ES2257797T3 - Procedimiento de separacion de plaquetas o de microparticulas de origen plaquetario a partir de una muestra que las contiene. - Google Patents
Procedimiento de separacion de plaquetas o de microparticulas de origen plaquetario a partir de una muestra que las contiene.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE SEPARACION DE PLAQUETAS O MICROPARTICULAS DE ORIGEN PLAQUETARIO A PARTIR DE UNA MUESTRA QUE LAS CONTIENE Y SE CARACTERIZA EN PARTICULAR PORQUE: A) SE CENTRIFUGA LA MENCIONADA MUESTRA EN UN RECIPIENTE QUE CONTIENE EN SU EXTREMO DISTAL UN GEL COMPACTO; DICHO GEL ES BASICAMENTE IMPERMEABLE A LA FASE LIQUIDA DE LA MUESTRA, PERO PUEDE SER PENETRADO EN LAS CONDICIONES DE CENTRIFUGACION POR LAS PLAQUETAS O LAS MICROPARTICULAS DE ORIGEN PLAQUETARIO; B) SE SEPARA EL SOBRENADANTE DE LA CENTRIFUGACION; Y C) SE RECUPERAN A CONTINUACION LAS PLAQUETAS O LAS MICROPARTICULAS DE ORIGEN PLAQUETARIO INCORPORADAS AL GEL.
Description
Procedimiento de separación de plaquetas o de
micropartículas de origen plaquetario a partir de una muestra que
las contiene.
La presente invención se refiere a la separación
de plaquetas o de micropartículas de origen plaquetario a partir de
una muestra biológica que las contiene.
La invención se aplica tanto a las plaquetas como
a las micropartículas de origen plaquetario. Por micropartículas de
origen plaquetario, se entiende una sub-unidad, o
vesiculación de la célula obtenida a partir de cualquier
tratamiento, mecánico o de otro tipo o incluso resultando de un
estado de activación celular o de un estado fisiopatológico
particular, tal como la apoptosis o la lisis celular o plaquetaria
por ejemplo.
A continuación en la descripción, el término
"células" se utilizará para designar indiferentemente, salvo
indicación contraria, los diferentes productos que se desea separar,
principalmente las plaquetas y las micropartículas de origen
plaquetario.
La presente invención tiene como objetivo
específico separar de una muestra las moléculas ligadas a unas
células, las mismas moléculas no ligados presentes en la fase
líquida, principalmente en forma soluble. Dichas moléculas pueden
ser por ejemplo unos marcadores celulares o unos elementos ligados a
la superficie de las células, tales como los anticuerpos, o unos
ligandos. En determinados casos, puede resultar interesante
dosificar a la vez el elemento ligado a unas células y el elemento
no ligado presente en la fase líquida, principalmente en forma
soluble, o incluso la relación entre los dos.
Cuando se efectúan las dosificaciones de
marcadores celulares en las muestras sanguíneas, es necesario
separar las células del medio que presentan dichos marcadores, de
los propios marcadores presentes en estado soluble y por lo tanto
son susceptibles de falsear las dosificaciones posteriores.
El procedimiento más comúnmente utilizado para
separar las células consiste en centrifugar la muestra después de un
tratamiento eventual previo.
Se obtiene de este modo un precipitado que
contiene las células y sobre el que se fijan las moléculas ligadas,
las moléculas no ligadas permanecen en el sobrenadante (que se puede
eliminar mediante cualquier procedimiento, principalmente por
aspiración/decantación).
Sin embargo, en el momento de la centrifugación,
el precipitado celular tiende a aprisionar unas moléculas no
ligadas, es por lo tanto necesario resuspender el precipitado en
varias etapas con el fin de efectuar unos lavados para reducir
significativamente la concentración residual de las moléculas no
ligadas. De este modo, y de forma característica, es necesario
efectuar por lo menos tres lavados a una dilución al 1/10 en cada
etapa (100 \mul residuales diluidos hasta 1 ml) para reducir en 3
log (1000) veces la concentración residual de las moléculas
no
ligadas.
ligadas.
Dichas centrifugaciones repetidas adolecen, por
supuesto, de numerosos inconvenientes de entre los cuales:
- -
- pérdida de células;
- -
- fragilización de las células;
- -
- formación de agregados entre las células que son a veces difícilmente reversibles, se trata en particular de las células que tienen tendencia principalmente a adherirse entre ellas y en particular las plaquetas;
- -
- la longitud del procedimiento y la pesadez de la manipulación. En efecto, tres lavados incluso con una centrifugación corta (5 min) necesitan en total aproximadamente 30 min. de tratamiento;
- -
- los enlaces son inestables; las enlaces de tipo ligando/receptor, anticuerpo/antígeno, enzima/sustrato son reversibles y la disociación de las moléculas ligadas es más marcada cuanto más se alarga el tiempo de lavado. Los tiempos de lavado largos representan por lo tanto un defecto más marcado del procedimiento cuanto más débil es la afinidad del par del enlace (velocidad de disociación rápida). En dicho caso resulta indispensable:
- -
- acortar el tiempo de lavado;
- -
- reducir el volumen de la fase líquida residual en contacto con las moléculas ligadas a las células, pero es lo que también reduce la eficacia del lavado.
- -
- Por último, se indica en el caso de las manipulaciones de materiales infecciosos, la formación de aerosoles que es por supuesto deseable evitar, si es posible.
En el caso particular de las plaquetas, las
centrifugaciones repetidas inducen además unos problemas citados
anteriormente, una agregación y una activación que son siempre muy
perjudiciales para las dosificaciones posteriores y que, en
cualquier caso modifican las propiedades biológicas de las plaquetas
después de las diferentes etapas de centrifugación.
Es la razón por la, desde hace mucho tiempo se ha
intentado aportar unas modificaciones al procedimiento conocido con
el fin de resolver algunos de los inconvenientes citados
anteriormente.
Se ha propuesto en particular realizar unas
centrifugaciones sobre un lecho de suero, que son menos traumáticas
para las células pero que de hecho son evidentemente mucho más caras
y sobre todo más delicadas de utilizar, lo que hace que dicho
procedimiento no se haya utilizado.
Se han previsto asimismo las centrifugaciones a
través de una fase oleosa hidrófoba (ver principalmente P. Poncelet
and P. Carayon, J. Immunol. Methods (1985), 85,
65-74 y Titus JA et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 78, 519). Dicha estrategia, que se utiliza sobre todo para
las mediciones de radio-inmunología, presenta un
determinado número de ventajas. Resulta extremadamente eficaz para
separar las moléculas libres que quedan en la fase acuosa y las
moléculas ligadas que son arrastradas en la fase hidrófoba con las
células; la separación es rápida, del orden de 2 min. y la
concentración residual de moléculas no ligadas, menos del 1%. Además
existe poca disociación de las moléculas ligadas en el tiempo
después de la separación.
Sin embargo hay que destacar que cuando se desea
someter a las células preparadas de este modo a una citometría de
flujo, a microscopia o a unos ensayos de actividad biológica o
incluso a unas pasadas en cultivo, dicha técnica evidentemente hace
que las células, una vez pasadas en el aceite, no se puedan utilizar
más. Además, en el caso de las plaquetas, el contacto con un aceite
mineral genera una activación/agregación que por supuesto las hace
totalmente inadecuadas para cualquier tratamiento posterior.
Asimismo se han previsto unos lavados sobre
soportes filtrantes, por ejemplo por depresión. La ventaja es que
en dicho caso hay menos manipulación. Se pueden tratar las grandes
series y esto es fácilmente adaptable a las "selecciones", los
lavados son eficaces y rápidos, lo que es ventajoso, el principal
defecto es la no disponibilidad de las células (excluida la
recuperación) para unos análisis tales como los citados
anteriormente.
Se han descrito en la técnica anterior, unos
procedimientos bastante generales que se refieren al lavado de las
células por centrifugación. Por ejemplo, el documento EP 0 176 080 y
Gadol N. et al (Diagnostic Immunology, 1985 3 (3)
145-154) describen unos procedimientos de lavado de
las poblaciones celulares mononucleares gracias a un gel que parece
menos traumático para las células. Se han descrito otras técnicas a
base de gel hidrófobo en el documento EP 176 080, Poncelet et
al., Journal of Immunological Methods, 1985, Vol. 85, Nº 1
páginas 65-74 y Titus et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1981, Vol. 78, Nº 1, páginas
519-523. La patente US nº 3.997.442 describe un
procedimiento para separar dos fases de densidades diferentes a
partir de un fluido a partir de un material tixotrópico depositado
en el fondo del tubo de centrifugación.
Por último, se ha propuesto con anterioridad la
secuencia de centrifugación sobre un lecho o gradiente de albúmina
+ cromatografía sobre un gel de cribado molecular para eliminar las
moléculas plasmáticas no ligadas a las plaquetas. Sin embargo, dicha
técnica de laboratorio que se ha utilizado para eliminar en algunos
casos las proteínas plasmáticas no ligadas a plaquetas y
susceptibles de interaccionar con unos ensayos funcionales, es muy
larga y compleja de llevar a cabo.
Es la razón por la que la presente invención
propone un procedimiento de separación de las plaquetas o de las
micropartículas a partir de una muestra que las contiene
caracterizada porque:
a) se centrifuga dicha muestra en un recipiente
que contiene en su extremo distal un gel compacto, siendo dicho gel
sustancialmente impermeable a la fase líquida de la muestra pero que
puede ser atravesado en las condiciones de centrifugación por las
plaquetas o micropartículas de origen plaquetario a separar;
b) se separa eventualmente el sobrenadante de
centrifugación; y
c) se recuperan a continuación las plaquetas o
micropartículas de origen plaquetario incorporadas en el gel;
estando dicho gel constituido por partículas hidrófilas que en el
estado hinchado presentan un diámetro comprendido entre 30 y 500
\mum y preferentemente, comprendido entre 90 y 350 \mum.
Las plaquetas o micropartículas de origen
plaquetario incorporadas en el gel se recuperan a continuación por
suspensión del gel en un medio adecuado tal como por ejemplo un
medio tampón y/o de fuerza iónica particular. Después se separan las
plaquetas o micropartículas de origen plaquetario del gel por
ejemplo por filtración. Esto permite obtener una suspensión
plaquetaria que puede de este modo ser concentrada en relación con
la muestra de partida; el procedimiento de la presente invención
puede por lo tanto ser también un procedimiento de
concentración.
Dicho procedimiento reside en el hecho que cuando
se lleva a cabo una centrifugación, la capacidad de penetración de
los elementos sólidos contenidos en una solución es directamente
proporcional a su masa, de este modo, las partículas más pesadas
pueden ser capaces de penetrar en el gel o incluso eventualmente de
atravesarlo, mientras que las moléculas solubles así como el medio
líquido, no serán en la mayoría de los casos, capaces de penetrar el
gel correspondiente.
Por supuesto, el procedimiento según la presente
invención deberá ser adaptado a la naturaleza de los productos para
cada separación, en particular a las plaquetas, que se desean
separar actuando sobre su naturaleza y las propiedades físicas del
gel así como sobre las velocidades de centrifugación con el fin de
asegurar una separación de fases tal como se desea.
Dicho procedimiento está particularmente adaptado
a la separación, a partir de una muestra que las contiene, de las
moléculas ligadas a unas células, de las mismas células no ligadas,
presentes en la fase líquida, principalmente en forma soluble.
El gel utilizado en el procedimiento según la
presente invención es preferentemente un gel hidrófilo constituido
por partículas que en el estado hinchado, presentan un diámetro
comprendido entre 30 y 500 \mum, y preferentemente comprendido
entre 90 y 350 \mum.
Asimismo, cuando se coloca, el gel hinchado
presenta unas características tales que la concentración en peso
seco de partículas está comprendida entre 0,04 y 0,2 g/ml.
Por supuesto, el gel en cuestión puede estar
preparado para su utilización, es decir ya colocado en el fondo del
recipiente de centrifugación o bien ser colocado de forma
extemporánea, es decir a partir de un gel diluido que será
sedimentado por centrifugación.
Dicho gel se seleccionará preferentemente de
entre la gamma Sephadex®, principalmente los geles comercializados
bajo la denominación G25, G100, G200 o equivalente, utilizados
habitualmente para la cromatografía de cribado molecular.
La velocidad de centrifugación será
preferentemente tal que la fuerza de centrifugación esté comprendida
entre 200 g y 5.000 g.
De este modo, de forma esquemática, el
procedimiento comprende:
1) la introducción de una muestra líquida que
contiene principalmente las plaquetas o las micropartículas de
origen plaquetario en un tubo de centrifugación encima de un sistema
gelificado;
2) una centrifugación a una velocidad
adecuada;
3) el lavado por eliminación, principalmente
aspiración o decantación de la fase líquida;
4) la recuperación de las plaquetas o de las
micropartículas de origen plaquetario en el gel o como se verá a
continuación eventualmente debajo del gel.
El procedimiento según la presente invención
permite por lo tanto obtener dos fases diferentes:
- un sobrenadante encima del gel que contiene el
conjunto de las moléculas que han quedado en solución, en algunos
casos el exceso de reactivos, pero en otros casos las proteínas
celulares solubles que no han quedado fijadas sobre las células
y;
- un gel que contiene principalmente las
plaquetas así como las moléculas que se han fijado a dichas
plaquetas.
Preferentemente, se preferirá utilizar a título
de recipiente de centrifugación un tubo cuyo extremo distal
presenta un diámetro más pequeño, situándose el gel en dicha parte
distal de diámetro más pequeño. Por "parte distal" o "extremo
distal" se entiende por supuesto la parte más alejada de la
apertura del tubo. El tubo de centrifugación que presenta de este
modo un estrechamiento en su parte inferior, permite concentrar las
células por una parte y por otra parte que cuando el gel se prepara
un tiempo determinado antes de su utilización, se asegura una mejor
conservación. Es la razón por la que en general, el diámetro de la
zona del gel, es decir el diámetro de la parte inferior del tubo
estará preferentemente comprendido entre 2 y 7 mm, y
preferentemente inferior a 5 mm. De forma general, la relación de
volúmenes de la cámara superior, es decir la muestra o el
sobrenadante y la cámara de recolección, es preferentemente superior
a 10, permitiendo en dichas condiciones una mejor concentración.
Resulta asimismo posible prever en una forma de
realización preferida, que la parte distal del tubo en la que se
coloca el gel esté abierta en su extremo, estando dicha apertura
obturada por un filtro susceptible de retener el gel. En tal caso,
dicho extremo abierto desemboca en un recipiente que debe ser
acoplado de forma amovible al tubo de forma que recibe los
elementos figurados de la muestra que han atravesado el gel.
Conviene recordar que las células migran en
función de su masa y que en principio quedan aprisionadas en el
gel. En dicho caso, se pueden recuperar las células contenidas en el
gel poniendo el gel de nuevo en suspensión, después se filtra la
suspensión con un filtro que retiene las partículas de gel y permite
el paso de los elementos figurados. Sin embargo, en el caso en el
que se aumenta la fuerza de centrifugación o bien cuando se
aumenta la duración de la centrifugación, o por la utilización de un
gel adecuado, es posible hacer migrar dichas células a través del
gel. En dicho caso, son susceptibles de pasar directamente al
recipiente inferior. Por supuesto en el caso en el que se utiliza
dicho dispositivo, conviene rellenar el recipiente inferior con un
líquido antes de la centrifugación.
El recipiente de la parte inferior puede ser
principalmente un tubo atornillado en la parte inferior del tubo de
centrifugación propiamente dicho o bien acoplado por cualquier medio
adecuado. En dicha forma de realización, es por lo tanto posible
prever en el recipiente inferior, el establecimiento de un gradiente
correspondiente a dos o más densidades, lo que permitirá al mismo
tiempo en el momento la centrifugación, la separación de las
diferentes especies celulares en función de su densidad. El
procedimiento que permite producir los gradientes de densidad es
conocido y no será descrito de nuevo con detalle en la presente
memoria. La mayoría de veces, será suficiente con un gradiente a dos
densidades que permitirá por ejemplo separar las plaquetas de los
otros elementos figurados de la sangre.
De entre las muestras que pueden ser tratadas
según el procedimiento según la presente invención, hay que citar
más particularmente:
- -
- un plasma rico en plaquetas;
- -
- la sangre total, preferentemente tratada previamente con una solución de tipo lisis de los eritrocitos;
- -
- una suspensión de células en una solución equivalente al tampón de recuperación o diferente; como por ejemplo:
- -
- una solución de fijación (paraformaldehído, formol, glutaraldehído, etanol);
- -
- una solución de lisis diferencial (lisis de los eritrocitos);
- -
- una solución de tratamiento enzimático (fosfolipasa, tripsina, proteasa,...), química (ácido fórmico, cítrico, acético...), soluciones preferidas si las células deben ser imperativamente separadas de la solución después de la parada/neutralización por dilución;
- -
- una solución que contiene un reactivo inmunológico (anticuerpo, antígeno) o no (ligando), sustrato de una enzima, un elemento de un par de fijación (tal como biotina, X-biotina, avidina,...)
Tal como se ha mencionado anteriormente, resulta
particularmente interesante utilizar unas suspensiones en las que
las células se han tratado con un reactivo. En efecto, en dicho
caso, el reactivo en exceso podrá ser separado por el procedimiento
según la presente invención y será posible prever la revelación del
reactivo o incluso entonces del marcador de las células cuando esto
sea posible por introducción de un elemento revelador en el gel.
De este modo es posible prever la incorporación
en el gel de un anticuerpo anti-IgG de ratón
marcado, por ejemplo, fluorescente, con la ayuda de productos tales
como DDAF (fragmento F (ab')_{2} de un anticuerpo
anti-IgG de ratón conjugado al FITC comercializado
por la compañía Eurobio), y después introducir en la parte superior
del tubo un medio que contiene unas células así como un anticuerpo
monoclonal de ratón reactivo con dichas células. Con el fin de que
la reacción sea completa, el anticuerpo monoclonal estará por
supuesto en exceso y en dichas condiciones, una parte de los
anticuerpos se fijará sobre las células, quedando los otros en la
solución. Después del tratamiento con la ayuda del procedimiento
según la presente invención, las células marcadas con los
anticuerpos monoclonales penetrarán en el gel, y a nivel de dicho
gel serán reconocidas por los anticuerpos anti-IgG
de ratón fluorescentes y por lo tanto serán reveladas.
Una de las ventajas de dicho procedimiento, es
que es posible prever unos tubos pre-tratados que
contienen el gel y el anticuerpo anti-IgG de ratón
fluorescente, el manipulador no tiene más que llevar a cabo la etapa
de fijación de los anticuerpos monoclonales y después la
centrifugación, la revelación aparecerá indirectamente a nivel del
gel.
Además, la separación de las moléculas no ligadas
permite utilizar un reactivo de segunda capa en cantidad muy baja,
lo que evidentemente elimina el ruido de fondo a nivel del
inmuno-marcaje y por lo tanto mejora la
sensibili-
dad.
dad.
Se puede asimismo en el mismo enfoque, prever la
utilización, por ejemplo de un marcador de superficie celular
principalmente cuando se trata de enzimas. Dicha enzima debe
presentarse tanto en el estado ligado como en el no ligado. Si el
gel contiene el sustrato de dicha enzima con un cromógeno o un
fluorógeno después de la centrifugación, se podrá visualizar
inmediatamente en el gel la presencia de células portadoras del
marcador enzimático.
De entre las enzimas utilizables, hay que citar
principalmente las ecto-enzimas celulares y solubles
así como las enzimas de la cadena de coagulación presentadas por
unos leucocitos, unas plaquetas o unas micropartículas obtenidas de
las plaquetas, (por ejemplo los factores Xa, XIa, IXa y la proteína
C). Se puede asimismo tratar de enzimas puramente celulares pero en
las que un inhibidor o un sustrato que interfiere en el ensayo, está
presente en forma soluble en el plasma.
Por último, puede tratarse de enzimas acopladas a
un reactivo, por ejemplo un anticuerpo, un ligando, una avidina
conjugada con peroxidasa, \beta-galactosidasa,
acetilcolinesterasa.
En todas estas operaciones, la centrifugación
permite eliminar las especies solubles no ligadas a las células.
Numerosas características y ventajas de la
presente invención se pondrán más claramente de manifiesto tras la
lectura de los ejemplos siguientes.
Las inmunoglobulinas (Ig) están normalmente
presentes en el plasma a 10-20 mg/ml. La presencia
de dicha cantidad tan elevada obliga, previo
inmuno-marcaje con un anticuerpo
anti-Ig, al lavado exhaustivo de las plaquetas
presentes en el plasma rico en plaquetas (PRP), es decir 2 a 4
lavados, por centrifugación.
Dichas centrifugaciones repetidas implican:
- unas pérdidas importantes que necesitan unas
muestras de partida de gran tamaño (hasta 5-10 ml de
sangre), incompatibles con unos ensayos en pediatría neonatal;
- las plaquetas no se pueden lavar por
centrifugación en presencia de los glóbulos rojos y glóbulos
blancos, lo que obliga a trabajar en un PRP (una centrifugación
inicial suplementaria);
- unos riesgos importantes de desenganche y
pérdida de la totalidad o parte (por lo tanto sesgo de selección) de
las Ig anticuerpos anti-plaquetas, conocidas por
presentar poca afinidad (auto-anticuerpos);
- una carga de trabajo y de tiempo de ocupación
de las centrifugas no despreciables (cada lavado requiere una
centrifuga rápida durante 15 min.).
En la técnica de tubo-gel, según
la presente invención, la muestra puede ser indiferentemente sangre
total o PRP.
Se decanta el sobrenadante por inversión simple
(operación repetida 3 veces = 3 lavados). El gel, que contiene las
células (plaquetas +/- glóbulos rojos y glóbulos blancos) se pone de
nuevo en suspensión en un volumen pequeño de tampón de
inmuno-marcaje.
El gel es retenido sobre unas redes de un filtro
(rejilla de nylon de apertura de 35 \mum) tal como, por ejemplo la
"Cell Strainer" de Falcon/Becton Dickinson y las células
recuperadas después de una centrifugación corta (3 min, 800 rpm) en
vista del inmuno-marcaje.
Se dispone entonces de una suspensión de
plaquetas (+/- glóbulos rojos y glóbulos blancos), desprovista de
plasma y en particular de Ig plasmáticas, que conservan sus
características morfológicas permitiendo el análisis por citometría
de flujo, su fenotipo inmunológico inicial, que no han perdido los
anticuerpos asociados a lo largo de las operaciones de lavado, y que
no se han activado mediante el procedimiento de separación.
La eficacia del "lavado" realizado mediante
la transferencia en el gel se ha ensayado utilizando una Ig
trazadora fluorescente, que se dosifica en la muestra de partida y
en la suspensión final. Se ha medido el factor de dilución \geq a
1000 entre la centrifugación inicial y la final del trazador. Esto
corresponde, para un plasma que contiene 10 mg/ml de Ig a una
concentración residual \leq a 10 \mug/ml de Ig en la suspensión
de células. Una concentración residual tal necesitaría un mínimo de
2 a 3 lavados de las plaquetas en las condiciones citadas
anteriormente.
Para la medición de las Ig asociadas a las
plaquetas como para otros antígenos de superficie plaquetarios, un
protocolo de estabilización de las células que permite mantener los
antígenos de interés a su nivel de expresión inicial resulta un
problema mayor y delicado.
La resolución de dicho problema en las plaquetas
permitiría diferenciar el análisis de citometría de flujo
(operación que requiere una técnica particular) del tratamiento de
la muestra (operación a realizar sobre el sitio en un plazo
corto).
corto).
Una fijación, a la vez suave pero eficaz y
estandarizada, requiere un tratamiento de la muestra celular con el
fijador soluble de una duración limitada, con la sustitución del
fijador por un medio de conservación desprovisto de fijador.
El sistema tubo-gel ofrece dicha
posibilidad.
La muestra (PRP, 500 \mul) se diluye de este
modo en el fijador (PFA, 0,2%, 500 \mul) y la incubación se sigue
durante 10 min.
El análisis cuantitativo del fenotipo
inmunológico de las plaquetas fijadas de este modo e inmediatamente
desprovistas del fijador después de 10 minutos ha demostrado la
fiabilidad de dicho protocolo para una conservación de una semana de
los principales antígenos plaquetarios indicados en los protocolos
de estudios farmacológicos
multi-céntricos/multi-nacionales.
El procedimiento según la presente invención se
puede asimismo utilizar a una escala más grande con el fin de
efectuar una preparación rápida de las plaquetas lavadas, lo que
constituye una alternativa al método de Mustard (Methods in
Enzymology, 1989, Vol. 169, 3-21.) Por otra parte,
se han descrito determinados tratamientos químicos sobre las
plaquetas y los leucocitos (por ejemplo un tratamiento con ácido
cítrico pH 4) para decapar los antígenos HLA y detectar
específicamente los anticuerpos dirigidos contra los antígenos
diferentes a HLA. Tales tratamientos requieren evidentemente una
neutralización con la eliminación de determinadas moléculas químicas
en contacto con las células y es cierto que el procedimiento según
la presente invención que es particularmente rápido y simple debería
permitir la utilización facilitada de dicho tipo de proceso.
Asimismo, los tratamientos enzimáticos pueden
reclamar una separación rápida de los elementos celulares (por
ejemplo, tripsina, PIPLC o Proteasa K). Una centrifugación estándar
deja las células en contacto durante más de 5 minutos con el
sobrenadante que contiene la enzima activa, mientras que gracias al
procedimiento según la presente invención, se puede prever limitar
la duración del tiempo de contacto.
Asimismo, es posible prever la utilización del
procedimiento según la invención en el método QIFI de cuantificación
de moléculas celulares por citometría que está basada en los
marcajes indirectos (en dos capas de anticuerpos monoclonales 1 +
anti Ig Fluorescente). Dicho procedimiento está descrito en Poncelet
et al., J. of Inmunol. Methods, 85 (1985),
65-74, cuyo contenido está incorporado en la
presente memoria como referencia. Es un principio difícil de aplicar
con un contra marcaje (anticuerpo monoclonal 2 portador de otro
fluorocromo). El procedimiento de separación que elimina el exceso
de reactivo anticuerpo monoclonal 1 y anti Ig permite enfocar un
contra marcaje que se puede utilizar de forma simple.
Asimismo es posible descartar rápidamente
determinados reactivos no deseados, como por ejemplo unos
activadores, unas citoquinas, unos mensajeros, unos productos
tóxicos a corto plazo (agua destilada para la lisis de los
eritrocitos o el ácido fórmico), unos agentes complejantes tales
como el EDTA o el citrato o unos iones que desencadenan unas
reacciones tales como el calcio o el magnesio.
La sangre total se centrifuga durante 15 minutos
a 170 g. Se extrae la fase superior correspondiente al PRP (Plasma
rico en plaquetas).
- -
- se añaden 200 \mul del PRP a 2 ml de tampón en el interior del tubo gel,
- -
- centrifugación 5 minutos - 1200 g,
- -
- eliminación de la fase líquida superior por inversión,
- -
- 2 lavados en un tampón adecuado del gel que contiene las plaquetas (adición de 2 ml de tampón en el tubo, encima del gel y eliminación por inversión),
- -
- suspensión del gel y de las plaquetas mediante una pipeta,
- -
- transferencia de la suspensión sobre un filtro en un tapón del tubo,
- -
- centrifugación del tubo cerrado, las partículas del gel son retenidas por el filtro mientras que las plaquetas "caen" al fondo del tubo,
- -
- eliminación del tapón filtro y recogida del filtrado.
- -
- numeración de las plaquetas en el filtrado, numeración a llevar al microlitro,
- -
- comparación de dicha numeración con la del PRP de partida,
- -
- establecimiento de una relación numeración filtrado/numeración PRP expresada en porcentaje.
Ausencia de activación de las plaquetas a lo
largo del proceso de separación (ver Tabla 1). El nivel de
activación plaquetaria se objetiviza por la medición de los
marcadores de superficie específicos.
Las plaquetas se consideran no activadas cuando
la GMP140 es inferior a 500 copias por plaqueta.
Respeto de la reactividad plaquetaria (tabla 1).
El mantenimiento de la reactividad plaquetaria se define mediante
las modificaciones cuantitativas de determinados marcadores de
superficie después de una activación in vitro. Se han
seleccionado:
- -
- la GMP140 que sólo se expresa sobre las plaquetas activadas,
- -
- la GpII/IIIa cuyo valor aumenta en el momento de la activación,
- -
- la GpIb cuyo valor decae en el momento de la activación por internalización.
La reactividad de las plaquetas se conserva para
el activador TRAP.
\vskip1.000000\baselineskip
Estado basal | TRAP | |
GpIIbIIIa | 76 355 | 112 206 |
GpIb | 37 438 | 17 452 |
GpIIIa | 66 796 | 98 452 |
GMP140 | 370 | 13 525 |
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento es reproducible sea cual sea la
numeración plaquetaria. De este modo, el procedimiento de separación
está validado para una numeración plaquetaria normal (150 a 400 x
10^{9} plaquetas/litro). Para recuperar un número de plaquetas
más importante se puede realizar una extensión del volumen de la
toma de ensayo hasta 500 \mul para las muestras trombopénicas (10
x 10^{9} a 150 x 10^{9} plaquetas por litro de sangre), ver
tabla 2 siguiente.
Muestra | Toma para el ensayo | Cantidad de plaquetas | Cantidad de plaquetas | Rendimiento (%) |
de PRP (\mul) | inicial | separadas/lavadas | ||
Normal | 200 | 10^{8} | 4x10^{7} | 40 |
(200 x 10^{9} plt/l) | ||||
Trombopenia a | 200 | 4x10^{6} | 1,6 x 10^{6} | 42 |
10 x 10^{9} plt/l | ||||
Trombopenia a | 500 | 10^{7} | 4,2 x 10^{6} | 42 |
10 x 10^{9} plt/l |
Medición de las inmunoglobulinas asociadas a las
plaquetas (PAlg). Comparación de las técnicas de
lavado/separa-
ción en tubo de gel y mediante centrifugaciones múltiples (ver tabla 3 siguiente).
ción en tubo de gel y mediante centrifugaciones múltiples (ver tabla 3 siguiente).
El procedimiento de separación/lavado de las
plaquetas por centrifugación es susceptible de activar dichas
células conduciendo a una extensión de las Ig internas responsables
de los resultados por exceso. Las mediciones de las PAlg se han
realizado en una muestra normal cuyas plaquetas se han lavado
mediante tubo gel o mediante 3 centrifugaciones. Existe en efecto un
número de PAlg medido superior para el procedimiento de
separación/lavado mediante centrifugación (tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Lavados gel Separación | Lavados centrifugación | |
Cuantificación PAlg | 1387 PAlg por plaqueta | 2407 PAlg por plaqueta |
Claims (12)
1. Procedimiento de separación de plaquetas o de
micropartículas de origen plaquetario, a partir de una muestra que
las contiene seleccionada de entre un plasma rico en plaquetas y una
muestra que contiene unas moléculas ligadas a unas plaquetas o unas
micropartículas de origen plaquetario y las mismas moléculas no
ligadas presentes en la fase líquida, principalmente en forma
soluble, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- se centrifuga dicha muestra en un recipiente que contiene en su extremo distal un gel compacto, siendo dicho gel sustancialmente impermeable a la fase líquida de la muestra pero que puede ser atravesado en las condiciones de centrifugación por las plaquetas o las micropartículas de origen plaquetario;
- b)
- se separa eventualmente el sobrenadante de centrifugación, y;
- c)
- se recuperan a continuación las plaquetas o micropartículas de origen plaquetario incorporadas en el gel;
caracterizado porque dicho gel está
constituido por partículas hidrófilas que en el estado hinchado
presentan un diámetro comprendido entre 30 y 500 \mum y
preferentemente, comprendido entre 90 y 350 \mum.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las moléculas son inmunoglobulinas.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el gel está
presente a una concentración en peso seco de partículas de 0,04 g/ml
a 0,2 g/ml con respecto al gel.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la velocidad de
centrifugación está comprendida entre 200 y 5000 g.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el recipiente de
centrifugación es un tubo cuya parte distal presenta un diámetro más
pequeño, estando el gel dispuesto en dicha parte distal de diámetro
más pequeño.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque el diámetro más pequeño es del orden de
2 a 7 mm.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque que la parte
distal del tubo en el que se coloca el gel está abierta en su
extremo inferior, estando dicha apertura obturada por un filtro
susceptible de retener el gel, desembocando dicho extremo abierto en
un recipiente acoplado de forma amovible al tubo de forma que
recibe las células de la muestra que ha atravesado el gel.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el recipiente contiene un gradiente de
densidad.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en la etapa c)
se recupera el gel poniéndolo de nuevo en suspensión y se filtra
dicha suspensión con un filtro que retiene las partículas de gel y
permite el paso de las plaquetas o de las micropartículas de origen
plaquetario.
10. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra está constituida por una
suspensión en la que se han tratado las plaquetas o las
micropartículas de origen plaquetario con un reactivo.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque las plaquetas o las micropartículas de
origen plaquetario se han tratado con un anticuerpo en exceso que
reconoce un antígeno plaquetario a título de reactivo.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el gel contiene
un componente que asegura la revelación del reactivo o del marcador
de las plaquetas.
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---|---|---|---|
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FR9707032 | 1997-06-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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ID=9507693
Family Applications (1)
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Country | Link |
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AT (1) | ATE318892T1 (es) |
DE (1) | DE69833629T2 (es) |
DK (1) | DK0882788T3 (es) |
ES (1) | ES2257797T3 (es) |
FR (1) | FR2764302B1 (es) |
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US4751001A (en) * | 1984-09-24 | 1988-06-14 | Becton Dickinson And Company | Blood partitioning apparatus |
US4867887A (en) * | 1988-07-12 | 1989-09-19 | Becton Dickinson And Company | Method and apparatus for separating mononuclear cells from blood |
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1998
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