ES2256836T3 - Inductor de la respuesta hipersensitiva en las plantas. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN LAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO Y DE AMINOACIDOS PARA PROVOCADORES PROTEINICOS DE LA REACCION DE DEFENSA DE LAS PLANTAS CONOCIDA COMO RESPUESTA HIPERSENSIBLE ASI COMO LOS METODO PARA SU PREPARACION Y PROCESOS DE INACTIVACION.

Description

Inductor de la respuesta hipersensitiva en las plantas.

Las plantas, así como los humanos y los animales, sufren lesiones y pérdidas producidas por infecciones por bacterias. A escala mundial, las bacterias clasificadas del genero Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas son responsables de la mayoría de las pérdidas producidas por patógenos bacterianos de plantas. Muchas de las enfermedades bacterianas de las planteas provocan grandes pérdidas de forma esporádica a los agricultores. Las pérdidas son resultado de la muerte, mutilación o productividad reducida de las plantas afectadas.

Muchos de los patógenos bacterianos de plantas presentan un marcado grado de especificidad hacia las plantas que infectan. Por ejemplo, Erwinia amylovora infecta manzanos, perales y plantas relacionadas de la familia Rosaceae. Otras plantas no enferman al estar expuestas a E. amylovora. Sin embargo, cuando se introducen células suficientes de E. amylovora en el tejido de las hojas de las otras plantas, el tejido mesófilo se colapsa pasadas unas horas. Este colapso ha recibido el nombre de respuesta hipersensible (RH) y se considera una reacción de defensa de las plantas puesto que durante la RH las bacterias están delimitadas al interior del tejido colapsado, muriendo eventualmente, y por lo tanto no provocan daños a toda la planta.

Los genes que requieren los patógenos bacterianos de las plantas para poder inducir la respuesta hipersensible, llamados genes hrp, para producir la reacción hipersensible y para su patogenicidad, también son necesarios para provocar la enfermedad. Sin embargo, los productos de genes hrp y cómo funcionan en la inducción de la RH y en el desarrollo de la enfermedad, se desconocían antes de la presente invención. La presente invención se refiere a productos de genes hrp (inductores) responsables del colapso observado en la RH y que son necesarios para el desarrollo de la enfermedad.

Las interacciones entre los patógenos bacterianos y sus plantas huésped normalmente pertenecen a dos categorías: (1) compatible (patógeno-huésped). conduce al crecimiento bacteriano intercelular, al desarrollo de los síntomas y al desarrollo de la enfermedad en la planta huésped; y (2) incompatible (patógeno-no huésped), que tiene como resultado la respuesta hipersensible, un tipo especial de interacción incompatible, sin síntomas progresivos de la enfermedad. Durante las interacciones compatibles en plantas huésped, las poblaciones bacterianas aumentan drásticamente y se producen los síntomas progresivos; durante las interacciones incompatibles las poblaciones bacterianas no aumentan y no se producen síntomas progresivos.

La respuesta hipersensible de las plantas superiores se caracteriza por el colapso y muerte rápidos y localizados de los tejidos que contienen el patógeno incompatible (un microorganismo que es patogénico exclusivamente en otras plantas) y está asociada con la defensa de las plantas contra muchas bacterias, hongos, nemátodos y virus [véase Phytopathogenic Prokaryotes, (M.S. Mount and G.H. Lacy eds.) Academic Press, New York. pp 149-177 (1982)]. En 1963 se demostró la inducción de la respuesta hipersensible mediante bacterias cuando de infiltraron los espacios intercelulares de hojas de tabaco con l0^{7} células/ml de un patógeno incompatible. Las áreas infiltradas se colapsaron en 24-48 horas y dejaron de favorecer la multiplicación bacteriana [véase Nature 199:299 (1963)]. Por lo tanto, en la RH, se localiza el patógeno y se limita su posterior crecimiento.

La técnica utilizada en el laboratorio para demostrar la RH es directa. Se infiltran los espacios intercelulares de hojas de tabaco puncionando en primer lugar un sector de la hoja con una aguja de disección recta normal. A continuación, se aplica una jeringa de 1 ml de capacidad (sin aguja), con una suspensión de células bacterianas de 0,1-0,5 ml (normalmente 10^{7}-10^{8} células viables/ml) de la bacteria en uno de los laterales de la hoja, directamente sobre la punción. Mientras se presiona con un dedo en el lado opuesto de la hoja para estabilizarla y para evitar que el líquido se escape del área puncionada, se presiona ligeramente el émbolo de la jeringa para introducir la suspensión bacteriana en la hoja. La infiltración se considera correcta cuando aparece en la hoja un área impregnada de agua de aproximadamente 1-4 cm^{2}.

Una hipótesis común propuesta para explicar el mecanismo de inducción de la reacción hipersensible implica la producción de un inductor específico por parte de las bacterias que reacciona con un receptor específico de las células de la planta. Sin embargo, la base molecular (genes y producto de genes) de esta respuesta hacia patógenos potenciales era desconocida antes de la presente invención a pesar de la investigación continuada realizada por los patólogos de plantas desde que se describió por primera vez la RH en 1963.

Las observaciones fisiológicas y genéticas sugieren que el mismo factor bacteriano que induce la respuesta hipersensible en no huésped también es necesaria para la patogenicidad en huéspedes.

La producción del inductor de la respuesta hipersensible está controlada por un conjunto de diversos genes hrp, que se conservan largamente y que a menudo son intercambiables, entre muchas especies de bacterias patogénicas de plantas. A pesar de que otros han clonado algunos genes hrp determinados y varios de ellos, se han clonado conjuntos funcionales de genes hrp solo a partir de Erwina amylovora y Pseudomonas syringae. Se ha demostrado que estos conjuntos confieren a bacterias no patogénicas la capacidad de inducir la respuesta hipersensible en hojas de tabaco y en hojas de otro tipo [véase Mol. Plant-Microbe Interact. 4:132 (1991): J. Bacteriol 170:4748 (1988); y Beer et al., Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions (H. Hennecke and D.P.S. Verma eds.) Kluwer Academic Publishers, Boston, pp 53-60 (1991)].

Según un primer aspecto de la invención, proponemos una proteína aislada capaz de inducir una respuesta hipersensible en diferentes especies de plantas cuando se introduce dicha proteína en el tejido de la hoja de una planta bajo condiciones de crecimiento normales de la planta, en donde dicha proteína está codificada por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar en un ácido nucleico con SEQ ID Nº. 4 bajo condiciones astringentes de lavado de x 0,4 SSC, SDS 0,2% SDS a 65ºC.

Según un segundo aspecto alternativo de la invención, se propone un péptido biológicamente activo aislado del grupo formado por

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una secuencia similar con al menos una adición de aminoácido, una secuencia similar con al menos una eliminación de aminoácidos, una secuencia similar con al menos una sustitución de aminoácidos, y una secuencia similar con al menos una inserción de aminoácidos, siempre que dicha adición, eliminación, sustitución o inserción no inhiba la actividad biológica de la secuencia de aminoácidos 385.

En la presente memoria se describe un método para alterar la enfermedad o la respuesta hipersensible en una planta que comprende proporcionar a dicha planta un inhibidor del inductor de harpin y permitir a dicho inhibidor reaccionar con el inductor de harpin.

Según un tercer aspecto alternativo de la invención, los autores proporcionan un gen para su inserción en un huésped apropiado para permitir la expresión de harpin, el cual está formado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo

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una secuencia similar con al menos una adición de ácido nucleico, una secuencia similar con al menos una eliminación de ácido nucleico, una secuencia similar con al menos una sustitución de ácido nucleico y una secuencia similar con al menos una inserción de ácido nucleico, en combinación con un vector para introducir la secuencia en el huésped adecuado y siempre que dicha adición, eliminación, sustitución e inserción no inhiba la expresión biológica de harpin.

Según un cuarto (y alternativo) aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ADN aislada que codifica un péptido según el primer aspecto de la invención.

Según un quinto y sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de expresión y una célula huésped que contiene una molécula de ADN según el quinto aspecto de la invención.

Inicialmente, se aisló y purificó el inductor de la respuesta hipersensible a partir de E. coli DH5\alpha(pCPP430), y posteriormente de una cepa natural de E. amylovora, la bacteria que provoca una enfermedad en las plantas rosáceas, tales como el manzano y el peral, conocida como fuego bacteriano. Se propone el nombre "harpin" para el inductor de la respuesta hipersensible de E. amylovora; se considera que este inductor pertenece al arquetipo de una familia de inductores proteináceos de RH producidos por diferentes bacterias fitopatogénicas.

En la presente memoria se describen proteínas inductoras específicas aisladas de bacterias, que al ser aplicadas en plantas no huésped, provocan una respuesta tóxica similar a la respuesta inducida por las células vivas de las bacterias que han producido las proteínas. También se describe el aislamiento y caracterización de los genes que codifican las proteínas inductoras, que pueden utilizarse para hacer que las plantas u otros organismos produzcan proteína inductora, que ejercería sus efectos tóxicos de manera controlada y precisa.

El trabajo de los inventores permite una caracterización e identificación suficiente de dichas proteínas para permitir el diseño y desarrollo de técnicas que inactiven, destruyan o unan dichas proteínas. Esto es deseable ya que se sabe que las bacterias que producen dichas proteínas son necesarias para provocar la enfermedad en plantas huésped de la bacteria. Al neutralizar los efectos tóxicos de las proteínas se neutralizan sus funciones en la enfermedad y se reduce la enfermedad en las plantas.

Los inventores consideran que es posible desarrollar anticuerpos contra dichas proteínas, elaborar secuencias de los anticuerpos producidos, construir secuencias de ácido nucleico que al ser introducido correctamente en el genoma de una planta harían que la planta expresara el anticuerpo y de ese modo se evitaría que las bacterias provocaran enfermedades en las plantas.

Los inventores describen la identificación de un gen hrp determinado del conjunto de genes hrp de Erwinia amylovora. Dicho gen determinado se transcribe y traduce para obtener un inductor proteináceo de la respuesta hipersensible. Otra porción de la presente descripción trata acerca de la identificación de genes homólogos de las especies Erwinia, Xanthomonas y Pseudomonas que codifican proteínas similares al inductor de RH de E. amylovora. Previamente al trabajo de la presente memoria, no se había descrito el aislamiento del inductor proteináceo de la respuesta hipersensible. Por lo tanto, los inventores proporcionan una descripción de las técnicas para aislar y purificar un inductor proteináceo de la respuesta hipersensible. También se describe la manipulación genética de los genes que codifican la proteína inductora de RH para mejorar la producción de harpin.

Por lo tanto, puede resumirse que la invención en sus diversos aspectos se refiere a proporcionar profilaxis contra Erwinia amylovora, el agente causante del fuego bacteriano del manzano, del peral y de otras plantas rosáceas. Además, la presente invención, en sus diversos aspectos, se refiere ampliamente a proporcionar profilaxis contra bacterias del género Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas que provocan otras enfermedades en una gran variedad de plantas.

En la descripción de la presente invención se hace referencia a las siguientes expresiones en relación con las cepas bacterianas, cósmidos y plásmidos.

DII5\alpha

Una cepa de laboratorio de Escherichia coli utilizada normalmente para la clonación;

Ea321

Cepa natural de Erwinia amylovora a partir de la cual se derivan todas las mutaciones y clones;

Ea321T143

Mutante Hrp con transposón Tn5 utilizado para cribar una biblioteca de cósmidos (en el vector pCPP9) para el restablecimiento de la función Hrp. Este cribado tuvo como resultado la identificación del cósmido pCPP430. (Este mutante tiene una inserción en uno de los genes hrp, no hrpN; el efecto de la inserción es evitar la expresión de la harpin por mutagénesis del operón).

Ea321K49

El mutante hrp que contiene el transposón Tn10mini-kan insertado en un gen hrp implicado en la regulación de la producción de harpin.

Ea321T5

El mutante hrp que contiene el gen hrpN mutagenizado con transposón no polar Tn5tacl. (Este mutante de Ea321 posee una inserción en el gen que codifica la harpin).

pCPP9

Un vector cósmido creado para clonar el ADN de E. amylovora. La porción de vector de pCPP430. Cósmido pCPP430 que contiene 46,5 kb de ADN de Ea321 que incluye todo el conjunto de genes hrp de Ea321. Este cósmido confiere a E. coli la capacidad de inducir la RH y restablecer el fenotipo Hrp de todos los mutantes Hrp de E. amylovora. Clon a partir del cual se derivó hrpN.

pCPP1084

Plásmido que contiene un fragmento de 1,3 kb de HindIII de pCPP430, que incluye todo el hrpN (1155 pares básicos). El vector es pBluescript M13+.

pCPP50

Un plásmido desarrollado modificando el pINIII^{113}-A2 de Masui et al. (Bio/Technology, January 1984 pp. 81-85). Se suprimió un fragmento del original y se insertó un fragmento de pBluescript. Se realizaron las modificaciones para crear un vector más adecuado para la producción de harpin.

pCPP2139

Plásmido que al encontrarse en E. coli tiene como resultado la sobreproducción de harpin. Construido clonando el gen hrpN de pCPP430 en pCPP50.

pbluescript

M13+ Un plásmido utilizado rutinariamente para subclonar y secuenciar ADN. Utilizado también para la expresión in vitro de proteína de ADN clonado.

Además, estas y otras expresiones utilizadas en esta descripción pueden encontrarse en Molecular Plant-Microbe Interactions 4(5):493 (1991) y en Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbes Interaction 1:53 (1991).

Tanto E. coli DH5\alpha(pCPP1084) y E. amylovora Ea321 se han depositado en la American Type Culture Collection ubicada en Rockville. Maryland. Sus números de depósito son ATCC 69021 y ATCC 49947, respectivamente. El depósito de ATCC 69021 se ha realizado según el Tratado de Budapest, y los cultivos se harán públicos según las disposiciones de dicho tratado.

Los diversos aspectos relativos a la identificación, aislamiento, purificación y caracterización del inductor de RH y los genes se entenderán con mayor claridad a partir de las siguientes figuras y ejemplos, todos ellos incluidos con el fin de clarificar la presente invención y no para limitar su alcance.

La Figura 1 es un mapa de restricción de endonucleasa del conjunto hrp de Erwinia amylovota; y

La Figura 2 describe los cambios en el pH de una solución de baño de cultivos en suspensión de células de
tabaco.

Más particularmente, la figura 1 representa el mapa de restricción de endonucleasa del conjunto hrp de Erwinia amylovora en donde "E" designa EcoRI, "H" designa HindIII, y "B" designa sitios de restricción BamHI. Las líneas verticales indican la ubicación de las inserciones de transposón a las que se les ha comprobado sus efectos en la capacidad de inducir la RH y de ser patogénicos para el peral. Células metabólicamente activas de Erwinia amylovora Ea321 [véase Molecular Plant-Microbe Interactions 1(3):135 (1988)] y E. coli DH5\alpha(pCPP430)con todas las inserciones indicadas no indujeron la reacción hipersensible en tabaco. La región abarcada por todas las inserciones indicadas es esencial también para la inducción de una reacción de intercambio K^{+}/H^{+} de cultivos en suspensión de células de tabaco. Los derivados de Ea321 que contienen las inserciones indicadas no son patogénicos para el peral.

Más especialmente, en relación con la Figura 2, se restaron los valores de control (no aditivos) antes de su representación gráfica. Los cuadrados despejados ilustran la harpin (60 nM); los círculos despejados ilustran células de E. coli DH5\alpha(pCPP430) (5 x 10^{7} células/ml); los cuadrados rellenados ilustran células de E. amylovora Ea321 (5 x 10^{7} células/ml; los triángulos ilustran células de E. coli DH5\alpha(pCPP430K49) (5 x 10^{7} células/ml); los diamantes ilustran células de E. amylovora Ea321 K49 (5 x 10^{7} células/ml); y los círculos rellenados ilustran células de E. coli DH5\alpha(pCPP9) (5 x 10^{7} células/ml). Se agitaron los cultivos en suspensión de células de tabaco a temperatura ambiente con los preparados indicados. Se midió el pH a los intervalos indicados. Todos los preparados que indujeron la RH en las hojas de tabaco también provocaron un aumento del pH del medio de cultivo en suspensión de células de tabaco.

Ejemplo I

Se identificó el plásmido pCPP430 a partir de una biblioteca de ADN genómico de la cepa natural de E. amylovora, conocida en nuestro laboratorio como Ea321, y se depositó en el American Type Culture Collection como 49947. La cepa se recibió en 1978 procedente de la Colección Nacional Francesa de bacterias fitopatogénicas, en donde recibe el nombre CNFB 1367. Se aisló el ADN genómico y se digirió con Sau3A, se ligó en el vector cósmido de pCPP9 previamente digerido con BamHl, se empaquetó y transfectó en cepa ED8767 de E. coli según los procedimientos anteriormente descritos [véase Mol. Plant-Microbe Int. 1:135 (1988)]. Los cósmidos resultantes se movilizaron en cepas por conjugación con la ayuda del plásmido auxiliar pRK2013 [Bauer, D.W., Molecular genetics of pathogenicity of Erwinia amylovora: techniques, tools and their application. Ph.D. thesis. Cornell University, Ithaca, NY (1989)].

La biblioteca resultante se diluyó y sembró en placas de agar nutriente que contenían una concentración final de espectinomicina y canamicina de 50 \mug/ml. Se seleccionaron las placas que contenían alrededor de 500 colonias, tras una incubación a 37º durante 24 hr., cuando el diámetro de cada colonia era 0,5-1,0 mm. Las colonias de dichas placas se repicaron en placas que contenían agar Luria-Bertani (LA) en las que se había extendido previamente 0,1 ml de una suspensión de cepa Ea321T143. Ea321T143 es una cepa mutante de Hrp inducida por TnlO de Ea321; no es patogénica para el peral y no induce la RH en la planta del tabaco ni en otras plantas. Se hizo crecer hasta OD_{620}=1,3 en caldo Luria más tetraciclina (10 \mug/ml). Las placas de LA se incubaron durante 5 hr. a 28ºC y su crecimiento en dichas placas se repicó en un medio mínimo para el crecimiento de Erwinia amylovora, que contenía glucosa 2 g/l, asparagina 1,5 g/l, citrato sódico 0,25 g/l, MgSO_{4} 5 mg/l, ácido nicotínico 0,25 g/l, (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 g/l, K_{2}HPO_{4} 3,51 g/l, KH_{2}PO_{4} 1,51 g/l, y 50 mg/1 espectinomicina y 10 mg/l tetraciclina. Este procedimiento seleccionó transconjugados de Ea321T143 que contenían varios cósmidos de la biblioteca Ea321. Pasadas 48 hr. de incubación a 28ºC, se presionaron rodajas de pera inmadura recién cortada sobre la superficie de cada placa de transconjugados de modo que todas las colonias situadas bajo la rodaja de pera entraron en contacto con tejido de la pera. Las rodajas de pera se invirtieron, se incubaron en cajas de plástico revestidas de toallas de papel bien humedecidas y se observaron diariamente durante hasta 5 días para detectar la presencia de gotas de exudado. La pera inmadura había sido cosechada aproximadamente 6 semanas tras la floración, de árboles de Pyrus communis cv. Bartlett Los frutos tenían un diámetro de 2-4 cm y se almacenaron a 0-2ºC hasta el momento de utilización. Según se utiliza en la descripción de la presente invención, el exudado es una mezcla de planta y productos bacterianos formada en gran parte por células bacterianas vivas.

El exudado se sembró por dilución-estría en placas de medio mínimo de E. amylovora- con 50 \mug/ml de espectinomicina y 10 \mug/ml de tetraciclina, se incubó durante 2 días a 28ºC y se recogieron colonias individuales con palillos estériles, se propagaron en una placa nueva de agar mínimo Ea + 50 \mug/ml de espectinomicina y 10 \mug/ml de tetraciclina y se volvió a comprobar su patogenicidad. Se clavaron palillos contaminados con las cepas a comprobar en el tejido de la pera recién cortada. Los cósmidos de las colonias que provocaron la enfermedad en la pera se removilizaron en DH5\alpha desde Ea321T143 combinando 0,5 alícuotas de cultivos de LB + antibiótico LB realizados durante la noche de DH5\alpha, el transconjugante patógeno^{+} Ea321T143 (la cepa de Ea321T143 que contiene el cósmido que confiere a Ea321T143 la capacidad de provocar la enfermedad), y pRK2013, el plásmido auxiliar. La combinación se mezcló a fondo, se centrifugó y se suspendió el sedimento en 150 Pl de caldo L, sin antibióticos. Se resuspendió el sedimento y se colocaron gotas de 0,1 ml en placas LA, se les permitió impregnase de agar sin esparcirse, y a continuación se incubaron las placas a 28ºC durante 5 hr. Las la incubación, se resuspendió el crecimiento localizado en 1 ml de tampón fosfato de potasio 5 mM, con pH 6,5, y se sembraron 0,1 alícuotas sobre las placas de LA + 50 \mug/ml de espectinomicina y 20 \mug/ml de ácido nalidixico que a continuación se incubaron durante 48 hr. a 37ºC. Las colonias se transfirieron simultáneamente con palillos a placas de LA + 50 \mug/ml de espectinomicina y LA + Km. Las colonias que crecieron_solo_en las placas de 50 \mug/ml de espectinomicina, lo cual indicaba la pérdida del plásmido auxiliar pRK2013 (Km^{r}), se escogieron para su conservación por congelación y para continuar con su estudio.

Para determinar si el mismo cósmido que restableció la patogenicidad a la pera, en lo sucesivo llamado pCPP430, también afectaba a la reacción de Ea321T143 en el tabaco, se infiltraron suspensiones en sectores de hojas de tabaco. El efecto de pCPP430, mantenido en E. coli DH5\alpha se comprobó en las hojas de tabaco. Se hizo crecer la cepa a OD_{620} 0,4- 0,6 (aproximadamente 108 ufc/ml) en caldo Luria + 50 \mug/ml de espectinomicina. Se centrifugó el cultivo (12.000 x g durante 1 minuto), se resuspendió en tampón fosfato 5 mM con pH 6,5, hasta su volumen original y se infiltró en hojas de trabajo. El colapso del tejido se produjo en 8 horas. No se observó colapso cuando se infiltraron las células de DH5\alpha(solo) o DH5\alpha(pCPP9) en las hojas de tabaco. Por lo tanto, los inventores concluyen que pCPP430, con un ADN determinado de E. coli DH5\alpha con Ea321 habilitada provoca la reacción de RH y que pCPP430 contiene todos los genes necesarios para dicha reacción.

El gen hrp de E. amylovora contenido en el cósmido pCPP430, está especialmente bien expresado en Escherichia coli [véase Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe interactions, supra; Phytopathology 79:1166 (1989); y Mol. Plant-Microbe Interactions 4(5):493 (1991)]. Normalmente la síntesis de novo de ARN y proteínas fue necesaria para que Ea321 indujera la HR. Sin embargo E. coli (pCPP430) y Ea321(pCPP430) pueden inducir la RH en presencia de inhibidores bacterianos transcripcionales o traduccionales tales como rifampicina y tetraciclina. Esto indicó que el inductor de RH estaba presente en células de E. coli DH5\alpha(pCPP430) antes de que se infiltrara la bacteria en las hojas de trabajo.

La búsqueda del inductor de RH comenzó infiltrando en las hojas de trabajo los sobrenadantes del cultivo libre de células de E. amylovora Ea321, Ea321 (pCPP430) ó E. coli DH5\alpha(pCPP430). Los sobrenadantes se produjeron haciendo crecer cada cepa en caldo LB con el antibiótico adecuado hasta la fase logarítmica tardía (OD_{620}= aprox. 1,0). Como se esperaba, en base a la experiencia de otros colaboradores [véase Phytopathology 57:322 (1967)], no se produjo respuesta hipersensible alguna.

Se creó la cepa Ea321(pCPP430) mediante el siguiente procedimiento:

Ejemplo II

Se hicieron crecer por la noche cepas Ea321, E. coli DH5\alpha(pCPP430) y E. coli DH5\alpha(pRK2013) en caldo LB que contenía, respectivamente, ningún antibiótico, 50 \mug/ml de espectinomicina, ó Km^{50}. La mañana siguiente se combinaron 0,5 ml de alícuotas de cada cepa, en un tubo de microcentrifugación, se centrifugaron durante 2 min. y se resuspendieron en 0,15 ml de caldo Luria (sin antibióticos). Se colocó un alícuota de 0,1 ml de esta suspensión en agar Luria (sin antibióticos) y se incubó durante 5 hr. a 28ºC. El crecimiento de dicha zona se resuspendió en 1 ml de tampón fosfato de potasio 5 mM, con pH 6,5, y se sembraron alícuotas de 0,1 ml en placas de medio mínimo de E. amylovora con 50 \mug/ml de espectinomicina para seleccionar las cepas de Ea321 que albergaban pCPP430. Se incubaron las placas durante 2-3 días a 28ºC. Con palillos se trasladaron simultáneamente colonias individuales a un medio mínimo que contenía 50 \mug/ml de espectinomicina y a un medio mínimo que contenía Km^{50}.Tan solo se seleccionaron para su posterior estudio las colonias que crecieron en el medio con 50 \mug/ml de espectinomicina (que indica la selección de pCPP430) pero no en el medio con Km^{50} (que indica pérdida del plásmido auxiliar pRK2013).

Aunque los sobrenadantes del cultivo libres de células de todas las bacterias utilizadas no indujeron la respuesta hipersensible, los preparados de determinadas células de una forma nueva tuvieron como resultado preparados libres de células que inducían una fuerte respuesta hipersensible en 12 horas que no podía distinguirse de la inducida por las células bacterianas metabolizadoras a partir de las cuales se habían elaborado los preparados. Se aisló el inductor de la respuesta hipersensible, se purificó y se caracterizó del preparado de inducción libre de células (CFEP) según el Ejemplo III.

El aislamiento del CFEP con harpin de DH5\alpha(pcPP430) de E. coli según una realización de la presente invención se describe en el siguiente ejemplo:

Ejemplo III

Se hicieron crecer células de DH5\alpha(pCPP430)de E. coli en medio Luria-Bertani (LB) hasta 0D_{620}=0,8, se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en una décima parte del volumen original en tampón fosfato de potasio 5 mM, con pH 6,6, con 0,1 mM de fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF), Un inhibidor de la serina proteasa. A continuación se rompieron las células mediante sonicación usando un Sonicator Ultrasonic Cell Disruptor^{TM} (Heat Sistemas-Ultrasonics) con una potencia de 4, y ajustando el programador de ciclo de pulsos a 40% del ciclo de trabajo (bajo estas condiciones, se trataron con ultrasonidos 10 ml de suspensión bacteriana durante 10 min. en hielo). Tras eliminar los desechos de la sonicación centrifugando a 12.000 x g durante 1 hora, se filtró el líquido sobrenadante a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,2 \mum para extraer las células intactas restantes. El preparado resultante, en diluciones de hasta alrededor de 1:10, pudo inducir la respuesta hipersensible en las hojas de tabaco. El CFEP contenía el material intracelular de un cultivo de OD_{620}=0,4, la misma densidad de células vivas de E. coli necesaria para inducir la respuesta hipersensible.

La purificación de harpin según el presente ejemplo se describe en el siguiente ejemplo:

Ejemplo IV

Experimentos iniciales que utilizaban el preparado obtenido del Ejemplo II indicaron que la actividad de inducción de la RH era estable al calor y de naturaleza proteinácea. El preparado conservó actividad de inducción de RH según se determinó mediante la infiltración de hojas de tabaco descrita anteriormente tras la incubación durante la noche a 65ºC. Sin embargo, excepto con PMSF, el inhibidor de la serina proteasa se había añadido durante la preparación, toda la actividad de inducción de RH se perdió tras 3 horas a 37ºC ó 6-8 horas a 4ºC. La incubación del preparado con pronasa E (Sigma) a 100 \mug/ml, durante 1 hora a 37ºC destruyó cualquier actividad inductora.

La ventaja de la estabilidad al calor del preparado inductor se utilizó para ayudar en la purificación adicional del inductor. Tan solo permaneció un número limitado de proteínas tras mantener el preparado inductor del Ejemplo III en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos y tras la posterior eliminación del material insoluble mediante centrifugación. Fue destacable una banda, correspondiente a 44 kD tras la electroforesis del preparado calentado del Ejemplo III en SDS-poliacrilamida (se prepararon geles de SDS-PAGE al 10% y se utilizaron según las instrucciones del proveedor, Hoeffer Scientific Instruments; proteína de los geles se tiñó con azul de Coomassie R-250 al 0,025% durante 30 min. y se destiñó con geles de metanol al 50% y de solución de ácido acético al 10%. Una banda con esta movilidad estuvo presente excepcionalmente en todos los preparados con actividad inductora de RH. Tras la determinación del preparado del Ejemplo III en un lecho de gel granulado con isoelectroenfoque o mediante cromatografía de intercambio iónico, las fracciones con actividad de inducción de RH siempre contenían una proteína que correspondía a un tamaño molecular de 44 kD con un pH de 4,0 a 4,5.

Para lograr una mayor purificación de la harpin, se aplicaron diversas técnicas de separación a los CFEP preparados como se describe en el Ejemplo III. Antes de cada paso, se calentó el CFEP en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, se enfrió a 25-30ºC y se centrifugó durante 10 min. a 12.000 x g. El líquido sobrenadante se retuvo y filtró a través de una membrana de filtración con un tamaño de poro de 0,2 \mum (Millipore, MF).

El CFEP tratado con calor se unió a una resina de intercambio aniónico (Whatman DE-52) y se eludió paso a paso con cantidades incrementales de KCI en tampón fosfato de potasio 5 mM, con pH 6,5. Se eludió la harpin de la columna con tampón con 90 mM de KCI. Se determinó la presencia de harpin mediante infiltración de sectores de hojas de trabajo con elementos de la columna que se habían concentrado hasta un 50% del volumen inicial. Además, se sometieron a electroforesis fracciones en geles SDS-PAGE según procedimientos estándar. Se obtuvo la purificación final con cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Se aplicaron los preparados purificados mediante cromatografía de intercambio fónico se ajustaron a pH 2 con la adición de ácido acético, a lo que siguió centrifugación para eliminar cualquier precipitado, a una columna preempaquetada de HPLC de fase inversa (YMC AQ-303). La columna se eludió con un gradiente de 10-70% de acetonitrilo con pH 2 en 0,25% de p/v de ácido trifluoroacético. La detección de la proteína se realizó por absorción de luz de 190 nm a 300 nm. Se comprobó la capacidad de inducir la RH de cada fracción de 0,25 ml infiltrando sectores de la hoja de tabaco.

El lecho de gel granulado utilizado para la resolución del preparado del Ejemplo III se elaboró con Bio-lyteT^{TM} (Bio-Rad Laboratories) tal y como recomienda el fabricante. Se utilizaron anfolitos de rango amplio, con pH 3-10 (Sigma) a una concentración final en la emulsión del 2%. Las soluciones del electrodo fueron 1M de H3PO4 (ánodo) y 1M de NaOH (cátodo).

Para determinar si la banda de proteína 44 kD predominante ("harpin") presente en todas las muestras inductoras de RH, poseían actividad inductora, se cortó la región sin teñir adecuada del gel SDS preparatorio y se sometió a electroelución con tampón sin SDS. La proteína eluída (200 \mug/ml) se dializó por la noche contra 2 litros de tampón fosfato de potasio 5 mM, con pH 6, 5, con 0,1 mM de fenil metil sulfonil fluoruro. A concentraciones \geq500 nM (\geq25 \mug/ml), harpin indujo la respuesta hipersensible en las hojas de todas las plantas comprobadas, entre las que se incluye tabaco, tomate y Arabidopsis thaliana.

La experimentación posterior confirmó que harpin era sensible a la proteasa, estable al calor y ácida. El tratamiento de harpin con proteasa suprimió la capacidad de inducción de la RH y eliminó la banda de proteína de 44 kD de los geles de SDS poliacrilamida. Sin embargo, al incubar harpin con proteasa que se había mantenido a 100ºC durante 10 min. para inactivar la enzima, el preparado conservó la actividad inductora de RH. Cuando estaba presente proteasa activa en la mezcla de infiltración, no se desarrolló ninguna respuesta hipersensible. Sin embargo, la infiltración de las hojas de tabaco solo con la proteasa activa o inactivada mediante calor no tuvo como resultado ningún síntoma macroscópico. Harpin conservó su actividad inductora de RH tras el calentamiento en un baño de agua hirviendo durante 10 min. La harpin purificada a partir de un gel SDS presentó un pH de 4,3 según se determinó por resolución en geles de isoelectroenfoque de capa fina utilizando técnicas convencionales.

La ubicación subcelular de la harpin según una realización de la presente invención se describe en el siguiente ejemplo;

Ejemplo V

Se sugirió la ubicación de la harpin en la superficie celular del organismo al efectuarse las siguientes observaciones: (I) el sobrenadante de E. amylovora Ea321(pCPP430) ó E. coli DH5\alpha(pCPP430) no indujo la respuesta hipersensible, lo cual indica que la harpin no se secreta en el medio, sino que está presente en o sobre la bacteria; (ii) tras la incubación a 37ºC durante 5 min. de todas las células Ea321(pCPP430) y E. coli DH5\alpha(pCPP430) con 40 y 80 \mug/ml de proteasa, respectivamente, y con 40 \mug/ml de tetraciclina para detener la producción continuada de harpin, la bacteria no pudo inducir una respuesta hipersensible. Cuando se incluyó 0,5 mM de PMSF, el inhibidor de la proteasa, en la mezcla de incubación descrita anteriormente, la bacteria indujo la respuesta hipersensible; Aparentemente, el PMSF protegió a la harpin de inactivación por proteasa. (La infiltración de hojas de tabaco con PMSF o solo con tetraciclina no tuvo efecto alguno, lo cual indicó que ninguno de los compuestos funciona independientemente en la provocación de la RH); (iii) el tratamiento de la bacteria con cantidades crecientes de proteasa tuvo como resultado una reducción de la capacidad de inducir la respuesta hipersensible, bien asociada con la desaparición de harpin de los geles SDS en los que se había sometido a electroforesis la bacteria tratada con proteasa [Tabla 1]: (iv) tras centrifugar el preparado del Ejemplo III a 105.000 x g durante 1 h, se encontró la mayoría de actividad inductora de RH en el líquido sobrenadante, sin embargo, al añadir 30 mM de MgCl_{2}, un estabilizador de membrana, antes de someterlo a ultrasonidos, la mayoría de la actividad estaba asociada al sedimento, que es la porción centrifugada que contiene las membranas; y (v) la cromatografía de permeación en gel del preparado sin hervir del Ejemplo III indicó la asociación del inductor con una fracción de peso molecular muy elevado (> 10^{6} D) que eran probablemente vesículas de membrana; y (vi) el fraccionamiento de las células lisadas de Ea321 (pCPP430) [véase Science 233:1403 (1985)] en la ultracentrifugadora y la reacción con anticuerpos específicos de harpin, solo tuvo como resultado la reacción con la fracción de membrana de la célula y el control de toda la célula.

Los resultados descritos anteriormente indicaron que la harpin está situada en o cerca de la superficie celular bacteriana y que es inestable. Las suspensiones celulares de Ea321(pCPP430) ó E. coli DH5\alpha(pCPP430) mantuvieron su actividad inductora de RH durante no más de 0,5 h y 1 h, respectivamente, en presencia de tetraciclina (40 \mug/ml), un inhibidor de la traducción. Además, no se detectó harpin cuando las células perdieron la actividad inductora de RH. Sin embargo, cuando se incluyó en la suspensión el inhibidor de proteasa PMSF (0,5 mM), la bacteria conservó la actividad inductora de RH durante más de dos horas, y se detectaron cantidades en descenso de harpin simultáneamente en los geles SDS con el paso del tiempo. Partiendo de un número igual de células, fue necesaria más proteasa para destruir la harpin y evitar la reacción hipersensible para E. coli DH5\alpha(pCPP430) que para Ea321 (pCPP430). Por lo tanto, la sensibilidad a de la harpin a la proteólisis puede explicar las observaciones previas de la breve naturaleza de la capacidad de inducción de RH de bacterias fitopatogénicas [véase Science 245:1374 (1989)].

El siguiente procedimiento y la Tabla 1 ilustran el protocolo y los resultados de la sensibilidad a la proteasa de la actividad inductora de RH de E. amylovora Ea321 que contiene su conjunto de genes hrp.

Se hicieron crecer células de E. amylovora Ea321(pCPP430) en medio LB y se cosecharon a OD_{620} = 0,6 mediante centrifugación. A continuación se resuspendieron las células en 0,1 volumen de 5 mM de tampón fosfato de potasio, con pH 6,5, con 40 \mug/ml de tetraciclina. Se añadió proteasa (como se indica en la Tabla 1) a 200 pl de suspensión celular y se incubó a 37ºC durante 5 minutos y posteriormente se infiltró 100 \mul de cada mezcla en hojas de tabaco. Se advirtió colapso pasadas 24 hr. tras la infiltración. Se mezcló 20 \mul de tampón de separación 5x 80 \mul de las mezclas restantes, se hirvió durante 5 minutos y a continuación se centrifugó durante 10 min. en una microcentrifugadora, antes de cargar 15 \mul en cada carril de gel SDS-PAGE aL 10%. Se realizó electroforesis durante 2 horas a 20 mA, seguido por el teñido con azul de Coomassie R-250 al 0,025% durante 30 min. y se destiñó con metanol al 50% y solución de ácido acético al 10%. Se esterilizó por filtrado el sobrenadante libre de células producido a partir del cultivo de LB y a continuación se concentró a una décima parte del volumen original con el Centriprep-10 (Amicon). El tratamiento con niveles más elevados de proteasa tuvo como resultado la pérdida de la capacidad de inducción RH y desaparición de la banda de harpin (44 kD) de los geles SDS. Los datos resultantes de este protocolo se describen en la siguiente tabla:

TABLA 1

Proteasa/ml	Inducción de RHHarpin
	en tabaco	detectada
0 \mug	+	+
5 \mug	+	+
10 \mug	+	+
20 \mug	débil.	+
40 \mug	-	-
80 \mug	-	-
80 \mug + 0,5 mM PMSF	+	+
sobrenadante libre de células	-	-
+ = una reacción positiva;
- = una reacción negativa.

La capacidad de las cepas bacterianas para inducir la respuesta hipersensible en hojas de tabaco intactas está fuertemente correlacionada con su capacidad para inducir una reacción de intercambio K^{+}/H^{+} en cultivos en suspensión de células de tabaco. Las dos reacciones están genéticamente relacionadas, puesto es necesaria una porción importante de conjuntos de genes hrp de E. amylovora para inducir la reacción de intercambio K^{+}/H^{+}. Por lo tanto, se comprobó el efecto de la harpin en cultivos en suspensión de células de tabaco según el siguiente ejemplo.

En el siguiente ejemplo se describe el efecto de la harpin en plantas, células y tejidos vegetales según las realizaciones de la presente invención.

Ejemplo VI

Para determinar si un preparado determinado poseía actividad inductora de RH, se utilizó una técnica similar a la utilizada con células bacterianas completas [véase Mol. Plant-Microbe Interact. 4:494 (1991). Se hicieron crecer plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L. "Xanthl") hasta una altura de 90-100 cm en mezcla de tierra artificial. Se trasladó las plantas del invernadero al laboratorio <24 hr. antes de la infiltración. La infiltración de la lámina de la hoja se efectuó con una jeringa sin aguja a través de pequeño orificio efectuado con una aguja de disección. El colapso de la zona infiltrada, indicativo de la RH, se registró pasadas 24 hr. tras la infiltración.

Todas las UFC que contenían la proteína de 44 kD, según la detección mediante SDS-PAGE, provocó colapsos de las zonas infiltradas de las hojas de tabaco. Harpin, purificada mediante HPLC (Ejemplo IV) indujo la RH a concentraciones \geq500 nM.

Para comprobar el efecto de la harpin en cultivos en suspensión de células de tabaco, se obtuvieron cultivos en suspensión de células de tabaco de cuatro días de vida (Nicotiana tabaccum var. Samsun) del programa de biotecnología de la universidad de Cornell. La suspensión celular se filtró a través de una sola capa de gasa de trama abierta en un vaso de laboratorio de 1 litro para eliminar las masas aglomeradas grandes. Medio de ensayo del tabaco: [MES 0,5 mM, manitol 0,175 M, K_{2}SO_{4} (2 ml de una solución patrón 0,25 M), CaCl_{2} (2 ml de solución patrón 0,25 M), 996 ml de agua de gran pureza; se ajustó a pH 6,0 con 1N NaOH y se filtró a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,2 \mum] que se utilizó para eliminar tantas células como fuera posible a través de una sola capa de gasa. Esta suspensión lavada y filtrada se vertió a continuación en un embudo de gran tamaño forrado con 1 capa de Miracloth^{TM} (tela no tejida), y se lavaron cuidadosamente las células que recubrían el MiraclothTM con un medio de ensayo de tabaco de 200-400 ml adicional. Se pesaron quince gm de células húmedas y se resuspendieron cuidadosamente en 415 ml de medio de ensayo de tabaco. Se midieron alícuotas de veinte ml de esta suspensión en vasos de plástico cónicos (diámetro superior de 4 cm; diámetro inferior de 2,5 cm; 4 cm altura) y se colocaron inmediatamente en un agitador giratorio ajustado a 150 rpm con un avance de 2 cm y se mantuvo a 25 _ 3ºC.

Se permitió que las células se equilibraran hasta que alcanzaron un pH de aproximadamente 5,8 (normalmente 20-30 min). Llegados a este punto, se añadió a cada muestra de célula de tabaco 1 ml de suspensión bacteriana o extracto sonicado, ó 0,5 ml de proteína purificada con 20 \mul de 20 \mug/ml de un concentrado de PMSF. El pH de la muestra se leyó con un medidor de pH Corning y se volvió a ajustar a pH 6 con 0,1 de N NaOH (ó 0,1 de N HCI según corresponda). La segunda lectura se tomó pasados 30 minutos de la primera lectura. Todas las lecturas posteriores se tomaron en intervalos de una hora hasta pasadas 6 horas tras la lectura en el momento 0. Todos los tratamientos se comprobaron por duplicado.

Se prepararon las suspensiones de células bacterianas haciendo crecer por la noche cultivos en LB con el antibiótico adecuado y a continuación se volvió a diluir las cepas hasta un OD_{620} de 0,20 a la mañana siguiente. Se volvieron a hacer crecer los cultivos a OD 0,4. En este OD, se estimó que las cepas de Ea321 y sus derivados tenían una concentración de aproximadamente 2 x loa ufc/ml. Cepas de E. coli DH5\alpha.y sus derivados se estimó que poseían una concentración de aproximadamente 1 x 10^{8} ufc/ml. Se centrifugaron las células a 5000 x g y se resuspendieron para producir concentraciones 5 veces mayores (para Ea321 y sus derivados) y 10 veces mayores (para E. coli y sus derivados) en 1 mM de tampón MES con pH 6. De este modo, se consiguieron concentraciones de células de aproximadamente de 1 x 10^{9} ufc/ml. Cuando se añadió una suspensión de células de 1 ml a 20 ml de suspensión de células de tabaco, la concentración final de ufc/ml del ensayo se estimó en 5 x 10^{7} por ml.

Las células de E. amylovora provocaron un aumento del pH de la solución de baño (una medida de la reacción de intercambio K^{+}/H{+}) con un retraso de 2-3 hr. tras la adición de la bacteria al cultivo de suspensión de células de tabaco (véase figura 2). Por el contrario, una adición única de harpin en el momento cero provocó un aumento rápido del pH de la solución de baño durante la primera hora. El pH disminuyó ligeramente durante la posterior incubación. Los mutantes de E. amylovora que no producen harpin in vitro no pudieron inducir la reacción de intercambio K^{+}/H^{+}. Cepas de E. coli que contenían mutaciones en el conjunto de genes hrp clonados de E. amylovora tampoco lograron inducir la reacción de intercambio. La inducción de la reacción de intercambio, así como la reacción hipersensible, de la harpin proporciona pruebas adicionales de que la harpin es activa en las interacciones bacteria-planta. Los datos procedentes de estos estudios sobre el efecto de harpin en cultivos de células de tabaco se presentan en la Figura 2.

El siguiente ejemplo proporciona una comparación de la harpin obtenida a partir de E. coli DH5\alpha(pCPP430) y de la obtenida de Ea 321.

Ejemplo VII

Para demostrar que la harpin se produce por E. amylovora y no por E. coli estimulada por la presencia de pCPP430, se utilizaron las mismas técnicas para su aislamiento de E. coli DH5\alpha(pCPP430) con E. amylovora Ea321, con la diferencia que se preincubaron las células en un medio inductor de RH durante 5 horas antes de someterlas a sonicación. Además, E. coli DH5\alpha(pCPP9), que alberga el vector de pCPP430, fue sometido a los mismos procedimientos que E. coli DH5\alpha(pCPP430). Una proteína aislada con el mismo peso molecular que la aislada de Ea321, poseía capacidad inductora de RH. En base a la intensidad relativa de la banda de 44 kD en los geles de SDS poliacrilamida, se estimó que E. amylovora Ea321 produce, en cada célula, alrededor de una décima cantidad de harpin que la que produce E. coli DH5\alpha(pCPP430). Las propiedades de la proteína inductora de E. amylovora Ea321 y E. coli DH5\alpha(pCPP430) fueron idénticas. No se observó actividad inductora de RH estable al calor y sensible a proteasa asociada con una proteína de 44 kD en extractos libres de células obtenidos a partir de E. coli DH5\alpha(pCPP9).

Las propiedades de la harpin de E. amylovora fueron consistentes con diversas observaciones fisiológicas importantes que se realizaron tras descubrir que las bacterias pueden inducir la respuesta hipersensible. La infiltración de tejidos de plantas con patógenos incompatibles e inhibidores de la proteína bacteriana o de la síntesis del ARN evitan la respuesta hipersensible [véase Phytopathology 72:1513 (1982)] lo cual indica que es necesario el nuevo ARN y la síntesis de proteínas. Cuando se infiltran las bacterias en agar diluido en agua, no se induce ninguna respuesta hipersensible, lo cual sugiere que es necesario el contacto estrecho entre las bacterias y las células de plantas. Las bacterias preinducidas perdieron rápidamente la capacidad de inducción de RH al ser infiltradas con inhibidores traduccionales o transcripcionales [véase Science 245:1374 (1989)]. Otras pruebas de que el inductor es un componente de la superficie celular bacteriana se han encontrado en observaciones de que el inductor no es difundible en tejido infiltrado de plantas y que cada bacteria introducida mata solo una célula de la planta. Como pronosticaron estas observaciones, la harpin está asociada con la superficie celular bacteriana y aparece con una naturaleza inestable debido a su extrema sensibilidad a la proteólisis. Por lo tanto, la degradación de la harpin puede ser importante en la regulación del desarrollo de la interacción planta-bacteria.

El fenotipo no patogénico de los mutantes de hrp sugiere que la harpin también es un factor primario determinante de la patogenicidad de E. amylovora. La base del papel esencial de la harpin tanto en interacciones compatibles (huésped:enfermedad) como en incompatibles (no huésped:respuesta hipersensible) no está clara. El rango de huéspedes de algunas bacterias patogénicas de plantas ha demostrado estar controlado por genes avr que pueden conferir incompatibilidad específica del cultivo a patógenos hrp^{+}. La actividad bioquímica de los productos de genes avr y la base de su dependencia de los genes hrp para la expresión fenotípica se desconoce, a pesar de que avrB se regula mediante genes hrp. La regulación de la producción o acumulación de harpin también pueden ser un factor determinante. las agrupaciones de genes hrp en E. amylovora se expresa alrededor de 10 veces menos en tejido huésped (pera) que en tejido no huésped (tabaco).

A pesar de que se han identificado los principales determinantes de la enfermedad en las bacterias patogénicas de las plantas que provocan tumores o maceración extensiva del tejido (fitohormonas y enzimas pécticas, respectivamente), se desconoce la base molecular de la patogenicidad entre bacterias que provoca necrosis retardada en un rango limitado de huéspedes. Entre dichas bacterias son económicamente importantes Pseudomonas syringae y Xanthomonas campestris pathovars. Las toxinas y las enzimas degradadoras de la pared celular vegetal pueden aumentar la virulencia de estos patógenos, pero los genes hrp son absolutamente necesarios para la multiplicación bacteriana en tejidos huésped y para la producción de síntomas de la enfermedad.

La conservación de los genes hrp [véase Laby, R.J., Molecular studies on pathogenicity and virulence factors of Erwinia amylovora, M.S. Thesis, Cornell University (1991)] sugiere que la harpin de E. amylovora es el arquetipo de una clase muy importante de determinantes de enfermedad bacteriana de la planta. Por lo tanto, la disrupción de la proteína harpin o del equilibrio correcto de su producción sería un nuevo enfoque en el control de las enfermedades bacterianas prevalentes en las plantas de cosecha. El modo de acción de la harpin también revelaría la base molecular de la respuesta hipersensible y de la resistencia de las plantas a una amplia gama de patógenos microbianos.

El siguiente ejemplo constituye una descripción de la determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal mediante la cual se localizó la proteína harpin codificadora de genes.

Ejemplo VIII

Para localizar la proteína harpin codificadora de genes, llamada hrpN, se determinó la secuencia parcial de los aminoácidos de la proteína harpin. Se utilizó una muestra de harpin (25 \mug) purificada por HPLC según el Ejemplo IV. Se evaporó una porción del eluido de la columna cromatográfica de fase inversa correspondiente a la elución pico a 42,5 min. se evaporó hasta casi sequedad en vacío para eliminar el solvente de acetonitrilo. A continuación se disolvió la fracción en tampón TE y se remitió al laboratorio de análisis de proteínas del programa de biotecnología de la universidad de Cornell con la solicitud de que se determinara la proporción de los diferentes aminoácidos presentes en la proteína y la secuencia de aminoácidos que empezaban a continuación de N-terminal.

Los resultados de dichos análisis se muestran en la siguiente tabla en la que la composición de aminoácidos de los análisis de harpin difieren solo ligeramente a partir de la composición de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN:

Aminoácido	% Deducido a	% Deducido a partir
	partir de ADN	de harpin
alanina	5,4	7,6
arginina	1,8	1,3
asparagina	7,0
ácido aspártico	5,7	14,2
cisteína	0	0
glutamina	6,5
ácido glutámico	2,1	9,3
glicina	22,0	22,0

(Continuación)

Aminoácido	% Deducido a	% Deducido a partir
	partir de ADN	de harpin
histidina	0,8	<1,0
Isoleucina	2,3	2,3
leucina	10, 6	10, 9
lisina	4,7	5,2
metionina	6,0	5,7
fenilalanina	1,6	2,0
prolina	3,1	2,3
serina	9,6	8,9
treonina	6,2	5,2
troptofano	0,5	-
tirosina	1,0	<1,0
valina	2,8	2,2

Los procedimientos utilizados para determinar la composición de aminoácidos incluye la hidrólisis de la proteína con 6N HCL seguido por derivación de los residuos aminoácidos y resolución según S.A. Cohen et al., 1984, American Laboratory p. 48.

La secuencia de aminoácido N-terminal de harpin según una realización de la presente invención se determinó según los métodos de Hunkapiller [véase Methods Of Prolpin Microcharacterization; A Practical Handbook ppg 223-247, Humana Press, Clifton, New Jersey (1986)] es la siguiente:

\sa{Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile}

La secuencia de aminoácido deducida de harpin (incluida la secuencia de aminoácido N-terminal indicada anteriormente) según una realización de la presente invención:

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(Secuencia pasa a página siguiente)

5

Se utilizó la secuencia parcial de aminoácidos de harpin para construir una sonda oligonucleótida cuyas bases se corresponden a las que codifican los aminoácidos noveno a quinceavo de la región N-terminal de harpin. Puesto que muchos de estos aminoácidos pueden tener codones de ácido nucleico, se construyó un oligonucleótido degenerado 48 veces según procedimientos estándar.

En el siguiente ejemplo se describe la identificación de clones que codifican la harpin por hibridación con una sonda oligonucleótida para harpin.

Ejemplo IX

Se identificó el gen estructural que codifica la harpin por hibridación de la sonda oligonucleótida identificada por hibridación de la sonda oligonucleótida construida en el Ejemplo VIII con ADN de Erwinia amylovora. Al ADN específico clonado en la agrupación hrp de E. amylovora en el cósmido pCPP430 se digiró con la enzima de restricción HindIII. Los resultados de la digestión de ADN se sometieron a electroforesis en agarosa al 0,7%, se tiñeron con bromuro de etidio, se transfirieron a una membrana de nylon (Immobilon) y se hibridaron con la sonda oligonucleótida anteriormente descrita, según procedimientos estándar. La sonda se marcó con fósforo radioactivo utilizando GTP marcado con 32P.

Tras la hibridación y la exposición de las membranas a película de rayos X X-O-Mat (Kodak) y el desarrollo de la película, un fragmento de 1,3 kb HindIII dio la señal de hibridación más fuerte como respuesta a la sonda. El fragmento se subclonó en el vector pBluescript M13+ (Stratagene), y se designó pCPP1084.

La producción de anticuerpos antiharpin se describe en el siguiente ejemplo:

Ejemplo X

Se produjeron anticuerpos en conejos como respuesta a una inyección de harpin. Se administraron tres inyecciones de harpin altamente purificada (100, 150 y 50 \mug, respectivamente) en intervalos de 2-3 semanas. Se cosechó el antisuero pasadas 8 semanas, se precipitó el IgG con sulfato de amonio y se preabsorbió con lisato de E. coli DH5\alpha(pCPP9) sonicado. Se confirmó la especifidad del antisuero mediante reacción en borrones de Western de harpin purificada por HPLC tal y como se describe en el Ejemplo VII. No se observó reacción con suero preinmune cuando se hibridaron los borrones de Western que contenían CFEP procedente de DH5\alpha(pCPP430).

La descripción de hrpN en el sistema de expresión de T7 ARN polimerasa/promotor se describe en el siguiente ejemplo:

Ejemplo XI

Para confirmar que el fragmento de 1,3 kb de HindIII contiene el gen hrpN completo, el plásmido pGpI-2 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:1074 (1985)] y pCPP1084, que contiene el fragmento de 1,3 kb de HindIII bajo el control de T7\phi10 promotor, se transformó en E. coli DH5\alpha,o Ea321. Estos dos plásmidos compatibles constituyen el sistema de expresión T7. Se cultivaron las células que contienen ambos pGpl-1 y pCPP1084 se cultivaron en LB con 100 \mug/ml de ampicilina y 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Se cosecharon dos cientos \mul de células a O_{D620}=0, 5 y se lavaron con 5 ml de medio M9 [Sambrook, J., E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor. (1989)]. Finalmente, las células se resuspendieron en 1,0 ml de medio M9 complementado con 0,01% de 18 aminoácidos (sin cistidina ni motionina). Se cultivaron las células con agitación (200 rpm) a 30ºC durante 1 hr. y a continuación se pasaron a 42ºC durante 10 min. Se añadió rifampicina (20 mg/ml de solución patrón Sigma R350I en metanol) hasta alcanzar una concentración final de 200 \mug/ml. Se incubaron las células a 42ºC durante 10 minutos y se pasó a 30ºC y se incubó durante 1 hora más. Las células se pulsaron con 10 PC1 de 35S metionina durante 5 minutos a 30ºC. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 50 \mul de "tampón de separación" (60 mM de Tris-HCI, con pH 6.8. 1% de SDS, 1% de 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol y 0,01% de azul de bromofenol). Se calentaron las muestras a 100ºC durante 3 min. y se colocaron 20 \mul en gel SDS-PAGE al 10%. Tras someterlo a electroforesis a 15 mA durante 2,0 hr. en un aparato Mighty Small^{TM} (según las instrucciones de Hoefer Scientific Instruments), se secó el gel y se expuso a película de rayos X durante 2 hr. a temperatura ambiente. Se observó una banda sencilla de 44 kD, cuyo tamaño molecular correspondía a la de harpin, en las construcciones E. coli DH5\alpha. y Ea321. La banda de 44 kD expresada desde este sistema también reaccionó con anticuerpos antiharpin provocados en conejos (Ejemplo X). Este experimento demostró que el fragmento de 1,3 kb de HindIII contiene marco de lectura abierto completo que codifica la proteína harpin de 44 kD.

La secuencia de ácido nucleico del gen hrpN según una realización de la presente invención se determinó según el siguiente ejemplo.

Ejemplo XII

Se efectuó el análisis de secuenciación de ADN mediante el método de terminación de la cadena dideoxi (Sanger 1977, PNAS 74:5643-5667). Se verificaron las secuencias de ambas cadenas utilizando el cebador universal o el cebador T3 Los subclones generados por Kpnl y Pt+1 desde el fragmento de 1,3 kb de HindIII se utilizaron directamente como plantillas para la secuenciación. La secuencia de nucleótido de hrpN se remitió a Genbank y se le asignó el número de acceso M92994. A continuación se muestra la secuencia de nucleótido.

7

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8

En esta secuencia, el marco de lectura abierto (incluyendo el codón de terminación TGA) que se expresa para proporcionar la secuencia de aminoácidos de harpin es la siguiente:

9

10

La sobreexpresión del gen hrpN para producir cantidades más grandes de harpin se ilustra en el siguiente ejemplo:

Ejemplo XIII

Se construyó un nuevo plásmido designado pCPP50 especialmente para la expresión alta de harpin del siguiente modo:

Se modificó el vector de expresión pINIIIl13-A2 [véase Bio/Technology, pp 81-85 (Jan. 1984)]. Se digirió con la endonucleasa de restricción Xbal y HindIII que tuvo como resultado dos fragmentos. El fragmento más pequeño de ADN se desechó y se sustituyó con una porción del poliligador pBluescript SK- (Xbal a HindlIl). Estas manipulaciones eliminaron el sitio de unión de ribosomas y el codón de iniciación (ATG) de pINIII113-A2 y se los sustituyó por diversos sitios de clonación útiles (Xbal, SpeI, BamHI, Smal, Pstl, EcoRV, HindIII, BamHI). El vector resultante (pCPP50) se utilizó en combinación con el gen hrpN para facilitar la sobreproducción de harpin por E. coli.

El plásmido pCPP1084, con hrpN (Ejemplo VII) se digirió con la endonucleasa de restricción HindIII. El fragmento de ADN de 1,3 kb de HindIII se purificó a partir de un gel de agarosa y se ligó con pCPP50 que también había sido digerido con HindIII y tratado con fosfatasa alcalina. El ADN se transformó en E. coli DH5\alpha. Se analizaron diversos transformantes en un gel de SDS-poliacrilamida para la producción de una proteína que correspondiera a la movilidad conocida de la harpin. Un clon, designado pCPP2139, produjo grandes cantidades de harpin.

Se produjeron grandes cantidades de harpin en E. coli DH5\alpha(pCPP2139) según el siguiente procedimiento: E. coli DH5\alpha(pCPP2139) se cultivó en medio mínimo M9 complementado con 5 g/1 de ácidos casamino y 40 mg/1 de tiamina. Las bacterias se cultivaron durante 20 horas adicionales a 37ºC. Se aisló harpin a partir de la bacteria según el Ejemplo III.

La harpin producida por E. coli DH5\alpha(pCPP2139) fue activa en ensayos en hoja de trabajo y tenía el mismo peso molecular en geles de SDS-poliacrilamida y reaccionó con antisueros antiharpin (Ejemplo X) al igual que la harpin producida por E. coli DH5\alpha(pCPP430).

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En ensayos de dilución de hoja de tabaco, el CFEP producido a partir de E. coli DH5\alpha(pCPP2139) tenía una actividad detectable en una dilución 1:150. E. coli DH5\alpha(pCPP430) tenía una actividad detectable en una dilución de solo 1:10. Por lo tanto, E. coli DH5\alpha(pCPP2139) produjo al menos 15 veces tanta harpin como E. coli DH5\alpha(pCPP430). Los resultados a los que se hace referencia se incluyen en la siguiente tabla.

TABLA 2

CFEP a partir de cepa de E.coli	Diluciones
	1:10	1:20	1:50	1:100	1:150	1:200
DH5\alpha(pCPP2139)	+	+	+	+	+	-
DH5u(pCPP430)	+	-	-	-	-	-
+ = una reacción positiva, colapso del tejido de tabaco al igual que en la respuesta hipersensible;
- = una reacción negativa, no hay colapso del tejido de hoja de tabaco

Se extrajeron conclusiones similares mediante examen de los geles de SDS-poliacrilamida que contenían preparados de harpin de las dos construcciones.

Además de determinar hrpN en E. amylovora, y debido a que se cree que la harpin es el arquetipo de una familia de inductores proteináceos de RH producidos por diversas bacterias fitopatogénicas diferentes, la identificación de homólogos de hrpN también se realizó en Erwinia chrysanthemi y Erwinia stewartii según el siguiente protocolo.

Ejemplo XIV

Se utilizó el fragmento de ADN de 1,3 kb de HindIII de pCPP1084, que contenía hrpN, con una sonda radioactiva contra 18 cósmidos que se había demostrado previamente que contenían genes hrp de la cepa AC4150 de E. chrysanthemi. Un cósmido, pCPP2157, se hibridó fuertemente con el clon HrpN bajo condiciones de alta astringencia (lavados realizados en 0,4 xSSC, 0,2% SDS, 65ºC). Se utilizó el cósmido en análisis posteriores. Se clonó un fragmento de 800 bp Clal de pCPP2157, el cual se había hibridado con la sonda HrpN, en pBluescript SK- para producir pCPP2140. La secuenciación inicial del ADN (utilizando el kit Sequenase versión 2,0, U.S. Biochemicals) de un extremo del fragmento 800 bp Clal presentó una región de 224 nucleótidos con una identidad nucleótida del 72%. La comparación de la secuencia se realizó con FASTA, y la secuencia de nucleótidos de E. chrysanthemi correspondiente al hrpN de E. amylovora (mayor similitud) del nucleótido 1005 al 1223 indica una identidad del 72%. A continuación se describe la secuencia de E. chrysanthemi:

11

Utilizando un protocolo similar, se utilizó el fragmento de ADN de 1,3 kb de Hind III de pCPP1084 para explorar un ADN de E. stewartii. El ADN genómico de la cepa DC283 y el ADN del clon cósmido pES411 [véase Coplin et al., Mol. Plant-Microbe Interactions. 5:266-268 (1992)] se hidrolizaron con Hind III, se sometieron a electroforesis y se hibridaron. Se hibridó con la sonda un fragmento de 1,8 kb de Hind III de ambos preparados de ADN. Estos resultados indican que el hrpN de E. amylovora comparte homología con un gen parecido a hrpN de E. stewartii.

A continuación se describen los dos medios de inactivación de la gravedad de la enfermedad en las plantas de la harpin.

Ejemplo XV

La inactivación de la harpin por medio de reacción de células E. amylovora con un antisuero específico para harpin (Ejemplo X) o bien con una proteasa que degrada la harpin (Ejemplo VII) tuvieron como resultado una reducción en la enfermedad del peral provocada por E. amylovora. Las peras inmaduras, cosechadas cuando el diámetro del fruto era de 3-4 em, se cortaron por la mitad a lo largo y se colocaron sobre toallas de papel humedecidas. Se cortaron pocillos en las partes centrales de la fruta con un sacabocados del número 1 (véase Beer. S.V. Methods in Phytobacteriology, pp 372-375 (1990) Klement. Z., Rudolf, K. y Sands, D. eds). Se mezcló un ml de un cultivo de Ea321 (2 x 10^{8} ufc/ml) con 50 \mul y 100 \mul de una dilución de 1:25 de antisuero antiharpin (Ejemplo X), y pasados 5 minutos, se depositó 50 \mul de la mezcla en el pocillo de cada pera. De forma similar, se mezclaron suspensiones de Ea321 con proteasa antes de depositarlas en los pocillos de la pera. Las peras se incubaron a 27ºC y se observaron diariamente durante 3 días.

Los controles consistieron en células no tratadas y células mezcladas con suero preinmune extraído del mismo conejo. En la siguiente tabla se muestran los resultados:

Tratamiento	Transfección
Ea321	8/8
Ea321 + Proteasa(100 \mug/ml	6/8
Ea321 + Proteasa (200 \mug/ml)	5/8
Ea321 + Antisuero (50 \mul/ml)	5/8
Ea321 + Antisuero (100 \mul/ml)	5/8
Ea321 + Suero preinmune (100 \mul/ml)	8/8
* \begin{minipage}[t]{155mm} Número de mitades de pera tratadas (de un total de 8) que presentaron exudado en los extremos cortados pasadas 64 horas tras la inoculación con 50 \mu l con 1 x 10^{8} ufc de Ea321 tratado como se ha indicado anteriormente.\end{minipage}

El tratamiento de E. amylovora con proteasa o antisuero específico para harpin redujo el número de peras infectadas. El tratamiento con suero proinmune (normal) no tuvo efecto alguno en el desarrollo de la enfermedad. La prueba mencionada anteriormente sobre el efecto de los dos tratamientos que afectan a la harpin sin afectar a la vitalidad o crecimiento de E. amylovora fue especialmente severa. Tan solo podía resultar afectada la harpin presente en las células tratadas porque el antisuero o enzima no podía estar presente para reaccionar con la harpin en la progenie de las células tratadas. Bajo condiciones previstas para el uso práctico, los anticuerpos antiharpin podrían ser producidos por plantas transformadas con genes que codifiquen anticuerpos antiharpin o con proteasa, y estos a su vez inhibirían o atenuarían la gravedad de la enfermedad de la planta expuesta al inductor. Asimismo, en la naturaleza, el tratamiento de los manzanos o perales en flor con proteasa o anticuerpos antiharpin puede tener como resultado una mayor reducción del fuego bacteriano, ya que normalmente las infecciones las inician un pequeño número de células, en contraposición a alrededor de 10^{8}, como se utilizó en el ejemplo anterior.

De este modo, para resumir la presente invención, hay sólidas pruebas de que la harpin es el arquetipo de factores proteináceos que permiten que las bacterias patogénicas vegetales (y posiblemente otros microorganismos patogénicos) induzcan la respuesta hipersensible en no huéspedes o estimulen la enfermedad en huéspedes. Para comenzar, cepas de los tres géneros Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas inducen una respuesta hipersensible similar (visual y fisiológicamente) al ser infiltradas en hojas de sus plantas no huésped respectivas. Esta relación está documentada prácticamente desde el descubrimiento de la respuesta hipersensible inducida por bacterias en 1963. Además, los genes necesarios para la inducción de la RH por las cepas de dichos tres géneros de bacterias (referidos de forma conjunta, como genes hrp) también son los necesarios para la patogenicidad de las plantas huésped y para la inducción de la respuesta hipersensible en plantas no huésped.

La relación entre los genes hrp de las bacterias fitopatogénicas está documentada en los estudios de Laby and Beer [Molecular Plant Microbe Interactions 5:(1992); R.J. Laby, Molecular studies on pathogenicity and virulence factors of Erwinia amylovora, M.S. Thesis, Cornell University, Ithaca, NY 1991]. Demostraron definitivamente relaciones, a nivel del ADN, entre el conjunto de genes hrp de E. amylovora y el conjunto de genes hrp de Pseudomonas syringae, así como la relación entre el conjunto de genes hrp de E. amylovora y el conjunto de genes wts (clorosis) de E. stewartii. Otros investigadores han demostrado una relación sorprendente entre los genes hrp de diversos P. syringae pathovars (cepas de P. syringae patogénico para plantas específicas y diferentes). Otros investigadores han demostrado una relación estrecha entre los genes hrp de cepas de Xanthomonas campestris y de P. solanacearum. Por lo tanto, existen pruebas abrumadoras de que el ADN conservado entre bacterias patogénicas de plantas de diversos géneros provoca enfermedades en multitud de plantas.

También se ha demostrado la significativa similitud en la secuencia de ADN del gen hrpN de E. amylovora y del gen homólogo de E. chrysanthemi, según la presente invención. Además, hemos observado una fuerte hibridación entre el hrpN y el ADN genómico de E. stewartii, un patógeno grave para el maíz. Más específicamente, se observó hibridación entre hrpN y un fragmento de 1,8 kb de Hind III específico del conjunto de genes wts. Esto indica que las otras dos especies de Erwinia examinadas hasta la fecha poseen hrpN homólogos. Por lo tanto, puede esperarse una similitud significativa en los productos de genes parecidos a hrpN (proteína) según las realizaciones de la presente invención.

Además, muchos de los genes hrp de E. amylovora parecen estar implicados en la secreción de la exposición en la superficie de la célula de harpin, según el fenotipo de las mutaciones en dichos genes. Un gen del conjunto de genes hrp de Pseudomonas syringae, que se hibrida con una porción del conjunto de genes hrp de E. amylovora, codifica una proteína con una gran similitud un aminoácidos con proteínas implicadas en la secreción de diversas bacterias gram-negativas.

Por lo tanto, las similitudes conocidas de los genes hrp de Pseudomonas, Xanthomnonas, y Erwinia constituyen una base firme para sospechar que los inductores de RH producidos por cepas de los tres géneros pueden tener una secuencia de aminoácidos similar o al menos en cuanto a sus características generales (proteína) y función.

Los usos a los que se destina en los diversos aspectos y partes de la presente invención son muchos y variados. Por ejemplo, pueden utilizarse mutantes hrpN para identificar, por complementación, genes de otros organismos patogénicos para las plantas (por ej., bacterias, hongos, nemátodos) que codifican las proteínas que funcionan de forma similar a la harpin. A pesar de que dichas proteínas pueden tener unas estructuras primarias sustancialmente diferentes (y, por lo tanto, serían difíciles de detectar mediante técnicas de hibridación de ADN), dichas proteínas deberían restablecer la capacidad para inducir la RH a células de E. amylovora o de E. coli que poseen el conjunto hrp funcional, exceptuando el gen hrpN.

Otro uso dentro del alcance de la presente invención es utilizar la harpin y/o cepas productoras de harpin para identificar en las plantas receptores de harpin y/o sus interactores en los sistemas de transducción de señales y para clonar sus genes codificadores. Por lo tanto, esto permitiría explotar el potencial de la harpin para funcionar (según la planta) como un factor de patogenicidad o como un inductor de reacciones de defensa para manipular la estructura o expresión de genes vegetales que codifican receptor(es) con el objetivo de producir plantas manipuladas genéticamente con una resistencia mejorada a los patógenos de las plantas.

Otro uso de la harpin dentro del alcance de la presente invención sería como potenciador de la producción de un metabolito secundario en plantas cultivadas de forma natural o en cultivo de tejido.

Otro uso sería la fusión de la harpin codificadora de genes a promotores específicos de los genes de las plantas para desarrollar plantas transgénicas específicas. Cuando se "activa" el gen de la planta, se expresa la harpin y se matan las células de la planta. Algunos promotores de genes de planta adecuados y sus usos proyectados incluyen genes implicados en el desarrollo del polen (lo cual tendría como resultado el desarrollo de plantas macho estériles); genes que se expresan en respuesta a una infección por hongos, por ej., genes que codifican fenilalanina amonio liasa y chalcona sintasa (se eliminaría la célula de la planta limitando de ese modo el progreso del hongo y haciendo que la planta sea resistente a las enfermedades por hongos); y genes implicados en el desarrollo de senescencia (para facilitar la cosecha, la expresión de genes hrp tendría como resultado la desfoliación).

Otro uso de la harpin dentro del alcance de la presente invención sería la utilización de harpin como una "molécula objetivo" con la que reaccionarían compuestos químicos diseñados para ello, inactivando de ese modo la harpin bacteriana, la cual, y debido a que es esencial para la enfermedad, proporcionaría un objetivo bactericida específico.

En la presente patente se describe un listado de los nucleótidos y aminoácidos:

De ese modo hemos ilustrado y descrito las realizaciones preferidas de esta invención. Debe entenderse que la presente invención puede variarse y modificarse, y por lo tanto, los inventores no desean limitarse a los términos precisados, sino que desean validar dichos cambios y alteraciones que pudieran realizarse para adaptar la invención a sus diversos usos y condiciones. Dichas variaciones y modificaciones, por ejemplo, incluyen la sustitución de secuencias similares estructuralmente, tanto del inductor como de los genes hrpN descritos en la presente memoria (independientemente de si se derivan de fuentes naturales o de fuentes fabricadas sintéticamente), que funcionan para obtener actividades sustancialmente similares a las descritas específicamente anteriormente. Por lo tanto, se consideran dentro del alcance de la presente invención los cambios en la secuencia por la eliminación, inserción o adición de ácidos nucleicos (en las secuencias de ADN) o aminoácidos (en las secuencias de péptidos) que no alteren sustancialmente las secuencias descritas específicamente. En consecuencia, dichos cambios y alteraciones se destinan a ser el rango completo de equivalentes y por lo tanto dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

De ese modo, se ha descrito el modo y proceso de la invención para elaborarla y utilizarla con los términos completos, claros, concisos y exactos para permitir a cualquier experto en la técnica a la que pertenezca, o que esté relacionada, elaborarla y utilizarla.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Zhong-Min Wel, David W. Bauer, Steven V. Beer, Alan Colimer, Sheng-Yang He, y Ron J. Laby

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Inductor de la respuesta hipersensible en plantas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENAS: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº:1:

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\sa{Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 385 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENAS: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº:2:

12

13

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: pares básicos 1287

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(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: pares básicos 1158

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº:4:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº:5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: pares básicos 222

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº:5:

17

Claims (14)

1. Una proteína capaz de inducir una respuesta hipersensible en diferentes especies de plantas cuando se introduce dicha proteína en tejido de hoja de una planta bajo condiciones normales de crecimiento, en donde dicha proteína está codificada por una secuencia de un ácido nucleico capaz de hibridarse en una secuencia complementaria de un ácido nucleico con SEQ ID Nº. 4 bajo condiciones astringentes de lavado de x 0,4 SSC, SDS 0,2% SDS a 65ºC.

2. Un péptido según la reivindicación 1 que corresponde a un inductor de respuesta hipersensible de un patógeno Erwinia, Pseudomonas, o Xanthomonas.

3. Un péptido según la reivindicación 1 ó 2 que es sensible a la proteasa, ácido, posee un peso molecular de aproximadamente 44kD, un pH de aproximadamente 4,3 y que es estable al calor a 100ºC durante al menos un minuto.

4. Un péptido del grupo formado por

18

19

un péptido similar con al menos una adición de aminoácidos, un péptido similar con al menos una eliminación de aminoácidos, un péptido similar con al menos una sustitución de aminoácidos y un péptido similar con al menos una inserción de aminoácidos, siempre que dicha adición, eliminación, sustitución e inserción no inhiba la actividad inductora de respuesta hipersensible del péptido.

5. Un gen para su inserción en un huésped adecuado para permitir la expresión de harpin, formado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo

20

200

una secuencia similar con al menos una adición de ácido nucleico, una secuencia similar con al menos una eliminación de ácido nucleico, una secuencia similar con al menos una sustitución de ácido nucleico y una secuencia similar con al menos una inserción de ácido nucleico, en combinación con un vector para introducir la secuencia en el huésped adecuado y siempre que dicha adición, eliminación, sustitución e inserción no inhiba la expresión de harpin que posee actividad inductora de la respuesta hipersensible.

6. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde dicho péptido está purificado, recombinado, o no posee cisteína.

7. Una molécula de ADN aislada que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 6.

8. Una molécula de ADN según la reivindicación 7, en donde la molécula de ADN posee una secuencia nucleótida que corresponde a SEC ID Nº. 4.

9. Una molécula de ADN según la reivindicación 7 u 8, en donde dicho péptido posee un peso molecular de 44 kDa en un gel de poliacrilamida SDS.

10. Un sistema de expresión que contiene una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 ó 9.

11. Una célula huésped que contiene una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 o 9.

12. Una célula huésped según la reivindicación 11, en donde dicha célula huésped es Escherichia coli DH5 (pCPP430).

13. Una célula huésped según la reivindicación 11, en donde dicha célula huésped posee Nº. de acceso ATCC 69021.

14. Una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde la molécula de ADN se encuentra en un sistema de expresión.