ES2251080T3 - Molecula de acido nucleico aislada que codifica los precursores de antigenos de rechazo tumorales mage-c1 y mage-c2 y sus usos. - Google Patents
Molecula de acido nucleico aislada que codifica los precursores de antigenos de rechazo tumorales mage-c1 y mage-c2 y sus usos.Info
- Publication number
- ES2251080T3 ES2251080T3 ES98918810T ES98918810T ES2251080T3 ES 2251080 T3 ES2251080 T3 ES 2251080T3 ES 98918810 T ES98918810 T ES 98918810T ES 98918810 T ES98918810 T ES 98918810T ES 2251080 T3 ES2251080 T3 ES 2251080T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- mage
- nucleic acid
- baselineskip
- seq
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 70
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 101001036406 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C1 Proteins 0.000 title claims description 115
- 102100039447 Melanoma-associated antigen C1 Human genes 0.000 title claims description 96
- 101001057156 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C2 Proteins 0.000 title claims description 87
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 77
- 102100027252 Melanoma-associated antigen C2 Human genes 0.000 title claims description 74
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 127
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 33
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 39
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 35
- 102100029450 M1-specific T cell receptor alpha chain Human genes 0.000 description 32
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 31
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 27
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 24
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 23
- 241000237955 Nassarius Species 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 19
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 17
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 10
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- 201000010208 Seminoma Diseases 0.000 description 8
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 8
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 7
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 7
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 4
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 4
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Substances O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 4
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 201000003911 head and neck carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 201000005825 prostate adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101000986084 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 101100384865 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cot-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100022919 Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 2
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- SPTYHKZRPFATHJ-HYZXJONISA-N dT6 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)[C@@H](O)C1 SPTYHKZRPFATHJ-HYZXJONISA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 1,4-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=C(N)C=C1 CBCKQZAAMUWICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDJNDUULNXNRQD-XKBRQERYSA-N 1-[(2r,4s,5s)-5-[bromo(hydroxy)methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](C(Br)O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 NDJNDUULNXNRQD-XKBRQERYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical class C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100373139 Caenorhabditis elegans mig-14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091060290 Chromatid Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010014597 HLA-B44 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001036688 Homo sapiens Melanoma-associated antigen B1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102100039477 Melanoma-associated antigen B1 Human genes 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 102400000745 Potential peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001357 Potential peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 239000004904 UV filter Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005084 bladder transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000001528 bladder urothelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004756 chromatid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 108010081400 fluorescein isothiocyante avidin Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 102000054453 human MAGEC1 Human genes 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- -1 that is Proteins 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000025421 tumor of uterus Diseases 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
Abstract
La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para antígenos expresados por células tumorales que pueden reconocerse por células T citotóxicas, conduciendo a la lisis de las células tumorales que los expresan. Esta invención también se refiere a vectores que están diseñados para codificar el antígeno expresado por las células tumorales y también a células transfectadas por las moléculas de ácido nucleico o vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico. También forman parte de esta invención diversos usos terapéuticos y de diagnóstico que utilizan las propiedades de las moléculas de ácido nucleico y los antígenos para los que codifican dichas moléculas.
Description
Molécula de ácido nucleico aislada que codifica
los precursores de antígenos de rechazo tumorales
MAGE-C1 y MAGE-C2 y sus usos.
Esta invención se refiere a moléculas de ácido
nucleico que codifican precursores de antígenos de rechazo de
tumores. Más particularmente, la invención se refiere a moléculas de
ácidos nucleicos que codifican precursores de antígenos de rechazo
de tumores que se pueden transformar, entre otros, en péptidos
presentados por muchas moléculas del MHC, como
HLA-A1 y sus alelos, HLA-A2,
HLA-Cw*1601, HLA-B44, y así
sucesivamente. MAGE-C1, una realización preferida,
comparte homología parcial con otros miembros de la familia MAGE
conocidos hasta la fecha, pero es aproximadamente 2 kb mayor.
MAGE-C2 es otra realización preferida. Estas
moléculas de ácido nucleico se expresan en diversos tumores y en
células de testículos normales, pero no se expresan en otras células
normales.
El procedimiento mediante el que el sistema
inmunitario del mamífero reconoce y reacciona con materiales
extraños o ajenos es complejo. Una faceta importante del sistema es
el linfocito T o respuesta de "células T". Esta respuesta
requiere que las células T reconozcan e interaccionen con complejos
de moléculas de la superficie celular, denominados antígenos
leucocitarios humanos ("HLA"), o complejos de
histocompatibilidad principales ("MHCs"), y péptidos. Los
péptidos derivan de moléculas mayores que son tratadas por las
células que presentan también la molécula HLA/MHC. A este respecto,
véase Male et al., Advanced Immunology (J.P: Lipincott
Company, 1987), especialmente los capítulos 6-10. La
interacción de las células T y los complejos HLA/péptido está
restringida, requiriendo una célula T específica para una
combinación particular de una molécula HLA y un péptido. Si una
célula T específica no está presente, no hay respuesta de célula T,
incluso si su complejo asociado está presente. De forma similar, no
hay respuesta si el complejo específico está ausente, pero la célula
T está presente. Este mecanismo está implicado en la respuesta del
sistema inmunitario a materiales extraños, en patologías
autoinmunitarias, y en respuestas a anormalidades celulares. Se ha
dirigido mucho trabajo a los mecanismos por los que las proteínas se
transforman en los péptidos que se unen a HLA. A este respecto,
véanse Barinaga, Science 257:880 (1992); Fremont et
al., Science 257:919 (1992); Matsumura et al.,
Science 257:927 (1992); Latron et al., Science
257:964
(1992).
(1992).
El mecanismo por el que las células T reconocen
anormalidades celulares se ha implicado también en el cáncer. Por
ejemplo, en la solicitud de patente PCT PCT/US92/04354, depositada
el 22 de mayo de 1992, publicada el 26 de noviembre de 1992, se
describe una familia de genes, que se transforman en péptidos, los
cuales, a su vez, se expresan sobre las superficies de las células,
lo que puede conducir a la lisis de las células tumorales mediante
linfocitos T citolíticos específicos ("CTLs"). Se dice que los
genes codifican "precursores de antígenos de rechazo de
tumores" o moléculas "TRAP", y los péptidos derivados de los
mismos se denominan "antígenos de rechazo de tumores" o
"TRAs". Véanse Traversari et al. Immunogenetics
35:145 (1992); Van der Bruggen et al., Science
254:1643 (1991), para mayor información sobre esta familia de genes.
Asimismo, véanse las patentes de EE.UU Nº 5.342.774 y Nº
5.462.871.
En la patente de EE.UU. Nº 5.405.940, se explica
que el gen MAGE-1 codifica un precursor antigénico
de rechazo de tumores, que se transforma en nonapéptidos que son
presentados por la molécula HLA-A1. Los nonapéptidos
que se unen a HLA-A1, siguen una "regla" para
la unión en la que se satisface un motivo distintivo. A este
respecto véanse, p.ej., PCT/US93/07421; Falk et al.,
Nature 351:290-296 (1991); Engelhard, Ann.
Rev. Immunol. 12:181-207 (1994); Ruppert et
al., Cell 74:929-937 (1993); Rötzxchke
et al., Nature 348:252-254 (1990);
Bjorkman et al., Nature 329:512-518
(1987); Traversari et al., J. Exp. Med.
176:1453-1457 (1992). La referencia muestra que,
dada la especificidad conocida de péptidos particulares por
moléculas de HLA particulares, se debería esperar que un péptido
particular se una a una molécula de HLA, pero no a otras. Debido a
que diferentes individuos poseen diferentes fenotipos de HLA, la
identificación de un péptido particular como la pareja de una
molécula de HLA particular tiene ramificaciones diagnósticas y
terapéuticas, solo para individuos con ese fenotipo HLA particular.
Se necesita trabajar más en el área, debido a que las anormalidades
celulares no están restringidas a un fenotipo HLA particular, y la
terapia dirigida requiere algún conocimiento del fenotipo de las
células anormales en discusión.
En la solicitud de patente de EE.UU. de Nº de
serie 288.977, presentada el 11 de agosto de 1994, actualmente
patente de EE.UU. Nº 5.629.166, se describe el hecho de que el
producto de expresión MAGE-1 se transforma en un
segundo TRA. Este segundo TRA es presentado por moléculas
HLA-Cw*1601. La memoria muestra que una TRAP dada
puede producir una pluralidad de TRAs, cada uno de los cuales
satisfará una regla de motivo distintivo para unirse a una molécula
del MHC.
En la patente de EE.UU de Nº de serie 994.928,
presentada el 22 de diciembre de 1992, se muestra que la tirosinasa,
una molécula que se produce por algunas células normales (p.ej.,
melanocitos), se transforma en las células tumorales para producir
péptidos presentados por moléculas HLA-A2.
En la solicitud de patente de EE.UU de Nº de
serie 08/032.978, presentada el 18 de marzo de 1993, se muestra que
una segunda TRA, no derivada de tirosinasa, es presentada por
moléculas HLA-A2. La TRA se deriva de una TRAP, pero
la codifica un gen distinto de MAGE. Esta memoria muestra que una
molécula de HLA particular puede presentar TRAs derivadas de
diferentes fuentes.
En la solicitud de patente de EE.UU. de Nº de
serie 08/079.110, presentada el 17 de junio de 1993, actualmente
patente Nº 5.571.711 concedida el 5 de junio de 1996, se describe un
precursor antigénico de rechazo de tumores, el precursor llamado
"BAGE". El precursor BAGE no está relacionado con la familia
MAGE.
En las solicitudes de patentes de EE.UU. de Nº de
serie 08/096.039 y de Nº de serie 08/250.162, se describe también un
precursor de TRAP distinto de MAGE.
La solicitud de patente de EE.UU. Nº 08/316.231,
presentada el 30 de septiembre de 1994, describe precursores
antigénicos de rechazo de tumores adicionales. Estos precursores
antigénicos de rechazo de tumores se denominan precursores
antigénicos de rechazo de tumores "DAGE", y no muestran
homología con las familias de genes MAGE, BAGE o GAGE.
El trabajo presentado por las comunicaciones,
patentes y solicitudes de patente citadas anteriormente se refiere,
en gran parte, a las familias de genes MAGE, BAGE, GAGE y DAGE. La
presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que
codifican un precursor antigénico de rechazo de tumores relacionado
con MAGE, es decir, MAGE-C1 y
MAGE-C2, y a los precursores antigénicos de rechazo
de tumores y antígenos de rechazo de tumores en sí mismos. La
invención se refiere asimismo a aplicaciones tanto de ácidos
nucleicos como de moléculas de proteína.
La invención se elabora con mayor intensidad en
la descripción siguiente.
La Figura 1(A)-1(F)
es la secuencia nucleótida del DNAc de MAGE-C1. Se
indica la posición de varios cebadores de nucleótidos sentido y
antisentido.
La Figura 2(A)-2(F)
representa una comparación de las secuencias nucleótidas de
MAGE-C1 y MAGE-A1.
La Figura 3 es una comparación esquemática del
gen MAGE-C1 con el clon MAGE-C1 de
DNAc aislado y el gen publicado MAGE-A1. Los exones
aparecen como recuadros numerados de I a III
(MAGE-A1) o IV (MAGE-C1). Los
intrones aparecen como líneas. La deleción en el clon de DNAc
comparada con el gen MAGE-C1, aparece como un hueco.
Los recuadros abiertos entre los genes MAGE-A1 y
MAGE-C1 indican regiones de similitud. Los marcos de
lectura abiertos se indican mediante recuadros punteados dentro de
los exones. Los segmentos repetidos en el gen
MAGE-C1 se muestran como un recuadro sombreado. Se
indican los sitios de restricción importantes (B: BamHI, D: Dpn11,
E: EcoR1, P: Pstl, X: XbaI), así como las posiciones de dos pares de
oligonucleótidos (SL33/SL34, y SL38/SL43). El asterisco aguas arriba
del exón 1 de MAGE-C1 muestra la localización de las
secuencias de reconocimiento consenso Sp1 y 2 Ets. Se indica también
la posición de la sonda XbaI-EcoR1.
La Figura 4 es una representación esquemática de
los genes MAGE-C1, MAGE-C2 y
MAGE-A1. Los exones aparecen como recuadros
abiertos, los intrones como líneas. Los marcos de lectura abiertos
se representan mediante recuadros oscuros. Las regiones de homología
entre MAGE-C2 y los otros dos genes se representan
mediante zonas sombreadas. Los cebadores de PCR importantes se
indican mediante flechas. El recuadro rayado representa la región
repetitiva encontrada en el gen MAGE-C1.
Muchos de los antígenos neoplásicos identificados
hasta el momento son codificados por genes, como MAGE, BAGE y GAGE,
que comparten un patrón de expresión común: se expresan en los
testículos (y algunas veces en la placenta), pero en ningún otro
tejido normal, y se reactivan en varios tipos neoplásicos. Este tipo
de antígeno es de particular interés para la oncoinmunoterapia.
Como alternativa a la identificación de antígenos
tumorales mediante clonación de genes que codifiquen para antígenos
que se sabe que son reconocidos por linfocitos T citolíticos
antitumorales (CTL), se buscaron directamente nuevos genes
expresados específicamente en tumores, ya que tales genes podrían
proporcionar una fuente de antígenos específicos para tumores.
Usando una técnica de hibridación sustractiva basada en PCR
denominada Representational Difference Analysis, aplicada a DNAc
(Hubank y Shatz, "Identifying Differences in mRNA Expression by
Representational Difference Analysis of cDNA", Nucleic Acids
Res. 22: 5640-5648 (1994)), se identificaron
nuevos miembros de la familia de genes MAGE, que se describen
aquí.
Los ejemplos de esta invención muestran el
aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican precursores
de antígenos de rechazo de tumores ("TRAP"),
MAGE-C1 y MAGE-C2. Estas moléculas
que codifican TRAP muestran especial homología con la familia MAGE,
que codifica secuencias descritas en las referencias mostradas más
arriba. Por tanto, un aspecto de la invención es una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica una proteína que tiene la
secuencia aminoácida codificada por la secuencia nucleótida mostrada
en SEQ ID Nº: 9 y una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una proteína que tiene la secuencia aminoácida codificada
por la secuencia nucleótida mostrada en SEQ ID Nº: 18.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de
DNAc. La SEQ ID Nº: 9 y la SEQ ID Nº: 18 no son secuencias
codificadoras MAGE, BAGE o GAGE previamente conocidas, como se verá
comparándolas con la secuencia de cualquiera de estos genes, según
se describen en las referencias citadas.
Asimismo, una parte de la invención son aquellas
moléculas de ácidos nucleicos que tienen la secuencia de nucleótidos
1-2815 y 2816-4225 de SEQ ID Nº: 9.
Otra realización de esta invención es una molécula de ácido nucleico
que codifica un precursor antigénico de rechazo de tumores e hibrida
con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleótida
1-2815 de SEQ ID Nº: 9 pero no hibrida con las
moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia nucleótida de
SEQ ID Nº: 8, es decir, la secuencia nucleótida
MAGE-A1 según se representa en la Figura 2, bajo
condiciones estrictas. Una realización adicional de esta invención
es una molécula de ácido nucleico que codifica un precursor
antigénico de rechazo de tumores e hibrida con una molécula de ácido
nucleico que tiene la secuencia nucleótida 261-2856
de SEQ ID Nº: 9, pero no hibrida con moléculas de ácido nucleico que
tienen la secuencia nucleótida de SEQ ID Nº: 8. El término
"condiciones estrictas", según se usa aquí, se refiere a la
hibridación en SSC 5x, SDS al 1%, reactivo de Denhardt 5x a 65ºC,
durante la noche, seguido de dos lavados a temperatura ambiente
durante 20 minutos, en SSC 2x y SDS al 0,1%, un lavado durante 20
minutos en SSC 2x y SDS al 0,1% a 65%, y un lavado en SSC 0,2x, SDS
al 0,1% a 65ºC. Hay otras condiciones, reactivos y otros que se
pueden usar, que producen el mismo grado de severidad. El experto en
la técnica estará familiarizado con tales condiciones y, por tanto,
no se proporcionan aquí.
La amplia distribución de la expresión de
MAGE-C1 y MAGE-C2 en las células
tumorales y no en las células normales, demuestra que las moléculas
de ácido nucleico aisladas se pueden usar como sondas diagnósticas
para determinar la presencia de células anormales, p.ej., tumorales,
que expresan secuencias relacionadas con MAGE-C1 o
MAGE-C2. La identificación de seminoma con
MAGE-C1 fue del 100% (Tabla 2), de forma que, a un
nivel muy básico, las moléculas de ácido nucleico se pueden usar
para determinar si el seminoma está presente o no. Hay que señalar
que existen muchas formas disponibles para el experto en la técnica,
para confirmar que una muestra de tumor es un seminoma, y no es
necesario reiterarlas aquí.
También se observará de los ejemplos que la
invención abarca el uso de las secuencias en vectores de expresión,
que se pueden usar para transformar o transfectar células
hospedadoras y líneas celulares, sean éstas procariotas (p.ej.,
E. coli), o eucariotas (p.ej., células CHO o COS). Los
vectores de expresión requieren que la secuencia pertinente, es
decir, aquellas descritas más arriba, estén unidas operativamente a
un promotor. El vector de expresión puede incluir, p.ej., una
secuencia que codifica una o más moléculas HLA. En una situación en
la que el vector contenga ambas secuencias codificadoras, se puede
usar para transformar o transfectar una célula que no expresa
normalmente cada una. La secuencia codificadora del precursor
antigénico de rechazo de tumores se puede usar sola, cuando, p.ej.,
la célula hospedadora ya expresa moléculas HLA. La célula
hospedadora particular que es adecuada para expresar las secuencias
aquí descritas incluye, p.ej., células procariotas o eucariotas,
como E. coli, células CHO, COS o células de insectos.
Otro aspecto de esta invención es el aislamiento
de un DNA genómico (DNAg) que codifica una proteína que tiene la
secuencia aminoácida codificada por una molécula de ácido nucleico
que tiene la SEQ ID Nº: 9 o la SEQ ID Nº: 18. Tal DNAg se puede
identificar y aislar usando métodos bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, se pueden usar sondas específicas de
MAGE-C1 derivadas de la SEQ ID Nº: 9 o sondas
específicas de MAGE-C2 derivadas de la SEQ ID Nº:
18, para escrutar una genoteca preparada, p.ej., a partir de células
LB373-MEL. Los técnicos en la materia serán capaces
de determinar a partir del análisis de secuencia, aquellas
secuencias que son específicas para MAGE-C1 y/o
MAGE-C2. También es posible, usando técnicas bien
conocidas en la materia, determinar el cromosoma en el que está
localizado tal DNAg, véase, p.ej., PCT/US95/02203.
Otra realización de esta invención es un kit de
expresión, que permite al técnico medio preparar un vector o
vectores de expresión deseados. Tales kits de expresión incluyen al
menos porciones separadas de cada una de las secuencias
codificadoras previamente analizadas, p.ej., un vector como un
plásmido bacteriano, un cósmido o un vector vírico que comprende un
promotor (DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
85:2274-2278 (1988), Grosveld et al.,
Gene 10:6715-6732 (1982), y Bates et
al., Gene 26:137-146 (1983), cualquiera
de las secuencias que codifican HLA, como las mostradas en Zemmour y
Parham, Immunogenetics 37:239-250 (1993), una
secuencia codificadora de MAGE-C1 o
MAGE-C2, o ambas, una secuencia codificadora de HLA
y una codificadora de MAGE-C2 o
MAGE-C2. Se pueden añadir otros componentes
conocidos en la técnica, como, p.ej., marcadores de resistencia,
potenciadores o promotores inducibles.
Para distinguir las moléculas de ácido nucleico y
las TRAPs y TRAs de esta invención, de los materiales MAGE, BAGE y
GAGE previamente descritos, la invención se debe denominar como gen
MAGE-C1, gen MAGE-C2, TRAP y TRAs
MAGE-C1, y TRAP y TRAs MAGE-C2. Por
tanto, cuando se usa aquí MAGE-C1 o
MAGE-C2, se refiere a precursores antigénicos de
rechazo de tumores, y sus TRAs derivados, que son codificados por
las secuencias de ácido nucleico previamente desconocidas.
"Secuencia codificadora de MAGE-C1",
"secuencia codificadora de MAGE-C2" y términos
similares, se usan para describir las propias moléculas de ácido
nucleico.
La invención, según se describe aquí, tiene
diversos usos, algunos de los cuales se describen aquí. Primero, la
invención permite al técnico medio diagnosticar un trastorno
caracterizado por la expresión de RNAs mensajeros de
MAGE-C1 o MAGE-C2 y los TRAPs y TRAs
de MAGE-C1 o MAGE-C2. Los métodos
implican determinar la expresión de RNAm de las moléculas de ácido
nucleico MAGE-C1 y MAGE-C2 y
moléculas relacionadas, y/o la presencia de TRAs derivadas del TRAP
codificado por MAGE-C1 o MAGE-C2 y
moléculas de ácido nucleico relacionadas. En la primera situación,
tales determinaciones se pueden realizar a través de cualquier
análisis estándar de determinación de ácidos nucleicos, incluyendo
la reacción en cadena de la polimerasa, o analizando con sondas de
hibridación marcadas. En la última situación, TRAP y TRA se pueden
detectar ensayando para el TRAP o TRA solo o ensayando para
complejos de TRA y HLA, usando parejas de unión como, p.ej.,
anticuerpos. Otra realización de esta invención es detectar la
presencia de células T citolíticas específicas para complejos de una
molécula HLA y un péptido derivado de la proteína codificada por la
molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 en una
muestra que contiene CTL, que comprende poner en contacto dicha
muestra con células que presentan dichos complejos sobre su
superficie, y determinar (I) la proliferación de células T
citolíticas, o (II) la lisis de células presentadoras de dichos
complejos, como determinación de dichas células T citolíticas en
dicha muestra. La proliferación de CTL se puede detectar analizando
la liberación de TNF o la liberación de una sustancia marcada
radiactivamente, como ^{51}Cr, según se describe, p.ej., en
PCT/US95/02203, incorporada mediante referencia en su totalidad.
Además, los CTL se pueden detectar mediante análisis ELISPOT, como
en Schmitt et al., J. Immunol. Meth.,
210:167-179 (1997) y Lalvani et al. J.
Exp. Med., 186:859 (1997), o mediante análisis FACS de complejos
tetrámeros fluorogénos de péptido/MHC clase I (Dunbar et al.
Current Biology, 8:713-716 (1998)).
El aislamiento de estas moléculas de ácido
nucleico MAGE-C1 y MAGE-C2, también
hace posible aislar las propias moléculas TRAP, especialmente
moléculas TRAP formadas por la secuencia aminoácida codificada por
SEQ ID Nº: 9 o SEQ ID Nº: 18. El aislamiento de las moléculas de
ácido nucleico MAGE-C1 y MAGE-C2
también permite identificar TRAs que son únicas para
MAGE-C1 o MAGE-C2, analizadas con
más detalle más adelante.
Además, el polipéptido que tiene la secuencia
aminoácida codificada por la secuencia nucleotida
257-3682 de SEQ ID Nº: 9, el polipéptido que tiene
la secuencia aminoácida codificada por la secuencia nucleótida
330-1449 de SEQ ID Nº: 18 y sus polipéptidos
derivados, también son parte de esta invención. Estos polipéptidos,
solos o en combinación con otros polipéptidos de otras moléculas
TRAP, por ejemplo, se pueden combinar con materiales tales como
adyuvantes que se conocen bien en la técnica, véanse, p.ej., la
patente de EE.UU. Nº 5.057.540 de Kensil et al., o la
solicitud PCT, PCT/US92/03579 de Scott et al., para producir
vacunas que serán útiles para tratar trastornos caracterizados por
la expresión de las moléculas.
Los péptidos derivados del polipéptido que tiene
la secuencia aminoácida codificada por la secuencia nucleótida
257-3682 de SEQ ID Nº: 9 y el polipéptido que tiene
la secuencia aminoácida codificada por la secuencia nucleótida
330-1449 de SEQ ID Nº: 18, que son presentados por
moléculas de MHC y reconocidos por CTL, se pueden combinar con
péptidos de otros antígenos de rechazo de tumores para formar
"polítopes". Péptidos ejemplares incluyen los enumerados en la
solicitud de patente de EE.UU. de Nº de serie 08/672.351;
08/718.964, actualmente patente de EE.UU. Nº _________; 08/487.135,
actualmente patente de EE.UU. Nº _________, 08/530.569 y
08/880.963.
Péptidos adicionales que se pueden usar son los
descritos en las siguientes referencias: patentes de EE.UU. N^{os}
5.405.940; 5.487.974; 5.519.117; 5.530.096; 5.554.506; 5.554.724;
5.558.995; 5.585.461; 5.589.334; 5.648.226 y 5.683.886; las
publicaciones internacionales PCT N^{os} 92/20356; 94/20356;
96/10577; 96/21673; 97/10837; 97/26535; y 97/31017, así como la
solicitud de EE.UU. pendiente de resolución de Nº de serie
08/713.354.
Los polítopes son grupos de 2 o más péptidos
potencialmente inmunógenos o estimuladores inmunitarios, que se
pueden unir entre sí de varias formas, para determinar si este tipo
de molécula estimulará y/o provocará una respuesta inmunitaria.
Estos péptidos se pueden unir entre sí
directamente o a través del uso de las secuencias flanqueadoreas,
véase Thomson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
92(13):5845-5849 (1995), mostrando la unión
directa de secuencias de epítopes relevantes. El uso de polítopes
como vacunas se conoce bien. Véanse, p.ej., Gilbert et al., Nat.
Biotechnol., 15(12):1280-1284 (1997);
Thomson et al., más arriba; Thomson et al., J.
Immunol., 157(2):822-826 (1996); Tam
et al., J. Exp. Med.,
171(1):299-306 (1990).
Tam et al., en particular, muestra que los
polítopes, cuando se usan en un modelo de ratón, son útiles para
generar tanto anticuerpos, como inmunidad protectora. Además, la
referencia muestra que los polítopes, cuando se digieren, producen
péptidos que pueden ser presentados por MHCs y son presentados por
los mismos. Tam et al. muestra esto demostrando el
reconocimiento de epítopes individuales procesados a partir de
"cadenas" de polítopes, vía CTLs. Este enfoque se puede usar,
p.ej. para determinar cuantos epítopes se pueden reunir en un
polítope, y producir aún reconocimiento, y también para determinar
la eficacia de diferentes combinaciones de epítopes. Se pueden
fabricar diferentes combinaciones "a medida" para pacientes que
expresan subgrupos particulares de antígenos de rechazo de tumores.
Estos polítopes se pueden introducir como estructuras
polipeptídicas, o a través del uso de sistemas de suministro de
ácidos nucleicos. Para explicarlo, la técnica tiene muchas vías
diferentes disponibles para introducir DNA que codifica un epítope
individual, o un polítope, como se analiza más abajo. Véase, p.ej.,
Allsopp et al., Eur. J. Immunol.
26(8):1951-1959 (1996). Se pueden usar
adenovirus, poxvirus, partículas de tipo virus Ty, plásmidos,
bacterias, etc. Se pueden analizar estos sistemas en modelos de
ratón para determinar qué sistema parece más apropiado para una
situación paralela determinada, en seres humanos. También se pueden
analizar en ensayos clínicos humanos.
Además, se pueden preparar vacunas de células,
como células cancerosas no proliferativas, transfectantes no
proliferativos, etc., que presentan los complejos TRA/HLA en su
superficie. En todos los casos en los que se usan células como
vacuna, las células pueden ser transfectantes que se han
transfectado con secuencias que codifican para uno o ambos de los
componentes necesarios para proporcionar una respuesta CTL, es
decir, moléculas TRAP, TRA y HLA, usando técnicas que son bien
conocidas en el estado de la técnica, véase, p.ej. PCT/US95/02203 y
Zemmour, más arriba, para las secuencias de diversas moléculas de
HLA. Alternativamente, las células pueden expresar tanto moléculas
de HLA como moléculas TRAP/TRA, sin transfección. Además, las
moléculas TRAP, sus TRAs asociados, así como los complejos de TRA y
HLA, se pueden usar para producir anticuerpos, usando técnicas
estándar bien conocidas en el estado de la técnica.
Cuando se usa aquí "trastorno", se refiere a
cualquier estado patológico en el que se expresa el precursor
antigénico de rechazo de tumores. Un ejemplo de tal trastorno es el
cáncer, el seminoma en particular.
Los enfoques terapéuticos basados en esta memoria
tienen como premisa la respuesta del sistema inmunológico de un
sujeto, que conduce a la lisis de células presentadoras de HLA/TRA.
Uno de tales enfoques es la administración de CTLs que son
específicos para un complejo HLA/TRA a un sujeto que tiene células
anormales del fenotipo en estudio. El técnico está capacitado para
desarrollar tales CTLs in vitro, véase, p.ej., Herin et
al., más arriba. Por ejemplo, una muestra de células, como
células sanguíneas, se ponen en contacto con una célula diana que
presenta un complejo HLA/TRA, y son capaces de hacer que un CTL
específico prolifere. La célula diana puede ser un transfectante,
como una célula COS transfectada con un HLA y TRAP particular y de
expresarlo, según se describió más arriba. Estos transfectantes
presentan el complejo deseado sobre su superficie y, cuando se
combinan con un CTL de interés, estimulan su proliferación. Las
células COS, como las utilizadas aquí están ampliamente disponibles,
como lo están otras células hospedadoras adecuadas, que incluyen,
pero no están limitadas a, células CHO, Spodopitera
furjiperda, E. coli, Bacillus, etc.
Una metodología terapéutica se denomina
transferencia adoptiva (Greenberg, J. Immunol.
136(5):1917 (1986); Riddel et al., Science
257:238 (7-10-92); Lynch et
al., Eur. J. Immunol. 21:1403-1410
(1991); Kast et al., Cell 59:603-614
(11-17-89)). En la transferencia
adoptiva, las células presentadoras del complejo HLA/TRA deseado se
combinan con CTLs, conduciendo a la proliferación de los CTLs que
son específicos para ese complejo. Los CTLs proliferados se
administran a continuación a un sujeto con una anormalidad celular
que se caracteriza porque ciertas células anormales presentan el
complejo particular. Los CTLs lisan a continuación las células
anormales, logrando por tanto el fin terapéutico deseado.
La terapia anterior asume que al menos algunas de
las células anormales del sujeto presentan el complejo HLA/TRA
relevante. Esto se puede determinar fácilmente, ya que la técnica
está muy familiarizada con métodos para identificar células que
presentan una molécula HLA particular, así con cómo identificar
células que expresan el DNA de las secuencias pertinentes, en este
caso MAGE-C1 o MAGE-C2, y secuencias
relacionadas. Si las células anormales del paciente presentan el
complejo HLA/TRA relevante, el paciente es un candidato apropiado
para los enfoques terapéuticos descritos más arriba.
La transferencia adoptiva no es la única forma de
terapia que está disponible de acuerdo con la invención. Las CTLs
también se pueden inducir in vivo, usando diversos enfoques.
Se ha elaborado un enfoque sobre lo anterior, es decir, el uso de
células no proliferativas que expresan el complejo como una vacuna.
Las células usadas en este enfoque pueden ser aquellas que expresan
normalmente el complejo, como células de seminoma irradiadas o
células irradiadas transfectadas con uno o ambos de los genes
necesarios para la presentación del complejo. Chen et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110-114 (enero
1991) ejemplifica este enfoque, mostrando el uso de células
transfectadas que expresan péptidos HPV E7 en un régimen
terapéutico. Se pueden usar varios tipos celulares.
De forma similar, se pueden usar vectores, como
vectores víricos o bacterianos, que llevan una molécula de ácido
nucleico que codifica, bien un HLA o un TRAP o TRA, o una de sus
combinaciones. En estos sistemas, la molécula de ácido nucleico es
tranportada por, p.ej., un virus Vaccinia o la bacteria BCG, que
infectan células hospedadoras. Las células infectadas presentan el
complejo HLA/TRA y son reconocidas por CTLs autólogos, que luego
proliferarán.
Los CTLs también se pueden inducir in
vivo, combinando el propio TRA o TRAP con un adyuvante, para
facilitar la incorporación en células presentadoras de HLA. Las
células presentan el complejo HLA/péptido de interés, tratando
adicionalmente el TRAP para producir la pareja peptídica de la
molécula de HLA. Alternativamente, las células pueden presentar el
TRA sin necesidad de un tratamiento posterior. Véanse, p.ej.,
Braciale, T.J. y Braciale, V.L., Immunology Today
12:124-129 (1991); T. Elliot, Immunology
Today 12:386-388 (1991), y Madelboim et
al., Nature 369:67-71 (1994).
Asimismo, una característica de esta invención
son péptidos aislados derivados de MAGE-C1 TRAP o
MAGE-C2 TRAP, que están de acuerdo con las reglas
para la presentación por moléculas del MHC. Por ejemplo, en la
solicitud PCT Nº PCT/US93/07421, se describen diversos motivos
distintivos como asociados con diferentes moléculas del MHC. Estos
motivos, así como los descritos por, p.ej., Falk et al.,
Nature 351:290-296 (1991); Engelhard, Ann.
Rev. Immunol. 12:181-207 (1994); Ruppert et
al., Cell 74:929-937 (1993); Rötzschke
et al., Nature 348:252-254 (1990);
Bjorkman et al., Nature 329:512-518
(1987) y Traversari et al. J. Exp. Med.
176:1453-1457 (1992), sirven como base para
identificar péptidos apropiados que se pueden obtener o derivar de
la secuencia aminoácida MAGE-C1 y de la secuencia
nucleótida que codifica la proteína. En otro aspecto de la
invención, estos péptidos se pueden usar solos o en mezclas, para
estimular la proliferación de CTL. Estos péptidos también son útiles
en vacunas.
Está bien establecido que la sangre de individuos
afectados por tumores, contiene frecuentemente células T citolíticas
("CTLs"), que reconocen complejos de moléculas del MHC y
péptidos presentados. Véanse, p.ej., Robbins et al., Canc.
Res. 54:3124-3126 (1994); Topolian et
al., J. Immunol. 142:3714-3725 (1989);
Coulie et al. Int. J. Cancer
50:289-297 (1992). Asimismo, hay que destacar
Kawakami et al., J. Exp. Med.
180:347-352 (1994); Hom et al. J.
Immunother. 10:153-164 (1991), Darrow et
al., J. Immunol. 142(9):3329-3335
(1989); Slovin et al., J. Immunol.
137(9):3042-3048 (1986).
Estos trabajos establecen todos la utilidad de un
análisis de proliferación de CTL para diagnosticar un posible
cáncer.
En general, un paciente tendrá sólo CTLs que
reconozcan células diana que presenten complejos particulares de TRA
y HLA y proliferen como respuesta al contacto con las mismas, sólo
si al menos algunas de las propias células del paciente también
están expresando también ese complejo particular. Si se extrae una
muestra que contiene un linfocito sanguíneo periférico (PBL) de un
paciente que se sospecha que tiene células anormales, p.ej., células
tumorales, y se pone en contacto dicha muestra que contiene CTL con
una célula diana que presenta complejos de una molécula del MHC
relevante y un péptido derivado de MAGE-C1 o
MAGE-C2, sólo se observará proliferación de CTLs que
sean específicos para ese complejo. Por tanto, la proliferación de
CTLs en la muestra de PBL del paciente indicará que el paciente
posiblemente tiene células tumorales que expresan ese complejo
HLA/TRA particular. Las células diana pueden ser células que
normalmente presentan la molécula de MHC en cuestión, o pueden ser
células que se han transfectado con una secuencia codificadora de
HLA. Las células diana pueden ser posiblemente células tumorales o
células normales.
Una realización de la invención implica mezclar
una muestra de células diana con (1) un péptido o mezcla de péptidos
derivados de una TRAP de MAGE-C1 o una TRAP de
MAGE-C2 y son presentados por las moléculas de MHC
de la célula diana y (2) una muestra de PBL del sujeto que se está
evaluando. La mezcla se analiza a continuación para proliferación de
CTL. En la técnica se conocen varios métodos para determinar la
proliferación de CTL, p.ej., análisis de liberación TNF, y análisis
de liberación de ^{51}Cr, p.ej., PCT/US95/02203.
El péptido o péptidos de esta invención se pueden
combinar también con uno o más adyuvantes para estimular una
respuesta CTL más pronunciada. Ejemplares de tales adyuvantes son
saponinas y sus derivados, como aquellas descritas mediante la
patente de EE.UU. Nº 5.057.540 de Kensil et al., o la
solicitud PCT, PCT/US92/03579 de Scott et al. Por supuesto,
también se pueden usar adyuvantes estándar, como el adyuvante
completo de Freund, o adyuvante incompleto de Freund.
Otros aspectos de la invención estarán claros
para el experto en la técnica y no es necesario repetirlos aquí.
Los términos y expresiones que se han empleado se
usan como términos de descripción y no de limitación, y no hay
intención, en el uso de tales términos y expresiones, de excluir
ningún equivalente de las características mostradas y descritas o
porciones de las mismas, reconociéndose que son posibles varias
modificaciones dentro del alcance de la invención.
Se generó una genoteca de DNAc enriquecida para
secuencias presentes solo en el tipo celular de interés, una célula
"de prueba", y no presentes en otro tipo celular, una célula
"conductora", esencialmente según se describió por Hubank y
Schatz, Nucl. Acids Res., 22:5640-5648
(1994).
En resumen, se preparó el RNA total procedente de
células de prueba y de células conductoras. Aquí, las células de
prueba eran células de melanoma LB373-MEL y las
células conductoras eran células cutáneas normales. Se aisló
poli-A + RNA del RNA total, usando columnas de
oligo-dT, empleando técnicas bien conocidas en el
estado de la técnica. El poli-A + RNA se transcribió
inversamente a continuación para producir DNAc. El DNAc se digirió
con enzima de restricción DpnII, que corta el DNA en sitios GATC,
para generar fragmentos cortos de DNA dúplex con colgantes de
5'-GATC. Se ligaron adaptadores de DNA dúplex con
colgantes de 5'-GATC (adaptador
R-BgI que está formado por oligonucleótidos
R-BgI-12 y
R-BgI-24 anillados de SEQ ID Nº: 2 y
SEQ ID Nº: 11, respectivamente), con el DNAc digerido con DpnII
preparado a partir de las células de prueba y conductoras. El DNAc
ligado al adaptador se amplificó a continuación mediante la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), bien conocida. El producto
amplificado es una "representación" de la célula de prueba y la
conductora, respectivamente. Ambas representaciones de la célula de
prueba y la conductora se digirieron con DpnII. La prueba digerida
se ligó a nuevas moléculas adaptadoras (el adaptador
J-BgI que está compuesto por oligonucleótidos
J-BgI-12 y
J-BgI-24, de SEQ ID Nº: 3 y SEQ ID
Nº: 12, respectivamente). Luego se realizó una primera vuelta de
hibridación sustractiva, mezclando el DNAc conductor digerido con el
DNAc de prueba digerido ligado a los adaptadores
J-BgI, en proporciones de 100/1. La muestra de DNAc
de células de prueba y conductora mezclados se desnaturalizó a 98ºC
durante 5 min y luego se incubó a 67ºC durante 20 horas para volver
a hibridar la muestra desnaturalizada. Esto produjo una mezcla de
DNAc dúplex híbridos. Los DNAc híbridos eran de tres tipos. Un tipo
híbrido constituido por dos moléculas de DNAc de células de prueba
que representaban secuencias nucleótidas únicas para células de
prueba, un segundo tipo híbrido constituido por dos moléculas de
DNAc de células conductoras, y un tercer tipo híbrido constituido
por una molécula de DNAc de célula de prueba y una molécula de DNAc
de célula conductora. Tras la hibridación, la muestra se amplificó
por PCR usando un adaptador J-BgI monocatenario,
J-Bg1-24 SEQ ID Nº: 12. Los DNAc
híbridos compuestos por dos moléculas de DNAc de células conductoras
no se amplificaron, porque no comprendían el adaptador
J-BgI. Los DNAc híbridos constituidos por una
molécula de DNAc de prueba y una molécula de DNAc conductora, sólo
se amplificaron linealmente. Solo los DNAc dúplex, formados por dos
moléculas de DNAc de células de prueba se amplificaron
exponencial-
mente.
mente.
Tras 10 ciclos de amplificación PCR, según se
describió anteriormente, la muestra se trató con nucleasa de judía
Mung (que digiere específicamente el DNA monocatenario producido por
la amplificación lineal), luego se sometió a 18 ciclos adicionales
de PCR. El producto enriquecido resultante se denominó producto
diferencial 1 (DP1). Se generaron DP1-testículos
[-HLLK] y DP1-LB373 [-piel].
Los adaptadores J-BgI en DP1 se
cambiaron por adaptadores
N-BgI-12/24
(N-BgI-12:
5'-GATCTTCCCTCG-3';
N-BgI-24:
5'-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-3', es
decir, oligonucleótidos N-BgI-12 y
N-BgI-24 anillados, SEQ ID Nº: 4 y
SEQ ID Nº: 13, y se repitió el procedimiento de hibridación
sustractiva para generar los segundos productos diferenciales
(excepto porque el anillado y extensión en las reacciones PCR se
realizaron a 72ºC). Las proporciones de células de prueba a células
conductoras fueron de 1/800 para generar DP2.Testículos (-HLLK),
pero de 1/100 para generar DP2.LB373 (-piel). Se generó un tercer
producto diferencial DP3.testículo (-HLLK) repitiendo el
procedimiento con DP2.testículo (-HLLK) ligado a
J-BgI como célula de prueba y la representación de
HLLK como célula conductora, con una amplificación final realizada
de 22 ciclos.
Muchos antígenos tumorales conocidos son
codificados por genes que se expresan sólo en tumores y en
testículos. Buscando secuencias que eran comunes a
DP3.Testículos[-HLLK] (que representan secuencias de ácidos
nucleicos exclusivas de células de testículos) y DP2.LB373 [-piel]
(que representan secuencias de ácidos nucleicos exclusivas de
células de melanoma), según se describió anteriormente, se
identificaron secuencias de ácidos nucleicos que se expresaban sólo
en testículos y células tumorales, que codifican antígenos tumorales
no identificados
anteriormente.
anteriormente.
Para clonar DNA de DP3.Testículos[-HLLK], se
digirió DP3.Testículos[-HLLK] con DpnII y el DNA digerido se ligó a
digeridos de BAmHI del plásmido pTZ18R disponible en el comercio.
Las bacterias, DH5\alphaF'IQ (disponibles en el comercio), se
sometieron a electroporación con DNA ligado. Las bacterias sometidas
a electroporación se seleccionaron y escrutaron mediante hibridación
de colonias con una sonda producida mediante marcaje de
DP2.LB373[-piel] con cebadores aleatorios, polimerasa de DNA de
Klenow y \alpha-^{32}P-dCTP.
Los plásmidos procedentes de transformantes que
hibridaban con la sonda DP2.LB373[-piel] se aislaron y se analizaron
sus insertos. Un clon que contenía un inserto de 283 pb se purificó
y secuenció usando técnicas bien conocidas en la técnica. La
secuencia del inserto de 283 pb compartía homología parcial con la
familia del gen MAGE. La máxima homología (74%) se obtuvo con una
secuencia de 147 nucleótidos, correspondiente a los nucleótidos 9895
a 10041 del DNAc de MAGE-4a, según se predijo del
DNA genómico de MAGE 4a (Nº de acceso de Genbank U 10687). Estos
datos sugerían que el inserto de 283 pb era una porción de un
miembro de la familia MAGE no identificado previamente. Este miembro
de la familia se denominó MAGE-C1.
Para obtener el DNAc de MAGE-C1
completo, se escrutó una genoteca de DNAc, preparada a partir de RNA
de LB373-MEL y se subclonó en pcDNAI/Amp. La
genoteca de DNAc se preparó como sigue.
Se extrajo el RNA total de células
LB373-MEL mediante el procedimiento de
guanidina-isotiocianato (Davis L.G., M.D. Dibner y
J.F. Battery, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier,
New York, págs. 130-135 (1986)). Se purificó
poli-A+RNA sobre columnas de
oligo-dT (Pharmacia) y se convirtió en DNAc usando
un cebador de oligo-dT (NotI, EcoRI) SEQ ID Nº: 5.
El DNAc se ligó a adaptadores BstX1 (SEQ ID Nº: 6), se digirió con
Not1 y se ligó con el vector de expresión pcDNAI/Amp digerido con
BstX1 y Not1, disponible en el comercio, usando métodos bien
conocidos en la técnica. Se sometieron a electroporación bacterias
de la cepa Top 10F' de Escherichia coli con los plásmidos
recombinantes ligados y los transformantes se seleccionaron con
amplicilina (50 \mug/ml). La genoteca se escrutó con una sonda de
^{32}P marcada radioactivamente, derivada del inserto de 283 pb
aislado más
arriba.
arriba.
Los transformantes bacterianos se escrutaron para
secuencias MAGE-C1, usando métodos bien conocidos en
la técnica. De forma resumida, se sembraron aproximadamente 140.000
bacterias sobre filtros de membrana de nylon. Se fabricaron filtros
de membrana de nylon duplicados y se trataron para desnaturalizar y
fijar el DNA bacteriano. Se generó una sonda específica de
MAGE-C1 de 168 pb mediante RT-PCR
(PCR de transcripción inversa), usando como molde RNA
LB373-MEL, y cebadores específicos de
MAGE-C1, es decir, cebador del mismo sentido SL26:
5'-CCAGTAGATGAATATACAAGTT-3', que
se corresponde con los nucleótidos (nt) 2666 a nt 2687 de la SEQ ID
Nº: 1 y el cebador antisentido SL27:
5'-GATAGGCTGCTTCACTT-3', que es la
secuencia complementaria de nt 2817 a nt 2833 de SEQ ID Nº: 1. Este
producto de PCR de MAGE-C1 de 168 pb, que
corresponde a nt 2666 a 2833 de SEQ ID Nº: 1, se purificó sobre una
columna CL-6B de sefarosa, marcada luego usando
cebadores al azar, DNA-polimerasa de Klenow Y
\alpha-^{32}P-dCTP, según se
describió anteriormente (Ejemplo 3). Los filtros de membrana
duplicados tratados se hibridaron con la sonda específica
MAGE-C1 (500.000 cpm/ml; incubación durante la noche
a 65ºC en SSC 5X, SDS al 0,1%, reactivo de Denhardt 5X), luego se
lavaron en condiciones estrictas y se autorradiografiaron durante 70
horas a temperatura ambiente. Las condiciones estrictas, según se
describen aquí, se refieren a SSC 0,1X a 0,5X, SDS al 0,1% a 65ºC
durante 20 min. Se identificaron dos colonias que hibridaban con la
sonda MAGE-C1. Las colonias se purificaron y
escrutaron una vez más para verificar que hibridaban con la sonda.
Los plásmidos se aislaron de estas colonias y sus insertos se
secuenciaron y analizaron usando métodos que se conocían bien en la
técnica. Se seleccionó un clon y el DNAc de MAGE-C1
insertado se analizó en detalle. El clon analizado contenía una
molécula de DNAc de MAGE-C1 de 4031 pb de longitud
(Figura 1) SEQ ID Nº: 1. Un marco de lectura abierto (ORF) se
extiende a lo largo del DNAc casi completo, con un primer ATG,
localizado en el nt 257, de acuerdo con la conocida regla de Kozak,
y un codón de parada en nt 3473. El ORF codifica una proteína
putativa de 1072
aminoácidos.
aminoácidos.
El alineamiento con el DNAc de
MAGE-A1 reveló homologías significativas entre el
DNAc de MAGE-C1 (SEQ ID Nº: 1) y los exones 2 y 3 de
MAGE-A1. El marco de lectura abierto de
MAGE-C1, sin embargo, es aproximadamente 2 kb mayor
que el de MAGE A1, debiéndose la mayoría de la diferencia a una
secuencia repetitiva larga.
El cebador del mismo sentido SL33
(5'-CGGAGGGAGGAGACTTA-3') nt
18-34 de SEQ ID Nº: 1 y el cebador antisentido SL34
(5'-TTAAGGTGGTGCTCTAGG-3'), que es
complementario a nt 200-217 de SEQ ID Nº: 1, se
muestran en la Figura 1. Estos cebadores están localizados en
diferentes exones, según se determinó por los diferentes tamaños de
los productos de PCR procedentes de DNAc (202 pb) o de DNAs
genómicos (aproximadamente 1,1 kb) preparados de tejido normal y
células tumorales. El patrón de expresión del RNA mensajero de
MAGE-C1 se determinó mediante análisis
RT-PCR estándar de tejido normal y muestras
tumorales. Estos datos indican que la expresión de
MAGE-C1 no se detecta en los tejidos normales
analizados (Tabla 1), con la excepción de los testículos. Entre las
muestras de células tumorales, la expresión de
MAGE-C1 se detecta frecuentemente en melanoma (46%),
seminoma (100%), carcinoma de células de transición de la vejiga
(18%), carcinoma de mama (16%), y carcinoma pulmonar distinto del de
células pequeñas (16%). También se detecta en una fracción
significativa de sarcoma, carcinoma de cabeza y cuello y
adenocarcinoma de próstata (Tabla 2).
10 \mug de RNA total extraído mediante el
procedimiento de guanidina-isotiocianato (Davis
et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier,
Nueva York, págs. 130-135 (1986) se separaron
mediante electroforesis en gel de
agarosa-formaldehído, se transfirieron a una
membrana de nylon mediante transferencia capilar y se fijaron
mediante radiación UV. La hibridación con la sonda
XbaI-EcoRi de 1,3 kb de MAGE-C1,
correspondiente a los nucleótidos 589 a 1904 de SEQ ID Nº: 1
(marcada radioactivamente con
[\alpha-^{32}P]dCTP) se realizó durante
la noche a 60ºC en sulfato de dextrano al 10%, NaCl 1M, SDS al 1% y
100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. La
membrana se lavó consecutivamente en 2xSSC, SDS al 0,1% durante 20
min a temperatura ambiente, en SSC 2x, SDS al 0,1% durante 20 min a
60ºC, y finalmente en SSC 2x, SDS al 0,1% durante 5 min a 60ºC. Se
realizó autorradiografía durante 7 días usando película MS BioMax
(Kodak). La misma membrana se hibridó con una sonda específica de
\beta-actina en condiciones idénticas, excepto
porque el lavado se realizó dos veces durante 10 min en SSC 2x a
temperatura ambiente, y la autorradiografía se realizó durante la
noche. Se observó una especie de MAGE-C1 mensajero
que migraba, de alrededor de 4 kb en el RNA total procedente de
testículo normal y en algunas líneas celulares tumorales. No se
detectaron especies de MAGE-C1 mensajero en el RNA
total procedente de pulmón
normal.
normal.
La secuenciación y alineamiento de SEQ ID Nº: 1
(Figura 2 y Figura 3) revelaron que el DNAc de
MAGE-C1 es homólogo a MAGE-A1 (Van
der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991)) sólo en
su tercer tercio. Excepto por otro intervalo corto de homología
respecto al segundo exón de MAGE-A1,
MAGE-C1 está compuesto por secuencias no
relacionadas con la familia MAGE o con cualquier secuencia descrita
en los bancos de datos. Comparado con otros DNAc de MAGE,
MAGE-C1 contiene una inserción de aproximadamente
2,4 kb, representada en la Figura 3 por un gran recuadro rayado, que
comprende 3 tipos de secuencias repetidas en tándem: repeticiones de
42 pb, repeticiones de 63 pb y repeticiones de 48 pb.
Las tranferencias Southern preparadas con varios
DNA genómicos procedentes de líneas celulares de melanoma
LB373-MEL, SK29-MEL, y LB33.
A-1 (Coulie et al., J. Exp. Med.
180:35-42 (1994); Coulie et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92:7976-7980 (1995);
Lehmann et al. Eur. J. Immunol.
25:340-347 (1995)), se hibridaron con una sonda de
DNAc Xbal-EcoRI de 1,3 kb, derivada de SEQ ID Nº: 1,
que contiene la mayoría de la inserción que distingue el clon de
DNAc de MAGE-C1 de otros DNAc de MAGE. Diez \mug
de DNA genómico digerido con una enzima de restricción, se separaron
mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfirieron a
membranas de nylon mediante el método de transferencia capilar, y se
fijaron mediante radiación UV, según se describió (Sambrook et
al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, N.Y. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, págs. 9.31-9.58). La
hibridación con la sonda XbaI-EcoRI de 1,3 kb de
MAGE-C1 se realizó en SSC 5x, medio de Denhardt 5x,
SDS al 0,1% y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón
desnaturalizado durante 12 a 24 horas a 68ºC. Las membranas se
lavaron consecutivamente en SSC 2x, SDS al 0,1% durante 20 min a
temperatura ambiente, en SSC 2x, SDS al 0,1% durante 20 min a 68ºC,
y en SSC 0,2x, SDS al 0,1% durante 20 min a 68ºC. La
autorradiografía se realizó durante 3 días, utilizando película
BioMax MS (Kodak).
En el DNA procedente de la línea de melanoma SK29
digerida con 5 enzimas de restricción distintas, estaba presente una
única banda de hibridación, sugiriendo que MAGE-C1
es el único gen de este tipo en la familia MAGE. Sin embargo, DNAs
digeridos con Pst1 aislados de linfocitos sanguíneos periféricos de
11 pacientes macho contienen cada uno una única banda
MAGE-C1, pero de diferentes tamaños, sugiriendo la
existencia de polimorfismo alélico en el gen
MAGE-C1. DNAs digeridos con EcoRi procedentes de
LB373-MEL y
LB33-MEL.A-1 contienen una única
banda de MAGE-C1 de idéntico tamaño (véase Figura 3
para las posiciones de la sonda y los sitios de restricción).
Para aislar el gen MAGE-C1, se
escrutó una biblioteca de cósmidos preparada con DNA genómico de la
línea de melanoma
LB33-MEL-A-1. El DNA
genómico procedente de la línea de melanoma
LB33-MEL.A-1 se digirió parcialmente
con Mbo1 y se ligó a los brazos de cósmido del vector c2RB según se
describió (Lurquin, C. et al., Cell
58:293-303 (1989)). El DNA ligado se introdujo en
dos cabezas de fago \lambda (GIGAPACK, Stratagene) y se valoró en
Escherichia coli ED8767. La biblioteca se representó mediante
40 grupos de 70.000 cósmidos independientes. Cada grupo se usó para
infectar bacterias Ed8767, y se amplificó en medio LB que contenía
50 \mug/ml de ampicilina. Se congelaron alícuotas de cultivos de
16 horas, otras se valoraron para evaluar la amplificación de la
biblioteca (10^{5}x), y el resto de cultivos se amplificó
nuevamente y se usó para aislar el DNA de cósmidos total, según se
describió (De Plaen, Immunology Methods Manual, Academic
Press Ltd., 9.9: 691-718 (1997).
DNA extraído de 16 grupos de aproximadamente
70.000 cósmidos independientes, se sometió a amplificación PCR con
cebadores MAGE-C1. Doce grupos se encontraron
positivos, y uno de estos se escrutó mediante hibridación de
colonias con la sonda XbaI-EcoRI. Se identificó un
cósmido positivo, C7.2. El análisis de restricción y la
transferencia Southern reveló que este cósmido contenía un inserto
de aproximadamente 42 kb, que llevaba 4 fragmentos de EcoRI de 1,
1,4, 1,6 y 2 kb, respectivamente, y un fragmento BamHI de 2 kb, que
hibridaba con una sonda correspondiente al clon de DNAc de
MAGE-C1 completo (SEQ ID Nº: 1). Esos 5 fragmentos
se subclonaron en el fagémido pTZ19R y se determinó su secuencia
nucleótida. La comparación de estas secuencias con el clon de DNAc
mostró que MAGE-C1 está compuesto por cuatro exones
(Figura 3). Un marco de lectura abierto de 3.426 pares de bases
empieza con un ATG localizado al final del exón III, y se extiende a
través de la mayor parte del exón IV. Todos los motivos distintivos
repetidos están incluidos en el último, pero la longitud de esta
región repetitiva era más larga en el clon de DNAg comparada con la
encontrada en el clon de DNAc. Aunque los clones de DNAc y genómicos
procedían de bibliotecas de diferentes orígenes (sublíneas
LB373-MEL y
LB33-MEL.A-1, respectivamente), la
variación alélica difícilmente podría explicar esta discrepancia,
como se demostró mediante análisis de transferencia Southern con la
sonda XbaI-EcoRI. Para confirmar los resultados de
los análisis de transferencia Southern, se amplificó el DNA genómico
de ambas líneas celulares mediante PCR con los cebadores SL38
(5'-GGCGACGACACCCAGT-3'),
correspondiente a nt 521 a 536 de SEQ ID Nº: 1, y SL43
(5'-AGGAAAGTAGAGAGGAGACAT-3'),
correspondiente a nt 1862 a 1882 de SEQ ID Nº: 1, y se obtuvieron
productos de idénticos tamaños. La secuenciación parcial de estos
productos de PCR no mostró diferencia a nivel de nucleótidos entre
las dos líneas celulares, excluyendo la presencia de un sitio de
escisión en las células LB373-MEL, que está ausente
en las células LB33-MEL.
Para determinar si los artefactos de la
transcripción inversa eran responsables de las diferentes longitudes
de las regiones repetitivas en los clones de DNAg y DNAc, se
amplificó mediante PCR el DNAc obtenido de la transcripción del RNA
total, usando los cebadores SL38 y SL43.
Se usó Transcription in vitro Systems
(Promega) para producir RNA de MAGE-C1 para la
amplificación PCR y clonación de la región repetitiva de
MAGE-C1 a partir de DNAc. Un \mug del clon de DNAc
de MAGE-C1 que contenía pcDNAI/Amp digerido con
HindIII, se diluyó hasta un volumen final de 20 \mul con 4 \mul
de tampón SP6 5x, 1 \mul de cada NTP a 10 mM, 2 \mul de
ditioeritritol a 0,1M, 0,5 \mul (20 unidades) de inhibidor de
RNAsa y 1 \mul (15 unidades) de RNA polimerasa SP6. Se produjo una
reacción testigo, en la que 5 \mul
[\alpha-^{32}P]CTP (3000 Ci/mmol) se
añadieron a una mezcla idéntica a la mezcla de transcripción
descrita anteriormente, excepto porque sólo se usaron 2,4 \mul de
CTP 0,1 mM. Las reacciones se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se
añadió un \mul (1U) de DNAsa RQ1 a las mezclas, que se incubaron
nuevamente durante 1 hora a 37ºC. Una décima parte del RNA marcado
radioactivamente se analizó mediante electroforesis sobre un gel de
agarosa formaldehído, el gel se secó y autorradiografió para
confirmar que sólo se obtenían productos completos. Se extrajo con
fenol RNA no radiactivo, se precipitó con etanol, y se volvió a
poner en suspensión en 10 \mul de agua. Un \mul de solución de
RNA se transcribió inversamente en las mismas condiciones que el RNA
total (Weynants et al., Int. J. Cancer
56:826-829 (1994)).
Para excluir la contaminación con DNA plasmídico,
se incluyó una reacción testigo en la que no se incluía
transcriptasa inversa MoMLV. 1/40 de las reacciones completadas se
incluyeron en 37 ciclos de PCR con el cebador SL38 del mismo sentido
y el cebador antisentido SL43. Los productos de PCR se fraccionaron
mediante electroforesis en gel de agarosa. En las reacciones testigo
no se detectó ningún producto detectable.
El cebador del mismo sentido SL38
(5'-GGCGACGACACCCAGT-3'),
correspondiente a nt 521 a 536 de SEQ ID Nº: 1 y el cebador
antisentido SL43
(5'-AGGAAAGTAGAGAGGAGACAT-3'),
correspondiente a nt 1862 a nt 1882 de SEQ ID Nº: 1, se usaron para
amplificar DNAc (1/40 del producto de transcripción inversa
procedente de 2 \mug de RNA total) o 500 ng de DNA genómico
procedente de líneas de melanoma LB373-MEL y
LB-33-MEL.A-1. Se
realizó PCR en 50 \mul de volumen final, con 5 \mul de tampón
DynaZyme 10x, 1 \mul de cada dNTP 10mM, 25 pmoles de cada cebador
y 2 unidades de DynaZyme (FynnZymes Oy), para 30 (DNA genómico) o 37
(DNAc) ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min a 65ºC y 2 min a 72ºC.
Los productos de PCR se ligaron al plásmido pCR3,
usando el Eukaryotic TA Clonin Kit (Invitrogen), y los productos de
ligamiento se sometieron a electroporación en bacterias Top10F'. Se
obtuvieron múltiples productos, con tamaños que variaban de 1,6 a
0,35 kb. Como contraste, se obtuvo un solo producto del DNA genómico
amplificado por PCR con los cebadores SL38 y SL43. También se
generaron múltiples productos de PCR con DNAc molde obtenido de
transcripción inversa de un RNA de longitud total transcrito in
vitro a partir del clon de DNAc de MAGE-C1 (SEQ
ID Nº: 1). Estos resultados sugieren que los artefactos de
transcripción inversa son responsables de la discrepancia entre los
clones de DNAc y genómico, y que las especies de RNAm natural
transcritas a partir del gen MAGE-C1 en la línea de
melanoma LB373-MEL, tienen que comprender la región
repetitiva entera, según se encuentra en el cósmido C7.2, como se
describió más arriba. La secuencia de un DNAc completo de este RNAm
natural se presenta como SEQ ID Nº: 9.
La región repetitiva corresponde a un total de 18
repeticiones directas de 14 aminoácidos (aa), 17 repeticiones de 21
aa, y 16 repeticiones de 16 aa. El gen MAGE-C1
comparte la máxima homología global con el gen
MAGE-A10. Sin embargo, la comparación y alineamiento
se realizan en las Figuras 2 y 3 con MAGE-A1, el gen
mejor caracterizado de la familia MAGE. El exón 1 del gen
MAGE-C1, no tiene parejas homólogas en otros MAGEs,
pero hay que destacar que un sitio de unión consenso Sp1 y dos Ets
preceden inmediatamente al primer exón, según se describió en
MAGE-1 (De Smet et al., Immunogenetics
42:282-290, (1995); De Smet et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93:7149-7153 (1996) y en
algunos promotores de MAGE-4 (presentado por De
Plaen).
Los experimentos de hibridación de fluorescencia
in situ (FISH) con el cósmido C7.2 como sonda muestran que el
gen MAGE-C1 se localiza sobre el brazo largo del
cromosoma X, sobre la banda Xq27.
Se usó una sonda de cósmido genómico humano para
MAGE-C1, para hibridación de fluorescencia in
situ. El clon del cósmido MAGE-C1 entero se
tradujo con muescas usando dATP biotina-14 y dCTP
biotina-14 (Gibco BRL) para hibridación de
fluorescencia in situ y se hibridó con extensiones de
metafases humanas normales en dos experimentos independientes.
Se obtuvieron preparaciones de cromosomas de
linfocitos de sangre periférica normal estimulados con
fitohemaglutinina, cultivados durante 72 horas. Para inducir la
formación de bandas R, algunos de los cultivos se sincronizaron con
timidina tras 48 horas, se incubaron a 37ºC y se trataron con
5'bromodesoxiuridina (BrdU) la mañana siguiente, durante la fase S
tardía final, y se recogieron 6 horas después (Jacky, P.B., Raven
Press, pág. 89, (1991)). Las recogidas citogenéticas y las
preparaciones de portas se realizaron usando métodos estándar. Los
portas se almacenaron a -80ºC antes de su uso.
La hibridación in situ de fluorescencia a
cromosomas en metafase se realizó según se describió por Pinkel
et al. (Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83:2934-2938, (1986)). En resumen, la sonda
marcada con biotina (50-100 ng) se disolvió en la
mezcla de hibridación (formamida al 50%, sulfato de dextrán al 10%,
SSC 2x, 0,1 \mug de DNA de COT-1 (Gibco BRL), 10
\mug de DNA de esperma de salmón cortado como vehículo) y se
incubó durante 60 min a 37ºC para permitir al DNA de
COT-1 anillarse con las secuencias repetitivas en la
sonda. La mezcla de sondas se aplicó a continuación al porta y se
desnaturalizó conjuntamente durante 10 minutos a 80ºC sobre una
estufa de portas. Se dejó producirse la hibridación durante la noche
en una cámara húmeda a 37ºC. Los portas se lavaron usando el
procedimiento de lavado con formamida, como para el kit de detección
de FITC-biotina y, cuando era apropiado, el
protocolo de amplificación para color dual FISH (Oncor). La
detección de la sonda marcada con biotina se logró mediante
incubación con el conjugado de FITC-avidina, y la
sonda de repetición del satélite \alpha específica del cromosoma
X, marcada con digoxigenina, se detectó usando un conjugado
anti-digoxigenina-rodamina.
La identificación cromosómica se realizó mediante
hibridación simultánea con una sonda de repetición del satélite
\alpha específico del cromosoma X (Oncor), o mediante formación de
bandas R usando bromodesoxiuridina y montando los portas en una
solución de montaje antidesteñido modificada, de
p-fenilendiamina (pH11) (Lemieux et al.,
Cytogenet. Cell Genet. 59:311-312 (1992)) que
contenía 0,01 \mug/ml de yoduro de propidio como contratinte, para
producir un patrón de bandas R. Los portas se examinaron y
fotografiaron usando un microscopio Axiophot de Zeiss y
combinaciones de filtros UV apropiadas. Las diapositivas de 35 mm se
escanearon usando un Coolscan de Nikon, se trataron usando Adobe
Photoshop 4.0 y se imprimieron usando un Fujix Pictography 3000.
La localización cromosómica del locus
MAGE-C1 humano se obtuvo inicialmente mediante mapeo
del híbrido celular somático en experimentos que no se describen
aquí, y se confirmo y refinó independientemente mediante hibridación
de fluorescencia in situ, según se describió más arriba. En
estos experimentos, se examinaron para señales específicas de
hibridación extensiones de metafases con bandas 47 R procedentes de
linfocitos normales. Se consideró que las señales eran específicas
sólo si se detectaban en cada cromátida de un único cromosoma. Se
observaron señales específicas en 15 de las 47 metafases examinadas
(32%). En cada caso, las señales de hibridación se localizaban en la
porción distal del cromosoma X. Los cromosomas patrón de bandas R
permitieron una localización más específica del locus
MAGE-C1 en Xq26-q27.
De forma interesante, se han localizado también
otros miembros de la familia MAGE tanto en los brazos largos como en
los cortos del cromosoma X. Doce genes de la familia MAGE se han
mapeado en la región distal del brazo largo del cromosoma X (De
Plaen, et al., Immunogenetics
40:360-369 (1994); Oaks et al. Cancer
Research 54:1627-1629 (1994)) y
MAGE-Xp está localizado en la región Xp21.3 del
brazo corto (Muscatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92:4987-4991 (1995)).
La búsqueda de la secuencia de la proteína
MAGE-C1 para los péptidos que se unen a la clase I
del HLA se realizó en la dirección de internet:
http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio (Parker, K. C., M. A.
Bednarek, y J. E. Coligan, "Scheme for Ranking Pontential
HLA-A2 Binding Peptides Based on Independent Binding
of Individual Peptide Side-Chains", J.
Immunol. 152:163 (1994). La Tabla 3 enumera los péptidos que se
espera que se unan a las moléculas de la clase I del HLA indicadas y
que se encuentran más de una vez en la proteína
MAGE-C1.
Se generó una genoteca de DNAc enriquecida para
secuencias presentes sólo en células de melanoma, denominadas de
prueba, eliminando secuencias que son compartidas con células
cutáneas normales, denominadas conductoras. El resultado del
enriquecimiento se denomina un producto diferenciador (DP).
De forma más precisa, se preparó RNA total
procedente de células de melanoma LB373-MEL (células
de prueba) y de una muestra de piel normal (células conductoras),
luego se purificó en columnas de oligo-dT para
obtener poli-A + RNA. Poli-A + RNA
se transcribió inversamente para producir DNAc. El DNAc resultante
se digirió con enzima de restricción DpnII, que corta el DNA en los
sitios GATC, produciendo fragmentos cortos de DNA dúplex con
colgantes 5'-GATC. Los adaptadores dúplex con un
colgante 5'-GATC (adaptador R-BgI
que está compuesto por R-BgI 12 y
R-BgI 24 anillados, SEQ ID N^{OS}: 2 y 4,
respectivamente) se ligaron al DNAc digerido. El DNAc ligado al
adaptador se amplificó a continuación mediante PCR, usando como
cebador una hebra del adaptador R-BgI,
R-BgI 24. El producto resultante se denomina una
representación de la probadora y la directora, respectivamente.
Ambas representaciones se digirieron con DpnII. La probadora
digerida se ligó a nuevas moléculas adaptadoras (el adaptador
J-BgI que está compuesto por J-BgI
12 y J-BgI 24 anilladas, SEQ ID N^{os}: 3 y 12,
respectivamente). A continuación se realizó una primera ronda de
hibridación sustractiva, mezclando el DNAc conductor digerido con
este DNAc probador con J-BgI adaptado y digerido, en
proporciones 100/1, desnaturalizando la muestra e incubando a 67º
durante 20 horas, para volver a hibridar la muestra desnaturalizada.
Después de la hibridación, la muestra se amplificó por PCR, usando
una hebra del adaptador J-BgI como cebador,
J-BgI 24. Los híbridos constituidos por dos hebras
de DNA que se originaban de la población conductora no se podían
amplificar, porque no estaban ligados al adaptador
J-BgI, mientras que los híbridos constituidos por
una hebra de DNA de cada origen (de prueba y conductora) se
amplificaban exponencialmente. Tras 10 ciclos de amplificación, la
muestra se trataba con nucleasa de judía Mung (que digiere
específicamente el DNA monocatenario producido por la amplificación
lineal), luego se sometió a 18 ciclos de PCR adicionales.
El producto resultante se denominó producto
diferenciador 1 (DP1). Los adaptadores J-BgI en DP1
se cambiaron por adaptadores
N-BgI-12/24
(N-BgI-12:5'GATCTTCCCTCG-3';
N-BgI-24:5'-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-3'),
es decir, oligonucleótidos N-BgI-12
y N-BgI-24 anillados, SEQ ID Nº: 4 y
SEQ ID Nº: 13, y el proceso de hibridación sustractiva y
amplificación selectiva se repitió para generar los segundos
productos diferenciales (excepto porque el anillado y extensión en
las reacciones de PCR se realizó a 72ºC). La proporción de probadora
a conductora fue 1:800, para generar DP2.LB373 (-piel).
DP2.LB373[-piel] se clonó en el vector fagémido
pTZ18R, para generar una genoteca de DNAc enriquecida en secuencias
expresadas en melanoma pero silentes en piel normal.
Se secuenciaron 49 clones individuales de la
genoteca enriquecida en melanoma, que corresponden a 27 genes
diferentes. La búsqueda para homologías con secuencias descritas en
las bases de datos mostraron que 16 de estos 27 genes corresponden a
genes identificados previamente. De forma notable, dos de ellos
correspondían al gen MAGE-A3 y al gen
MAGE-A10, respectivamente, que se sabe que se
expresan exclusivamente en tumores y testículos. Once secuencias
eran desconocidas, y se usó RT-PCR para determinar
si se expresaban en un panel de diferentes tejidos normales. Sólo
dos de estos once genes nuevos no se expresaban en tejidos normales,
excepto testículos. El primero se denominó LAGE-1 y
se describe en la solicitud de patente de EE.UU de Nº de serie
08/791.495. El segundo comparte homologías significativas con
miembros de la familia de genes MAGE, y más particularmente con el
gen MAGE-C1. Por tanto se denominó
MAGE-C2.
El clon MAGE-C2 aislado de la
genoteca enriquecida en melanoma es un fragmento de restricción
DpnII del mensajero de MAGE-C2 completo. Para aislar
un DNAc de MAGE-C2, se escrutó una genoteca de DNAc
con una sonda de MAGE-C2.
La genoteca de DNAc se construyó con RNA de
LB373-MEL en pcDNA1/Amp, según se describió
anteriormente. Aproximadamente, 84.000 bacterias se sembraron en
placa sobre membranas de nylon. Se realizaron duplicados y se
trataron para desnaturalizar y fijar el DNA bacteriano. Se generó
una sonda específica de MAGE-C2, realizando PCR
sobre el clon de MAGE-C2 parcial con cebadores
específicos SL102 y SL103 (SL102:
5'-AGGCGCGAATCAAGTTAG-3', SEQ ID Nº:
15; SL103:
5'-CTCCTCTGCTGTGCTGAC-3', SEQ ID Nº:
16. El producto de PCR de MAGE-C2 de 206 pb se
purificó sobre una columna de sefarosa CL-6B, luego
se marcó usando cebadores aleatorios, DNA-polimerasa
de Klenow y \alpha-^{32}P-dCTP.
Los duplicados tratados se hibridaron con la sonda específica de
MAGE-C2 (500.000 cpm/ml; incubación durante la noche
a 65ºC), luego se lavaron en condiciones estrictas (último lavado
realizado a 65ºC en SSC 0,2x, SDS al 0,1%), y se autorradiografiaron
durante 70 horas. Resultaron ocho manchas positivas. Se realizó un
segundo escrutinio, y se obtuvo un clon bacteriano que contenía un
gran marco de lectura abierto para MAGE-C2.
El DNAc de MAGE-C2 tiene 1983 pb
de largo (SEQ ID Nº: 18). El marco de lectura abierto empieza con un
ATG en posición 330, y finaliza con un codón de parada en posición
1449, codificando para una proteína putativa de 373 aminoácidos (SEQ
ID Nº: 19).
Se seleccionaron cebadores de PCR complementarios
de varias regiones del DNAc de MAGE-C2 y los
productos de PCR obtenidos tras la amplificación del DNAc y del DNA
genómico se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. La
amplificación por PCR del DNA genómico con pares de cebadores A y B
(Figura 4), originó productos de mayor tamaño que aquellos obtenidos
por amplificación de DNAc, revelando la existencia de al menos dos
intrones en el gen MAGE-C2. Las secuencias de estos
dos intrones se determinaron secuenciando los productos de PCR. La
amplificación PCR con los pares de cebadores C y D (Figura 4),
originó productos de idénticos tamaños cuando se usaba DNAc o DNA
genómico como molde, sugiriendo que no existía ningún intrón
adicional en el gen MAGE-C2. La secuencia del gen
MAGE-C2, según se dedujo de la secuencia del clon de
DNAc y de las secuencias de los intrones, se muestra en SEQ ID Nº:
20.
En la Figura 4 se muestran representaciones
esquemáticas de los genes MAGE-C2,
MAGE-C1 y MAGE-A1. El gen
MAGE-C2 entero es homólogo a las secuencias del gen
MAGE-C1. A pesar de ello MAGE-C2 no
contiene la gran región repetitiva que se encuentra en la región
codificante del gen MAGE-C1. La estructura
exón-intrón del gen MAGE-C2 es
intermedia entre la del gen MAGE-C1 y la de los
genes MAGE-A, representada en la Figura 4 por en gen
MAGE-A1. Como los genes MAGE-A,
MAGE-C2 comprende tres exones, pero los exones 1 y 2
de MAGE-C2 son homólogos a los exones 1 y 2 de
MAGE-C1. El tercer exón de MAGE-C2
tiene una estructura comparable a la del tercer exón de los genes
MAGE-A: contiene el marco de lectura abierta entero,
y comienza en una localización similar. La secuencia codificadora
del gen MAGE-C2 es más larga que la del gen
MAGE-A1, y esto se debe a la inserción, cerca del
codón de inicio, de una secuencia de 108 pb que no se encuentra en
el gen MAGE-A1.
El patrón de expresión del gen
MAGE-C2 se determinó mediante análisis
RT-PCR de tejido normal y muestras tumorales. El
cebador del mismo sentido SL102 (SEQ ID Nº: 15) y el cebador
antisentido SL103 (SEQ ID Nº: 16) seleccionados se localizan en
diferentes exones (Figura 4: par de cebadores A).
MAGE-C2 no se expresa en un panel analizado de
tejidos normales (Tabla 4), con la excepción de los testículos.
Entre las muestras tumorales, MAGE-C2 se expresa
frecuentemente en melanoma y carcinoma de células transicionales de
vejiga. También se expresa en una fracción significativa de
carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de mama, carcinoma pulmonar
de células distintas de las pequeñas, y sarcoma (Tabla 5). La
expresión de MAGE-C2 está correlacionada con la de
otros genes MAGE. Se analizaron 326 muestras tumorales. Entre las 63
muestras que expresan el gen MAGE-C2, 62 expresan
también al menos un gen MAGE-A. La única muestra
tumoral que es positiva para la expresión MAGE-C2,
pero negativa para todos los demás genes MAGE es una muestra de
tumor de mama. Para pacientes de cáncer que tienen tumores como este
último, la inmunoterapia específica con antígenos MAGE se basará
solamente en el uso de antígenos derivados de
MAGE-C2.
La localización cromosómica del gen
MAGE-C2 se determinó mediante análisis PCR del Gene
Bridge 4 Radiation Hybrid Panel (Walter et al., Nature
Genet., 7:22-28 (1994)). Cada DNA del panel se
sometió a PCR con los cebadores SL102 y SL103 SEQ ID N^{os}:15 y
16. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de
agarosa, se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa, y se
hibridaron con cebador marcado radiactivamente SL118
(5'-AGCTGCCTCTGGTTGGCAGA-3' SEQ ID
Nº: 17). El cebador SL118 es complementario a una secuencia del
primer intrón del gen MAGE-C2. Los resultados de
PCR se sometieron a análisis en la dirección de internet:
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl.
El análisis reveló que MAGE-C2 está localizado
sobre el cromosoma X, entre los marcadores DXS1227 y DSX7087. El gen
MAGE-C1 está localizado entre esos mismos
marcadores, que corresponden a las bandas citogenéticas
Xq26-Xq27.
La proteína MAGE-C2 comparte
similitudes con otras proteínas MAGE. Alineamientos múltiples de
todas las proteínas MAGE conocidas muestran que la máxima homología
se observa en su extremo COOH. Los resultados de comparaciones de
apareamiento entre los dos tercios C-terminales de
MAGE-C2 y los segmentos correspondientes de otras
proteínas MAGE, se muestran en la Tabla 6. Los segmentos
C-terminales de las proteínas MAGE-A
comparten 52 a 94% de identidad de aminoácidos, y son más próximas
en identidad entre sí que con las proteínas MAGE-B,
con las que comparten de 39 a 55% de identidad de aminoácidos. De
forma similar, las proteínas MAGE-B, con 52 a 67% de
identidad de aminoácidos, están más próximas entre sí que con las
proteínas MAGE-A. Basándose en los criterios de
similitud de secuencias, MAGE-C1 y
MAGE-C2 pertenecen a una tercera subfamilia:
comparten 68% de identidad de aminoácidos entre sí, mientras que
sólo comparten 43 a 55% de identidad de aminoácidos con las
proteínas MAGE-A y 39 a 46% con las proteínas
MAGE-B.
La búsqueda de la secuencia de la proteína
MAGE-C2 para péptidos que se unen a la clase I del
HLA se realizó en la dirección de internet:
http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio. La Tabla 7 enumera los
péptidos de MAGE-C2 que se espera que se unan a las
moléculas de clase I del HLA. Estas moléculas de clase I del HLA se
mostró previamente en algunos tumores que presentaban péptidos
codificados por un gen de la familia MAGE.
Una transferencia de Southern preparada con DNAs
genómicos de líneas celulares de melanoma LB373-MEL,
SK29-MEL, y LB33.A-1 se hibridó con
una sonda amplificada por PCR de 1,9 kb, derivada de SEQ ID Nº: 18.
La preparación de la transferencia se realizó según se describió más
arriba (Ejemplo 7). La hibridación con la sonda
MAGE-C2 marcada radioactivamente con
[\alpha-^{32}P]dCTP, se realizó en SSC
5x, medio de Denhardt 5x, SDS al 0,1% y 100 \mug/ml de DNA de
esperma de salmón desnaturalizado durante 18 horas a 68ºC. Las
membranas se lavaron consecutivamente en SSC 2x, SDS al 0,1% durante
20 min. a temperatura ambiente, y en SSC 2x, SDS al 0,1% durante 20
min. a 68ºC. La autorradiografía se realizó durante 10 días.
Se encontraron varias bandas de hibridación en
los DNAs genómicos obtenidos de las tres líneas de melanoma. Los
DNAs genómicos se digirieron con las enzimas de restricción BamHI o
EcoRI. En los DNAs genómicos digeridos con EcoRI, se pueden
distinguir al menos 5 bandas que hibridan con la sonda de
MAGE-C2. Dos de éstas se encontró que representaban
los fragmentos de los genes MAGE-C1 y
MAGE-C2, respectivamente. Estos resultados sugieren
que MAGE-C1 y MAGE-C2, aquí
descritas, son miembros de una familia MAGE-C
mayor.
| Tipo de tejido | Número de muestras que expresan MAGE-C1/número |
| de muestras analizadas | |
| Vejiga | 0/2 |
| Cerebro | 0/4 |
| Mama | 0/3 |
| Colon | 0/2 |
| Epidídimo | 0/1 |
| Riñón | 0/1 |
| Hígado | 0/4 |
| Pulmón | 0/6 |
| Linfocitos (PBL) | 0/4 |
| Ovario | 0/1 |
| Placenta | 0/1 |
| Próstata | 0/2 |
| Testículos | 3/3 |
| Útero | 0/4 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Tipo de tumor | Número de muestras que expresan | Porcentaje que expresa |
| MAGE-C1/número de muestras ensayadas | MAGE-C1 | |
| Melanoma cutáneo | 48/105 | 46% |
| \hskip0,5cm Primario | 17/46 | 37% |
| \hskip0,5cm Metastásico | 31/59 | 52% |
| \hskip0,5cm Melanoma de mucosas | 5/8 | |
| \hskip0,5cm Melanoma uveal | 0/9 | |
| Tumores testiculares | ||
| \hskip0,5cm Seminoma | 9/9 | 100% |
| \hskip0,5cm Distinto de seminoma | 0/3 | |
| Neuroblastoma | 1/3 | |
| Carcinoma de células | 9/51 | 18% |
| transicionales de la vejiga | 24% | |
| \hskip0,5cm Invasivo | 9/37 | |
| \hskip0,5cm Superficial | 0/14 | |
| Carcinoma de mama | 6/36 | 16% |
| Carcinoma de pulmón | ||
| \hskip0,5cm NSCLC | 15/95 | 16% |
| \hskip0,5cm SCLC | 0/3 | |
| Sarcoma | 2/17 | 12% |
| Tumores cerebrales | 1/9 |
| Tipo de tumor | Número de muestras que expresan | Porcentaje que expresa |
| MAGE-C1/número de muestras ensayadas | MAGE-C1 | |
| Adenocarcinoma de próstata | 2/18 | 11% |
| Carcinoma de células escamosas | 4/42 | 10% |
| de cabeza y cuello | ||
| \hskip0,5cm Carcinoma colorrectal | 0/30 | |
| \hskip0,5cm Leucemia | 0/37 | |
| \hskip0,5cm Mieloma | 0/1 | |
| \hskip0,5cm Tumores renales | 0/8 | |
| \hskip0,5cm Tumores pancreáticos | 0/1 | |
| \hskip0,5cm Tumores ováricos | 0/3 | |
| \hskip0,5cm Tumores uterinos | 0/9 | |
| \hskip0,5cm Carcinoma esofágico | 0/6 | |
| \hskip0,5cm Mesotelioma | 0/3 |
| Molécula de clase I del HLA | Péptido MAGE-C1 | Posición de inicio en la proteína MAGE-C1 | Nº de repeticiones |
| B 60 | FEGFPQSPL | 190, 260, 365, 400, 435, 470, 506 | 7 |
| B 62 | LQIPVSRSF | 198, 268 | 2 |
| B 2705 | LQIPMTSSF | 338, 408 | 2 |
| ERTQSTFEGF | 254, 289, 324, 464 | 4 | |
| B 4403 | GEDSLSPHY | 556, 571, 586 | 3 |
| B 5101 O B 5102 | FPSSTSSSL | 817, 834 | 2 |
| SPPQGEDSL | 551, 567 | 2 | |
| EGFPQSPLQI | 191, 261, 366, 401, 436, 471, 507 | 7 | |
| FPQSPLQIPV | 193, 263, 438, 473 | 4 | |
| EGFAQSPLQI | 226, 296 | 2 | |
| FAQSPLQIPV | 228, 298 | 2 | |
| B 5103 | FAQSPLQIPV | 228, 298 | 2 |
| B 5801 | RTQSTFEGF | 255, 290, 325, 265 | 4 |
| Cw 0401 | FPSSTSSSL | 817, 834 | 2 |
| TFEGFPQSPL | 259, 364, 399, 469, 505 | 5 | |
| SFSSTLLSIF | 205, 275, 345 | 3 | |
| SFPSSTSSSL | 833, 816 | 2 |
| Tipo de tejido | Expresión de MAGE-C2 |
| Vejiga | - |
| Cerebro | - |
| Mama | - |
| Colon | - |
| Corazón | - |
| Riñón | - |
| Hígado | - |
| Pulmón | - |
| Linfocitos (PBL) | - |
| Ovario | - |
| Placenta | - |
| Piel | - |
| Suprarrenales | - |
| Testículos | + |
| Útero | - |
\vskip1.000000\baselineskip
| Tipo de tumor | Número de muestras | |
| positivas/número | ||
| analizado | ||
| Melanoma cutáneo | 30/70 | (43%) |
| \hskip0,5cm Primario | 10/30 | (33%) |
| \hskip0,5cm Metastásico | 20/40 | (50%) |
| \hskip0,5cm Melanoma uveal | 0/5 | |
| Carcinoma de células transicionales | 9/30 | |
| de la vejiga | ||
| \hskip0,5cm Invasivo | 6/15 | |
| \hskip0,5cm Superficial | 3/15 | |
| Carcinoma de células escamosas de | 4/20 | |
| cabeza y cuello | ||
| Carcinoma de mama | 3/20 | |
| Carcinoma de pulmón (NSCLC) | 4/35 | |
| Sarcoma | 2/15 | |
| Carcinoma esofágico | 2/15 | |
| Adenocarcinoma de próstata | 1/10 | |
| Mieloma | 1/5 | |
| \hskip0,5cm Tumores cerebrales | 0/9 | |
| \hskip0,5cm Carcinoma colorrectal | 0/20 | |
| \hskip0,5cm Leucemia | 0/25 | |
| \hskip0,5cm Neuroblastoma | 0/2 | |
| \hskip0,5cm Mesotelioma | 0/4 | |
| \hskip0,5cm Tumores renales | 0/24 | |
| \hskip0,5cm Tumores tiroideos | 0/5 | |
| \hskip0,5cm Tumores uterinos | 0/5 |
| A1 | A2 | A3 | A4 | A6 | A8 | A9 | A10 | A11 | A12 | B1 | B2 | B3 | B4 | C1 | ||
| A1 | ||||||||||||||||
| A2 | 68 | |||||||||||||||
| A3 | 68 | 83 | ||||||||||||||
| A4 | 77 | 66 | 66 | |||||||||||||
| A6 | 69 | 82 | 94 | 66 | ||||||||||||
| A8 | 73 | 64 | 83 | 77 | 63 | |||||||||||
| A9 | 65 | 58 | 60 | 68 | 57 | 72 | ||||||||||
| A10 | 63 | 56 | 52 | 60 | 55 | 64 | 59 | |||||||||
| A11 | 62 | 56 | 56 | 62 | 56 | 62 | 63 | 62 | ||||||||
| A12 | 67 | 86 | 83 | 65 | 81 | 65 | 58 | 54 | 56 | |||||||
| B1 | 45 | 40 | 39 | 46 | 39 | 43 | 43 | 47 | 46 | 41 | ||||||
| B2 | 43 | 40 | 40 | 43 | 39 | 42 | 43 | 45 | 42 | 40 | 62 | |||||
| B3 | 50 | 40 | 40 | 47 | 40 | 46 | 46 | 48 | 48 | 41 | 52 | 55 | ||||
| B4 | 50 | 44 | 43 | 47 | 44 | 48 | 49 | 55 | 50 | 45 | 67 | 64 | 59 | |||
| C1 | 49 | 44 | 44 | 49 | 46 | 50 | 50 | 53 | 49 | 44 | 39 | 44 | 40 | 43 | ||
| C2 | 50 | 46 | 46 | 49 | 46 | 49 | 50 | 55 | 50 | 43 | 43 | 46 | 44 | 46 | 68 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Molécula de clase I del HLA | Péptido MAGE-C2 | Posición de inicio en la proteína |
| MAGE-C2 (SEQ ID Nº: 19) | ||
| A1 | LVEFLLLKY | 148 |
| YGEPRELLTK | 267 | |
| A0201 | VIWEVLNAV | 248 |
| KVLEFLAKL | 313 | |
| SLLIIILSV | 228 | |
| FLAKLNNTV | 317 | |
| KVWVQGHYL | 276 | |
| KVAELVEFL | 144 | |
| LLFGLALIEV | 191 | |
| GLPDSESSFT | 129 | |
| KVAELVEFLL | 144 | |
| GVYAGREHFV | 257 | |
| B4403 | AEMLMIVIKY | 165 |
| WEVLNAVGVY | 250 | |
| REVPHSSPPY | 287 | |
| DEKVAELVEF | 142 |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: LUCAS, Sophie; DE SMET, Charles; BOON-FALLEUR, Thierry
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO AISLADA QUE CODIFICA EL PRECURSOR DE ANTÍGENOS DE RECHAZO DE TUMORES MAGE-C1 Y MAGE C-2 Y SUS USOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 20
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Felfe & Lynch
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 805 Third Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO: 10022
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- SOPORTE LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows 2000 professional
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: MS Word
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/08493
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 24 de abril de 1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: 435
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/845.528
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 25 de abril de 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Mary Anne Schofield
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.669
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: LUD 5455.2 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212) 318-3100
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212) 752-5958
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4031 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: dúplex
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCTGCGGT GA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCTGTTCA TG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCTTCCCT CG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNACCTGGAAG AATTCGCGGC CGCAGGAATT TTTTTTTTTT TTTTTT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Adaptador BstX1 de la hebra superior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTTCCAGCA CA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1142
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1691 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4225 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: dúplex
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 310
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCGACGTCG ACTATCCATG AACA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: adaptador BstX1 de la hebra inferior
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGAAAG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGCGCGAAT CAAGTTAG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCTCTGCT GTGCTGAC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTGCCTCT GGTTGGCAGA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1983 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: dúplex
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 373
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2940 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: dúplex
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20:
Claims (23)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un precursor de antígeno de rechazo de tumores que tiene
una secuencia de aminoácidos de un precursor de antígeno de rechazo
de tumores, codificada por una secuencia nucleotídica seleccionada
del grupo formado por SEQ ID Nº: 9 y SEQ ID Nº: 18.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada que
tiene una secuencia nucleotídica que codifica un precursor de un
antígeno de rechazo de tumores, comprendiendo dicha molécula de
ácido nucleico aislada una secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID
Nº: 9 o SEQ ID Nº: 18.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico es una
molécula de DNAc o DNAg.
4. Una molécula de ácido nucleico aislada, que
codifica un precursor de antígeno de rechazo de tumores, cuya
secuencia complementaria hibrida bajo condiciones estrictas con una
molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica
formada por los nucleótidos 1-2815 de SEQ ID Nº:
9.
5. Una molécula de RNAm aislada, que es
complementaria a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación
1.
6. Un vector de expresión que comprende una
molécula de ácido nucleico aislada, según la reivindicación 1 o la
reivindicación 3, ligada operativamente a un promotor.
7. El vector de expresión según la reivindicación
6, en el que el promotor es un promotor inducible.
8. Una línea o estirpe celular transfectada o
transformada con el vector de expresión de la reivindicación 6.
9. La línea celular según la reivindicación 8, en
la que dicha línea celular es una línea celular eucariota.
10. La línea celular según la reivindicación 9,
en la que dicha línea es una línea celular de roedor o simio,
preferiblemente una línea celular COS o CHO.
11. Un método para determinar la presencia de
células T citolíticas específicas para complejos de una molécula de
HLA y un péptido derivado de la proteína codificada por la molécula
de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en una muestra que
contiene CTL, que comprende poner en contacto dicha muestra con
células que presentan dichos complejos en su superficie, y
determinar (i) proliferación de células T citolíticas, o (ii) lisis
de células presentadoras de dichos complejos, como determinación de
dichas células T citolíticas en dicha muestra.
12. El método según la reivindicación 11, que
comprende determinar la proliferación de células T citolíticas
midiendo la liberación de factor de necrosis tumoral.
13. El método según la reivindicación 11, que
comprende determinar la lisis de dichas células determinando la
liberación de una sustancia marcada radioactivamente,
preferiblemente ^{51}Cr, desde dichas células.
14. El método según la reivindicación 11, en el
que dichas células que presentan dichos complejos se han
transfectado o transformado con al menos uno de (i) una molécula de
ácido nucleico que codifica para una molécula de HLA y (ii) la
molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1.
15. El método según la reivindicación 11, en el
que dichas células se han transfectado o transformado con (i) una
molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula de HLA, y
(ii) el ácido nucleico de la reivindicación 1.
16. Un precursor aislado de antígeno de rechazo
de tumores codificado por la molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1 o de la reivindicación 3.
17. Kit útil en un análisis basado en la reacción
en cadena de la polimerasa, que comprende un oligonucleótido que
tiene una secuencia de los nucleótidos 18-34 de SEQ
ID Nº: 1 y un oligonucleótido que tiene una secuencia nucleotídica,
que es complementaria a los nucleótidos 200-217 de
SEQ ID Nº: 1.
18. Método para determinar la expresión de un gen
MAGE-C1 en una muestra, que comprende poner en
contacto dicha muestra con un oligonucleótido que tiene una
secuencia formada por (i) nucleótidos 18-34 de SEQ
ID Nº: 1 y (ii) un oligonucleótido que tiene una secuencia que es
complementaria a los nucleótidos 200-217 de SEQ ID
Nº: 1, en condiciones que favorezcan la hibridación de las
secuencias (i) o (ii) a una secuencia codificadora de
MAGE-C1; llevar a cabo la reacción en cadena de la
polimerasa; y determinar el producto de expresión para determinar la
presencia de una secuencia codificadora de MAGE-C1
en dicha muestra.
19. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un precursor de antígeno de rechazo de tumores, cuya
secuencia complementaria hibrida en condiciones estrictas con una
molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia nucleótida
descrita por SEQ ID Nº: 18, con la condición de que la secuencia
complementaria no hibrida con la SEQ ID Nº: 8, en condiciones
estrictas.
20. Método para determinar la expresión de un gen
MAGE-C2 en una muestra, que comprende poner en
contacto dicha muestra con (i) un oligonucleótido que tiene una
secuencia descrita por SEQ ID Nº: 15 y (ii) un oligonucleótido que
tiene una secuencia descrita por SEQ ID Nº: 16, en condiciones que
favorezcan la hibridación de las secuencias (i) o (ii) con una
secuencia codificadora de MAGE-C2; llevar a cabo la
reacción en cadena de la polimerasa; y determinar el producto de
expresión para establecer la presencia de una secuencia codificadora
de MAGE-C2 en dicha muestra.
21. Una línea o estirpe celular transfectada o
transformada con la molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1.
22. Un polítope que comprende una pluralidad de
antígenos de rechazo de tumores derivados de precursores de
antígenos de rechazo de tumores MAGE-C1 o
MAGE-C2, según la reivindicación 16.
23. Un polítope que comprende al menos un
antígeno de rechazo de tumores derivado de un precursor de antígeno
de rechazo de tumores MAGE-C1 o
MAGE-C2, según la reivindicación 16, y al menos otro
antígeno de rechazo de tumores.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/845,528 US6027924A (en) | 1997-04-25 | 1997-04-25 | Isolated nucleic acid molecule coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-C1 and uses thereof |
| US845528 | 1997-04-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2251080T3 true ES2251080T3 (es) | 2006-04-16 |
Family
ID=25295436
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98918810T Expired - Lifetime ES2251080T3 (es) | 1997-04-25 | 1998-04-24 | Molecula de acido nucleico aislada que codifica los precursores de antigenos de rechazo tumorales mage-c1 y mage-c2 y sus usos. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6027924A (es) |
| EP (1) | EP0979235B1 (es) |
| JP (1) | JP3915076B2 (es) |
| AT (1) | ATE313551T1 (es) |
| AU (1) | AU739680B2 (es) |
| DE (1) | DE69832875T2 (es) |
| DK (1) | DK0979235T3 (es) |
| ES (1) | ES2251080T3 (es) |
| PT (1) | PT979235E (es) |
| WO (1) | WO1998049184A1 (es) |
| ZA (1) | ZA983488B (es) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE505542T1 (de) | 1998-02-05 | 2011-04-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Tumorassoziierte antigenderivate der mage-familie,zur herstellung von fusionsproteinen mit t-helper epitope und zusammensetzungen zur impfung |
| US6297364B1 (en) * | 1998-04-17 | 2001-10-02 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecule encoding cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof |
| EP2292638A3 (en) | 2002-09-27 | 2011-03-23 | Ludwig Institute For Cancer Research | MAGE-C2 antigenic peptides and uses thereof |
| US6903287B2 (en) * | 2003-04-14 | 2005-06-07 | Agilent Technologies, Inc. | Liquid metal optical relay |
| DE102005041616B4 (de) * | 2005-09-01 | 2011-03-17 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Melanom-assoziierte MHC Klasse I assoziierte Oligopeptide und für diese kodierende Polynukleotide und deren Verwendungen |
| GB0721686D0 (en) * | 2007-11-05 | 2007-12-12 | Medinnova As | Polypeptides |
| GB201520550D0 (en) | 2015-11-23 | 2016-01-06 | Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd | Peptides |
| GB201520539D0 (en) * | 2015-11-23 | 2016-01-06 | Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd | Peptides |
| GB201520568D0 (en) | 2015-11-23 | 2016-01-06 | Immunocore Ltd | Peptides |
| GB201520541D0 (en) * | 2015-11-23 | 2016-01-06 | Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd | Peptides |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4889806A (en) * | 1987-04-15 | 1989-12-26 | Washington University | Large DNA cloning system based on yeast artificial chromosomes |
| US5342774A (en) | 1991-05-23 | 1994-08-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1 |
| US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
| NZ255683A (en) * | 1992-08-07 | 1996-08-27 | Cytel Corp | Immunogenic composition comprising a 9-10 aa residue peptide having a hla-a3.2, hla-a1, hla-a11 or hla-a24.1 binding motif |
| US5405940A (en) | 1992-08-31 | 1995-04-11 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nonapeptides derived from MAGE genes and uses thereof |
| US5462871A (en) | 1992-08-31 | 1995-10-31 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules which encode MAGE derived nonapeptides |
| US5487974A (en) | 1992-12-22 | 1996-01-30 | Ludwig Institute For Cancer-Research | Method for detecting complexes containing human leukocyte antigen A2 (HLA-A2) molecules and a tyrosinase drived peptide on abnormal cells |
| WO1995004542A1 (en) * | 1993-08-06 | 1995-02-16 | Cytel Corporation | Cloning and characterization of the complete mage-1 gene |
| US5512444A (en) * | 1994-03-01 | 1996-04-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | Method for determining bladder tumors by assaying for MAGE-1,2,3 or 4 |
| NZ282536A (en) * | 1994-03-01 | 1998-07-28 | Ludwig Inst Cancer Res | Nucleic acid molecule useful as a primer in determining expression of a mage tumour rejections antigen precursor |
| US5554506A (en) | 1994-03-24 | 1996-09-10 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated, MAGE-3 derived peptides which complex with HLA-A2 molecules and uses thereof |
| US5554724A (en) | 1994-03-24 | 1996-09-10 | University Of Leiden | Isolated tumor rejection antigen precursor MAGE-2 derived peptides, and uses thereof |
-
1997
- 1997-04-25 US US08/845,528 patent/US6027924A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-12-17 US US08/993,118 patent/US5997872A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-04-24 JP JP54726698A patent/JP3915076B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-24 ZA ZA983488A patent/ZA983488B/xx unknown
- 1998-04-24 DK DK98918810T patent/DK0979235T3/da active
- 1998-04-24 AT AT98918810T patent/ATE313551T1/de active
- 1998-04-24 WO PCT/US1998/008493 patent/WO1998049184A1/en active IP Right Grant
- 1998-04-24 EP EP98918810A patent/EP0979235B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-24 PT PT98918810T patent/PT979235E/pt unknown
- 1998-04-24 ES ES98918810T patent/ES2251080T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-24 AU AU71665/98A patent/AU739680B2/en not_active Expired
- 1998-04-24 US US09/066,281 patent/US6475783B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-24 DE DE69832875T patent/DE69832875T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-06-04 US US10/160,237 patent/US7022819B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0979235A4 (en) | 2003-01-15 |
| JP3915076B2 (ja) | 2007-05-16 |
| JP2002503096A (ja) | 2002-01-29 |
| ZA983488B (en) | 1999-01-19 |
| US6475783B1 (en) | 2002-11-05 |
| ATE313551T1 (de) | 2006-01-15 |
| AU739680B2 (en) | 2001-10-18 |
| DK0979235T3 (da) | 2006-04-10 |
| DE69832875T2 (de) | 2006-08-24 |
| EP0979235A1 (en) | 2000-02-16 |
| AU7166598A (en) | 1998-11-24 |
| DE69832875D1 (de) | 2006-01-26 |
| US5997872A (en) | 1999-12-07 |
| PT979235E (pt) | 2006-05-31 |
| EP0979235B1 (en) | 2005-12-21 |
| US20030170256A1 (en) | 2003-09-11 |
| WO1998049184A1 (en) | 1998-11-05 |
| US7022819B2 (en) | 2006-04-04 |
| US6027924A (en) | 2000-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3477523B2 (ja) | Ｍｈｃ分子ｈｌａ−ｃ−クローン１０と複合体を形成する分離されたペプチドとその利用方法 | |
| US5695994A (en) | Isolated cytolytic T cells specific for complexes of MAGE related peptides and HLA molecules | |
| ES2210252T3 (es) | Acido nucleico que codifica un precursor de antigeno de rechazo de tumores. | |
| JP3096739B2 (ja) | Ｈｌａ分子によって提示される単離ノナペプチドとその使用 | |
| US5462871A (en) | Isolated nucleic acid molecules which encode MAGE derived nonapeptides | |
| JP3536179B2 (ja) | Ｈｌａ−ａ２分子と複合する腫瘍拒絶抗原前駆体由来の単離ペプチド | |
| US5591430A (en) | Isolated, MAGE-3 derived peptides which complex with HLA-A2 molecules and uses thereof | |
| JPH10506785A (ja) | 腫瘍拒絶抗原前駆体ｄａｇｅをコードする単離核酸分子とその利用方法 | |
| ES2251080T3 (es) | Molecula de acido nucleico aislada que codifica los precursores de antigenos de rechazo tumorales mage-c1 y mage-c2 y sus usos. | |
| JPH10503928A (ja) | Ｈｌａ−ａ２によって提示される少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子 | |
| KR20000016382A (ko) | Mage－b계통군의 구성원인 분리된 핵산분자 그리고 그것의사용 | |
| ES2310418T3 (es) | Acidos nucleicos lage-1 asociados a tumores. | |
| US6429287B1 (en) | Isolated molecules which complex with HLA-Cw*16 molecules, and uses thereof | |
| ES2197196T3 (es) | Metodos para identificar individuos que padecen una anormalidad celular. | |
| US20020176865A1 (en) | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursors of members of the MAGE-C and MAGE-B families and uses thereof | |
| US6680191B1 (en) | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursors of members of the MAGE-C and MAGE-B FAMILIES and uses thereof | |
| KR20010041642A (ko) | Ｔａｇｅ 분자를 코드화하는 분리된 핵산 분자 및 그것의사용 |