ES2250959T3

ES2250959T3 - Determinacion en un liquido biologico de un peptido parcial de proadrenomedulina de la region media con fines diagnosticos e imnunoensayos para la realizacion de una determinacion de este tipo.

Info

Publication number: ES2250959T3
Application number: ES04700013T
Authority: ES
Inventors: Andreas Bergmann; Joachim Struck
Original assignee: BRAHMS GmbH
Current assignee: BRAHMS GmbH
Priority date: 2003-04-10
Filing date: 2004-01-29
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2024-01-29
Also published as: CN1759319A; WO2004090546A1; JP2006523302A; JP5021791B2; DE10316583A1; US9885709B2; CN1759319B; DE502004000166D1; ATE312342T1; US20070212742A1; US20180143190A1; EP1488209A1; US9541549B2; HK1089232A1; US20140322822A1; MXPA05010827A; JP4602321B2; EP1488209B1; JP2010210644A

Abstract

Procedimiento in vitro para determinar la inmunorreactividad de la adrenomedulina en líquidos biológicos para fines diagnósticos, caracterizado porque se mide el péptido parcial de la región mid (mid- proAM; SEQ ID NO:3) de la proadrenomedulina, que comprende los aminoácidos (45-92) de la preproadrenomedulina completa (pre-proAM; SEQ ID NO:1).

Description

Determinación en un líquido biológico de un péptido parcial de proadrenomedulina de la región media con fines diagnósticos e inmunoensayos para la realización de una determinación de este tipo.

La invención se refiere a un procedimiento para determinar un péptido parcial de la región mid de la proadrenomedulina (mid-proAM), en especial para determinar el péptido parcial proAM (45-92) en líquidos biológicos con fines de diagnóstico médico y en concreto en el diagnóstico de la septicemia, pero también, por ejemplo, para el diagnóstico del cáncer o el diagnóstico cardiaco o en general dentro del marco de los estados de enfermedad en los que una determinación del péptido adrenomedulina (AM) proporciona resultados relevantes desde el punto de vista diagnóstico. Las determinaciones según la invención se realizan en especial mediante inmunoensayo de un tipo en el que se trabaja con un anticuerpo marcado (ensayo sandwich; ensayo competitivo según el principio de SPALT o de SPART).

En esta memoria el concepto de "diagnóstico" se utiliza fundamentalmente como definición simplificada, que puede incluir también pronóstico/diagnóstico precoz y control de seguimiento concomitante al tratamiento.

El péptido adrenomedulina (AM o ADM) lo describieron por primera vez en 1993 Kitamura et al. (véase 18; los datos numéricos se refieren a la lista bibliográfica adjunta) como un nuevo péptido hipotensor formado por 52 aminoácidos, que se aisló a partir de un fenocromocitoma humano. El mismo año se describió un ADNc codificador para un péptido precursor de 185 aminoácidos y la secuencia completa de aminoácidos de este péptido precursor (19; SEQ ID BO:1). El péptido precursor, que comprende entre otras cosas una secuencia señal de 21 aminoácidos en el extremo N, se designa como "preproadrenomedulina" (pre-proAM). En la presente memoria, todas las posiciones indicadas de los aminoácidos se refieren normalmente a la pre-proAM, que comprende 185 aminoácidos, que presenta la frecuencia SEQ ID NO:1, salvo que del contexto concreto se infiera lo contrario.

El péptido adrenomedulina (AM) es un péptido que comprende 52 aminoácidos (SEQ ID NO:2), que comprende los aminoácidos 95 a 146 del pre-proAM, a partir del cual se forma mediante disociación proteolítica. De los fragmentos de péptido formados en la disociación del pre-proAM hasta la fecha sólo se han caracterizado esencialmente unos pocos fragmentos, en concreto el péptido fisiológicamente activo adrenomedulina (AM) y "PAMP", un péptido de 20 aminoácidos (22-41), que en el pre-proAM siguen a los 21 aminoácidos del péptido señal. Tanto del AM como del PAMP se han descubierto, y analizado con más detalle, también subfragmentos fisiológicamente activos.

El descubrimiento y la caracterización del AM en el año 1993 desencadenó una intensa actividad investigadora y una oleada de publicaciones, cuyos resultados se han recopilado recientemente en diversos artículos de revisión, remitiéndose dentro del marco de la presente memoria en especial al artículo que se encuentra en número dedicado al AM de "Peptides" (Peptides 22 (2001)), en especial (12) y (2). Otra revisión es (3). En los estudios científicos realizados hasta la fecha se encontró entre otras cosas que al AM puede considerársele un péptido regulador multifuncional. Se le libera a la circulación en una forma inactiva alargada mediante glicina (5). Existe además una proteína de enlace específica del AM (11), que probablemente modula asimismo la acción del AM.

Los efectos fisiológicos del AM, lo mismo que también los del PAMP, que estaban en un primer plano de los estudios realizados hasta la fecha, fueron efectos que influyen sobre la presión sanguínea. Así, el AM es un vasodilatador activo, pudiéndose asignar la acción hipotensora en especial a las secciones de péptido de la parte del extremo C del AM. Las secuencias de péptido del extremo N del AM muestran, por el contrario, efectos hipertensores (véase por ejemplo (6)).

Se encontró además que el otro péptido fisiológicamente activo PAMP formado a partir del pre-proAM, arriba citado, muestra igualmente una acción hipotensora, si bien parece presentar un mecanismo de acción distinto al de AM (véase junto a los artículos de revisión arriba citados (2) y (3) también (8), (9) o (14) así como el documento EP 0 622 458 A2).

Se observó además que las concentraciones del AM que pueden medirse en la circulación y en otros líquidos biológicos se sitúan en una serie de estados patológicos significativamente por encima de las concentraciones que se encuentran en personas de control sanas. Así, los niveles de AM en pacientes con insuficiencias por congestión (congestive heart failure), infarto de miocardio, enfermedades renales, enfermedades de hipertensión, diabetes mellitus, en la fase aguda de un shock y en la septicemia y el shock séptico están significativamente elevados, aunque en medida diferente (véase por ejemplo (2), capítulo 7, y la bibliografía allí citada). También las concentraciones de PAMP aumentan en algunos de los estados patológicos citados, aunque los niveles en plasma están relativamente más bajos en relación a AM ((2); página 1702).

Se sabe además que en la septicemia y en el shock séptico se observan concentraciones de AM desacostumbradamente altas (véase (2) y (4), (1), (13), (15) y (16)). Los resultados se comparan con los cambios hemodinámicos típicos que se conocen como fenómenos típicos del curso de la enfermedad en pacientes con septicemia y otros cuadros clínicos graves, como por ejemplo SIRS.

Aunque se supone que el AM y el PAMP se forman a partir del mismo péptido precursor, el pre-proAM (SEQ ID NO:1), estando presentes en cantidades equimolares como péptidos parciales las secuencias de aminoácidos correspondientes a estos péptidos, las concentraciones de AM y PAMP medibles en líquidos biológicos son al parecer distintas. Esto no es nada extraño. Así, las concentraciones medibles de diferentes productos de desecho de un mismo péptido precursor, por ejemplo, son diferentes porque son el resultado de distintas vías de desintegración que compiten, que por ejemplo en diferentes estados patológicos conducen a una fragmentación distinta de un péptido precursor y, con ello, a diferentes productos de desintegración. Determinados péptidos parciales contenidos en el péptido precursor pueden formarse o no como péptidos libres, y/o diferentes péptidos de manera distinta en cantidades distintas. Aunque para el procesamiento de un péptido precursor se recorra sólo una vía de desintegración, y con ello todos los productos de desecho procedan de un mismo péptido precursor y deban estar en principio en cantidades equimolares, las concentraciones estacionarias de diferentes péptidos parciales y fragmentos medibles en líquidos biológicos pueden ser muy diferentes, a saber, por ejemplo, cuando algunos de ellos se forman a diferente velocidad y/o presentan diferentes estabilidades (duraciones) individuales en cada líquido biológico, o si se retiran de la circulación debido a diferentes mecanismos de aclaramiento y/o con distintas velocidades de aclaramiento.

Así, en relación con la formación de AM puede suponerse que en el procesamiento proteolítico del pre-proAM se formarán, junto a AM y PAMP, también otros fragmentos de péptidos. Sin embargo, en la literatura científica no se encuentra ningún dato sobre la aparición y la estabilidad de otros posibles fragmentos de este tipo, y esto a pesar de que para fines de investigación, por ejemplo, la firma Phoenix Pharmaceuticals, Inc. ofrece comercialmente péptidos correspondientes a fragmentos de péptido pre-proAM de este tipo y también radioinmunoensayos (RIA) para su determinación.

Del documento WO00/69900 se conoce un péptido (SEQ ID NO:939) que equivale al SEQ ID NO:3 de la presente solicitud. No obstante, el documento WO00/69900 no revela ninguna aplicación diagnóstica de este péptido.

Partiendo de los conocimientos conseguidos con la aparición de la prohormona procalcitonina en la septicemia (véase por ejemplo el documento EP 0 656 121 B1), y partiendo de la hipótesis de que en la septicemia podrían detectarse en la circulación de los pacientes de septicemia otras prohormonas no observadas normalmente, el solicitante llevó a cabo un ensayo orientativo para detectar la proadrenomedulina en el suero de pacientes de septicemia, utilizando para ello un RIA de adquisición comercial con un anticuerpo que se liga a los aminoácidos 45-92 del pre-proAM, pero no a las secuencias del AM maduro. Los resultados, que se describen en la publicación WO 00/22439, demuestran una concentración elevada, con respecto a la de las personas de control sanas, de un analizado designado provisionalmente como preadrenomedulina. El aumento medido, no obstante, se encuentra sólo en un orden de magnitudes de aproximadamente el doble del valor normal; por lo tanto era relativamente reducido. En vista de los datos de la bibliografía, que informan en la septicemia de valores de AM aumentados en un orden de magnitudes de 12x el valor normal, el aumento observado al doble aproximado del valor normal para la inmunorreactividad proAM medido con el ensayo utilizado parecía poco atractivo para determinar, en el marco del diagnóstico de la septicemia, esta "inmunorreactividad proAM" en lugar del AM. Sobre la base de los resultados medidos no puede decidirse si en el ensayo descrito se midió realmente proadrenomedulina (22-185 o 22-146) o si la inmunorreactividad de proadrenomedulina medida del modo descrito es atribuible a una o varias especies distintas aparecidas en las muestras de los pacientes.

Dentro del marco de amplios trabajos de investigación y desarrollo con biomarcadores, que podrían ser de utilidad clínica en el diagnóstico de la septicemia, y en especial también con vistas a la meta de poder mejorar el diagnóstico fino de la septicemia por la vía de una determinación de parámetros múltiples (determinación simultánea de varios biomarcadores), el solicitante también tomó en consideración la determinación o determinación adicional del AM aumentado en caso de septicemia. Sin embargo, tal como se demostró, no era posible sin más una determinación fiable del AM obteniendo resultados que permitieran una comparación sencilla de los resultados de medición más allá de los límites de cada uno de los trabajos de investigación. Los datos de la mayoría de los trabajos de investigación se obtuvieron con RIAs, que se basan en una competencia del AM con un péptido marcador marcado por un sitio de fijación común del AM de un anticuerpo. Con frecuencia, los correspondientes RIAs eran desarrollos individuales y se trabajaba con diferentes anticuerpos y péptidos, lo cual dificultó una comparación cuantitativa interensayos de los resultados de medición obtenidos (véase por ejemplo 10). Además, los resultados de investigación más recientes habían mostrado que existían diferentes formas de AM (con o sin resto de glicina del extremo C), a las que podían atribuirse actividades distintas (véase (2) y por ejemplo (5)). El descubrimiento de una proteína de enlace (véase 11) para AM condujo a un complicación adicional de la situación, pues tanto el resto de glicina existente o en falta como también la ausencia o existencia de complejidad del AM debido a su proteína de enlace, pueden influir de manera imprevisible sobre la determinación del AM dependiendo del correspondiente ensayo. Estas circunstancias imponen elevadas exigencias a un inmunoensayo válido para AM que sea adecuado para exploraciones de rutina: para un ensayo de este tipo deben encontrarse anticuerpos apropiados que se fijen en las zonas del AM no ocupadas por la proteína de enlace, si es que hay alguna de esas zonas. O bien debe realizarse un paso previo de liberación y separación de la proteína de enlace del AM, siendo difícilmente evaluable la influencia de un paso de este tipo sobre la estabilidad del AM y/o los valores de medida que pueden obtenerse. El hecho de que junto al AM completo se encuentren fisiológicamente también distintos péptidos parciales de AM y que parecen desempeñar un cierto papel en el proceso fisiológico general, dificulta todavía más la obtención de un inmunoensayo válido y la capacidad de comparación de los valores de medición obtenidos de la literatura.

Por consiguiente, el solicitante se ha puesto el objetivo de crear un procedimiento de medición válido y apto para rutinas que sea ampliamente insensible a las influencias perturbadoras de una medición directa del AM, arriba citadas, y que pueda proporcionar valores fiables para la producción fisiológica de AM y/o su precursor en distintos estados patológicos, en especial la septicemia u otros estados patológicos en los que se encuentren valores

\hbox{aumentados para AM.}

Este objetivo se consigue según la invención determinando para fines de diagnóstico no AM u otro de los péptidos parciales pre-proAM investigados hasta la fecha, sino un péptido parcial de la región mid que contiene los aminoácidos 42-95 del pre-proAM (SEQ ID NO:3), produciéndose la determinación de manera especialmente preferida con un inmunoensayo en el que se trabaja con un anticuerpo marcado.

La reivindicación 1 reproduce el núcleo de la presente invención.

Las configuraciones ventajosas y preferidas de la invención deben tomarse de las restantes reivindicaciones.

Para conseguir el objetivo de crear un procedimiento de determinación que registre de manera fiable la formación de AM o sus predecesores o productos secundarios en diferentes estados patológicos, en especial septicemia pero también, por ejemplo, enfermedades cardiacas, enfermedades hipertensas o enfermedades cancerosas u otras enfermedades en las que puedan observarse niveles de AM elevados, a pesar de los resultados poco prometedores, por un lado se tomó la referencia del resultado descrito en el documento WO 00/22439 de un aumento de la "inmunorreactividad de proadrenomedulina" en la septicemia. Por otro lado, se llevaron a cabo extensos estudios clínicos complementarios, midiendo con distintos ensayos nuevos el suero de pacientes de septicemia, cáncer y cardiopatía, que de manera sorprendente proporcionaron valores de medición con validez claramente mejorada.

Los análisis realizados y los resultados significativos de los mismos se describirán a continuación con más detalle, tomando como referencia las figuras.

En ellas se muestra:

Figura 1 los resultados de la medición de mid-proAM en el suero de 109 personas normales sanas, comparado con los resultados de la medición de 110 sueros de septicémicos y de 20 sueros de pacientes con politrauma. Todas las mediciones se realizaron con un ensato SPALT, tal como se describe con mayor detalle en la parte experimental. Resulta curioso que - a diferencia de lo que sucede en el caso de procalcitonina y otros marcadores de inflamación - sólo aumentaron los valores para los pacientes de septicemia (concentraciones elevadas de aproximadamente 550 pmol/l o 550 fmol/l frente a valores de 33 pmol/l para personas sanas), pero no los valores para los pacientes de politrauma.

Figura 2 los resultados de la medición de mid-proAM en el suero de 274 personas normales sanas, de 267 septicémicos, de 20 pacientes con cardiopatías y 49 pacientes de cáncer con un ensayo Sandwich, tal como se describe con más detalle en la parte experimental.

En relación a los análisis que condujeron a la presente invención, pasó a un primer plano de interés la cuestión sobre la naturaleza de las especies medidas en las diferentes enfermedades y de la elección de una especie particularmente apropiada para mediciones de AM/proAM. Ya que los RIAs son en principio poco apropiados para proporcionar conocimientos valiosos sobre esta cuestión, y además por diversas razones los RIAs parecían poco prometedores para el objetivo de desarrollo pretendido de crear un ensayo válido para determinaciones de rutina, hubo que desarrollar primero nuevos ensayos, eligiéndose inmunoensayos de un tipo en el que podía trabajarse con anticuerpos marcados.

Dentro del marco de analizar la cuestión de si los valores elevados medidos según el documento WO 00/22439 para una inmunorreactividad de proadrenomedulina en la septicemia reflejan realmente el aumento de concentración de proadrenomedulina en las muestras analizadas, se desarrolló primero un ensayo Sandwich que, debido al diseño del análisis, era muy específico para la proadrenomedulina (22-146 o 22-185) al no poder reconocer AM ni péptidos parciales pre-proAM que no contenían AM.

En este ensayo Sandwich se trabajó con dos anticuerpos distintos que reconocían específicamente la secuencia de aminoácidos del péptido (69-86: zona del péptido SPCD19; SEQ ID NO:4) o un péptido (129-147; péptido AM de extremo C). Como material estándar sirvió proadrenomedulina completa recombinada (22-185), que se calibró con un ensayo AM comercial.

Al medir sueros de personas normales sanas y de pacientes de septicemia, con este ensayo Sandwich no se obtuvieron valores elevados por encima del límite de detección de aproximadamente 40 pg/ml (no se muestran los resultados). A partir de estos hallazgos hubo que llegar a la conclusión de que el aumento la inmunorreactividad proAm encontrado en la septicemia no puede atribuirse a la presencia del péptido de proadrenomedulina en las muestras.

Para comprobar más la cuestión de si los aumentos relativamente bajos (aproximadamente 2x) de los "valores de medición de inmunorreactividad proAM" de mediciones anteriores eran reales, o si en estas mediciones desempeñaban algún papel los posibles artefactos que podían atribuirse al RIA comercial utilizado, se desarrolló otro ensayo, basado en el llamado principio SPALT. En un ensayo de este tipo se aprovecha una competencia entre un competidor ligado a la fase sólida (solid phase = SP) para el analizado ("antígeno" = A) y el analizado por sitios de fijación comunes de un anticuerpo marcado, que se encuentra en el líquido de reacción. En el presente caso el anticuerpo estaba marcado con un trazador luminiscente (LT) (véase la parte experimental). La presencia del analizado o la ocupación de los sitios de fijación del anticuerpo por parte de competidores por la fijación procedentes de la muestra, se muestra como disminución de la fijación del anticuerpo marcado en la fase sólida.

Como competidor ligado a la fase sólida sirvió en el ensayo SPALT descrito el péptido ligado a la fase sólida (69-86: zona del péptido SPCD19; SEQ ID NO:4), como anticuerpo un anticuerpo-ovino-anti-SPCD19 marcado, formado contra este péptido y que reconoce este péptido (refinado por afinidad; véase la parte experimental). Como estándar sirvieron diluciones del péptido SPCD19 en suero caballar normal. El límite de detección se situó aproximadamente en 50 pmol/l. En la determinaciones se incubaron durante la noche 100 \mul de la muestra (o estándar) y 100 \mul del trazador a 4ºC en tubos Polysorb revestidos de péptido SPCD19, después de lo cual se lavaron con 4 x 1 ml de solución de lavado estándar procedente del LUMItest® del solicitante y se midieron entonces con un luminómetro.

En una medición de sueros de septicemia con este ensayo SPALT se encontró una delimitación drástica entre los septicémicos y las personas normales sanas. Para un límite de detección de aproximadamente 1 ng/ml se encontraron para el suero de septicémicos valores que se situaban en promedio alrededor de 19000 pg/ml. En vista de el aumento bastante reducido en los ensayos previos al utilizar RIA comercial (WO 00/22439), la clara diferenciación de los sueros de septicémicos y sanos fue muy sorprendente.

Se ampliaron las mediciones clínicas con el citado ensayo SPALT. Los resultados del estudio ampliado se resumen gráficamente en la Figura 1, remitiéndose expresamente a la explicación de la parte superior de la Figura 1.

Los resultados positivos antes citados del ensayo SPALT demostraron que (1) aunque la "inmunorreactividad proAM" medida en sueros septicémicos no se podía atribuir a la presencia real de proadrenomedulina, (ii) resultaba apropiada una medición equivalente de un analizado con una secuencia de aminoácidos procedente de la sección media del pre-proAM, más exactamente del mid-proAM según SEQ ID NO:3, para diferenciar claramente a los septicémicos de las personas normales.

Partiendo de estos resultados se profundizó el estudio en dos direcciones:

1.: Había que identificar las especies proAM aparecidas realmente en la circulación y eventualmente estudiar su idoneidad como biomarcadores para mediciones de rutina.

2.: Paralelamente había que profundizar en qué medida la medición de estas especies proporciona resultados de medición valiosos desde el punto de vista diagnóstico.

A continuación se describen con más detalle los resultados tomando como referencia la parte experimental. Pueden resumirse de la siguiente manera:

1.: En la circulación (suero, plasma) se encuentra en una concentración significativamente elevada, y con una buena capacidad de medición reproducible, un péptido que contiene los aminoácidos 45-92 del pre-proAM o que consta de ellos (SEQ ID NO:3) y que en esta solicitud se designa como mid-proAM.

2.: La medición del suero de enfermos con un ensayo que mide específicamente mid-proAM proporciona unos resultados que no sólo permiten una clara diferenciación entre septicémicos y personas normales sino que - en unión de hallazgos clínicos - permite detectar también otras enfermedades asociadas a un aumento en la formación de AM, y en concreto particularmente enfermedades cardiacas y cancerosas.

El procedimiento se refiere, pues, en especial a la determinación del mid-proAM en la circulación de un paciente, y en concreto usando particularmente muestras de plasma.

A continuación se explicarán con más detalle determinados aspectos generales de formas de realización preferidas de la invención, y se explicarán con más detalle otros resultados seleccionados del estudio.

Para la realización práctica de la invención se prefiere un formato de ensayo en que se trabaja con anticuerpos marcados, por ejemplo un ensayo que funcione según el principio SPALT competitivo antes descrito (aunque pueden emplearse también otras marcaciones, por ejemplo radiactivas, como ensayo SPALT).

Sin embargo, se prefieren en particular ensayos Sandwich no competitivos, por ejemplo del tipo que se utilizó para los estudios amplios de profundización y que se describirán a continuación con mayor detalle.

Los ensayos Sandwich no competitivos (inmunoensayos de dos caras) tienen frente a los inmunoensayos competitivos una serie de ventajas, entre las que se cuentan que pueden prepararse mejor como ensayos de fase sólida (ensayos heterogéneos), pueden ser más robustos de manejar, pueden proporcionar resultados de medición con una mayor sensibilidad y son también más adecuados para una automatización y una medición en serie. Además, en comparación con los inmunoensayos competitivos que trabajan sólo con un tipo de anticuerpos, proporcionan también información adicional puesto que los inmunoensayos Sandwich sólo reconocen aquellas moléculas o péptidos en los que existen en la misma molécula ambos sitios de fijación para los anticuerpos utilizados para la formación del
sandwich.

Los anticuerpos pueden ser fundamentalmente cualquier anticuerpo monoclonal y/o policlonal adecuado, aunque se prefieren ahora los anticuerpos policlonales depurados por afinidad.

Se prefiere en particular obtener uno de los anticuerpos mediante inmunización de un animal, en especial una oveja, con un antígeno que contiene una secuencia de péptido sintética, que presenta los aminoácidos 69-86 del pre-proAM y un resto adicional de cisteína en el extremo N (SEQ ID NO:4). El otro anticuerpo puede obtenerse, por ejemplo, de manera correspondiente con un antígeno que contiene una secuencia de péptido sintética que presenta los aminoácidos 83-94 (zona del péptido PSR13; SEQ ID NO:5) del pre-proAM con un resto adicional de cisteína en el extremo N. Los anticuerpos obtenidos utilizando los citados péptidos sintéticos, que registran conjuntamente una sección sin huecos de la región mid de la secuencia proAM, sólo reconocen sitios de fijación en la zona del mid-proAM antes citada (aminoácidos 45-92), más exactamente en la zona de los aminoácidos 60-92 del pre-proAM.

En una forma de realización preferida se lleva a cabo el procedimiento como inmunoensayo Sandwich heterogéneo en el que uno de los anticuerpos se inmoviliza en una fase sólida cualquiera, por ejemplo en las paredes de tubos de ensayo revestidas (por ejemplo de poliestirol; "Coated Tubes"; CT) o en microplacas de titulación, por ejemplo de poliestirol, o en partículas, por ejemplo partículas magnéticas, mientras que el otro anticuerpo lleva un resto que constituye una etiqueta directamente detectable, o que permite la unión selectiva a una etiqueta, y sirve para la detección de las estructuras Sandwich formadas.

Pueden emplearse fundamentalmente todas las técnicas de marcación utilizables en los ensayos del tipo descrito, entre las que se cuentan las marcaciones con radioisótopos, enzimas y etiquetas de fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminiscencia y marcados cromáticos detectables ópticamente de manera directa, como por ejemplo átomos de oro y partículas de pigmento, tal como las que se utilizan en especial para el llamado Point-of-Care (POC) o los tests rápidos. En caso de un immunoensayo Sandwich heterogéneo, ambos anticuerpos pueden presentar también partes de un sistema detector del tipo que se describe a continuación en relación con ensayos homogéneos.

Por lo tanto, está dentro del marco de la presente invención configurar el procedimiento según la invención también como test rápido.

El procedimiento según la invención puede configurarse además como procedimiento homogéneo en el que los complejos Sandwich, formados a partir de los dos anticuerpos y el mid-proAM que hay que detectar, permanecen suspendidos en la fase líquida. En un caso de este tipo se prefiere marcar ambos anticuerpos con partes de un sistema de detección que después, cuando ambos anticuerpos se integran en un único Sandwich, permiten generar o desencadenar una señal. Un procedimiento de este tipo particularmente preferido se refiere a la utilización de reactivos detectores que deben utilizarse por pares, tal como se describen por ejemplo en los documentos US-A-4 822 733, EP-B1-180 492 o EP-B1-539 477 y el estado actual de la técnica allí citado. Hacen posible una medición, que selectivamente sólo registra productos de reacción que contienen ambos componentes de marcado en un único inmunocomplejo, directamente en la mezcla de reacción. Como ejemplo se remite a la tecnología ofrecida bajo las marcas TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) y KRYPTOR®, que ponen en práctica las enseñanzas de las solicitudes antes indicadas.

Se mostró sorprendentemente que la determinación según la invención del mid-proAM (SEQ ID NO:3) proporciona resultados de medición altamente significativos. Esta información vale, tal como se mostrará más adelante, no sólo para el diagnóstico de la septicemia sino también para el de enfermedades cardiacas y del cáncer.

Se supone que el procedimiento de determinación según la invención puede realizarse de manera especialmente ventajosa también dentro del marco de un denominado diagnóstico multiparámetro, en concreto tanto en el campo del diagnóstico cardiaco como también en el de la septicemia y el cáncer. Otros parámetros determinados son por ejemplo los parámetros cardiacos ANP, BNP, proANP o proBNP o parámetros de septicemia, que por ejemplo se eligen del grupo formado por anticuerpos antigangliósidos, las proteínas procalcitonina, CA 125, CA 19-9, S100B, proteínas S100A, LASP-1, fragmentos de citoqueratina solubles, en especial CYFRA 21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1 solubles (sCY1F), los péptidos inflamina y CHP, otras prohormonas de péptidos, la glicina-N-aciltransferasa (GNAT), la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) y la proteína reactiva C (CRP) o fragmentos suyos. En las determinaciones multiparámetro citadas está previsto determinar los resultados de las mediciones para varios parámetros de manera simultánea o paralela y, por ejemplo, evaluarlos con ayuda de un programa informático que utilice también correlaciones de parámetros significativas desde el punto de vista diagnóstico.

A continuación se explicará con mayor detalle la invención describiendo la fabricación de componentes de ensayo preferidos, la ejecución de una forma de realización preferida de un ensayo de tipo Sandwich y los resultados, obtenidos utilizando un ensayo de este tipo, de determinaciones mid-proAM en plasmas EDTA de personas de control y de enfermos de septicemia, corazón y cáncer.

Se describirá además la identificación del péptido parcial proAM presente en la circulación y determinado realmente.

Parte experimental Material y métodos 1. Síntesis de péptidos

Partiendo de la secuencia de aminoácidos conocida de la preproadrenomedulina humana (SEQ ID NO:1) se eligieron una primera zona (Pos. 69-86: zona de péptido SPCD19; SEQ ID NO:4) y una segunda zona de péptido (Pos. 83-94: zona de péptido PSR13; SEQ ID NO:5). Completadas con un resto de cisteína del extremo N, ambas zonas se sintetizaron químicamente por un procedimiento estándar como péptidos solubles, se depuraron, mediante espectrometría de masas y Reversed Phase HPLC se controló su calidad y se liofilizaron en alícuotas (empresa JERINI AG, Berlín, Alemania). Las secuencias de aminoácidos de los péptidos son:

Péptido SPCD19:	CRPQDMKGASRSPEDSSPD	(SEQ ID NO:4)
Péptido PSR13:	CSSPDAARI RVKR	(SEQ ID NO:5)

Además, como estándar se sintetizó todo el mid-proAM (según Pos. 45-92; SEQ ID NO:3):

ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRV

\hskip0,3cm

(SEQ ID NO:3) 2. Conjugación e inmunización

Mediante MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) se conjugaron los anteriores péptidos
SPCD19 y PSR13 en la proteína portadora KLH (Keyhole limpet hemocyanin) (véanse las instrucciones de trabajo "NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers" de la firma PIERCE, Rockford, IL; EE.UU.). Con estos conjugados se inmunizaron ovejas según el siguiente programa: cada oveja recibió inicialmente 100 \mug de conjugado (los datos de masa referidos a la porción peptídica del conjugado) y después 4 veces a la semana 50 \mug de conjugado cada vez (los datos de masa referidos a la porción peptídica del conjugado). Empezando el cuarto mes desde el comienzo de la inmunización se extrajo a cada oveja 700 ml de sangre 4 veces a la semana y a continuación se obtuvo el antisuero mediante centrifugacón. La conjugación, la inmunización y la obtención de antisueros lo realizó la empresa MicroPharm, Carmarthenshire, RU.

3. Depuración de los anticuerpos

En un procedimiento de 1 paso, a partir de los antisueros que se obtuvieron partiendo del cuarto mes desde la inmunización, se prepararon de la siguiente manera los anticuerpos específicos del péptido.

Para ello se acoplaron primero los péptidos antes citados SPCD19 y PSR13 a SulfoLink Gel (véanse instrucciones de trabajo "SulfoLink Kit", firma PIERCE, Rockford, IL, EE.UU.). Para el acoplamiento se emplearon 5 mg de péptido por cada 5 ml de gel.

La depuración por afinidad de los anticuerpos específicos del péptido de los antisueros de oveja frente a ambos péptidos se realizó de la siguiente manera:

Las columnas de péptido se lavaron primero tres veces de manera alternante con 10 ml de tampón de elución (50 mM de ácido cítrico, pH 2,2) y tampón de fijación (100 mM de fosfato sódico, 0,1% Tween, pH 6,8) cada uno. Se filtraron 100 ml de los antisuero de oveja a través de 2 \mum y se mezclaron con el material existente en la columna. El gel se lavó cuantitativamente con 10 ml de tampón de fijación procedente de la columna. La incubación se realizó durante la noche a temperatura ambiente y con agitación. Las porciones se llevaron cuantitativamente a columna vacías (NAP 25, Pharmacia, vaciadas). Se eliminaron los sobrantes. A continuación se lavó con 250 ml de tampón de fijación hasta dejar libre de proteína (contenido en proteína del eluado de lavado < 0,02 A280 nm). Se añadió tampón de elución a las columnas lavadas y se recogieron fracciones de 1 ml cada una. De cada fracción se determinó el contenido de proteína mediante el método BCA (véanse las instrucciones de trabajo de la firma PIERCE, Rockford, IL; EE.UU.). Se hizo un pool de fracciones con concentraciones de proteína > 0,8 mg/ml. Tras una determinación de la proteína del pool por el método BCA, se obtuvieron rendimientos de 49 mg para los anticuerpos anti-SPCD19 (depurado por afinidad; policlonal) y 60 mg para el anticuerpo anti-PSR13 (depurado por afinidad; policlonal).

4. Marcado

Mediante una columna de filtración por gel NAP-5 (Pharmacia), 500 \mul del anticuerpo anti-SPCD19 depurado se tamponaron en 1 ml 100 mM de tampón de fosfato potásico (pH 8,0) según las instrucciones de trabajo. La determinación de la concentración de proteína de la solución de anticuerpos dio un valor de 1,5 mg/ml.

Para el marcado por quimioluminiscencia del anticuerpo se mezclaron 67 \mul de la solución de anticuerpos con
10 \mul de MA70-Akridinium-NHS-Ester (1 mg/ml; firma HOECHST Behring) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron después 423 \mul de glicina 1 M y se incubó durante otros 10 minutos. A continuación se tamponó según instrucciones de trabajo la porción de marcaje a través de una columna de filtración por gel NAP-5 (Pharmacia) en 1 ml de medio circulante A (50 mM de fosfato potásico, 100 mM de NaCl, pH 7,4) y se liberaron con ello los componentes de bajo peso molecular. Para separar los últimos restos de etiqueta no fijados a los anticuerpos se realizó una HPLC de filtración por gel (columna: Waters Protein Pak SW300). Se aplicó la muestra y a una velocidad de flujo de 1 ml/min se cromatografió con el medio circulante A. Con un fotómetro de flujo se midieron las longitudes de onda de 280 nm y 368 nm. La relación de absorción 368 nm/280 nm como medida para el grado de marcaje del anticuerpo fue en el pico 0,10. Se recopilaron las fracciones conteniendo anticuerpos monómeros (tiempo de retención 8-10 min) y se recogieron en 3 ml de fosfato potásico 100 mM, NaCl 150 mM, 5% de Bovines Serum Albumin, azida sódica 0,1%, pH 7,4.

Por un lado los anticuerpos marcados se utilizaron en un inmunoensayo Sandwich tal como se describe a continuación, pero por otro lado también en el ensayo SPALT ya descrito.

5. Acoplamiento

Para obtener la fase sólida de un inmunoensayo Sandwich se recubrieron de la siguiente manera tubos de poliestirol irradiados de 5 ml (firma Greiner) con anticuerpos anti-PSR13 depurados: se diluyeron los anticuerpos en 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,8 hasta una concentración de 6,6 \mug/ml. Se pipetearon en cada tubo de ensayo 300 \mul de esta solución. Los tubos de ensayo se incubaron 20 horas a 22ºC. Se aspiró la solución. A continuación se llenó cada tubo de ensayo con 4,2 ml de fosfato sódico 10 mM, 2% Karion FP, 0,3% Bovines Serum Albumin, pH 6,5. Al cabo de 20 horas se aspiró la solución. A continuación se secaron los tubos de ensayo en una secadora de vacío.

Los procedimientos descritos de marcación e inmovilización se llevaron a cabo, además, en una manera esencialmente igual con cada uno de los restantes anticuerpos, obteniéndose un ensayo Sandwich "inverso". Las determinaciones que se realizaron de manera análoga a las determinaciones que se describen a continuación, empleando un inmunoensayo marcado/inmovilizado "inverso" de este tipo, proporcionaron resultados esencialmente idénticos y por ese motivo no se describen adicionalmente.

6. Realización y evaluación del inmunoensayo Sandwich

Se fabricó un tampón de ensayo de la siguiente composición:

100 mM fosfato sódico, 150 mM NaCl, 5% Bovines Serum Albumin, 0,1% IgG no específico de oveja, 0,1% azida sódica, pH 7,4.

Como material estándar sirvió un mid-proAM (SEQ ID NO:3) químicamente sintetizado. Este péptido se diluyó en serie en suero normal de caballo (firma SIGMA). Al estándar así fabricado se le adscribieron concentraciones según el peso de péptido.

Las muestras para medición fueron plasmas EDTA de personas manifiestamente sanas, de pacientes con septicemia y de pacientes con afecciones cardiacas y cáncer.

En los tubos de ensayo se pipetearon 10 \mul de estándar o muestra y 200 \mul de tampón de ensayo, conteniendo 1 millón de RLU (relative light units) del anticuerpo anti-SPCD19 marcado con MA70. Se incubó dos horas a 22ºC con agitación. Se lavó después 4x con 1 ml de solución de lavado (0,1% Tween 20) cada vez por cada tubo de ensayo, se dejó escurrir y la quimioluminiscencia ligada al tubo de ensayo se midió en un luminómetro (firma BERTHOLD, LB952T; reactivos básicos BRAHMS AG).

Utilizando el software MultiCalc (Spline Fit) se leyeron las concentraciones de proadrenomedulina de la región med de las muestras en las curvas estándar. Los resultados se resumen gráficamente en la Figura 2.

7. Realización y evaluación del inmunoensayo SPALT

Como competidor ligado a la fase sólida sirvió en el ensayo SPALT descrito el péptido ligado a la fase sólida SPCD19 (zona de péptido 69-86; SEQ ID NO:4), que se fijó a las paredes de tubo Polysorb. Como anticuerpo se empleó el anticuerpo de oveja anti-SPCD19 (depurado por afinidad) marcado que se obtuvo del modo descrito en 1. a 4. Como estándar sirvieron diluciones del péptido SPCD19 en suero normal de caballo.

En las determinaciones se incubaron durante la noche 100 \mul de muestra (o estándar) y 100 \mul de trazador a 4ºC en los tubos de Polysorb revestidos de péptido SPCD19, tras lo cual se lavaron 4x con 1 ml de solución de lavado estándar del LUMItest® del solicitante y después se midieron en el luminómetro.

Los resultados de una serie de mediciones obtenidas en este ensayo se representan en la Figura 1.

8. Identificación del analizado medido en el ensayo descrito

Para enriquecer el analizado reconocido por el anticuerpo utilizado en el ensayo antes descrito, se fraccionaron directamente por vía analítica tres plasmas septicémicos individuales a través de un C18 Reversed Phase HPLC, eluyéndose mediante un gradiente lineal de acetonitrilo. Se recopilaron y secaron fracciones de 1 ml. Las fracciones se recogieron en tampón de ensayo y se determinó la inmunorreactividad SPCD19 de cada una de las fracciones. Se inmovilizó un anticuerpo anti-SPCD19 (véase anteriormente en 3.) a las paredes de un tubo de Polysorb y se determinó la competencia por este anticuerpo de la muestra (fracción) y del SPC19 marcado con luminiscencia.

Con un análisis de este tipo se demostró que en todos los plasmas septicémicos la máxima inmunorreactividad se encontraba en la misma fracción (fracción 22).

Para identificar más los analizados medidos se hizo un pool de 7 sueros septicémicos de 3 ml cada uno (volumen 22 ml). Utilizando una columna Carbolink con un anticuerpo anti-SPCD19 se sometieron los sueros del pool a una depuración por afinidad y el eluado ácido se fraccionó igual que antes a través de un C18 Reversed Phase HPLC. Se secó la fracción 22 y se analizó por espectrometría de masas.

En un análisis por espectrometría de masas se calculó como masa molar del analizado aislado un valor de aproximadamente 5146 Dalton. Este valor equivale a la masa molar de un fragmento proAM que contiene los aminoácidos de las posiciones 45-92, es decir, del mid-proAM (el valor teórico es de 5146,72 Dalton bajo el supuesto de que los dos restos de metionina existentes están oxidados).

En un análisis MALDI-TOF de la degradación tríptica de la fracción 22 aislada, como masas monoisotópicas (M + H^{+}) se identificaron, entre otros, fragmentos de péptido que equivalen a los aminoácidos de las posiciones 79-89, 75-89, 61-74 y 61-78 del pre-proAM. Los datos de masas molares y el análisis de espectrometría de masas de la degradación tríptica demuestran conjuntamente que el péptido contenido en la fracción aislada es el péptido (SEQ ID NO:3) designado como mid-proAM (45-92). Su formación puede explicarse mediante un procesado proteolítico del producto de traducción pre-proAM original mediante peptidasa señal, prohormonaconvertasa (disociación entre aminoácidos básicos) y amino- y carboxipeptidasa (disociación de los aminoácidos básicos) (véase el programa análogo para la desintegración de la procalcitonina en (20)).

9. Análisis de estabilidad

Para verificar la cuestión de si con una medición del mid-proAM hay que tener en cuenta problemas debido a una estabilidad insuficientes del mid-proAM en una muestra o solución de medición, se midieron 20 sueros septicémicos frescos y otros tantos después de un almacenaje de 3 días a temperatura ambiente. Los resultados se resumen en la tabla siguiente. Muestran que después de un almacenaje de 3 días la inmunorreactividad casi no había variado. Esta estabilidad demostrada del mid-proAM es una gran ventaja para el diagnóstico desde el punto de vista del
manejo.

TABLA 1

# Paciente	mid-proAM [nmol/l]	mid-proAM [nmol/l]	Variación
	día = 0	día = 3
1	6,2	6,1	98,8%
2	3,3	3,2	98,1%
3	2,2	2,1	97,0%
4	1,6	1,5	95,4%
5	1,1	1,0	92,7%
6	1,3	1,2	95,7%
7	1,9	2,1	109,6%
8	2,6	2,7	102,8%
9	2,8	2,7	96,4%
10	3,1	3,1	98,9%
11	4,6	4,9	106,3%
12	5,8	5,9	102,1%
13	3,6	3,4	95,2%
14	4,2	4,6	110,7%
15	3,0	2,4	80,0%
16	1,2	1,3	105,5%
17	1,5	1,5	102,2%
18	1,7	1,8	103,4%
19	2,0	1,8	89,5%
20	2,1	2,0	94,1%

Valor medio = 98,8%

Resumiendo, puede afirmarse que una determinación de mid-proAM, por ejemplo utilizando un anticuerpo
SPCD19, presenta numerosas ventajas frente a una determinación de, por ejemplo, AM:

Una deterrminación del mid-proAM no está sometido a ninguna limitación conocida debido a la existencia de una proteína de enlace, una fragmentación y una dinámica de concentración débil.

El analizado mid-proAM presenta además una buena estabilidad, es decir, una pérdida muy baja de inmunorreactividad en el almacenamiento a temperatura ambiente, lo cual constituye una gran ventaja práctica para las determinaciones rutinarias de diagnóstico.

Se observa una dinámica extraordinariamente favorable y no puede suponerse que sea específica para la septicemia.

Hay que suponer, por tanto, que una medición de mid-proAM puede presentar ventajas en todas las enfermedades para las que se han descrito aumentos de la concentración de AM, apareciendo hoy especialmente ventajosa una determinación en el marco del diagnóstico de la septicemia, las cardiopatías y el cáncer.

Lista bibliográfica

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20.: Meisner M., (2000) "Procalcitonin", Georg Thieme Verlag, ISBN 3-13-105473-5, pág. 22

<110> B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Bestimmung eines midregionalen Proadrenomedullin-Teilpeptids in biologischen Proben zu diagnostischen Zwecken Bowie Immunoassays für die Durchführung einer solchen Bestimmung

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 3723 PCT AS

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<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> DE 10316583.5

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<151> 2003-04-10

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<160> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 185

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 52

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

2

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<210> 3

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<211> 48

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\sa{Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys}

\sac{Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala}

\sac{Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide

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<400> 4

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\sa{Cys Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser}

\sac{Ser Pro Asp}

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<210> 5

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide

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<400> 5

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\sa{Cys Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg}

Claims

1. Procedimiento in vitro para determinar la inmunorreactividad de la adrenomedulina en líquidos biológicos para fines diagnósticos, caracterizado porque se mide el péptido parcial de la región mid (mid-proAM; SEQ ID NO:3) de la proadrenomedulina, que comprende los aminoácidos (45-92) de la preproadrenomedulina completa (pre-proAM; SEQ ID NO:1).

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque se mide el mid-proAM en líquidos biológicos mediante un inmunoensayo que funciona, como mínimo, un anticuerpo marcado que reconoce específicamente una secuencia del mid-proAM.

3. Procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque el inmunoensayo es un ensayo con un competidor ligado a fase sólida para los analizados y un anticuerpo marcado (ensayo SPALT) o un ensayo Sandwich (inmunoensayo de dos caras), que se fijan específicamente en distintas secuencias parciales

\hbox{del mid-proAM (SEQ ID
NO:3).}

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque se determina mid-proAM (SEQ ID NO:3) circulante y el líquido biológico es un plasma.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque ambos anticuerpos se fijan en una zona del mid-proAM, que se extiende desde el aminoácido 60 hasta el aminoácido 94 del pre-proAM.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el/los anticuerpo(s) son anticuerpos monoclonal(es) y/o policlonales.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque ambos anticuerpos son anticuerpos policlonales depurados por afinidad.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque uno de los anticuerpos se obtiene mediante inmunización de un animal con un antígeno, que contiene una secuencia de péptido sintético que comprende los aminoácidos 69-86 del pre-proAM (SEQ ID NO:4), y el otro anticuerpo se obtiene mediante inmunización con un antígeno que contiene una secuencia de péptido sintético que comprende los aminoácidos 83-94 del pre-proAM (SEQ ID NO:5).

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque uno de los anticuerpos está marcado y el otro anticuerpo está fijo a una fase sólida o puede fijarse selectivamente a una fase sólida.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque tanto el primero como el segundo anticuerpo están dispersos en el mezcla de reacción líquida y porque en el primer anticuerpo está fijo un primer componente de marcaje y porque el segundo componente de este sistema de marcaje está fijo al segundo anticuerpo, de tal manera que después de la fijación de ambos anticuerpos en el mid-proAM que hay que detectar se genera una señal medible que posibilita una detección del complejo Sandwich formado en la solución de medida.

11. Procedimiento según la reivindicación 10 caracterizado porque el sistema de marcaje comprende cripatos o quelatos de tierras raras en combinación con un colorante de fluorescencia o quimiolumiscencia, en especial del tipo ciano.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque se aplica para el diagnóstico, para la determinación del grado de gravedad y el pronóstico así como para el control terapéutico de seguimiento del curso de la septicemia.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 caracterizado porque se realiza dentro del marco de una determinación multiparámetro, en el que se determina al mismo tiempo como mínimo un parámetro adicional, relevante para el diagnóstico de la septicemia.

14. Procedimiento según la reivindicación 13 caracterizado porque el o los parámetro(s) adicional(es) relevante(s) para el diagnóstico de la septicemia se elige(n) del grupo formado por anticuerpos antigangliósidos, las proteínas procalcitonina, CA 125, CA 19-9, S100B, proteínas S100A, LASP-1, fragmentos de citoqueratina solubles, en especial CYFRA 21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1 solubles (sCY1F), los péptidos inflamina y CHP, otras prohormonas de péptidos, la glicina-N-aciltransferasa (GNAT), la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) y la proteína reactiva C (CRP) o fragmentos suyos.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado se aplica en el campo del diagnóstico cardiaco.

16. Procedimiento según la reivindicación 15 caracterizado porque se realiza dentro del marco de una determinación multiparámetro, en el que se determinan al mismo tiempo parámetros adicionales, relevantes para el diagnóstico cardiaco.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque se aplica en el campo del diagnóstico del cáncer.

18. Procedimiento según la reivindicación 17 caracterizado porque se realiza dentro del marco de una determinación multiparámetro, en el que se determinan al mismo tiempo parámetros adicionales, relevantes para el diagnóstico del cáncer.