede entenderse a partir de la ecuación general
anteriormente mencionada de fuerzas dielectroforéticas que los
parámetros involucrados en las fuerzas dielectroforéticas de
sustancias que reciben fuerzas dielectroforéticas son, en general,
la permitividad y la conductividad de las sustancias y el medio, el
tamaño de las sustancias y la frecuencia del campo eléctrico
aplicado. Estos parámetros deben ser ajustados apropiadamente,
dependiendo del tipo de separación que mejora las sustancias a las
que se ha unido una sustancia compleja detectora y las sustancias
marcadoras que se usan para la detección de la molécula específica
(molécula que va a ser medida). Aunque no puede ser mencionado en
general, la conductividad del medio empleado es habitualmente no más
de 13 mS/cm (como concentración de PBS) y preferentemente no más de
1 mS/cm. Para el tamaño de las sustancias mejoradoras de la
separación, en el caso de partículas, un tamaño de partículas medio
es habitualmente no más de 1 mm, y preferentemente 0,025 a 100
\mum, y en el caso de moléculas biológicas, el tamaño es
habitualmente más de 10 nm, y preferentemente más de 50 nm (tamaños
de formas estimados de moléculas de proteínas normales de unos
pocos a algunas decenas de nanómetros).
Se puede decir a partir de la ecuación general
anteriormente mencionada de dielectroforesis que los parámetros
involucrados en las fuerzas dielectroforéticas de un campo eléctrico
aplicado son la resistencia del campo eléctrico aplicado y la
frecuencia aplicada. En particular, incluso si las sustancias son
iguales, como la frecuencia aplicada puede provocar cambios en las
propiedades dielectroforéticas positivas y negativas, los
parámetros han de ser ajustados apropiadamente según la molécula
específica (molécula que va a ser medida). Estos parámetros deben
ser ajustados apropiadamente dependiendo del tipo de sustancias
mejoradoras de la separación a las que una sustancia compleja
detectora se ha unido y las sustancias marcadoras que se usan para
la detección de la molécula específica (molécula que va a ser
medida). Aunque no puede ser mencionado en general, si una
sustancia mejoradora de la separación de dielectroforesis tiene una
dielectroforesis positiva, la resistencia del campo eléctrico
aplicado es habitualmente no más de 3,5 MV/m, y preferentemente no
más de 1,0 MV/m. Si una sustancia mejoradora de la separación de
dielectroforesis tiene una dielectroforesis negativa, la resistencia
del campo eléctrico es de no más de 3,5 MV/m. La frecuencia
aplicada está habitualmente en el sector de 100 Hz a 10 MHz, y
preferentemente 1 kHz a 10 MHz.
En la presente invención, el campo eléctrico que
va a ser aplicado puede ser cualquiera de un campo eléctrico AC y
un campo eléctrico DC, y es generalmente preferible usar el campo
eléctrico AC.
Los métodos de separación de una molécula
específica empleando sustancias mejoradoras de la separación pueden
ser clasificados en dos tipos como se describe a continuación:
Método de separación
1
En primer lugar, en el caso de que una sustancia
mejoradora de la separación sea una sustancia que tenga las mismas
fuerzas dielectroforéticas positivas o negativas como moléculas
distintas de la molécula específica (molécula que va a ser medida)
[por ejemplo, una sustancia marcadora libre (por ejemplo, una
sustancia específica marcada por una sustancia marcadora que no
está involucrada en una sustancia compleja) empleada para la
detección de la molécula específica y similares] y esté
influenciada por fuerzas dielectroforéticas mayores que la molécula
específica (molécula que va a ser medida), sustancialmente,
solamente la sustancia mejoradora de la separación y la molécula
específica unida a la sustancia mejoradora de la separación
recibieron fuerzas dielectroforéticas grandes y se separaron.
Es decir, (1) por ejemplo, la molécula
específica puede ser separada de las moléculas distintas de la
molécula específica ajustando la resistencia del campo eléctrico y
las condiciones medias de forma que la sustancia mejoradora de la
separación y una molécula unida a la sustancia mejoradora de la
separación se unan en una posición particular en el electrodo de
dielectroforesis por fuerzas dielectroforéticas, y las moléculas
distintas de la molécula específica (molécula que no va a ser
medida) [por ejemplo, una sustancia marcadora libre empleada para
la detección de la molécula específica y similares] no se unan.
Adicionalmente, (2) por ejemplo, la separación
se puede llevar a cabo empleando un aparato de cromatografía
denominado dielectroforético (aparato de fraccionamiento del flujo
de campo) en el que la separación se lleva a cabo con la
interacción entre las fuerzas dielectroforéticas provocadas sobre
las moléculas a partir del campo eléctrico como se describe con
posterioridad y el movimiento molecular. En este caso, como la
sustancia mejoradora de la separación y la molécula unida a la
sustancia mejoradora de la separación solamente son capturadas en
el electrodo de separación de dielectroforesis por fuerzas
dielectroforéticas, o como las diferencias tienen lugar entre la
velocidad de desplazamiento de la sustancia mejoradora y la molécula
unida a la sustancia mejoradora de la separación por una parte, y
la de las demás moléculas por otra parte, la molécula específica
puede ser fácilmente separada de las moléculas distintas de la
molécula específica (moléculas que no va a ser medidas).
Método de separación
2
En segundo lugar, en el caso de que la sustancia
mejoradora de la separación sea una sustancia que tenga fuerzas
dielectroforéticas positivas o negativas diferentes de las moléculas
distintas de la molécula específica [por ejemplo, una sustancia
marcadora para ser usada en la detección de la molécula específica],
es decir, cuando una sustancia mejoradora de la separación tiene
fuerzas dielectroforéticas positivas y las moléculas distintas de
la molécula específica tiene fuerzas dielectroforéticas negativas, o
dicho de otra forma, una sustancia mejoradora de la separación
tiene fuerzas dieléctricas negativas y las moléculas distintas de la
molécula específica tienen fuerzas dielectroforéticas positivas, la
sustancia mejoradora de la separación y la molécula específica
unida a la sustancia mejoradora de la separación por un lado, y las
moléculas distintas de la molécula específica por otro lado se
desplazan a zonas de campos eléctricos diferentes y, por tanto, la
molécula específica puede ser separada de las moléculas distintas
de las moléculas específicas.
Es decir, por ejemplo (1) la sustancia
mejoradora de la separación y la molécula unida a la sustancia
mejoradora de la separación por un lado, y las moléculas distintas
de la molécula específica por otro lado se desplazan a zonas de
campos eléctricos sustancialmente diferentes, respectivamente en el
electrodo de dielectroforesis por fuerzas dielectroforéticas, de
forma que la molécula específica puede ser separada de las moléculas
distintas de la molécula específica [por ejemplo, una sustancia
marcadora para ser usada en la detección de la molécula específica
y similares].
Adicionalmente (2) la separación se puede
realizar, por ejemplo, usando un aparato de cromatografía
dielectroforética (aparato de fraccionamiento del flujo de campo).
En este caso, bajo condiciones en las que la sustancia mejoradora
de la separación y la molécula específica unida a la sustancia
mejoradora de la separación tengan fuerzas dielectroforéticas
positivas, y las moléculas distintas de la molécula específica
tengan fuerzas dielectroforéticas negativas, la sustancia
mejoradora de la separación y la molécula específica unida a la
sustancia mejoradora de la separación son capturadas en el
electrodo de separación dielectroforético por fuerzas
dielectroforéticas, y las moléculas distintas de la molécula
específica no son capturadas en el electrodo por fuerzas
dielectroforéticas negativas. Por otra parte, bajo condiciones en
las que las moléculas distintas de la molécula específica tengan
fuerzas dielectroforéticas positivas, y la sustancia mejoradora de
la separación y la molécula específica unida a la sustancia
mejoradora dela separación tengan fuerzas dielectroforéticas
negativas, las moléculas distintas de la molécula específica son
capturadas en el electrodo de separación dielectroforética por
fuerzas dielectroforéticas, y la sustancia mejoradora de la
separación y la molécula específica unida a la sustancia mejoradora
de la separación no son capturadas en el electrodo por fuerzas
dielectroforéticas negativas. Por tanto, la molécula específica
puede ser separada de las moléculas distintas de la molécula
específica.
Para electrodos de dielectroforesis y aparatos
de cromatografía dielectroforética que pueden ser empleados en la
presente invención, pueden ser usados cualesquiera de los que se
emplean habitualmente en la técnica. En particular, como se expone
con posterioridad, están incluidos electrodos que tienen una
estructura capaz de formar un campo eléctrico horizontal y
verticalmente no uniforme equipados con el electrodo como es que se
acaba de exponer.
Una "sustancia mejoradora de la separación"
es habitualmente usada en la forma unida a una "sustancia de unión
a la molécula específica", con lo que la sustancia puede estar
unida a la "molécula específica" en una muestra.
Alternativamente, la unión directa de la "sustancia mejoradora de
la separación" a la "molécula específica" se puede llevar a
cabo mediante métodos químicos como métodos para unir a la molécula
específica a través de un grupo funcional que sea previamente
introducido en la superficie de la sustancia mejoradora de la
separación, métodos para unir la "molécula específica" a la
sustancia mejoradora de la separación a través de un conector, y
similares. Para la "sustancia que se une específicamente a la
molécula específica" empleada en este caso se puede usar la
misma sustancia que la "sustancia que se une específicamente a la
molécula específica" previamente descrita [no es necesario que
esta en sí misma pueda ser medida (detectada) o marcada con una
sustancia marcadora mediante algún método], o una sustancia que
posea propiedades de unirse específicamente a un nuevo sitio formado
mediante la formación de una sustancia compleja de la "molécula
específica" y la "sustancia que se une a la molécula
específica", o similares. La sustancia que posee propiedades de
unirse específicamente a un nuevo sitio formado mediante la
formación de una sustancia compleja de la "molécula específica"
y la "sustancia que se une a la molécula específica" incluye,
por ejemplo, anticuerpos, cadenas de péptidos, cadenas de
nucleótidos y similares, que pueden reconocer la sustancia compleja
de la "molécula específica" y la "sustancia que se une a la
molécula específica y se puede unir a la sustancia compleja".
La unión de la "sustancia mejoradora de la
separación" y la "sustancia que se une a la molécula
específica" se puede llevar a cabo de un modo similar a los
métodos para marcar la "molécula específica" con una sustancia
marcadora, como se describió anteriormente.
Cuando una sustancia que posee específicamente
propiedades de unirse de forma directamente a la "molécula
específica" es usada como una "sustancia mejoradora de la
separación", no son necesarios los procedimientos anteriormente
descritos.
Esta "sustancia mejoradora de la
separación" incluye, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas,
lípidos y similares.
En la presente invención, "separar la
sustancia compleja de las moléculas distintas de la "molécula
específica contenida en la muestra" no significa necesariamente
separar (aislar) solamente la "sustancia compleja (por ejemplo,
la sustancia compleja de la molécula específica y la sustancia
mejoradora de la separación), sino que significa separar uno o más
tipos de sustancias distintas de la "sustancia compleja" que
coexiste en la muestra y la "molécula específica" una de otra,
dependiendo de la finalidad. En este caso, si las condiciones son
ajustadas de forma apropiada y se repite el método de separación
según la presente invención, la "molécula específica" puede
ser aislada en forma de una sustancia compleja de la misma con la
sustancia mejoradora de la separación. En resumen, el objeto es
hacer posible medir una cantidad de la "molécula específica" o
las "moléculas distintas de la molécula específica" en
una
muestra.
muestra.
Según el método de separación de la presente
invención como se describió anteriormente, pueden ser recogidas la
"molécula específica" (que incluye los casos de ser recogida en
forma de una sustancia compleja de la molécula específica y una
sustancia mejoradora de la separación) o las moléculas distintas de
la "molécula específica".
A saber, en el caso de (1) el Método de
separación 1 anteriormente descrito, por ejemplo, las moléculas
distintas de la "molécula específica" pueden ser recogidas
lavando el electrodo con un tampón apropiado habitualmente empleado
en la técnica, agua o similar, mientras se aplica un campo eléctrico
con condiciones tales que la molécula específica sea capturada en
forma de una sustancia compleja con una sustancia mejoradora de la
separación en una posición particular del electrodo, y las demás
moléculas no son capturadas en una posición particular en el
electrodo, y seguidamente la molécula específica (una sustancia
compleja de la molécula específica y la sustancia mejoradora de la
separación) puede ser recogida cesando de aplicar el campo eléctrico
y lavando el electrodo con un tampón apropiado habitualmente
empleado en la técnica, agua o similar.
En el caso (1) del Método de separación 2
anteriormente descrito, la sustancia mejoradora de la separación y
la molécula unida a la sustancia mejoradora de la separación por una
parte, y las moléculas distintas de la molécula específica por otra
parte, se desplazan a zonas del campo eléctrico sustancialmente
diferentes, respectivamente, en el electrodo de dielectroforesis
por fuerzas dielectroforéticas, de forma que estas moléculas en
desplazamiento pueden ser recogidas de forma separada y
respectiva.
En el caso en que la separación se lleve a cabo
mediante el método (2) del Método de separación 1 anteriormente
descrito, la molécula específica u otras moléculas pueden ser
recogidas respectivamente recogiendo una primera fase móvil que
contiene las moléculas distintas de la molécula específica que
recibe pequeñas fuerzas dielectroforéticas y desplazándose sin ser
capturada en una posición particular del electrodo y, después de
eso, recogiendo una solución lavada que contiene la molécula
específica desplazando la molécula específica que recibe grandes
fuerzas dielectroforéticas que es capturada en una posición
particular en el electrodo durante la aplicación del campo
eléctrico, cesando de aplicar el campo eléctrico y lavando el
electrodo con un tampón apropiado habitualmente empleado en la
técnica, agua o similar.
En el caso de que la separación se lleve a cabo
mediante el método (2) del Método de separación 2 anteriormente
descrito, la molécula específica o la otra molécula pueden ser
recogidas respectivamente, bajo condiciones en la que la sustancia
mejoradora de la separación y la molécula específica unida a la
sustancia mejoradora de la separación tengan fuerzas
dielectroforéticas positivas y las moléculas distintas de la
molécula específica tenga fuerzas dielectroforéticas negativas,
recogiendo una primera fase móvil que contenga las moléculas
distintas de la molécula específica que tiene fuerzas
dielectroforéticas negativas y desplazándose sin ser capturada en
una posición particular en el electrodo y, después de eso,
recogiendo una solución lavada que contiene la molécula específica
desplazando la molécula específica que tiene fuerzas
dielectroforéticas positivas, que es capturada en una posición
particular en el electrodo durante la aplicación del campo
eléctrico, cesando de aplicar el campo eléctrico y lavando el
electrodo con un tampón apropiado habitualmente empleado en la
técnica, agua o similar. Alternativamente, la molécula específica o
la otra molécula pueden ser recogidas respectivamente bajo
condiciones en las que las moléculas distintas de la molécula
específica tengas fuerzas dielectroforéticas positivas y la
sustancia mejoradora de la separación y la molécula específica unida
a la sustancia mejoradora de la separación tengan fuerzas
dielectroforéticas negativas, recogiendo una primera fase móvil que
contenga la molécula específica que tiene fuerzas dielectroforéticas
negativas y desplazándose sin ser capturada en una posición
particular del electrodo y, después de eso, recogiendo una solución
lavada que contiene las moléculas distintas de la molécula
específica desplazando las moléculas que tienen fuerzas
dielectroforéticas positivas y que han sido capturadas en una
posición particular del electrodo durante la aplicación del campo
eléctrico cesando de aplicar el campo eléctrico y lavando el
electrodo con un tampón apropiado habitualmente empleado en la
técnica, agua o
similar.
similar.
Los tampones que pueden ser empleados incluyen
tampones que son habitualmente empleados en la técnica, por
ejemplo, tampones de tris(hidroximetilaminometano), tampones
de Good, tampones de fosfato, tampones de borato y similares.
Una sustancia compleja de los dos miembros
anteriormente mencionados (la "molécula específica" y la
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de las
moléculas específicas") no puede ser habitualmente separada de la
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de las
moléculas específicas" por dielectroforesis. Además, una
sustancia compleja de los tres miembros anteriormente mencionados
(la "molécula específica" y la "sustancia que se une a la
molécula específica" y la ``sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de las moléculas específicas) no
puede ser habitualmente separada de una sustancia compleja de la
"sustancia que se une a la molécula específica" y la
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de las
moléculas específicas" y la "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de las moléculas específicas"
libre por dielectroforesis. Incluso si no se consigue la separación,
sin embargo, no hay ningún problema particular en medir las
"moléculas específicas" en una muestra, como se describe con
posterioridad.
Cuando una "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de las moléculas específicas" que
se une a la "molécula específica" en una muestra es usada
sola, no en forma de una sustancia compleja de la "sustancia
capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de las moléculas
específicas" y una "sustancia que se une a la molécula
específica", ya que si la "sustancia que se une a la molécula
específica" es usada en una cantidad en exceso, la "sustancia
que se une a la molécula específica" todavía permanece. Sin
embargo, la sustancia así retenida que se une a la molécula
específica puede ser separada junto con las moléculas distintas de
"la molécula específica".
Una segunda realización que no pertenece a la
presente invención (un segundo método, abreviado a veces en lo
sucesivo como realización (2)) se refiere a separar dos o más tipos
de moléculas unas de otras colocando una solución en la que los dos
o más tipos de moléculas están disueltas bajo un campo eléctrico no
uniforme que tiene una resistencia del campo eléctrico de 500 KV/m
o mayor, en que el campo está formado por un electrodo que tiene
una estructura capaz de formar un campo eléctrico no uniforme.
Lo que sigue describe esto en detalle.
Una resistencia del campo eléctrico de 500 KV/m
o mayor permite separar dos o más tipos de moléculas en una
solución con otra que no ha sido separada en el pasado. Una
resistencia del campo eléctrico adecuada para el campo eléctrico no
uniforme formado por el electrodo que se describió anteriormente
debe ser ajustada apropiadamente, dependiendo del tipo de los dos o
más tipos de moléculas en una solución, y aunque esto no puede ser
mencionado en general, se selecciona apropiadamente en el intervalo
de 500 KV/m o mayor, preferentemente 500 KV/m o mayor a 10 MV/m,
más preferentemente 500 KV/m a 3,5 MV/m. Resistencias superiores del
campo eléctrico pueden provocar dificultades en el análisis debido
a la generación de calor. Si son de esperar estas probabilidades, se
puede realizar un enfriamiento apropiado de la unidad del
electrodo, por ejemplo.
En la presente invención, el campo eléctrico que
va a ser aplicado puede ser cualquiera de un campo eléctrico AC y
un campo eléctrico DC, y generalmente es preferible usar el campo
eléctrico AC.
Más específicamente, por ejemplo, si una
molécula que va a ser medida es una cadena de nucleótidos
(oligonucleótido o polinucleótido), cromosoma y similar, la
resistencia del campo eléctrico es 500 KV/m o mayor, preferentemente
500 KV/m a 10 MV/m, más preferentemente 500 KV/m a 3,5 MV/m. Si una
molécula que va a ser medida es, por ejemplo, una cadena de
péptido, una proteína o similar, la resistencia del campo eléctrico
es 500 KV/m o mayor, preferentemente 1 MV/m a 10 MV/m, más
preferentemente 1 MV/m a 3,5 MV/m.
La frecuencia de los campos eléctricos no
uniformes es habitualmente 100 HZ a 10 MHz y, más preferentemente 1
kHz a 10 MHz.
En el caso de la realización (1) de la presente
invención, como la separación es facilitada debido a uso de una
sustancia compleja que contiene una "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica", dos o
más tipos de moléculas pueden ser separadas respectivamente a una
resistencia del campo eléctrico inferior a 500 KV/m. Sin embargo,
es preferible llevar a cabo la separación a 500 KV/m o más, porque
la separación resultará más fácil.
Dos o más tipos de moléculas en la realización
(2) incluyen componentes biológicos como cadenas de nucleótidos
(cadenas de oligonucleótidos, cadenas de polinucleótidos),
cromosomas, cadenas de péptidos (por ejemplo,
C-péptido, angiotensina I y similares), proteínas
(proteínas de suero como inmunoglobulina A (IgA), inmunoglobulina E
(IgE), inmunoglobulina G (IgG),
\beta_{2}-microglubulina, albúmina y ferritina;
proteínas enzimáticas como amilasa, fosfatasa alcalina y
\gamma-glutamiltransferasa; anticuerpos
antivirales para virus como el virus Rubella, virus Herpes, virus
de la hepatitis, virus ATL, virus del SIDA y sustancias antígenas de
estos virus; anticuerpos para diverso alergenos; lípidos como
lipoproteínas; y proteasas como trispsina, plasmina, serina
proteasas y similares; cadenas de azúcares (por ejemplo, cadenas de
azúcares de \alpha-fetoproteína,
CA19-9, antígeno específico de la próstata, antígeno
carcinoembriónico, sustancias que tienen cadenas de azúcares
particulares producidas por células cancerígejas); lecitinas (por
ejemplo, concanavalina A, lecitina Lens culinaris, lecitina
Phaseolus vulgaris, lecitina Dutura stramonium,
lecitina de germen de trigo y similares) y similares. En la
realización (2), los dos o más tipos de moléculas son lo que son
solubles en una solución, y en la realización (1) de la presente
invención, los dos o más tipos de moléculas que son insolubles no
provocan ningún problema.
Según la realización (2), entre las moléculas
anteriormente mencionadas, si hay dos o más tipos de moléculas del
mismo tipo y tienen un peso molecular diferente, o dos o más tipo de
moléculas bastante diferentes, puede ser conseguida la separación.
Las combinaciones de dos o más tipos de moléculas de la misma clase
y que tienen un peso molecular diferente incluyen, por ejemplo,
combinaciones de moléculas seleccionadas entre cadenas de
nucleótidos (oligonucleótidos o polinucleótidos) y cromosomas y, por
ejemplo, combinaciones de moléculas seleccionadas entre cadenas de
péptidos, proteínas y similares. Las combinaciones de dos o más
tipos de moléculas bastante diferentes incluyen, por ejemplo,
combinaciones de molécula(s) seleccionada(s) entre
cadenas de nucleótidos (oligonucleótidos o polinucleótidos) y
cromosomas con molécula(s) seleccionada(s) entre
glúcidos, cadenas de péptidos y proteínas y combinaciones de
azúcares con molécula(s) seleccionada(s) entre cadenas
de péptidos, proteínas y lecitinas, y similares.
Las soluciones anteriormente descritas en las
que los dos o más tipos de moléculas son disueltas incluyen
muestras derivadas de un cuerpo vivo que incluyen fluidos corporales
como suero, plasma, fluido cerebroespinal, fluido sinovial y
linfático o excreciones como orina y heces, y sus materiales
tratados. Los materiales tratados incluyen, por ejemplo, diluciones
apropiadas de estas muestras derivadas de un cuerpo vivo con agua,
tampones o similares, o las obtenidas a partir de una
reconstitución con moléculas apropiadamente disolventes o
suspensoras como se describió anteriormente a partir de estas
muestras derivadas de cuerpos en agua, tampones o similares. En la
presente invención, las soluciones en las que son disueltos dos o
más tipos de moléculas incluyen también las que contienen moléculas
como las anteriormente descritas, que son químicamente
sintetizadas.
Los tampones que pueden ser empleados incluyen
tampones que son habitualmente empleados en la técnica, por
ejemplo, tampones de tris(hidroximetilaminometano), tampones
de Good, tampones de fosfato, tampones de borato y similares.
Cuando las soluciones anteriormente descritas
tienen una conductividad elevada, se genera calor de Joule por la
corriente que fluye en la solución a medida que es aplicado el
voltaje, dando lugar a posibilidades de llevar a ebullición la
solución. Por lo tanto, es preferible que las soluciones sean usadas
con un ajuste apropiado de forma que la conductividad esté
habitualmente en un intervalo de no más de 10 mS/dm, preferentemente
no más de 200 \muS/cm.
En la presente invención, un electrodo que tiene
una estructura capaz de formar un campo eléctrico horizontal y
verticalmente no uniforme es uno elaborado de materiales conductores
como, por ejemplo, aluminio, oro y similares. Su estructura puede
ser cualquier estructura capaz de provocar fuerzas
dielectroforéticas, es decir, formar un campo eléctrico horizontal
y verticalmente no uniforme, que incluye, por ejemplo, una forma
interdigital [J. Phys. D: App. Phys. 258, 81-89
(1992); Biochim. Biophys. Acta., 964, 221-230 (1988)
y similares]. Más específicamente, como se muestra en la Figura 2,
las formas de triángulo, cuadrado, trapezoide, ola sinoidal o
diente de sierra o similares son preferidas, y son posibles
estructuras con disposiciones que se repiten de forma regular y
continua de estas. Cuando el electrodo es usado con el fin de
recoger una molécula específica, es preferible un electrodo que
tenga una estructura con esta disposición que se repite de forma
regular y continua.
Este electrodo es elaborado habitualmente
colocando un electrodo que tenga uno o más pares de las formas
anteriormente mencionadas en una manera de dientes de peine sobre
un sustrato hecho de materiales no conductores como, por ejemplo,
vidrio, cuarzo, silicio y similares, empleando una tecnología de
micromaquinarias conocida por sí misma [Biochem. Biophys. Acta.,
964, 221-230 y similares[. La distancia entre
electrodos adyacentes (enfrentados) no está especificada en
particular, si se puede formar un campo eléctrico no uniforme que
tenga una fuerte resistencia del campo eléctrico, y aunque no pueda
ser mencionado en general, debe ser apropiadamente ajustado,
dependiendo del tipo de moléculas que van a ser medidas. Por
ejemplo, en el caso de cadenas de péptidos, proteínas y similares,
la distancia entre las partes más anchas en el electrodo (separación
mínima) habitualmente es de no más de 10 \mu, preferentemente 5
\mum, y en el caso de cadenas de nucleótidos (polinucleótidos,
oligonucleótidos) y similares, es de no más de 100 \mum,
preferentemente no más de 50 \mum. En el caso de los cromosomas,
la separación mínima es habitualmente no más de 50 \mum,
preferentemente no más de 10 \mum. Debe apreciarse que si la
distancia entre los electrodos adyacentes (enfrentados) es demasiado
grande en relación con la molécula de interés, es imposible formar
un campo eléctrico no uniforme que tenga una suficiente resistencia
eléctrica, y si la distancia es demasiado pequeña, puede ser
imposible capturar la molécula de interés.
El método de separación según la realización (2)
se puede llevar a cabo, por ejemplo, de las siguientes formas.
Método
A
Con el fin de separar una de otra dos o más
tipos de moléculas disueltas en una solución colocando una solución
en la que los dos o más tipos de moléculas están disueltas bajo un
campo eléctrico no uniforme formado con el electrodo (sustrato de
electrodo) anteriormente descrito, la separación se puede realizar
según las diferencias en los modos de movimiento de las moléculas
existentes bajo un campo eléctrico no uniforme ajustando condiciones
apropiadas en las que se forma el campo eléctrico no uniforme, con
el fin de desplazar solamente la molécula que va a ser medida por
fuerzas dielectroforéticas (por ejemplo, solamente la molécula que
va a ser medida se desplaza hasta una posición particular por
fuerzas dielectroforéticas y es capturada en la posición particular
en el electrodo, y las demás moléculas no reciben suficientes
fuerzas de electroforesis y no son capturadas en una posición
particular en el electrodo). Alternativamente, las moléculas pueden
ser separadas en una posición débil y una posición fuerte en el
campo eléctrico ajustando estas condiciones apropiadas a las que la
molécula que va a ser medida recibe fuerzas dielectroforéticas
positivas y las demás moléculas reciben la dielectroforesis
negativa ajustando la permitividad y la conductividad del medio y la
frecuencia del campo eléctrico aplicado.
Método
B
La separación se puede realizar permitiendo que
la molécula que va a ser medida se desplace en el campo eléctrico
no uniforme mediante el uso del electrodo (sustrato del electrodo)
anteriormente descrito y utilizando seguidamente la interacción
provocada en el mismo entre las fuerzas de dielectroforesis causadas
a las moléculas por el campo eléctrico y el movimiento de las
moléculas. En este caso, las moléculas que reciben fuerzas
dielectroforéticas más fuertes de desplaza más lentamente que las
que reciben fuerzas dielectroforéticas débiles, por lo que es
posible hacer la separación de las moléculas más fácilmente.
Más específicamente, es empleado un sustrato de
electro que, como se muestra en la Figura 3, tiene el electrodo
anteriormente mencionado y una trayectoria de flujo tal que una
solución en la que estén disueltos los dos o más tipos de moléculas
se pueda desplazar en el electrodo, a con la aplicación de un
voltaje al electrodo, una solución en la que están disueltos dos o
más tipos de moléculas se puede permitir que se desplace en un
campo eléctrico no uniforme que tenga una resistencia del campo
eléctrico de 500 kV/m o mayor, formado por el voltaje aplicado. En
la Figura 3, la flecha indica la dirección del flujo de una solución
en la que están disueltos dos o más tipos de moléculas.
Por lo tanto, las moléculas en una solución son
atraídas hacia las proximidades de un electrodo que tiene un campo
eléctrico más fuerte por fuerzas electroforéticas en el electrodo.
El movimiento de las moléculas está controlado por tres factores:
la fuerza dielectroforética F_{d}, la resistencia debida al flujo
en la trayectoria del flujo F_{v} y la fuerza debida al
movimiento térmico F_{t}. (1) En el caso de F_{d} >>
F_{v} + F_{t}, las moléculas son capturadas (atrapadas) en el
electrodo, (2) en el caso de F_{d} << F_{v} + F_{t},
las moléculas son separadas por elución con el flujo en la
trayectoria de flujo, independientemente del campo eléctrico. (3)
En el caso de F_{d} \approx F_{v} + F_{t}, las moléculas
son portadas en dirección descendente con adsorción y desorción
repetidas en el electrodo, de forma que las moléculas llegan a la
salida con retraso, con relación a flujo ajustado en la trayectoria
de flujo. Por lo tanto, si la separación se realiza bajo
condiciones como en el caso (1) anteriormente mencionado, es posible
separar dos o más tipos de moléculas unas de otras, ya que las
moléculas que reciben fuerzas dielectroforéticas grandes son
capturadas en una posición particular en el electrodo, y las demás
moléculas no son capturadas en una posición particular en el
electrodo y se separan del flujo. Si la separación se realiza bajo
condiciones como las del caso (3) anteriormente mencionado, es
posible separar dos o más tipos de moléculas unas de otras, ya que
las moléculas que reciben fuerzas dielectroforéticas mayores de
desplazan a una velocidad inferior en la trayectoria de flujo que
las moléculas que reciben fuerzas dielectroforéticas más
pequeñas.
En el Método B anteriormente descrito, una
solución en la que están disueltas do o más tipos de moléculas
puede ser desplazada, por ejemplo, usando un medio físico que fluye
con una bomba o similar, o por flujo electroosmótico.
Según el método de separación de la realización
2, es posible recoger la molécula específica que va a ser medida en
una solución en la que estén disueltos dos o más tipos de
moléculas.
Por lo tanto, en el método de separación, Método
A anteriormente descrito, la molécula específica o las demás
moléculas pueden ser recogidas respectivamente, por ejemplo,
separando los dos o más tipos de moléculas unas de otras de forma
tal que la molécula específica sea capturada en una posición
particular en el electrodo y las demás moléculas no sean capturadas
en una posición particular en el electrodo, y seguidamente se lava
el electrodo con un tampón apropiado habitualmente empleado en la
técnica, agua, o similar mientras se aplica un ampo eléctrico, y
seguidamente se deja de aplicar el campo eléctrico y seguidamente se
lava el electrodo con un tampón apropiado habitualmente empleado en
la técnica, agua o similar.
En el método de separación, Método B
anteriormente descrito, por ejemplo, cuando la separación se leva a
cabo bajo la condición (1) anteriormente descrita, las moléculas
específicas o las demás moléculas pueden ser recogidas
respectivamente recogiendo una primera fase móvil que contenga
moléculas, reciben fuerzas dielectroforéticas pequeñas y se
desplazan sin ser capturadas en una posición particular en el
electrodo y, después de eso, se recoge una solución lavada que
contiene moléculas que reciben fuerzas dielectroforéticas grandes y
que han sido capturadas en una posición particular en el electrodo
durante la aplicación del campo eléctrico permitiendo que estas
moléculas se desplacen hacia la salida de la trayectoria de flujo
dejando de aplicar el campo eléctrico y se lava el electrodo con un
tampón apropiado habitualmente empleado en la técnica, agua o
similar.
En el método de separación, Método B
anteriormente descrito, por ejemplo, cuando la separación se lleva a
cabo bajo la condición (1) anteriormente descrita, las moléculas
específicas o las demás moléculas pueden ser recogidas,
respectivamente, recogiendo una primera fase móvil que contenga
moléculas que reciben fuerzas dielectroforéticas pequeñas y
desplazándolas sin ser capturadas en una posición particular en el
electrodo y, después de eso, recogiendo una solución lavada que
contenga moléculas que reciben fuerzas dielectroforéticas pequeñas
y desplazándolas sin ser capturadas en una posición particular en el
electrodo y, después de eso, recoger una solución lavada que
contenga moléculas que reciben fuerzas dielectroforéticas grandes y
que han sido capturadas en una posición particular en el electrodo
durante la aplicación del campo eléctrico, permitiendo que estas
moléculas se desplacen hacia la salida de la trayectoria de flujo
dejando de aplicar el campo eléctrico y lavando el electrodo con un
tampón apropiado habitualmente empleado en la técnica, agua o
similar. Cuando la separación se lleva a cabo bajo la condición (3)
anteriormente descrita, las moléculas específicas o las demás
moléculas pueden ser recogidas respectivamente recogiendo, a la
salida de la trayectoria del flujo, una fase móvil que contenga
moléculas que reciben fuerzas dielectroforéticas pequeñas en primer
lugar, y seguidamente una fase móvil que contiene moléculas que se
desplazan a una velocidad inferior y que reciben fuerzas
dielectroforéticas mayores.
La molécula específica que va a ser medida en
una solución puede ser medida midiendo uno cualquiera de los dos o
más tipos de moléculas separadas mediante el método de separación de
las realizaciones (1) y (2) de la presente invención mediante
métodos de acuerdo con las propiedades de la molécula.
En primer lugar, se proporciona la siguiente
descripción considerando los casos en que se emplea el método de
separación de la realización (1) de la presente invención.
Un componente (una molécula específica [una
molécula que va a ser medida] y/o la molécula distinta de la
molécula específica) puede ser medido separando una sustancia
compleja que resulta de la interacción entre la "molécula
específica" (una molécula que va a ser medida) y la "sustancia
capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la molécula
específica" que se une a la molécula específica de las moléculas
distintas de la molécula específica contenidas en la muestra
mediante el método de separación de la realización (1) de la
presente invención, seguido de la medición de la molécula
específica (la molécula que va a ser medida) en la sustancia
compleja o la molécula distinta de la "molécula
específica".
En el método anteriormente mencionado, la
"molécula específica" es una que puede ser medida (detectada)
en sí misma o marcada con una sustancia marcadora mediante algún
método, o alternativamente una unida a una "sustancia que se une
a la molécula específica" que puede ser medida (detectada) en sí
misma o marcada con una sustancia marcadora. La sustancia
marcadora, la "sustancia que se une a la molécula específica" y
el método de marcado son como se describieron anteriormente.
Además, una molécula específica (una molécula
que va a ser medida) en una muestra puede ser medida rápida y
fácilmente llevando a cabo la separación de una sustancia compleja
(sustancia compleja 1) que se forma a partir de la "molécula
específica" (la molécula que va a ser medida), la sustancia que
se une a la molécula específica y una "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica" que se
une a la molécula específica de la sustancia (libre) que se une a la
molécula específica que no está involucrada en la formación de la
sustancia compleja, denominada separación B/F, mediante el método de
separación de la realización (1) de la presente invención, seguido
de la medición de la sustancia compleja 1, la molécula específica
(la molécula que va a ser medida) o la sustancia que se une a la
molécula específica en la sustancia compleja 1, o la sustancia
libre que se une a la molécula específica que no está involucrada en
la formación de la sustancia compleja.
En los métodos anteriormente mencionados,
generalmente, como la sustancia que se une a la molécula específica
se usa una "sustancia que se une a la molécula específica" que
puede ser medida (detectada) en sí misma o marcada con una
sustancia marcadora mediante algún método.
Además de ello, mediante el método de separación
de la realización (1) de la presente invención, como se describió
anteriormente, se realiza la separación de un complejo de la
molécula específica (la molécula que va a ser medida), una
sustancia que se une a la molécula específica (o molécula que se una
a la molécula específica marcada con una sustancia marcadora) y una
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica" (una sustancia compleja 1) formada mediante
la reacción de la molécula específica (la molécula que va a ser
medida), una sustancia que se une a la molécula específica (o
molécula que se une a la molécula específica marcada con una
sustancia marcadora) y una "sustancia capaz de cambiar propiedades
dielectroforéticas de la molécula específica" de la sustancia
libre que se une a la molécula específica (o la sustancia marcada
libre que se une a la molécula específica). Después de eso, es
posible medir la presencia o ausencia de la molécula específica (la
molécula que va a ser medida) en una muestra detectando la sustancia
compleja 1 separada, basándose en las propiedades de la sustancia
que se une a la molécula específica en la sustancia compleja 1 (o
la sustancia marcadora unida a la sustancia de unión a la molécula
específica en la sustancia compleja 1).
Además de ello, es posible medir no solamente la
presencia de la molécula específica (la molécula que va a ser
medida) en una muestra, sino también determinar la cantidad de la
molécula específica (molécula que va a ser medida) en una muestra
cuantitativamente, por ejemplo, según métodos descritos con
posterioridad.
Mediante el método de separación de la
realización (1) de la presente invención, como se describió
anteriormente, se realiza la separación de una sustancia compleja de
la molécula específica (la molécula que va a ser medida), una
sustancia que se une a la molécula específica (o una sustancia
marcada que se une a la molécula específica marcada con una
sustancia marcadora) y una ``sustancia capaz de cambiar las
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica (una
sustancia compleja 1) de la sustancia libre que se une a la molécula
específica (o la sustancia marcada libre que se une a la molécula
específica marcada con una sustancia marcadora). Después de eso, es
posible medir la cantidad de la sustancia que se une a la molécula
específica en la sustancia compleja 1 (o la cantidad de la sustancia
marcadora que se une a la sustancia que se une a la molécula
específica en la sustancia compleja 1) o la cantidad de la sustancia
libre que se une a la molécula específica (o la cantidad de la
sustancia marcadora que está unida a la sustancia libre que se une a
la molécula específica) mediante métodos de medición de acuerdo con
las propiedades de la sustancia que se une a la molécula específica
o la sustancia marcadora y, por tanto, la cantidad de molécula
específica (molécula que va a ser medida) en una muestra, puede ser
medida basándose en la cantidad.
Alternativamente, la molécula específica en una
muestra puede se medida mediante métodos denominados competitivos
en los que se emplea una molécula específica marcada para reacciones
competitivas entre la molécula específica marcada y la molécula
específica en la muestra.
Por lo tanto, es posible que poniendo en
contacto una muestra que contiene la molécula específica, la
molécula específica marcada con una sustancia marcadora (la
molécula específica marcada) y una "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica" con
otra, se forme una mezcla de una sustancia compleja marcada de la
molécula específica marcada y la "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica" y una
sustancia compleja de la molécula específica y la "sustancia capaz
de cambiar propiedades dielectroforéticas de la molécula
específica" y la mezcla se somete a dielectroforesis para separar
la sustancia compleja que contiene la molécula específica marcada
de la molécula específica marcada, y la cantidad de la sustancia
marcadora unida a la sustancia específica marcada en la sustancia
compleja marcada separada o la cantidad de la sustancia marcadora
unida a la molécula específica marcada libre se determina mediante
métodos de medición de acuerdo con las propiedades de la sustancia
marcadora, y la cantidad de una molécula específica en una muestra
se determina sobre la base de la cantidad obtenida.
En estos métodos anteriormente mencionados, con
el fin de determinar la cantidad de la molécula específica en una
muestra sobre la base de la cantidad resultante de la molécula
específica, la sustancia que se une a la molécula específica o la
sustancia marcadora, la cantidad de la molécula específica en una
muestra puede ser calculada, por ejemplo, usando curvas de
calibración respectivas que muestran la relación entre las
cantidades de la molécula específica y las cantidades de la
sustancia marcadora en la sustancia compleja, la cantidad de la
sustancia que se une a la molécula específica en la sustancia
compleja (o la sustancia que se une a la molécula específica
marcada por una sustancia marcadora), las cantidades de la sustancia
marcadora de la molécula específica marcada libre o la cantidad de
la sustancia libre que se une a la molécula específica (o la
sustancia marcadora en la sustancia marcada que se une a la molécula
específica marcada por una sustancia marcadora), las curvas de
calibración que están siendo obtenidas llevando a cabo medicines de
una manera similar con muestras que tienen concentraciones
conocidas de la molécula específica.
Además, una cantidad relativa de la molécula
específica en una muestra puede ser calculada y puede ser conectado
también un error encontrado entre los dispositivos de separación
dielectroforética, por ejemplo, añadiendo a una muestra una
concentración conocida de una sustancia detectable como un patrón
interno, y comparando una cantidad del patrón interno con una
cantidad de la sustancia marcadora o sustancia que se une a la
molécula específica (o la sustancia marcada que se une a la
molécula específica) en una sustancia compleja resultante, o una
cantidad de la sustancia marcadora en la molécula específica marcada
libre o la sustancia libre que se une a la molécula específica (o
la sustancia marcadora en la sustancia marcada libre que se une a la
molécula específica).
En el método anteriormente mencionado, la
sustancia detectable es una que puede ser medida (detectada) por sí
misma o marcada con una sustancia marcadora mediante algún método.
Por ejemplo, la sustancia detectable incluye el ejemplo concreto
como la molécula específica anteriormente mencionada y la sustancia
mejoradora de la separación, con la condición de que sea distinta
del componente contenido en la muestra y no se pueda unir a la
molécula que va a ser medida. La sustancia marcadora y el método de
marcado son los mismos que se describieron anteriormente.
La siguiente descripción se proporciona con
respecto a los casos en que se emplea el método de separación de la
realización (2) de la presente invención.
La molécula que va a ser medida (molécula A) en
los métodos de medición que emplean el método de separación de la
realización (2) de la presente invención puede ser una cualquiera
que sea el objeto de la separación como se describió anteriormente
y sea soluble en una solución como la anteriormente descrita, en que
(1) una molécula capaz de interaccionar mutuamente con la molécula
A para formar una sustancia compleja (una molécula B) existe, la
molécula B que posee propiedades capaces de ser medidas (detectadas)
por sí misma mediante algún método o que es capaz de ser marcada
con una sustancia marcadora; o (2) la molécula A puede ser marcada
con una sustancia marcadora y una molécula capaz de interaccionar
mutuamente con la molécula A para formar una sustancia compleja
marcada (una molécula B) existe.
Por lo tanto, la molécula A en una muestra puede
ser medida rápida y fácilmente llevando a cabo la separación de una
sustancia compleja que resulta de la interacción entre la molécula
que va a ser medida (la molécula A) y una sustancia que se une
específicamente a la molécula que va a ser medida (una molécula B)
(sustancia compleja 2), denominada separación B/F, mediante el
método de separación de la realización (2) de la presente invención
y midiendo seguidamente la sustancia compleja 2, la molécula A o la
molécula B en la sustancia compleja 2 (o la sustancia marcadora
unida a la molécula B en la sustancia compleja 2) o la molécula
libre B (o la sustancia marcadora unida a la molécula B libre).
A saber, una muestra que contiene la molécula A
se hace reaccionar con la molécula B (o la molécula B marcada con
una sustancia marcadora [una molécula marcada B]), y la sustancia
compleja 2 resultante de la molécula A y la molécula B (o la
molécula B marcada) se separa de la molécula B libre (o la molécula
B marcada) mediante el método de separación de la realización (2)
de la presente invención. Después de eso, la presencia o ausencia
de la molécula A en la muestra puede ser medida detectando la
sustancia compleja 2 separada, basándose en las propiedades de la
molécula B en la sustancia compleja 2 (o la sustancia marcadora
unida a la molécula B en la sustancia compleja).
Además, es posible medir no solamente la
presencia de la molécula A en una muestra, sino también determinar
la cantidad de la molécula A en una muestra cuantitativamente, por
ejemplo, según el siguiente método.
Es decir, una muestra que contiene la molécula A
se hace reaccionar con la molécula B (o la molécula B marcada con
una sustancia marcadora [una molécula B marcada]), y la sustancia
compleja 2 resultante de la molécula A y la molécula B (o molécula
B marcada) se separa de la molécula B libre (o la molécula B marcada
libre) mediante el método de separación de la realización (2) de la
presente invención. Después de eso, es posible medir la cantidad de
la molécula B en la sustancia compleja 2 separada (la sustancia
marcadora unida a la molécula B en la sustancia compleja 2
separada) o la cantidad de la molécula B libre (o la sustancia
marcadora unida a la molécula B marcada libre) mediante métodos de
medición de acuerdo con las propiedades de la molécula B o la
sustancia marcadora y, por tanto, la cantidad de la molécula A en la
muestra es medida sobre la base de la cantidad obtenida.
Alternativamente, la molécula A en una muestra
puede ser medida mediante métodos denominados competitivos en los
que una molécula A marcada es empleada para reacciones competitivas
entre la molécula A marcada y la molécula A en la muestra.
Por lo tanto, una muestra que contiene una
molécula A, la molécula A marcada con una sustancia marcadora (la
molécula A marcada) y una molécula B se hacen reaccionar para formar
una sustancia compleja marcada de la molécula A marcada y la
molécula B y una sustancia compleja de la molécula A y la molécula
B, y seguidamente la sustancia compleja marcada se separa de la
molécula específica marcada libre que va a ser medida A mediante el
método de separación según la presente invención, como se describió
anteriormente. Después de eso, es posible medir la cantidad de la
sustancia marcadora unida a la molécula marcada A en la sustancia
compleja marcada separada, o la cantidad de la sustancia marcadora
unida a la molécula A marcada libre mediante métodos de medición de
acuerdo con las propiedades de la sustancia marcadora y, por tanto,
se mide la cantidad de la molécula A en la muestra sobre la base de
la cantidad obtenida.
En los métodos anteriormente mencionados, con el
fin de determinar la cantidad de la molécula A en una muestra sobre
la base de las cantidades resultantes de la molécula B o la
sustancia marcadora, la cantidad de la molécula A en una muestra
puede ser calculada, por ejemplo, usando curvas de calibración
respectivas que muestran la relación entre las cantidades de la
molécula A y las cantidades de la sustancia marcadora en la
sustancia compleja marcada, las cantidades de la molécula B (o la
sustancia marcadora) en la sustancia compleja, las cantidades de la
sustancia marcadora en la molécula A marcada libre, o las cantidades
de la molécula B libre (o la sustancia marcadora en la molécula B
marcada), siendo obtenida la curva de calibración llevando a cabo
mediciones de una manera similar con muestras que tienen
concentraciones conocidas de la molécula A.
Además, puede ser calculada una cantidad
relativa de la molécula específica en una muestra y puede ser
conectado también un error encontrado entre los dispositivos de
separación dielectroforética, por ejemplo, añadiendo a una muestra
una concentración conocida de una sustancia detectable como un
patrón interno, y comparando una cantidad del patrón interno con
una cantidad de la sustancia marcadora o la molécula B (o la
sustancia marcada que se une a la molécula específica) en una
sustancia compleja resultante, o una cantidad de la sustancia
marcadora en la molécula A marcada libre o la molécula B libre (o la
sustancia marcadora en la molécula B marcada libre).
En el método anteriormente mencionado, la
sustancia detectable es una que puede ser medida (detectada) por sí
misma o marcada con una sustancia marcadora mediante algún método.
Por ejemplo, la sustancia detectable incluye el ejemplo concreto
como la molécula específica anteriormente mencionada y la sustancia
mejoradora de la separación, con la condición de que sea una
distinta del componente contenido en la muestra y no pueda unirse a
la molécula que va a ser medida. La sustancia marcadora y el método
de marcado son los mismos que los anteriormente descritos.
En los métodos anteriormente mencionados, la
molécula que se une específicamente a la molécula A (una molécula
B) es el mismo que la "sustancia que se une específicamente a la
molécula específica" como se describió previamente.
Las sustancias marcadoras que pueden ser usadas
en la presente invención son cualesquiera sustancias habitualmente
usadas en técnicas como inmunoensayo enzimático (EIA),
radioinmunoensayo (RIA), fluoroinmunoensayo (FIA), métodos de
hibridación y similares, y están ilustrados por enzimas como
fosfatasa alcalina (ALP), \beta-galactosidasa
(\beta-Gal), peroxidasa (POD), microperoxidasa,
glucosa oxidasa (GOD),
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PDH), malato deshidrogenasa y luciferasa; colorantes como
Coomassie Brilliant Blue R250 y metil orange; radioisótopos como
Tc^{99m}, I^{131}, I^{125}, C^{14}, H^{3}, P^{32} y
S^{35}; sustancias fluorescentes como, por ejemplo fluoresceína,
rodamina, dansilo, fluorescamina, cumarina, naftilamina o sus
derivados y europio (Eu); sustancias luminiscentes como luciferina,
isoluminol, luminol y
bis(2,4,6-trifluorofenil)oxalato;
sustancias que tienen absorción en el campo ultravioleta como fenol,
naftol, antraceno y sus derivados; sustancias que tienen
propiedades como agentes marcadores del espín ilustrados por
compuestos con grupos oxilo como
4-amino-2,2,6,6-tetrametilpiperidino-1-oxilo,
3-amino-2,2,5,5-tetrametilpirrolidino-1-oxilo
y
2,6-di-t-butil-\alpha-(3,5-di-t-butil-4-oxo-2,5-ciclohexadien-1-ilideno)-p-toliloxilo
y similares.
El marcado de una molécula A o una molécula B
con una sustancia marcadora se puede realizar mediante uno
cualquiera de los métodos habituales comúnmente usados en la
técnica, como los métodos de marcado que se emplean en EIA, RIA,
FIA, métodos de hibridación o similares, que son conocidos por sí
mismos [por ejemplo, Ikagaku Zikken Koza (Methos in Medical and
Chemical Experiments) vol. 8, editado por Y. Yamamura, 1ª ed.,
Nakayama-Shoten, 1971; A. Kuwao, Illustrative
Fluorescent Antibodies, 1ª ed., Softscience Inc., 1983; Enzyme
Immunoassays, editado por E. Ishikawa, T. Kawai y K. Miyai, 3ª ed.,
Igaku-Shoin, 1987; Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª ed., J. Sambrook, E.F. Fritsh y T. Maniatis, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, y similares], y métodos habituales que
emplean reacciones de avidina (o estreptavidina) y biotina.
En el método de medición de la presente
invención (el segundo método, realización (2)), las condiciones en
la reacción de una molécula A y una molécula B (o una molécula
marcadora B) para formar una sustancia compleja 2, o la reacción de
una molécula A (o la molécula A marcada) y una molécula B para
formar una sustancia compleja marcada puede ser en condiciones
tales que no se inhiba la formación de la sustancia compleja 2 (o la
sustancia compleja marcada). Por lo tanto, estas reacciones se
pueden llevar a cabo, por ejemplo, según métodos habituales como
las condiciones de reacción en la formación de la sustancia compleja
2 (o la sustancia compleja marcada) en EIA, RIA, FIA, métodos de
hibridación o similares, que son conocidos por sí mismos. También,
en el primer método de la presente invención, las condiciones de la
reacción en la formación de una sustancia compleja 1 de una
molécula específica (la molécula específica marcada), una sustancia
que se une a la molécula específica y una "sustancia capaz de
cambiar propiedades dielectroforéticas" [o de un material
específico (la molécula específica marcada) y la "sustancia capaz
de cambiar propiedades dielectroforéticas"] o una sustancia
compleja marcada de la molécula específica marcada, una sustancia
que se une a la molécula específica y una "sustancia capaz de
cambiar propiedades dielectroforéticas" pueden ser aquellas según
las condiciones de reacción anteriormente mencionadas.
En el método de la realización (2) de la
presente invención (el segundo método), la concentración de la
molécula B (o la molécula B marcada) usado en la reacción de la
molécula A y la molécula B (o la molécula B marcada) para formar
una sustancia compleja 2 no puede ser mencionado en general debido a
la variación según el límite de detección de la molécula A y
similar, y es preferible que la molécula B (o molécula B marcada)
esté presente habitualmente en las soluciones de la reacción sobre
una concentración que permita unirse a todas las moléculas A
correspondientes a la concentración del límite de detección,
preferentemente el doble de tal concentración, más preferentemente
cinco veces mayor que tal concentración. También, según estas
condiciones, pueden ser ajustadas la concentración de la
"molécula específica" y la "sustancia que se une a la
molécula específica" (o la "sustancia que se une a la molécula
específica" marcada), o la "sustancia capaz de cambiar
propiedades dielectroforéticas de la molécula específica" que
van a ser usadas en el método de la realización (1) de la presente
invención (el primero método).
En el método de la realización (2) (el segundo
método), la concentración de la molécula A marcada y la molécula B
usadas en la reacción de la molécula A, la molécula A marcada y la
molécula B para formar una sustancia compleja marcada puede ser
ajustada en la medida apropiada, dependiendo del ajuste del nivel
del límite de detección de la molécula A y la sensibilidad de
medición y similares. La concentración de la molécula A marcada que
va a ser usada es al menos más que una concentración que permita
unir todas las moléculas B presentes en la solución de la reacción.
También, según estas condiciones puedan ser ajustadas, la
concentración de las "moléculas específicas marcadas" y la
"sustancia que se une a la molécula específica" (o la
"sustancia que se une a la molécula específica" marcada)
usadas en el método de la realización (1) de la presente invención
(el primer método).
En el método de la realización (2) (el segundo
método), el pH y la temperatura de la reacción, que no pueden ser
mencionados en general debido a variaciones dependientes de las
propiedades de la molécula A y la molécula B, pueden estar en el
intervalo en que no es inhibida la formación de la sustancia 2
compleja (o la sustancia compleja marcada). El pH está
habitualmente en el intervalo de 2 a 10, preferentemente 5 a 9, y la
temperatura está habitualmente en el intervalo de 0 a 90°C,
preferentemente 20 a 80ºC. Para el tiempo de reacción, el tiempo
requerido para formar una sustancia compleja 2 (o la sustancia
compleja marcada) es diferente dependiendo de las propiedades de la
molécula A y la molécula B, y la reacción se puede realizar
habitualmente en la medida apropiada durante un período de unos
pocos segundos a una pocas horas. También, el pH de la reacción, la
temperatura y el tiempo de reacción en el método de la realización
(1) de la presente invención (el primer método) pueden ser
ajustados según estas condiciones.
En los métodos de medición de la presente
invención, se pueden llevar a cabo mediciones mediante métodos
predeterminados respectivos según el tipo de analitos, con el fin
de medir la molécula B en la sustancia compleja 2 separada (o la
sustancia marcadora unida a la molécula B en la sustancia compleja
2), la molécula B libre (o la sustancia marcadora unida a la
molécula B marcada libre), la sustancia que se une a la molécula
específica en la sustancia compleja 1 (o la sustancia marcadora
unida a sustancia que se une a la molécula específica en la
sustancia compleja 1), la sustancia libre que se une a la molécula
específica (o la sustancia libre que se une a la molécula
específica marcada por una sustancia marcadora), la sustancia
marcadora unida a la molécula A marcada en la sustancia compleja
marcada, la sustancia marcadora unida a la molécula A marcada, la
sustancia marcadora unida a la molécula específica marcada en la
sustancia compleja marcada o la sustancia marcadora unida a la
molécula específica, marcada libre. Por ejemplo, si tienen
actividades enzimáticas, las mediciones se pueden llevar a cabo
según métodos habituales como métodos EIA y de hibridación, por
ejemplo, métodos descritos en "Enzyme Immunoassays" (Proteins,
Nucleic Acids and Enzymes, Extra issue nº 31), editado por T.
Kitagawa, T. Nambara, A. Tsuzi y E. Eshikawa, pag.
51-63, Kyoritsy Publishing Inc., publicado el 10 de
Septiembre de 1987) y similares. Si las sustancias que van a ser
medidas son radioactivas, las mediciones se pueden llevar a cabo
seleccionado un instrumento de medición apropiado como un contador
GM de inmersión, un contador de centelleo líquido, un contador de
centelleo de tipo pocillos y similar, dependiendo del tipo y la
resistencia de la radiación emitida a partir de las sustancias
radioactivas, según métodos habituales como RIA y métodos de
hibridación (véase, por ejemplo, "Methods in Medical and Chemical
Experiments", vol. 8, editado por Y. Yamamura, 1ª ed.
Kakayama-Shoten, 1971; "Methods in Biochemical
Experiments 2: Tracer Experiments" Parte II. S. Takemura y T,
Honzyo, pag. 501-525, Tokyo Kagaku Dozin, Inc.,
publicado el 25 de Febrero de 1977). Si sus propiedades son
fluorescentes, la medición se puede llevar a cabo según métodos
habituales como FIA y métodos de hibridación que emplean
instrumentos de medición como fluorofotómetros, microscopios láser
confocales o similares, por ejemplo, métodos descritos en
"Illustrative Fluorescent Antibodies" (A. Kuwao, 1ª ed.,
Softscience Inc., 1983), "Methods in Biochemial Experiments 2:
Chemistry of Nucleic Acids III", M. Miyoshi, pag.
299-318, Tokyo Kagaku Dozin, Inc., publicado el 15
de Diciembre de 1977) y similares. Si sus propiedades son
luminiscentes, la medición se puede llevar a cabo según métodos
habituales que emplean instrumentos de medición como contadores de
fotones, por ejemplo, métodos descritos en "Enzyme
Immunoassays" (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes", Extra
issue nº 31), editado por T. Kitagawa, T. Nambra, A. Tsuzi y E.
Ishikawa, pag. 252-263, Kyoritsu Publishing Inc.,
publicado el 10 de Septiembre de 1987) y similares. Si sus
propiedades son las que poseen absorción en el campo ultravioleta,
la medición se puede llevar a cabo mediante métodos habituales
empleando instrumentos de medición como espectrofotómetros, y si
sus propiedades son cromógenas, la medición se puede llevar a cabo
mediante métodos habituales empleando instrumentos como
espectrofotómetros y microscopios. Si sus propiedades son
propiedades de espín, la medición se puede llevar a cabo según
métodos que emplean instrumentos de resonancia de espín
electrónico, por ejemplo, métodos descritos en "Enzyme
Immunoassays" ((Proteins, Nucleic Acids and Enzymes", Extra
issue nº 31), editado por T. Kitagawa, T. Nambra, A. Tsuzi y E.
Ishikawa, pag. 264-271, Kyoritsu Publishing Inc.,
publicado el 10 de Septiembre de 1987) y similares.
En los métodos de medición de la presente
invención, para medir moléculas respectivas separadas mediante los
métodos de separación según la presente invención como se
describieron anteriormente, las mediciones se pueden llevar a cabo,
por ejemplo, midiendo si la molécula compleja o la sustancia
compleja y/o la molécula B libre o la "sustancia que se une a la
molécula específica" libre son separadas o capturadas en una
posición particular en el electrodo (una zona del campo eléctrico
fuerte y/o débil), mediante la observación directa de la molécula B
en la sustancia compleja 2 (o la sustancia marcadora unida a la
molécula B en la sustancia 2 compleja), la molécula B libre (o la
sustancia marcadora unida a la molécula B marcada libre), la
sustancia que se une a la molécula específica en la sustancia
compleja 1 (o la sustancia marcadora unida a la sustancia que se
une a la molécula específica en la sustancia compleja 1) o la
sustancia libre que se une a la molécula específica (o la sustancia
marcada libre que se une a la molécula específica). En este caso, es
preferible que la molécula B, la molécula específica o la sustancia
marcadora tenga propiedades de radiactividad, fluorescencia,
luminiscencia, cromógenas, de espín o similares.
Una solución eluyente del sustrato de electrodo
anteriormente descrito puede ser guiada directamente a una unidad
de detección, en la que la molécula B en la sustancia compleja 2 (o
la sustancia marcadora unida a la molécula B en la sustancia
compleja 2) en la solución eluyente, la molécula B libre (o la
sustancia marcadora unida a la molécula B marcada, libre) en la
solución eluyente, la sustancia que se une a la molécula específica
en la sustancia compleja 1 (o la sustancia marcadora unida a la
sustancia que se une a la molécula específica en la sustancia
compleja 1) en la solución eluyente, la sustancia libre que se une a
la molécula específica (o la sustancia marcada libre que se une a
la molécula específica) en la solución eluyente, la sustancia
marcadora unida a la molécula A marcada en la sustancia compleja
marcada en la solución eluyente, la sustancia marcadora unida a la
molécula A marcada libre en la solución eluyente, la sustancia
marcadora unida a la molécula específica marcada en la sustancia
compleja marcada en la solución eluyente, o la sustancia marcadora
unida a la molécula específica marcada, libre en la solución
eluyente pueden ser medidas directamente. Alternativamente, se puede
realizar una medición similar a la anterior mediante el uso del
electrodo equipado
con la unida de detección. Usando estos métodos como anteriormente, se pueden realizar mediciones más rápidamente.
con la unida de detección. Usando estos métodos como anteriormente, se pueden realizar mediciones más rápidamente.
En este caso, si las actividades enzimáticas son
las propiedades que son detectables mediante algún método y
poseídas por la molécula B, la sustancia que se une a la molécula
específica, la molécula específica o la sustancia marcadora, es
necesario proporcionar una unidad de reacción entre la terminal en
sentido descendente del electrodo en el sustrato y la unidad de
detección, a la que se suministran reactivos para medir las
actividades enzimáticas para llevar a cabo la reacción con la
solución eluyente. Los reactivos para medir las actividades
enzimáticas usados en la unidad de reacción pueden ser los
preparados según los métodos descritos en "Enzyme
Immunoassays" (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, Extra issue
nº 31), editado por T. Kitagawa, T. Nambara, A. Tsuzi y E.
Eshikawa, pag. 51-63, Kyoritsy Publishing Inc.,
publicado el 10 de Septiembre de 1987) y similares, o pueden ser
apropiadamente seleccionados para este uso reactivos empleados de
estuches de ensayo disponibles en el comercio para ensayos
clínicos. También, en el caso de que las propiedades de la molécula
B o la sustancia marcadora no tengan actividades enzimáticas, es
opcional proporcionar una unidad de reacción adecuada entre la
terminal en sentido descendente del electrodo en el sustrato y la
unidad de detección, a la que se suministrar reactivos
predeterminados para reaccionar para los fines de aumentar la
sensibilidad de la detección y similares.
Entre los dos métodos de medición, en este
último método, es decir, el método en el que las moléculas
respectivas son guiadas a la unidad de detección después de la
separación en el electrodo, es probable que la eficacia de la
separación se reduzca, o la sensibilidad de detección de las
moléculas que han sido separadas se reduzca, debido a influencias,
por ejemplo, del caudal de la solución de elución, la forma de la
trayectoria del flujo de elución, la difusión en la solución
eluyente de cada molécula durante el movimiento a la unidad de
detección y similares. Por lo tanto, si solamente una molécula
específica está previsto que sea detectada, el primer método, es
decir, el método en el que las moléculas respectivas separadas son
detectadas observando directamente la superficie del electrodo
después de la separación en el electrodo es ventajoso, por ejemplo,
porque este método puede superar diversos problemas que resultan de
influencias de la difusión, por ejemplo, como se describió
anteriormente, y adicionalmente el tiempo necesario desde la
separación hasta la detección puede ser reducido mediante este
método, ya que no hay necesidad de guiar las respectivas moléculas
separadas hasta la unidad de detección. También, este método es
ventajoso, por ejemplo, por cuanto el método conduce a una reducción
del espacio de la sustancia ya que la reacción, separación y
detección se llevan a cabo en el sustrato del electrodo y, por
tanto, las unidades de reacción, separación y detección pueden estar
integradas, y además de ello se puede esperar que un dispositivo
detector en sí mismo pueda ser miniaturizado, ya que no es necesaria
la alimentación de una solución eluyente.
Los métodos de medición de la presente invención
se pueden llevar a cabo según métodos conocidos por sí mismos como
se describió anteriormente, excepto en cuanto al empleo de los
métodos de separación de la presente invención, y los reactivos
usados se seleccionan también en la medida apropiada según métodos
conocidos por sí mismos.
Es ventajoso llevar a cabo los métodos
anteriormente mencionados de la presente invención para preparar,
por adelantado, un estuche de ensayo de medición dielectroforética
que comprenda reactivos y otros para ser usados para llevar a cabo
la presente invención.
Específicamente, el estuche de ensayo
dielectroforético de la presente invención comprende una
"sustancia que se une a la molécula específica" y una
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica" en el que estas sustancias pueden formar una
sustancia compleja con la "molécula específica" en una
muestra.
Alternativamente, el estuche de ensayo
dielectroforético de la presente invención comprende la "molécula
específica marcada con una sustancia marcadora", una
"sustancia que se une a la molécula específica" y una
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica", en que estas sustancias pueden formar una
sustancia compleja con la "molécula específica" en una muestra
o la "molécula específica marcada con una sustancia
marcadora".
En los estuches de ensayo anteriormente
mencionados, las realizaciones preferidas y los ejemplos específicos
de la "sustancia que se une a la molécula específica", la
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica" y la "molécula específica marcada con una
sustancia marcadora", como se describieron anteriormente, y la
"sustancia capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la
molécula específica" es preferentemente una sustancia que se une
a cualquiera o a ambas de la "molécula específica" y la
"sustancia que se une a la molécula específica". Los estuche
de ensayo anteriormente mencionados pueden además ser combinados
con aparatos dielectroforéticos.
Además, los estuches de ensayo pueden contener
también reactivos habitualmente usados en la técnica como se
describió anteriormente, patrones de la molécula específica o la
molécula A, y similares.
Lo que sigue describirá los métodos de medición
de la presente invención más en detalle, proporcionando un ejemplo
en el caso de emplear un método de hibridación para detectar una
secuencia génica específica.
En primer lugar, una sonda de nucleótidos que
tiene una longitud apropiada que tiene una secuencia complementaria
para la secuencia génica que va a ser detectada (o medida) y ha sido
marcada con una sustancia marcadora, y genes desconocidos que son
desnaturalizados a la cadena única y mezclados en un tampón
adecuado, y reasociados para formar un complejo de la sonda de
nucleótidos y los genes desnaturalizados a la cadena única.
Seguidamente, la solución de la reacción resultante es sometida al
método de separación de la presente invención que emplea fuerzas
dielectroforéticas como se describió anteriormente para separar el
complejo de la sonda de nucleótidos libre. Después de la
separación, la sustancia marcadora en el complejo es medida mediante
los métodos anteriormente descritos, por lo que es posible detectar
o medir si los genes desconocidos contienen la secuencia
complementaria para la sonda de nucleótidos, es decir, la presencia
o ausencia de la secuencia complementaria para la sonda de
nucleótidos.
En los métodos anteriormente mencionados, la
sonda de nucleótidos y los tampones pueden ser seleccionados
apropiadamente según métodos conocidos por sí mismos. Los métodos
para preparar una sonda de nucleótidos son genes desconocidos
desnaturalizados para la cadena única, las condiciones de la
reasociación y similares pueden ser realizados según métodos
conocidos por sí mismos.
La presente invención se describirá
adicionalmente en detalle con referencia a los Ejemplos, Ejemplos de
Referencia y Ejemplos Experimentales, que no está previsto que
limiten en modo alguno la presente invención.
Ejemplo de Referencia
1
Se diseñó una hilera de electrodos múltiples que
tenía una separación mínima de 7 \mum, un conjunto apilado de
electrodos de 20 \mum y el número de electrodos de 2016 (1008
pares), y se preparó una fotomáscara según el diseño para elaborar
el electrodo como sigue.
En un sustrato de vidrio en el que se depositó
aluminio y al que se aplicó un material fotosensible, se extendió
un modelo de electrodo diseñado en una máquina de extensión de haces
de electrones, y seguidamente se reveló el material fotosensible y
al aluminio fue marcado para preparar la fotomáscara.
El sustrato de electrodo se elaboró según el
método descrito por T. Hashimoto, "Illustrative
Photofabrication", Sogo-denshi Publication
(1985), como sigue.
La fotomáscara así preparada se puso en contacto
estrechamente con el sustrato de vidrio con aluminio depositado, al
que se aplicó el material fotosensible, y seguidamente se expuso al
modelo de electro con una lámpara de mercurio. El sustrato del
electrodo fue elaborado revelando el sustrato de vidrio expuesto
para el electrodo y grabando la superficie de aluminio, seguido de
la separación del material fotosensible que permanecía en la
superficie de aluminio. La superficie de aluminio, que tenía
actividades electroquímicas, fue provista con una revestimiento
delgado orgánico que tenía un grosor de 5 nm mediante revestimiento
por centrifugado de un material fotosensible diluido.
Las Figuras 4 y 5 muestran las vistas
esquemáticas del sustrato de electrodo elaborado y el electrodo,
respectivamente. En la Figura 4, el número 1 indica el
electrodo.
Ejemplo de Referencia
2
Con el fin de separar moléculas por el
movimiento de las moléculas bajo un campo eléctrico AC no uniforme,
se preparó una trayectoria de flujo en el sustrato del electrodo
elaborado en el Ejemplo de referencia 1 usando caucho de
silicona.
La trayectoria de flujo del caucho de silicona
para enviar una solución disolvente de moléculas en el electrodo
tenía una profundidad de 25 \mum y una anchura de 400 \mum y
estaba diseñada de forma que la trayectoria de flujo discurra a
través de una zona en la que estaba colocado el electrodo en el
sustrato del electrodo.
Su elaboración se llevó a cabo según el método
descrito por T. Hashimoto, "Illustrative Photofabrication",
Sogo-denshi Publication (1985). En primer lugar, un
material fotosensible negativo de tipo laminar que tenía un grosor
de 25 \mum fue aplicado sobre el sustrato de vidrio, expuesto con
una fotomáscara diseñada para preparar la trayectoria de flujo, y
se reveló el material fotosensible negativo. Se extendió caucho de
silicona sin curar usando el sustrato fotosensible negativo como
plantilla, y seguidamente se curó para producir una superficie de
caucho de silicona que tenía una superficie cóncava con una altura
de 25 \mum en la zona en la que se colocó el electrodo.
El sustrato del electrodo y la trayectoria del
flujo del caucho de silicona fueron adheridos con un caucho de
silicona de curado de tipo de dos fluidos de forma que la superficie
cóncava del caucho de silicona estuviera enfrentada a la zona en la
que estaba colocado el electrodo en el sustrato eléctrico. Se colocó
una jeringuilla para inyectar una solución en dirección ascendente
de la trayectoria del flujo, y se añadió un aparato que permitía
que una solución en la que estaban disueltas las moléculas fluyera
en el electrodo al sustrato del electrodo.
Las Figuras 6 y 7 muestran las vistas
esquemáticas del sustrato del electrodo que tiene la trayectoria de
flujo formada y la sección a lo largo de la línea
a-a', respectivamente. En la Figura 6, el número 1
indica el electrodo, y la flecha representa la dirección del
movimiento de una solución en la que están disueltos dos o más
tipos de moléculas.
Se unió biotina a \lambda-DNA
como una sustancia mejoradora de la separación de dielectroforesis
para proporcionar \lambda-DNA biotinilado, que se
mezcló seguidamente con un anticuerpo anti-biotina
marcado con fluoresceína para llevar a cabo la reacción de
antígeno-anticuerpo mediante el uso del resultante
como una muestra, la detección cuantitativa de moléculas de biotina
se llevó a cabo con un aparato de cromatografía
dielectroforética.
El \lambda-DNA biotinilado en
el que la biotina se acopló con \lambda-DNA se
preparó usando un estuche de ensayo marcador
Photo-Biotin (Nippon Gene Co. Ltd.) según el
protocolo de preparación anejo. Los componentes se mezclaron
seguidamente a las relaciones mostradas en la Tabla 1 en PBS 50 mM
(pH 7,5) para llevar a cabo la reacción de
antígeno-anticuerpo. La concentración de
\lambda-DNA total en cada muestra se ajustó a 0,32
nM añadiendo \lambda-DNA no biotinilado, que es
igual a la concentración de \lambda-DNA
biotinilado en la muestra que tiene una concentración de biotina de
128 nM (Muestra nº 5).
| Muestra Nº | Concentración de biotina | Anticuerpo anti-biotina |
| marcado con fluoresceína | ||
| 1 | 0 nM | 5,7 nM |
| 2 | 0,8 nM | 5,7 nM |
| 3 | 1,6 nM | 5,7 nM |
| 4 | 3,2 nM | 5,7 nM |
| 5 | 128 nM | 5,7 nM |
Después de que se completó la reacción de
antígeno-anticuerpo, el medio de las reacciones fue
sustituido con tampón de carbonato 2,5 mM (pH 10) para preparar
muestras, usando un filtro de ultrafiltración que tenía un peso
molecular de corte de 50000.
Las soluciones de la reacción anteriormente
descritas fueron alimentadas al sustrato del electrodo que tenía la
trayectoria de flujo formada en el Ejemplo de Referencia 2 a un
caudal de 800 \mum/s en el orificio de inyección de la muestra
usando una bomba de microjeringuilla (KSD 100, Aishisu Co., Inc.).
El campo eléctrico aplicado tenía una frecuencia de 1 MHz y una
resistencia del campo eléctrico de 0,9 MV/m (definida como el
voltaje aplicado/7 \mum de se separación mínima).
Las muestras de moléculas anteriormente
mencionadas fueron introducidas en el orificio de inyección de
muestras en el sustrato del electrodo, y la cantidad de
fluorescencia se midió cerca de la salida de la trayectoria de
flujo aplicando el campo eléctrico predeterminado durante un período
de 30 a 80 segundos después de introducir cada muestra.
Las mediciones se llevaron a cabo tomando
imágenes fluorescentes aproximadamente cada cinco segundos en un
área de la trayectoria de flujo cerca de la salida de la trayectoria
de flujo bajo un microscopio láser confocal (LSM-GB
200, Olympus Optical Co., Ltd.) y calculando la suma de los valores
del brillo de todos los pixeles (en lo sucesivo denominada la
cantidad fluorescente). En las mediciones, cuando se usaron imágenes
confocales perfectas, en el caso de que la distribución de la
intensidad fluorescente tuviera lugar con la profundidad de la
trayectoria de flujo, no se obtuvieron resultados exactos. Por
tanto, el orificio del fotomultiplicador del microscopio láser se
abrió completamente con el fin de permitir integrar y medir la
fluorescencia dependiendo también de la profundidad.
La relación de captura puede ser calculada a
partir de la siguiente ecuación 1.
En estas mediciones, cuando no es aplicado el
campo eléctrico, la cantidad de fluorescencia medida a la salida
del electrodo es igual a la de la entrada, ya que las muestras que
tienen moléculas marcadas con fluorescencia se desplazan en la
estructura del electrodo por medio de una bomba de jeringuilla. Sin
embargo, cuando el campo eléctrico es aplicado y las moléculas son
atraídas hacia el electrodo por fuerzas de dielectroforesis, la
cantidad de fluorescencia será disminuida. Por lo tanto, la cantidad
disminuida en la cantidad de fluorescencia es tomada como la
cantidad capturada de moléculas y usada para indicar la cantidad de
moléculas atraídas hacia el electrodo cuando la cantidad total de
las moléculas iniciales se considera que es 100.
Relación \ de
\ captura \ (%) =
(F_{-}-F_{+})x100/F
en la
cual
F_{-}: la cantidad de fluorescencia sin
aplicar el campo eléctrico
F_{+}: la cantidad de fluorescencia durante la
aplicación del campo eléctrico
Los resultados se muestran en la Figura 8. A 0,9
MV/m de la resistencia del campo eléctrico empleado en estos
experimentos, la relación de captura era aproximadamente 100% para
el \lambda-DNA y 0% para el anticuerpo
anti-biotina marcado con fluoresceína. A una
concentración de biotina de 0 pM, como no había
\lambda-DNA biotinilado que fuera reconocido por
el anticuerpo anti-biotina marcado con fluoresceína,
el anticuerpo marcado no fue atrapado en el electrodo, y la
relación de captura exhibida fue casi 0%. Es esperado que cuando es
añadido el \lambda-DNA biotinilado, el anticuerpo
marcado que forma un complejo con el \lambda-DNA
biotinilado atrapado en el electrodo es también atrapado en el
electrodo, ya que el anticuerpo anti-biotina marcado
con fluoresceína está unido a biotina por la reacción de
antígeno-anticuerpo. Por lo tanto, la relación de
captura indicada en este caso es para representar la relación del
anticuerpo unido al \lambda-DNA biotinilado entre
el anticuerpo anti-biotina marcado total que está
contenido en la muestra. En concentraciones de biotina de 0 a 3,2
nM, la relación de captura fue aumentada proporcionalmente para
aumentar la concentración de biotina, y por tanto se puede decir
que el antígeno es detectado cuantitativamente. Por el contrario,
para muestras que tienen la concentración de biotina añadida a 3,2
nM o mayores, se encontró poco aumento en la relación de captura y
la captura fue del orden de casi 30%. Por esta causa, es probable
que el anticuerpo anti-biotina marcado con
fluoresceína usado en este Ejemplo tenga un bajo título de
anticuerpo, y el anticuerpo capaz de unirse a la biotina estaba
presente en tan solo aproximadamente 30% del anticuerpo total.
Hasta ahora, es imposible separar un complejo de
biotina y anticuerpo anti-biotina marcado con
fluoresceína a partir de un anticuerpo anti-biotina
marcado con fluoresceína sin reaccionar por cromatografía
dielectroforética y no se ha conseguido la detección de un complejo
con biotina, porque no hay diferencia en la separación por
dielectroforesis entre el complejo y el anticuerpo sin reaccionar
hasta un alcance suficiente. Los resultados anteriormente
mencionados indican que las aplicaciones de una sustancia mejoradora
de la separación puede permitir detectar cuantitativamente por
cromatografía de dielectroforesis las moléculas que no han sido
detectadas hasta ahora.
Se hizo reaccionar
alfa-fetoproteína (AFP) con gránulos de látex en los
que se había inmovilizado anticuerpo
anti-\alpha-fetoproteína (AFP)
A4-4, y se formó un complejo haciendo reaccionar
adicionalmente con un anticuerpo anti-AFP marcado
con fluoresceína WA1 Fab' que tenía un epitopo diferente del de
A4-4. Se detectó AFP separando el complejo del
anticuerpo anti-AFP marcado con fluoresceína sin
marcar WA1 en el electrodo.
Se mezclaron 1,2 mg de anticuerpo
anti-AFP A4-4 preparado por los
inventores y 10 mg de gránulos de látex con un diámetro de 120 nm
(látex reactivo N-100, Sekisui Chemical col., Inc.)
en una solución de citrato (pH 3) y seguidamente los gránulos se
recogieron como precipitados por centrifugación. Los gránulos
recogidos se pusieron en suspensión en solución al 2,5% de BSA para
bloquear la superficie de los gránulos, produciendo gránulos de
látex sobre los que se adsorbió el anticuerpo
anti-AFP A4-4. Los gránulos de látex
preparados tenían adsorbidos 123 \mug de anticuerpo
anti-AFP A4-4 por 1 mg de los
gránulos de látex.
Se digirieron 40 mg de anticuerpo
anti-AFP WA1 con pepsina, y seguidamente se redujo
con 2-aminometanotiol (Wako Pure Chemicals
Industries, Ltd.) para preparar 15 mg del Fab'. Se mezclaron 15 mg
del anticuerpo anti-AFP WA1 Fab' y 150 \mug de
isotiocianato de fluoresceína (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.)
en 10 ml de solución de tampón de carbonato (pH 9) y se preparó un
anticuerpo anti-AFP WA1 Fab' marcado con
fluoresceína usando una columna NAP-25 (Amersham
Pharmacia Biotech).
La reacción de
antígeno-anticuerpo se llevó a cabo mezclando los
componentes como se muestra en la Tabla 2 en PBS 50 mM (pH 7,5) y
dejando en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas.
| Muestra Nº | Látex inmovilizado en | AFP | Anticuerpo anti-AFP marcado |
| anticuerpo anti-AFP A4-4 | con fluoresceína WA1 Fab' | ||
| 1 | 0,10% | 0 \muM | 0,70 \muM |
| 2 | 0,10% | 0,09 \muM | 0,70 \muM |
| 3 | 0,10% | 0,18 \muM | 0,70 \muM |
| 4 | 0,10% | 0,35 \muM | 0,70 \muM |
Después de que se completó la reacción de
antígeno-anticuerpo, las soluciones de la reacción
se diluyeron 100 veces con agua destilada, y las materias
resultantes se sometieron a la separación dielectroforética.
En el electrodo dielectroforético descrito en el
Ejemplo de Referencia 1 se hicieron gotear 20 \mul de las
soluciones anteriormente mencionadas, y se colocó un vidrio de
recubrimiento que tenía en cada lado 22 mm. Se tomaron imágenes
fluorescentes antes y con posterioridad a la aplicación del campo
eléctrico usando un microscopio láser confocal. El campo eléctrico
aplicado tenía una frecuencia de 100 kHz y una resistencia del campo
eléctrico de 1,4 MV/m.
Se realizó un análisis de las imágenes
fluorescentes usando un software de análisis de imágenes Scion
Image. Después de que se hallara el promedio de la graduación de
los tonos de colores de las imágenes fluorescentes antes y durante
la aplicación del campo eléctrico, la graduación del tono de colores
de las imágenes antes de la aplicación del campo eléctrico se
sustrajo del obtenido durante la aplicación del campo eléctrico, de
forma que solamente fueran indicadas las áreas que tenían una
fluorescencia aumentada por la aplicación del campo eléctrico. El
densitograma de las áreas que tenían un aumento de fluorescencia se
obtuvo para expresar la cantidad aumentada de fluorescencia como
valores de concentración de producción de imágenes.
Como consecuencia de la dielectroforesis en el
electrodo, los gránulos se desplazaron hasta una zona débil en la
resistencia del campo eléctrico debido a que recibían fuerzas
dielectroforéticas negativas, y las demás moléculas biológicas,
incluido el anticuerpo anti-AFP WA1 Fab' marcado con
fluoresceína sin reaccionar se desplazaron hasta una zona fuerte en
la resistencia del campo eléctrico debido a que recibían fuerzas
dielectroforéticas positivas, y por lo tanto permitían separar, en
el electrodo, el complejo de gránulos de látex inmovilizados en
anticuerpo anti-AFP/AFP/anticuerpo
anti-AFP WA1 Fab' marcado con fluoresceína del
anticuerpo anti-AFP WA1 Fab' marcado con
fluoresceína sin reaccionar.
La Figura 9 muestra imágenes fluorescentes en el
electrodo tomadas desde el microscopio láser antes y durante la
aplicación del campo eléctrico, cuando se añadió AFP a 0,35 \muM.
En las muestras que contenían AFP, la fluorescencia había aumentado
en el electrodo de aluminio debido a las fuerzas dielectroforéticas
negativas durante la aplicación del campo eléctrico, mientras que
en la muestra que no contenía AFP, no se encontraron cambios en las
imágenes antes y durante la aplicación del campo eléctrico. Estas
imágenes fueron tratadas con Scion Image para obtener densitogramas
en zonas de bandas en las que la fluorescencia estaba aumentada, y
la cantidad aumentada de fluorescencia se expresó como valores de
concentración de producción de imágenes. La Figura 10 muestra la
relación entre las concentraciones de AFP y las cantidades
aumentadas de fluorescencia.
A partir de los resultados de la Figura 10, se
comprenderá que se encuentra una buena respuesta a la dosis entre
las concentraciones de AFP añadidas y que los valores de
concentración de la producción de imágenes y los de AFP pueden ser
detectados cuantitativamente.
Se usaron los mismos reactivos que en el
apartado 2-1.
Después de que se prepararon las muestras que
tenían los componentes mostrados en la Tabla 2 con suero normal que
no contenía AFP, se llevó a cabo la reacción de
antígeno-anticuerpo dejando en reposo durante dos
horas a temperatura ambiente.
Después de que se completó la reacción de
antígeno-anticuerpo, las soluciones de la reacción
se diluyeron 100 veces con agua destilada y las materias
resultantes se sometieron a dielectroforesis.
Los procedimientos se llevaron a cabo
análogamente a los del apartado 2-1.
Los resultados se muestran en la Figura 11.
Puede encontrarse a partir de la Figura 11 que se obtiene un buen
resultado cuantitativo en el intervalo de la presencia de AFP. A
partir de este descubrimiento, se entiende que si se usa suero como
las muestras, los componentes en el suero no afectan a la
dielectroforesis en gran medida, y se puede conseguir la detección
de una proteína que va a ser medida en suero.
\newpage
A partir de estos resultados, el uso de una
sustancia que tenga dielectroforesis negativa, como gránulos de
látex, como una sustancia mejoradora de la separación, permite
separar en el electrodo dielectroforético un componente biológico
que tiene dielectroforesis positiva, y permitirá separar y detectar
cuantitativamente una proteína al nivel molecular, lo que era
imposible hasta ahora.
Con el fin de preparar gránulos de
estreptavidina para fijar una sonda de DNA, se inmovilizó
estreptavidina en gránulos de látex carboxilados con un diámetro de
2 \mum (Polysciences, Inc.) usando un estuche de ensayo de
carbodiimida para micropartículas caboxiladas (Polysciences, Inc.).
Como la sonda de DNA se usó un producto obtenido amplificando 2 kb
de una secuencia casi media de \lambda-DNA por PCR
usando un cebador de
5'-CTATGACTGTACGC
CACTGTCC-3' marcada con 5'-biotina y un cebador de 5'-CAATCACCAACCCAGAAAACAATG-3'. El producto se hizo reaccionar con los gránulos inmovilizados en estreptavidina para preparar gránulos de látex inmovilizados en DNA de 2 kb.
CACTGTCC-3' marcada con 5'-biotina y un cebador de 5'-CAATCACCAACCCAGAAAACAATG-3'. El producto se hizo reaccionar con los gránulos inmovilizados en estreptavidina para preparar gránulos de látex inmovilizados en DNA de 2 kb.
Los gránulos de látex inmovilizados en DNA de 2
kb preparados se mantuvieron en reposo en NaOH 0,3 N durante 5
minutos para desnaturalizar el DNA de 2 kb hasta cadenas únicas.
Después de que los gránulos fueron precipitados por centrifugación,
los gránulos se volvieron a poner en suspensión en NaOH 0,3 N. Se
añadió solución de HCl a la concentración final de 0,3 N para
neutralizar, para preparar gránulos de látex inmovilizados en sonda
de DNA de 2 kb.
Se marcaron lambda-DNA y T7 DNA
en una secuencia diferente de \lambda-DNA con
fluoresceína (fluorescencia verde) y Cy3 (fluorescencia roja;
Molecular Probes, Inc.), respectivamente, usando un estuche de
ensayo marcador de ácidos nucleicos Label IT. Los DNA marcados
fueron desnaturalizados a cadenas únicas dejándolos en reposo a
temperatura ambiente durante 5 minutos en NaOH 0,3 N, y seguidamente
fueron neutralizados añadiendo solución de HCl hasta la
concentración final de 0,3 N.
En un tampón SSC, se añadieron 0,05% (p/v) de
los gránulos de látex inmovilizados en sonda de DNA de 2 kb al T7
\lambda-DNA y T7 DNA de cadena única marcados
hasta la concentración final de 20 \mug/ml, y la hibridación se
llevó a cabo a 68ºC durante 18 horas. La solución de la muestra
después de la reacción de hibridación se diluyó 100 veces con agua
destilada, y se sometió a dielectroforesis.
Los procedimientos se llevaron a cabo
análogamente a los del apartado 2-1, con la
excepción de que se empleó un campo eléctrico que tenía una
frecuencia de 3 MHz y una resistencia del campo eléctrico de 0,9
MV/m.
Los resultados se muestran en la Figura 12.
Cuando se observó la solución después de la
hibridación bajo un microscopio de fluorescencia, solamente se
observó en los gránulos la fluorescencia de Cy3 con el que había
sido marcado el \lambda-DNA. Cuando el campo
eléctrico fue aplicado después de que esta solución se hizo gotear
sobre el electrodo dielectroforético, los gránulos de látex
recibieron fuerzas dielectroforéticas negativas y se desplazaron
hasta una zona débil en la resistencia del campo eléctrico, de
forma que la fluorescencia de \lambda-DNA marcado
con Cy3 se unió a los gránulos unidos a sonda de DNA de 2 kb fue
observada en una zona débil en una resistencia del campo eléctrico
débil. Por el contrario, la fluorescencia de T7 DNA marcado con
fluoresceína no unido a los gránulos inmovilizados en sonda de DNA
de 2 kb fue observada en una zona del borde del electrodo, debido al
movimiento hacia una zona fuerte en la resistencia del campo
eléctrico por dielectroforesis positiva. Por tanto, este ejemplo
demuestra que el uso de gránulos de látex como una sustancia
mejoradora de la separación dielectroforética permitirá separar y
detectar una molécula específica de DNA entre muchas especies
moleculares.
A partir de estos resultados, se comprende que
una sustancia mejoradora de la separación dielectroforética es útil
en una separación dielectroforética para la detección de una
sustancia.
\newpage
Ejemplo Experimental
1
Como muestras de DNA se usó 1 ml de una solución
en agua ultrapura que contenía 0,001 mg de
\lambda-DNA (48,5 kb, de doble cadena), que fue
marcado con un reactivo fluorescente
YO-PRO-1 (una marca registrada de la
empresa Molecular Probes, Inc.) según el método descrito por R. P.
Hogland, ``Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,
6th Edición, Molecular Probes, Inc. (1996) y 1 ml de solución en
agua ultrapura que contenía 0,001 mg de un oligonucleótido (22
bases, DNA de cadena única, preparado por los inventores), que fue
marcada en la posición terminal con un colorante fluorescente de
fluoresceína cuando fue sintetizado como un DNA corto mediante un
método habitual, respectivamente.
Con el fin de examinar si las moléculas de DNA
experimentan o no dielectroforesis en el sustrato de electrodo
elaborado en el Ejemplo de Referencia 1, se hicieron gotear 10
\mul de las muestras respectivas de DNA anteriormente descritas
(el \lambda-DNA marcado y el oligonucleótido)
sobre el sustrato del electrodo, y la fluorescencia de las muestras
de DNA se observó bajo un microscopio de fluorescencia aplicando
gradualmente al electrodo un voltaje AC con una frecuencia de 1
MHz.
Se observó que el \lambda-DNA
comenzó a acumularse en una posición de campo eléctrico fuerte por
dielectroforesis a aproximadamente 500 kV/m de resistencia del
campo eléctrico en la separación mínima entre los electrodos. Sin
embargo, a esta resistencia del campo eléctrico, no se observó que
el oligonucleótido se acumulara en una posición del campo eléctrico
fuerte por dielectroforesis.
Se usaron como muestras de proteínas una
solución en agua ultrapura que contenía 0,1 mg de IgM (peso
molecular de aproximadamente 900 kDa), que fue marcada con un
reactivo fluorescente FITC (isotiocianato de fluoresceína, Wako
Pure Chemicals Industries, Ltd.) según el método descrito por H.
Maeda, Journal of Biochemistry, 65, 777 (1969) y una solución en
agua ultrapura que contenía 0,1 mg de BSA (peso molecular,
aproximadamente 65 kDa), que fue marcado con un reactivo
fluorescente TRITC (isotiocianato de
tetrametil-rodamina, Wako Pure Chemicals
Industries, Ltd.) según el método descrito por H. Maeda, Journal of
Biochemistry, 65, 777 (1969), respectivamente.
Con el fin de examinar si las moléculas de
proteínas experimentan o no dielectroforesis en el sustrato del
electrodo, se hicieron gotear 10 \mul de las respectivas muestras
de proteínas anteriormente descritas (la IgM marcada y BSA) sobre
el sustrato del electrodo, y se observó la fluorescencia en las
muestras de DNA bajo un microscopio de fluorescencia aplicando
gradualmente al electrodo un voltaje AC con una frecuencia de 1
MHz.
Se observó que la IgM marcada con FITC comenzó a
acumularse en una posición del campo eléctrico fuerte a
aproximadamente 1,0 MV/m de la resistencia del campo eléctrico en
la separación mínima en el electrodo. Sin embargo, a esta
resistencia del campo eléctrico, se observó claramente que el BSA
marcado don TRITC se asociaba a una posición del campo eléctrico
fuerte por dielectroforesis.
Ejemplo Experimental
2
Como muestras de moléculas se usaron el
\lambda-DNA marcado y las soluciones de
oligonucleótidos usadas en el Ejemplo Experimental 1.
Las soluciones de moléculas anteriormente
descritas fueron alimentadas al sustrato de electrodo que tenía la
trayectoria de flujo elaborado en el Ejemplo de Referencia 2 a un
caudal de 800 m/s en el orificio de inyección de la muestra usando
una bomba de microjeringuillas (KSD 100, Aishisu Co., Inc.). El
campo eléctrico aplicado tenía una frecuencia de 1 MHz y
resistencias del campo eléctrico de unos centenares de kV/m a unos
pocos MV/m (definido como el voltaje aplicado/7 \mum de la
separación mínima).
Cada muestra de molécula (10 \mug/ml del
\lambda-DNA marcado o 0,56 pg/ml del
oligonucleótido marcado) fue introducida en el orificio de
inyección de muestras en el sustrato del electrodo, y la cantidad de
fluorescencia se midió cerca de la salida de la trayectoria de
flujo con la aplicación del campo eléctrico predeterminado durante
un período de 30 a 80 segundos después de introducir cada
muestra.
Las mediciones se llevaron a cabo tomando
imágenes fluorescentes aproximadamente cada cinco segundos en la
trayectoria de flujo cercana a la salida de la trayectoria de flujo
usando un microscopio láser confocal (LSM-GB 200,
Olympus Optical Col, Ltd.) y calculando la suma de los valores del
brillo de todos los píxeles (en lo sucesivo denominada la cantidad
de fluorescencia). En las mediciones, cuando se usaron imágenes
confocales perfectas, en el caso de que la distribución de la
intensidad fluorescente tuviera lugar con la profundidad de la
trayectoria de flujo, no se obtuvieron resultados exactos. Por
tanto, el orificio del fotomultiplicador del microscopio láser
estuvo completamente abierto con el fin de permitir integrar y medir
la fluorescencia dependiendo también de la profundidad.
La relación de captura se calculó a partir de la
ecuación 1 anteriormente descrita.
En estas mediciones, cuando no se aplica el
campo eléctrico, la cantidad de fluorescencia medida a la salida
del electrodo es igual a la de la entrada, ya que las muestras de
molécula marcada con fluorescencia se desplazaba en la estructura
del electrodo por medio de la bomba de jeringuilla. Sin embargo,
cuando el campo eléctrico es aplicado y las moléculas son atraídas
hacia el electrodo por fuerzas dielectroforéticas, la cantidad de
fluorescencia será disminuida. Por lo tanto, la cantidad disminuida
en la cantidad de fluorescentes es tomada como la cantidad
capturada de moléculas y es usada para indicar la cantidad de
moléculas atraídas hacia el electrodo cuando la cantidad total de
las moléculas iniciales se considera que es 100.
La Figura 13 muestra el transcurso del tiempo de
la cantidad de fluorescencia a la salida de la trayectoria de
flujo, cuando se usó la solución de \lambda-DNA
marcado y el campo eléctrico aplicado tenía una resistencia del
campo eléctrico de 0,60 o 1,04 MV/m. La Figura 14 muestra el
transcurso del tiempo de la cantidad de fluorescencia a la salida
de la trayectoria de flujo, cuando se usó la solución de
oligonucleótido marcado y el campo eléctrico aplicado tenía una
resistencia del campo eléctrico de 1,4 MV/m. En la Figura 13, los
resultados bajo la resistencia del campo eléctrico aplicado de 0,60
MV/m son indicados mediante círculos abiertos, y los resultados bajo
1,04 MV/m mediante círculos cerrados.
Como se muestra en la Figura 13, se reconoce que
cuando se usó la solución de \lambda-DNA marcada y
el campo eléctrico aplicado tenía una resistencia del campo
eléctrico de 1,04 MV/m, la cantidad de fluorescencia a la salida de
la trayectoria de flujo se redujo hasta aproximadamente cero, ya que
el campo eléctrico era suficientemente fuerte y todo el
\lambda-DNA fue capturado en el electrodo. Un
aumento transitorio en la cantidad de fluorescencia después de 80
segundos es debido al cese del campo eléctrico, dando lugar a la
liberación de las moléculas de DNA que se habían acumulado en el
electrodo hasta entonces, y proporcionando así transitoriamente una
mayor cantidad de fluorescencia que la del estado inicial. Después
de que el DNA capturado haya sido liberado, la cantidad de
fluorescencia se hizo volver al nivel inicial. Un modelo similar
pudo ser reconocido también cuando se usó la solución de
\lambda-DNA marcado y el campo eléctrico aplicado
tenía una resistencia del campo eléctrico de 0,60 MV/m. Sin
embargo, debe entenderse que la cantidad de fluorescencia no estaba
reducida a cero durante la aplicación del campo eléctrico (durante
el período de 30 a 80 segundos), dicho de otro modo, el DNA no fue
completamente capturado debido a que la resistencia del campo
eléctrico no era suficiente. Adicionalmente, aunque el
\lambda-DNA fue fuertemente capturado en una
posición del campo eléctrico fuerte a una resistencia del campo
eléctrico de 0,5 MV/m en el Ejemplo Experimental 1, debe entenderse
en estos experimentos que cuando se va a obtener una capacidad
similar para capturar DNA en el electrodo, es necesario proporcionar
una resistencia del campo eléctrico más fuerte que sin el flujo en
la trayectoria de flujo, porque es añadida la resistencia que
resulta del flujo.
Como se muestra en la Figura 14, debe entenderse
que cuando se usó la solución de oligonucleótido marcado y el campo
eléctrico aplicado tenía una resistencia del campo eléctrico de 1,4
MV/m, no se observó ninguna disminución en la cantidad de
fluorescencia, es decir, el oligonucleótido no fue capturado en
absoluto a esta resistencia del campo eléctrico.
Estos resultados sugieren que el
\lambda-DNA y un oligonucleótido pueden ser
separados uno de otro usando el método de separación de la presente
invención.
Los componentes respectivos fueron separados de
las soluciones en de \lambda-DNA (48,5 kb, doble
cadena) y un oligonucleótido (22 bases, DNA de cadena única).
Se llevaron a cabo mediciones preliminares de la
intensidad de la fluorescencia para confirmar que 5 \mug/ml de
\lambda-DNA (48,5 kb, doble cadena) marcado con un
reactivo fluorescente YO-PRO-1 y 2,3
pg/ml de un oligonucleótido (22 bases, DNA de cadena única) marcado
con fluoresceína reactiva fluorescente en la posición terminal en
la síntesis como un DNA de cadena corte emiten la misma cantidad de
fluorescente uno y otro. Como muestras se usaron soluciones en agua
ultrapura que contenían el oligonucleótido marcado y el
\lambda-DNA marcado a concentraciones dadas, como
se muestra en la siguiente Tabla 3, basada en este resultado.
| Muestra Nº | Relación de mezcla de | Concentración de | Concentración de |
| oligonucleótido: \lambda-DNA | oligonucleótido marcado | \lambda-DNA marcado | |
| 1 | 0:1 | 0 pg/ml | 10 \mug/ml |
| 2 | 1:1 | 2,3 pg/ml | 5 \mug/ml |
| 3 | 5:1 | 2,3 pg/ml | 1 \mug/ml |
| 4 | 1:0 | 2,3 pg/ml | 0 \mug/ml |
Las muestras fueron alimentadas al sustrato de
electrodo que tenía la trayectoria de flujo elaborado en el Ejemplo
de Referencia 2 a un caudal de 800 \mum/s en el orificio de
inyección de muestras usando una bomba de microjeringuilla (KSD
100, Aishisu Co., Inc.). El campo eléctrico aplicado tenía una
frecuencia de 1 MHz y una resistencia del campo eléctrico de 0,86
MV/m o 1,02 MV/m, y el campo eléctrico predeterminado fue aplicado
durante un período de 30 a 80 segundos después de la inyección de la
muestra para medir las cantidades de fluorescencia del
\lambda-DNA marcado cerca de la salida de la
trayectoria de flujo. Las mediciones y la determinación de la
relación de captura se llevaron a cabo como en el Ejemplo
Experimental 2.
Los resultados se muestran en la Figura 15, en
la que los resultados de la muestra que tenía una relación de
mezcladura de 0:1 del oligonucleótido marcado y
\lambda-DNA está indicada mediante círculos
abiertos, los resultados de la muestra que tiene una relación de
mezcladura de 1:1 mediante cuadrados abiertos, los resultados de la
muestra que tiene una relación de mezcladura de 5:1 mediante + y los
resultados de la muestra que tiene una relación de mezcladura de
1:0 mediante x.
En este Ejemplo, teniendo en cuenta el
acontecimiento en el que todo el \lambda-DNA
capturado y el oligonucleótido no es capturado en absoluto, la
relación de captura es igual al porcentaje de la cantidad de
fluorescencia derivada del \lambda-DNA ocupado en
la cantidad de fluorescencia de una muestra completa. Es decir, la
Muestra 1 (una muestra que tiene una relación de mezcladura de 0:1
del oligonucleótido marcado y \lambda-DNA) debe
proporcionar una relación de captura de 100%, la Muestra 2 (una
muestra que tiene una relación de mezcladura de 1:1 del
oligonucleótido marcado y \lambda-DNA) debe
proporcionar una relación de captura de 1/(1+1)=50%, la Muestra 3
(una muestra que tiene una relación de mezcladura de 5:1 del
oligonucleótido marcado y \lambda-DNA) debe
proporcionar una relación de captura de 1/(1+5)=16,7%, y la Muestra
4 (una muestra que tiene una relación de mezcladura de 1:0 del
oligonucleótido marcado y \lambda-DNA) debe
proporcionar una relación de captura de 0%.
A partir de los resultados mostrados en la
Figura 15, debe entenderse que, cuando el campo eléctrico aplicado
tiene una resistencia del campo eléctrico de 0,86 MV/m, la relación
de captura del \lambda-DNA (Muestra 1) era 53% y
el oligonucleótido (Muestra 4) no fue capturado en absoluto.
Adicionalmente, para la Muestra 2 (una muestra de
\lambda-DNA a oligonucleótido = 1:1), la relación
de captura obtenida fue la mitad del valor anteriormente
mencionado, un poco más de 20%, y para la Muestra 3 (una muestra de
\lambda-DNA a oligonucleótido = 1:5), la relación
de captura obtenida fue un poco menor que 10%. Debe entenderse que
estas relaciones de captura son casi congruentes con los valores
teóricos calculados a partir de 53% de la relación de captura de la
Muestra 1 (Muestra 2, 53% \div 1(1+1) = 26,5%; Muestra 3,
53% \div 1(1+5) = 8,8%).
Cuando el campo eléctrico aplicado tenía una
resistencia del campo eléctrico de 1,02 MV/m, debe entenderse que
se obtuvo un 100% de la relación de captura para el
\lambda-DNA solo (Muestra 1) y no se obtuvo
ninguna captura para el oligonucleótido solo (Muestra 4). Debe
entenderse también que la Muestra 2 proporcionó una relación de
captura de 60% y la Muestra 3 proporcionó una relación de captura de
aproximadamente 20%, y estas relaciones de captura son casi
congruentes con los respectivos valores teóricos, 50% y 16,7%. Debe
entenderse a partir de esto que el \lambda-DNA y
un oligonucleótido pueden ser separados uno de otro en un tiempo
corto de unas pocas decenas de segundos según el método de la
presente invención.
Debe entenderse a partir de estos resultados que
pueden ser separados dos o más tipos de moléculas unos de otros con
combinaciones de una molécula que va a ser separada y
molécula(s) coexistente(s) seleccionando una
resistencia del campo eléctrico apropiada.
Los componentes respectivos fueron separados de
soluciones en IgM (peso molecular de aproximadamente 900 kDa) y BSA
(peso molecular de aproximadamente 65 kDa).
Como muestras se usaron soluciones en agua
superpura que contenían 0,1 mg/ml de IgM (peso molecular de
aproximadamente 900 kDa) marcada con un reactivo fluorescente FITC
y 0,1 mg/ml de BSA (peso molecular de aproximadamente 65 kDa)
marcado con un reactivo fluorescente TRITC.
Los procedimientos se llevaron a cabo
análogamente a los del Ejemplo 1, con la excepción de que se empleó
un caudal de 400 \mum/s y una resistencia del campo eléctrico
aplicado de 1,42, 1,78 o 2,14 MV/m, y las cantidades de
fluorescencias de IgM y BSA marcadas fueron medidas simultáneamente
para determinar las respectivas relaciones de captura.
Los resultados se muestran en la Figura 16, en
la que las relaciones de captura de las IgM y BSA capturadas están
indicadas por círculos abiertos y círculos cerrados,
respectivamente.
A partir de los resultados mostrados en la
Figura 16, debe entenderse que tanto para IgM como para BSA, la
relación de captura fue aumentada con resistencias del campo
eléctrico crecientes, y a una resistencia del campo eléctrico de
2,14 MV/m, la relación de captura fue de aproximadamente 68,5% para
IgM y 38% para BSA y, por tanto, hay una clara diferencia en la
relación de captura según la diferencia de peso molecular.
Aunque las moléculas de proteínas no pudieron
ser capturadas completamente a la resistencia del campo eléctrico
empleada en este Ejemplo, es fácilmente esperado que la separación
de IgM de BSA puede ser conseguida extendiendo adicionalmente la
zona de separación del electrodo ya que se encuentra una diferencia
significativa en la relación de captura según la diferencia de peso
molecular. Esto sugiere que el método de la presente invención
permite la separación también según la diferencia de tamaño en el
nivel molecular de las proteínas.
Las moléculas de complejo de
\lambda-DNA marcado con biotina/anticuerpo
anti-biotina marcado con fluoresceína y anticuerpo
anti-biotina marcado con fluoresceína libre no
unidas a \lambda-DNA marcado con biotina fueron
separadas unas de otras a partir de soluciones obtenidas mezclando
\lambda-DNA marcado con biotina y anticuerpo
anti-biotina marcado con fluoresceína, seguido de la
reacción de antígeno-anticuerpo.
Se preparó \lambda-DNA marcado
con biotina con estuche de ensayo de marcado
Photo-Biotin (Nippon Geno Co., Ltd.) según el
protocolo de preparación anejo, y seguidamente los componentes
fueron mezclados con PBS 50 mM (pH 7,5) a relaciones como se
muestra en la Tabla 4 para llevar a cabo la reacción de
antígeno-anticuerpo. Después de que se completó la
reacción de antígeno-anticuerpo, el medio fue
sustituido con tampón de carbonato (pH 10) usando un filtro de
ultrafiltración que tenía un peso molecular de corte de 50000 para
preparar muestras.
La concentración de 21 \mug/ml de anticuerpo
anti-biotina marcado con fluoresceína (Cosmo Bio Co.
Ltd.) tenía moles de biotina iguales a los de 10 \mug/ml de
\lambda-DNA marcado con biotina.
| Muestra Nº | Concentración de \lambda-DNA | Concentración de anticuerpo | Concentración de |
| marcado con biotina | anti-biotina marcado | \lambda-DNA sin marcar | |
| con fluoresceína | |||
| 1 | 0 \mug/ml | 21 \mug/ml | 10 \mug/ml |
| 2 | 2,5 \mug/ml | 21 \mug/ml | 7,5 \mug/ml |
| 3 | 5 \mug/ml | 21 \mug/ml | 5 \mug/ml |
| 4 | 10 \mug/ml | 21 \mug/ml | 0 \mug/ml |
La resistencia del campo eléctrico era de 1,07
MV/m y los procedimientos se llevaron a cabo análogamente a los del
Ejemplo 2. Se midieron las cantidades de fluorescencias del
anticuerpo anti-biotina marcado con fluoresceína en
las moléculas complejas y el anticuerpo anti-biotina
marcado con fluoresceína libre para determinar la relación de
captura.
Los resultados se muestran en la Figura 17. Como
se muestra a partir de los resultados en la Figura 17, debe
entenderse que la relación de captura de la molécula compleja era
36% para una concentración de biotina- \lambda-DNA
de 10 \mug/ml, 8,9% para 2,5 \mug/ml y 6% para 0 \mug/ml y,
por tanto, la relación de captura es disminuida con concentraciones
decrecientes de \lambda-DNA marcado con biotina.
Bajo condiciones dielectroforéticas suficientes para capturar el
\lambda-DNA a 100% cuando se aplicó
\lambda-DNA sin marcar de la Muestra 1, la
relación de captura fue de 6% mientras que la aplicación de
\lambda-DNA marcados de las Muestras 2, 3 y 4
proporcionó una relación de captura significativamente mayor. Por
lo tanto, debe entenderse que la separación de moléculas complejas
que resultan de la reacción de antígeno-anticuerpo
de anticuerpo anti-biotina marcado con fluoresceína
y \lambda-DNA marcado con biotina del anticuerpo
anti-biotina marcado con fluoresceína libre no unido
a \lambda-DNA sin marcar se puede realizar con
algo de dependencia de la concentración.
Como se mencionó anteriormente, según el primer
método de la presente invención, dos o más tipos de moléculas
disueltas en una solución en la que no había sido posible una
separación hasta ahora, han sido satisfactoriamente separados unos
de otros por primera vez con fuerzas dielectroforéticas, mediante un
método de formación de una sustancia compleja que contiene una
sustancia mejoradora de la separación, lo cual no había sido llevado
a cabo en el pasado. Por tanto, la presente invención supone un
gran avance como invención.
Adicionalmente, el segundo método de la presente
invención es el primer método mediante el cual dos o más tipos de
moléculas disueltas en una solución en la cual no había sido posible
una separación hasta ahora, han sido satisfactoriamente separados
unos de otros usando fuerzas dielectroforéticas bajo un campo
eléctrico fuerte que no había sido empleado en el pasado.
Según la presente invención, las respectivas
moléculas pueden ser rápida y fácilmente separadas de una solución
en la que están disueltos dos o más tipos de moléculas, como
moléculas de componente biológicos, por ejemplo, DNA y proteínas,
que no habían podido ser separadas hasta ahora mediante fuerzas
dielectroforéticas.
Claims (7)
1. Un método para separar una sustancia compleja
de una "molécula específica" en una muestra y una "sustancia
capaz de cambiar propiedades dielectroforéticas de la molécula
específica" que se une a la "molécula específica" de
moléculas distintas de la "molécula específica" en la muestra,
que comprende
- formar la sustancia compleja de la "molécula
específica" y la "sustancia capaz de cambiar propiedades
dielectroforéticas de la molécula específica",
caracterizado por las etapas de
- aplicar la mezcla de reacción resultante que
contiene la sustancia compleja a una dielectroforesis usando un
campo eléctrico no uniforme, y
- separar la sustancia compleja de las moléculas
distintas de la "molécula específica" mediante fuerzas
dielectroforéticas.
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente las etapas de
- medir la "molécula específica" en la
sustancia compleja separada o una molécula distinta de la
"molécula específica" en la muestra, y
- determinar la cantidad de un componente en la
muestra sobre la base del resultado de la medición.
3. El método según la reivindicación 2, en el
que cada uno de los componentes en la "molécula específica" es
una "molécula que va a ser medida".
4. El método de la reivindicación 2, en el que
la muestra que contiene la "molécula específica" es puesta en
contacto con una "molécula específica marcada por una sustancia
marcadora" y la "sustancia capaz de cambiar propiedades
dielectroforéticas de la molécula específica" que se une a la
"molécula específica" para formar una sustancia compleja
marcada de la "molécula específica marcada por la sustancia
marcadora" y la "sustancia capaz de cambiar propiedades
dielectroforéticas de la molécula específica", y que comprende
las etapas de
- aplicar la mezcla de reacción resultante que
contiene la sustancia compleja marcada a dielectroforesis usando un
campo eléctrico no uniforme,
- separar la sustancia compleja marcada de la
"molécula específica marcada por la sustancia marcadora" que no
está involucrada en la formación de la sustancia compleja,
- medir la "molécula específica marcada por la
sustancia marcadora" en la sustancia compleja marcada separada o
la "molécula específica marcada por la sustancia marcadora" que
no está involucrada en la formación de la sustancia compleja, y
- determinar una cantidad del componente en la
muestra sobre la base del resultado de la medición.
5. El método según una de las reivindicaciones 1
a 4, en el que la muestra que contiene la "molécula específica"
es una muestra derivada de un cuerpo vivo, o un material tratado de
la muestra derivada del cuerpo.
6. El método según una de las reivindicaciones 1
a 5, en el que la "sustancia capaz de cambiar propiedades
dielectroforéticas de la molécula específica" es una sustancia
que puede proporcionar a la "molécula específica" propiedades
dielectroforéticas, sobre la base de que la "molécula
específica" puede ser separada de las moléculas distintas de la
"molécula específica" contenida en la muestra por
dielectroforesis, uniéndose a la "molécula específica".
7. El método según una de las reivindicaciones 1
a 6, en el que la "sustancia que se une a la molécula
específica" es una sustancia que se une a la molécula específica
mediante una reacción de "antígeno"-"anticuerpo", una
reacción "cadena de azúcar"-"lecitina", una reacción de
"enzima"-"inhibidor", una reacción de
"proteína"-"péptido", o una reacción de "cromosoma o
cadena de nucleótido"-"cadena de nucleótido".
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