ES2255669T3 - Uso de uno o varios secuestrantes de oxigeno liberados de plasma y componentes de pared celular naturales o modificados para el tratamiento externo de heridas abiertas, especialmente cronicas. - Google Patents
Uso de uno o varios secuestrantes de oxigeno liberados de plasma y componentes de pared celular naturales o modificados para el tratamiento externo de heridas abiertas, especialmente cronicas.Info
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Abstract
Uso de uno o varios secuestrantes de oxígeno naturales o modificados liberados de plasma y componentes de pared celular, seleccionados de hemoglobina o mioglobina de origen humano o animal, o derivados modificados de los mismos, o mezclas de los mismos para la preparación de un agente para el tratamiento externo de heridas abiertas.
Description
Uso de uno o varios secuestrantes de oxígeno
liberados de plasma y componentes de pared celular naturales o
modificados para el tratamiento externo de heridas abiertas,
especialmente crónicas.
La presente invención se refiere al uso de uno o
varios secuestrantes de oxígeno liberados de plasma y componentes de
pared celular naturales o modificados para la preparación de un
agente para el tratamiento externo de heridas abiertas,
especialmente crónicas. Como secuestrantes de oxígeno son adecuadas
la hemoglobina o mioglobina de origen humano o animal. Los
secuestrantes de oxígeno pueden estar también preferiblemente
modificados. Las modificaciones adecuadas son reticulación, reacción
con poli(óxidos de alquileno), efectores químicamente reactivos o
químicamente no reactivos o combinaciones. El agente puede aplicarse
sobre la zona herida especialmente mediante pulverización de una
disolución acuosa que contiene el o los secuestrantes de oxígeno.
Pueden utilizarse de forma especialmente eficaz los secuestrantes de
oxígeno en heridas crónicas debido a la degeneración del tejido,
ante todo, la degeneración del tejido diabético.
Para el tratamiento de heridas se usan distintos
procedimientos en función del estado. En primer lugar, debe
desinfectarse una herida todavía abierta y por tanto protegerse
contra influencias negativas externas. Esto puede realizarse
mediante disoluciones de desinfección o apósitos de pulverización
adecuados o también mediante la aplicación de una disolución de
yodo. La verdadera curación de herida debe realizase entonces desde
dentro. Esto significa que los vasos sanguíneos todavía presentes
deben suministrar suficientemente sustratos a los tejidos destruidos
para que puedan utilizar el mecanismo reparador de tejido.
Las heridas pueden estar causadas por los
factores más distintos como, por ejemplo, lesiones o también después
de operaciones o incidentes traumáticos.
Por otro lado, es conocido que la formación de
heridas, especialmente también de heridas crónicas, puede estar
producida por enfermedades en las que aparece una degeneración y/o
estrechamiento de vasos grandes y/o pequeños. Esto puede suceder,
por ejemplo, en pacientes ancianos por un largo posicionamiento
(decúbito). Es otro ejemplo de esto la diabetes mellitus, la
denominada enfermedad del azúcar, que tiene como consecuencia una
degeneración observable y arteriosclerosis (P. Carpenter, A. Franco,
"Atlas der Kapillaroskopie", 1983, Abbott,
Max-Plack-Inst. 2,
D-Wiesbaden) de los vasos grandes y pequeños (macro-
y microangiopatía de las arterias). A este respecto, podría
comprobarse además, ante todo en la piel que rodea la herida,
mediante la medida de la denominada presión parcial de oxígeno
transcutáneo, una reducción de esta magnitud de medida. Esto
significa que se presenta aquí una falta de oxígeno (hipoxia). Como
valor crítico es válido 5,33 kPa (C.D. Müller, Hartmann Wund
Forum 1,
(1999), 17-25).
(1999), 17-25).
A través de las arterias fluye la sangre a los
tejidos, también a la piel. Suministra a las células continuamente
los sustratos necesarios para la vida. Una degeneración de estos
vasos conduce a una falta de suministro de sustratos a las células
y a su muerte. Los sustratos deben superar por difusión o filtración
la pequeña última parte del recorrido aparentemente sin importancia
de aproximadamente 20 \mum de los vasos más pequeños (capilares)
a las células, en este momento desempeña un papel especial el
oxígeno, porque el organismo tiene problemas especiales en relación
con este sustrato.
Se trata en este momento de 3 problemas:
- (1)
- El oxígeno es absolutamente necesario para la vida (después de aproximadamente 5 minutos una persona sufre muerte cerebral si su cerebro no recibe oxígeno), pero igualmente el oxígeno es altamente tóxico (un recién nacido que respira oxígeno puro muere después de pocos días).
- (2)
- El oxígeno tiene una muy baja solubilidad en medio acuoso. Esto conduce, según la primera ley de Fick a una baja difusividad del oxígeno. Hay que añadir una ley fundamental de la difusión, a saber, la relación de Smoluchowski y Einstein, que indica que la velocidad de difusión (del oxígeno) se reduce al aumentar la distancia de difusión. La constante de difusión del oxígeno es entonces tan baja que ya a una distancia de difusión de sólo 20 \mum la velocidad de difusión asciende sólo a un 5% del valor inicial. Por tanto, una capa de agua de sólo 50 \mum representa prácticamente un aislamiento total de oxígeno para las células. El oxígeno está en cierto modo inmovilizado. Se transporta por convección con la corriente sanguínea por los largos recorridos en el organismo desde los pulmones a las puntas de los dedos de los pies unido a la hemoglobina, y sólo así es capaz de superar las grandes distancias en un tiempo razonablemente corto para el organismo.
- (3)
- Para el oxígeno no hay ningún almacén en el cuerpo, en contraposición, por ejemplo, con la glucosa; por lo consiguiente, este sustrato debe ponerse a disposición de las células constante y rápidamente en cantidad suficiente; el oxígeno es lo que se denomina un sustrato inmediato necesario para la vida.
El organismo ha resuelto estos problemas con
ayuda de distintos mecanismos. Los efectos tóxicos del oxígeno se
evitan al unirse éste a la hemoglobina y hacerse inocuo. Al mismo
tiempo, se diluye el oxígeno libre y se pierde así además potencial
oxidativo dañino. A pesar de ello, se pone a disposición en cantidad
suficiente instantáneamente, porque el enlace con hemoglobina es
reversible. El problema del bajo alcance difusivo se resuelve al
haber desarrollado el organismo una red vascular finamente
dispersada (sistema capilar), que garantiza que de promedio cada
célula está separada sólo como máximo 25 \mum de un capilar; de
este modo el recorrido de difusión del oxígeno en el organismo
permanece por debajo de la longitud crítica de 50 \mum.
Continuamente además, una célula puede ser suministrada por
difusión por varios lados con oxígeno; esto representa un mecanismo
de seguridad. El oxígeno inmediato según las necesidades no debe
estar presente en exceso, si no actuaría perjudicialmente. La
disponibilidad del oxígeno se consigue en el organismo mediante una
regulación vascular de la corriente vascular que controla la
circulación sanguínea y, por tanto, optimiza el suministro de
oxígeno.
En caso de que exista una superficie de herida
abierta, se suprime el suministro por difusión de oxígeno por
varios lados de la capa celular superficial. Ésta es como un cultivo
celular. Su suministro de oxígeno desde fuera es por tanto malo,
porque se forma sobre la capa celular una película líquida acuosa
que, como se ha explicado, forma una barrera difusiva de oxígeno
por las leyes de difusión correspondientes. Esto se ilustra en la
siguiente Figura 1a, en la que se indica esquemáticamente la capa de
agua que se forma sobre las células del fondo de la herida. Las
heridas recientes en tejidos normales pueden curarse en caso
conveniente en algunos días, en caso de que el suministro de
oxígeno desde la parte inferior, por consiguiente desde dentro, sea
suficiente. Sin embargo, en estudios experimentales animales se ha
podido comprobar que también dichas heridas recientes curan algo
mejor cuando se aumenta la concentración de oxígeno del aire
circundante (M.P. Pai y col., Sug. Gyn. Obstet. 135
(1972), 756-758). Las heridas antiguas,
especialmente crónicas, no pueden simularse en ensayos animales. En
seres humanos, sin embargo, curan como es sabido con su notable
falta de oxígeno sólo muy lentamente o nada en
absoluto.
absoluto.
Para poder curar mejor entonces también heridas
crónicas, se ha empleado la denominada terapia de oxígeno
hiperbárico (OHB). En este momento, se disponen los pacientes en
cámaras de alta presión donde se aplica una sobrepresión de oxígeno
puro de aproximadamente 300 kPa durante un tiempo conocido de
aproximadamente una hora en las denominadas sesiones. Una terapia
de herida normal abarca aproximadamente 40 de dichas sesiones (C.D.
Müller y col., Hartmann Wund Forum 1 (1999),
17-25). Realmente, se consiguen de este modo las
curaciones de heridas. Sin embargo, las terapias múltiples se
demuestran menos exitosas, y el efecto puede disminuir también con
el número de pasos. Esto es explicable: ciertamente, mejora el
suministro de oxígeno de las células de herida superficiales, pero
esto se paga, como se ilustra anteriormente, con un efecto tóxico
del oxígeno concentrado a alta presión; finalmente prevalece
probablemente el efecto dañino.
La patente de EE.UU. 2.527.210 del año 1944
describe una disolución de hemoglobina que es utilizable tanto por
vía intravenosa como tópica, por ejemplo, mediante pulverización
para el tratamiento de heridas. La hemoglobina se obtiene en este
momento a partir de eritrocitos recientes, que se someten a un shock
de congelación después de centrifugación y separación por succión
del plasma sanguíneo sobrenadante. De esta manera, se realiza una
lisis celular y se libera la hemoglobina. Se presentan con el
producto las paredes celulares degradadas. Se trata en esta
preparación de un detritus celular concentrado (residuo celular).
Para el tratamiento superficial, debe conseguirse de esta manera
especialmente un efecto de recubrimiento antiséptico, como
habitualmente mediante disolución de yodo, después de haber añadido
previamente sulfuro de sodio al 5%. Por consiguiente, aquí solamente
se cierra la herida. Para ajustar correctamente la viscosidad del
producto, por ejemplo, para aplicación por pulverización, se añade
plasma. No se cita aquí un transporte de oxígeno.
Este modo de aplicación de dichos productos de
hemoglobina se abandonó públicamente en lo sucesivo. Así, el
documento WO 97/15313 describe el uso terapéutico de hemoglobina
para mejorar la curación de heridas. Para ello, se administra
sistémicamente hemoglobina libre de estroma y pirógenos, por
consiguiente por vía intravenosa, a pacientes, especialmente
después de operaciones o incidentes traumáticos para aumentar la
presión sanguínea. Se utiliza especialmente una hemoglobina
reticulada con diaspirina con este fin.
Sin embargo, la administración sistémica
intravenosa de hemoglobina puede ejercer sólo la conocida influencia
indirecta por un lado sobre la curación de heridas, ya que debe
realizarse el suministro de los vasos sanguíneos que se encuentran
en la herida desde dentro y, por tanto, no es posible ninguna
posibilidad de tratamiento desde fuera y tampoco de sobrepasar la
barrera de dispersión anteriormente descrita.
Además, es dudosa una aplicación de componentes
de membrana celular sobre heridas abiertas, ya que los fosfolípidos
emitidos por la membrana celular notoriamente son parcialmente muy
tóxicos.
En un informe publicado en Internet el 14.3.2002
(www.sangui.de/en/Stock/news: "Study demonstrates
effectiveness of oxygen in skin treatment") se informa de que
pueden tratarse la piel envejecida o las arrugas con emulsiones que
contienen portadores de oxígeno naturales o artificiales. Sin
embargo, no se trata en este momento de heridas abiertas, en las
que está presente una capa de barrera como se ha explicado.
Por tanto, el objetivo de la presente invención
es utilizar uno de dichos productos para el tratamiento de heridas
abiertas con el que se transporte localmente oxígeno desde fuera
selectivamente a los vasos sanguíneos afectados, especialmente
dañados, sin afectar a todo el organismo, por consiguiente
sistémicamente, con lo que pueden evitarse efectos secundarios
indeseados.
Este objetivo se consigue según la invención al
preparar un agente que presenta un secuestrante (o portador) de
oxígeno natural o artificial liberado de plasma y componentes de
pared celular o mezclas de los mismos según la reivindicación 1,
preparado éste último mediante una modificación adecuada de uno
natural, y al incorporar éste a la capa de barrera de oxígeno del
fondo de la herida. En este momento, en virtud del secuestrante
(portador) de oxígeno incorporado, se crea un transporte de oxígeno
eficaz a través de la capa de barrera debido al mecanismo de
difusión facilitada (véase la Figura 1b).
Sorprendentemente, no se realiza aquí por
consiguiente un recubrimiento y cierre de la herida. Además, es
posible una curación de herida acelerada mediante el suministro de
oxígeno desde fuera a los vasos sanguíneos inicialmente ya no
intactos. Mediante este mecanismo, se ofrece a las células del fondo
de la herida el oxígeno de modo fisiológico, a saber, a partir de
la unión a hemoglobina, en forma no tóxica y en cantidad suficiente
directamente al lugar deseado, evitando el daño oxidativo.
Esto es ante todo sorprendente por eso, porque el
estado de la técnica enseña que es posible una curación de herida
externa más bien con agentes antisépticos como yodo o hidrogeles
(véase el documento WO 97/15313, página 3, línea 1) o bien un
tratamiento desde dentro de la misma, y una aplicación externa de
hemoglobina conduce al sellado de la herida o se consigue una
curación de herida especialmente eficaz mediante una oclusión
externa con hipoxia, veáse Gretenar y col., Schweiz Med.
Forum, 2001, 237-242.
Según la invención, se utiliza un secuestrante de
oxígeno natural (nativo) como se ha descrito seleccionado de
hemoglobina o mioglobina o un derivado modificado de los mismos o
mezclas de los mismos. La modificación puede ser una reticulación
intramolecular, una polimerización (reticulación intermolecular),
una pegilación (ligamiento covalente con poli(óxidos de alquileno)),
una modificación con efectores químicamente reactivos como
5'-fosfato de piridoxal o 5'-fosfato
de
2-nor-2-formilpiridoxal,
o también con efectores químicamente no reactivos de secuestro de
oxígeno como, por ejemplo, 2,3-bisfosfoglicerato,
hexafosfato de inositol, hexasulfato de inositol o ácido melítico,
o una combinación de los mismos. Para la mioglobina, no es posible
ninguna reticulación intramolecular como para la hemoglobina, sino
todas las demás modificaciones. Dichos productos son conocidos y se
describen, por ejemplo, en los documentos DE-A
10031744, DE-A 10031742 y DE-A
10031740. Se describen también reticulaciones de portadores de
oxígeno en los documentos DE 1970137, EP 97100790, DE 4418937, DE
3841105, DE 3714351, DE 3576651.
Son secuestrantes de oxígeno modificados
especialmente preferidos hemoglobinas con un peso molecular de
65.000 a 15.000.000, como productos reticulados intramolecularmente
como según el documento WO 97/15313, especialmente polímeros como
productos reticulados intermolecularmente con un peso molecular
medio de 80.000 a 10.000.000 g/mol, especialmente 100.000 a
5.000.000, o mioglobinas preparadas análogamente con un peso
molecular medio de 16.000 a 5.000.000, especialmente 100.000 a
3.000.000, preferiblemente hasta 1.000.000 g/mol. Se prefieren muy
especialmente aquellos portadores de oxígeno que están
polimerizados, por ejemplo, con reticulantes conocidos para reacción
intermolecular como reticulantes bifuncionales como diepóxido de
butadieno, divinilsulfona, diisocianato, especialmente
hexametilendiisocianato, ciclohexildiisocianato y ácido
2,5-bisisocianatobencenosulfónico, éster de
di-N-hidroxisuccinimidilo, diimidoéster o dialdehído,
especialmente glioxal, el glicolaldehído de reacción análoga o
glutardialdehído.
Además, se prefieren aquellos productos que están
polimerizados de este modo y que están pegilados con un
polietilenglicol o derivado adecuado del mismo. Pertenecen a ellos,
por ejemplo, poli(óxido de etileno), poli(óxido de propileno) o un
copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno o un éster, éter
o esteramida de los mismos. Se prefiere además cuando el poli(óxido
de alquileno) ligado covalentemente presenta una masa molecular de
200 a 5.000 g/mol.
Para el ligamiento covalente de los poli(óxidos
de alquileno), se usan preferiblemente aquellos derivados de
poli(óxidos de alquileno) que contienen un agente ligante con un
grupo funcional ya unido covalentemente que proporciona una
reacción química directa con grupos amino, alcohol o sulfhidrilo de
la hemoglobina, formando ligamientos covalentes de los poli(óxidos
de alquileno), por ejemplo, poli(óxidos de alquileno) con grupos
reactivos éster N-hidroxisuccinimidilo, epóxido
(glicidiléter), aldehído, isocianato, vinilsulfona, yodoacetamida,
imidazolilformiato, tresilato, entre otros. Muchos de dichos
polietilenglicoles activados monofuncionales son
comercialmente
obtenibles.
obtenibles.
La preparación de dichos secuestrantes de oxígeno
modificados se describe en las solicitudes de patente alemana
citadas anteriormente.
Son muy especialmente preferidos los productos de
hemoglobina modificados reticulados (intra o intermolecularmente) o
reticulados y pegilados, con un peso molecular medio de 250.000 a
750.000 g/mol o productos de mioglobina con un peso molecular medio
de 50.000 a 750.000 g/mol. Ante todo, se prefieren aquellos
productos que reaccionan adicionalmente con efectores químicamente
reactivos o químicamente no reactivos de secuestro de oxígeno o una
combinación de los mismos.
El secuestrante de oxígeno, que actúa también
como portador de oxígeno, puede ser a este respecto de origen humano
o animal, como de caballo, vaca o preferiblemente de cerdo. A este
respecto, el producto se purifica libre de plasma y componentes de
pared celular mediante medidas conocidas adecuadas como
centrifugación y ultrafiltración fraccionada. No se realiza una
lisis celular mediante congelación profunda, ya que de otro modo no
puede obtenerse la composición deseada. El producto está además
libre de estroma y pirógenos.
Especialmente, los portadores de oxígeno así
preparados como se ha descrito pueden purificarse también como, por
ejemplo, cromatográficamente (por ejemplo, mediante cromatografía de
exclusión por volumen preparativa), mediante centrifugación,
filtración o ultrafiltración, separarse en fracciones de distintos
pesos moleculares y a continuación procesarse adicionalmente,
véanse, por ejemplo, los documentos DE-A 10031740 o
WO 02/00230.
De forma especialmente preferida, se usa como
secuestrante de oxígeno hemoglobina humana o de cerdo que es natural
o modificada como se ha citado.
Además, puede utilizarse también mioglobina. Se
prefiere en este momento la natural humana, siendo posible también
cualquier otra procedencia animal o también modificada como se ha
citado. Ésta se obtiene como se ha citado anteriormente para la
hemoglobina, pero no es posible la reticulación intramolecular.
Pueden utilizarse también mezclas de secuestrantes de oxígeno
naturales con modificados como, por ejemplo, en relación 20:1 a
1:20, referida al peso.
Son también posibles mezclas de mioglobina y
hemoglobina o sus derivados modificados en la relación anteriormente
citada de 20:1 a 1:20.
El agente se prepara como se describe con detalle
a continuación, mediante la incorporación del secuestrante de
oxígeno a un medio acuoso.
Según la invención, se realiza el tratamiento de
heridas abiertas, especialmente crónicas (por consiguiente ya no
recientes) tanto en seres humanos como en animales, prefiriéndose la
aplicación en seres humanos, mediante tratamiento tópico con los
secuestrantes de oxígeno descritos. Para la aplicación, se disuelve
el o los secuestrantes de oxígeno en un medio acuoso en una cantidad
de 0,1 a 35% en peso, especialmente 0,1 a 20, ante todo 0,1 a 15%
en peso. El portador, es decir, el medio acuoso, presenta ante todo
electrolitos fisiológicamente compatibles, como sales en cantidades
adecuadas. Pertenecen a ellas cloruro de sodio, cloruro de potasio,
calcio, magnesio, hidrogeno(bi)carbonato de sodio,
citrato de sodio, lactato de sodio. Éstas se presentan
preferiblemente a concentración fisiológica o también múltiplos de
la misma, por ejemplo, 10 veces, pero también en cantidades de 0,1
a 30% en peso, siendo especialmente adecuado para ello el cloruro de
sodio. Los electrolitos pueden presentarse también en mezclas.
Dado el caso, pueden estar presentes también
otros aditivos, a saber, de 0 a 20, preferiblemente 0,1 a 20,
especialmente 0 a 15% en peso, preferiblemente 0,1 a 15,
especialmente 0,1 a 10% en peso. Estos son especialmente nutrientes
para las células. Se seleccionan ante todo de glucosa, por ejemplo,
en cantidades de 0,1 a 5% en peso, insulina en cantidades de hasta
25 UI/ml, los aminoácidos naturales conocidos para la respectiva
aplicación, por consiguiente los aminoácidos conocidos para los
seres humanos o para los animales respectivos, por ejemplo, 0 ó 0,01
a 5% en peso, o también factores tisulares como interleuquinas desde
cantidades fisiológicas hasta cantidades 10 veces mayores.
Dado el caso, puede ser ventajoso si están
contenidos además como aditivos antioxidantes como acetilcisteína,
superoxidodismutasa en cantidades de 0,001% en peso a 2% en peso. En
este caso, actuaría éste también como catalasa, si se utiliza como
hemoglobina/derivado secuestrante de oxígeno.
El agente se aplica externamente. Según el estado
de la herida, se frota o preferiblemente se pulveriza finamente. A
este respecto, pueden utilizarse uno o varios secuestrantes de
oxígeno distintos. Así, pueden utilizarse en el agente, por
ejemplo, el o los secuestrantes de oxígeno naturales a concentración
especialmente alta, el o los productos modificados también a
concentración especialmente baja, según la necesidad, o también
seleccionarse una combinación de ambos grupos si la viscosidad para
la aplicación de pulverización debe ajustarse especialmente. En
otro caso, la selección del o de los secuestrantes de oxígeno y su
concentración es respectivamente independiente e igualmente
eficaz.
Según la invención, se ha mostrado que pueden
tratarse eficazmente las heridas abiertas, especialmente también
las crónicas por las causas más distintas. Así, pueden tratarse
aquellas después de operaciones, después de traumatismos, lesiones
o también debido a alteraciones degenerativas de tejidos. A este
respecto, se trata tanto de alteraciones degenerativas de vasos
sanguíneos arteriales como de heridas debidas a una insuficiencia
venosa crónica. Pertenecen a ellas especialmente heridas por
decúbito así como crónicas, ante todo debidas a una enfermedad
diabética.
La invención se ilustra con detalle mediante los
siguientes ejemplos.
Se liberó hemoglobina natural humana de plasma y
componentes de pared celular mediante centrifugación y
ultrafiltración y se purificó.
Se disolvieron 8% en peso de ella en 100 ml de
agua que contenía 0,9% en peso de cloruro de sodio, así como 5% en
peso de glucosa y 20 UI/ml de insulina.
Se desoxigenó hemoglobina de cerdo de alta
pureza, disuelta a una concentración de 330 g/l en un electrolito
acuoso de composición NaHCO_{3} 50 mM y NaCl 100 mM, a 4ºC
mediante agitación de la disolución bajo nitrógeno puro
constantemente renovado sobre la disolución. A continuación, se
añadieron 4 mol de ascorbato de sodio (en forma de disolución 1
molar en agua) por mol de hemogolobina (monomérica), y se dejó
reaccionar durante 6 h. La disolución se tituló con ácido láctico
0,5 molar a un valor de pH de 7,1, se añadieron 1,1 mol de
5'-fosfato de piridoxal por mol de hemoglobina y se
dejó reaccionar durante 16 h. Entonces, se ajustó con lejía de sosa
0,5 molar un valor de pH de 7,8, se añadió 1,1 mol de borohidruro de
sodio (en forma de una solución 1 molar en lejía de sosa 0,01
molar), y se dejó reaccionar durante 1 hora. Entonces, se ajustó a
un pH de 7,3 con ácido láctico 0,5 molar, se añadieron en primer
lugar 1,1 mol de 2,3-bisfosfoglicerato por mol de
hemoglobina y después de 15 min de tiempo de reacción
8 mol de glutardialdehído por mol de hemoglobina disuelto en 1,8 l de agua pura por litro de disolución de hemoglobina, para la reticulación de la hemoglobina durante 5 minutos, y se dejó reaccionar durante 2,5 horas. Después de titulación con lejía de sosa 0,5 molar a un valor de pH de 7,8, siguió una adición de 15 mol de borohidruro de sodio (en forma de una disolución 1 molar en lejía de sosa 0,01 molar) por mol de hemoglobina durante 1 h. Se realizó una adición de
2 l de agua por litro de disolución de hemoglobina original. El valor de pH ascendió entonces a 9,3, y siguió directamente una adición de 4 mol de propionato de metoxisuccinimidilo-polietilenglicol de peso molecular 2.000 g/mol durante 2 h. Se sustituyó la atmósfera de nitrógeno sobre la disolución por oxígeno puro.
8 mol de glutardialdehído por mol de hemoglobina disuelto en 1,8 l de agua pura por litro de disolución de hemoglobina, para la reticulación de la hemoglobina durante 5 minutos, y se dejó reaccionar durante 2,5 horas. Después de titulación con lejía de sosa 0,5 molar a un valor de pH de 7,8, siguió una adición de 15 mol de borohidruro de sodio (en forma de una disolución 1 molar en lejía de sosa 0,01 molar) por mol de hemoglobina durante 1 h. Se realizó una adición de
2 l de agua por litro de disolución de hemoglobina original. El valor de pH ascendió entonces a 9,3, y siguió directamente una adición de 4 mol de propionato de metoxisuccinimidilo-polietilenglicol de peso molecular 2.000 g/mol durante 2 h. Se sustituyó la atmósfera de nitrógeno sobre la disolución por oxígeno puro.
Después de 1 h, se separaron los componentes
insolubles mediante centrifugación (20.000 g durante 15 min). A
continuación, se realizó un intercambio del electrolito mediante una
cromatografía de exclusión por volumen (gel Sephadex
G-25, Pharmacia, Alemania) por una disolución
electrolítica acuosa de composición NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y
NaHCO_{3} 20 mM.
El rendimiento ascendió a 77%; el rendimiento
para pesos moleculares mayores de 700.000 g/mol es de 28%.
Las medidas de las características de secuestro
de oxígeno en condiciones fisiológicas (una temperatura de 37ºC, una
presión parcial de dióxido de carbono de 5,33 kPa y un valor de pH
de 7,4) proporcionaron al producto un valor de p50 de 2,93 kPa y un
valor de n50 de 1,95.
Este secuestrante de oxígeno es especialmente
adecuado para el uso según la invención en disolución acuosa como se
describe en el ejemplo 1.
La síntesis de la hemoglobina humana reticulada
con glutardialdehído se realizó como en el ejemplo 2, pero usando
hemoglobina humana concentrada de alta pureza y utilizando un exceso
molar de 16 veces de reticulante. Los polímeros se obtuvieron
mediante fraccionamiento de la disolución de los productos de
reticulación con ayuda de una cromatografía de exclusión por volumen
(según el documento EP-A 951072800: "Verfahren zur
Herstellung molekular-einheitlicher hyperpolymerer
Hämoglobine" con gel Sephacryl S-300 HR,
Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania) (aquí como el 57% en masa
que primero eluye de hemoglobina reticulada).
Las hemoglobinas reticuladas se dividieron en dos
partes A y B. La hemoglobina A (véase la figura 3) se evidenció
predominantemente como hemoglobina polimérica con un valor modal de
distribución del peso molecular de
950 kg/mol (véase el ejemplo 1). La unión covalente de mPEG-SPA-1000 activo monofuncional se realizó análogamente al ejemplo 2 para el modo de actuación descrito para la hemoglobina de cerdo reticulada. Después de la adición de hidrogenocarbonato de sodio (hasta 150 mM) a la disolución del polímero, pudo hacerse reaccionar mPEG-SPA-1000 en exceso molar de 12 veces con los monómeros de hemoglobina. A continuación de un tiempo de reacción de una hora, se añadió lisina en un exceso molar de 60 veces para la "absorción" de las moléculas todavía activas de mPEG-SPA-1000. Tanto la hemoglobina reticulada según la disolución A como el producto reticulado y pegilado según la disolución B son adecuados para el uso según la invención.
950 kg/mol (véase el ejemplo 1). La unión covalente de mPEG-SPA-1000 activo monofuncional se realizó análogamente al ejemplo 2 para el modo de actuación descrito para la hemoglobina de cerdo reticulada. Después de la adición de hidrogenocarbonato de sodio (hasta 150 mM) a la disolución del polímero, pudo hacerse reaccionar mPEG-SPA-1000 en exceso molar de 12 veces con los monómeros de hemoglobina. A continuación de un tiempo de reacción de una hora, se añadió lisina en un exceso molar de 60 veces para la "absorción" de las moléculas todavía activas de mPEG-SPA-1000. Tanto la hemoglobina reticulada según la disolución A como el producto reticulado y pegilado según la disolución B son adecuados para el uso según la invención.
Se preparó hemoglobina de vaca reticulada
mediante la reticulación de hemoglobina de vaca concentrada de alta
pureza con un exceso molar de 14 veces de glutardialdehído según el
ejemplo 2, un fraccionamiento molecular de los productos de síntesis
y la unión de mPEG-SPA-1000 según el
ejemplo 2 ó 3.
La Figura 5 muestra una distribución del peso
molecular del polímero de hemoglobina no modificada, a saber, un
diagrama de elución de una cromatografía de exclusión por volumen
(en gel "Sephacryl S-400 HR", Pharmacia
Biotech, Friburgo, Alemania), el valor modal de la distribución del
peso molecular asciende aquí a 810 kg/mol.
Se hicieron reaccionar hemoglobina de cerdo
desoxigenada concentrada de alta pureza disuelta en un electrolito
acuoso de composición NaHCO_{3} 50 mmol/l y NaCl 100 mmol/l a
temperatura ambiente con glutardialdehído en exceso molar de 14
veces. Se añadió cianoborohidruro de sodio en exceso molar de 10
veces a la hemoglobina (monomérica), se redujeron las bases de
Schiff formadas en la reticulación y se estabilizó la reticulación
covalente. La disolución obtenida de hemoglobina reticulada se
dividió en tres partes (A, B y C) y se procesaron adicionalmente de
forma distinta.
La parte A permaneció sin cambios, la
determinación de la distribución del peso molecular (según Pötzschke
H. y col. (1996, Macromolecular Chemistry and Physics
197, 119-1437, así como Pötzschke H. y col.
(1996, Macromolecular Chemistry and Physics 197,
3229-3250) aplicando cromatografía de exclusión por
volumen con el gel Sephacryl S-400 HR (Pharmacia
Biotech, Friburgo, Alemania), proporcionó un valor modal de la
distribución del peso molecular de la hemoglobina de cerdo
reticulada de 520 kg/mol
Los polímeros de la parte B se ligaron
covalentemente con mPEG-SPA-1000
activo monofuncional (Shearwater Polymers Europe, Enschede,
Holanda): en primer lugar se añadió hidrogenocarbonato de sodio en
forma de sólido hasta una concentración final de 150 mmol/l a la
disolución de hemoglobina reticulada, a continuación se realizó la
adición de mPEG-SPA-1000 en exceso
molar de 12 veces (referido a los monómeros de hemoglobina)
igualmente en forma de sólido. Después de un tiempo de reacción de
una hora, se añadió lisina en un exceso molar de 60 veces (referido
a la hemoglobina) y reaccionó con las moléculas de
mPEG-SPA-1000 todavía activas.
Parte C: Se procesó la disolución de hemoglobina
reticulada igual que se describe para la parte B, pero usando
mPEG-SPA-2000 (Shearwater Polymers
Europe, Enschede, Holanda).
A continuación, se realizó un intercambio de
disolvente en las tres disoluciones A, B y C (con ayuda de una
ultrafiltración "Ultraminisette 10 kDa", Pall Gelman Sciences,
RoBdorf, Alemania o una cromatografía de exclusión por volumen en
gel "Sephadex G-15 M", Pharmacia Biotech,
Friburgo, Alemania) por una disolución en un electrolito acuoso
(dis. est.) de composición: NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y NaN_{3} 3
mM.
Todos los productos según la disolución A, B o C
son adecuados para el fin según la invención.
Se preparó hemoglobina reticulada
intramolecularmente como se describe en el ejemplo 2, pero a 0,1% de
concentración.
Se purificó por cromatografía en gel mioglobina
humana natural comercial (por ejemplo, de Sigma, Alemania). Ésta
puede utilizarse según la invención como tal o también modificada
como se describe anteriormente.
Se añadieron 10% de una hemoglobina humana no
modificada como se describe en el ejemplo 1 y 5% de un producto
modificado como se describe en el ejemplo 2 a 100 ml de agua
purificada que contenía 0,9% en peso de cloruro de sodio, 0,2% en
peso de bicarbonato de sodio, 1% en peso de glucosa. La disolución
está inmediatamente lista para uso.
Se añadieron 8% en peso de una mioglobina humana
modificada con polietilenglicol, preparada según el ejemplo 3,
disolución A, a 100 ml de agua purificada que contenía 0,9% en peso
de cloruro de sodio, así como 5% en peso de glucosa, 20 UI/ml. La
disolución está inmediatamente lista para uso y también es
especialmente estable.
Se aplicó finamente una disolución según el
ejemplo 2 a una herida crónica existente durante mes en el lado
interno del tobillo izquierdo de una paciente femenina, debida a una
insuficiencia venosa crónica, sobre toda la superficie con ayuda de
un pulverizador fino. Esto se realizó dos veces al día. Después de
20 días, se mostró una clara granulación de la base de la herida
perfilándose el borde la herida y formándose un epitelio temporal.
Después de 2 meses, se cerró la herida.
En un paciente masculino existía hacía 1 año una
dehiscencia de 10 cm de longitud y 4 cm de anchura después de
oclusión arterial de la pierna izquierda y amputación del metatarso
(boca de pez). Se realizó un tratamiento como se describe en el
ejemplo 10 después de la limpieza previa de la herida crónica con
larvas y disolución concentrada de urea. Después de 4 meses, se
cerró la herida.
Claims (17)
1. Uso de uno o varios secuestrantes de oxígeno
naturales o modificados liberados de plasma y componentes de pared
celular, seleccionados de hemoglobina o mioglobina de origen humano
o animal, o derivados modificados de los mismos, o mezclas de los
mismos para la preparación de un agente para el tratamiento externo
de heridas abiertas.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el o los portadores de oxígeno se
seleccionan de hemoglobina humana o de cerdo natural o modificada o
mezclas de las mismas.
3. Uso según una de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque se utiliza mioglobina modificada o
natural o mezclas de las mismas.
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque se utilizan hemoglobina y mioglobina o
derivados modificados de las mismas en una relación de mezcla de
1:20 a 20:1.
5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque la modificación del o de los
secuestrantes de oxígeno es una reticulación intra- o
intermolecular, una pegilación, una reacción con efectores
químicamente reactivos o químicamente no reactivos o una combinación
de las mismas.
6. Uso según la reivindicación 5,
caracterizado porque la modificación es una reticulación
intermolecular, una pegilación o una combinación de las mismas.
7. Uso según la reivindicación 6,
caracterizado porque se presenta como modificación
adicionalmente una reacción con un efector químicamente reactivo o
químicamente no reactivo, o una combinación de los mismos.
8. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 7,
caracterizado porque el o los secuestrantes de oxígeno se
aplican en forma de una disolución sobre la herida.
9. Uso según la reivindicación 8,
caracterizado porque la aplicación del o de los secuestrantes
de oxígeno ha de realizarse mediante pulverización.
10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9,
caracterizado porque el o los secuestrantes de oxígeno se
aplican en forma de una disolución acuosa que contiene sales
fisiológicamente compatibles, así como 0,1 a 15% en peso del o de
los secuestrantes de oxígeno y de 0 a 20% en peso o desde
concentración fisiológica hasta 10 veces mayor de aditivos.
11. Uso según la reivindicación 10,
caracterizado porque comprende como sales fisiológicamente
compatibles aquellas seleccionadas de cloruro de sodio,
hidrogenocarbonato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de
potasio, cloruro de calcio y magnesio, citrato de sodio, lactato de
sodio o mezclas de los mismos.
12. Uso según una de las reivindicaciones 10 u
11, caracterizado porque los aditivos se seleccionan de
glucosa, insulina, aminoácidos, antioxidantes y factores
tisulares.
13. Uso según una de las reivindicaciones 1 a
12, caracterizado porque han de tratarse heridas crónicas,
heridas de operación, heridas de lesiones y heridas por
traumatismos.
14. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque han de tratarse heridas crónicas debidas
a una degeneración o estrechamiento de los vasos sanguíneos
arteriales.
15. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque han de tratarse heridas crónicas debidas
a una enfermedad diabética.
16. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque han de tratarse heridas por
decúbito.
17. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque han de tratarse heridas debidas a una
insuficiencia venosa crónica.
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