ES2255669T3 - Uso de uno o varios secuestrantes de oxigeno liberados de plasma y componentes de pared celular naturales o modificados para el tratamiento externo de heridas abiertas, especialmente cronicas. - Google Patents

Abstract

Uso de uno o varios secuestrantes de oxígeno naturales o modificados liberados de plasma y componentes de pared celular, seleccionados de hemoglobina o mioglobina de origen humano o animal, o derivados modificados de los mismos, o mezclas de los mismos para la preparación de un agente para el tratamiento externo de heridas abiertas.

Description

Uso de uno o varios secuestrantes de oxígeno liberados de plasma y componentes de pared celular naturales o modificados para el tratamiento externo de heridas abiertas, especialmente crónicas.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere al uso de uno o varios secuestrantes de oxígeno liberados de plasma y componentes de pared celular naturales o modificados para la preparación de un agente para el tratamiento externo de heridas abiertas, especialmente crónicas. Como secuestrantes de oxígeno son adecuadas la hemoglobina o mioglobina de origen humano o animal. Los secuestrantes de oxígeno pueden estar también preferiblemente modificados. Las modificaciones adecuadas son reticulación, reacción con poli(óxidos de alquileno), efectores químicamente reactivos o químicamente no reactivos o combinaciones. El agente puede aplicarse sobre la zona herida especialmente mediante pulverización de una disolución acuosa que contiene el o los secuestrantes de oxígeno. Pueden utilizarse de forma especialmente eficaz los secuestrantes de oxígeno en heridas crónicas debido a la degeneración del tejido, ante todo, la degeneración del tejido diabético.

Antecedentes de la invención

Para el tratamiento de heridas se usan distintos procedimientos en función del estado. En primer lugar, debe desinfectarse una herida todavía abierta y por tanto protegerse contra influencias negativas externas. Esto puede realizarse mediante disoluciones de desinfección o apósitos de pulverización adecuados o también mediante la aplicación de una disolución de yodo. La verdadera curación de herida debe realizase entonces desde dentro. Esto significa que los vasos sanguíneos todavía presentes deben suministrar suficientemente sustratos a los tejidos destruidos para que puedan utilizar el mecanismo reparador de tejido.

Las heridas pueden estar causadas por los factores más distintos como, por ejemplo, lesiones o también después de operaciones o incidentes traumáticos.

Por otro lado, es conocido que la formación de heridas, especialmente también de heridas crónicas, puede estar producida por enfermedades en las que aparece una degeneración y/o estrechamiento de vasos grandes y/o pequeños. Esto puede suceder, por ejemplo, en pacientes ancianos por un largo posicionamiento (decúbito). Es otro ejemplo de esto la diabetes mellitus, la denominada enfermedad del azúcar, que tiene como consecuencia una degeneración observable y arteriosclerosis (P. Carpenter, A. Franco, "Atlas der Kapillaroskopie", 1983, Abbott, Max-Plack-Inst. 2, D-Wiesbaden) de los vasos grandes y pequeños (macro- y microangiopatía de las arterias). A este respecto, podría comprobarse además, ante todo en la piel que rodea la herida, mediante la medida de la denominada presión parcial de oxígeno transcutáneo, una reducción de esta magnitud de medida. Esto significa que se presenta aquí una falta de oxígeno (hipoxia). Como valor crítico es válido 5,33 kPa (C.D. Müller, Hartmann Wund Forum 1,
(1999), 17-25).

A través de las arterias fluye la sangre a los tejidos, también a la piel. Suministra a las células continuamente los sustratos necesarios para la vida. Una degeneración de estos vasos conduce a una falta de suministro de sustratos a las células y a su muerte. Los sustratos deben superar por difusión o filtración la pequeña última parte del recorrido aparentemente sin importancia de aproximadamente 20 \mum de los vasos más pequeños (capilares) a las células, en este momento desempeña un papel especial el oxígeno, porque el organismo tiene problemas especiales en relación con este sustrato.

Se trata en este momento de 3 problemas:

(1)

El oxígeno es absolutamente necesario para la vida (después de aproximadamente 5 minutos una persona sufre muerte cerebral si su cerebro no recibe oxígeno), pero igualmente el oxígeno es altamente tóxico (un recién nacido que respira oxígeno puro muere después de pocos días).

(2)

El oxígeno tiene una muy baja solubilidad en medio acuoso. Esto conduce, según la primera ley de Fick a una baja difusividad del oxígeno. Hay que añadir una ley fundamental de la difusión, a saber, la relación de Smoluchowski y Einstein, que indica que la velocidad de difusión (del oxígeno) se reduce al aumentar la distancia de difusión. La constante de difusión del oxígeno es entonces tan baja que ya a una distancia de difusión de sólo 20 \mum la velocidad de difusión asciende sólo a un 5% del valor inicial. Por tanto, una capa de agua de sólo 50 \mum representa prácticamente un aislamiento total de oxígeno para las células. El oxígeno está en cierto modo inmovilizado. Se transporta por convección con la corriente sanguínea por los largos recorridos en el organismo desde los pulmones a las puntas de los dedos de los pies unido a la hemoglobina, y sólo así es capaz de superar las grandes distancias en un tiempo razonablemente corto para el organismo.

(3)

Para el oxígeno no hay ningún almacén en el cuerpo, en contraposición, por ejemplo, con la glucosa; por lo consiguiente, este sustrato debe ponerse a disposición de las células constante y rápidamente en cantidad suficiente; el oxígeno es lo que se denomina un sustrato inmediato necesario para la vida.

El organismo ha resuelto estos problemas con ayuda de distintos mecanismos. Los efectos tóxicos del oxígeno se evitan al unirse éste a la hemoglobina y hacerse inocuo. Al mismo tiempo, se diluye el oxígeno libre y se pierde así además potencial oxidativo dañino. A pesar de ello, se pone a disposición en cantidad suficiente instantáneamente, porque el enlace con hemoglobina es reversible. El problema del bajo alcance difusivo se resuelve al haber desarrollado el organismo una red vascular finamente dispersada (sistema capilar), que garantiza que de promedio cada célula está separada sólo como máximo 25 \mum de un capilar; de este modo el recorrido de difusión del oxígeno en el organismo permanece por debajo de la longitud crítica de 50 \mum. Continuamente además, una célula puede ser suministrada por difusión por varios lados con oxígeno; esto representa un mecanismo de seguridad. El oxígeno inmediato según las necesidades no debe estar presente en exceso, si no actuaría perjudicialmente. La disponibilidad del oxígeno se consigue en el organismo mediante una regulación vascular de la corriente vascular que controla la circulación sanguínea y, por tanto, optimiza el suministro de oxígeno.

En caso de que exista una superficie de herida abierta, se suprime el suministro por difusión de oxígeno por varios lados de la capa celular superficial. Ésta es como un cultivo celular. Su suministro de oxígeno desde fuera es por tanto malo, porque se forma sobre la capa celular una película líquida acuosa que, como se ha explicado, forma una barrera difusiva de oxígeno por las leyes de difusión correspondientes. Esto se ilustra en la siguiente Figura 1a, en la que se indica esquemáticamente la capa de agua que se forma sobre las células del fondo de la herida. Las heridas recientes en tejidos normales pueden curarse en caso conveniente en algunos días, en caso de que el suministro de oxígeno desde la parte inferior, por consiguiente desde dentro, sea suficiente. Sin embargo, en estudios experimentales animales se ha podido comprobar que también dichas heridas recientes curan algo mejor cuando se aumenta la concentración de oxígeno del aire circundante (M.P. Pai y col., Sug. Gyn. Obstet. 135 (1972), 756-758). Las heridas antiguas, especialmente crónicas, no pueden simularse en ensayos animales. En seres humanos, sin embargo, curan como es sabido con su notable falta de oxígeno sólo muy lentamente o nada en
absoluto.

Para poder curar mejor entonces también heridas crónicas, se ha empleado la denominada terapia de oxígeno hiperbárico (OHB). En este momento, se disponen los pacientes en cámaras de alta presión donde se aplica una sobrepresión de oxígeno puro de aproximadamente 300 kPa durante un tiempo conocido de aproximadamente una hora en las denominadas sesiones. Una terapia de herida normal abarca aproximadamente 40 de dichas sesiones (C.D. Müller y col., Hartmann Wund Forum 1 (1999), 17-25). Realmente, se consiguen de este modo las curaciones de heridas. Sin embargo, las terapias múltiples se demuestran menos exitosas, y el efecto puede disminuir también con el número de pasos. Esto es explicable: ciertamente, mejora el suministro de oxígeno de las células de herida superficiales, pero esto se paga, como se ilustra anteriormente, con un efecto tóxico del oxígeno concentrado a alta presión; finalmente prevalece probablemente el efecto dañino.

La patente de EE.UU. 2.527.210 del año 1944 describe una disolución de hemoglobina que es utilizable tanto por vía intravenosa como tópica, por ejemplo, mediante pulverización para el tratamiento de heridas. La hemoglobina se obtiene en este momento a partir de eritrocitos recientes, que se someten a un shock de congelación después de centrifugación y separación por succión del plasma sanguíneo sobrenadante. De esta manera, se realiza una lisis celular y se libera la hemoglobina. Se presentan con el producto las paredes celulares degradadas. Se trata en esta preparación de un detritus celular concentrado (residuo celular). Para el tratamiento superficial, debe conseguirse de esta manera especialmente un efecto de recubrimiento antiséptico, como habitualmente mediante disolución de yodo, después de haber añadido previamente sulfuro de sodio al 5%. Por consiguiente, aquí solamente se cierra la herida. Para ajustar correctamente la viscosidad del producto, por ejemplo, para aplicación por pulverización, se añade plasma. No se cita aquí un transporte de oxígeno.

Este modo de aplicación de dichos productos de hemoglobina se abandonó públicamente en lo sucesivo. Así, el documento WO 97/15313 describe el uso terapéutico de hemoglobina para mejorar la curación de heridas. Para ello, se administra sistémicamente hemoglobina libre de estroma y pirógenos, por consiguiente por vía intravenosa, a pacientes, especialmente después de operaciones o incidentes traumáticos para aumentar la presión sanguínea. Se utiliza especialmente una hemoglobina reticulada con diaspirina con este fin.

Sin embargo, la administración sistémica intravenosa de hemoglobina puede ejercer sólo la conocida influencia indirecta por un lado sobre la curación de heridas, ya que debe realizarse el suministro de los vasos sanguíneos que se encuentran en la herida desde dentro y, por tanto, no es posible ninguna posibilidad de tratamiento desde fuera y tampoco de sobrepasar la barrera de dispersión anteriormente descrita.

Además, es dudosa una aplicación de componentes de membrana celular sobre heridas abiertas, ya que los fosfolípidos emitidos por la membrana celular notoriamente son parcialmente muy tóxicos.

En un informe publicado en Internet el 14.3.2002 (www.sangui.de/en/Stock/news: "Study demonstrates effectiveness of oxygen in skin treatment") se informa de que pueden tratarse la piel envejecida o las arrugas con emulsiones que contienen portadores de oxígeno naturales o artificiales. Sin embargo, no se trata en este momento de heridas abiertas, en las que está presente una capa de barrera como se ha explicado.

Objetivo de la invención

Por tanto, el objetivo de la presente invención es utilizar uno de dichos productos para el tratamiento de heridas abiertas con el que se transporte localmente oxígeno desde fuera selectivamente a los vasos sanguíneos afectados, especialmente dañados, sin afectar a todo el organismo, por consiguiente sistémicamente, con lo que pueden evitarse efectos secundarios indeseados.

Explicación de la invención

Este objetivo se consigue según la invención al preparar un agente que presenta un secuestrante (o portador) de oxígeno natural o artificial liberado de plasma y componentes de pared celular o mezclas de los mismos según la reivindicación 1, preparado éste último mediante una modificación adecuada de uno natural, y al incorporar éste a la capa de barrera de oxígeno del fondo de la herida. En este momento, en virtud del secuestrante (portador) de oxígeno incorporado, se crea un transporte de oxígeno eficaz a través de la capa de barrera debido al mecanismo de difusión facilitada (véase la Figura 1b).

Sorprendentemente, no se realiza aquí por consiguiente un recubrimiento y cierre de la herida. Además, es posible una curación de herida acelerada mediante el suministro de oxígeno desde fuera a los vasos sanguíneos inicialmente ya no intactos. Mediante este mecanismo, se ofrece a las células del fondo de la herida el oxígeno de modo fisiológico, a saber, a partir de la unión a hemoglobina, en forma no tóxica y en cantidad suficiente directamente al lugar deseado, evitando el daño oxidativo.

Esto es ante todo sorprendente por eso, porque el estado de la técnica enseña que es posible una curación de herida externa más bien con agentes antisépticos como yodo o hidrogeles (véase el documento WO 97/15313, página 3, línea 1) o bien un tratamiento desde dentro de la misma, y una aplicación externa de hemoglobina conduce al sellado de la herida o se consigue una curación de herida especialmente eficaz mediante una oclusión externa con hipoxia, veáse Gretenar y col., Schweiz Med. Forum, 2001, 237-242.

Según la invención, se utiliza un secuestrante de oxígeno natural (nativo) como se ha descrito seleccionado de hemoglobina o mioglobina o un derivado modificado de los mismos o mezclas de los mismos. La modificación puede ser una reticulación intramolecular, una polimerización (reticulación intermolecular), una pegilación (ligamiento covalente con poli(óxidos de alquileno)), una modificación con efectores químicamente reactivos como 5'-fosfato de piridoxal o 5'-fosfato de 2-nor-2-formilpiridoxal, o también con efectores químicamente no reactivos de secuestro de oxígeno como, por ejemplo, 2,3-bisfosfoglicerato, hexafosfato de inositol, hexasulfato de inositol o ácido melítico, o una combinación de los mismos. Para la mioglobina, no es posible ninguna reticulación intramolecular como para la hemoglobina, sino todas las demás modificaciones. Dichos productos son conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos DE-A 10031744, DE-A 10031742 y DE-A 10031740. Se describen también reticulaciones de portadores de oxígeno en los documentos DE 1970137, EP 97100790, DE 4418937, DE 3841105, DE 3714351, DE 3576651.

Son secuestrantes de oxígeno modificados especialmente preferidos hemoglobinas con un peso molecular de 65.000 a 15.000.000, como productos reticulados intramolecularmente como según el documento WO 97/15313, especialmente polímeros como productos reticulados intermolecularmente con un peso molecular medio de 80.000 a 10.000.000 g/mol, especialmente 100.000 a 5.000.000, o mioglobinas preparadas análogamente con un peso molecular medio de 16.000 a 5.000.000, especialmente 100.000 a 3.000.000, preferiblemente hasta 1.000.000 g/mol. Se prefieren muy especialmente aquellos portadores de oxígeno que están polimerizados, por ejemplo, con reticulantes conocidos para reacción intermolecular como reticulantes bifuncionales como diepóxido de butadieno, divinilsulfona, diisocianato, especialmente hexametilendiisocianato, ciclohexildiisocianato y ácido 2,5-bisisocianatobencenosulfónico, éster de di-N-hidroxisuccinimidilo, diimidoéster o dialdehído, especialmente glioxal, el glicolaldehído de reacción análoga o glutardialdehído.

Además, se prefieren aquellos productos que están polimerizados de este modo y que están pegilados con un polietilenglicol o derivado adecuado del mismo. Pertenecen a ellos, por ejemplo, poli(óxido de etileno), poli(óxido de propileno) o un copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno o un éster, éter o esteramida de los mismos. Se prefiere además cuando el poli(óxido de alquileno) ligado covalentemente presenta una masa molecular de 200 a 5.000 g/mol.

Para el ligamiento covalente de los poli(óxidos de alquileno), se usan preferiblemente aquellos derivados de poli(óxidos de alquileno) que contienen un agente ligante con un grupo funcional ya unido covalentemente que proporciona una reacción química directa con grupos amino, alcohol o sulfhidrilo de la hemoglobina, formando ligamientos covalentes de los poli(óxidos de alquileno), por ejemplo, poli(óxidos de alquileno) con grupos reactivos éster N-hidroxisuccinimidilo, epóxido (glicidiléter), aldehído, isocianato, vinilsulfona, yodoacetamida, imidazolilformiato, tresilato, entre otros. Muchos de dichos polietilenglicoles activados monofuncionales son comercialmente
obtenibles.

La preparación de dichos secuestrantes de oxígeno modificados se describe en las solicitudes de patente alemana citadas anteriormente.

Son muy especialmente preferidos los productos de hemoglobina modificados reticulados (intra o intermolecularmente) o reticulados y pegilados, con un peso molecular medio de 250.000 a 750.000 g/mol o productos de mioglobina con un peso molecular medio de 50.000 a 750.000 g/mol. Ante todo, se prefieren aquellos productos que reaccionan adicionalmente con efectores químicamente reactivos o químicamente no reactivos de secuestro de oxígeno o una combinación de los mismos.

El secuestrante de oxígeno, que actúa también como portador de oxígeno, puede ser a este respecto de origen humano o animal, como de caballo, vaca o preferiblemente de cerdo. A este respecto, el producto se purifica libre de plasma y componentes de pared celular mediante medidas conocidas adecuadas como centrifugación y ultrafiltración fraccionada. No se realiza una lisis celular mediante congelación profunda, ya que de otro modo no puede obtenerse la composición deseada. El producto está además libre de estroma y pirógenos.

Especialmente, los portadores de oxígeno así preparados como se ha descrito pueden purificarse también como, por ejemplo, cromatográficamente (por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por volumen preparativa), mediante centrifugación, filtración o ultrafiltración, separarse en fracciones de distintos pesos moleculares y a continuación procesarse adicionalmente, véanse, por ejemplo, los documentos DE-A 10031740 o WO 02/00230.

De forma especialmente preferida, se usa como secuestrante de oxígeno hemoglobina humana o de cerdo que es natural o modificada como se ha citado.

Además, puede utilizarse también mioglobina. Se prefiere en este momento la natural humana, siendo posible también cualquier otra procedencia animal o también modificada como se ha citado. Ésta se obtiene como se ha citado anteriormente para la hemoglobina, pero no es posible la reticulación intramolecular. Pueden utilizarse también mezclas de secuestrantes de oxígeno naturales con modificados como, por ejemplo, en relación 20:1 a 1:20, referida al peso.

Son también posibles mezclas de mioglobina y hemoglobina o sus derivados modificados en la relación anteriormente citada de 20:1 a 1:20.

El agente se prepara como se describe con detalle a continuación, mediante la incorporación del secuestrante de oxígeno a un medio acuoso.

Según la invención, se realiza el tratamiento de heridas abiertas, especialmente crónicas (por consiguiente ya no recientes) tanto en seres humanos como en animales, prefiriéndose la aplicación en seres humanos, mediante tratamiento tópico con los secuestrantes de oxígeno descritos. Para la aplicación, se disuelve el o los secuestrantes de oxígeno en un medio acuoso en una cantidad de 0,1 a 35% en peso, especialmente 0,1 a 20, ante todo 0,1 a 15% en peso. El portador, es decir, el medio acuoso, presenta ante todo electrolitos fisiológicamente compatibles, como sales en cantidades adecuadas. Pertenecen a ellas cloruro de sodio, cloruro de potasio, calcio, magnesio, hidrogeno(bi)carbonato de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio. Éstas se presentan preferiblemente a concentración fisiológica o también múltiplos de la misma, por ejemplo, 10 veces, pero también en cantidades de 0,1 a 30% en peso, siendo especialmente adecuado para ello el cloruro de sodio. Los electrolitos pueden presentarse también en mezclas.

Dado el caso, pueden estar presentes también otros aditivos, a saber, de 0 a 20, preferiblemente 0,1 a 20, especialmente 0 a 15% en peso, preferiblemente 0,1 a 15, especialmente 0,1 a 10% en peso. Estos son especialmente nutrientes para las células. Se seleccionan ante todo de glucosa, por ejemplo, en cantidades de 0,1 a 5% en peso, insulina en cantidades de hasta 25 UI/ml, los aminoácidos naturales conocidos para la respectiva aplicación, por consiguiente los aminoácidos conocidos para los seres humanos o para los animales respectivos, por ejemplo, 0 ó 0,01 a 5% en peso, o también factores tisulares como interleuquinas desde cantidades fisiológicas hasta cantidades 10 veces mayores.

Dado el caso, puede ser ventajoso si están contenidos además como aditivos antioxidantes como acetilcisteína, superoxidodismutasa en cantidades de 0,001% en peso a 2% en peso. En este caso, actuaría éste también como catalasa, si se utiliza como hemoglobina/derivado secuestrante de oxígeno.

El agente se aplica externamente. Según el estado de la herida, se frota o preferiblemente se pulveriza finamente. A este respecto, pueden utilizarse uno o varios secuestrantes de oxígeno distintos. Así, pueden utilizarse en el agente, por ejemplo, el o los secuestrantes de oxígeno naturales a concentración especialmente alta, el o los productos modificados también a concentración especialmente baja, según la necesidad, o también seleccionarse una combinación de ambos grupos si la viscosidad para la aplicación de pulverización debe ajustarse especialmente. En otro caso, la selección del o de los secuestrantes de oxígeno y su concentración es respectivamente independiente e igualmente eficaz.

Según la invención, se ha mostrado que pueden tratarse eficazmente las heridas abiertas, especialmente también las crónicas por las causas más distintas. Así, pueden tratarse aquellas después de operaciones, después de traumatismos, lesiones o también debido a alteraciones degenerativas de tejidos. A este respecto, se trata tanto de alteraciones degenerativas de vasos sanguíneos arteriales como de heridas debidas a una insuficiencia venosa crónica. Pertenecen a ellas especialmente heridas por decúbito así como crónicas, ante todo debidas a una enfermedad diabética.

Ejemplos

La invención se ilustra con detalle mediante los siguientes ejemplos.

I. Preparación de agentes según la invención Ejemplo 1

Se liberó hemoglobina natural humana de plasma y componentes de pared celular mediante centrifugación y ultrafiltración y se purificó.

Se disolvieron 8% en peso de ella en 100 ml de agua que contenía 0,9% en peso de cloruro de sodio, así como 5% en peso de glucosa y 20 UI/ml de insulina.

Ejemplo 2

Se desoxigenó hemoglobina de cerdo de alta pureza, disuelta a una concentración de 330 g/l en un electrolito acuoso de composición NaHCO_{3} 50 mM y NaCl 100 mM, a 4ºC mediante agitación de la disolución bajo nitrógeno puro constantemente renovado sobre la disolución. A continuación, se añadieron 4 mol de ascorbato de sodio (en forma de disolución 1 molar en agua) por mol de hemogolobina (monomérica), y se dejó reaccionar durante 6 h. La disolución se tituló con ácido láctico 0,5 molar a un valor de pH de 7,1, se añadieron 1,1 mol de 5'-fosfato de piridoxal por mol de hemoglobina y se dejó reaccionar durante 16 h. Entonces, se ajustó con lejía de sosa 0,5 molar un valor de pH de 7,8, se añadió 1,1 mol de borohidruro de sodio (en forma de una solución 1 molar en lejía de sosa 0,01 molar), y se dejó reaccionar durante 1 hora. Entonces, se ajustó a un pH de 7,3 con ácido láctico 0,5 molar, se añadieron en primer lugar 1,1 mol de 2,3-bisfosfoglicerato por mol de hemoglobina y después de 15 min de tiempo de reacción
8 mol de glutardialdehído por mol de hemoglobina disuelto en 1,8 l de agua pura por litro de disolución de hemoglobina, para la reticulación de la hemoglobina durante 5 minutos, y se dejó reaccionar durante 2,5 horas. Después de titulación con lejía de sosa 0,5 molar a un valor de pH de 7,8, siguió una adición de 15 mol de borohidruro de sodio (en forma de una disolución 1 molar en lejía de sosa 0,01 molar) por mol de hemoglobina durante 1 h. Se realizó una adición de
2 l de agua por litro de disolución de hemoglobina original. El valor de pH ascendió entonces a 9,3, y siguió directamente una adición de 4 mol de propionato de metoxisuccinimidilo-polietilenglicol de peso molecular 2.000 g/mol durante 2 h. Se sustituyó la atmósfera de nitrógeno sobre la disolución por oxígeno puro.

Después de 1 h, se separaron los componentes insolubles mediante centrifugación (20.000 g durante 15 min). A continuación, se realizó un intercambio del electrolito mediante una cromatografía de exclusión por volumen (gel Sephadex G-25, Pharmacia, Alemania) por una disolución electrolítica acuosa de composición NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y NaHCO_{3} 20 mM.

El rendimiento ascendió a 77%; el rendimiento para pesos moleculares mayores de 700.000 g/mol es de 28%.

Las medidas de las características de secuestro de oxígeno en condiciones fisiológicas (una temperatura de 37ºC, una presión parcial de dióxido de carbono de 5,33 kPa y un valor de pH de 7,4) proporcionaron al producto un valor de p50 de 2,93 kPa y un valor de n50 de 1,95.

Este secuestrante de oxígeno es especialmente adecuado para el uso según la invención en disolución acuosa como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 3

La síntesis de la hemoglobina humana reticulada con glutardialdehído se realizó como en el ejemplo 2, pero usando hemoglobina humana concentrada de alta pureza y utilizando un exceso molar de 16 veces de reticulante. Los polímeros se obtuvieron mediante fraccionamiento de la disolución de los productos de reticulación con ayuda de una cromatografía de exclusión por volumen (según el documento EP-A 951072800: "Verfahren zur Herstellung molekular-einheitlicher hyperpolymerer Hämoglobine" con gel Sephacryl S-300 HR, Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania) (aquí como el 57% en masa que primero eluye de hemoglobina reticulada).

Las hemoglobinas reticuladas se dividieron en dos partes A y B. La hemoglobina A (véase la figura 3) se evidenció predominantemente como hemoglobina polimérica con un valor modal de distribución del peso molecular de
950 kg/mol (véase el ejemplo 1). La unión covalente de mPEG-SPA-1000 activo monofuncional se realizó análogamente al ejemplo 2 para el modo de actuación descrito para la hemoglobina de cerdo reticulada. Después de la adición de hidrogenocarbonato de sodio (hasta 150 mM) a la disolución del polímero, pudo hacerse reaccionar mPEG-SPA-1000 en exceso molar de 12 veces con los monómeros de hemoglobina. A continuación de un tiempo de reacción de una hora, se añadió lisina en un exceso molar de 60 veces para la "absorción" de las moléculas todavía activas de mPEG-SPA-1000. Tanto la hemoglobina reticulada según la disolución A como el producto reticulado y pegilado según la disolución B son adecuados para el uso según la invención.

Ejemplo 4

Se preparó hemoglobina de vaca reticulada mediante la reticulación de hemoglobina de vaca concentrada de alta pureza con un exceso molar de 14 veces de glutardialdehído según el ejemplo 2, un fraccionamiento molecular de los productos de síntesis y la unión de mPEG-SPA-1000 según el ejemplo 2 ó 3.

La Figura 5 muestra una distribución del peso molecular del polímero de hemoglobina no modificada, a saber, un diagrama de elución de una cromatografía de exclusión por volumen (en gel "Sephacryl S-400 HR", Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania), el valor modal de la distribución del peso molecular asciende aquí a 810 kg/mol.

Ejemplo 5

Se hicieron reaccionar hemoglobina de cerdo desoxigenada concentrada de alta pureza disuelta en un electrolito acuoso de composición NaHCO_{3} 50 mmol/l y NaCl 100 mmol/l a temperatura ambiente con glutardialdehído en exceso molar de 14 veces. Se añadió cianoborohidruro de sodio en exceso molar de 10 veces a la hemoglobina (monomérica), se redujeron las bases de Schiff formadas en la reticulación y se estabilizó la reticulación covalente. La disolución obtenida de hemoglobina reticulada se dividió en tres partes (A, B y C) y se procesaron adicionalmente de forma distinta.

La parte A permaneció sin cambios, la determinación de la distribución del peso molecular (según Pötzschke H. y col. (1996, Macromolecular Chemistry and Physics 197, 119-1437, así como Pötzschke H. y col. (1996, Macromolecular Chemistry and Physics 197, 3229-3250) aplicando cromatografía de exclusión por volumen con el gel Sephacryl S-400 HR (Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania), proporcionó un valor modal de la distribución del peso molecular de la hemoglobina de cerdo reticulada de 520 kg/mol

Los polímeros de la parte B se ligaron covalentemente con mPEG-SPA-1000 activo monofuncional (Shearwater Polymers Europe, Enschede, Holanda): en primer lugar se añadió hidrogenocarbonato de sodio en forma de sólido hasta una concentración final de 150 mmol/l a la disolución de hemoglobina reticulada, a continuación se realizó la adición de mPEG-SPA-1000 en exceso molar de 12 veces (referido a los monómeros de hemoglobina) igualmente en forma de sólido. Después de un tiempo de reacción de una hora, se añadió lisina en un exceso molar de 60 veces (referido a la hemoglobina) y reaccionó con las moléculas de mPEG-SPA-1000 todavía activas.

Parte C: Se procesó la disolución de hemoglobina reticulada igual que se describe para la parte B, pero usando mPEG-SPA-2000 (Shearwater Polymers Europe, Enschede, Holanda).

A continuación, se realizó un intercambio de disolvente en las tres disoluciones A, B y C (con ayuda de una ultrafiltración "Ultraminisette 10 kDa", Pall Gelman Sciences, RoBdorf, Alemania o una cromatografía de exclusión por volumen en gel "Sephadex G-15 M", Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania) por una disolución en un electrolito acuoso (dis. est.) de composición: NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y NaN_{3} 3 mM.

Todos los productos según la disolución A, B o C son adecuados para el fin según la invención.

Ejemplo 6

Se preparó hemoglobina reticulada intramolecularmente como se describe en el ejemplo 2, pero a 0,1% de concentración.

Ejemplo 7

Se purificó por cromatografía en gel mioglobina humana natural comercial (por ejemplo, de Sigma, Alemania). Ésta puede utilizarse según la invención como tal o también modificada como se describe anteriormente.

Ejemplo 8

Se añadieron 10% de una hemoglobina humana no modificada como se describe en el ejemplo 1 y 5% de un producto modificado como se describe en el ejemplo 2 a 100 ml de agua purificada que contenía 0,9% en peso de cloruro de sodio, 0,2% en peso de bicarbonato de sodio, 1% en peso de glucosa. La disolución está inmediatamente lista para uso.

Ejemplo 9

Se añadieron 8% en peso de una mioglobina humana modificada con polietilenglicol, preparada según el ejemplo 3, disolución A, a 100 ml de agua purificada que contenía 0,9% en peso de cloruro de sodio, así como 5% en peso de glucosa, 20 UI/ml. La disolución está inmediatamente lista para uso y también es especialmente estable.

II. Ejemplos de aplicación Ejemplo 10

Se aplicó finamente una disolución según el ejemplo 2 a una herida crónica existente durante mes en el lado interno del tobillo izquierdo de una paciente femenina, debida a una insuficiencia venosa crónica, sobre toda la superficie con ayuda de un pulverizador fino. Esto se realizó dos veces al día. Después de 20 días, se mostró una clara granulación de la base de la herida perfilándose el borde la herida y formándose un epitelio temporal. Después de 2 meses, se cerró la herida.

Ejemplo 11

En un paciente masculino existía hacía 1 año una dehiscencia de 10 cm de longitud y 4 cm de anchura después de oclusión arterial de la pierna izquierda y amputación del metatarso (boca de pez). Se realizó un tratamiento como se describe en el ejemplo 10 después de la limpieza previa de la herida crónica con larvas y disolución concentrada de urea. Después de 4 meses, se cerró la herida.

Claims (17)

1. Uso de uno o varios secuestrantes de oxígeno naturales o modificados liberados de plasma y componentes de pared celular, seleccionados de hemoglobina o mioglobina de origen humano o animal, o derivados modificados de los mismos, o mezclas de los mismos para la preparación de un agente para el tratamiento externo de heridas abiertas.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el o los portadores de oxígeno se seleccionan de hemoglobina humana o de cerdo natural o modificada o mezclas de las mismas.

3. Uso según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se utiliza mioglobina modificada o natural o mezclas de las mismas.

4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utilizan hemoglobina y mioglobina o derivados modificados de las mismas en una relación de mezcla de 1:20 a 20:1.

5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la modificación del o de los secuestrantes de oxígeno es una reticulación intra- o intermolecular, una pegilación, una reacción con efectores químicamente reactivos o químicamente no reactivos o una combinación de las mismas.

6. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque la modificación es una reticulación intermolecular, una pegilación o una combinación de las mismas.

7. Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque se presenta como modificación adicionalmente una reacción con un efector químicamente reactivo o químicamente no reactivo, o una combinación de los mismos.

8. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el o los secuestrantes de oxígeno se aplican en forma de una disolución sobre la herida.

9. Uso según la reivindicación 8, caracterizado porque la aplicación del o de los secuestrantes de oxígeno ha de realizarse mediante pulverización.

10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el o los secuestrantes de oxígeno se aplican en forma de una disolución acuosa que contiene sales fisiológicamente compatibles, así como 0,1 a 15% en peso del o de los secuestrantes de oxígeno y de 0 a 20% en peso o desde concentración fisiológica hasta 10 veces mayor de aditivos.

11. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque comprende como sales fisiológicamente compatibles aquellas seleccionadas de cloruro de sodio, hidrogenocarbonato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y magnesio, citrato de sodio, lactato de sodio o mezclas de los mismos.

12. Uso según una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque los aditivos se seleccionan de glucosa, insulina, aminoácidos, antioxidantes y factores tisulares.

13. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque han de tratarse heridas crónicas, heridas de operación, heridas de lesiones y heridas por traumatismos.

14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque han de tratarse heridas crónicas debidas a una degeneración o estrechamiento de los vasos sanguíneos arteriales.

15. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque han de tratarse heridas crónicas debidas a una enfermedad diabética.

16. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque han de tratarse heridas por decúbito.

17. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque han de tratarse heridas debidas a una insuficiencia venosa crónica.