ES2262155T3 - Formulacion liposomial mejorada. - Google Patents
Formulacion liposomial mejorada.Info
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Abstract
DEPENDIENDO DEL ANTIGENO ENCAPSULADO, LOS FORMULADOS LIPOSOMICOS SUFREN INESTABILIDAD EN PRESENCIA DE ALUMBRE. LOS FORMULADOS QUE CONTIENEN UN DETERGENTE NO IONICO COMO AGENTE ESTABILIZANTE EVITAN ESTA INESTABILIDAD.
Description
Formulación liposomal mejorada.
La invención se refiere a formulaciones
farmacéuticas, en especial a formulaciones liposomales. De forma más
específica, la invención se refiere a un método para estabilizar
liposomas administrados en presencia de un compuesto de aluminio
adyuvante.
La formulación de vacunas mediante encapsulación
de antígenos/inmunógenos en liposomas constituye un método
ampliamente utilizado. A menudo es deseable incluir, junto con el
antígeno encapsulado en los liposomas, un adyuvante que incluya una
sal de aluminio (es decir, un alumbre), por ejemplo hidróxido de
aluminio. Se ha observado que en algunos casos el alumbre estimula
en gran medida la inmunogenicidad del antígeno, mientras que en
otros no tiene efectos o inhibe la respuesta inmune. Parece que la
naturaleza del efecto observado depende de la naturaleza del
antígeno. En conejos a los que se les han inyectado liposomas que
contienen el lípido A y el antígeno de la malaria R32tet32, la
producción de anticuerpos mejora cuando los liposomas son
adsorbidos en alumbre (observaciones no publicadas). Sin embargo, un
péptido de VIH encapsulado en liposomas presentaba una
inmunogenicidad reducida cuando se incluía alumbre en la formulación
(White, W.I. y col. Vaccine (1995), en impresión). Una
composición similar que
contenía el antígeno de la malaria RLF no se vió afectada por la presencia de alumbre (observaciones no publicadas).
contenía el antígeno de la malaria RLF no se vió afectada por la presencia de alumbre (observaciones no publicadas).
Sería deseable preparar una formulación de
liposomas de tal forma que la administración con alumbre mejorara
coherentemente la respuesta inmune. La presente invención describe
estas formulaciones y también proporciona un medio para predecir,
para un determinado antígeno, si la composición mejorada será o no
deseable o necesaria.
Se ha descubierto ahora, de forma sorprendente,
que la presencia de un adyuvante de alumbre rompe los liposomas que
contienen ciertos antígenos. Prevenir esta disrupción estabiliza y
mantiene la inmunogenicidad de la composición. Además, la medida de
la capacidad de una formulación particular de experimentar tal
disrupción en presencia de alumbre proporciona una herramienta
predictiva para determinar si el alumbre disminuirá o no la
inmunogenicidad de la composición.
Así, en un aspecto, la invención se dirige a una
composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno
encapsulado en liposomas, comprendiendo además dicha composición
alumbre y al menos un agente estabilizador en una cantidad efectiva
para impedir la disrupción de dichos liposomas en presencia de
alumbre, donde dicho agente estabilizador es un detergente no
iónico, un polioxietilen sorbitan éster, cuya forma esterificada
contiene menos de 18 átomos de carbono y/o al menos un
enlace-\pi.
Figura 1a: es una representación gráfica de la
velocidad de liberación de PSA desde los liposomas en ausencia de
alumbre añadido;
Figura 1b: es una representación de la velocidad
de liberación de PSA desde los liposomas en presencia de
alumbre;
Figura 1c: representa los resultados de la
Figura 1b corregidos para las velocidades de liberación mostradas en
la Figura 1a.
Figura 2a: muestra el efecto de la concentración
de Tween 80 sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia
de alumbre en los liposomas;
Figura 2b: muestra el efecto de la concentración
de Span 80 sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia de
alumbre en los liposomas;
Figura 2c: muestra el efecto de la concentración
de Tween 20 sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia
de alumbre en los liposomas;
Figura 2d: muestra el efecto de la concentración
de Tween 40 sobre la liberación de glucosa en presencia y ausencia
de alumbre en los liposomas;
Figura 2e: muestra el efecto de la concentración
de Tween 60 (Tween 60 es una marca comercial) sobre la liberación de
glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas;
Figura 2f: muestra el efecto de la concentración
de Tween 65 (Tween 65 es una marca comercial) sobre la liberación de
glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas;
Figura 2g: muestra el efecto de la concentración
de Tween 85 (Tween 85 es una marca comercial) sobre la liberación de
glucosa en presencia y ausencia de alumbre en los liposomas.
Figura 3: muestra el tiempo de liberación de
glucosa desde los liposomas en presencia de Alhydrogel^{TM} para
liposomas preparados con y sin Tween 80 (Tween 80 es una marca
comercial).
Figura 4a: muestra el efecto de la concentración
de Tween 80 sobre la liberación de PSA desde los liposomas a dos
temperaturas en ausencia de alumbre;
Figura 4b: muestra el efecto de la concentración
de Tween 80 sobre la liberación de PSA desde los liposomas a dos
temperaturas en presencia de alumbre;
Figura 4c: representa la diferencia entre las
Figuras 4a y 4b.
La invención proporciona un método para
estabilizar preparaciones liposomales contra la disrupción causada
por la presencia de geles de hidróxido de aluminio o de otros
adyuvantes basados en alumbre. Los presentes solicitantes han
descubierto que el efecto variable de la adición de adyuvantes de
alumbre sobre la inmunogenicidad de las preparaciones liposomales es
debido a un efecto del alumbre sobre la integridad de los liposomas
per se. Por tanto, además de proporcionar un método para
estabilizar estas preparaciones que se romperían en presencia de
alumbre, la invención proporciona un método para predecir el efecto
de la adición de adyuvantes de alumbre sobre la inmunogenicidad de
una composición determinada.
La invención puede ensayarse in vitro en
presencia y ausencia de un adyuvante de alumbre en lo que respecta a
la liberación de la sustancia encapsulada en los liposomas. El
ensayo empleado para detectar esta liberación, por supuesto,
dependerá de la naturaleza de la sustancia encapsulada; a
continuación se ponen como ejemplos la liberación de glucosa y de
PSA, pero el método de ensayo será aquel más apropiado para la
sustancia particular en cuestión. Por ejemplo, si la sustancia
encapsulada es una citoquina, se puede comparar la concentración de
citoquina atrapada en los liposomas y liberada midiendo la actividad
proliferativa con respecto a células diana. Si la sustancia atrapada
es una enzima, se puede evaluar la actividad de la enzima liberada.
Los protocolos precisos para evaluar la velocidad de liberación de
una sustancia encapsulada no forman parte de la invención; éstos son
estándar en la técnica y propios de la sustancia en cuestión.
Sin embargo, los resultados de este ensayo, tal
como lo descubrieron los inventores, predicen el comportamiento de
la composición ensayada in vivo. Las composiciones que
presentan mejores velocidades de liberación en presencia de alumbre
in vitro mostrarán una menor inmunogenicidad in vivo;
sin embargo, tanto la mejor velocidad de liberación como la menor
inmunogenicidad pueden atenuarse de acuerdo con el método de la
invención.
La invención proporciona un remedio
especialmente para aquellas composiciones que en el ensayo in
vitro demostraron ser propensas a una disrupción debida al
alumbre y que, por tanto, redujeron potencialmente la
inmunogenicidad. Las composiciones pueden estabilizarse mediante la
inclusión en la composición liposomal de un agente estabilizador que
impida eficazmente la disrupción de los liposomas debida al contacto
con el adyuvante. Los liposomas son formulados utilizando un agente
estabilizador, típicamente un detergente no iónico que se
corresponde con las propiedades de Tween 80. Estas propiedades
vienen determinadas por la estructura del detergente, que contiene
cadenas laterales polioxietileno y que está libre de cadenas
laterales hidrofóbicas saturadas de cadena larga. Así, el detergente
no iónico preferente para ser incluido en las preparaciones
liposomales de la invención incluye Tween 20 (Tween 20 es una marca
comercial), Tween 40 (Tween 40 es una marca comercial), Tween 80
y
Tween 85.
Tween 85.
Tal como es generalmente conocido, los liposomas
son estructuras unilamelares o multilamelares en las que un medio
acuoso está rodeado de una bicapa lipídica. En general, la
composición de la bicapa lipídica, que forma la base estructural del
liposoma, está compuesta al menos por fosfolípidos y, de forma más
general, por mezclas de fosfolípidos con lípidos per se. Los
liposomas más útiles para la presente invención, derivados de
fosfatidilcolina, derivados de fosfatidilglicerol y similares, se
utilizan junto con componentes no fosfolipídicos, si se desea, por
ejemplo con colesterol. Otras realizaciones alternativas adecuadas
incluyen mezclas de fosfolípidos con triglicéridos, por ejemplo.
Además, se pueden utilizar ácidos grasos, vitaminas lipídicas,
esteroides, medicamentos lipofílicos y otros compuestos lipofílicos
que puedan incluirse en bicapas lipídicas estables, las cuales
pueden incluir o no fosfolípidos. Los liposomas en general se
denominan mesofases esmécticas.
De forma más detallada, los liposomas, tal como
se utilizan normalmente, se componen de mesofases esmécticas y
pueden incluir tanto mesofases esmécticas fosfolipídicas o como no
fosfolipídicas o mezclas de las mismas. Las mesofases esmécticas son
estados intermedios entre el sólido y el líquido, comúnmente
conocidas como cristales líquidos. Estos estados se caracterizan por
el orden residual en algunas direcciones pero no en otras. En
general, las moléculas contenidas son un poco más largas que anchas
y tienen una parte polar o aromática. La forma molecular y las
interacciones polar-polar o aromáticas permiten que
las moléculas se alineen en matrices parcialmente ordenadas,
especialmente cuando las moléculas poseen un grupo polar en un
extremo. Los cristales líquidos con un orden de alto rango en la
dirección del eje longitudinal de las moléculas que contienen se
denominan cristales líquidos esmécticos en capas o lamelares. En los
estados esmécticos, las moléculas pueden encontrarse en capas
simples o dobles, normales o inclinadas con respecto al plano de la
capa y con cadenas alifáticas rígidas o fundidas.
En los liposomas empleados en la presente
invención están incluidos fosfolípidos y los liposomas pueden llevar
una carga positiva neta, una carga negativa neta o pueden ser
neutros. La inclusión de diacetilfosfato es un método adecuado para
dotar de carga negativa; se puede utilizar estearilamina para
proporcionar una carga positiva. Preferentemente, los lípidos son
diacilgliceroles en los cuales al menos un grupo acilo comprende
como mínimo 12 átomos de C, preferentemente entre 14 y 24 átomos de
C. También es preferente que al menos un grupo cabeza de los
fosfolípidos -es decir, la parte de la molécula que contiene el
grupo fosfato- sea una fosfocolina, una fosfoetanolamina, un
fosfoglicerol, una fosfoserina o un fosfoinositol.
Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o
cloroformo/metanol pueden almacenarse a aproximadamente -20ºC.
Preferentemente, se utiliza cloroformo como único disolvente ya que
se evapora de forma más rápidamente que el metanol.
Se pueden obtener fosfolípidos a partir de
fuentes naturales, por ejemplo fosfatidilcolina del huevo o la soja,
ácido fosfatídico del cerebro, fosfatidilinositol del cerebro o de
vegetales, cardiolipina del corazón o fosfatidiletanolamina de
vegetales o bacterias. Sin embargo, preferentemente éstos no se
utilizan como fosfátidos primarios - es decir, constituyentes en más
del 50% de la composición total de fosfátidos. Se prefiere utilizar
fosfolípidos relativamente puros disponibles comercialmente.
En la presente invención, los liposomas pueden
comprender lípidos en cualquier proporción molar y opcionalmente
contienen colesterol. Preferentemente, DMPC, DMPG y colesterol se
combinan en una proporción molar de aproximadamente
0,9:0,1:0,75.
Tal como se utiliza aquí, el término "mezcla
lipídica liposomal" se refiere a los componentes que forman la
parte estructural, esto es la bicapa lipídica, del liposoma que
encapsula la sustancia contenida en un medio acuoso
encerrado.
encerrado.
Existen diversos métodos para elaborar
liposomas; el tamaño depende del método elegido. Generalmente, los
liposomas suspendidos en una solución acuosa son esféricos y tienen
una o varias bicapas lipídicas concéntricas. Cada monocapa se
compone de una matriz paralela de moléculas representadas por la
fórmula XY donde X es hidrofílica e Y es hidrofóbica; en solución
acuosa, las capas concéntricas se disponen de tal modo que las
partes hidrofílicas permanecen en contacto con la fase acuosa y las
regiones hidrofóbicas autoasociadas. Cuando las fases acuosas están
presentes tanto dentro como fuera del liposoma, las moléculas
lipídicas forman una bicapa, conocida como lamela, de disposición
XY-YX.
Típicamente, los liposomas se preparan mezclando
el fosfolípido y otros componentes que forman parte de la estructura
del liposoma en un disolvente orgánico, evaporando el disolvente,
resuspendiendo en un disolvente acuoso y finalmente liofilizando la
composición lipídica/fosfolipídica. La composición liofilizada se
reconstituye entonces en un tampón que contiene la sustancia que se
vaya a encapsular.
En un método particularmente preferente, los
liposomas se preparan mezclando los líquidos que se deben usar,
incluido el lípido A, en la proporción deseada, en un recipiente por
ejemplo en un matraz de vidrio con forma de pera cuyo volumen es
diez veces superior al de la suspensión de liposomas prevista. En un
evaporador rotatorio se elimina el disolvente a aproximadamente 40ºC
bajo presión negativa. Se puede utilizar el vacío obtenido de un
aspirador de bomba filtrante unido a un grifo de agua. Normalmente,
el disolvente se elimina en 2-5 minutos. Se puede
secar entonces la composición en un desecador bajo vacío, y es
estable durante una semana aproximadamente.
Los lípidos secos pueden rehidratarse a
aproximadamente fosfolípidos a 30 mM en agua estéril, libre de
pirógenos, agitando hasta que toda la película lipídica salga del
recipiente. Entonces, se pueden separar los liposomas acuosos en
partes alícuotas, liofilizadas y selladas a vacío.
Como alternativa, los liposomas se pueden
preparar de acuerdo con el método de Bangham y col., J. Mol.
Biol. (1965) 13: 238-252, o tal como lo
describe Gregoriadis en Drug Carriers in Biology and
Medicine, G. Gregoriadis, Ed. (1979) pp.
287-341, o por el método de Deamer y Uster tal como
está descrito en Liposomes, M. Ostro, Ed. (1983), o según el
método de evaporación en fase inversa descrito por Szoka y col.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:
4194-4198. Según el método elegido, los liposomas
resultantes tendrán distinta capacidad para atrapar el material
acuoso y éstos difieren en sus proporciones espaciales con respecto
a los lípidos.
Se puede incluir un agente estabilizador en las
composiciones de la invención, bien sea mediante la adición de un
agente estabilizador en la proporción adecuada en la preparación de
una mezcla lipídica liofilizada, o bien mediante la adición del
agente estabilizador al tampón de reconstitución. El agente
estabilizador puede ser añadido como único detergente o puede ser
añadido, por supuesto, como mezcla de detergentes apropiados.
La proporción de agente estabilizador a incluir
en la mezcla fosfolipídica/lipídica original o la concentración de
agente estabilizador en el tampón de reconstitución dependerá de la
naturaleza de la sustancia que deba ser encapsulada y se puede
optimizar mediante una experimentación rutinaria. En general, el
agente estabilizador estará presente aproximadamente al
0,2-5% molar con respecto a la mezcla lipídica
liposomal, preferentemente al 0,5-4% molar
aproximadamente.
El propio agente estabilizador será un
detergente no iónico con las características físicas apropiadas. De
forma más específica, el detergente no iónico debe ser soluble a una
temperatura que no afecte negativamente a la integridad de los
liposomas y que no desnaturalice o interfiera de otro modo en la
inmunogenicidad del antígeno. Así, el detergente debe ser soluble a
una temperatura razonable. Se piensa que la incapacidad de Tween 60
y Tween 65 para estabilizar las preparaciones liposomales, ilustrada
a continuación en los ejemplos descritos, se debe a su insolubilidad
a temperaturas razonables. Las características generales del
detergente están representadas por la serie Tween siempre que
presenten las propiedades de solubilidad adecuadas.
Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar pero
no limitar la invención.
Se prepararon liposomas encapsuladores de
glucosa o del antígeno específico prostático (PSA) según el
procedimiento de Alving, C.R. y col., en Liposome Technology:
Interactions of Liposomes with the Biological Milieu (1993) III:
CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 317-343. Otras
descripciones se encuentran en Verma, J.N. y col., Infect
Immun (1992) 60: 2438-2444, y en
Richards, R.L. y col., Infect Immun (1988) 56:
682-686. La Tabla 1 a continuación muestra las
abreviaturas utilizadas para los componentes empleados en estos
Ejemplos.
Abrev. | Nombre | Nº de carbonos | Nº de enlaces-\pi |
en cada acilo | en cada acilo | ||
DLPC | dilauroil fosfatidilcolina | 12 | 0 |
DMPC | dimiristoil fosfatidilcolina | 14 | 0 |
DPPC | dipalitoil fosfatidilcolina | 16 | 0 |
DSPC | diestearoil fosfatidilcolina | 18 | 0 |
DOPC | dioleoil fosfatidilcolina | 18 | 1 |
DLnPC | dilinoleoil fosfatidilcolina | 18 | 2 |
DMPG | dimiristoil fosfatidilglicerol | 14 | 0 |
CHOL | colesterol | ||
LA | Lípido A | ||
Tween 20 | Monolaurato de polioxietilen sorbitano | 12 | 0 |
Tween 40 | Monopalmitato de polioxietilen sorbitano | 16 | 0 |
Tween 60 | Monoestearato de polioxietilen sorbitano | 18 | 0 |
Tween 65 | Triestearato de polioxietilen sorbitano | 18 | 0 |
Tween 80 | Monooleato de polioxietilen sorbitano | 18 | 1 |
Tween 85 | Trioleato de polioxietilen sorbitano | 18 | 1 |
Span 80 | Monooleato de sorbitano |
En una preparación típica, se elaboran liposomas
multilamelares a partir de una mezcla de DMPC:DMPG:CHOL:
LA en una proporción molar 9:1:7,5:0,011. Se incluye el lípido A como adyuvante. La mezcla lipídica se evapora con rotatición hasta una fina película seca, a aproximadamente 40ºC, a vacío, a partir de una solución de cloroformo, en un matraz en forma de pera. Para asegurar la eliminación completa del disolvente orgánico, se seca luego el matraz a muy bajo vacío (aproximadamente 0,05 mm de Hg) durante toda la noche en un desecador a temperatura ambiente. Después del secado, se esponjan cuidadosamente los lípidos en agua libre de pirógenos estéril, desionizada en un vórtex. Se congela la suspensión resultante a -55ºC, se liofiliza a -20ºC durante toda la noche y a 0ºC-10ºC al día siguiente utilizando un Virtis Unitop 800SL Freeze Mobile (Virtis Company, Gardener, NY).
LA en una proporción molar 9:1:7,5:0,011. Se incluye el lípido A como adyuvante. La mezcla lipídica se evapora con rotatición hasta una fina película seca, a aproximadamente 40ºC, a vacío, a partir de una solución de cloroformo, en un matraz en forma de pera. Para asegurar la eliminación completa del disolvente orgánico, se seca luego el matraz a muy bajo vacío (aproximadamente 0,05 mm de Hg) durante toda la noche en un desecador a temperatura ambiente. Después del secado, se esponjan cuidadosamente los lípidos en agua libre de pirógenos estéril, desionizada en un vórtex. Se congela la suspensión resultante a -55ºC, se liofiliza a -20ºC durante toda la noche y a 0ºC-10ºC al día siguiente utilizando un Virtis Unitop 800SL Freeze Mobile (Virtis Company, Gardener, NY).
Los lípidos liofilizados se reconstituyen
entonces en presencia de la sustancia que se debe encapsular para
obtener liposomas multilamelares que contienen dicha sustancia. Se
encapsuló glucosa en los liposomas para facilitar la evaluación de
la dispersión; se encapsuló PSA en los liposomas para determinar el
efecto de la naturaleza de la sustancia encapsulada sobre la
dispersión. El tampón de reconstitución era una solución salina
tamponada con fosfato (PBS) o
Tris-glicina/NaCl/Tween 80 (TG). Este último tampón
se utilizó para incluir el agente estabilizador, en este caso Tween
80. En los ejemplos posteriores, cuando se añaden otros candidatos
estabilizadores alternativos, éstos se sustituyen por Tween 80 en el
tampón. La concentración fosfolipídica liposomal en el tampón de
reconstitución es 10-200 mM.
Se elimina la sustancia no encapsulada (glucosa
o PSA) mediante el lavado de los liposomas tres veces con NaCl 0,15
M a 27.000 x g durante 10 minutos a 10ºC. Los liposomas resultantes
se suspenden en NaCl 0,15 M o en un tampón isotónico apropiado para
alcanzar una concentración fosfolipídica final de
10-200 mM.
Para determinar la integridad de los liposomas,
se calculó primero la glucosa atrapada mediante restando la glucosa
atrapada de la glucosa total en el paso de reconstitución. Se
midieron la glucosa atrapada y la glucosa total tal como lo describe
Kinsky, S.C. Methods Enzymol (1974)
32:501-513; Alving, C.R. y col. (1993)
(supra) mediante evaluación del cambio de absorbancia a 340
nm en presencia de hexoquinasa y
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa.
Se midió la liberación de glucosa de la misma forma en función del
tiempo a varias temperaturas en presencia y ausencia de alumbre.
Los liposomas que contenían glucosa preparados como en el Ejemplo 1
fueron incubados con y sin varios geles de hidróxido de aluminio
comercialmente disponibles en una proporción 1/1 (v/v).
Alhydrogel^{TM} y Rehydrogel^{TM} son de Reheis, Inc., Berkeley
Heights, NJ; el gel absortivo Rehsorptar^{TM} es suministrado por
Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL.
Cuando no se añadió alumbre se liberó solamente
un 0,06% aproximadamente de la glucosa atrapada después de 120
horas. Sin embargo, cuando se mezcló gel de hidróxido de aluminio
con las preparaciones liposomales, la glucosa se liberó linealmente
con el tiempo de forma dependiente de la temperatura a varias
velocidades, según la elección del alumbre. La Tabla 2 resume las
velocidades iniciales de liberación de la glucosa atrapada en
presencia de los distintos geles de hidróxido de aluminio de los
liposomas preparados en el Ejemplo 1 incubados a 100 mM de
fosfolípidos mezclados a una proporción de 1/1 (v/v) con hidróxido
de aluminio dosificado a 2 mg de aluminio/ml antes de la
incubación.
Liberación de glucosa | |||
V_{máx} (\mumol min^{-1} x 10^{6}) | |||
Tipo de compuesto alumínico | 4ºC | Temperatura ambiente | 37ºC |
ensayado | (24ºC-27ºC) | ||
Alhydrogel^{TM} | 8,67 | 15,10 | 23,35 |
Rehydragel | 6,69 | 11,50 | 25,70 |
Rehsorptar | 2,92 | 3,85 | 9,69 |
Estos datos confirman la influencia de la
temperatura y de la naturaleza de la preparación de alumbre sobre la
velocidad de liberación.
Se prepararon liposomas que contenían PSA como
sustancia encapsulada de acuerdo con el Ejemplo 1. Se determinaron
las concentraciones de PSA en los liposomas mediante una
modificación del ensayo de Lowry, O.H. y col. J. Biol. Chem
(1951) 193: 265-275, tal como lo describe
Alving, C.R. y col. (1993) (supra). Se determinó el PSA
liberado utilizando un ensayo para proteínas estándar Lowry.
Brevemente, el ensayo del PSA en los liposomas
se modifica para incluir la adición secuencial de cloroformo a una
parte alícuota de la muestra de liposomas, con evaporación de la
muestra hasta sequedad en un Speed Vac Concentrator SC100 (Savant
Instruments, Inc., Farmingdale, NY) a 43ºC o en bajo corriente de
nitrógeno, con la adición de un 15% de desoxicolato de sodio en
salina normal, y mediante un vórtex para asegurar que todas las
proteínas de la muestra están disueltas. La solución de la muestra
de desoxicolato de sodio se procesa entonces en el ensayo para
proteínas estándar Lowry. A los 20 minutos de incubación, se
centrifuga la muestra a 27.000 x g durante 10 minutos, se recoge el
sobrenadante y se mide la absorbancia a 750 nm.
Utilizando los ensayos anteriores se descubrió
que la eficacia de encapsulación para el PSA era del 50%.
Se incubaron liposomas que contenían PSA con y
sin Alhydrogel^{TM} en una proporción 1/1 (v/v) a 4ºC, temperatura
ambiente y a 37ºC. Como se muestra en las Figuras 1a y 1b, se liberó
linealmente el PSA con el tiempo durante un período de 14 días de
forma dependiente de la temperatura con o sin alumbre, pero la
liberación de PSA mejoraba notablemente en presencia de
Alhydrogel^{TM}. La Figura 1c muestra la liberación de PSA en
presencia del alumbre corregido para la liberación de PSA en su
ausencia. La Tabla 3 muestra la V_{máx} calculada para su
comparación con los valores correspondientes de glucosa. La
comparación de los valores de la Tabla 3 con los de la Tabla 2
muestra que las velocidades de liberación inducida por el alumbre
para el PSA tienen un orden de magnitud superior a los
correspondientes a la glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Liberación de PSA | |||
V_{máx} (\mumol min^{-1} x 10^{6}) | |||
4ºC | T. amb. | 37ºC | |
Alhydrogel^{TM} | 32,9 | 51,3 | 81,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
Es sabido que los liposomas que comprenden
cantidades sustanciales de fosfolípidos insaturados o saturados con
menos de 14 átomos de carbono en sus cadenas acilo esterificado son
inherentemente inestables. En consecuencia, cuando el experimento
establecido en el Ejemplo 2 se repitió utilizando DLPC (12 carbonos)
o DOPC o DLnPC (insaturado) como componente fosfatidilcolina, el
efecto del alumbre fue indetectable ya que los liposomas eran ya
inestables; cuando la preparación liposomal fue incubada a 37ºC, se
liberó más del 60% de glucosa en los liposomas que contenían DMPC,
DOPC o DLnPC aun en ausencia de Alhydrogel^{TM}. Sin embargo, la
sustitución de DPPC o DSPC por DMPC en los liposomas no produjo
ninguna diferencia en la velocidad de liberación de la que se había
medido con los liposomas que contenían DMPC con o sin
Alhydrogel^{TM}.
Se prepararon varias otras preparaciones
liposomales, diseñadas para proporcionar fosfolípidos cargados
positivamente, cargados negativamente y neutros, en general tal y
como se establece en el Ejemplo 1 y se compararon con los liposomas
del Ejemplo 1 en cuanto a la liberación de glucosa en presencia y
ausencia de Alhydrogel^{TM} a 37ºC durante cinco días por medio
del procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Los resultados se
muestran en la Tabla 4.
Influencia de la carga fosfolipídica liposomal sobre da Desestabilización de la permeabilidad de | |||
los liposomas por Alhydrogel^{TM} | |||
Naturaleza fosfolipídica | Composición de los Liposomas | % de Glucosa atrapada liberada | |
-Alhydrogel^{TM} | +Alhydrogel^{TM} | ||
Fosfolípido | (1) DMPC/CHOL/LA | 1,69 | 9,50 |
neutro | (10:7,5:0,011) | ||
(2) DMPC/CHOL | 0,75 | 8,44 | |
(10:7,5) |
Naturaleza fosfolipídica | Composición de los Liposomas | % de Glucosa atrapada liberada | |
-Alhydrogel^{TM} | +Alhydrogel^{TM} | ||
Fosfolípido cargado | (3) DMPC/DMPG/CHOL/LA | 1,43 | 23,24 |
negativamente | (9:1:7,5:0,011) | ||
(4) DMPC/DMPG/CHOL | -0,43 | 32,20 | |
(8:2:7,5) | |||
Fosfolípido cargado | (5) DMPC/Estearilamina/CHOL | 1,60 | 10,18 |
positivamente | (9:1:7,5) | ||
(6) DMPC/Estearilamina/CHOL/LA | 2,02 | 19,95 | |
(9:1:7,5:0,011) |
En ausencia de Alhydrogel^{TM}, todas las
preparaciones de liposomas dan unos resultados comparables. Sin
embargo, parece que existe alguna correlación entre la liberación y
el estado de carga del fosfolípido. Por ejemplo, el incremento de la
proporción de DMPG, un lípido de carga negativa relativa, mejora la
liberación (comparar la preparación 4 con la preparación 3). De
forma similar, la adición de LA negativamente cargado mejora la
liberación en algunos casos (comparar la composición 6 con la
composición 5), aunque esto no sea coherente (comparar la
composición 1 con la composición 2).
Se añadieron varios detergentes no iónicos a la
preparación de liposomas a unos niveles de concentración hasta 4%
molar y se estudiaron los liposomas resultantes en referencia a su
estabilidad en presencia y ausencia de Alhydrogel^{TM}, tal como
se mide por medio de la liberación de glucosa después de la
incubación. Los detergentes no iónicos ensayados incluían Span 80 y
varios Tweens. Los resultados se muestran en las Figuras
2a-g. Estos datos muestran que Tween 20, Tween 40,
Tween 80 y Tween 85 podían estabilizar los liposomas en presencia de
alumbre; Span 80, Tween 60 y Tween 65 no podían.
En base a estos resultados, parece que el
detergente estabilizador requiere las cadenas laterales
polioxietileno de los Tweens y al menos una característica en el
grupo acilo asociada a la desestabilización de los liposomas en
general -es decir, una cadena acilo relativamente corta (< 18
carbonos o al menos un enlace-\pi). Se resumen
estos resultados en la Tabla 5. En todos los casos, el agente
estabilizador con éxito era más eficaz a una concentración
aproximadamente del 4% molar (con respecto a la mezcla lipídica
liposomal).
Efecto del detergente sobre la estabilidad | ||||
Detergente | Presencia de polioxietileno | Nº de carbonos | Nº. de enlaces-\pi | ¿Se estabiliza |
de cadena lateral | en cada acilo | en cada acilo | con alumbre? | |
Tween 20 | + | 12 | 0 | + |
Tween 40 | + | 16 | 0 | + |
Tween 60 | + | 18 | 0 | - |
Tween 65 | + | 18 | 0 | - |
Tween 80 | + | 18 | 1 | + |
Tween 85 | + | 18 | 1 | + |
Span 80 | - | 18 | 1 | - |
Las preparaciones liposomales preparadas según
el Ejemplo 1, bien sea sin Tween 80 o con un contenido del 4% molar
de Tween 80, fueron evaluadas en cuanto a su integridad según la
liberación de glucosa en presencia de 1/1 v/v de Alhydrogel^{TM},
incubadas a 37ºC durante un período de 120 horas. Mientras los
liposomas que contenían Tween 80 no mostraban esencialmente ninguna
liberación de glucosa, existía una liberación lineal sustancial de
glucosa durante este período de tiempo en los liposomas carentes de
Tween 80, tal como se muestra en la Figura 3. Los valores V_{máx}
calculados, en unidades \muM min^{-1} x 10^{6}, son 0,44 para
los liposomas que contienen Tween 80, en comparación con 23,4 para
los liposomas que no contienen Tween 80.
Se repitieron los experimentos utilizando
concentraciones variables de Tween 80 en los liposomas preparados
para encapsular el PSA e incubación con y sin Alhydrogel^{TM} a
4ºC y 37ºC. Se muestran los resultados en las Figuras 4a y 4b. La
Figura 4a muestra que la liberación de PSA de los liposomas
preparados en ausencia de alumbre es relativamente independiente de
la presencia o ausencia de Tween 80. Por otro lado, la Figura 4b
muestra que en presencia de Alhydrogel^{TM}, el Tween 80 es
protector contra la liberación. La Figura 4c muestra los resultados
para varias concentraciones de Tween 80 incluido en los liposomas en
presencia de Alhydrogel^{TM} corregido para la liberación de PSA
en su ausencia - es decir, la Figura 4b menos la Figura 4a. Parece
que la estabilización máxima tiene lugar en el rango de
0,5-1% molar de Tween 80 cuando el PSA está
encapsulado.
Claims (8)
1. Composición farmacéutica que comprende al
menos un antígeno encapsulado en liposomas, comprendiendo además
dicha composición alumbre y al menos un agente estabilizador en una
cantidad efectiva para impedir la disrupción de dichos liposomas en
presencia de alumbre, caracterizada porque dicho agente
estabilizador es un detergente no iónico que es un polioxietilen
sorbitano éster, donde la forma esterificada contiene menos de 18
átomos de carbono y/o al menos un enlace-\pi.
2. Composición según la reivindicación 1
caracterizada porque dicho detergente no iónico se selecciona
de entre el grupo formado por Tween 20 (monolaurato de polioxietilen
sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxietilen sorbitano),
Tween 80 (monooleato de polioxietilen sorbitano), Tween 85
(trioleato de polioxietilen sorbitano) y mezclas de los mismos.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque dicho antígeno es antígeno específico
prostático (PSA).
4. Composición según la reivindicación 3,
caracterizada porque el detergente noniónico comprende Tween
80.
5. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dichos
liposomas son formulados a partir de una mezcla de DMPC, DMPG, CHOL
y LA.
6. Composición según la reivindicación 5,
caracterizada porque los liposomas son formulados a partir de
una mezcla DMPC:DMPG:CHOL:LA en una proporción molar de
9:1:7,5:0,011.
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la
composición farmacéutica se prepara mediante la reconstitución de la
mezcla lipídica liposomal estructural en un tampón de reconstitución
que contiene el antígeno y el agente estabilizador.
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el agente
estabilizador está presente en los liposomas aproximadamente a un
0,5-4% molar de la mezcla lipídica liposomal.
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