ES2260886T3 - Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO PROCEDIMIENTO PARA LA INTEGRACION ESTABLE DE UN ADN QUE COMPRENDE UN GEN QUE ES FUNCIONAL EN UNA CELULA DE UNA PLANTA DE CEREAL, EN EL GENOMA NUCLEAR DE UNA PLANTA DE CEREAL. DICHO PROCEDIMIENTO COMPRENDE LAS SIGUIENTES FASES: A) PROPORCIONAR UN CALLO EMBRIOGENICO COMPACTO DE UNA PLANTA DE CEREAL; B) EXTRAER Y/O DEGRADAR DICHO CALLO EMBRIOGENICO COMPACTO Y TRANSFERIR DICHO ADN AL INTERIOR DEL GENOMA NUCLEAR DE UNA CELULA DE DICHO CALLO EMBRIOGENICO COMPACTO, PARA PRODUCIR UNA CELULA TRANSFORMADA; Y, OPCIONALMENTE, C) REGENERAR UNA PLANTA DE CEREAL TRANSFORMADA A PARTIR DE DICHA CELULA TRANSFORMADA.

Description

Procedimiento para transformar plantas monocotiledóneas.

La presente invención se refiere a un procedimiento rápido y eficiente para transformar plantas monocotiledóneas en general, especialmente plantas gramíneas, particularmente maíz y otros cereales importantes. Particularmente, la invención se refiere a al uso de tejido intacto capaz de formar callo embriogénico compacto, o de callo embriogénico compacto obtenido a partir de dicho tejido para obtener plantas monocotiledóneas transgénicas.

La presente invención se refiere asimismo a nuevas plantas gramíneas transgénicas, particularmente cereales, que pueden obtenerse mediante el procedimiento de transformación de la presente invención.

Antecedentes de la invención

Recientemente, ha habido una expansión enorme de las posibilidades de la ingeniería genética de las plantas. Se han obtenido muchas especies vegetales dicotiledóneas transgénicas. Sin embargo, muchas especies de plantas, especialmente las que pertenecen a las monocotiledóneas y particularmente las gramíneas, que incluyen las especies económicamente importantes como maíz, trigo y arroz, han demostrado ser muy recalcitrantes a la transformación genética estable.

Se ha tropezado con dificultades en obtener tanto: a) la transformación integradora de células de plantas monocotiledóneas con ADN (es decir, la inserción estable del ADN en el genoma nuclear de las células de plantas monocotiledóneas), como b) la regeneración a partir de las células transformadas de plantas monocotiledóneas fenotípicamente normales, tales como plantas monocotiledóneas adultas fértiles fenotípicamente normales. Se ha sugerido que tales dificultades se han debido predominantemente a la no disponibilidad de las células monocotiledóneas que son competentes con respecto a: 1) captación del ADN, 2) transformación integradora con el ADN tomado, y 3) regeneración de plantas monocotiledóneas fenotípicamente normales, a partir de las células transformadas (Potrykus (1990) Bio/Technology 9:535). En general, la transferencia génica directa en los protoplastos (utilizando tratamiento con polietilenglicol y/o electroporación) parece que posee el mejor potencial para el éxito. La mayor parte de los protoplastos para la utilización en tales métodos de transferencia génica directa se han obtenido a menudo a partir de cultivos de suspensiones celulares embriogénicas (Lazzeri y Lörz (1988) Advances in Cell Culture, Vol. 6, Academic Press, p.291; Ozias-Akins y Lörz (1984) Trends in Biotechnology 2:119). Sin embargo, el éxito de tales procedimientos se ha visto limitado debido al hecho de que la regeneración de plantas fenotípicamente normales a partir de los protoplastos ha sido difícil de alcanzar para la mayoría de los genoti-
pos.

Recientemente, se ha informado del éxito en la transformación y en la regeneración de plantas fenotípicamente normales a partir de ciertas progenies de arroz (Shimamoto et al. (1989) Nature 338:274; Datta et al. (1990) Bio/Technology 8:736; y Hayashimoto et al. (1990) Plant Physiol. 93:857) y maíz (Gordon-Kamm et al. (1990) Bio/Technology 2:603; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833; Gould et al. (1991) Plant Physiology 95:426; y publicaciones PCT WO91/02071 y WO89/12102). Sin embargo, no está claro a partir de tales informes que sus procedimientos de transformación y regeneración se apliquen generalmente a las monocotiledóneas, particularmente a las plantas gramíneas y muy particularmente a los cereales.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona un nuevo método para transformar eficaz y reproduciblemente el genoma de una planta monocotiledónea, particularmente una planta gramínea tal como un cereal importante (por ejemplo, maíz, trigo, arroz, centeno, etc.). Este método comprende la transformación con ADN de células de: a) un tejido intacto de la planta monocotiledónea, tejido el cual es capaz de formar callo embriogénico compacto, o b) un callo embriogénico compacto, particularmente sus sectores embriogénicos, obtenido de tal tejido intacto, siendo tales células competentes con respecto a: 1) la captación del ADN, 2) la transformación integrante del genoma de la planta, preferiblemente su genoma nuclear, con el ADN, y 3) la regeneración de la planta fenotípicamente normal (por ejemplo, planta adulta fértil, fenotípicamente normal) a partir de las células tras la transformación de su genoma. Tales células competentes se obtienen preferiblemente hiriendo y/o degradando el tejido intacto o el callo embriogénico compacto de la planta, por ejemplo: a) cortando el tejido intacto y las células del mismo o el callo embriogénico compacto y las células del mismo obtenido de tal tejido intacto; y/o b) dependiendo de la naturaleza del tejido intacto o del callo embriogénico compacto, tratando el tejido intacto o el callo embriogénico compacto con una enzima para degradar las paredes celulares del tejido intacto o del callo embriogénico compacto.

El tejido intacto o callo embriogénico compacto resultante, herido y/o degradado, que contiene las células competentes de esta invención, se puede transformar, preferiblemente mediante transferencia génica directa, tal como mediante electroporación, con uno o más fragmentos de ADN (por ejemplo, fragmentos de ADN extraños), preferiblemente fragmentos de ADN lineal. Preferiblemente, al menos uno de los fragmentos del ADN contiene un gen que puede servir como un marcador seleccionable o detectable, preferiblemente un marcador seleccionable, para células vegetales transformadas. Tal fragmento de ADN marcador puede estar localizado sobre el mismo fragmento de ADN o sobre un fragmento de ADN separado como otro gen u otros genes de interés.

Las células transformadas se pueden separar, de manera convencional, de células no transformadas cultivando sobre un medio selectivo, preferiblemente durante un tiempo prolongado, y las células transformadas, así seleccionadas, se pueden regenerar de manera convencional en plantas fenotípicamente normales (por ejemplo, plantas maduras) que poseen el gen o genes de interés integrados establemente en sus genomas, particularmente sus genomas nucleares.

Esta invención también proporciona: nuevas células competentes de plantas monocotiledóneas, especialmente plantas gramíneas, particularmente plantas de cereales, cuyos genomas se han transformado establemente con uno o más fragmentos de ADN; cultivos celulares que consisten en tales células transformadas; plantas fenotípicamente normales (por ejemplo, plantas fértiles, fenotípicamente normales) regeneradas a partir de tales células transformadas; y semillas de tales plantas transformadas. Entre tales células transformadas, cultivos celulares, plantas y semillas, se encuentran aquellas transformadas con un fragmento de ADN que contiene un gen que codifica una proteína capaz de exterminar o discapacitar a una célula vegetal en la que se expresa la proteína y que está bajo el control del promotor PTA29 específico del tapetum, con lo que las plantas se hacen estériles. Las plantas gramíneas transformadas de esta invención, particularmente maíz y arroz transformados, se caracterizan por provenir de líneas vegetales a partir de las cuales es prácticamente imposible regenerar, con técnicas convencionales, las plantas transformadas, como plantas fenotípicamente normales, a partir de cultivos de suspensión embriogénica transformados o a partir de protoplastos transformados, particularmente cuando para cada 10.000 protoplastos no transformados de tales líneas vegetales se puede regenerar no más de alrededor de 500, especialmente no más de alrededor de 100, particularmente no más de alrededor de 10, de forma bastante particular no más de alrededor de 1, planta o plantas fenotípicamente normales.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Ensayos en gel del NPTII del Ejemplo 2 de cinco transformantes de maíz obtenidos mediante electroporación de embriones zigóticos inmaduros.

Figura 2: Transferencias Southern del Ejemplo 2 del ADN genómico de uno de los transformantes de maíz del Ejemplo 1 (H99-M148-1) utilizando la secuencia que se lista como Sec. Id. 2 como una sonda. Se indican las longitudes de fragmentos estándar. El origen se indica por O.

Líneas:

1:

ADN digerido por PstI del fago lambda + pTTM1 digerido por HindIII (control positivo - la sonda se hibridará al fragmento pTTM1 de 2824 pares de bases).

2:

ADN genómico digerido por BgIII

3:

ADN genómico digerido por EcoRI

4:

ADN genómico digerido por EcoRV

5:

ADN genómico digerido por HindIII

6:

ADN genómico digerido por BamHI

7:

ADN genómico digerido por PvuI

8:

ADN genómico digerido por PvuII

9:

ADN genómico digerido por PstI

10:

ADN genómico vegetal digerido por EcoRI de la planta H99 no transformada (control negativo).

Figura 3: Ensayos en gel de NptII del Ejemplo 4 de siete transformantes obtenidos mediante electroporación de fragmentos embriogénicos compactos de callo derivados de embriones zigóticos inmaduros.

Figura 4: Transferencias Southern del Ejemplo 4 del ADN genómico de uno de los transformantes de maíz del Ejemplo 3 (Pa91-M146-2) utilizando la secuencia que se lista como Sec. Id. 2 como una sonda. Se indican las longitudes de fragmentos estándar. El origen se indica por O.

Líneas:

1:

ADN digerido por PstI del fago lambda + pTTM1 digerido por HindIII (control positivo - la sonda se hibridará al fragmento pTTM1 de 2824 pares de bases).

2:

ADN genómico digerido por BgIII

3:

ADN genómico digerido por EcoRI

4:

ADN genómico digerido por EcoRV

5:

ADN genómico digerido por HindIII

6:

ADN genómico digerido por BamHI

7:

ADN genómico digerido por PvuI

8:

ADN genómico digerido por PvuII

9:

ADN genómico digerido por PstI

10:

ADN genómico vegetal digerido por EcoRI (control negativo).

Listado de secuencias

Sec. Id. No. 1:

secuencia de pDE108.

Sec. Id. No. 2:

secuencia de la sonda utilizada para detectar el gen \underbar{neo} quimérico en las hibridaciones Southern.

Sec. Id. No. 3:

secuencia de un fragmento de ADN del plásmido pTTM8 utilizado en la construcción de plásmidos pVE107 y pVE108, y que incluye el promotor del gen TA29 del tabaco y el gen barnasa.

Sec. Id. No 4:

secuencia de pDE110.

Descripción detallada de la invención

En las monocotiledóneas, el callo embriogénico puede ser de dos tipos bien conocidos y diferentes (véase: Vasil (1988) Bio/Technology 6:397; Armstrong y Green (1988) Crop Sci. 28:363). Un tipo de callo embriogénico puede describirse mejor como compacto y/o nodular, y puede a menudo considerarse como organizado. Tal callo, que en la presente memoria se denomina "callo embriogénico compacto", se utiliza según esta invención. El otro tipo de callo embriogénico que se encuentra generalmente menos a menudo puede describirse mejor como blando, friable y muy embriogénico, y tal callo, que en la presente memoria se denomina "callo embriogénico friable", crece generalmente más deprisa que el callo embriogénico compacto. A partir de cualquiera de los tipos de callo, pueden regenerarse plantas fenotípicamente normales y, en ambos tipos de callo, los embriones somáticos se encuentran en distintos estados de desarrollo. El aspecto y morfología final de los dos tipos de callo puede diferir en distintas especies de monocotiledóneas, particularmente en distintas especies de cereales. Sin embargo, los dos tipos de callo pueden distinguirse fácilmente el uno del otro por los expertos en la materia en la formación y manipulación de cultivos de tejidos de distintas especies de monocotiledóneas.

En el maíz, los callos embriogénicos compactos y los callos embriogénicos friables se conocen más familiarmente como callo de tipo I y callo de tipo II, respectivamente. Varias características distintivas en la estructura y propiedades de los callos del maíz del tipo I y del tipo II se describen en publicaciones, tales como: Armstrong y Phillips (1988) Crop. Sci. 28:363; Springer et al. (1979) Protoplasma 101:269; Fransz (1988) "Cytodifferentiation during callus initiation and somatic embryogenesis in Zea Mays L.", tesis doctoral, Universidad de Wageningen, Países bajos; Ozias-Akins et al. (1982) Protoplasma 110: 95; Novak et al. (1983) Maydica 28:381; Ho et al. (1983) Protoplasma 118:169; Green et al. (1975) Crop Sci. 15:417; Freeling et al. (1976) Maydica 21: 97; Lu et al. (1982) Theor. Appl. Genet. 62: 109; Vasil et al. (1985) Protoplasma 127:1; Dunstan et al (1978) Protoplasma 97: 251; Vasil et al. (1982) Bot. Gaz. 143:454; Green (1983) en: Basic biology of new developments in biotechnology, Hollaender et al. (eds) Plenum Press, Nueva York, p. 195-209; Vasil et al (1984) Am. J. Bot. 71:158; y Kamo et al (1985) Bot. Gaz. 146:327.

El callo de tipo I del maíz es esencialmente blanco, blanco pálido o amarillento, y de aspecto compacto, a menudo presenta una superficie nodular y representa la generación y propagación de un conjunto organizado de tejidos que se refleja en su aspecto nodular. Se caracteriza por un alto grado de asociación y diferenciación celular, y por varias estructuras, tales como raíces, estructuras foliares y elementos vasculares. Pueden generalmente reconocerse los embriones somáticos. El origen de los brotes regenerados no siempre es obvio y puede ocurrir aparentemente mediante embriogénesis somática y organogénesis. Durante el desarrollo del embrión somático, los embrioides pueden fusionarse y dar lugar a callo blanco y duro, o pueden desarrollarse a embriones somáticos secundarios.

El callo del maíz de tipo II es esencialmente blando, friable, blanco o amarillento pálido, de aspecto algo transparente y muy embriogénico. Crece rápidamente y no contiene elementos vasculares. El callo de tipo II difiere del callo friable no embriogénico por cuanto contiene numerosos embrioides globulares y lisos que pueden presentar una estructura de tipo suspensor mediante la cual los embrioides se unen al callo. Los embrioides pueden desarrollarse a embriones somáticos bien organizados.

Se pueden usar aproximadamente las mismas características distintivas, que se encuentran en los dos tipos de callos de maíz, para distinguir entre el callo embriogénico compacto y el callo embriogénico friable de otra especie monocotiledónea, particularmente una especie de cereal tal como arroz (Kyozuka et al. (1988) Theor. Appl. Genet. 76: 887), trigo (Redway et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 76: 609; Redway et al. (1990) Plant Cell Reports 8:714), y cebada.

Generalmente, a partir de las plantas monocotiledóneas, el callo embriogénico compacto de la presente invención puede obtenerse mediante el cultivo in vitro de fuentes de explantes procedentes de la planta tal como embriones zigóticos inmaduros, semillas maduras, bases foliares, anteras, micróesporas, inflorescencias jóvenes, etc. En el maíz, el callo de tipo I se genera más eficientemente a partir de embriones zigóticos inmaduros. El callo embriogénico compacto puede inducirse a partir de los explantes apropiados procedentes de la planta, y puede mantenerse en cultivo según los procedimientos bien establecidos (véase Hodges et al. (1986) Bio/Technology 4:219). Durante el mantenimiento del cultivo del callo, debe tenerse cuidado en seleccionar y subcultivar sólo los sectores embriogénicos de los callos en los que están las células embriogénicas. Tales células pueden caracterizarse generalmente como pequeñas, estrechamente empaquetadas, de paredes delgadas, con un citoplasma rico, muy basófilas, que contienen muchas pequeñas vacuolas, gotitas lipídicas y granos de almidón (Vasil (1988) supra). La forma más conveniente de eliminar, de una planta, tejidos que se sabe pueden formar el callo embriogénico compacto es mediante la disección.

Las células competentes de la presente invención pueden obtenerse directamente a partir de una planta monocotiledónea, cortando a partir de ésta, de forma convencional, tejido intacto que sea capaz de formar callo embriogénico compacto. Las células de tal tejido intacto herido se pueden transformar entonces de forma estable. Sin embargo, se prefiere cortar tal tejido intacto herido en fragmentos más pequeños para hedir adicionalmente tal tejido y proporcionar más células competentes para la transformación. La dimensión máxima media de los fragmentos del tejido tienen una longitud preferiblemente de 0,1 a 5 mm, particularmente 1 a 2,5 mm de longitud, más particularmente 1,25 a 1,75 mm de longitud. A este respecto, el tejido intacto herido de esta invención puede ser cualquier trozo de tejido que se corta de la planta o cualquiera de sus fragmentos (por ejemplo, trozos de corte). De este modo, la expresión "tejido intacto" se debe entender que se refiere a agregados de células de plantas monocotiledóneas que se obtienen a partir de una parte de una planta de origen natural, sin una etapa de cultivo de tejido entre medias.

Se cree que la rotura mecánica o herida del tejido intacto y de sus células individuales, cortando el tejido intacto de la planta, y cortándolo posiblemente además para romperlo o herirlo adicionalmente, es generalmente suficiente para generar las células competentes de esta invención. A este respecto, las expresiones "rotura mecánica" y "herida" tienen la intención de abarcar el daño significativo de la pared celular de una o más células del tejido intacto, con objeto de exponer la(s) célula(s) y hacer que se abra(n) a la inserción de un fragmento de ADN según la presente invención. Así, "rotura mecánica" o "herida" según la presente invención, no se limita a cortar la pared celular, sino que incluye otros procedimientos para eliminar físicamente una o más porciones de ella o hacer que sea discontinua en uno o más lugares, tal como desgastándola, presionándola o golpeándola.

Sin embargo, la rotura mecánica o herida del tejido intacto según esta invención se puede complementar o incluso sustituir por un tratamiento del tejido intacto con una enzima o mezcla de enzimas para degradar las paredes celulares de la planta, especialmente cuando el tejido intacto es relativamente grande. El tratamiento enzimático se puede llevar a cabo de manera convencional. Preferiblemente, la enzima se aplica al tejido intacto principalmente para generar poros en sus paredes celulares. Por lo tanto, se prefiere que el tratamiento enzimático sea relativamente breve (por ejemplo, de 1 y 10 minutos, dependiendo de la naturaleza y de la consistencia del tejido intacto), de forma que no se cause una ruptura completa de los tejidos. Dependiendo del tipo de planta, pueden utilizarse varias enzimas o disoluciones enzimáticas, tales como las que se enumeran por Powell y Chapman (1985) en "Plant Cell Culture. A Practical Approach", R.A. Dixon ed., capítulo 3.

Cuando el tejido intacto, obtenible de la planta, es demasiado pequeño para ser herido (por ejemplo, cortado), o el tejido intacto herido es demasiado pequeño para ser herido adicionalmente (por ejemplo, cortado en trozos más pequeños), se puede usar el tratamiento enzimático para generar células competentes adicionales. Tal tratamiento enzimático también puede ser particularmente útil, por sí mismo, para formar células competentes de esta invención en embriones, particularmente en embriones zigóticos inmaduros aislados de semillas en desarrollo, en embriones zigóticos maduros aislados de semillas maduras (por ejemplo, secas) de, por ejemplo, maíz. Los embriones generalmente no se cortan para retirarlos de las semillas, y generalmente no se pueden cortar en fragmentos significativamente más pequeños sin destruir su capacidad para generar callo embriogénico compacto. Los embriones inmaduros son particularmente en maíz puesto que son la única fuente conveniente y fiable de callo embriogénico compacto. En arroz y en otras monocotiledóneas, también se pueden usar embriones maduros. A este respecto, para plantas tal como maíz, se prefiere que el tejido intacto (por ejemplo, embriones de maíz inmaduros) tenga una longitud máxima de alrededor de 0,5 hasta 2 mm, preferiblemente 0,5 hasta 1,5 mm, incluso aunque se pueden usar longitudes más pequeñas de 0,5 hasta 1 mm.

Según la presente invención, el tejido intacto también se somete preferiblemente a un período de, por ejemplo, alrededor de 15 minutos o más, preferentemente alrededor de 30 minutos hasta aproximadamente 5 horas, particularmente de 2 a 3 horas, de preplasmólisis, que implica situar el tejido en una disolución hipertónica convencional, tal como el tampón de electroporación referido anteriormente. El propósito de dicho tratamiento de preplasmólisis es separar al menos parcialmente, en las células del tejido intacto, sus protoplastos, preferentemente la totalidad o por lo menos parte de sus membranas celulares, de sus paredes celulares. Tal preplasmólisis se realiza preferentemente después de cualquier herida del tejido intacto, pero antes de cualquier tratamiento enzimático de éste. Cuando el tejido intacto ya se ha degradado mediante un tratamiento enzimático, se prefiere que cualquier preplasmólisis subsiguiente se verifique solamente durante un tiempo breve, y después del tratamiento enzimático de embriones inmaduros de maíz, como se explica anteriormente, se prefiere que tal preplasmólisis no se lleve a cabo en absoluto.

Las células competentes de esta invención también se pueden obtener: cultivando in vitro el tejido intacto de la presente invención para producir callo embriogénico compacto; y después cultivando el callo en fragmentos más pequeños. Los fragmentos del callo resultantes deben comprender, totalmente o al menos en parte, los sectores o partes embriogénicas del callo. Los fragmentos del callo tienen también preferentemente una longitud máxima media de 0,5 a 2,5 mm, particularmente de 1 a 2 mm, más particularmente de 1,25 a 1,75 mm, y tienen preferentemente una longitud mínima de alrededor de 0,1 mm. Para obtener cantidades suficientes del callo embriogénico primario, se prefiere propagar el callo primario, como se obtiene a partir de explantes de tejido, durante por lo menos un mes, y subcultivar los sectores embriogénicos de tal callo primario por lo menos una vez durante este período. Se cree que la rotura mecánica o la herida de los sectores embriogénicos del callo embriogénico compacto y de sus células, por ejemplo, cortándolos, es generalmente suficiente para generar las células competentes de la presente invención. Sin embargo, la ruptura mecánica del callo puede complementarse o sustituirse por un tratamiento enzimático para degradar las paredes celulares del callo, especialmente cuando los fragmentos del callo embriogénico compacto siguen siendo relativamente grandes. Dicho tratamiento enzimático puede realizarse de una forma convencional. El tratamiento enzimático sirve principalmente de modo preferido para generar poros en las paredes celulares de las células de los fragmentos del callo, y se recomienda por tanto que el tratamiento enzimático sea relativamente breve, preferentemente de entre 1 y 10 minutos, dependiendo de la consistencia de los fragmentos del callo, de forma que no se cause una ruptura completa de los tejidos. Dependiendo de la planta monocotiledónea, pueden utilizarse varios enzimas o disoluciones enzimáticas, tales como las que se enumeran por Powell y Chapman (1985) más arriba. Preferiblemente, los fragmentos del callo embriogénico compacto también se someten a un periodo (por ejemplo, 2 a 3 horas) de preplasmólisis, como se explica anteriormente.

El tejido intacto o los fragmentos del callo embriogénico compacto, heridos y/o degradados, particularmente sus sectores embriogénicos, obtenidos tal como se describió anteriormente, se ponen en contacto entonces con uno o más fragmentos de ADN que contienen un(os) gen(es) de interés, con objeto de transformar las células de plantas monocotiledóneas competentes de la presente invención. Se prefiere que por lo menos uno de los genes de interés se adapte para servir como un marcador seleccionable en las células de plantas monocotiledóneas transformadas resultantes. Se cree que la transferencia génica directa, particularmente la electroporación, proporciona una eficiencia óptima de transformación. Sin embargo, pueden utilizarse otras técnicas conocidas de transferencia del ADN, tales como transferencia génica directa utilizando polietilenglicol, bombardeo con microproyectiles revestidos con ADN (es decir, transformación biolística utilizando, por ejemplo, un cañón de partículas) o transferencia mediada por Agrobacterium.

El callo embriogénico compacto, utilizado para llevar a cabo el procedimiento de transformación vegetal de la presente invención, puede tener ciertas características de un callo embriogénico friable. A este respecto, un callo embriogénico compacto, o un callo embriogénico friable, puede cambiar o provocar su cambio a un tipo de callo que presente alguna de las características del callo embriogénico compacto, así como algunas otras del callo embriogénico friable. Como resultado, tal tipo intermedio de callo y sus partes embriogénicas pueden a veces transformarse según la presente invención. En realidad, los embriones somáticos que se desarrollan sobre dicho tipo intermedio de callo, así como sobre callo embriogénico friable, pueden aislarse y herirse y/o degradarse y transformarse entonces tal como se describió anteriormente. De este modo, al llevar a cabo el procedimiento de esta invención, tales embriones somáticos obtenidos a partir de un callo de tipo intermedio o de un callo embriogénico friable se pueden considerar como equivalentes a embriones zigóticos inmaduros o maduros obtenidos desarrollando semillas maduras, particularmente cuando se utiliza la electroporación como el medio para transformar las células de los embriones somáticos.

Según la presente invención, la electroporación puede llevarse a cabo de una forma convencional. A este respecto, fragmentos de callo o del tejido intacto heridos y/o degradados, particularmente sus secciones embriogénicas o meristemáticas, particularmente sus secciones completamente embriogénicas, pueden transferirse a una cubeta apropiada para la utilización en un aparato de electroporación (por ejemplo, tal como se describe por Dekeyser et al. (1990) The Plant Cell 2:591). Preferentemente, se transfieren a la cubeta de 10 a 500 mg aproximadamente, particularmente de 50 a 200 mg aproximadamente, y muy particularmente de 100 a 150 mg aproximadamente, de fragmentos de tejido intacto o de callo, por 200 \mul de tampón de electroporación. Para los cereales, tal como el maíz, (en el que se prefiere usar embriones inmaduros intactos tratados con enzimas), se prefiere transferir a la cubeta alrededor de 10 hasta 500 embriones, particularmente alrededor de 50 hasta 150 embriones, más particularmente alrededor de 75 hasta 125 embriones, en 200 \mul de tampón de electroporación. El ADN se añade entonces a ésta, y se lleva a cabo la electroporación. Preferentemente, el ADN se coincuba (por ejemplo, durante aproximadamente 1 hora) con los fragmentos del tejido intacto o del callo antes de la electroporación. Se cree que los mejores resultados se pueden obtener con ADN lineal en lugar de circular, ADN de tamaño relativamente pequeño, preferentemente menor que 20 kb aproximadamente, particularmente más pequeño que 15 kb, particularmente más pequeño que 10 kb, muy particularmente menor que 6 kb (por ejemplo, menor que aproximadamente 2-3 kb). A este respecto, pueden utilizarse múltiples fragmentos lineales de ADN de distinta composición para transformar las células competentes de la presente invención con múltiples genes de interés. Preferentemente, se añaden de 5 a 30 \mug aproximadamente, particularmente de 10 a 25 \mug aproximadamente, muy particularmente 20 \mug aproximadamente, de ADN, a la cubeta que contiene fragmentos del tejido intacto o del callo. No se cree que las condiciones particulares de electroporación sean críticas, y pueden obtenerse buenos resultados, por ejemplo, con una descarga de un pulso con una fuerza de campo de 375 V/cm a partir de un condensador de 900 \muF, utilizando un tampón de electroporación que contiene 150 mM de NaCl u 80 mM de KCl (Dekeyser et al. (1990) supra).

Cuando la transformación (por ejemplo, mediante electroporación) se completa, fragmentos del tejido intacto o del callo, que contienen las células monocotiledóneas transformadas, se transfieren a un medio de cultivo apropiado, preferentemente un medio selectivo cuando aquéllas contengan un marcador seleccionable. Esta transferencia deberá realizarse tan pronto como sea posible después, preferentemente de forma inmediata después, del suceso de transformación, y particularmente en los tres días siguientes a éste. Preferentemente, los fragmentos del tejido intacto o del callo transformados con un marcador seleccionable se cultivan utilizando condiciones y medios de cultivo convencionales (véase, por ejemplo, referencias en Vasil (1988) más arriba) suplementados con un agente selectivo. La selección del agente selectivo dependerá del marcador seleccionable utilizado en los fragmentos de ADN para transformar las células de los fragmentos del tejido intacto o del callo, tal como se considera seguidamente. La concentración del agente selectivo debe proporcionar una presión de selección muy alta sobre las células transformadas, de modo que sólo transformantes estables, en los que se integren, preferentemente de manera total, los fragmentos de ADN que contienen el marcador seleccionable, en el genoma de las células, puedan sobrevivir y aislarse. Aunque tales fragmentos del tejido intacto o del callo transformados pueden cultivarse durante algunos días en medio no selectivo, se prefiere que se transfieran a medio selectivo tan pronto como sea posible, y se conserven durante un período prolongado (por ejemplo, tanto como seis meses), preferentemente por lo menos durante un mes, particularmente de dos a tres meses, para producir cantidades significativas de callo morfogénico transformado, tales como callo embriogénico compacto transformado, que puede utilizarse para regenerar una planta fenotípicamente normal. Se prefiere también que la hipertonicidad del medio se mantenga durante un tiempo limitado (por ejemplo, hasta dos a tres semanas), por ejemplo suplementando el medio con manitol.

Según la presente invención, cualquier fragmento de ADN puede integrarse en el genoma, particularmente en el genoma nuclear, de una planta monocotiledónea. Generalmente, el fragmento de ADN contiene un gen endógeno o extraño u otra secuencia de ADN que es funcional en las células vegetales transformadas, y que confiere una característica adicional a tales células y a las plantas regeneradas a partir de éstas. Con este fin, el fragmento de ADN incluye preferentemente uno o más genes quiméricos que contienen las siguientes secuencias de ADN ligadas operativamente: 1) una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de una secuencia codificante en la célula de la planta (un "promotor"); 2) una secuencia (una "secuencia codificante") que codifica una proteína con una actividad específica en el interior de la célula de la planta (una "proteína de interés"); y 3) señales apropiadas de regulación de la transcripción en 3’. Con objeto de obtener la funcionalidad requerida de la proteína, puede también ser necesario que la proteína se dirija a uno o más compartimientos particulares de la célula vegetal, tales como el citosol, mitocondrias, cloroplastos o retículo endoplásmico. Para que la proteína sea dirigida al citosol, el gen quimérico, tal como se describe anteriormente, puede utilizarse como tal. Sin embargo, para que la proteína se dirija a otros compartimentos, se necesita que exista una secuencia adicional (una "secuencia diana") entre los fragmentos de ADN 1) y 2) del gen quimérico. Si es necesario, el gen quimérico puede también contener potenciadores transcripcionales y/o traduccionales, y la utilización del codón de las secuencias del ADN puede optimizarse para la expresión en las células de la planta.

Los genes quiméricos según la presente invención pueden construirse según principios y técnicas bien establecidos. A este respecto, las diversas secuencias de ADN deberán estar unidas de modo que la traducción se inicie en el codón de iniciación de la secuencia codificante de la proteína (o de la secuencia diana cuando esté presente).

Se piensa que los diversos promotores constitutivos e histoespecíficos y órganoespecíficos que se utilizan actualmente para dirigir la expresión de genes en las plantas dicotiledóneas transformadas serán también apropiados para emplearlos en las monocotiledóneas transformadas de la presente invención. A este respecto, células vegetales particulares pueden transformarse con un gen quimérico que comprende: una secuencia codificante que codifica una proteína de interés; y en dirección 5’ de la misma, bien un promotor extraño o uno endógeno apropiado para la expresión de la secuencia codificante. Promotores constitutivos extraños apropiados incluyen: el promotor de los aislados CM1841 (Gardner et al. (1981) Nucl. Acids. Res. 9:2871) y CabbB-S (Franck et al. (1980) Cell, 21:285) (el promotor "35S") del Virus del Mosaico de la Coliflor ("CaMV"), que dirige la expresión constitutiva de genes heterólogos (Odell et al. (1983) Nature 313:810); un promotor relacionado (el "promotor 35S3") que puede aislarse del aislado CabbB-JI (Hull y Howell (1978) Virology 86:482) del CaMV, y que difiere del promotor 35S en su secuencia (la secuencia del promotor 35S3 se da a conocer en la publicación de patente Europea ("EP") 359617) y en su mayor actividad en plantas transgénicas (Harpster et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 212:182); y los promotores TR1’ y TR2’ que gobiernan la expresión de los genes 1’ y 2’, respectivamente, del ADN T de Agrobacterium (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723) y son promotores inducidos por heridas. También se conocen promotores extraños órganoespecíficos, histoespecíficos y/o inducibles apropiados (véanse, por ejemplo, referencias citadas en Kuhlemeier et al. (1987) Ann. Rev. Plant Physiol. 38:221) tales como los promotores de los genes de pequeñas subunidades (tal como el gen 1A) de la 1,5-ribulosa bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana (el promotor "ssu") que son promotores inducibles por la luz (Krebbers et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11:745) activos sólo en el tejido fotosintético; los promotores específicos de las anteras que se dan a conocer en el documento EP 344029; y los promotores específicos de las semillas de, por ejemplo, Arabidopsis thaliana (Krebbers et al. (1988) Plant Physiol. 87:859). Promotores de utilidad particular para la transformación de plantas monocotiledóneas, con objeto de hacer estériles a los ejemplares del género masculino, tal como se describe en el documento EP 344029, son los promotores PTA29, PTA26 y PTA13, particularmente PTA29, específicos de las capas celulares superficiales, del documento EP 344029.

Asimismo, se cree que se pueden usar secuencias conocidas de regulación de la transcripción del extremo 3’ y señales de poliadenilación utilizadas en plantas dicotiledóneas transformadas, en plantas monocotiledóneas transformadas de la presente invención. Tales señales de regulación de la transcripción en 3’ pueden proporcionarse en dirección 3’ de la secuencia codificante. A este respecto, una célula vegetal particular puede transformarse con un gen quimérico que contenga señales de finalización de la trancripción, bien endógenas o extrañas, y señales de poliadenilación, apropiadas para obtener la expresión del gen quimérico. Por ejemplo, pueden utilizarse los extremos extraños no traducidos 3’ de los genes, tales como el gen 7 (Velten y Schell (1985) Nucl. Acids Res. 13:6998), el gen de la octopina sintasa (Gielen et al. (1983) EMBO J. 3:835) y el gen de la nopalina sintasa de la región de ADN T del Agrobacterium tumefaciens plásmido-Ti.

Para construir un gen quimérico que pueda expresarse en una célula vegetal transformada, preferentemente en su citoplasma, seguido de la translocación de su proteína de interés a las mitocondrias celulares, cloroplastos y/o luz del retículo endoplásmico, se conocen secuencias dianas adecuadas. No se cree que la selección de tales secuencias diana sea crítica, y una célula vegetal particular puede transformarse con un gen quimérico que contenga una secuencia diana endógena o extraña que codifique un péptido diana que proporcionará la translocación del producto de expresión del gen. Mediante la expresión "péptido diana", se quiere significar un fragmento polipeptídico que se asocia normalmente, en una célula eucariota, con una proteína o subunidad proteica cloroplástica o mitocondrial, o con una proteína translocada al retículo endoplásmico y que se produce en una célula como parte de una proteína precursora codificada por el ADN nuclear de la célula. El péptido diana es responsable del proceso de translocación de la proteína mitocondrial o cloroplástica codificada por el núcleo o de la subunidad proteica en el cloroplasto o la mitocondria o en la luz del retículo endoplásmico. Durante el proceso de translocación, el péptido diana se separa o se elimina proteolíticamente de la proteína o de la subunidad. Puede proporcionarse una secuencia diana al gen quimérico para expresar un péptido diana que puede translocar una proteína de interés expresada en el interior de una célula vegetal transformada, tal como se describe generalmente en las solicitudes de Patente Europea ("EPA") 85402596.2 y 88402222.9. Un péptido diana apropiado para el transporte a los cloroplastos es el péptido de tránsito de la subunidad pequeña de la enzima 1,5-ribulosa bifosfato carboxilasa (Krebbers et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11:745; EPA 85402596.2), pero también se pueden utilizar otros péptidos cloroplásticos de tránsito, tales como los listados por Watson (1984) Nucl. Acids. Res. 12: 5145 y Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104. Péptidos diana mitocondriales apropiados son los péptidos mitocondriales de tránsito descritos por Schatz (1987) Eur. J. Biochem. 165:1 y listados por Watson (1984) más arriba. Péptidos diana apropiados que pueden translocar una proteína de interés a la luz del retículo endoplásmico de una célula vegetal son, por ejemplo, los péptidos señal descritos por Von Heijne (1988) Biochem. Biophys. Acta 947:307 y que se listan por Watson (1984) más arriba.

Las secuencias codificantes que pueden utilizarse para la producción de plantas dicotiledóneas transgénicas son bien conocidas (véanse, por ejemplo, las secuencias codificantes listadas por Weising et al (1988) Annual Rev. Genet. 22:421), y se cree que tales secuencias codificantes pueden utilizarse igualmente bien, según la presente invención, en las plantas monocotiledóneas transformadas. A este respecto, las secuencias codificantes pueden ser extrañas o endógenas a las plantas, y pueden, por ejemplo, codificar proteínas que: son tóxicas para especies de insectos, protegiendo de este modo a las plantas contra el ataque de éstos (documentos EP 193259, EP 305275 y EP 358557); proteger a las plantas contra las condiciones de estrés (documento EP 359617); confieren a las plantas una resistencia o tolerancia a herbicidas específicos (documento EP 242236); eliminan o incapacitan a las células vegetales en las que las proteínas se expresan de modo que, cuando las secuencias codificantes están bajo el control de un promotor órgano-específico masculino o femenino, las proteínas pueden hacer que las plantas se vuelvan respectivamente estériles masculinas (documento EP 344029) o estériles femeninas (documento EP 412006); pueden extraerse de las plantas o seleccionarse de sus órganos, y procesarse posteriormente opcionalmente de modo que las plantas pueden utilizarse como fuente de péptidos o proteínas económicamente importantes (documento EP 319353); o se enriquecen en aminoácidos nutricionalmente importantes de modo que las plantas transformadas o sus órganos, en los que las proteínas se expresan, pueden utilizarse como alimento con valor nutricional potenciado para los animales o el ser humano (documento EP 318341).

Las secuencias codificantes de particular utilidad para transformar plantas monocotiledóneas de modo que se vuelvan resistentes a los insectos son los genes aislados de las cepas de Bacillus thuringiensis ("Bt") y sus partes truncadas que codifican proteínas cristalinas insecticidas y sus toxinas polipeptídicas insecticidas (para una revisión, véase: Höfte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242). Se cree que los siguientes genes Bt son particularmente importantes para el control de los insectos en los cereales (por ejemplo, maíz, arroz, trigo y cebada): el gen CryIAb (documento EP 193259) y el gen CryIAc para el control de especies de Helicoverpa (por ejemplo, H. zea y H. armigera); el gen CryIAb y el gen CryIb (documento EP 358557) para el control de especies de Ostrinia (por ejemplo, O. nubilalis) en el maíz; el gen CryIAc para el control de especies de Agrotis en el maíz y en el trigo; y los genes CryID y CryIE (documento EP 358557) para el control de especies de Spodoptera (por ejemplo, S. frugiperda) en el maíz. Para obtener una expresión suficiente de tales genes en los tejidos de las plantas transgénicas, se prefiere que los genes se modifiquen tal como se describe en la solicitud nº PCT PCT/EP 91/00733 (publicación PCT WO 91/16432).

Marcadores seleccionables según la presente invención son genes quiméricos en los que las secuencias codificantes codifican proteínas que confieren a las células de la planta, en las que se expresan, resistencia a un agente seleccionable tal como un antibiótico y/o un herbicida. Marcadores capaces de rastreo según la presente invención son genes quiméricos en los que las secuencias codificantes codifican proteínas que confieren a las células de la planta, en las que se expresan, un aspecto distinto, tal como un color diferente, produciendo plantas transformadas con el marcador capaz de rastreo separable manualmente. La selección de un marcador seleccionable o capaz de rastreo, preferentemente un marcador seleccionable, para transformar una planta monocotiledónea según la presente invención no se cree que sea crítica, sino que pueden utilizarse marcadores seleccionables y capaces de rastreo convencionales (véanse, por ejemplo, los marcadores listados en Weising et al. (1988) más arriba). Ejemplos de secuencias codificantes apropiadas para marcadores seleccionables son: el gen neo (Beck et al. (1982) Gene 19:327) que codifica la enzima neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiótico kanamicina; el gen hyg (Gritz y Davies (1983) Gene 25:179) que codifica la enzima higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiótico higromicina; y el gen bar (documento EP 242236) que codifica la fosfinotricin acetil transferasa que confiere resistencia al herbicia fosfinotricina. Utilizando un gen marcador seleccionable que codifica una proteína que confiere tolerancia o resistencia a un herbicida u otro agente selectivo que actúa en el metabolismo del cloroplasto, tal como el gen bar, se prefiere que el gen marcador forme parte de un gen quimérico junto con una secuencia diana cloroplástica, tal como se describe anteriormente. Ejemplos de secuencias codificantes apropiadas para marcadores capaces de rastreo son el gen gus (Jefferson et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6:3901) que codifica la beta-glucuronidasa, y el gen de la luciferasa (Ow et al. (1986) Science 234:856).

Tal como se consideró anteriormente, la presión de selección, proporcionada por la presencia de un agente seleccionable, será preferentemente bastante alta durante el cultivo de las células vegetales transformadas de la presente invención, que contienen marcadores seleccionables. Por ejemplo, cuando el gen neo se utiliza como un marcador seleccionable, la kanamicina se utilizará en concentraciones de por lo menos alrededor de 100-200 mg por litro, preferentemente por lo menos alrededor de 200 mg por litro, en el medio de cultivo. Tal alta presión de selección se mantendrá también durante un tiempo prolongado, por ejemplo, de dos a cuatro meses. Se cree, sin embargo, que presiones de selección y duraciones particulares no son críticas, y que la elección de las presiones de selección y de sus duraciones puede realizarse de una forma convencional. Sin embargo, cuando el gen bar se utiliza como un gen marcador seleccionable, la fosfinotricina (PPT) se utiliza preferentemente en concentraciones de 0,5 a 50, particularmente de 2 a 20 mg por litro del medio de cultivo.

Los sectores morfogénicos, preferentemente sectores embriogénicos, de callo morfogénico, preferentemente callo embriogénico compacto, producidos en un cultivo de células transformadas de tejido intacto herido y/o degradado o sectores embriogénicos heridos y/o degradados del callo embriogénico compacto de la presente invención, pueden entonces regenerarse a plantas fenotípicamente normales (por ejemplo, maduras y fértiles) de una forma convencional (véanse, por ejemplo, referencias en Vasil (1988) más arriba, y Lazzeri y Lörz (1988), más arriba). Las plantas regeneradas, así obtenidas, serán transgénicas y poseerán por lo menos el marcador seleccionable o capaz de rastreo, preferentemente el marcador seleccionable, integrado establemente en su genoma nuclar. La presencia y expresión de otros genes de interés puede entonces evaluarse de una forma convencional, tal como mediante transferencia Southern y/o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory).

Para los objetivos de la presente invención, una planta fenotípicamente normal, tal como la producida por los procedimientos de transformación y regeneración de la presente invención, deberá entenderse como al menos una planta que no difiere sustancialmente de una planta no transformada de la misma progenie en cualquiera de sus características fenotípicas, excepto en aquellas características que se añaden o cambian debido a la expresión de los fragmentos de ADN introducidos en el genoma de la planta durante la transformación. Por supuesto, cualquier procedimiento para transformar plantas produce habitualmente varias plantas transgénicas que exhiben diversos fenotipos, sólo algunos de los cuales son fenotípicamente normales tal como se definió anteriormente.

El procedimiento de la presente invención puede aplicarse a todas las progenies de plantas monocotiledóneas a partir de las cuales callo morfogénico compacto, tal como el callo embriogénico compacto, puede obtenerse durante el cultivo in vitro de explantes de varios tejidos procedentes de la planta tales como embriones zigóticos maduros e inmaduros, bases foliares, inflorescencias jóvenes, etc. El método será especialmente útil para la transformación de cosechas de gramíneas económicamente importantes, particularmente los cereales principales, tales como maíz, arroz, avena, cebada, sorgo, centeno y mijo. Las plantas transgénicas resultantes de la presente invención pueden utilizarse para crear, de una forma rápida y eficiente, nuevas progenies y/o variedades de plantas que se han producido sólo en cultivo de gran valor agronómico. A este respecto, pueden crearse plantas transgénicas según la presente invención que pueden utilizarse como plantas polinizadoras, por ejemplo, como plantas polinizadoras estériles hembras, para la producción de semillas híbridas tal como se da a conocer en el documento EP 412006 (que se incorpora a la presente memoria como referencia).

La presente invención proporciona un procedimiento rápido, eficiente y reproducible para transformar plantas monocotiledóneas, utilizando el callo embriogénico compacto o tejido intacto para producir cultivos de callo morfogénico transformado, preferentemente callo embriogénico compacto. Esto es sorprendente, ya que ni el callo embriogénico compacto ni el tejido intacto se han considerado generalmente como un material apropiado de partida para obtener transformantes estables (véase Vasil (1990) Bio/Technology 8:797). La utilización de tejido intacto o de callo embriogénico compacto según la presente invención constituye una mejora distinta respecto a los procedimientos existentes de transformación de plantas monocotiledóneas que han necesitado la utilización del callo embriogénico friable, de cultivos de suspensiones celulares embriogénicas y/o de protoplastos que son competentes para: 1) captación de ADN, 2) transformación integradora y 3) regeneración eficiente y reproducible de la planta monocotiledónea. Tales requisitos de competencia presentan, hasta la fecha, transformaciones estables limitadas de monocotiledóneas a progenies vegetales con propiedades de cultivo tisular muy específicas. Por ejemplo, sólo ciertas progenies del maíz, tales como la progenie consanguínea A188, ha tenido la capacidad de formar bastante callo de tipo II (es decir, formar callo de tipo II a frecuencias mayores que 10%, hasta por ejemplo 80% o más), a partir del cual pueden obtenerse cultivos competentes de suspensiones y/o protoplastos a frecuencias apreciables. Sin embargo, la totalidad de tales progenies de maíz han sido de bajo valor agronómico, de forma que transformaciones de progenies de maíz económicamente valiosas han sido posibles sólo mediante programas laboriosos de cría en los que propiedades apropiadas del cultivo tisular se han transferido a las progenies de maíz valiosas a partir de las progenies transformables de escaso valor.

A causa de que el procedimiento de la presente invención necesita solamente de un período relativamente corto de cultivo in vitro, el procedimiento necesita un tiempo más corto y un consumo de trabajo menor que los procedimientos previos. El corto tiempo de cultivo tisular asegura también que se reduzca la variación somaclonal.

El procedimiento de la presente invención produce nuevas plantas monocotiledóneas transgénicas fenotípicamente normales (por ejemplo, fértiles), particularmente plantas gramíneas, más particularmente cereales, lo más particular maíz y arroz, que son transformadas con por lo menos un gen (por ejemplo, extraño) de interés, integrado establemente en su genoma nuclear. Se cree que el procedimiento es independiente del genotipo de la planta, que es transformado, y capaz de transformar las células de cualquier planta, a partir de la cual puede obtenerse el callo embriogénico compacto por lo menos de uno de sus tejidos. Esto hace posible transformar un número sustancial de progenies monocotiledóneas, y un número sustancial de progenies dentro de cada especie. Además, la capacidad para formar tejido embriogénico compacto puede transferirse, mediante programas clásicos de cría, de una progenie que posee tal capacidad a otra progenie que no la tiene.

Las nuevas plantas transgénicas monocotiledóneas de la presente invención regeneradas a partir del callo morfogénico transformado, particularmente callo transformado embriogénico compacto, se caracterizan por el hecho de que a partir de tales monocotiledóneas, utilizando condiciones de cultivo convencionales tal como se describen por ejemplo, en Datta et al. (1990) más arriba, Shimamoto et al. (1989) más arriba, Hayashimoto et al. (1990) más arriba, Gordon-Kamm et al. (1990) más arriba, y Fromm et al. (1990) más arriba, es prácticamente imposible obtener cultivos embriogénicos de suspensión y/o protoplastos, o es prácticamente imposible obtener cultivos embriogénicos de suspensión y/o protoplastos que tengan suficiente capacidad para ser transformados establemente y regenerados entonces como plantas transgénicas fenotípicamente normales (por ejemplo, fértiles). Respecto a este segundo tipo de imposibilidad, no se cree que sea práctico obtener cultivos embriogénicos de suspensión o protoplastos de tales plantas monocotiledóneas que: 1) tengan una alta probabilidad de ser regenerables a plantas fenotípicamente normales; 2) tengan una alta probabilidad de ser competentes respecto a la captación de ADN y a la transformación integradora del ADN así captado; y 3) cuando se transforman así, tengan una alta probabilidad de ser regenerables a plantas transgénicas fenotípicamente normales.

En particular, la presente invención proporciona nuevas plantas de arroz transgénicas de progenies de arroz, a partir de las cuales se pueden obtener generalmente cultivos embriogénicos en suspensión (cuando son obtenibles), por ejemplo, según los procedimientos descritos por Li et al. (1990) Plant Mol. Biol. Report. 8:276, Datta et al. (1990) Plant Sci. 67:83 y Datta et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:253, y generalmente se pueden obtener protoplastos (cuando son obtenibles) a partir de los cultivos embriogénicos en suspensión, por ejemplo según los procedimientos descritos por Li y Murai (1990) Plant Cell Rep. 9:216. Sin embargo, en condiciones convencionales de cultivo, como se describe, por ejemplo, en Shimamoto et al. (1989) más arriba, Datta et al. (1990) más arriba y Hayashimoto et al. (1990) más arriba, es prácticamente imposible regenerar plantas fenotípicamente normales (por ejemplo, fértiles) a partir de cultivos embriogénicos en suspensión o protoplatos de tales progenies de arroz.

La presente invención proporciona también nuevas plantas de maíz transgénicas de progenies de maíz, a partir de las cuales pueden obtenerse generalmente cultivos embriogénicos de suspensión (cuando son obtenibles), por ejemplo, según los procedimientos descritos por Shillito et al. (1989) Bio/Technology 7:581, Prioli y Söndahl (1989) Bio/Technology 7:589, Gordon-Kamm et al. (1990) más arriba, y Fromm et al. (1990) más arriba, pudiéndose obtener generalmente protoplastos (cuando sean obtenibles) a partir de tales cultivos embriogénicos de suspensión, por ejemplo, según los procedimientos descritos por Shillito et al. (1989) más arriba y Prioli y Söndahl (1989) más arriba. Sin embargo, bajo condiciones de cultivo convencionales tal como las descritas por ejemplo, por Shillito et al. (1989) más arriba, Prioli y Söndahl (1989) más arriba, Gordon-Kamm et al. (1990) más arriba y Fromm et al. (1990) más arriba, es prácticamente imposible regenerar plantas fenotípicamente normales (por ejemplo, fértiles) a partir de cultivos embriogénicos de suspensión o protoplastos de tales progenies de maíz. Además, tales progenies de maíz tienen la capacidad de formar callo de tipo I a frecuencias altas, pero no poseen la capacidad de formar callo de tipo II a frecuencias más altas que el 10%, particularmente a frecuencias más altas que el 1%, más particularmente a frecuencias más altas que el 0,1%, de modo más completamente particular a frecuencias más altas que 0,01. El callo de maíz de tipo II es el único tipo de tejido de callo de maíz, a partir del cual pueden obtenerse adecuadamente cultivos embriogénicos de suspensión y protoplastos regenerables que pueden transformarse establemente, y por tanto, la incapacidad para obtener callo de tipo II para una progenie de maíz particular ha significado, hasta la fecha, que no se podían regenerar plantas de maíz transgénicas fenotípicamente normales (por ejemplo, maduras) a partir del callo transformado de tal progenie de maíz. La capacidad práctica para obtener callo de tipo II a partir de una progenie de maíz particular puede evaluarse mediante los procedimientos generales descritos por Gordon-Kamm et al. (1990) más arriba y Fromm et al. (1990) más arriba, y las referencias mencionadas en la presente memoria. Para realizar esta evaluación, los cultivos del callo pueden iniciarse a partir de, por ejemplo, 1000 embriones inmaduros de una progenie de maíz; los cultivos pueden conservarse mediante subcultivo cada 3 semanas, y sólo aquellos cultivos que se parezcan más al callo de tipo II típico, pueden volver a cultivarse; y después de 6 meses, puede determinarse a qué frecuencias se obtiene un callo uniforme de tipo II.

Más generalmente, para determinar si resulta práctico obtener protoplastos regenerables a partir de una progenie específica de una especie monocotiledónea, pueden seguirse los siguientes procedimientos bien conocidos. A este respecto, se cree que los protoplastos regenerables se generan más eficiente y con mayor seguridad a partir de cultivos embriogénicos de suspensión, que pueden producirse o conservarse mediante medios convencionales para cualquier monocotiledónea específica. El grado y calidad de un cultivo embriogénico de suspensión depende generalmente de su genotipo, y sólo si este cultivo embriogénico de suspensión de una progenie de la planta es capaz de la regeneración de ésta, compensa generalmente la formación de protoplastos para la transformación. Los cultivos embriogénicos de suspensión pueden caracterizarse generalmente como formados por grupos pequeños, bien dispersos de células embriogénicas ricamente citoplásmicas, sin tejidos de callo o meristemos organizados, con tiempos duplicados celulares de 27-32 horas, y capaces de formar embriones somáticos y plantas (Vasil (1988) Bio/Technology 6:397). Puede determinarse si un cultivo embriogénico de suspensión de una progenie particular de una especie monocotiledónea es apropiado para la regeneración de la planta, sembrando en placa un gran número (es decir, por lo menos 100) de agregados celulares sobre un medio apropiado de regeneración, y determinando qué proporción de los agregados dará lugar a plantas fértiles fenotípicamente normales. Si las plantas fértiles normales se obtienen a partir del 50% o más de los agregados celulares, se considera generalmente que compensa continuar la generación protoplástica. Sin embargo, una progenie específica de monocotiledónea puede considerarse como no apropiada para proporcionar protoplastos regenerables apropiados para la transformación de la planta si, utilizando el aislamiento y el cultivo convencionales de los protoplastos, y las técnicas de regeneración de la planta: para cada 10.000 protoplastos, no más de aproximadamente 500, particularmente no más de 100 aproximadamente, más particularmente no más de 10 aproximadamente, y más particularmente todavía no más de 1 aproximadamente, pueden regenerar plantas fenotípicamente normales (por ejemplo, planta(s) fértil(es)).

Los Ejemplos siguientes ilustran la presente invención. Si no se indica lo contrario, todos los procedimientos experimentales para manipular el ADN recombinante se realizaron mediante procedimientos estandarizados descritos por Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Se diseñaron oligonucleótidos según las reglas generales establecidas por Kramer y Fritz (1968) Methods in Enzymology 154:350 y se sintetizaron mediante el procedimiento del fosforamidito de Beaucage y Caruthers (1991) Tetrahedron Letters 22:1859, en un sintetizador de ADN 380A de Applied Biosystems (Applied Biosystems B.V., Maarssen, Países Bajos). Las siguientes cepas bacterianas y plásmidos, utilizados en los Ejemplos, están disponibles en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen ("DSM"), Mascheroder Weg 1B, Braunschweig, Alemania:

Cepa bacteriana	plásmido	DSM nº	Fecha de depósito
E. Coli WK6	pMa5-8	DSM 4567	3 de mayo de 1988
E. Coli WK6	pMc5-8	DSM 4566	3 de mayo de 1988

Ejemplo 1 Transformación del maíz con un gen marcador seleccionable mediante electroporación del ADN en embriones inmaduros zigóticos

Embriones inmaduros zigóticos de aproximadamente 0,5 a 1 mm se aislaron a partir de las semillas en desarrollo de dos progenies consanguíneas de maíz, Pa91 y H99. Los embriones recién aislados se trataron enzimáticamente durante 1-2 minutos con una disolución enzimática II (macerozyme al 0,3% (Kinki Yakult, Nishinomiya, Japón) en sales CPW (Powell y Chapman (1985) "Plant Cell Culture, A practical Approach" R.A: Dixon ed., capítulo 3) con manitol al 10% y 5 mM de ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES), pH 5,6). Después de 1-2 minutos de incubación en esta disolución enzimática, los embriones se lavaron cuidadosamente con una disolución de N6aph (macro y microelementos de medio N6 (Chu et al. (1975) Sci. Sin. Peking 18:659) suplementada con 6 mM de asparagina, 12 mM de prolina, 1 mg/l de tiamina-HCl, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 100 mg/l de inositol, 30 g/l de sacarosa y 54 g/l de manitol). Después de lavarlos, los embriones se incubaron en el tampón de electroporación del maíz, EPM-NaCl (150 mM NaCl, 5 mM CaCl_{2}, 10 mM HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N’-2-etanosulfónico) y 0,425 M de manitol, pH 7,2). En cada cubeta, se cargaron aproximadamente 100 embriones en 200 \mul de EPM-NaCl. Se añadieron por cubeta alrededor de 20 \mug de un ADN plasmídico, pDE108 linealizado con HindIII. pDE108 es un plásmido de 5399 pares de bases, cuya secuencia completa se muestra en SEQ. ID. No.1 y que contiene un gen quimérico que incluye el gen de resistencia a la kanamicina (neo) bajo el control del promotor 35S3 (documento EP 359617).

Después de una hora de incubación del ADN con los explantes, las cubetas se transfirieron a un baño de hielo. Después de 10 minutos de incubación en el hielo, se realizó la electroporación: un pulso con una fuerza de campo de 375 V/cm se descargó a partir de un condensador de 900 \muF. El aparato de electroporación fue tal como el que se describe por Dekeyser et al. (1990), The Plant Cell 2:591. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió un sustrato de N6aph líquido recién preparado a los explantes en la cubeta, después de lo cual los explantes se incubaron durante un período de otros 10 minutos en hielo.

Seguidamente, los embriones se transfirieron al sustrato Mahl VII (macro y micro elementos y vitaminas del medio N6 suplementados con 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 6 mM de prolina, 0,5 g/l de MES, 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y sacarosa al 2%, solidificado con 0,75 g/l de MgCl_{2} y 1,6 g/l de Phytagel (Sigma Chemical Company, St Louis, Mo, Estados Unidos de América), pH 5,8), y suplementado con 0,2 M de manitol. Después de 3 días para la progenie H99 y de 2 días para la progenie Pa91, los embriones se transfirieron al mismo sustrato suplementado con 200 mg/l de kanamicina. Después de aproximadamente 14 días, los embriones se transfirieron al sustrato Mahl VII sin manitol, suplementado con kanamicina. Los embriones se subcultivaron posteriormente en este sustrato selectivo durante aproximadamente 2 meses con intervalos de subcultivo de alrededor de 3 semanas. El tejido embriogénico inducido se aisló cuidadosamente y se transfirió al medio MS (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473) suplementado con 5 mg/l de 6-bencilaminopurina para la progenie H99, y 5 mg/l de zeatina para la progenie Pa91. El tejido embriogénico se conservó en dicho medio durante aproximadamente 14 días y se transfirió posteriormente a medio MS sin hormonas y con sacarosa al 6% para la progenie H99 y sacarosa al 3% para la progenie Pa91. Se transfirieron los brotes en desarrollo a medio 1/2 MS con 1,5% de sacarosa para desarrollo posterior en plántulas normales. Estas plántulas se transfirieron al suelo y se cultivaron en el invernadero.

Ejemplo 2 Caracterización de las plantas de maíz transformadas del Ejemplo 1

Se analizaron diecisiete plantas del Ejemplo 1 en cuanto a la presencia del gen quimérico neo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se preparó ADN según el protocolo descrito por Dellaporta et al. (1983) Plant Mol. Biol. Reporter 1:19, adaptado para aplicarlo a cantidades de tejido de alrededor de 10 a 20 mg. Para cada planta, se maceró tal cantidad de tejido en tampón de extracción en un tubo de microcentrífuga. Se amplificó un fragmento de 706 pares de bases, correspondiente a una parte de la secuencia codificante del gen neo con la reacción en cadena de la polimerasa, según el protocolo descrito por Sambrook et al. (1990) más arriba, utilizando sondas oligonucleótidas complementarias a las secuencias del plásmido pDE108, del nucleótido 1384 al 1406 y 2089 a 2067 (numeración como en la SEQ. ID. No. 1). En total, se realizaron 35 ciclos con una temperatura de hibridación de 50°C. El ADN final se analizó mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,5%. Se pudo identificar un fragmento de 706 pares de bases en un total de 13 plantas. Una de las plantas positivas murió en un estadio ulterior.

Se ensayó la actividad del producto de expresión del gen neo (es decir, neomicin fosfotransferasa II (NPTII)) en 9 de las plantas, de la forma siguiente. Se prepararon extractos en bruto moliendo tejidos de la planta en tampón de extracción (McDonnell et al. (1987) Plant. Molecular Biol. Reporter 5:380). Los extractos se sometieron entonces a electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante según el procedimiento descrito por Reiss et al. (1984) Gene 30:211. La actividad NPTII se ensayó entonces mediante fosforilación in situ de la kanamicina utilizando como sustrato [gamma-^{32}P]ATP (McDonnell et al. (1987) más arriba). Se encontró actividad NPTII en 8 de las plantas que se examinaron (Figura 1).

Una de las plantas (H-99-M148-1), que se encontró que era positiva en ambos ensayos, el de la PCR y el NPTII, se analizó posteriormente mediante hibridación Southern. Se preparó el ADN genómico a partir del tejido de la planta, según el protocolo descrito por Dellaporta et al. (1983) más arriba, suplementado por un tratamiento con RNasa para eliminar el ARN que quedaba. Se utilizó una planta H99 no transformada como control. Se digirieron muestras del ADN con uno de las siguientes enzimas de restricción: BglII, EcoRI, ECoRV, HindIII, BamHI, PvuI, PvuII ó PstI, y se sometieron a electroforesis horizontal de agarosa. Se llevó a cabo, tal como recomienda el fabricante (prospecto de Amersham Hybond -N+) una transferencia Southern a membranas Hybond N+ (Amersham International PLC, Amersham, Inglaterra) mediante el protocolo "transferencia alcalina del ADN", y la hibridación subsiguiente. Se prepararon sondas radioactivas con el equipo de marcaje del ADN multi-iniciador (Amersham), según el protocolo proporcionado por el fabricante, que se derivó de los procedimientos publicados (Feinberg y Vogelstein (1983) Anal. Biochem 132:6). Como sonda, se utilizó un fragmento EcoRI-HindIII de 1184 pares de bases derivado de otro plásmido. La secuencia de este plásmido se proporciona en Sec. Id. No. 2. Los patrones de bandas (por ejemplo, véase la Figura 2) mostraron que por lo menos el gen quimérico neo se integró en el ADN genómico de la planta.

Un análisis ulterior de esta planta transformada (H99-m148-1) mostró que transporta dos copias casi intactas del plásmido pDE108 y una parte de una tercera copia reorganizada. Las dos copias casi completas se insertan aparentemente en el genoma de la planta en una configuración concatámera de la cabeza a la cola. Sin embargo, algunas reorganizaciones deben haber ocurrido, pues se crearon un sitio NcoI adicional y una sitio BglII adicional, mientras que el sitio HindIII (utilizado para la linearización de pDE108 antes de la electroporación) se perdió en la unión de las dos copias. La secuenciación de la unión de las dos copias plasmídicas, como integrada en el genoma de la planta, reveló que sólo los extremos 5’ sobresalientes del sitio HindIII se han perdido, creando de este modo un sitio NcoI de la manera siguiente:

AGCCA	+	AGCTTGGCG	=	AGCCATGGCG
TCGGTTCGA		ACCGC	=	TCGGTACCGC

(las bases perdidas están subrayadas, y el sitio NcoI creado en la unión está en negrita). Un análisis adicional mostró que no se habían perdido, o se habían perdido muy pocas secuencias del ADN plasmídico alrededor de los sitios HindIII, que flanquean el genoma de la planta. Aunque las otras plantas no se ensayaron en este sentido, los ensayos PCR y NPTII mostraron que los genes quiméricos se encuentran presentes y expresados.

Las plantas transformadas maduras eran fértiles y completamente normales desde el punto de vista fenotípico. La planta que se ensayó previamente mediante hibridación Southern se utilizó como una planta polinizadora en tres cruzamientos con plantas no transformadas (dos de la progenie H99 consanguínea de maíz y una de la progenie Pa91 consanguínea de maíz). Un total de 44 de las plantas de la progenie F1 se ensayaron en cuanto a la actividad NPTII, tal como se ha descrito anteriormente, y veinte de ellas se encontraron positivas. Esto no difiere significativamente de la relación 1:1 esperada bajo segregación mendeliana normal, suponiendo que la planta polinizadora transformada tenía una copia activa (o alternativamente, múltiples copias activas unidas estrechamente) del gen neo quimérico (X^{2}=0,36).

Ejemplo 3 Transformación del maíz con un gen marcador seleccionable mediante electroporación del ADN en el callo de tipo I derivado de los embriones zigóticos inmaduros

Embriones zigóticos inmaduros de aproximadamente 0,5 a 1 mm de longitud se aislaron a partir de las semillas en desarrollo de la progenie consanguínea de maíz Pa91 y se cultivaron en el sustrato Mahl VII con intervalos posteriores de subcultivo de alrededor de 14 días. Se diseccionó cuidadosamente el tejido embriogénico a partir del callo de tipo I en desarrollo. El tejido embriogénico en EPM (EPM-NaCl sin NaCl) se cortó entonces finalmente en fragmentos con una longitud máxima de aproximadamente 1,5 mm. Los fragmentos de callo resultantes se plasmolizaron previamente durante tres horas en dicho tampón. Después de tres horas, los fragmentos del callo se transfirieron a EPM-NaCl. Alrededor de 100-150 mg de fragmentos de callo se transfirieron a 200 \mul de EPM-NaCl por cubeta. Se añadieron 20 \mug del ADN del plásmido pDE108 (Sec. Id. No 1), linealizados con HindIII, a cada cubeta. El ADN se incubó con los fragmentos de callo durante una hora, después de lo cual las cubetas se transfirieron a un baño de hielo.

Después de 10 minutos de incubación en hielo, se realizó la electroporación: un pulso con una fuerza de campo de 375 V/cm se descargó a partir de un condensador de 900 \muF. El aparato de electroporación fue como el descrito por Dekeyser et al (1990) más arriba. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió a los fragmentos de callo sustrato N6aph líquido recién preparado, suplementado con 6 mM de asparagina, 12 mM de prolina, 1 mg/l de tiamina-HCl, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 100 mg/l de inositol, 30 g/l de sacarosa y 54 g/l de manitol, los cuales fragmentos se incubaron posteriormente durante 10 minutos en hielo.

Después de un cultivo de un día en sustrato líquido N6aph suplementado con 1 mg/l de 2,4-D, los fragmentos de callo se transfirieron al sustrato Mahl VII suplementado con 0,2M de manitol y 200 mg/l de kanamicina. Catorce días después, los fragmentos de callo se subcultivaron en el mismo sustrato selectivo pero sin manitol, y se cultivaron posteriormente en dicho sustrato durante alrededor de 2 meses con intervalos de sulbcultivo de alrededor de 3 semanas. Los sectores embriogénicos de los callos resultantes se aislaron a partir del tejido viscoso y se transfirieron a sustrato MS (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473) con sacarosa al 3% y suplementado con 5 mg/l de zeatina para germinar. Se mantuvo el tejido en dicho medio durante aproximadamente 2 semanas, y se transfirió posteriormente a medio MS con sacarosa al 3% o 6%. Los brotes que se desarrollaron en dicho sustrato se transfirieron a un medio MS semifuerte con sacarosa al 1,5%, para desarrollo ulterior a plántulas normales. Estas plántulas se transfirieron al suelo y se cultivaron en el invernadero.

Ejemplo 4 Caracterización de las plantas de maíz transformadas del Ejemplo 3

Se analizaron veintinueve plantas del Ejemplo 3 en cuanto a la presencia del gen quimérico neo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se preparó ADN según Dellaporta et al. (1983) Plant Mol. Biol. Reporter 1:19, adaptado para aplicarlo a cantidades de tejido de aproximadamente 10 a 20 mg. Para cada planta, se maceró tal cantidad de tejido en tampón de extracción en un tubo de microcentrífuga. Se amplificó un fragmento de 706 pares de bases, correspondiente a una parte de la secuencia codificante del gen neo, con la reacción en cadena de la polimerasa, según el protocolo descrito por Sambrook et al. (1990) más arriba, utilizando sondas oligonucleótidas complementarias a las secuencias del plásmido pDE108, del nucleótido 1384 al 1406 y del 2089 al 2067 (numeración como en la Sec. Id. No. 1). En total, se realizaron 35 ciclos con una temperatura de hibridación de 50°C. El ADN final se analizó mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,5%. Se pudo identificar un fragmento de 706 pares de bases en un total de 14 plantas. Una de las plantas positivas murió en un estadio ulterior.

Se ensayó la actividad del producto de expresión NPTII del gen neo en 24 de las plantas, de la forma siguiente. Se prepararon extractos en bruto moliendo tejidos de la planta en tampón de extracción (McDonnell et al. (1987) Plant. Molecular Biol. Reporter 5:380). Los extractos se sometieron entonces a electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante según el procedimiento descrito por Reiss et al. (1984), Gene 30:211. La actividad NPTII se ensayó entonces mediante fosforilación in situ de la kanamicina utilizando como sustrato [gamma-^{32}P]ATP (McDonnell et al. más arriba). Se encontró actividad NPTII en 14 de las plantas que se examinaron (Figura 3). Dos plantas que eran NPTII positivas dieron negativo en un ensayo PCR.

Dos de las plantas (Pa91-M146-2 y Pa91-M149-1) que se encontraron positivas en ambos ensayos, el de la PCR y el NPTII, se analizaron posteriormente mediante hibridación Southern. Se preparó el ADN genómico a partir del tejido de la planta, según Dellaporta et al. (1983) más arriba, suplementado por un tratamiento con RNasa para eliminar el ARN que quedaba. Se utilizó una planta Pa91 no transformada como control. Se digirieron muestras del ADN con una de las siguientes enzimas de restricción: BglII, EcoRI, ECoRV, HindIII, BamHI, PvuI, PvuII o PstI, y se sometieron a electroforesis horizontal de agarosa. Se llevó a cabo una transferencia Southern, tal como recomienda el fabricante (Amersham) a membranas Hybond N+ mediante el protocolo de la "transferencia alcalina del ADN" y la hibridación subsiguiente. Se prepararon sondas radioactivas con el equipo de marcaje del ADN multiiniciador (Amersham), según el protocolo proporcionado por el fabricante derivado de los procedimientos publicados (Feinberg y Vogelstein (1983) Anal. Biochem 132:6). Como sonda, se utilizó un fragmento EcoRI-HindIII de 1184 pares de bases derivado de otro plásmido. La secuencia de dicho plásmido se proporciona en Sec. Id. No. 2. Los patrones de bandas (por ejemplo, véase la Figura 4) mostraron que por lo menos el gen quimérico neo se integró en el ADN genómico de la
planta.

Un análisis ulterior de una de las plantas transformadas (Pa91-M146-2) mostró que transporta dos copias casi intactas del plásmido pDE108 en una configuración de la cabeza a la cola. El sitio HindIII (utilizado para la linealización del pDE108 previa a la electroporación) en la unión de las dos copias, se perdió. La secuenciación de la unión de las dos copias plasmídicas, según se integra en el genoma de la planta, reveló que se han perdido sólo los extremos 5’ sobresalientes del sitio HindIII más una base en dirección 3’ de uno de los sitios HindIII, de la siguiente manera:

AGCCA	+	AGCTTGGCG	=	AGCCAGGCG
TCGGTTCGA		ACCGC		TCGGTCCGC

(las bases perdidas están subrayadas). Un análisis adicional mostró que no se habían perdido, o se habían perdido muy pocas secuencias del ADN plasmídico alrededor de los sitios HindIII, que flanquean el genoma de la planta. Aunque las otras plantas no se ensayaron en este sentido, los ensayos PCR y NPTII mostraron que los genes quiméricos se encuentran presentes y expresados.

Las plantas adultas eran fértiles y completamente normales desde el punto de vista fenotípico. Una de las plantas, que se ensayó previamente mediante hibridación Southern, se utilizó como una planta polinizadora en un cruzamiento con una planta no transformada de la progenie H99 consanguínea de maíz. Un total de 20 plantas de la progenie F1 se ensayaron en cuanto a la actividad NPTII tal como se ha descrito anteriormente, y seis de ellas se encontraron positivas. Esto no difiere significativamente de la relación 1:1 esperada bajo segregación mendeliana normal, suponiendo que la planta polinizadora transformada tenía una copia activa del gen neo quimérico (X^{2}=3,2).

Ejemplo 5 Transformación del maíz con un gen de esterilidad masculina y un marcador seleccionable mediante electroporación génica del ADN a embriones zigóticos inmaduros

Embriones zigóticos inmaduros de aproximadamente 1 a 1,5 mm se aislaron a partir de las semillas en desarrollo de la progenie consanguínea H99 del maíz. Embriones recién aislados se trataron enzimáticamente y se lavaron tal como se describe en el Ejemplo 1. Después del lavado, los embriones se cargaron en el tampón de electroporación del maíz, EPM-KCl (80 mM KCl, 5 mM CaCl_{2}, 10 mM HEPES y 0,425 M de manitol, pH 7,2). Se cargaron aproximadamente en cada cubeta 100 embriones en 200 \mul de EPM-KCl. Se añadieron por cubeta, alrededor de 20 \mug de un ADN plasmídico, pVE107 linealizado con HindIII. pVE107 es un plásmido de 6659 pares de bases que se obtiene mediante unión del fragmento EcoRV-EcoRI de pTTM8 de 1287 pares de bases (documento EP 344029; Sec Id. No 3) al gran fragmento XbaI (relleno con Klenow)-EcoRI del plásmido pDE108 (Sec. Id. No.1). El pVE107 contiene: un gen quimérico que comprende el gen de la resistencia a la kanamicina (neo) bajo el control del promotor 35S3; y otro gen quimérico que comprende el gen de barnasa (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202:913) bajo el control del promotor específico de tapetum del gen TA29 de Nicotiana tabacum (documento EP 344029).

Todas las construcciones vectoriales que implican fragmentos del gen barnase se realizaron en la cepa WK6 de E. coli que contiene el plásmido pMc5BS. pMc5BS contiene el gen barstar (que codifica un inhibidor de barnase) bajo el control del promotor tac (De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21). Este plásmido se construye: clonando el fragmento EcoRI-HindIII del plásmido pMT416 (véase Hartley (1988) más arriba) en los sitios EcoRI e HindIII del plásmido pMc5-8 (DSM 4566); y a continuación suprimiendo la secuencia, empezando con el codón de iniciación de la secuencia señal phoA y finalizando con el último nucleótido antes del codón de iniciación de la traducción de la región codificante barstar, mediante un procedimiento de mutagénesis en bucle tal como se describe generalmente por Sollazo et al. (1985) Gene 37:199.

Después de una incubación de una hora del ADN con los explantes, las cubetas se transfirieron a un baño de hielo. Después de 10 minutos de incubación en hielo, la electroporación se realizó tal como se describe en el Ejemplo 1. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió un sustrato de N6aph líquido recién preparado a los explantes en la cubeta, después de lo cual los explantes se incubaron durante un período de otros 10 minutos en hielo.

Seguidamente, los embriones se transfirieron al sustrato Mahl VII suplementado con 0,2 M de manitol y 200 mg/l de kanamicina. Después de aproximadamente 14 días, los embriones se transfirieron al sustrato Mahl VII sin manitol, pero con el mismo agente selectivo, kanamicina. Los embriones se subcultivaron posteriormente en este sustrato selectivo durante aproximadamente 2 meses con intervalos de subcultivo de alrededor de 3 a 4 semanas. El tejido embriogénico inducido se aisló cuidadosamente y se transfirió al medio MS (Murashige y Skoog (1962) más arriba) suplementado con 5 mg/l de 6-bencilaminopurina. Se mantuvo el tejido embriogénico en este medio durante aproximadamente 14 días, y se transfirió posteriormente a medio MS sin hormonas y sin sacarosa. Se transfirieron los brotes en desarrollo a medio 1/2 MS con sacarosa al 1,5% para desarrollo ulterior a plántulas normales. Estas se transfirieron al suelo y se cultivaron en el invernadero.

Ejemplo 6 Caracterización de las plantas de maíz transformadas del Ejemplo 5

Siete plantas del Ejemplo 5, denominadas RZM19-2, RZM19-3, RZM19-4, RZM19-5, RZM19-6, RZM19-7 y RZM19-8, derivaron del mismo grupo de callos embriogénicos. Se sometieron a un extenso análisis Southern. A este respecto, el ADN genómico de las plantas digerido con BamHI-NcoI se sondó con pVE107 y con el fragmento pequeño EcoRV-XbaI de pTTM8 (que contiene PTA29-barnasa; véase Sec. Id. No 3). En todas las plantas, la banda más intensa detectada fue el fragmento esperado de 1400 pares de bases. Sin embargo, el patrón encontrado en estas transferencias Southern y en otras fue muy complejo e indicaba que la transformación había producido muchas inserciones de la totalidad o parte de pVE107 en los genomas de las plantas. Algunas de las copias insertas de pVE107 estaban aparentemente incompletas y/o habían sufrido reorganizaciones. Sin embargo, se encontró el mismo patrón complejo de integración en las siete plantas. Esto podría explicarse por el hecho de que los siete transformantes derivaban todos de un grupo del callo embriogénico.

Las plantas transformadas eran masculinas estériles, pero por lo demás completamente normales desde el punto de vista fenotípico; la fertilidad de la planta hembra, por ejemplo, fue normal. Las espiguillas de las flores masculinas eran de una longitud aproximadamente normal, pero eran muy delgadas y parecían estar vacías, no abriéndose nunca. Un análisis detallado mostró que las anteras estaban reducidas a estructuras casi microscópicas. Este fenotipo indica no sólo que se expresaba por lo menos una copia del gen barnasa, sino que también se expresó selectivamente en algunos o todos los tejidos de las anteras.

El transformante RZM19-3 fue polinizado con polen de una planta H99 no transformada, y se recuperó una progenie de 53 plántulas. De estas 53 plántulas, 32 (el 60%) dieron positivo en un ensayo NPTII, mientras que 21 (el 40%) fueron NPTII negativas. Esta proporción en la progenie F1 no difiere significativamente de la relación 1:1 esperada bajo la segregación mendeliana normal, suponiendo que la hembra parental transformada tenía una copia activa del gen quimérico neo (X^{2}=2,28). La progenie negativa NPTII fue masculina fértil, mientras que la progenie positiva NPTII fue masculina estéril.

Treinta y una plantas de la progenie NPTII positiva se sometieron a análisis Southern. Veintiocho de dichas plantas mostraron el mismo patrón de integración que el del transformante original, RZM19-3, del cual derivaron. Tres plantas presentaron un patrón ligeramente alterado.

Ejemplo 7 Transformación del maíz con un gen de esterilidad masculina y un gen de resistencia al herbicida mediante electroporación del ADN en los embriones inmaduros zigóticos

Embriones zigóticos de la progenie consanguínea del maíz H99 se aislaron, se trataron enzimáticamente, se lavaron y se cargaron en un tampón de electroporación tal como se describe en el Ejemplo 5. Se cargaron en cada cubeta aproximadamente 100 embriones en 200 \mul de EMP-KCl. Se añadieron alrededor de 20 \mug por cubeta de un ADN plasmídico, pVE108 linealizado con HindIII. pVE108 es un plásmido de 5620 pares de bases que se obtiene mediante unión del fragmento EcoRV-EcoRI de pTTM8 de 1287 pares de bases (documento EP 344029; Sec. Id. No 3) al gran fragmento EcoRI-StuI del plásmido pDE110 (Sec. Id. No. 4). pVE108 contiene: un gen quimérico que comprende el gen bar (documento EP 242236), que codifica la fosfinotricina acetil transferasa (PAT) y que confiere resistencia a un inhibidor herbicida de la glutamina sintetasa tal como la fosfinotricina (PPT), bajo el control del promotor 35S3; y otro gen quimérico que comprende el gen barnasa (Hartley (1988) más arriba), bajo el control del promotor del gen TA29 específico de tapetum (documento EP 344029) de N. tabacum. Todas las construcciones vectoriales que implican fragmentos del ADN que comprenden el gen barnasa se realizaron en la cepa WK6 de E. coli que contiene el plásmido pMc5BS del Ejemplo 5.

Después de una incubación de una hora del ADN con los explantes, las cubetas se transfirieron a un baño de hielo. Después de 10 minutos de incubación en hielo, la electroporación se realizó tal como se describe en el Ejemplo 1. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió un sustrato de N6aph líquido recientemente preparado a los explantes en la cubeta, después de lo cual los explantes se incubaron durante un período de otros 10 minutos en hielo.

Seguidamente, los embriones de un experimento de electroporación se transfirieron al sustrato Mahl VII suplementado con 0,2M de manitol y 2 mg/l de PPT. Después de aproximadamente 14 días, los embriones se transfirieron al sustrato Mh1 VII (sustrato Mahl VII del Ejemplo 1 pero sin prolina e hidrolizado de caseína), suplementado con 2 mg/l de PPT pero sin manitol. Después de aproximadamente 4 semanas, los embriones se subcultivaron durante otro mes en sustrato Mh1 VII suplementado con 10 mg/l de PPT. El tejido embriogénico inducido se aisló cuidadosamente y se transfirió al medio MS suplementado con 5 mg/l de 6-bencilaminopurina. Se mantuvo el tejido embriogénico en este medio durante aproximadamente 14 días, y se transfirió posteriormente a medio MS sin hormonas y sin sacarosa. Se transfirieron los brotes que se desarrollaban a medio 1/2 MS con sacarosa al 1,5% para desarrollo ulterior a plántulas normales. Estas sobrevivieron a un rociado in vitro con dosis del herbicida BASTA® (Hoechst AG, Frankfurt am Main, Alemania) que corresponden a 2 l/ha. Estas plántulas se transfirieron entonces al suelo y se cultivaron en el invernadero, y dos de las plántulas transformadas, denominadas RZM35-1 y RZM35-18, se caracterizaron posteriormente (véase el ejemplo 8).

Los embriones procedentes de un segundo experimento de electroporación se transfirieron al sustrato Mh1 VII suplementado con 2 mg/l de PPT y 0,2 M de manitol. Después de aproximadamente 14 días, los embriones se transfirieron al sustrato Mh1 VII suplementado con 2 mg/l de PPT pero sin manitol. Después de aproximadamente otras tres semanas, los embriones se transfirieron a sustrato Mh1 VII suplementado con 10 mg/l de PPT pero sin manitol. Después de otras tres semanas, el tejido embriogénico inducido se aisló cuidadosamente y se transfirió al medio MS suplementado con 2 mg/l de PPT y 5 mg/l de 6-bencilaminopurina. Se mantuvo el tejido embriogénico en este medio durante aproximadamente 14 días, y se transfirió posteriormente a medio MS sin hormonas, sacarosa ni PPT. Se transfirieron los brotes que se desarrollaban a medio 1/2 MS con sacarosa al 1,5% para desarrollo ulterior a plántulas normales. Estas plántulas resultantes se transfirieron al suelo y se cultivaron en el invernadero, y tres de las plántulas trans-
formadas, denominadas RZM34-1, RZM34-12 y RZM34-14, se caracterizaron posteriormente (véase el Ejemplo 8).

Ejemplo 8 Caracterización de las plantas de maíz transformadas del Ejemplo 7

RZM34-1, RZM34-12, RZM34-14, RZM35-1 y RZM35-18 del Ejemplo 7 se desarrollaron en el invernadero. La actividad del producto de expresión del gen bar en las hojas de las plantas se ensayó de la manera siguiente en un "ensayo PAT". Cien mg de tejido foliar de cada planta, junto con 50 mg de arena marina tratada con ácido (Merck, Darmstadt, Alemania) y 5 mg de polivinilpolipirrolidona (PVPP) se molieron en un tubo Eppendorf con una varilla de vidrio en 50 \mul de tampón de extracción (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM Na_{2}-EDTA (sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético), 0,15 mg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,3 mg/ml de ditiotreitol (DTT) y 0,3 mg/ml de albúmina sérica bovina). Se centrifugó el extracto en una microcentrífuga durante 5 minutos a 16.000 rpm. El sobrenadante se recuperó y se diluyó diez veces con TE 25/1 (25 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM Na_{2}-EDTA. A 12 \mul del extracto diluído se añadieron entonces: 1 \mul de 1 mM de PPT en TE 25/1, 1 \mul de 2 mM de acetilcoenzima A en TE 25/1, y 2 \mul de [^{14}C]-acetilcoenzima A (60 mCi/mmol, 0,02 mCi/ml, [NEN Research Products, DUPONT, Wilmington, Delaware, Estados Unidos de América]. La mezcla reactiva se incubó durante 30 minutos a 37°C y se roció sobre una placa de silicagel de hoja de aluminio de 60 t.l.c. con zona de concentración (Merck). Se realizó una cromatografía ascendente en una mezcla 3/2 de 1-propanol y NH_{4}OH (25% NH_{3}). El ^{14}C se visualizó mediante autorradiografía nocturna (película XAR-5 Kodak).

La tolerancia al herbicida BASTA® se ensayó frotando un área pequeña cercana al ápice de una hoja por cada planta con una disolución del herbicida al 1%, y observando los síntomas de daño en y cerca de los sitios frotados. Mientras que RZM34-1, RZM35-1 y RZM35-18 no mostraron en absoluto síntomas de daño, RZM34-12 y RZM34-14 mostraron una ligera coloración pardusca y una sequedad del sitio rozado.

RZM34-1, RZM34-12, RZM34-14, RZM35-1 y RZM35-18 mostraron asimismo que eran estériles masculinos. El fenotipo de cada una de estas plantas fue idéntico al descrito para los transformantes del Ejemplo 5, que se analizaron en el Ejemplo 6.

El análisis Southern mostró que RZM35-1 y RZM35-18 tenían un patrón de integración idéntico, con sólo una copia del plásmido pVE108 presente en el genoma de cada uno. Una pequeña parte de la secuencia del ADN plasmídico adyacente al sitio HindIII (utilizada para linealización previa a la electroporación) pareció estar ausente en la copia integrada. El análisis Southern de RZM34-1, RZM34-12 y RZM34-14 mostró que cada una de estas plantas tiene probablemente dos o tres copias de una parte o de la totalidad del pVE108 integrado en su genoma. Es muy probable que las copias no se inserten en una configuración concatémera.

Los transformantes RZM35-1 y RZM34-1 fueron polinizados con polen procedente de una planta H99 no transformada, y se recuperaron las plántulas de la progenie. De las 35 plántulas recuperadas a partir de RZM35-1, 16 (el 46%) dieron positivo en un ensayo PAT, mientras que 19 (el 54%) fueron PAT negativas. Esta proporción en la progenie F1 no difiere significativamente de la relación 1:1 esperada bajo la segregación mendeliana normal de una copia activa del gen quimérico bar (X^{2}=0,26).

De las 34 plántulas recuperadas de RZM34-1, 19 (el 56%) dieron positivo en un ensayo PAT, mientras que 15 (el 44%) fueron PAT negativas. Esta proporción en la progenie F1 no difiere significativamente de la relación 1:1 esperada bajo la segregación mendeliana normal, suponiendo que la hembra parental transformada tenía una copia activa, o alternativamente múltiples copias activas pero estrechamente ligadas, del gen quimérico bar (X^{2}=0,47).

Ejemplo 9 Transformación de arroz con un gen de resistencia a herbicida mediante electroporación de ADN en callo embriogénico compacto derivado de semillas secas

Se esterilizaron en su superficie semillas maduras sin cáscara de la variedad de cultivo Nipponbare de arroz, se colocaron en medio 2N6 sólido (medio N6 (Chu et al. (1975) más arriba) suplementado con 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina-HCl, 1,0 mg/l de tiamina-HCl, 2,0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa y 2,0 g/l de Phytagel, pH 5,8), y se cultivaron a 27ºC en la oscuridad. El callo se desarrolló a partir de los escudetes de los embriones en 3-4 semanas. Las porciones embriogénicas del callo primario se transfirieron a medio N67 (medio N6 (Chu et al. (1975) más arriba), suplementado con 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina-HCl, 1,0 mg/l de tiamina-HCl, 2,0 g/l de casaminoácidos (ensayo de vitamina, Difco), 1,0 mg/l de 2,4-D, 0,5 mg/l de 6-bencilaminopurina, 20 g/l de sacarosa, 30 g/l de sorbitol y 2,0 g/l de Phytagel, pH 5,8) para la preparación en callo embriogénico compacto.

Tres a cuatro semanas después del subcultivo, el callo embriogénico se uso para experimentos de transformación. El callo se cortó en fragmentos con una longitud máxima de alrededor de 0,2 a 2 mm. Los trozos de callo se lavaron dos veces en EPM, y después se preplasmolizaron en este tampón durante 30 minutos hasta 3 horas a temperatura ambiente (25ºC). Después, los fragmentos del callo se lavaron 2 veces con EPM-KCl y se transfirieron a cubetas de electroporación, cada cubeta se cargó con alrededor de 150 a 200 mg de fragmentos de callo en 100 a 200 \mul de EPM-KCl. Se añadieron por cubeta 10 a 20 \mug de un ADN plasmídico, ya sea pDE110 circular o pDE110 linealizado con HindIII o EcoRI. El pDE110 es un plásmido de 4883 pares de bases, cuya secuencia completa se expone en Sec Id Nº4, y que contiene un gen quimérico que comprende el gen bar bajo el control del promotor
35S3.

El ADN se incubó con los fragmentos del callo durante alrededor de una hora a temperatura ambiente. La electroporación se llevó a cabo entonces como se describe en el Ejemplo 1. Después de la electroporación, se añadió a los fragmentos del callo medio N67 líquido sin casaminoácidos. Los fragmentos del callo se cultivaron entonces en placas en medio N67 sólido sin casaminoácidos pero suplementado con 5, 10 ó 29 mg/l de PPT, y se cultivaron en este medio selectivo a 27ºC en un regimen de luz/oscuridad de 16/8 horas durante alrededor de 4 semanas. Los callos en desarrollo resistente a PPT se aislaron y se subcultivaron durante alrededor de dos a tres semanas sobre medio N67 reciente sin casaminoácidos pero que contiene 5 mg/l de PPT. Después, los callos seleccionados resistentes a PPT se transfirieron a medio N6M25 de regeneración de plantas (medio N6 (Chu et al. (1975) más arriba) suplementado con 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina-HCl, 1,0 mg/l de tiamina-HCl, 288 mg/l de ácido aspártico, 174 mg/l de arginina, 7,0 mg/l de glicina, 1,0 mg/l de ácido O-naftalenacético (NAA), 5,0 mg/l de cinetina, 20 g/l de sacarosa y 2,0 g/l de Phytogel, pH 5,8) suplementado con 5 mg/l de PPT. Las plántulas se desarollaron en aproximadamente un mes y entonces se transfirieron a medio N6 (Chu et al. (1975) más arriba) libre de hormonas, suplementado con 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina-HCl, 1,0 mg/l de tiamina-HCl, 1,0 mg/l de casaminoácidos, 20 g/l de sacarosa y 2,0 g/l de Phytogel, pH 5,8 sobre el cual se mantuvieron durante otras dos a tres semanas, después de lo cual se transfirieron al suelo y se cultivaron en el invernadero.

Las composiciones de los medios 2N6, N67, N6M25 y N6 libre de hormonas, descritos anteriormente, se proporcionaron amablemente por Japan Tobacco Inc., Plant Breeding and Genetics Research Laboratory, 700 Higashibara, Toyoda, Iwata, Shizuoka 438, Japón.

Ejemplo 10 Caracterización de las plantas de arroz transformadas del Ejemplo 9

Se cultivaron durante cuatro semanas en suelo dos plantas de arroz transformadas del Ejemplo 9, obtenidas en diferentes experimentos de transformación, y después se pulverizaron con BASTA® a una dosis que corresponde a 2 l/ha. Las dos plantas fueron resistentes a BASTA® y sobrevivieron al tratamiento con el herbicida, mientras que las plantas de control no transformadas se pusieron marrones y murieron a los cuatro días de la pulverización del herbicida.

Las dos plantas y otras cuatro plántulas in vitro, derivadas de otros dos experimentos de transformación del Ejemplo 9, se analizaron por medio de una hibridación Southern en la que el ADN genómico de la planta digerido con PvuII, se sondó con pDE110. Este análisis mostró que, en todas las plantas analizadas, se integro en el genoma al menos parte de una copia de pDE110. En cinco de las seis plantas, se pudo identificar sin ambigüedad el fragmento de 1,6 kb correspondiente al fragmento de pDE110 que contiene la mayor parte del gen quimérico 35S-bar.

Ejemplo 11 Ensayos de campo con las plantas de maíz transformadas de los Ejemplos 2 y 4

La progenie del transformante de maíz H99-M148-1 del Ejemplo 2 y del transformante de maíz Pa91-M146-2 del Ejemplo 4 se ensayaron bajo condiciones de campo en la granja experimental de Plant Genetic Systems, N.V., en Afsnee, Bélgica. La prueba de campo fue autorizada por el Ministerio Belga de Agricultura con el número de registro BIOT/91/M06. La progenie de F1, F2 y F3 se obtuvo a partir de cruzamientos tal como se sumariza en la siguiente Tabla 1. En todos los casos se supuso que uno de los padres era heterozigótico para el gen neo.

Se plantaron hasta 100 semillas de cada lote de semillas en 5 filas paralelas, cada una con una longitud de 5 metros. Las plantas individuales estaban separadas 0,25 m, y la distancia entre las filas fue de 1 m. Se alternaron 10 filas de plantas experimentales con 1 fila de H99 no transformadas y 1 fila de plantas Pa91 no transformadas, como controles. Una parcela estaba formada por plantas experimentales F1 y F2 con controles. Cada una de estas parcelas estaba rodeada por i) un sendero con una anchura de 1 m y ii) 3 filas (separadas 1 m) de plantas de maíz no transformadas (variedad Sanora).

Se prepararon parcelas experimentales, se sembraron y se conservaron según el esquema de la Tabla 2 que sigue. Para plantar, los hoyos de las plantas se realizaron con estacas, y las semillas se depositaron manualmente en ellos hasta una profundidad de 4 a 5 cm.

El ensayo de campo finalizó mediante la eliminación manual y la quema de todas las mazorcas de las plantas experimentales. Los restos de las plantas se cortaron mecánicamente con una máquina segadora.

Se realizaron las siguientes observaciones. En el estadio de 2-3 hojas, el número total de semillas germinadas se contó para cada lote de semillas. Como puede apreciarse en la Tabla 3, que sigue, el porcentaje de germinación varió entre el 63% y el 100%, con excepción del lote de semillas P4482, del cual sólo germinaron el 42% de las semillas. La germinación de los lotes de semillas de las plantas H99 y Pa91 no transformadas varió entre el 25% y el 75%.

En el estadio de 3-4 hojas, el fenotipo del gen transgénico neo se ensayó de la manera siguiente. En cada planta, se realizó un corte con unas tijeras pequeñas por encima de la vena central de dos hojas. Los cortes se frotaron entonces con un trozo de lana de algodón empapado en una suspensión acuosa de kanamicina al 4% y SDS al 0,2%. Algunas plantas se trataron con una suspensión de kanamicina al 5% y SDS al 0,1%. Una planta se clasificó como sensible y falta de un gen neo activo cuando las hojas nuevamente formadas fueron amarillas. Una planta se clasificó como resistente y por tanto, con un gen neo activo, cuando las hojas recién formadas eran normales y no mostraban decoloración. La decoloración de las hojas recién formadas se verificó a los 10 días aproximadamente después de haberlas frotado. El 5-8% de las plantas ensayadas tenían un fenotipo intermedio, pues no podían clasificarse sin ambigüedad ni como sensibles ni como resistentes. Esto se debió probablemente a variaciones en las condiciones ambientales y/o a estadios de desarrollo de las plantas ensayadas y una concentración de kanamicina (y/o SDS) menor que la óptima.

En los análisis últimos, los fenotipos intermedios se agruparon con las plantas sensibles. Las proporciones de las plantas resistentes a la kanamicina respecto a las plantas sensibles a ésta (incluyendo los fenotipos intermedios) para cada cruzamiento o autocruzamiento se determinaron mediante una prueba chi-cuadrado de la bondad del ajuste (Snedecor y Cochran (1967) "Statistical Methods", the Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA), suponiendo una segregación mendeliana de un locus del gen neo. Los resultados se sumarizan en la Tabla 3, que sigue.

De los datos de la Tabla 3, puede concluirse que el gen neo introducido permaneció estable durante tres generaciones independientemente de si la progenie se obtuvo mediante el autocruzamiento, el retrocruzamiento, o el cruzamiento con una progenie no relacionada. El patrón de segregación estuvo de acuerdo con cada transformante original que había tenido sólo una copia activa o múltiples copias activas estrechamente relacionadas del gen neo y con la característica del gen neo que había tenido una herencia normal mendeliana de un locus.

En todos los casos, las plantas experimentales parecieron ser, morfológicamente, completamente normales respecto a las plantas de control no transformadas.

TABLA 1

	Cruzamiento	Lote de semillas
F1	H99 x H99-M148-1	P3166
	Pa91 x H99-M148-1	P3169
	H99 x Pa91-M146-2	P3162
	Autocruzamiento de Pa91-M146-2	P3173 (1)
F2	P3169-024 x H99	P3651
	Autocruzamiento de P3166-002	P3989
	P3166-012 x H99	P3983
	P3166-018 x H99	P3982
	Autocruzamiento de P3173-003	P3996
	P3162-017 x H99	P4004
	P3162-008 x Pa91	P4008
F3	H99 x (P3166-005 x H99)-001	P4481
	H99 x (P3162-004 x H99)-011	P4483
	Autocruzamiento de (Autocruzamiento de P3166-001)-003	P4482
	Pa91 x (P3169-028 x Pa91)-004	P4310
	H99 x (P3169-036 x H99)-003	P4306
(1) No ensayado

TABLA 2

Fecha	Actividad	Cantidad
29 Marzo, 1991	Abono con cal del suelo	2000 kg/ha
23 Mayo, 1991	tratamiento con NH_{4}NO_{3}	740 kg/ha
23 Mayo, 1991	tratamiento con superfosfato	833 kg/ha
23 Mayo, 1991	sulfato de potasio	120 kg/ha
27 Mayo, 1991	sembrado de lotes de semilla F1 y F2	-
4 Julio, 1991	tratamiento con herbicida:
	\hskip0.35cm Laddok	4 l/ha
	\hskip0.35cm aceite de parafina	105 l/ha
8 Julio, 1991	sembrado de lotes de semillas de F3	-
26 Julio, 1991	Tratamiento insecticida:
	\hskip0.35cm Pyrimor	0,265 kg/ha
	\hskip0.35cm Ambush	0,133 l/ha
10 Octubre, 1991	finalización	-

TABLA 3

	Código	Emerg.	%	T	R	I	S	ND	X^{2}	Sign.
F1	P3169	16/20	5	16	5	6	4	1	1,67	n.s.
	P3166	79/100	4	79	36	0	35	8	0,01	n.s.
	P3162	86/100	4	84	47	1	31	3	2,85	n.s.
F2	P3651	65/100	4	62	26	11	16	9	0,02	n.s.
	P3989	91/100	4	83	66	1	10	5	4,71	p<0,05
	P3983	36/40	4	34	17	2	14	1	0,03	n.s.
	P3982	51/60	4	42	20	4	17	1	0,02	n.s.
	P3996	54/60	4	48	32	0	11	5	0,01	n.s.
	P4004	92/100	4	86	38	11	31	6	0,20	n.s.
	P4008	20/20	4	18	6	9	3	0	2,00	n.s.
F3	P4481	72/100	5	66	32	2	30	2	0	n.s.
	P4483	63/100	5	47	22	2	23	0	0,19	n.s.
	P4482	42/100	5	34	30	0	4	0	3,18	n.s.
	P4310	84/100	5	82	50	7	24	1	4,46	p<0,05
	P4306	85/100	5	79	39	1	39	0	0,01	n.s.
\begin{minipage}[t]{155mm} Código = lote de semillas (véase Tabla 1); Emerg = número de plantas por número de semillas sembradas; % = porcentaje de kanamicina en disolución utilizada en el ensayo de frotamiento; T= número total de plantas ensayadas; R = número de plantas resistentes a la kanamicina; I = número de fenotipos intermedios; S = número de plantas sensibles a la kanamicina; ND = número de plantas ensayadas que no se clasificaron debido a que las plantas detuvieron su crecimiento y murieron; X^{2} = valor de chi cuadrado para la segregación de R respecto a I+S (valores esperados en cruzamientos externos son 50% R-50% I+S; valores esperados en los autocruzamientos son 75% R-25% I+S, suponiendo la segregación de un locus).\end{minipage}

1. INFORMACIÓN GENERAL

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i)

SOLICITANTE: PLANT GENETIC SYSTEM N.V.

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ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento para transformar plantas monocotiledóneas.

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iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

\vskip0.800000\baselineskip

iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

A.

DESTINATARIO: Plant Genetic Systems, N.V.

\vskip0.500000\baselineskip

B.

CALLE: Plateaustraat 22,

\vskip0.500000\baselineskip

C.

CÓDIGO POSTAL Y CIUDAD: 9000 Gante

\vskip0.500000\baselineskip

D.

PAÍS: Bélgica

\vskip0.800000\baselineskip

v)

FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

A.

TIPO DE MEDIO: disco blando de 5,25 pulgadas, impreso en ambas caras, de alta densidad, de 1,2 Mb.

\vskip0.500000\baselineskip

B.

ORDENADOR: IBM PC/AT

\vskip0.500000\baselineskip

C.

SISTEMA OPERATIVO: DOS versión 3.3

\vskip0.500000\baselineskip

D.

SOFTWARE: WordPerfect

\vskip0.800000\baselineskip

vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: No disponibles

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vii)

DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

\vskip0.800000\baselineskip

Solicitud de patente europea nº 91401888.2 del 8 de julio de 1991.

\vskip0.800000\baselineskip

Solicitud de patente europea nº 90403332.1 del 23 de noviembre de 1990.

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2. INFORMACIÓN PARA SEC. ID. NO. 1

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i)

Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A.

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

B.

LONGITUD : 5399 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

C.

TIPO DE FILAMENTO: bicatenario

\vskip0.500000\baselineskip

D.

TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

ii)

TIPO MOLECULAR: pDE108: ADN plasmídico replicable en E. coli.

\vskip0.800000\baselineskip

ix)

Características:

	1-451:	secuencia derivada de pUC18
	452-1284:	secuencia del promotor "35S3" derivado del aislado CabbB-JI del virus del mosaico
		de la coliflor.
	1285-2100:	secuencia codificante del gen de la neomicina fosfotransferasa.
	2101-3160:	secuencia reguladora en 3’ que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen
		octopina sintasa del ADN T de Agrobacterium.
	3161-5399:	secuencia derivada de pUC18.

\vskip0.800000\baselineskip

Otra información: el plásmido es replicable en E. coli, confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina.

\vskip0.800000\baselineskip

xi)

Descripción de la secuencia

1

2

3

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3. INFORMACIÓN PARA SEC. ID. NO. 2

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i)

Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A.

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

B.

LONGITUD: 1186 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

C.

TIPO DE FILAMENTO: bicatenario

\vskip0.500000\baselineskip

D.

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii)

TIPO MOLECULAR: ADN utilizado como sonda para el gen neo

\vskip0.800000\baselineskip

ix)

Características:

	1-8:	secuencia derivada del promotor específico del tapetum de Nicotiana tabacum.
	9-790:	secuencia codificante del gen de la neomicina fosfotransferasa.
	791-final:	secuencia reguladora en 3’ que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen 7
		de ADN T de Agrobacterium.

\vskip0.800000\baselineskip

xi)

Descripción de la secuencia

4

\vskip1.000000\baselineskip

4. INFORMACIÓN PARA SEC. ID. NO. 3

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i)

Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A.

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

B.

LONGITUD : 1287 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

C.

TIPO DE FILAMENTO: bicatenario

\vskip0.500000\baselineskip

D.

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii)

TIPO MOLECULAR: ADN que comprende un gen quimérico

\vskip0.800000\baselineskip

ix)

CARACTERÍSTICAS:

	1-545:	promotor del gen TA29 de Nicotiana tabacum.
	546-881:	secuencia codificante del gen barnasa
	882-final:	secuencia reguladora en 3’ que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen de
		la nopalina sintasa del ADN T de Agrobacterium.

\vskip0.800000\baselineskip

xi)

Descripción de la secuencia:

5

5. INFORMACIÓN PARA SEC. ID. NO. 4

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i)

Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A.

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

B.

LONGITUD: 4883 pares de bases

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C.

TIPO DE FILAMENTO: bicatenario

\vskip0.500000\baselineskip

D.

TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

ii)

TIPO MOLECULAR: pDE110: ADN plasmídico replicable en E. coli

\vskip0.800000\baselineskip

ix)

Características:

	1-395:	secuencia derivada de pUC18
	396-1779:	secuencia promotora "35S3" derivada del aislado CabbB-JI del virus del mosaico de
		la coliflor.
	1780-2331:	secuencia codificante del gen de la fosfinotricina acetiltransferasa.
	2332-2619:	secuencia reguladora en 3’ que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen
		nopalina sintasa del ADN T de Agrobacterium.
	2620-4883:	secuencia derivada de pUC18.

\vskip0.800000\baselineskip

Otra información: el plásmido es replicable en E. coli, confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina.

\vskip0.800000\baselineskip

xi)

Descripción de la secuencia

6

7

8

<110> Plant Genetic Systems N.V.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Procedimiento para transformar plantas monocotiledóneas

\vskip0.400000\baselineskip

<130> CEREALEPw4

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 99201052

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 21-11-1991

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 91401888.2

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 08-07-1991

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 90403332.1

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 23-11-1991

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5399

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: pDE108: ADN plasmídico repicable en E. coli, confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(451)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia derivada de pUC18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (452)..(1284)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia promotora "35S3" derivada del aislado CabbB-JI del virus del mosaico de la coliflor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1285)..(2100)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificante del gen de neomicina fosfotransferasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2101)..(3160)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia reguladora en 3’ que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen de octopina sintasa de ADN T de Agrobacterium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3161)..(5399)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia derivada de pUC18

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

9

10

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1186

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN usado como sonda para el gen neo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia derivada del promotor específico del tapetum de Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(790)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificante del gen de neomicina fosfotransferasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (791)..(1186)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia reguladora en 3’ que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen 7 de ADN

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

T de Agrobacterium

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

12

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1287

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN que comprende un gen quimérico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(545)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor procedente del gen TA29 de Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (546)..(881)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificante del gen de barnasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (882)..(1287)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia reguladora en 3’ que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen de nopalina

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

sintasa procedente de ADN T de Agrobacterium

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

13

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4883

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artifical

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: pDE110: ADN plasmídico repicable en E. coli, confiere a la bacteria resistencia a la ampicilina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(395)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia derivada de pUC18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (396)..(1779)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia promotora "35S3" derivada del aislado CabbB-JI del virus del mosaico de la coliflor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1780)..(2331)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia codificante del gen de fosfinotricina acetil transferasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2332)..(2619)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia reguladora en 3’ que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen de nopalina sintasa de ADN T de Agrobacterium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Características misc.

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2620)..(4883)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia derivada de pUC18

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

14

15

Claims (18)

1. Procedimiento para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de una planta de cereal, en el genoma nuclear de una planta de un cereal, comprendiendo dicho procedimiento:

a)

proporcionar un callo embriogénico compacto de una planta de cereal;

b)

herir y/o degradar dicho callo embriogénico compacto, y transferir dicho ADN al genoma nuclear de una célula en dicho callo embriogénico compacto, por medio de electroporación, bombardeo con microproyectiles revestidos con ADN, o por medio de una transformación mediada por Agrobacterium, para generar una célula transformada; y opcionalmente

c)

regenerar una planta de cereal transformada a partir de dicha célula transformada.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho callo embriogénico compacto es herido cortándolo, preferentemente en fragmentos de callo.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho callo embriogénico compacto es herido cortándolo en fragmentos de una longitud máxima de 0,5 a 2,5 mm.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho callo embriogénico compacto es herido cortándolo en fragmentos de una longitud máxima de 1 a 2 mm.

5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho callo embriogénico compacto es herido cortándolo en fragmentos de una longitud máxima de 1,25 a 1,75 mm.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho callo embriogénico compacto o sus fragmentos son heridos mediante tratamiento con un enzima capaz de degradar las paredes celulares de dicho callo o de sus fragmentos durante un periodo de tiempo, de forma que no cause una rotura completa de los tejidos.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho callo embriogénico compacto o sus fragmentos son tratados con dicha enzima durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a 10 minutos.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho callo embriogénico compacto o sus fragmentos son tratados con dicha enzima durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a 2 minutos.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho callo embriogénico compacto o sus fragmentos son sometidos a un período de plasmólisis previo a la transferencia de dicho ADN.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho ADN es transferido al genoma nuclear de una célula en dicho callo embriogénico compacto o en sus fragmentos, mediante electroporación.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) de dicho procedimiento se realiza mediante el bombardeo con microproyectiles revestidos con ADN.

12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho ADN es transferido al genoma nuclear de una célula en dicho callo de tipo I o sus fragmentos, mediante transferencia del ADN mediada por Agrobacterium.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho gen comprende el ADN que codifica barnasa bajo el control del promotor del gen TA29 del tabaco.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho promotor comprende la secuencia del ADN entre el nucleótido 1 y 545 de SEC ID. No 3.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho gen comprende el ADN que codifica una fosfinotricina acetiltransferasa o una neomicina fosfotransferasa.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha planta de cereal es arroz.

17. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha planta de cereal es trigo.

18. Uso de un callo embriogénico compacto de una planta de cereal como material de partida para transferir un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de una planta de cereal, por medio de electroporación, bombardeo con microproyectiles revestidos con ADN, o por medio de una transformación mediada por Agrobacterium, en el genoma nuclear de dicha planta de cereal.