ES2246514T3 - Analogos de tiroxina desprovistos de actividad hormonal importante para tratar tumores malignos. - Google Patents
Analogos de tiroxina desprovistos de actividad hormonal importante para tratar tumores malignos.Info
- Publication number
- ES2246514T3 ES2246514T3 ES97927813T ES97927813T ES2246514T3 ES 2246514 T3 ES2246514 T3 ES 2246514T3 ES 97927813 T ES97927813 T ES 97927813T ES 97927813 T ES97927813 T ES 97927813T ES 2246514 T3 ES2246514 T3 ES 2246514T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dime
- cells
- thyroxine
- cell
- methyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/235—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
- A61K31/166—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the carbon of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. procainamide, procarbazine, metoclopramide, labetalol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
- C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
- C07C69/84—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of monocyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of a six-membered aromatic ring
- C07C69/92—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of monocyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of a six-membered aromatic ring with etherified hydroxyl groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
LA INVENCION SUMINISTRA PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER, PARTICULARMENTE TUMORES MALIGNOS, CON ANALOGOS DE LA TIROXINA QUE NO TIENEN ACTIVIDAD HORMONAL SIGNIFICATIVA. SE ADMINISTRA UN ANALOGO DE LA TIROXINA A UN MAMIFERO ENFERMO EN UNA CANTIDAD EFECTIVA PARA PROVOCAR LA DEPRESION O REGRESION DEL CRECIMIENTO DEL TUMOR MALIGNO PARA TRATAR EL CANCER. ANALOGOS DE LA TIROXINA PARTICULARMENTE PREFERIDOS SON AQUELLOS CAPACES DE PROVOCAR ALREDEDOR DE UN 35% O MAS DE INHIBICION DE LA VELOCIDAD INICIAL DEL MONTAJE DE LA PROTEINA MICROTUBULAR IN VITRO.
Description
Análogos de tiroxina desprovistos de actividad
hormonal importante para tratar tumores malignos.
Esta solicitud es una continuación en parte de la
solicitud de patente de EE.UU. en tramitación junto con la presente
nº de serie 08/655.267, presentada el 4 de junio, 1996, cuya
descripción se incorpora en el presente documento por
referencia.
La presente invención se refiere en general al
campo de los productos terapéuticos para el cáncer. Más
específicamente, la presente invención se refiere a análogos de
tiroxina específicos desprovistos de actividad hormonal importante,
particularmente al
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo, como agentes antitumorales potentes, selectivos y no
tóxicos.
Los crecimientos cancerosos malignos, debido a
sus características únicas suponen un serio desafío para la medicina
moderna. Estas características incluyen la proliferación celular
incontrolable que da como resultado el crecimiento no regulado del
tejido maligno, una capacidad para invadir tejidos locales e incluso
remotos, falta de diferenciación, falta de síntomas detectables y lo
que es más importante, la falta de terapia y prevención
eficaces.
El cáncer se puede desarrollar en cualquier
tejido de cualquier órgano a cualquier edad. La etiología del cáncer
no está claramente definida, pero los mecanismos tales como la
susceptibilidad genética, los trastornos de rotura cromosómica,
virus, factores medioambientales y trastornos inmunológicos, se han
asociado todos al crecimiento y transformación de células
malignas.
Actualmente la quimioterapia antineoplásica
abarca diferentes grupos de fármacos incluyendo agentes alquilantes,
antagonistas de purina y antibióticos antitumorales. Los agentes
alquilantes alquilan las proteínas y ácidos nucleicos de las células
previniendo la replicación celular, alterando el metabolismo celular
y finalmente conduciendo a la muerte celular. Los agentes
alquilantes típicos son las mostazas nitrogenadas, ciclofosfamida y
clorambucilo. Las toxicidades asociadas con el tratamiento con
agentes alquilantes incluyen náuseas, vómitos, alopecia, cistitis
hemorrágica, fibrosis pulmonar y un mayor riesgo de desarrollar
leucemia aguda.
Los antagonistas de purina, pirimidina y folato
son específicos del ciclo y fase celular, y con el fin de promover
un efecto antitumoral, requieren que las células estén en el ciclo
de replicación celular y en la fase de síntesis de ADN de la
replicación. Los antagonistas de purina tales como la
6-mercaptopurina o 6-tioguanidina
inhiben la síntesis nueva de purina y la interconversión de purinas.
Los antagonistas de pirimidina, tales como la citarabina,
5-fluorouracilo o floxuridina inhiben la síntesis de
ADN por inhibición de la desoxicitidilato-quinasa y
ADN-polimerasa.
Los antagonistas de folato, por ejemplo,
metotrexatos, se unen fuertemente a la enzima intracelular
dihidrofolato-reductasa conduciendo finalmente a la
muerte celular que resulta de la incapacidad de sintetizar
pirimidinas. Las toxicidades asociadas con el uso de estos
compuestos incluyen alopecia, mielosupresión, vómitos, náuseas, y
ataxia cerebelosa, entre otros.
Los alcaloides de plantas tales como la
vincristina, vinblastina o las podofilotoxinas etopósido y
tenipósido, en general inhiben la mitosis y síntesis de ADN y la
síntesis de proteínas dependientes de ARN. Las toxicidades de estos
fármacos son similares a las descritos antes e incluyen miopatía,
mielosupresión, neuropatía periférica, vómitos, náuseas y
alopecia.
Los antibióticos antitumorales tales como la
doxorrubicina, daunorrubicina, y actinomicina actúan como
intercalantes del ADN, que previenen la replicación celular, inhiben
la síntesis de ARN dependiente de ADN e inhiben la
ADN-polimerasa. La bleomicina produce la escisión
del ADN y la mitomicina actúa como inhibidor de síntesis de ADN por
alquilación bifuncional. Las toxicidades de estos antibióticos son
numerosas y graves e incluyen necrosis, mielosupresión, reacciones
anafilácticas, anorexia, cardiotoxicidad dependiente de la dosis y
fibrosis pulmonar.
Otros compuestos usados para el tratamiento
quimioterapéutico del cáncer son iones inorgánicos tales como el
cisplatino, modificadores de la respuesta biológica tales como el
interferón, enzimas y hormonas. Todos estos compuestos, al igual que
los mencionados antes van acompañados de reacciones adversas
tóxicas.
Se dice que el documento de EE.UU. 4.724.234
describe un procedimiento para producir oncolisis y regresión de
tumores malignos y otras afecciones malignas sin efectos adversos en
las células normales del cuerpo. Concretamente, se describe un
régimen nutricional calórico y de composición que se administra
simultáneamente con un régimen de fármacos de un agente o agentes
que desacoplan la fosforilación oxidativa, más preferiblemente el
2,4-dinitrofenol. La tiroxina también está listada
como uno de los agentes de desacoplamiento.
Por consiguiente, sería muy ventajoso
proporcionar composiciones quimioterapéuticas seguras y no tóxicas
que inhiban y/o supriman eficazmente la proliferación de células
tumorales y/o el crecimiento neoplásico. Además, sería muy ventajoso
proporcionar composiciones quimioterapéuticas seguras, eficaces y no
tóxicas que sean fáciles de administrar.
Por lo tanto es conveniente y es el objetivo de
esta invención la identificación de compuestos orgánicos seguros,
eficaces, no tóxicos y que se puedan administrar por vía oral,
capaces de reducir o invertir el crecimiento del tumor maligno en
mamíferos y el uso de dichos compuestos para tratar el cáncer.
La presente invención se refiere a análogos de
tiroxina específicos desprovistos de actividad hormonal importante,
particularmente al
3,5-diyodo-4-(4'-metoxi-fenoxi)benzoato
de metilo ("DIME") para reducir o invertir el crecimiento de
tumores malignos, y tratar el cáncer. Los análogos de tiroxina
típicamente se caracterizan por la falta de actividad hormonal
importante.
En particular, la presente invención se refiere a
un medicamento para tratar un tumor maligno en un mamífero, que
comprende una cantidad de análogo de tiroxina suficiente para
reducir el crecimiento del tumor maligno, en el que el análogo de
tiroxina se caracteriza por ser un compuesto capaz de producir
aproximadamente 35 por ciento o más de inhibición de la velocidad
inicial de unión de las proteínas de microtúbulos in vitro,
preferiblemente aproximadamente 45 por ciento o más, más
preferiblemente aproximadamente 70 por ciento o más, y más
preferiblemente aproximadamente 90 por ciento o más de inhibición de
la velocidad inicial de unión de las proteínas de microtúbulos in
vitro.
Los análogos de tiroxina útiles en los
procedimientos de la presente invención son compuestos que tienen la
fórmula estructural:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos, en la
que:
X = O, S, CH_{2}, carboxi o está ausente;
Y = O o S;
R_{1} = metilo o etilo;
R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se selecciona
cada uno independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo (C_{2} -C_{4}),
alquinilo (C_{2}-C_{4}), hidroxi, alcoxi
(C_{1}-C_{4}) y halógeno; y
R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} se selecciona
cada uno independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxi, alcoxi
(C_{1}-C_{4}), halógeno, NO_{2} y
NH_{2}.
En otra realización ilustrativa, los análogos de
tiroxina útiles en los procedimientos de la presente invención son
compuestos que tienen la fórmula estructural:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos en la
que:
X = O, S, CH_{2}, carboxi o está ausente;
Y = O o S;
R_{1} = metilo o etilo;
R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se selecciona
cada uno independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxi, alcoxi
(C_{1}-C_{4}) y halógeno; y
R_{7} y R_{8} se selecciona cada uno
independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxi, alcoxi
(C_{1}-C_{4}), halógeno, NO_{2} y
NH_{2}.
En una realización preferida de la invención, el
análogo de tiroxina es el
3,5-diyodo-4-(4'-metoxi-fenoxi)benzoato
de metilo ("DIME").
La Fig. 1 ilustra los efectos en la morfología
celular después de incubación, en células E-ras 20
con DIME 4 \muM durante 18-24 horas. Panel A, no
tratado con fármaco (control); Panel B, tratado con fármaco; Panel
C, tratado con fármaco. Los paneles A y B son un aumento de 150x; el
Panel C es un aumento de 300x.
La Fig. 2 es un gráfico que ilustra la pérdida
de tumorigenicidad de células endoteliales bovinas transformadas con
E-ras tratadas con DIME; y
La Fig. 3 es una gráfica que ilustra la semivida
en el suero (t) y la biodisponibilidad oral de DIME en ratones.
La Fig. 4 muestra el efecto tumorigénico del
pretratamiento con DIME (10 \muM durante 4 días) en la formación
de tumor de 10^{5} o 10^{6} células E-ras 20 por
inoculación.
La Fig. 5 muestra el efecto de la concentración
de DIME en las velocidades de formación de colonia por las células
MDA-MB-231.
La Fig. 6 muestra la inducción de la rotura del
ADN por 0,0 \muM (a), 2,0 \muM (b), 5 \muM (c) y 10 \muM
(d). Se trataron células E-Ras (2 x 10^{4}
células/cm^{2}) con DIME 18 horas antes del ensayo TUNEL.
La Fig. 7 muestra la separación por
cromatografía en capa fina de DIME (D) y el ácido carboxílico (A),
su producto de degradación por extractos celulares (cáncer de
pulmón) de A-549 (equivalente a 2 x 10^{6}
células). En el experimento mostrado en las líneas 1 y 2 la
actividad de estearasa del extracto se produce durante la incubación
de 4 horas con DIME 1 \muM. La línea 2 ilustra la inhibición de
estearasa por BNPP 125 \muM. Las líneas 3 y 4 representan los
mismos experimentos que las líneas 1 y 2, excepto que los extractos
celulares se prepararon a partir de células intactas previamente
incubadas durante 24 horas con DIME 1 \muM, y después se lavaron y
extrajeron. Este experimento ilustra que la estearasa no es inducida
por DIME.
La Fig. 8 muestra el aumento de la acción
inhibidora de DIME en el crecimiento de células A-59
por BNPP.
La Fig. 9 es una gráfica del efecto de DIME en
células MDA-MB231. La densidad inicial de siembra
fue 0,05 x 10^{6} por 2 cm^{2}.
La Fig. 11 proporciona un análisis de citometría
de flujo realizado en núcleos de células de carcinoma de mama humano
MDA-MB 231, que demuestra que mediante 18 horas de
exposición al fármaco, se habían acumulado núcleos con un contenido
de ADN de G2, indicando el bloqueo de la fase M.
La Fig. 12 muestra imágenes que ilustran un
retraso de 13 horas en la mitosis seguido de la división irregular
en seis células hijas. Foto 1, 0 h 0 min; Foto 2, 10:55; Foto 3,
24:20; Foto 4, 24:40; Foto 5, 24:55; Foto 6, 25:10; Foto 7, 26:35;
Foto 28:20.
La Fig. 13 muestra el efecto de DIME en el
tiempo de permanencia en la fase M de células
MDA-MB-231.
La Fig. 14 muestra el análisis cuantitativo de
la división celular anómala inducida por DIME.
La Fig. 15 muestra el efecto de DIME en la
velocidad de entrada en la fase M de células
MDA-MB-231.
La Fig. 16 (A, B y C) muestra la hibridación de
cromosomas 19 con el ADN en células
MDA-MB-231 tratadas con DIME
(divididas en la metafase). La Fig. 16A es el control, la Fig. 16B
es la imagen con ADN teñido, la Fig. 16C es la hibridación del
cromosoma 19 del tratamiento con DIME 1 \muM durante 5 días
(metafase).
La Fig. 17 (A, B y C)muestra el efecto del
tratamiento con DIME en el huso mitótico de células
MDA-MB-231. Panel A, control (sin
fármaco); Panel B, DIME 1 \muM durante 18 h; Panel C, DIME 1
\muM durante 5 días.
La Fig. 18 muestra un ensayo óptico para la
unión de microtúbulos (polimerización de MTP). La concentración de
GTP era 1 \muM (curva derecha) y el efecto de DIME 4 \muM se
ilustra en la curva izquierda. Las otras condiciones eran las mismas
que las descritas en la leyenda de la Tabla 13.
La Fig. 19 muestra el efecto de aumentar la
concentración de DIME en la velocidad lineal inicial de
polimerización de MTP. La concentración de GTP era 1 mM, las otras
condiciones eran idénticas a las dadas en la leyenda de la Tabla
13.
La Fig. 20 muestra el análisis de
Michaelis-Menten del efecto de DIME 1 \muM
(círculos negros) en la velocidad lineal inicial de polimerización
de MTP como función de la concentración de GTP (círculos blancos,
sin fármaco). Las otras condiciones eran las mismas que las
descritas en la leyenda de la Tabla 13.
Tal como se usa en el presente documento:
"Alquilo" se refiere a un radical
hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada o cíclico saturado. Los
grupos alquilo típicos incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo,
ciclopropilo, butilo, isobutilo, ciclobutilo, terc-butilo,
pentilo, hexilo.
"Alquenilo" se refiere a un radical
hidrocarbonado de cadena lineal, ramificada o cíclico insaturado que
tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. El
radical puede estar en la conformación cis o trans
respecto al doble enlace(s). Los grupos alquenilo típicos
incluyen etenilo, propenilo, isopropenilo, ciclopropenilo, butenilo,
isobutenilo, ciclobutenilo, terc-butenilo, pentenilo,
hexenilo.
"Alquinilo" se refiere a un radical
hidrocarbonado de cadena lineal, ramificada o cíclico insaturado que
tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Los
grupos alquinilo típicos incluyen etinilo, propinilo, butinilo,
isobutinilo, pentinilo, hexinilo.
"Alcoxi" se refiere a un radical -OR,
en el que R es alquilo, alquenilo o alquinilo, como se ha definido
antes.
"Halógeno" se refiere a sustituyentes
flúor, cloro, bromo y yodo.
"Mamífero" se refiere a animales o
seres humanos.
"Sales farmacéuticamente aceptables"
se refiere a las sales de compuestos que retienen la eficacia y
propiedades biológicas de las bases libres y que se obtienen por
reacción de ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido
bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido
metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido
p-toluenosulfónico, ácido salicílico. Las sales
farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de metales
alcalinos tales como sodio y potasio, sales alcalinotérreas y sales
de amonio.
"Farmacóforo" se refiere a la
disposición tridimensional crítica de los restos moleculares o
fragmentos (o la distribución de la densidad electrónica) que es
reconocida por un receptor (Burger's Medicinal Chemistry and Drug
Discovery Vol. I: Principles and Practice 619, 5th Edition, John
Wiley & Sons; New York).
"Cantidad terapéuticamente eficaz" se
refiere a una cantidad de un compuesto o composición eficaz para
reducir, suprimir o invertir el crecimiento celular maligno o dar
como resultado la mejora de los síntomas asociados con enfermedades
cancerosas.
La presente invención se refiere a medicamentos
para tratar tumores malignos y cánceres en mamíferos con análogos de
tiroxina que se caracterizan por estar desprovistos de actividad
hormonal importante. Preferiblemente la presente invención se basa,
en parte, en el descubrimiento sorprendente de que algunos análogos
de tiroxina que no presentan actividad hormonal son inhibidores
potentes, selectivos y no tóxicos del crecimiento del tumor maligno.
El análogo de tiroxina preferido se denomina en el presente
documento DIME.
La tiroxina, un aminoácido de la glándula
tiroides (Merck Index, 1989, 9348:1483) y los análogos
de tiroxina son bien conocidos en la técnica. Está bien establecido
en la bibliografía que las hormonas tiroideas, específicamente las
tiroxinas T3 y T4, tienen dos tipos distintos de acciones
biológicas: una en el metabolismo celular, y la segunda en la
diferenciación y desarrollo celular (Jorgensen, 1978, "Thyroid
Hormones and Analogues II. Structure-Activity
Relationships", En: Hormonal Proteins and Peptides, Vol.
VI, pp. 107-204, C.H. Li. ed., Academic Press, NY).
Por ejemplo, la tiroxina suprime la captación de yodo por el
tiroides (Money y col., 1959, "The Effect of Various Thyroxine
Analogues on Suppression of Iodine-131 Uptake by the
Rat Thyroid", Endocrinology 64:123-125) e
induce la diferenciación celular según se ha estudiado en la
metamorfosis del renacuajo (Money y col., 1958, "The Effect of
Change in Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on the
Metamorphosis of Rana Pipiens Tadpoles", Endocrinology
63:20-28). Adicionalmente, la tiroxina y algunos
análogos de tiroxina reducen el crecimiento de tumores tirotrópicos
pituitarios no malignos en el ratón (Kumaoka y col., 1960, "The
Effect of Thyroxine Analogues on a Transplantable Mouse Pituitary
Tumor", Endocrinology 66:32-38; Grinberg y
col., 1962, "Studies with Mouse Pituitary Thyrotropic Tumors. V.
Effect of Various Thyroxine Analogs on Growth and Secretion",
Cancer Research 22: 835-841).
Los requisitos estructurales de la tiroxina y
análogos de tiroxina para la estimulación metabólica e inducción de
la diferenciación celular no son idénticos (véase Jorgensen, 1978,
"Thyroid Hormones and Analogues II.
Structure-Activity Relationships", En:
Hormonal Proteins and Peptides, Vol. VI, p. 150, C.H. Li,
ed., Academic Press, NY). Por ejemplo, Money y col. han encontrado
que no hay correlación entre la supresión de la captación de yodo
por el tiroides y la inducción de la metamorfosis del renacuajo
(Money y col., 1958, "The Effect of Change in Chemical Structure
of Some Thyroxine Analogues on the Metamorphosis of Rana Pipiens
Tadpoles", Endocrinology 63:20-28).
Basándose en estas observaciones, se puede
imaginar que respuestas celulares todavía sin identificar pueden ser
alteradas o inducidas por algunos análogos de tiroxina que no
presentan ninguno de los modos de acción (metabólico o de
diferenciación) presentados por la tiroxina T3 y T4.
Los análogos de tiroxina útiles en la presente
invención son compuestos que tienen la fórmula estructural:
y sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos, en la
que:
X = O, S, CH_{2}, carboxi o está ausente;
Y = O o S;
R_{1} = metilo o etilo;
R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se selecciona
cada uno independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxi, alcoxi
(C_{1}-C_{4}) y halógeno; y
R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} se selecciona
cada uno independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxi, alcoxi
(C_{1}-C_{4}), halógeno, NO_{2} y
NH_{2}.
En una realización preferida, los análogos de
tiroxina útiles en los procedimientos de la presente invención son
compuestos que tienen la fórmula estructural:
y sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos en la
que:
X = O, S, CH_{2}, carboxi o está ausente;
Y = O o S;
R_{1} = metilo o etilo;
R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se selecciona
cada uno independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxi, alcoxi
(C_{1}-C_{4}) y halógeno; y
R_{7} y R_{8} se selecciona cada uno
independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxi, alcoxi
(C_{1}-C_{4}), halógeno, NO_{2} y NH_{2}. En
una realización particularmente preferida, el análogo de tiroxina es
el
3,5-diyodo-4-(4'-metoxi-fenoxi)benzoato
de metilo ("DIME").
Los análogos de tiroxina tales como DIME han sido
descritos en la bibliografía. Sin embargo, a diferencia de la
tiroxina, se ha publicado que DIME no tiene actividad metabólica o
de diferencia celular importante (según se determinó por la
metamorfosis del renacuajo) (Money y col., 1958, "The Effect of
Change in Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on the
Metamorphosis of Rana Pipiens Tadpoles", Endocrinology
63:20-28; Stasilli y col., 1959, "Antigoitrogenic
and Calorigenic Activities of Thyroxine Analogues in Rats",
Endocrinology 64:62-82). Por ejemplo, la
captación de yodo en el tiroides de ratas es inhibido sólo
ligeramente (15%) por DIME comparado con la tiroxina (Money y col.,
1959, "The Effect of Various Thyroxine Analogues on Suppression of
Iodine-131 Uptake by the Rat Thyroid",
Endocrinology 64:123-125). Además, se ha
publicado que DIME no tiene actividad inhibidora frente al
crecimiento de un adenoma de pituitaria de ratón no maligno (Kumaoka
y col., 1960, "The Effect of Thyroxine Analogues on a
Transplantable Mouse Pituitary Tumor", Endocrinology
66:32-38; Grinberg y col., 1962, "Studies with
Mouse Pituitary Thyrotropic Tumors. V. Effect of Various Thyroxine
Analogs on Growth and Secretion". Cancer Research
22:835-841). No se han publicado estudios con
células malignas.
Ahora se ha descubierto que algunos análogos de
tiroxina que no tienen actividad hormonal importante,
particularmente DIME, no sólo inhiben el crecimiento de una variedad
de tipos de células malignas (véase la Tabla 3), si no que inducen
la apoptosis de células tumorales precedida también por la
micronucleación. Estas actividades citostáticas y citocidales son
sensibles a la estructura. El ensayo de trece análogos estructurales
y homólogos de DIME indica que incluso las alteraciones menores del
éster de metilo y los sustituyente 4'-metoxi
convierten a la molécula en completamente inactiva. Mientras que
DIME es muy activo tanto en los ensayos celulares como in
vivo, los homólogos 4'-propoxi y éster de etilo
son completamente inactivos. Por consiguiente, DIME define una
disposición crítica de los restos moleculares o un farmacóforo que
tiene actividad citostática y citocidal específica, y por
consiguiente potencial quimioterapéutico importante.
Sin querer limitarse por la teoría, se cree que
el modo de acción molecular más probable de los análogos de tiroxina
descritos en el presente documento es la inhibición del ciclo
celular e inducción de la apoptosis.
El avance de las células eucariotas a través del
ciclo de división celular está controlado principalmente por la
actividad de las proteína quinasas dependientes de ciclina. El
suceso mejor estudiado es la transición de la fase G2 a la M, que es
controlada por la quinasa cdc2 que forma complejo con la ciclina B
(para una revisión véase, Dunphy, 1994, Trends Cell. Biol.
4:202-207). La activación de la quinasa cdc2
requiere la fosforilación, un proceso que es regulado por la
proteína fosfatasa 2A (para una revisión véase, Wera & Hennings,
1995, Biochem. J. 311:17-29).
Se ha descubierto que los análogos de tiroxina
descritos en el presente documento ejercen una activación específica
de la proteína fosfatasa 2A tanto in vitro como in
vivo. In vivo, la activación de la proteína fosfatasa 2A
coincide con la inhibición de la quinasa cdc2 y desfosforilación de
la MAP quinasa y topoisomerasa II, convirtiendo a estas dos últimas
enzimas en inactivas. DIME no tiene acción metabólica, ni inhibe las
rutas biosintéticas del ADN, ARN o proteínas. Por lo tanto, el modo
de acción más probable es la inhibición del ciclo celular y la
inducción de la apoptosis por la desfosforilación de estas proteínas
reguladoras críticas. Por consiguiente, la activación de la
fosfatasa 2A y la inhibición simultánea de la quinasa cdc2 es un
objetivo terapéutico poderoso e importante para el tratamiento del
cáncer.
Aunque parece que las alteraciones del éster y
las posiciones 4' afectan significativamente a la eficacia de DIME;
los análogos de tiroxina útiles para reducir el crecimiento de
tumores malignos y tratar el cáncer no se limitan a DIME. Por
ejemplo, el homólogo 4'-etoxi presenta
aproximadamente 25-30% de la acción citocidal máxima
en células de cáncer humano comparado con el DIME (Ejemplo 4).
También se espera que DIME se pueda sustituir en las posiciones del
anillo aromático o en el oxígeno del puente sin pérdida importante
de la actividad.
Se sabe que los anillos aromáticos de la tiroxina
no están en el mismo plano (Jorgensen, 1978, "Thyroid Hormones and
Analogues II. Structure-Activity Relationships",
In: Hormonal Proteins and Peptides, Vol. VI, pp.
107-204, C.H. Li, ed., Academic Press, NY). También
se sabe que las posiciones de los anillos de ambos anillos
aromáticos en la tiroxina pueden estar sustituidas con una variedad
de sustituyentes, incluyendo grupos alquilo, halógeno, nitro y
amino, sin variar el grado de retención de la actividad hormonal
(Ibíd.). Además, el oxígeno del éster que conecta los anillos
puede estar ausente, o se puede sustituir por una variedad de grupos
o átomos que no confinen a los anillos aromáticos al mismo plano,
tal como por ejemplo, un grupo metileno, un grupo carboxilo o
azufre, sin pérdida importante de la actividad hormonal
(Ibíd.). Por consiguiente se espera y es previsible que
sustituciones similares en DIME no afecten a la pérdida importante
de actividad anticancerígena. Es significativo que el análogo
2'-cloro de DIME presenta aproximadamente 25% de la
acción inhibidora máxima en el crecimiento de células cancerígenas
humanas comparado con DIME (Ejemplo 5).
Debido a la estricta correlación entre la
eficacia in vitro e in vivo (véase los Ejemplos
2-7), los compuestos eficaces útiles en los
procedimientos de la invención se pueden identificar
convenientemente en el ensayo de pruebas de selección in
vitro. Dichas pruebas pueden seleccionar la capacidad de un
compuesto particular para activar la proteína fosfatasa 2A, como se
describe en los Ejemplos 2-3. Típicamente, los
compuestos útiles en los procedimientos de la presente invención
aumentarán la actividad de la proteína fosfatasa 2A en un factor de
aproximadamente dos a tres, medido por el ensayo descrito en el
Ejemplo 2 ó 3.
Dichas pruebas también pueden seleccionar la
capacidad de un compuesto particular para inhibir el crecimiento de
células tumorales malignas in vitro o in vivo, o
suprimir la tumorigenicidad de células malignas, como se describe en
los Ejemplos 4-6. En general, los compuestos activos
útiles en los procedimientos de la presente invención presentarán
una I_{50} (concentración de compuesto letal para el 50% de un
cultivo celular comparado con un cultivo control) en el intervalo de
aproximadamente 0,5 \mum a 5,0 \mum, medido por el ensayo
descrito en el Ejemplo 4.
Como observarán los expertos en la técnica, se
pueden usar muchas variedades de cultivos de células tumorales
malignas y líneas celulares para seleccionar la actividad,
incluyendo, pero sin limitar, HL-60,
HT-144, E-ras-20,
DU-145, MDA-168,
MCF-7, 855-2 y
MDA-MB-231. Por supuesto, también se
pueden usar otros ensayos in vitro y/o in vivo, como
entenderán los expertos en la técnica, para seleccionar la actividad
antitumoral y/o anticancerígena, para identificar análogos de
tiroxina eficaces, útiles en la presente invención.
Las fórmulas químicas a las que se hace
referencia en el presente documento presentan el fenómeno de la
tautomería e isomería conformacional. Cuando los dibujos de las
fórmulas en esta memoria descriptiva solo pueden representar uno de
las posibles formas tautómeras o isómeras conformacionales, se debe
entender que la invención abarca cualesquiera formas tautómeras e
isómeras conformacionales que presentan actividades biológicas o
farmacológicas similares a DIME, como se describe en el presente
documento.
Además de los compuestos descritos antes y sus
sales farmacéuticamente aceptables, la invención puede usar, cuando
sea aplicable, formas solvatadas así como no solvatadas de los
compuestos (por ejemplo, formas hidratadas).
Los compuestos descritos en el presente documento
se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido que sea
aplicable a la preparación de compuestos químicos. Se ilustran
procedimientos adecuados mediante ejemplos representativos. Los
materiales de partida necesarios se pueden obtener por
procedimientos estándar de la química orgánica.
Los análogos de tiroxina descritos en el presente
documento son útiles para tratar una amplia variedad de cánceres.
Dichos cánceres incluyen, a modo de ejemplo y sin limitar,
carcinomas tales como cánceres de faringe, colon, rectal,
pancreático, estómago, hígado, pulmón, pecho, piel, próstata,
ovario, cervical, útero y vejiga; leucemias; linfomas; gliomas;
retinoblastomas; y sarcomas.
En una realización preferida de la invención, el
cáncer está asociado con la formación de tumores sólidos,
incluyendo, a modo de ejemplo y sin limitar, cánceres de mama y
próstata.
Un análogo de tiroxina útil en la presente
invención se puede administrar a un paciente humano por sí mismo, en
forma de una sal farmacéuticamente aceptable, o en forma de una
composición farmacéutica en la que el compuesto se mezcla con
vehículos o excipiente(s) adecuados en una cantidad
terapéuticamente eficaz, es decir, con dosis eficaces para reducir o
suprimir el crecimiento de células malignas o dar como resultado la
mejora de síntomas asociados con enfermedades cancerosas.
Los análogos de tiroxina y las composiciones
farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden
administrar por una variedad de vías. Las vías de administración
adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal
transmucosa, o intestinal; suministro parenteral, incluyendo
inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como
inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas,
intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Alternativamente, se puede administrar el
compuesto de una forma local más que sistémica, por ejemplo,
mediante inyección del compuesto directamente en un tumor sólido, a
menudo en una formulación de depósito o de liberación sostenida.
Además, se puede administrar el compuesto en un
sistema de liberación de fármaco dirigida, por ejemplo, en un
liposoma recubierto con un anticuerpo específico del tumor. Los
liposomas serán dirigidos y absorbidos selectivamente por el
tumor.
En una realización preferida, los análogos de
tiroxina y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente
documento se administran por vía oral.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el
presente documento se pueden preparar de una forma conocida por sí
misma, por ejemplo, mediante procedimientos de mezcla, disolución,
granulación, formación de gragea, pulverización, emulsión,
encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales.
Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas
para usar de acuerdo con la presente invención se pueden formular de
forma convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente
aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares que
facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las
preparaciones que se pueden usar de forma farmacéutica. La
formulación adecuada depende de la vía de administración
elegida.
Para inyección, los agentes de la invención se
pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones
fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución
de Ringer, o tampón salino fisiológico. Para la administración
transmucosa, se usan en la formulación agentes de penetración
adecuados para la barrera que debe ser permeable. Dichos agentes de
penetración en general son conocidos en la técnica.
Para administración oral, los compuestos se
pueden formular fácilmente por combinación con vehículos
farmacéuticamente aceptables que son conocidos en la técnica. Dichos
vehículos permiten que los compuestos se formulen como comprimidos,
píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones
y similares, para la ingestión oral por el paciente que se va a
tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden
obtener mezclando los compuestos con un excipiente sólido,
opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la
mezcla de gránulos, después de añadir agentes auxiliares adecuados,
si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los
excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como
azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol;
preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz,
almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina,
goma de tragacanto, metilcelulosa,
hidroxipropilmetil-celulosa,
carboximetil-celulosa sódica, y/o
polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes
disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o
ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato sódico.
Los núcleos de grageas se proporciona con
recubrimientos adecuados. Para este propósito se pueden usar
soluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden contener
goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol,
polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de barniz, y
disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden
añadir colorantes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o
grageas para identificar o caracterizar diferentes combinaciones de
dosis de compuesto activo. Las preparaciones farmacéuticas que se
pueden usar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste suave hechas de
gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un
plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste
suave pueden contener los principios activos mezclados con una carga
tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes
tales como talco o estearato magnésico, y opcionalmente
estabilizantes. En las cápsulas blandas los compuestos activos se
pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como
aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos.
Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones
para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas
para dicha administración.
Para administración bucal, las composiciones
pueden tener forma de comprimidos o pastillas formulados de forma
convencional.
Para la administración por inhalación, los
compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se
suministran convenientemente en forma de una presentación de
pulverizador de aerosol de envases presurizados o un nebulizador,
usando un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano,
triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u
otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de
dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para
liberar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo
de gelatina, para usar en un inhalador o insuflador, se pueden
formular para que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una
base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos se pueden formular para
administración parenteral, por ejemplo, por inyección de bolo o
infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden
presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en
ampollas o en envases de múltiples dosis, con un conservante
añadido. Las composiciones pueden tener formas tales como
suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o
acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes
de suspensión, estabilizantes y/o de dispersión.
Las formulaciones farmacéuticas para
administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los
compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las
suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como
suspensiones aceitosas para inyección adecuadas. Los disolventes o
vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como
aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como
oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones
acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la
viscosidad de la suspensión, tales como
carboximetil-celulosa sódica, sorbitol, o dextrano.
Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes
adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos
para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.
\newpage
Alternativamente, el principio activo puede estar
en forma de polvo para reconstituir con un vehículo adecuado, por
ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de usar.
Los compuestos también se pueden formular en
composiciones rectales tales como supositorios o enemas de
retención, que contienen, por ejemplo, bases para supositorios
convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además, de las formulaciones descritas
previamente, los compuestos también se pueden formular en forma de
preparación de depósito. Dichas formulaciones de actuación
prolongada se pueden administrar por implante (por ejemplo
subcutáneo o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por lo
tanto, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales
polímeros o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en forma de una
emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o
como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco
soluble.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable para los
compuestos hidrófobos de la invención es un sistema de codisolvente
que comprende alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un
polímero orgánico miscible con agua, y una fase acuosa. El sistema
de codisolvente puede ser el sistema de codisolvente de VPD. VPD es
una solución de 3% de alcohol bencílico (peso/vol), 8% (peso/vol)
del tensioactivo no polar polisorbato 80, y 65% (peso/vol) de
polietilenglicol 300, y el volumen completado con etanol absoluto.
El sistema de codisolvente de VDP (VPD:5W) consiste en VPD diluido
1:1 con dextrosa al 5% (peso/vol) en solución acuosa. Este sistema
de codisolvente disuelve bien compuestos hidrófobos, y produce una
baja toxicidad por administración sistémica. Naturalmente, las
proporciones de un sistema de codisolvente pueden variar
considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y
toxicidad. Además, la identidad de los componentes del codisolvente
pueden variar: por ejemplo, se pueden usar otros tensioactivos no
polares de baja toxicidad en lugar de polisorbato 80; se puede
variar el tamaño de la fracción del polietilenglicol; otos polímeros
biocompatibles pueden sustituir al polietilenglicol, por ejemplo,
polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden
sustituir a la dextrosa.
Alternativamente, se pueden usar otros sistemas
de suministro para los compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los
liposomas y las emulsiones son ejemplos conocidos de vehículos o
excipientes de suministro para fármacos hidrófobos. También se
pueden usar algunos disolventes orgánicos tales como
dimetilsulfóxido, pero normalmente con el coste de una mayor
toxicidad. Adicionalmente, los compuestos se pueden suministrar
usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices
semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el
agente terapéutico. Se han establecido varios tipos de materiales de
liberación sostenida y son conocidos por los expertos en la técnica.
Dependiendo de su naturaleza química, las cápsulas de liberación
sostenida pueden liberar el compuesto durante unas semanas hasta
alrededor de 100 días.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
comprender vehículos o excipientes en fase sólida o de gel. Los
ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, pero no se
limitan carbonato cálcico, fosfato cálcico, diferentes azúcares,
almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como
polietilenglicoles.
Otras formulaciones adecuadas para administrar
los análogos de tiroxina descritas en el presente documento serán
evidentes para los expertos en la técnica, y se pueden encontrar por
ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack
Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
usar en la presente invención incluyen composiciones en las que los
principios activos están contenidos en una cantidad terapéuticamente
eficaz. El experto en la técnica determinara la cantidad eficaz,
especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en
el presente documento.
Para cualquier compuesto usado en el
procedimiento de la invención, se puede calcular una dosis
terapéuticamente eficaz inicialmente a partir de los ensayos de
cultivo celular. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos
de animales para alcanzar un intervalo de concentración en la
circulación que incluya la I_{50} determinada en el cultivo
celular (es decir, la concentración de compuesto de ensayo que es
letal para el 50% de un cultivo celular) o la I_{100} determinada
en cultivo celular (es decir, la concentración de compuesto que es
letal para el 100% de un cultivo celular). Dicha información se
puede usar para determinar de forma más precisa las dosis útiles en
seres humanos. También se pueden formular dosificaciones iniciales
comparando la eficacia de los análogos de tiroxina descritos en el
presente documento en ensayos de cultivo celular con la eficacia de
los fármacos anticancerígenos conocidos tales como la vincristina.
En este procedimiento, se puede obtener una dosificación inicial
multiplicando la relación de concentraciones eficaces obtenidas en
el ensayo de cultivo celular para el análogo de tiroxina y un
fármaco anticancerígeno conocido por la dosificación eficaz del
fármaco anticancerígeno conocido. Por ejemplo, si un análogo de
tiroxina es dos veces más eficaz en el ensayo de cultivo celular que
la vincristina (es decir, la I_{50}^{DIME} es igual a la mitad
de I_{50}^{vincristina} en el mismo ensayo), una dosificación
eficaz inicial del análogo de tiroxina sería la mitad de la
dosificación conocida para la vincristina. Usando esta guía inicial
un experto en la técnica podría determinar una dosificación eficaz
en seres humanos.
Las dosificaciones iniciales también se pueden
calcular a partir de datos in vivo.
Por ejemplo, se ha encontrado que 250 mg/kg
administrados por alimentación oral una vez al día, 5 días a la
semana durante 32 días, reducen significativamente el crecimiento de
xenoinjertos de cáncer de mama
(MDA-MB-231) en ratones sin sistema
inmune (véase el Ejemplo 7.3). Los estudios también han mostrado que
DIME tiene una semivida (t_{1/2}) en el suero de aproximadamente
2-2,5 horas, y está biodisponible en un 87% por
administración per os (véase el Ejemplo 7.2). Un experto en la
técnica pude optimizar fácilmente la administración a seres humanos
basándose en estos datos.
La cantidad e intervalo de dosificación se pueden
ajustar individualmente para proporcionar niveles del compuesto
activo en el plasma que sean suficientes para mantener el efecto
terapéutico. Las dosificaciones habituales para pacientes para
administración oral, están en el intervalo de aproximadamente
50-2000 mg/kg/día, normalmente aproximadamente
250-1000 mg/kg/día, preferiblemente aproximadamente
500-700 mg/kg/día y más preferiblemente
aproximadamente 350-550 mg/kg/día. Preferiblemente,
los niveles en el suero terapéuticamente eficaces se alcanzarán
mediante la administración de múltiples dosis cada día.
En los casos de administración local o captación
selectiva, es posible que la concentración local eficaz del fármaco
no esté relacionada con la concentración en el plasma. Un experto en
la técnica podrá optimizar las dosificaciones locales
terapéuticamente eficaces sin excesiva experimentación.
La cantidad de composición administrada, por
supuesto, dependerá del sujeto que se está tratando, del peso del
sujeto, de la gravedad de la afección, de la forma de
administración, y del criterio del médico que prescribe.
La quimioterapia se puede repetir de forma
intermitente mientras los tumores son detectables o incluso cuando
no son detectables. Además, debido a su aparente falta de toxicidad
(se discute a continuación), la terapia se puede proporcionar sola o
combinada con otros fármacos anticancerígenos u otros fármacos,
tales como por ejemplo AZT, antiinflamatorios, antibióticos,
corticoesteroides, vitaminas y similares.
Se espera y es previsible una posible sinergia
entre los análogos de tiroxina descritos en el presente documento y
otros fármacos. Además también se espera y es previsible la posible
sinergia entre una pluralidad de análogos de tiroxina.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de los
análogos de tiroxina descritos en el presente documento se pueden
determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos
celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la
DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la
DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la
población). La relación entre el efecto tóxico y terapéutico de la
dosis es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación
entre la DL_{50} y la DE_{50}. Se prefieren los compuestos que
presentan índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estos
ensayos en cultivos celulares y estudios con animales se pueden usar
para formular un intervalo de dosificación que no sea tóxico para
usar en un ser humano. La dosificación de dichos compuestos
preferiblemente está dentro de un intervalo de concentraciones en la
circulación que incluyen la DE_{50} con poca o sin toxicidad. La
dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la
forma de dosificación usada y la vía de administración usada. La
formulación exacta, vía de administración y dosificación pueden ser
elegidas por el propio médico en vista del estado del paciente
(véase, por ejemplo, Fingl y col., 1975, En: The Pharmacological
Basis of Therapeutics, Cap. 1, pág. 1).
Una de las ventajas, entre otras, de usar los
análogos de tiroxina descritos en el presente documento para tratar
el cáncer es su falta de toxicidad. Por ejemplo, se ha encontrado
que una dosis oral diaria de 1 g/kg administrada durante
12-15 días no producía efectos adversos en ratones
sin sistema inmune (véase el Ejemplo 7.1). Puesto que la semivida
(t_{1/2}) en el suero i.v. de DIME es aproximadamente
2-2,5 horas, son previsibles las dosificaciones
diarias repetidas de los análogos de tiroxina descritos en el
presente documento sin efectos adversos.
Tras describir la invención, se proporcionan los
siguientes ejemplos para ilustrar la invención.
Ejemplo
1
Se sintetizaron, purificaron y caracterizaron
catorce análogos de tiroxina. A continuación en la Tabla 1 se
proporciona un resumen de la estructura de cada compuesto
sintetizado y datos físicos seleccionados.
| ref: El compuesto b se preparó de acuerdo con Borrows y col., J. Chem. Soc., 1949:S185-S190 | |
| b: Temperatura de descomposición |
El
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo (Compuesto 1) se preparó como describen Borrows y col.,
1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I.
The Preparation of Thyrosine and Some of its Derivatives, and a New
Route to Thyroxine", J. Chem. Soc. 1949 (Supp. Issue Nº
1): S185-S190, y se recristalizó en etanol al 95%.
Punto de fusión: 153-155ºC.
Espectro de masas: FAB, m/z (intensidad
relativa): 510 (M^{+}, 100), 479 (4,5), 384 (4,5). Datos de alta
resolución para el pico M^{+}: calculado para
C_{15}H_{12}I_{2}O_{4}, 509,882513; encontrado, 509,882960,
pico: calculado para C_{15}H_{12}I_{2}O_{4}, 509,882513;
encontrado, 509,882960 (desviación = -0,9 ppm).
Espectro de RMN ^{1}H en
DMSO-d_{6} (valores \delta (ppm) respecto al
TMS): 3,719 (3H, singlete), 3,876 (3H, singlete), 6,693 (2H,
doblete, J = 9,45Hz, más desdoblamiento fino), 6,845 (2H, doblete, J
= 9,36Hz, más desdoblamiento fino), 8,390 (2H, singlete).
El
3,5-diyodo-4-(4'-etoxifenoxi)benzoato
de metilo (Compuesto 2) se sintetizó usando la metodología general
de Borrows, y col., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related
Substances. Part I. The Preparation of Thyrosine and Some of its
Derivatives, and a New Route to Thyroxine", J. Chem. Soc.
1949 (Supp. Issue Nº 1): S185-S190.
En un matraz de 50 ml a temperatura ambiente, se
agitó 4-etoxi-fenol (Aldrich) (1492
mg, 10,8 mmoles) con KOH acuoso 2,0 M (5,50 ml) para formar el
4-etoxifenolato potásico. Se añadió el
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
de metilo (Ullmann, 1909, Annalen der Chemie
366:92-93; fuente comercial: Spectrum chemical
Company, Gardena, CA; 2606 mg, 10,0 mmoles), y la mezcla se calentó
a reflujo durante 1 hora y se enfrió en un baño de hielo, después de
lo cual se depositó una masa gomasa del producto. Se añadió KOH
acuoso 1,0 M (20 ml) frío, y con enfriamiento continuado el producto
solidificó. El sólido amarillo-naranja se rompió, se
recogió en un filtro con succión, se aclaró con agua y se secó. El
material (3,08 g) se recristalizó en etanol al 95% caliente (50 ml)
para dar 2,56 g (70,6% de rendimiento) del
3,5-dinitro-4-(4'-etoxifenoxi)benzoato
de metilo. Punto de fusión: 101-103ºC.
Espectro de masas (EI): M^{+} en alta
resolución: calculado para C_{16}H_{14}N_{2}O_{8}:
362,075016; encontrado, 362,074793 (desviación = 0,6 ppm).
Una parte (724,4 mg, 2,00 mmoles) del
3,5-dinitro-4-(4'-etoxifenoxi)benzoato
de metilo se disolvió en ácido acético glacial (50 ml), se mezcló
con catalizador de paladio sobre carbón al 10% (Aldrich) (200 mg) en
un minirreactor Parr Modelo 4561, cargado con una atmósfera de
H_{2} (3,01 kg/cm^{2}) y se agitó rápidamente a temperatura
ambiente hasta que la presión disminuyó debido al cese de la
reacción (6 minutos, 1,12 kg/cm^{2} final). La mezcla se filtró
inmediatamente a través de un lecho de celita para separar el
catalizador y se evaporó el disolvente ácido acético en un rotavapor
para dar un residuo marrón aceitoso que representaba el derivado de
3,5-diamina bruto. La diamina bruta se disolvió en
ácido acético glacial (6,0 ml) y se tetraazotizó por adición gota a
gota en un periodo de 3 minutos, de una solución de nitrito sódico
agitada y enfriada con hielo (345 mg, 5 mmoles) en ácido sulfúrico
concentrado (3,5 ml). Después de agitar durante 30 minutos a la
temperatura del baño de hielo, la mezcla viscosa se pipeteó a una
solución de yoduro potásico (3,0 g) en agua destilada (2,5 ml)
rápidamente agitada a temperatura ambiente. La mezcla oscura se
agitó durante 30 minutos, y finalmente se calentó a 70ºC durante 5
minutos. La mezcla se vertió en acetato de etilo (100 ml) y se
añadió agua (50 ml). La mezcla de dos fases se transfirió a un
embudo de separación, se añadieron acetato de etilo (50 ml) y agua
(50 ml) adicionales, y el producto se extrajo en el acetato de
etilo. La capa orgánica (acetato de etilo) se lavó con dos porciones
adicionales de agua (50 ml cada una) y se secó sobre sulfato sódico
anhidro. La posterior eliminación del acetato de etilo por
evaporación dio un residuo alquitranado oscuro.
Este producto bruto se disolvió en acetona (8 ml)
y se purificó por placas de cromatografía de capa fina preparativa
(cinco) (Whatman, gel de sílice, capa de 1000 \mum, 20 cm x 20 cm,
con indicador de fluorescencia). Las placas se desarrollaron en
n-hexano:acetato de etilo:ácido acético (3:1:0,8
vol/vol/vol). La banda del producto (R_{f} = 0,84), visualizada
con luz UV se recogió de las respectivas placas, se juntaron, y se
eluyeron del gel de sílice (soportado en un embudo de vidrio
sinterizado) con acetato de etilo (3 x 50 ml). La separación del
acetato de etilo dio un sólido de color hueso que se cristalizó en
etanol al 95% (10 ml). Rendimiento: 275 mg en total de dos cosechas
de cristales blancos. (26% basado en 2 mmoles del precursor
dinitrado). Punto de fusión: 123-125ºC.
Espectro de masas: EI, m/z (intensidad relativa):
524 (M^{+}, 100), 496 (16,7), 310 (9,1), 242 (6,1), 211 (7,6), 155
(6,1). Datos de alta resolución para el pico M^{+}: calculado para
C_{16}H_{14}I_{2}O_{4}: 523,898163; encontrado, 523,898737
(desviación = -1,1 ppm).
Espectro de RMN ^{1}H en
DMSO-d_{6} (valores \delta (ppm) respecto al
TMS): 1,303 (3H, triplete, J = 6,94Hz), 3,877 (3H, singlete), 3,971
(2H, cuartete, J = 6,95Hz), 6,678 (2H, doblete, J = 8,98Hz, más
desdoblamiento fino), 6,879 (2H, doblete, J = 9,06Hz, más
desdoblamiento fino), 8,389 (2H, singlete).
El
3,5-diyodo-4-(4'-n-propoxifenoxi)benzoato
de metilo (compuesto 3) se preparó como se describe en el Ejemplo
1.2. El precursor dinitrado se sintetizó tratando una solución
acuosa de
4-n-propoxi-fenolato
potásico (preparado a partir del
4-n-propoxi-fenol
comercial) con
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
de metilo. El producto dinitrado se redujo con H_{2}/Pd (C) al
derivado de diamina, que después se tetraazotizó con
NaNO_{2}/H_{2}SO_{4} y se convirtió en el producto de diyodo
por reacción con yoduro potásico (reacción de Sandmeyer). La
purificación se hizo por TLC preparativa y cristalización.
El
3,5-diyodo-4-(4'-n-butoxifenoxi)benzoato
de metilo (Compuesto 4) se preparó como se describe en el Ejemplo
1.2. El precursor dinitrado se sintetizó tratando una solución
acuosa de
4-n-butoxi-fenolato
potásico (preparado a partir del
4-n-butoxi-fenol
comercial) con
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
de metilo. El producto dinitrado se redujo con H_{2}/Pd (C) al
derivado de diamina, que después se tetraazotizó con
NaNO_{2}/H_{2}SO_{4} y se convirtió en el producto de diyodo
por reacción con yoduro potásico (reacción de Sandmeyer). La
purificación se hizo por TLC preparativa y
cristaliza-
ción.
ción.
El
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoato
de etilo (Compuesto 5) se sintetizó por medio del cloruro de
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoilo,
estando descrito éste último por Borrows y col., 1949, J.
Chem. Soc. 1949: S185-S190. Así en un matraz de
10 ml el ácido
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoico
(99,2 mg, 0,200 mmol) se convirtió en el cloruro de
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoilo.
Después de eliminar el exceso de cloruro de tionilo a vacío, se
añadió etanol anhidro (5,0 ml) con agitación, y la mezcla se calentó
a 70ºC durante 5 minutos. El exceso de etanol se separó y el residuo
seco se disolvió en etanol al 95% caliente (4,0 ml), en el que
cristalizó el producto éster en el frigorífico (3ºC). Rendimiento:
55,8 mg (53%) de cristales de color de ante. Punto de fusión:
96-98ºC.
Espectro de masas (EI): Datos de alta resolución
para el pico M^{+}: calculado para C_{16}H_{14}I_{2}O_{4},
523,898163; encontrado, 523,898202 (desviación = -0,1 ppm).
Espectro de RMN ^{1}H en
DMSO-d_{6} (valores \delta (ppm) respecto al
TMS): 1,336 (3H, triplete, J = 7,19Hz), 3,717 (3H, singlete), 4,336
(2H, cuartete J = 7,06Hz), 6,695 (2H, doblete, J = 9,34Hz, más
desdoblamiento fino), 6,895 (2H, doblete, J = 9,20, más
desdoblamiento fino), 8,389 (2H, singlete).
El ácido
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoico
(Compuesto 6) se sintetizó como describen Borrows y col.,
1949; J. Chem. Soc. 1949: S185-S190.
La
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzamida
(Compuesto 7) se sintetizó por amidación del Compuesto 1. En un
matraz de 125 ml se disolvió el
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo (Compuesto 1) (100 mg, 0,196 mmol) en metanol anhidro (60
ml). Se burbujeó amoniaco gaseoso anhidro en la solución durante 5
minutos a una velocidad moderada a temperatura ambiente. Después de
reposar durante 1 hora en el matraz tapado, se repitió el
tratamiento con amoniaco gaseoso (5 minutos) y la mezcla se dejó
reposar en el matraz tapado durante 48 horas. Se separaron el
metanol/amoniaco por evaporación en el rotavapor, el residuo seco se
disolvió en metanol:agua (7:3 vol/vol) (30 ml) y se cristalizó en el
frigorífico (3ºC). Rendimiento: 58,3 mg (60% rendimiento) de
cristales de color de ante. Punto de fusión:
207-209ºC.
Espectro de masas (FAB): Datos de alta resolución
para el pico M^{+}: calculado para
C_{14}H_{11}I_{2}NO_{3}, 494,882847; encontrado, 494,881880
(desviación = 2,0 ppm).
Espectro de RMN ^{1}H en
DMSO-d_{6} (valores \delta (ppm) respecto al
TMS): 3,716 (3H, singlete), 6,682 (2H, doblete, J = 8,93Hz), 6,895
(2H, doblete, J = 8,99Hz), 7,528 (1H, singlete), 8,113 (1H,
singlete), 8,402 (2H, singlete).
La
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)-N-metil-benzamida
(Compuesto 8) se preparó por medio del cloruro de
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoilo
(véase, Ejemplo 1.5). El cloruro de ácido se hizo reaccionar con
exceso de metilamina en tetrahidrofurano a temperatura ambiente (1
hora), se filtró para separar el precipitado de hidrocloruro de
metilamina, se evaporó el disolvente y el producto cristalizó en
etanol al 95%.
La
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifoxi)-N,N-dimetil-benzamida
(Compuesto 9) se preparó por medio del cloruro de
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoilo
(véase, Ejemplo 1.5). El cloruro de ácido se hizo reaccionar con
exceso de metilamina en tetrahidrofurano a temperatura ambiente (1
hora), se filtró para separar el precipitado de hidrocloruro de
metilamina, se evaporó el disolvente y el producto cristalizó en
etanol absoluto.
El
3,5-diyodo-4-(4'-hidroxifenoxi)-benzoato
de metilo (compuesto 10) se preparó como se describe en el Ejemplo
1.2. El precursor dinitrado se preparó haciendo reaccionar el
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
con hidroquinona en solución de piridina como describen Borrows y
col., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related
Substances. Part II. The Preparation of Dinitrodiphenyl Ethers",
J. Chem. Soc. 1949 (Supp. Issue Nº 1):
S190-S199.
El
3,5-diyodo-4-fenoxibenzoato
de metilo (Compuesto 11) se preparó como se describe en el Ejemplo
1.2. El precursor dinitrado se sintetizó tratando una solución
acuosa de fenolato potásico (preparado a partir de fenol comercial)
con
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
de metilo. El producto dinitrado se redujo con H_{2}/Pd(C)
al derivado de diamina, que después se tetraazotizó con
NaNO_{2}/H_{2}SO_{4} y se convirtió en el producto de diyodo
por reacción con yoduro potásico (reacción de Sandmeyer). La
purificación se hizo por TLC preparativa y cristalización.
El
3,5-diyodo-4-(4'-yodofenoxi)benzoato
de metilo (Compuesto 12) se sintetizó como se describe en el Ejemplo
1.2. Puesto que el sustituyente yodo en el precursor dinitrado es
por sí mismo lábil respecto a la reducción con H_{2}/Pd(C),
el precursor yodo-dinitrado se redujo a la
yodo-diamida con hierro en polvo en ácido
acético/etanol al 95% (véase Gemmill y col., 1956,
"3-Iodo-, 3,3'-Diiodo- and
3,3'-Diiodo-5-bromothyroxine",
J. Am. Chem. Soc. 78:2434-2436). Después, la
yodo-diamina se tetraazotizó y se convirtió en el
producto de triyodo usando la reacción de Sandmeyer. Después de
purificación por TLC preparativa, el producto (p.f.
139-141ºC) se cristalizó en etanol.
Espectro de masas (EI): Datos de alta resolución
para el pico M^{+}: calculado para C_{14}H_{9}O_{3}I_{3},
605,768600; encontrado, 605,767839 (desviación = 1,3 ppm).
Espectro de RMN ^{1}H en
DMSO-d_{6} (valores \delta (ppm) respecto al
TMS): 3,879 (3H, singlete), 6,628 (2H, doblete, J = 8,97 Hz más
desdoblamiento fino), 7,670 (2H, doblete, J = 9,12 Hz más
desdoblamiento fino), 8,396 (2H, singlete).
El
3,5-diyodo-4-(3'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo (Compuesto 13) se sintetizó como se describe en el Ejemplo
1.2. El precursor dinitrado se sintetizó tratando una solución
acuosa de 3-metoxi-fenolato potásico
(preparado a partir de 3-metoxifenol comercial) con
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
de metilo. El producto dinitrado se redujo con H_{2}/Pd(C)
al derivado de diamina, que después se tetraazotizó con
NaNO_{2}/H_{2}SO_{4} y se convirtió en el producto de diyodo
por reacción con yoduro potásico (reacción de Sandmeyer). La
purificación se hizo por TLC preparativa y
cristaliza-
ción.
ción.
El
3,5-diyodo-4-(2'-cloro-4'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo (Compuesto 14) se sintetizó por la metodología general
descrita en el Ejemplo 1.2, pero con un procedimiento alternativo
para la reducción del precursor dinitrado.
El precursor dinitrado se preparó haciendo
reaccionar el
2-cloro-4-metoxifenol
(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) en forma del
2-cloro-4-metoxifenolato
potásico con el
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
de metilo, como se describe en el Ejemplo 1.2.1. El producto
3,5-dinitro-4-(2'-cloro-4'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo (66% rendimiento) se cristalizó en etanol para dar
cristales naranjas. Punto de fusión: 116-119ºC.
Espectro de masas (EI): M^{+} con alta
resolución: calculado para C_{15}H_{11}ClN_{2}O_{8},
382,020393; encontrado,
382,020187 (desviación = 0,5 ppm).
382,020187 (desviación = 0,5 ppm).
Puesto que el sustituyente
2'-cloro en el precursor dinitrado es lábil con
respecto a la reducción con H_{2}/Pd(C), el precursor se
redujo a la 2'-cloro-diamina con
hierro en polvo en ácido acético/etanol al 95%, de forma similar al
Ejemplo 1.12. Por lo tanto, en un matraz de 250 ml se disolvió el
3,5-dinitro-4-(2'-cloro-4'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo (765,5 mg, 2,00 mmol) en ácido acético glacial (35 ml) y
etanol al 95% (35 ml), la solución se calentó a 70ºC y se añadió
hierro en polvo (2,00 g). La mezcla se agitó vigorosamente en un
baño de calentamiento (70ºC). Después de 3 min de agitación, la
mezcla desarrolló un color marrón. Se continuó agitando a 70ºC
durante 35 min. Después la mezcla se transfirió a un embudo de
separación, se añadieron agua (250 ml) y acetato de etilo (250 ml),
el producto se extrajo en la capa de acetato de etilo, y se dejó que
la fase de acetato de etilo se separara de la fase acuosa (3 horas).
El extracto se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y el
acetato de etilo se separó por evaporación en el rotavapor para dar
el producto de 3,5-diamino bruto, que
solidificó.
El producto de diamino bruto se disolvió
inmediatamente en ácido acético glacial (6,0 ml), se tetraazotizó y
se convirtió por reacción de Sandmeyer en el
3,5-diyodo-4-(2'-cloro-4'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo como se describe en el Ejemplo 1.2. Después de purificar
por cromatografía en capa fina preparativa (R_{f} = 0,70) como se
describe en el Ejemplo 1.2, el producto se cristalizó en etanol al
95% (250,8 mg de cristales de color hueso, 23% de rendimiento).
Punto de fusión: 132-134ºC.
Espectro de masas: EI, m/z (intensidad relativa):
546 (34), 545 (16), 544 (M^{+}, 100), 418 (6), 382 (6). Datos de
alta resolución para el pico M^{+}: calculado para
C_{15}H_{11}ClI_{2}O_{4}, 543,843541; encontrado, 543,843424
(desviación = 0,2 ppm).
Espectro de RMN ^{1}H en
DMSO-d_{6} (valores \delta (ppm) respecto al
TMS): 3,747 (3H, singlete), 3,881 (3H, singlete), 6,328 (1H,
doblete, J = 8,97Hz), 6,780 (1H, doblete de dobletes, J = 9,10Hz y J
= 2,95Hz), 7,195 (1H, doblete, J = 3,02Hz), 8,400 (2H,
singlete).
Los análogos de tiroxina adicionales descritos en
el presente documento se pueden sintetizar usando las síntesis
descritas anteriormente a partir de los materiales de partida
adecuados, como será fácilmente evidente para los expertos en la
técnica de la química orgánica. Se puede encontrar orientación
adicional en la técnica, particularmente en Borrows y col., 1949,
"The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The
Preparation of Thyrosine and Some of its Derivatives, and a New
Route to Thyroxine", J. Chem. Soc. 1949 (Supp. Issue Nº
1): S185-S190; Borrows y col., 1949, "The
Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part II. The
Preparation of Dinitrodiphenyl Ethers", J. Chem. Soc. 1949
(Supp. Issue Nº 1): S190-S199; Clayton y col., 1951,
"The Synthesis of Thyroxine and Related substances. Part VIII. The
Preparation of Some Halógeno- and Nitro-diphenyl
Ethers", J. Chem. Soc. 1951:2467-2473;
Gemmill y col., 1956, "3-Iodo-,
3,3'-Diiodo- and
3,3'-Diiodo-5-bromothyroxine",
J. Am. Chem. Soc. 78:2434-2436; Meltzer y
col., 1957, "Thyroxine Analogs", J. Org. Chem. 22:
1577-1581; Crowder y col., 1958,
"Bisbenzylisoquinolines. Part II. The Synthesis of
5-(2-Aminoethyl)-4'-carboxy-2,3-dimethoxydiphenyl
Ether", J. Chem. Soc. 1958:2142-2149;
Jorgensen, 1978, "Thyroid Hormones and Analogues, I. Synthesis,
Physical Properties and Theoretical Calculations" In: Hormonal
Proteins and Peptides Vol. VI, pp. 57-105, C.H. Li,
Ed., Academic Press, NY (y referencias citadas en el mismo); y
Jorgensen, 1978, "Thyroid Hormones and Analogues, II.
Structure-Activity Relationships", In: Hormonal
Proteins and Peptides, Vol. VI, pp. 107-204, C.H.
Li, Ed., Academic Press, NY (y referencias citadas en el mismo).
Ejemplo
2
Se ensayaron los compuestos 1 y 3, identificados
en la Tabla 1, en la activación de la proteína fosfatasa 2A.
Se fosforiló la histona H1 con la proteína
quinasa C (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY) en un
volumen de 100 \mul de acuerdo con los protocolos estándar.
Alternativamente, se fosforiló la histona H1 con la quinasa p34cdc2
purificada de embriones de Mytilus Edulis de rápida multiplicación
en la etapa 4-8 después de aislamiento con la
técnica de agarosa P^{13}-Suc (Smythe and Newport,
1992, "Coupling of Mitosis to the Completion of S Phase in Xenopus
Occurs vía Modulation of the Tyrosine Kinase that Phosphorylates
p34cdc2". Cell 68:787-797).
Se preincubaron 125 ng de proteína fosfatasa 2A
(Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY; Usui y col., 1983,
J. Biol. Chem. 258:10455-10463) con el
análogo de tiroxina (50 \muM) en tampón (MOPS 20 mM o Tris, pH
7,5, MgCl_{2} 1 mM, \beta-mercaptoetanol 60
\muM) durante 10 min a 23ºC. El volumen de reacción total era 20
\mul. Se añadió el sustrato histona H1 marcada con ^{32}P (10
\mum, 10^{5} cpm) y se dejó que la reacción de desfosforilación
se desarrollara durante 5 min a 23ºC, y después de este tiempo la
reacción se inactivó por adición de 2 \mul de tampón de Laemmli.
Se llevó a cabo una reacción idéntica que contenía 125 ng de
proteína fosfatasa 2A no tratada como control.
Se separaron la histona H1 fosforilada y
desfosforilada por electroforesis en gel (SDS-PAGE
al 12%), se separaron las bandas que contenían la histona H1
fosforilada y se ensayó la actividad del ^{32}P mediante un
contador de centelleo.
La velocidad de desfosforilación en 5 min es una
señal de la velocidad inicial (V_{inic}) de la reacción de
desfosforilación. En la siguiente Tabla 2 se proporciona la
V_{inic} para los compuestos 1 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Activación de la proteína fosfatasa 2A | |
| Análogo de tiroxina | Actividad/5 min (cpm) |
| Control | 10217 \pm 1708 |
| Compuesto 1 | 24655 \pm 8600 |
| Compuesto 3 | 7521 \pm 1562 |
| Los valores descritos son la media de tres muestras |
\newpage
Estos resultados muestran que una corta
preincubación (10 min) de la proteína fosfatasa 2A con DIME
(Compuesto 1) más que duplica la V_{inic} de desfosforilación de
la histona H1. El homólogo 4'-propoxi no activa la
proteína fosfatasa 2A. Estos datos indican que incluso cambios poco
importantes en los extremos de la estructura del farmacóforo DIME
(es decir, los grupos metoxi y éster de metilo) afectan
significativamente a la actividad. Estos datos se correlacionan bien
con la activación de la proteína fosfatasa 2A observada en ensayos
de células malignas in vitro (véase el Ejemplo 3) y con la
eficacia antitumorigénica in vivo observada en ratones (véase
los Ejemplos 4 y 6).
Ejemplo
3
Se ensayó la activación de la proteína fosfatasa
2A en los compuestos 1-13 en cultivos de células
tumorales malignas in vitro de acuerdo con el protocolo
descrito por Bauer y col., 1996, "Modification of Growth Related
Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a
Ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment
with
5-Iodo-6-Amino-1,2-Benzopyrone
(INH_{2}BP)", International J. of Oncology
8:239-252. Los resultados para la activación por
DIME (Compuesto 1) están tabulados en la Tabla 3. Todos los demás
compuestos eran ineficaces.
\vskip1.000000\baselineskip
| \begin{minipage}[t]{120mm}Efecto de DIME en la actividad de fosfatasa del extracto nuclear de células E-ras 20\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{60mm}Actividad de fosfatasa (fmol Pi/mg de proteína x min)\end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{60mm}Extracto nuclear de E-ras (5-10 \mu g de proteína por ensayo)\end{minipage} | 29 \pm 5 |
| \begin{minipage}[t]{60mm}Extracto nuclear de E-ras + DIME 50 \mu M\end{minipage} | 44 \pm 7 |
| \begin{minipage}[t]{60mm}DU-145 (5-10 \mu g de proteína por ensayo)\end{minipage} | 12,1 \pm 3 |
| DU-145 + DIME 50 \muM | 19,1 \pm 2,5 |
| Pi = fosfato inorgánico |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran que DIME 50 \muM
activa la proteína fosfatasa 2A al menos en dos veces tanto en
células endoteliales bovinas transformadas con E-ras
como en células DU-145.
Ejemplo
4
Se ensayó la acción citocidal de los Compuestos
1-13 en siete líneas celulares de cáncer humano
in vitro. DIME (Compuesto 1) tenía la actividad máxima, y el
derivado etoxi (Compuesto 2) tenía el 25-30% de la
actividad máxima.
Se obtuvieron siete líneas de células de cáncer
humano de la colección americana de cultivo de tejidos (Rockville,
MD) y se mantuvieron en los medios de crecimiento recomendados. Las
células se sembraron en pocillos (2 cm^{2}) con una densidad de 2
x 10^{4} células/cm^{2}. Se añadieron diferentes concentraciones
de los Compuestos 1-13 a los medios en el momento de
la siembra.
Los cultivos se incubaron durante 72 horas a 37ºC
(atmósfera de CO_{2} al 5%). Después de la incubación, las células
se desprendieron con tripsina y se contaron en un hemocitómetro.
DIME (Compuesto 1) tenía la actividad máxima, y
el derivado etoxi (Compuesto 2) tenía el 25-30% de
la actividad máxima. Todos los demás análogos ensayados (Compuestos
3-13) eran completamente inactivos.
Los resultados experimentales para DIME
(Compuesto 1) están tabulados en la siguiente Tabla 4. I_{100}
indica la concentración a la cual no quedaban células viables;
I_{50} la concentración a la cual quedaba el 50% de las células
viables, comparado con un control.
\vskip1.000000\baselineskip
| Efecto de DIME en diferentes líneas celulares de cánceres humanos | ||
| Línea celular | I_{50} (\muM) | I_{100} (\muM) |
| HT 144 (melanoma) | 0,5 | 4,0 |
| U 145 (cáncer de próstata) | 0,5 | 3,5 |
| HeLA (cáncer de cérvix) | 0,6 | 3,5 |
| HL-60 (leucemia promielocítica) | 0,6 | 3,0 |
| MDA-MD-231 (cáncer de mama) | 0,4 | 3,0 |
| SK-Br-3 (cáncer de mama) | 0,6 | 5,0 |
| T47D (cáncer de mama ductal) | 0,7 | 3,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se ensayó la inhibición del crecimiento de
células cancerígenas MDA-MD-231 por
los compuestos 1 y 14. El compuesto 14 presentaba aproximadamente el
25% de la actividad inhibidora comparado con DIME (Compuesto 1).
Las células de cáncer humano
MDA-MD-231 se obtuvieron de la
colección americana de cultivo de tejidos (Rockville, MD) y se
mantuvieron en los medios de crecimiento recomendados. Las células
se hicieron crecer en presencia de diferentes concentraciones de los
compuestos 1 y 14 durante 3 días a 37ºC.
Los resultados experimentales están tabulados en
la siguiente Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
| Velocidad de crecimiento de células MDA-MD-231 | |||
| Compuesto 1 | Células | Compuesto 14 | Células |
| (\muM) | (x 10^{6}) | (\muM) | (x 10^{6}) |
| 0,0 | 0,95 | 0,0 | 0,95 |
| 0,5 | 0,20 | 0,5 | 0,95 |
| 1,0 | 0,10 | 1,0 | 0,71 |
| 2,0 | 0,09 | 2,0 | 0,20 |
\vskip1.000000\baselineskip
El análogo 2'-cloro de DIME
(Compuesto 14) presentaba una acción inhibidora del 25% comparado
con DIME (Compuesto 1).
Ejemplo
6
Se ensayó la acción morfológica de DIME
(Compuesto 1) en una línea de células endoteliales bovinas
transformadas con E-ras muy tumorigénica.
Las células endoteliales bovinas transformadas
con E-ras (Bauer y col., 1996. Intl. J.
Oncology 8:239-252) se expusieron a DIME 10
\muM durante 3 días. Se inyectaron células tratadas con DIME
(10^{5} o 10^{6} células/100 \mul) por vía subcutánea a
ratones sin sistema inmune y se siguió el avance del tumor durante
25 días.
Como se ilustra en la Fig.1, la exposición de
células endoteliales transformadas con E-ras a DIME
10 \muM durante un periodo de 3 días indujo micronucleación
extensa, coincidiendo con una pérdida de tumorigenicidad. Como se
ilustra en la Fig. 2, los animales expuestos a células no tratadas
presentaron crecimiento del tumor (curvas superiores), sucumbiendo a
los tumores a los 25 días. La exposición de las células a DIME 10
\muM antes de la inyección eliminó casi completamente la
tumorigenicidad (curvas inferiores). Los tumores no aparecieron
incluso después de 3 meses sin tratamiento con fármaco in
vivo.
Ejemplo
7
Los siguientes ejemplos demuestran la falta de
toxicidad, la biodisponibilidad, la semivida (t_{1/2}) en el suero
y la eficacia in vivo de DIME en los xenoinjertos de cáncer
de mama humano en ratones.
Se administró a diez ratones sin sistema inmune
una dosis oral diaria de DIME marcado con ^{14}C (Compuesto 1)
(1,0 g/kg, 0,1 ml en aceite de maíz) durante un periodo de
12-15 días. No se observaron efectos adversos en
ninguno de los ratones durante todo el tiempo de tratamiento.
Se administraron a los ratones dosis por vía oral
de DIME marcado por ^{14}C (Compuesto 1) 126 mg/kg. Después de la
administración de la dosis, los tiempos de toma de muestra de sangre
fueron 15 y 30 minutos y 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas. Se ensayaron
partes alícuotas (50 \mul) de sangre en un contador de centelleo
de líquidos y los datos se expresaron como
microgramo-equivalentes por ml. Los datos del nivel
en sangre se analizaron por el procedimiento de RSTRIP (Micromath,
Salt Lake City, UT).
Se administraron a grupos de ratones en paralelo
dosis por vía intravenosa de DIME marcado por ^{14}C (Compuesto 1)
24,5 mg/kg, y los tiempos de toma de muestra fueron a los 10, 20 y
30 minutos y 1, 2, 4, 6 y 8 horas.
Los niveles en el suero sanguíneo de DIME marcado
con ^{14}C (mg-eq/ml) se ilustran en la Fig. 3. El
área bajo la curva de concentración en la
sangre-tiempo era 665,28 \mug-h/ml
para la vía oral (datos representados por círculos) y 156
\mug-h/ml por vía intravenosa (datos representados
con cuadrados). Se calculó que la biodisponibilidad de DIME
administrado por vía oral era 83% a partir de estos datos, usando un
procedimiento de relación x dosis estándar. La semivida (t_{1/2})
de DIME era aproximadamente 2-2,5 horas.
La capacidad de los tumores humanos de crecer
como xenoinjertos en ratones atímicos (por ejemplo, ratones sin
sistema inmune) proporciona un modelo útil in vivo para
estudiar la respuesta biológica a las terapias de tumores humanos.
Desde el primer xenotransplante con éxito de tumores humanos en
ratones atímicos (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Pathol.
Microbiol. Scand. 77:758-760) se han
trasplantado y hecho crecer con éxito muchas líneas celulares de
tumores humanos (por ejemplo, de mama, genitourinarios,
gastrointestinal, de cabeza y cuello, glioblastoma, hueso y
melanomas malignos) en ratones sin sistema inmune. Las líneas
celulares de tumores de mama humanos, incluyendo
MCF-7, ZR75-1 y
MDA-MB-231, se han establecido como
injertos subcutáneos en ratones sin sistema inmune (Warri y col.,
1991, Intl. J. Cáncer 49:616-23; Ozzello
Sordat, 1980, "Behaviour of Tumors Produced by Transplantation of
Human Mammary Cell Lines in Athymic Nude Mice", Eur. J.
cancer 16:553-559; Osbourne y col., 1985,
Cáncer Res. 45:584-590; Siebert y col., 1983,
Cancer Res. 43:2223-2239).
Este experimento demuestra la inhibición de
xenoinjertos de MDA-MB-231 en
ratones sin sistema inmune.
Las células
MDA-MD-231 (cáncer de mama humano)
se obtuvieron de la colección americana de cultivo de tejidos
(Rockville, MD) y se mantuvieron en los medios de crecimiento
recomendados. Se inocularon a cada uno de veinte ratones sin sistema
inmune por vía subcutánea células
MDA-MB-231 (10^{6} células/100
\mul). A un grupo de diez ratones se le administró DIME por
alimentación oral (250 mg/kg, 10 ml/kg en aceite de maíz) una vez al
día, 5 días a la semana, durante un total de 32 días.
Al otro grupo (control) de diez ratones se le
administró sólo vehículo de acuerdo con el mismo programa de
dosificación. Los tumores se midieron dos veces por semana usando un
calibre Vernier, y se determinó el volumen medio del tumor en cada
tiempo.
Las comparaciones entre grupos se hicieron usando
un ensayo t de dos colas desapareado y los resultados se analizaron
usando análisis de varianza.
En la Tabla 5 se tabula la masa media de tumor
los días 14, 21, 28 y 32 después de la inoculación en ratones
tratados y no tratados.
| Volumen del tumor MDA-MB-231 después de tratamiento con DIME | ||||
| Grupo de | Día 14 \pm ETM^{a} | Día 21 \pm ETM^{a} | Día 28 \pm ETM^{a} | Día 32 \pm ETM^{a} |
| tratamiento | (valor p) | (valor p) | (valor p) | (valor p) |
| Control (vehículo) | 284,6 \pm 42,0 | 622,2 \pm 58,1 | 979,0 \pm 154 | 1176,6 \pm 222,4 |
| DIME (250 mg/kg) | 172,0 \pm 34,3 | 285,7 \pm 62,4 | 430 \pm 85,6 | 543,8 \pm 122,1 |
| (p = 0,06) | (p = 0,02) | (p = 0,01) | (p = 0,01) | |
| % de disminución | 40% | 54% | 56% | 54% |
| ^{a} ETM = error típico de la media |
Estos datos indican que DIME produce una
reducción significativa del crecimiento de tumores malignos, incluso
con un régimen de tratamiento no optimizado.
Se ensayan otros análogos de tiroxina descritos
en el presente documento como se ha descrito antes. Se espera que
los análogos presenten actividad de acuerdo con esos ensayos.
Ejemplo
8
Los siguientes ejemplos proporcionan
formulaciones de ejemplo, no limitantes, para administrar los
análogos de tiroxina de la invención a pacientes mamíferos,
especialmente seres humanos. Aunque los ejemplos muestran
formulaciones de DIME, hay que entender que cualquier de los
análogos de tiroxina descritos en el presente documento se puede
formular como se proporciona en los siguientes ejemplos.
Se preparan como sigue comprimidos que contienen
cada uno 60 mg de ingrediente activo:
| DIME | 60 mg |
| Almidón | 45 mg |
| Celulosa microcristalina | 45 mg |
| Carboximetil-almidón sódico | 4,5 mg |
| Talco | 1 mg |
| Polivinilpirrolidona (10% en agua) | 4 mg |
| Estearato magnésico | 0,5 mg |
| 150 mg |
El principio activo, el almidón y la celulosa se
pasan por un tamiz U.S. estándar nº de malla 45 y se mezclaron bien.
La solución de polivinilpirrolidona se mezcla con los polvos
resultantes que después se pasan por un tamiz U.S. estándar nº de
malla 14. Los gránulos se secan a 50º-60ºC y se pasan por un tamiz
U.S. estándar nº de malla 18. Después se añaden a los gránulos el
carboximetil-almidón sódico, estearato magnésico y
talco, previamente pasados por un tamiz U.S. estándar nº de malla
60, los cuales después se mezclan y comprimen con una máquina de
formación de comprimidos, para dar comprimidos que pesa cada uno 150
mg.
Los comprimidos se preparan a partir de los
ingredientes listados en la Tabla 1 por granulación, seguido de
compresión.
Se preparan cápsulas de gelatina dura usando los
siguientes ingredientes:
| DIME | 250 mg/cápsula |
| Almidón seco | 200 mg/cápsula |
| Estearato magnésico | 10 mg/cápsula |
Los ingredientes anteriores se mezclan y se
llenan cápsulas de gelatina dura con cantidades de 460 mg.
Se prepara una solución de aerosol que contiene
los siguientes componentes:
| DIME | 0,25% (p/p) |
| Etanol | 29,75% (p/p) |
| Propelente 22 (Clorodifluorometano) | 77,00% (p/p) |
El compuesto activo se mezcla con etanol y la
mezcla se añade a una porción del propelente 22, enfriado a -30ºC y
se transfiere a un dispositivo de carga. Después se introduce la
cantidad requerida en un envase de acero inoxidable y se diluye con
el resto del propelente. Después se ajustan las unidades de válvulas
en el envase.
Se preparan como sigue supositorios que contiene
cada uno 225 mg de principio activo
| DIME | 225 mg |
| Glicéridos de ácidos grasos saturados | 2.000 mg |
El principio activo se pasa por un tamiz U.S.
estándar nº de malla 60 y se suspende en los glicéridos de ácidos
grasos saturados previamente fundidos usando el calor mínimo
necesario. Después, la mezcla se vierte en un molde de supositorio
de capacidad nominal 2 g y se dejan enfriar.
Se preparan como sigue suspensiones que contiene
cada una 50 mg de medicamento por dosis de 5 ml
| DIME | 50 mg |
| Carboximetil-celulosa sódica | 50 mg |
| Jarabe | 1,25 ml |
| Solución de ácido benzoico | 0,10 ml |
| Aroma | c.v. |
| Color | c.v. |
| Agua purificada hasta | 5 ml |
El principio activo se pasa por un tamiz U.S.
estándar nº de malla 45 y se mezcla con la
carboximetil-celulosa sódica y el jarabe para formar
una pasta suave. La solución de ácido benzoico, el aroma y algo de
colorante se diluyen con algo de agua y se añaden con agitación. Se
añaden suficiente agua para producir el volumen requerido.
Ejemplo
9
La sustitución de un átomo de H por un átomo de
yodo en la posición 5 del
6-amino-1,2-benzopirano
aumentó significativamente la potencia inhibidora de pADPRT,
actividad antiVIH y acción antitumoral del compuesto relacionado.
Cole, y col. 1991 "Inhibition of HIV-1 IIIb
Replication in AA-2 Cells in Culture by Two Ligands
of Poly (ADP-Ribose) Polymerase:
6-Amino-1,2-benzopyrone
and
5-Iodo-6-amino-1,2-benzopyrone"
Biochem. Biophys. Res. Commun. 180:504-514;
Bauer y col. 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic
Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a
ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by
Treatment with
5-Iodo-6-amino-1,2-benzopyrone
(INH_{2}BP)" Intl. J. Oncol. 8:239-252.
Surgió la cuestión de si un aumento del número de sustituciones con
yodo en algunas moléculas aromáticas puede o no modificar sus
propiedades farmacológicas moleculares. Como primer enfoque de esta
cuestión se analizó primero la acción celular de los compuestos de
diyodo conocidos tales como los análogos de la hormona tiroidea.
Se ha establecido que los efectos metabólicos o
metamorfogénicos de los análogos de la hormona tiroidea dependen de
su estructura química. Jorgensen, E. 1978, "Thyroid Hormones and
Analogs. II. Structure-Activity Relationships".
En: "Hormonal Protein and Peptides" Vol. VI, Li CH(ed.),
Academic Press, New York, pp. 108-203. El
3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzoato
de metilo (DIME) hormonalmente inactivo, se sintetizó por primera
vez en 1949 (Borrows y col., 1949, "The Synthesis of thyroxine and
Related Substances. Part I. The Preparation of Tyrosine and Some of
its Derivatives, and a New Route to Thyroxine", J. Chem.
Soc. Suppl. Issue No. 1 :S185-S190) pero no se
ha publicado una acción metabólica o metamorfogénica importante de
esta sustancia, Money y col. 1958, "The Effect of Change in
Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on the Metamorphosis
of Rana pipiens Tadpoles", Endocrinology
63:20-28;. Stasili y col., 1959, "Antigoitrogenic
and calorigenic Activities of Thyroxine Analogues in Rats",
Endocrinology 64:62-82; Money y col., 1959,
"The Effect of Various Thyroxine Analogues on suppression of
^{131}I Uptake by the Rat Thyroid", Endocrinology
64:123-125; Kumaoka y col., 1960, "The Effect of
Thyroxine Analogues on a Transplantable Mouse Pituitary Tumor",
Endocrinology 66:32-38; Grinberg y col.,
1962, "Studies with Mouse Pituitary Thyrotropic Tumors. V. Effect
of Various Thyroxine Analogs on Growth and Secretion", Cancer
Res. 22:835-841. En un trabajo empezado
anteriormente por los autores de la invención, se ha mostrado que
DIME es un potencial agente tumoricida tanto en cultivos celulares
como in vivo. Kun y col., 1996, "Induction of Tumor
Apoptosis by
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)", Abstract No. 102, Int. J. Oncol.
9:supplement 829; Zhen, y col., 1997, "Induction of Metaphase
Blockand Endoreduplication in Human Cancer Cells by
3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)". Abstract, Amer. Assoc. Cancer Res.,
Symposium on Cell Signaling and Cancer. La síntesis y ensayo de
homólogos y análogos estructurales de DIME, que difieren sólo en las
sustituciones de la cadena lateral, como se muestra en la solicitud
de patente de EE.UU. en tramitación con la presente serie nº
08/655.267, presentada el 4 de Junio, 1996, ("Method of Treating
Malignant Tumors with Thyroxine Analogs having No Significant
Hormonal Activity"), definió la especificidad estructural para la
actividad tumoricida de DIME.
El siguiente trabajo muestra la comparación de la
estructura-acción de DIME y 17 de sus análogos, y
describe la acción tumoricida del propio DIME a nivel celular. Los
ensayos de metabolismo del fármaco y captación celular con DIME
indicaron las razones de su falta de toxicidad en animales in
vivo. Los análisis citométricos y el modo de acción de DIME y
los mecanismos bioquímicos son los objetivos de los siguientes
estudios.
Se obtuvieron fenoles sustituidos para la
síntesis de los compuestos 1-4 y
10-18 en la Tabla 1 de Aldrich Chemical Co.
(Milwaukee, WI. EE.UU.). El
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
de metilo, Ullmann F. 1909, "Die
4-Chlor-3,5-dinitrobenzoesäure",
Annalen der Chemie 36:92-93; se preparó a
partir del ácido
4-cloro-3,5-dinitrobenzoico
(Aldrich).
Cada fenol sustituido (en forma de su fenolato
potásico) se hizo reaccionar con el
4-cloro-3,5-dinitrobenzoato
de metilo para dar el
3,5-dinitro-4-(fenoxi
sustituido)benzoato de metilo, que después se redujo a la
correspondiente 3,5-diamina y se convirtió en el
compuesto 3,5-diyodo objetivo por la reacción de
Sandmeyer, Kun y col., 1996, "Induction of Tumor Apoptosis by
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)", Abstract No. 102. Int. J. Oncol. 9:
supplement 829. En general, la reducción se hizo por hidrogenación
catalítica, pero en los casos en los que R_{1} o R_{3} es un
átomo de halógeno (compuestos 12 y 14), la reducción se hizo con
hierro en polvo en ácido acético/etanol para evitar la
deshalogenación. Kun y col., 1996, "Induction of Tumor Apoptosis
by
Methyl-3,5-Diiodo-4-(4'-Methoxyphenoxy)
Benzoate (DIME)", Abstract No. 102, Int. J. Oncol. 9:
supplement 829. La purificación se hizo en general por cromatografía
en capa fina preparativa y cristalización. Para los compuestos en
los que R_{2} en la Tabla 7 es distinto de metoxi (concretamente
los compuestos 5-9), se usaron reacciones de
síntesis adicionales. El Compuesto 6 se preparó por hidrólisis
básica del compuesto 1. Borrows, y col. 1949, "The Synthesis of
Thyroxine and Related Substances. Part I. The Preparation of
Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New Route to
Thyroxine", J. Chem. Soc. Suppl. Issue No.
1:S185-S190. Los compuestos 5, 8 y 9 se prepararon
por reacción del cloruro de ácido de 6, Borrows, y col. 1949, "The
Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The
Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New
Routeto Thyroxine", J. Chem. Soc. Suppl. Issue No.
1:S185-5190; con etanol anhidro, metilamina y
dimetilamina respectivamente. Kun y col., 1996, "Induction of
Tumor Apotosis by
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
Benzoate (DIME)", Abstract No. 102, Int. J. Oncol. 9:
supplement 829. El compuesto 7 se obtuvo por reacción de 1 con
amoniaco en metanol anhidro. Todos los compuestos se caracterizaron
por el punto de fusión y la espectrometría de masas de alta
resolución (Tabla 7), con la excepción del ácido carboxílico 6
conocido. Se midieron los espectros de RMN ^{1}H de los compuestos
1-14 y en todos los casos fueron satisfactorios.
La síntesis del Compuesto 1 (DIME) se llevó a
cabo como describieron previamente Borrows, y col. 1949, "The
Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The
Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New
Routeto Thyroxine", J. Chem. Soc. Suppl. Issue No. 1
:S185-S190, p.f. 153-155ºC. Las
mediciones espectrales fundamentales, no publicadas previamente para
esta compuesto, son las siguientes. Espectro de absorción UV en
etanol, \tau max(\varepsilon): 289 nm (4,20 x 10^{3}),
232 nm (3,08 x 10^{4}), 213 nm (2,48 x 10^{4}). Espectro de
masas: FAB, m/z (intensidad relativa): 510 (M^{+}, 100), 479
(4,5),384 (4,5). Datos de alta resolución para el pico M^{+}:
calculado para C_{15}H_{12}I_{2}O_{4}, 509,882513;
encontrado, 509,882960 (desviación = -0,9 ppm). Espectro de RMN
^{1}H en DMSO-d_{6} (valores
\delta(ppm) respecto al TMS): 3,719 (3H, singlete), 3,876
(3H, singlete), 6,693 (2H, doblete, J = 9,45Hz, más desdoblamiento
fino), 6,84,5 (2H, doblete, J = 9,36Hz, más desdoblamiento fino),
8,390 (2H, singlete).
La síntesis del Compuesto 7
(3,5-diyodo-4-(4'-metoxifenoxi)benzamida)
se llevó a cabo burbujeando amoniaco en una solución del compuesto 1
(100 mg, 0,196 mmol) en metanol anhidro (60 ml) a temperatura
ambiente durante 5 min. Después de reposar 1 h, en un matraz tapado,
la mezcla se trató otra vez con amoniaco y se dejó reposar tapada
durante 48 horas. Se separaron el metanol/amoniaco por evaporación
en el rotavapor, el residuo seco se disolvió en metanol:agua
caliente (7:3 vol/vol) (30 ml) y se cristalizó en el frigorífico
(3ºC). Rendimiento: 58,3 mg (60%) de cristales de color ante, p.f.
207-209 ºC. Espectro de masas (FAB): Datos de alta
resolución para el pico M^{+}: calculado para
C_{14}H_{11}I_{2}NO_{3}, 494,882847; encontrado, 494,881880
(desviación = 2,0 ppm). Espectro de RMN ^{1}H en
DMSO-d_{6} (valores \delta (ppm) respecto al
TMS): 3,716 (3H, singlete), 6,682 (2H, doblete, J = 8,93 Hz, más
desdoblamiento fino), 6,895 (2H, doblete, J = 8,99 Hz, más
desdoblamiento fino), 7,528 (1H, singlete), 8,113 (1H, singlete),
8,402 (2H, singlete).
Se cultivaron células E-ras 20
como describen Bauer y col. 1996, "Modification of Growth Related
Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a
ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by
Treatment with
5-Iodo-6-amino-1,2-benzopyrone
(INH_{2}BP)" Intl. J. Oncol. 8:239-252;
HT-144 (melanoma), DU-145 (cáncer de
próstata), células HeLa (cáncer de cérvix), HL 60 (leucemia
promielítica), MDA-MB-231 (cáncer de
mama), SK-Br-3 (cáncer de mama),
T47D (cáncer de mama ductal), A559 (cáncer de pulmón), que se
obtuvieron de la colección americana de cultivo de tejidos
(Rockville, MD) y se cultivaron en los medios prescritos. Se ensayó
el efecto de DIME en cultivos con una densidad celular inicial de 2
x 10^{4} células por cm^{2} y se ensayó la comparación del
efecto de DIME en el crecimiento celular (células intactas
identificadas por exclusión con tinta azul de Tryptan) mediante
recuento celular directo después de tripsinización en un
hemocitómetro 72 horas después de la adición de
fármaco.
fármaco.
Se ensayó la tumorigenicidad de células
E-ras 20 en ratones atímicos sin sistema inmune como
describieron previamente Bauer y col. 1996, "Modification of
Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of
Tumorigenicity of a ras-Transformed Bovine
Endothelial Cell Line by Treatment with
5-Iodo-6-amino-1,2-benzopyrone
(INH_{2}BP)" Intl. J. Oncol. 8:239-252.
Se ensayó la acción antitumorigénica in vivo de DIME en
ratones atímicos a los que se inocularon 10^{6} células
MDA-MB-231, como en el ensayo de
tumorigenicidad. Aproximadamente a los 10-14 días
cuando aparecieron los tumores subcutáneos se inició el tratamiento
con DIME que consistía en la administración p.o. de suspensión de
DIME (una vez al día) y se continuó durante 28-32
días según publican Kun y col., 1996, "Induction of Tumor
Apoptosis by
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)", Abstract No. 102, Int. J. Oncol.
9:supplement 829.
Los ensayos de la cuantificación de la formación
de colonias se llevaron a cabo como describen Vidair, y col., 1986
"Evaluation of a Role for Intracellular Na^{+}, K^{+},
Ca^{2+} y Mg^{2+} in hyperthermic cell killing" Radiation
Res. 105:187-200.
Se lavó EAH-Sepharosa (Pharmacia,
Piscataway, NJ, EE.UU.) (2,0 g, húmedo) con agua y se cambió el
disolvente a DMF (ac) al 60%. La torta húmeda se volvió a suspender
en DMF al 60% (1,0 ml) que contenía el derivado de ácido carboxílico
de DIME (compuesto 6) (60 mg) y un exceso de 10 veces de
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (Sigma) y la
suspensión se rotó suavemente a temperatura ambiente durante 16
horas. Después, se recogieron las perlas de Sepharosa en un filtro
de vidrio sinterizado y se lavaron secuencialmente con DMF, dioxano,
DMF, DMF acuosa (al 66%, 50% y 33%) y finalmente con agua. Basándose
en el espectro de absorción UV de las perlas sustituidas, el
contenido de grupos DIME estaba en el intervalo de
1-2 \mumol por ml de torta húmeda.
(a) Se combinó cada uno de los homogeneizados de
tejido de ratón (cerebro, riñón, hígado, pulmón) que consistían en
0,2 g de tejido en 1,0 ml de tampón de homogeneización (Tris (pH
7,4) 50 mM, NaCl 400 mM, MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM,
NP-40 al 0,5%, PMSF 0,5 mM), con 1,0 ml de tampón
MES (100 mM, pH 6,5) que contenía [^{14}C]-DIME 20
\muM (10,55 mCi/mmol), y las mezclas se incubaron a 37ºC durante 4
horas. Después se añadió a cada tubo secuencialmente acetato de
etilo (1,5 ml), sulfato amónico (900 mg) y ácido perclórico al 60%
(160 \mul), con mezcla vortical después de cada adición. Después
de reposar durante 10 minutos, se potenció la separación de fase por
centrifugación en un Benchtop. Se quitó la capa superior (acetato de
etilo), y la capa inferior acuosa y el material de la interfase se
extrajeron con una segunda porción de acetato de etilo (1,5 ml). Los
extractos de acetato de etilo (combinados) contenían más del 90% de
los cpm totales presentes en el incubado original (aproximadamente 4
x 10^{5} cpm). Los extractos se evaporaron a sequedad usando una
corriente de N_{2}, los respectivos residuos se recogieron en
acetato de etilo (100 \mul), y se aplicaron partes alícuotas (10
\mul) como manchas puntuales en placas de TLC de gel de sílice
analíticas (placas flexibles Whatman PE SIL G/UV de 250 \mum de
grosor, 10 cm x 20 cm) y se desarrollaron en
n-hexano/acetato de etilo/etanol 3:1:0,8. Las bandas
de analitos, incluyendo el [^{14}C]-DIME como
patrón de referencia, se visualizaron por autorradiografía. Se
visualizaron patrones de referencia adicionales (DIME no radiactivo
y su análogo ácido carboxílico) en las placas con luz UV. (b)
Metabolismo de [^{14}C]-DIME en células en
cultivo: Se incubaron células (2-5 x 10^{6} en
cada ensayo) con [^{14}C]-DIME, y después se
homogeneizaron y se ensayaron los metabolitos como en (a).
Se expusieron cultivos de monocapa en pocillos de
9,6 cm^{2} (3 ml de medio) a [^{14}C]-DIME
(10,55 mCi/mmol) durante 24 horas, y después se lavaron 7 veces con
1 ml de medio que contenía DIME sin marcar. Las células se
disolvieron en 1 ml de Na_{2}CO_{3} al 4% y NaOH 0,2 M y se
midió la radiactividad por recuento de centelleo. El volumen de
células se determinó por recuento de hematocritos y de células de
pocillos paralelos tratados con DIME sin marcar.
El ensayo de cortes de ADN, como señal de
apoptosis, se hizo mediante la reacción de marcaje de la muesca
terminal de la dUTP desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL)
como especificaba el fabricantes del kit de ensayo (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN, EE.UU., Cat. nº
168-4817).
El inhibidor de la
carboxil-esterasa
bis[p-nitrofenil]-fosfato
(BNPP), Heymann, y col., 1968, "Inhibition of phenacetin and
acetanilide-induced methemoglobinemia in the rat by
the carboxyl esterase inhibitor of
bis[p-nitrophenyl]phosphate",
Biochem. Pharmacol. 18:801 -811, se obtuvo de SIGMA.
La especificidad estructural de DIME y sus
homólogos y análogos se puede evaluar examinando la Tabla 7 y Tabla
8. Se han preparado 17 análogos estructurales nuevos de DIME y se ha
comparado la actividad antitumoral de 10 de los compuestos (Tabla
8), lo cual parece suficiente para sacar conclusiones generales. El
ensayo biológico elegido fue la determinación de la acción
antitumorigénica de los fármacos en la tumorigenicidad in
vivo de células E-Ras en ratones sin sistema
inmune, Bauer y col., 1996, "Modification of growth related
enzymatic pathways and apparent loss of tumorigenicity of a
ras-transformed bovine endothelial cell line by
treatment with
5-iodo-6-amino-1,2-benzopyrone
(INH_{2}BP)" Intl. J. Oncol. 8:45
239-252. Se incubaron células E-ras
(10^{5} o 10^{6}) con DIME 10 \muM o análogos durante 4 días,
y después se inocularon 10^{5} y 10^{6} células por vía
subcutánea a ratones sin sistema inmune (5 por ensayo) y se
cuantificaron las velocidades de formación del tumor por mediciones
directas del volumen del tumor (compárese con 2). Como se muestra
para el propio DIME (Figura 4) se eliminó completamente la formación
del tumor. Se llevaron a cabo ensayos antitumorigénicos idénticos
con nueve análogos de DIME y considerando el efecto de DIME como el
100% (comparado con los tamaños de tumores a los 25 días), se
calculó la eficacia antitumoral como porcentaje de la actividad de
DIME. Hay que indicar que las células E-ras 20 son
relativamente menos sensibles a DIME que los tumores humanos, y por
lo tanto estos resultados sólo sirven como base de comparación de
los análogos DIME. Los resultados resumidos en la Tabla 8 ilustran
los sustituyentes R_{1} y R_{2} para determinar la eficacia
antitumoral. Este efecto es particularmente llamativo cuando se
comparan CH_{3}O, EtO, n-PrO, nBuO en R_{1},
sugiriendo que parece que los parámetros de la cadena lateral, no la
unión de la propia estructura nuclear de "tipo tiroxina",
confieren especificidad farmacológica.
Esta conclusión se confirma con los estudios de
unión a proteína preliminares con la columna de afinidad de
DIME-Sepharosa. En esta columna de afinidad DIME se
unió covalentemente a una matriz por R_{2}, y por lo tanto este
derivado de DIME, por analogía con los resultados en la Tabla 8,
tendría significativamente menos acción tumoricida que DIME (véase
Kun y col. Solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 08/655.267,
presentada el 4 de Junio, 1996, "Method of treating malignant
tumors with thyroxine analogs having no significant hormonal
activity", cuya descripción se incorpora en el presente documento
por referencia. Además, la percolación de los extractos celulares a
través de esta columna dio como resultado la unión de la proteína a
la matriz de afinidad; y una de las proteínas absorbidas se
identificó como la tubulina. La unión a la proteína de DIME se
determinó por el procedimiento del Centricon como se ha descrito
previamente, Bauer y col., 1996, "Modification of growth related
enzymatic pathways and apparent loss of tumorigenicity of a
ras-transformed bovine endothelial cell line by
treatment with
5-iodo-6-amino-1,2-benzopyrone
(INH_{2}BP)" Intl. J. Oncol. 8:45
239-252. Se obtuvieron valores de k_{D} de
10^{9} a 10^{10} calculados por la gráfica de Scatchard con
proteínas presentes en extractos celulares, incluso con BSA, lo que
indicaba una supuesta asociación hidrófoba de DIME con diferentes
proteínas. Basándose en los resultados con la columna de afinidad de
DIME-Sepharosa, se atribuye esta unión a la
estructura "nuclear" de DIME.
\vskip1.000000\baselineskip
| Inhibición de la tumorigenicidad de E-ras 20: eficacia de DIME y algunos análogos estructurales | |
| Compuesto nº | Eficacia (%) |
| 1 | 100 |
| 2 | 93 |
| 5 | 83 |
| 9 | 64 |
| 7 | 53 |
| 6 | 45 |
| 3 | 44 |
| 8 | 22 |
| 10 | 14 |
| 4 | 4 |
| \begin{minipage}[t]{145mm}Se comparó la eficacia de análogos de DIME en la tumorigenicidad in vivo de células E-ras 20 en ratones atímicos con la de DIME (compuesto 1) que se consideró como 100, determinando la reducción del tamaño del tumor el día 25. El tratamiento previo con DIME o sus análogos (Tabla 7) fue con 10 \mu M durante 4 días antes de la inoculación vía s.c. como se indica^{a} en la Tabla 7.\end{minipage} |
Las actividades relativas de los análogos de DIME
se pueden deducir de la Tabla 8, sin embargo, los presentes
experimentos se centraron principalmente en la acción citocidal del
propio DIME con el fin de definir sistemas experimentales adecuados
para el análisis más detallado de análogos de DIME. Extendiendo la
acción antitumorigénica de DIME (Figura 1) a condiciones in
vivo, se muestra que la alimentación de DIME a ratones sin
sistema inmune produce una regresión del tumor del
70-85% en 25-35 días mediante dosis
diarias per os de 0,25 a 1,0 g/kg, Kun y col., 1996, "Induction of
Tumor Apoptosis by
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)", Abstract No. 102, Int. J. Oncol.
9:supplement 829. Estas dosis grandes no produjeron toxicidad
perceptible por la razón probable que se describe más abajo. Puesto
que 0,25 g/kg y 1,0 g/kg de DIME tenían el mismo efecto antitumoral,
no había una relación de dosis-respuesta evidente.
Como se ha discutido, esta paradoja se puede explicar por una
captación de fármaco selectiva en células tumorales in
vivo.
El presente estudio se centró en procedimientos
de análisis de muerte de células con microscopio. Como se ilustra en
la Figura 5, la capacidad de formación de colonia de células
MDA-MB-231 disminuyó mucho con DIME
en un intervalo de concentración de 1-2 \muM en 10
días. Cuando se eliminó DIME antes del final de 8 horas de
incubación con células, se evitó la muerte celular y se invirtieron
completamente los cambios morfológicos inducidos por el fármaco. El
cultivo en placa otra vez de las células lavadas sin DIME hasta 8
horas después de la preincubación con DIME 1-10
\muM dio como resultado el inicio otra vez del crecimiento y
replicación celular normales. La naturaleza de los sucesos críticos,
que después de 8 horas de tratamiento con fármaco producen un camino
irreversible que conduce a la muerte celular hasta ahora son
desconocidos, y es objeto de estudios adicionales. Sin embargo, una
de las causas fácilmente detectadas de la muerte celular final
inducida por DIME es la rotura de ADN dependiente de la
concentración de fármaco, como se ilustra en la Figura 6.
Una propiedad llamativa de DIME es su aparente
selectividad para tumores in vivo. Se llevaron a cabo ensayos
de metabolismo de fármacos y captación de DIME celular para
caracterizar más esta propiedad. La incubación de células en cultivo
con [^{14}C]DIME, en condiciones descritas previamente
Bauer y col. 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic
Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a
ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by
Treatment with
5-Iodo-6-amino-1,2-benzopyrone
(INH_{2}BP)" Intl. J. Oncol. 8:239-252,
dio como resultado la captación celular del fármaco de una forma que
no se puede quitar por lavado de las células con PBS que contienen
DIME no radiactivo presente en la misma concentración y añadida de
forma extracelular durante la incubación (compárese con 2). La tasa
de captación de fármaco es significativamente mayor en células (por
ejemplo, MDA-MP-231) que mueren más
fácilmente con DIME comparado con células menos sensibles a DIME
(Tabla 9). Se desarrolló un fenotipo transformado de la célula de
riñón normal, células CV-1, que presentan una
pérdida de la inhibición por contacto y duplican el tiempo
rápidamente (12 horas frente a 54 horas del fenotipo no
transformado). Como se muestra en la Tabla 9, las células
tumorigénicas transformadas en general absorbieron DIME más
rápidamente que las células no transformadas (CV-1)
o las células que eran menos sensibles a la muerte con DIME (por
ejemplo, E-ras 20). Las líneas celulares
establecidas han experimentado crisis de inmortalidad, por lo tanto
las células no estrictamente operativas fisiológicamente, y los
resultados de la captación de fármaco y la aparente falta de
toxicidad de DIME in vivo, sugieren que las células normales
en el animal intacto no captan o captan muy poco DIME. Por otra
parte los homogeneizados de órganos de ratones normales, metabolizan
activamente (desesterificación) DIME como se ilustra en la Tabal 10.
La tasa más alta de actividad de
"DIME-estearasa" se producía en homogeneizados
de cerebro.
\vskip1.000000\baselineskip
| Captación de DIME | ||
| Tipo de célula | DIME extracelular^{a,b} | DIME intracelular_{a} |
| E-ras 20 (24 horas) | 10 | 105 \pm 20, (n=4) |
| MDA-MB-231 (24 horas) | 2 | 120 \pm 15, (n=4) |
| CV-1 (24 hours) | 2 | 25 \pm 4, (n=3) |
| CV-1-Transformada (24 horas) | 2 | 66 \pm 6, (n=3) |
| \begin{minipage}[t]{145mm}Concentración celular de DIME en cuatro tipos de células después de incubación durante 24 horas (véanse los procedimientos). _{a}\mu M; _{b}se eligió la concentración de DIME que producía 100% de inhibición del crecimiento, dejando 20 a 50 x 10^{4} células unidas/cm^{2}\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
| Escisión por estearasa de DIME a su ácido carboxílico^{a} en diferentes homogeneizados de tejidos | ||
| Tejido | [^{14}C]-DIME^{b} | [^{14}C]-ácido^{a,b} |
| Cerebro | 14,9 (305.000cpm) | 3,6 (73.800 cpm) |
| 17,1 (350.000cpm) | 2,0(41.250 cpm) | |
| Hígado | 186. (381.000 cpm) | 1,4 (27.900cpm) |
| Pulmón | 19,4 (396,000 cpm) | 1,0 (20.500 cpm) |
| ^{a} Compuesto 6 en la Tabla 7. | ||
| ^{b} \begin{minipage}[t]{145mm}en nmol, aislado por cromatografía en capa fina, empezando con 20,0 mol de [^{14}C]\text{-}DIME incubados en 2,0 ml de homogeneizado a 37^{o}C durante 4 horas. Los valores de cpm tienen una variabilidad de \pm 2%. La radiactividad específica de [^{14}C]\text{-}DIME era 20.470 cpm/nmol.\end{minipage} | ||
La correlación del metabolismo del fármaco y la
acción tumoricida de DIME también se demostró en experimentos con
células de tumor de pulmón humano (A-549). Como se
muestra en la Figura 4, las células A-549
escindieron fácilmente el enlace éster (R_{2}) en DIME mientras
que la inhibición de la actividad de estearasa con fosfato de
bis[p-nitrofenilo], Heymann, y col., 1968,
"Inhibition of phenacetin and acetanilide-induced
methemoglobinemia in the rat by the carboxyl esterase inhibitor of
bis[p-nitrophenyl]phosphate",
Biochem. Pharmacol. 18:801-811, dio como
resultado la muerte celular mucho más eficaz por DIME en células
A-549, como se ve en la Figura V. En la Tabla 11 se
resume una comparación de la acción de inhibición del crecimiento
celular de DIME en diferentes células cancerígenas, expresado en
concentración de DIME que produce el 50% de detención celular en 3
días. En la Figura 6 se ilustra un transcurso del tiempo de la
acción de DIME con una concentración final de 0,5, 1,0 y 2,0 \muM
en células MDA-MB-231.
| Efecto de DIME en diferentes líneas celulares de cáncer humano | |
| Línea celular | I_{50}, \muM (día 3) |
| E-ras 20 | 1,0 |
| LHT 144 (melanoma) | 0,5 |
| DU 145 (cáncer de próstata) | 0,5 |
| HeLa (cáncer de cérvix) | 0,6 |
| HL 60 (leucemia promielocítica) | 0,4 |
| MDA-MB-231 (cáncer de mama) | 0,4 |
| SK-Br-3 (cáncer de mama) | 0,6 |
| T47D (cáncer de mama ductal) | 0,7 |
| \begin{minipage}[t]{145mm}Para los experimentos de exposición a DIME, las células se sembraron en pocillos de 2 cm^{2} con una densidad de 2 x 10^{4} células/cm^{2}. Se añadió DIME al medio con diferentes concentraciones en el momento de la siembra. Después, los cultivos celulares se incubaron durante 3 días (37^{o}C en atmósfera de CO_{2} al 5%).\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
DIME es una molécula tumoricida única en cuanto
que parece que no tiene toxicidad in vivo observada
macroscópicamente excepto para las células tumorales que crecen en
animales intactos. A partir de los ensayos de captación de fármaco
parece evidente que las células que son sensibles a la muerte
celular por DIME absorben el fármaco con más avidez. La replicación
de las células que no son cancerígenas que crecen en cultivos
también es inhibida en diferente grado por DIME (no se muestra),
mientras que el fármaco no muestra toxicidad in vivo. Por lo
tanto, parece probable que la permeabilidad de las células a DIME en
cultivos celulares difiera del funcionamiento de las células in
vivo. Las razones para esta aparente especificidad del tumor
pueden depender de diferencias entre algunas propiedades de membrana
celular, hasta ahora desconocidas, de crecimiento de células en
cultivos y crecimiento de células en tejidos de animales, que son
objeto de investigaciones adicionales. Esta aparente diferencia de
permeabilidad de DIME entre las células (tanto tumorales como no
tumorales) que se han hecho crecer en cultivos celulares y células
que operan in vivo, no se mantiene en las células tumorales
que crecen in vivo, Kun y col., 1996, "Induction of Tumor
Apoptosis by
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)", Abstract No. 102, Int. J. Oncol.
9:supplement 829, porque in vivo mueren por la alimentación
de DIME, Kun y col., 1996, "Induction of Tumor Apoptosis by
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)", Abstract No. 102, Int. J. Oncol. 9:
supplement 829. Las dosis de DIME administradas in vivo
0,25-1,0 g/kg) superan mucho la concentración
tumoricida extracelular obtenida con los cultivos celulares
(0,5-2,0 \muM) lo que ilustra que las células
tumorales in vivo pueden absorber una pequeña parte de DIME
administrado in vivo, y parece que las células tumorales que
crecen in vivo han retenido la misma sensibilidad a DIME que
en los cultivos celulares, es decir, las células tumorales en
cultivo e in vivo presentan similar captación de fármaco. El
parecido de las membranas de células tumorales in vivo y las
líneas celulares que crecen en cultivos celulares parece que es una
nueva propensión de las células tumorales, que requiere un análisis
adicional. Además de la evidente selectividad in vivo para la
permeación de DIME en tumores, las células tumorales difieren de las
células normales en que en general no tienen actividad de
DIME-estearasa detectable (no se muestra) excepto en
el caso de células A-549 (cáncer de pulmón).
Los estudios de estas células (Figuras 4, 5)
ilustran de forma llamativa que el propio DIME, no su metabolito
generado por la estearasa es la molécula tumoricida. Como se ve en
la Tabla 8, la sustitución del grupo éster de metilo de DIME
(R_{2}) por la cadena de éster de etilo más larga, o por los
grupos amida, todavía mantiene una considerable eficacia antitumoral
de algunos análogos de DIME en células E-ras 20. En
este estudio sólo se ha analizado DIME con algo de detalle, pero
diferentes análogos de DIME "activos" también requieren
atención adicional, puesto que es posible que estos puedan tener
efectos celulares e in vivo que pueden ser explotados para
uso quimioterapéutico adicional. En cuanto a los átomos de yodo en
DIME y sus análogos, estos átomos voluminosos indudablemente imponen
restricciones conformacionales entre los dos anillos de benceno y a
la vez pueden ser determinantes críticos de la permeación
celular.
A continuación se proporcionan pruebas
adicionales relacionadas con el concepto más amplio del uso de
análogos de tiroxina para tratar una amplia variedad de cánceres. Se
ha descrito que DIME es un potente inductor de la muerte celular en
células tumorales en cultivos celulares e in vivo. La acción
tumoricida selectiva se explica mejor por la permeabilidad selectiva
de este fármaco en células tumorales in vivo, Mendeleyev y
col., 1997, "Structural Specificity and Tumoricidal Action of
Methyl-3,5-Diiodo-4-(4'-Meth-oxyphenoxy)
Benzoate (DIME)", Intl. J. Oncol., en prensa. Como se
describe aquí, la exposición de células tumorales DIME de 1 a 4, da
como resultado alteraciones citológicas y un bloqueo mitótico que
predice la implicación de varios sitios bioquímicos de acción de
DIME. Es importante definir primero el modo de acción celular de
DIME por procedimientos citométricos, antes de analizar los sitios a
nivel biológico. El presente ejemplo se refiere a la acción de DIME
en la morfología celular y nuclear y el avance por la mitosis.
Se examinó la morfología microscópica de células
E-ras por técnicas descritas anteriormente,
Mendeleyev y col., 1997, "Structural Specificity and Tumoricidal
Action of
Methyl-3,5-Diiodo-4-(4'-Meth-oxyphenoxy)
Benzoate (DIME)", Intl. J. Oncol., en prensa; Bauer y col.
1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and
Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-Transformed
Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with
5-Iodo-6-amino-1,2-benzopyrone
(INH_{2}BP)".
Se obtuvo la línea celular
MDA-MB-231 de ATCC (Rockville, MD,
EE.UU.) y las células se cultivaron en matraces T-75
a 37ºC en medio esencial mínimo alfa, complementado con FCS al 10%.
En los controles, que no recibieron DIME, se añadió colcemida 0,1
\mug/ml en los cultivos 4 horas antes de recoger las células
bloqueadas en la metafase y preparación de las propagaciones
celulares. Los efectos de DIME y de la colcemida son indistinguibles
en cuanto al bloqueo del ciclo celular en la fase M, y por lo tanto
cuando se ensayaron los efectos de DIME en las propagaciones de la
metafase no se añadió colcemida. Se aislaron las células (10^{7})
de la tripsinización en T-75 durante 5 min con
tripsina al 0,025%, y se sedimentaron por centrifugación, se
volvieron a suspender y se guardaron en 10 ml de KCl 75 mM a 37ºC
durante 10 min, se volvieron a sedimentar, y se fijaron en 10 ml de
metanol-ácido acético, con cuatro cambios sucesivos de metanol-ácido
acético. Se añadió gota a gota una parte alícuota de la suspensión
celular final (100 \mul) en cubreobjetos limpiados con etanol y
secados al aire.
Se prepararon sondas específicas para cromosomas
humanos por ONCOR (Gaithersburg. MD, EE.UU.). La hibridación se
llevó a cabo por una modificación del procedimiento descrito por
Pinkel y col., 1986, "Cytogenetic Analysis Using Quantitative
High-Sensitivity Fluorescence Hybridization",
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2934-2938.
Las células montadas en el portaobjetos se trataron con pepsina (20
\mug/ml en HCl 0,01 N) a 37ºC durante 10 min, después se
deshidrataron en una serie de etanol al 70%, 85% y 100%, y después
se desnaturalizó el ADN por inmersión en formamida al 70%, seguido
de solución salina de citrato estándar 2X (IX SSC es NaCl 0,5 M,
citrato sódico 0,015 M, pH 7,0) durante 2 min a 70ºC, y se
deshidrató en etanol como se ha descrito antes. La mezcla de
hibridación en un volumen total de 10 \mul consistía en formamida
al 50%, 2X SCC, sulfato de dextrano al 10%, 0,5 g de ADN de esperma
de arenque, y 1-5 \mug de ADN de placenta humana
tratado con proteinasa K. Tanto el ADN de esperma de arenque como el
ADN de placenta humana se trataron previamente con ultrasonidos para
dar fragmentos de 200-600 pb, y se añadieron -40 ng
de sonda de ADN con digoxigenina (desnaturalizado a 70ºC durante 5
min), y se incubaron a 37ºC durante 1 h. Esta mezcla se puso en
portaobjetos que contenían las células fijadas, se cerraron con un
cubreobjetos, y se incubaron a 37ºC durante 2 a 3 días. Después de
completarse la hibridación, los portaobjetos se lavaron en tres
cambios (3 x 5 min) de formamida al 50%, 2 X SSC, pH 7,0, y dos
veces en tampón de PN (que consistía en una mezcla de
NaH_{2}PO_{4} 0,1 M y NaHPO_{4} 0,1 M, Nonidet
P-40 al 0,1%, pH 8,0) a 45ºC, y después se trataron
con FITC antidigoxigenina 5 \mug/ml, FITC de conejo y oveja 2
\mug/ml (Boehringer Mannheim), en tampón de PNM (que es leche
deshidratada no grasa al 5% que contiene azida sódica al 0,02%,
después de centrifugación para separar los sólidos) durante 20 min a
temperatura ambiente, se lavaron dos veces durante 3 min en tampón
PN después de cada incubación, y se tiñó el ADN con DAPI 0,4 \muM
(4,6-diamino-2-fenilindol)
en solución para que no pierda el color (Vector labs, Burlingame,
CA, EE.UU.). Los portaobjetos se observaron en un microscopio de
fluorescencia Zeiss equipado con un filtro de paso de banda múltiple
(Chroma Technology, Brattleboro, VT, EE.UU.) para determinar el
número de señales de FISH en cada núcleo.
Las células en matraces de cultivo tisular
T-25 cerrados se pusieron en una cámara de
incubación de temperatura controlada construida para albergar un
microscopio invertido de contraste de fases. La cámara se protegió
de la luz ambiental. Cada 5 min se encendió la luz del microscopio
durante 12 s, y durante este tiempo se capturó una imagen mediante
un sistema de formación de imágenes obtenido de Compix, Inc. (Mars,
PA, EE.UU.). Se analizaron las secuencias de imágenes con software
de la misma empresa.
Se hicieron crecer hasta confluencia células
expuestas a diferentes tratamientos, se tripsinizaron, y se lavaron
con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para el análisis de
los núcleos, las células se fijaron en tampón celular de citrato
Vindelov: sacarosa 250 mM, citrato trisódico.2H_{2}O 40 mM, DMSO
50 ml en 1000 ml de solución, pH 7,6. Se usaron como control
linfocitos humanos normales obtenidos de la sangre. Se contó cada
muestra de células y control con un hemacitómetro, y la
concentración celular se ajustó a 2 x 10^{6} células/ml. Se
lavaron dos millones de células de cada línea celular en un volumen
total de 2 ml con PBS reciente, se trataron con RNAsa 200 \mug/ml
a 37ºC durante 30 min, y se tiñeron con yoduro de propidio 10
\mug/ml durante 45 min. Se llevó a cabo el análisis por citometría
de flujo en un citómetro de flujo Benchtop FACScan
(Becton-Dickinsori, San Jose, CA, EE.UU.) equipado
con un láser de argón refrigerado por aire ajustado a 488 nm. Se
recogieron veinte mil sucesos como datos en formato de lista de seis
parámetros para analizar y almacenar en archivo. Se obtuvieron dos
parámetros de dispersión de la luz (frontal y ortogonal),
fluorescencia de yoduro de propidio medida a 575/26nm y por encima
de 620 nm, y discriminación de señales debidas a dobletes por el
área y el ancho del pulso de fluorescencia, con una resolución del
canal de datos de 1024. El umbral de adquisición se fijó en los
sucesos positivos del yoduro de propidio por encima del canal 100.
La separación para excluir los restos pequeños, los agregados
grandes y los dobletes de células se hizo después de la
adquisición.
Las células se fijaron en metanol a -20ºC durante
5 min. El anticuerpo principal era antitubulina beta monoclonal de
ratón (Amersham) y el anticuerpo secundario de cabra, conjugado con
isotiocianato de fluoresceína de Cappel (Durham, NC, EE.UU.). El ADN
de los núcleos se tiñó durante 10 min de incubación en
4,6-diamino-2-fenilindol
(DAPI) 0,05 \mug/ml. Las células teñidas se observaron con un
Zeiss 40XPlan-Neofluar o un objetivo Nikon
60XPlanApo. Para clasificar las células en la fase mitótica, se
combinaron la profase y metafase en un sola categoría, porque era
difícil distinguir la profase tardía de la metafase.
Los efectos en la morfología celular después de
incubar células E-ras 20 con DIME 4 \muM durante
18-24 horas se ilustran en la Figura 10. Las células
tumorales aumentaron de tamaño, y como puede verse especialmente con
el aumento de 300 veces, aparecieron numerosos micronúcleos. La
naturaleza de estos cambios citológicos se investigó con más
detalle. Los análisis de citometría de flujo (Figura 11) llevados a
cabo en núcleos de células de carcinoma de mama humano
MDA-MB 231, demostraron que mediante una exposición
al fármaco de 18 horas, se había acumulado un contenido de ADN de
G2, indicando el bloqueo de la fase M.
La observación anterior promovió el examen de las
cinéticas de la entrada en la mitosis en células expuestas a DIME.
Las células se incubaron en medio que contenía DIME 1 \muM y
seguido de videomicroscopía de lapso de tiempo como se ha descrito
en Materiales y Procedimientos. La Figura 12 muestra imágenes que
ilustran un retraso de 13 h en la mitosis seguido de división
irregular en 6 células hija. En contraste, las células control se
retrasaron aproximadamente 0,5 h en la mitosis (véase la Figura 13)
y se dividieron siempre para dar exactamente 2 células hijas (no se
muestran los datos).
La videomicroscopía de lapso de tiempo también
permitió seguir el destino de las células hijas que resultaban de la
división celular irregular antes descrita. El veinte por ciento de
la mitosis observada en presencia de DIME 1 \muM dio células hijas
que fusionaron (Tabla 12), dando con frecuencia células
multinucleadas grandes del tipo observado en la Figura 10. Las
células de control no presentaban dicha división después de la
fusión.
| DIME incluye la fusión entre células hijas después de mitosis | ||
| Nº de mitosis controladas^{a} | \begin{minipage}[t]{45mm}N^{o} de mitosis seguidas de fusión de las células hijas^{b}\end{minipage} | |
| DIME 1,0 \muM | 35 | 7 |
| Control | 32 | 0 |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{145mm}Las mitosis se controlaron por videomicroscopía de lapso de tiempo durante la exposición continua de las células a DIME;\end{minipage} | ||
| ^{b} \begin{minipage}[t]{145mm}La fusión de las células hijas se producía a los pocos minutos de la citocinesis e implicaba 2-5 células hijas.\end{minipage} | ||
Se examinó la división celular que tenía lugar en
presencia de DIME 1 \muM para evaluar cuantitativamente el número
de células hijas que resultaban de cada mitosis (Figura 14). El
número de células hijas estaba en el intervalo de 1 a 6 por sucesos
mitótico. En contraste las células de control siempre se dividieron
(33/33) para dar 2 hijas. Por lo tanto al largo retraso inducido por
el fármaco en la mitosis antes descrito, le seguía un modelo muy
anómalo de división celular.
La Figura 15 muestra las velocidades a las que
las células que se incuban con DIME 1 \muM y las células control
entraban en la mitosis. Las curvas son casi coincidentes, lo cual
indicaba que DIME no afectaba a la velocidad a la que las células
atravesaban la interfase. En contraste, el periodo medio de tiempo
que cada célula tardaba en la mitosis aumentó en más de 20 veces con
el fármaco (Figura 13). Se confirmó que las células bloqueadas por
DIME en una configuración completa estaban realmente en mitosis por
su cromatina condensada y expandida (Figura 16) y por los husos
mitóticos anómalos (Figura 17).
Se llevó a cabo el análisis de cromosomas por
hibridación in situ de núcleos en la metafase con sondas
específicas para los cromosomas 1, 2, 7, 11 y 19. Todos dieron
resultados similares, y por lo tanto sólo se ilustra el cromosoma
19. Se muestran resultados representativos para el cromosoma 19 en
las Figuras 16 A, B y C. En todos los casos se usaron células
MDA-MB-231 (cáncer de mama humano).
La Figura 16A muestra la hibridación in situ en el cromosoma
19. La exposición a DIME 1 \muM durante 18 h no tenía un efecto
detectable, y por lo tanto las Figuras 16A y 16B representan tanto
las células control como las tratadas con fármaco. La Figura 16B
tiene el ADN teñido (DAPI) ilustrando la coincidencia de tinción de
ADN con la cromatina, mientras que la Figura 16A tiene teñido el
cromosoma 19. Sin embargo, la exposición de las células al fármaco
(DIME 1 \muM) durante 5 días induce una gran acumulación de
cromatina en la metafase en algunas células, con aproximadamente 40
señales de cromosoma-19, y alrededor de 100
cromosomas (Figura 16C). No se pudieron obtener pruebas de la rotura
de cromosoma, incluso aunque este tratamiento con fármaco finalmente
mata las células, Mendeleyev y col., 1997, "Structural Specificity
and Tumoricidal Action of
Methyl-3,5-Diiodo-4-(4'-Meth-oxyphenoxy)
Benzoate (DIME)", Intl. J. Oncol.,
10:689-695.
La estructura del huso mitótico después de 18 h
de exposición a DIME 1 \muM se representa en la Figura 17. La
Figura 17A es el huso mitótico con la tubulina teñida en células de
cáncer MDA-MB-231 no tratadas con
fármaco. La Figura 17B muestra cambios después de 18 h de exposición
al fármaco que consistían en anomalías llamativas de la distribución
de tubulina. Estas estructuras multicéntricas eran incluso más
exageradas después de exposición a DIME 1 \muM durante 5 días
(Figura 17C). La distribución multicéntrica celular de tubulina
(Figura 17B y 17C) parece similar a la nucleación de tubulina por
centrosomas añadidos in vitro como muestran Mitchison y col.,
1984, "Microtubule Assembly Nucleated by Isolated Centrosomes"
Nature 312:232-237. Sin embargo no se pudo
detectar un número anómalo de cromosomas por inmunofluorescencia (no
se muestran los datos), por lo que la aparente nucleación
multicéntrica de tubulina después de 18 h de tratamiento con DIME (1
\muM) no se puede relacionar directamente con los
centrosomas.
Estas figuras no predicen si DIME 1 \muM induce o no la despolimerización de tubulina o inhibe la repolimerización.
Estas figuras no predicen si DIME 1 \muM induce o no la despolimerización de tubulina o inhibe la repolimerización.
En estudios preliminares (no se muestran los
datos) también se ha estudiado el comportamiento de algunas
proteínas asociadas al huso por la técnica inmunocitológica. La
quinasa Cdc-2 no estaba asociada con el huso en
ausencia de DIME 1 \muM, pero la exposición de las células al
fármaco durante 18 horas demostró la inducción de la unión de
cdc-2-quinasa-huso.
El tratamiento con fármaco no alteraba el modelo de tinción por el
antisuero de la proteína pericentrina del centrosoma, ya que sólo se
observaban dos focos. La asociación de ciclina
B-microtúbulo-huso también
permanecía inalterada. Sin embargo, el fármaco inducía la
organización anómala de los centros polares del huso unidos todavía
a la ciclina B. En la asociación de la
proteína-fosfatasa 2a (pp2a)-huso,
como la pericentrina o ciclina B, no influía el tratamiento con
fármaco (1 \muM durante 18 horas).
Estos estudios de exploración comprenden la base
de la investigación biológica celular adicional. En experimentos
preliminares también se trató el posible papel de las fosfatasas en
las asociaciones de proteína-huso. La exposición a
ácido okadaico 100 nM extracelular durante 18 h, sólo eliminó la
asociación de cdc-2-quinasa- y
pp2a-huso, sugiriendo la implicación de las proteína
fosfatasas (no se muestran los datos).
Estos resultados parece que discriminan entre los
efectos tempranos de DIME 1 \muM, que se producen a las
18-24 horas después de la exposición al fármaco, y
las consecuencias tardías observadas aquí en el número de cromosomas
que se desarrollan después de 5 días de tratamiento con fármaco. Sin
embargo, es probable que los sucesos tardíos reflejen simplemente
una cascada de reacciones celulares iniciadas por la unión de DIME a
determinados sitios celulares. Los sucesos tempranos incluyen
cambios citológicos notables, específicamente la aparición de
células multinucleadas grandes. Se sabe que la formación de
micronúcleos se produce después de lesión por irradiación, y que
consiste en el fracaso de los fragmentos de cromosomas acéntricos
para producir la migración nuclear a los polos durante la anafase
debido a la ausencia de cinetocoros y unión de los microtúbulos del
huso, Bedford, J.S., 1991, "Sublethal Damage, Potentially Lethal
Damage, and Chromosomal Aberration in Mammalian Cells Exposed to
Ionizing Radiation", J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 21:
1457-1469. Los estudios de lapso de tiempo han
mostrado que el sulfato de vinblastina también induce células
multinucleadas bloqueadas en la metafase, Kirshan, 1968, "Time
Lapse and Ultrastructure Studies on the Reversal of Mitotic Arrest
Induces by Vinblastine Sulfate in Earl's L Cells", J. Natl.
Cáncer Institute 41:581-595, que recuerda a los
resultados mostrados aquí (Figura 10), excepto que los alcaloides de
la vinca también presentan efecto tóxicos graves en animales,
mientras que DIME no los tiene. La sobreexpresión de la proteína
fosfatasa 2a (pp2a) también induce la multinucleación, Wera y col.,
1995, "Deregulation of Transitional Control of the 65 kDa
Regulatory Subunit (PR65 Alpha) of Protein Phosphatase 2A leads to
Multinucleated Cells", J. Biol. Chem.
270:21374-21381, indicando claramente que el
mecanismo de desarrollo de este proceso complejo (multinucleación)
puede implicar una variedad de actividades enzimáticas probablemente
conectadas. Estos resultados muestran una activación de la pp2a en
las células con DIME (l.c.l), un efecto que probablemente se debe a
la acción directa de DIME en esta enzima. La participación de
diferentes enzimas celulares en el modo de acción de DIME es el
objeto de una publicación bioquímica separada.
Uno de los fenómenos celulares más fácilmente
observable inducido por DIME es un bloqueo en la fase M (Figuras 11
y 13), muy similar a la acción de la colcemida o especialmente los
alcaloides de la vinca, que se pueden sustituir por DIME. Los
efectos tardíos de DIME (5 días), ilustrados por la hibridación de
ADN-fluorescencia con sondas a los cromosomas 1, 2,
7, 11 y 19, son el resultado de la acumulación de cromosomas, debido
al fracaso de la división celular. DIME no tiene un efecto aparente
directo en el ADN. Los cortes en el ADN bicatenario (Figura 12 en
Mendeleyev y col., 1997, "Structural specificity and tumoricidal
action of
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)" Int. J. Oncology
10:689-695, son consecuencias corriente abajo de la
interacción de DIME con células cancerígenas y reflejan más
probablemente la regulación positiva de las
ADN-endonucleasas que son
de-poli-ADP-ribosiladas
en células tratadas con DIME mediante una activación indirecta de la
poli(ADP-ribosa)glicohidrolasa (nota
de pie de página I en la ref. 1). La activación de la endonucleasa
pueden no ser la única provocación de la muerte celular programada
por DIME, puesto que se sabe que diversos mecanismos moleculares
pueden conducir a la apoptosis, Wertz y col., 1996, "Diverse
Molecular Provocation of Programmed Cell Death", TIBS
21:359-364. El desarrollo de un huso mitótico
anómalo en células tratadas con DIME indica una acción celular
inicial de DIME en el sistema de tubulina, que se sabe que juega un
papel principal en la citocinesis, Murray y col., 1993, "The Cell
Cycle: An Introduction.", Oxford University Press, New York.
Puesto que DIME es un análogo de hormona tiroidea
"hormonalmente inactivo", surge la pregunta intrigante de si
los precursores metabólicos (o catabólicos) de las hormonas
tiroideas pueden o no jugar un papel en el mantenimiento de la
diferenciación fisiológica, sirviendo como reguladores correctores
de "antimalignidad". Parece que está garantizada la búsqueda de
metabolitos de la hormona tiroidea con acción tumoricida.
Ejemplo
11
En los siguientes experimentos el análogo de
hormona tiroidea hormonalmente inactivo, DIME con concentraciones 1
a 5 \muM inhibe la polimerización dependiente de GTP de la MTP
determinado por un ensayo óptico. Esta inhibición depende
críticamente de la concentración de GTP. La correlación cuantitativa
entre las concentraciones de DIME y GTP, en condiciones de una
velocidad lineal de polimerización de MTP, sigue la cinética de
Michaelis-Menten y la inhibición representa un tipo
"mixto", en el que k_{m} para GTP y U_{max} se alteran
simultáneamente. Los análogos químicos de DIME inhiben la
polimerización de MTP de forma paralela a su acción antitumorigénica
in vivo. El sitio de la MTP es uno de los sitios de respuesta
celular temprana de DIME.
La exposición de células de cáncer de mama humano
(MDA-MB-231) a DIME 1 \muM inducía
estructuras de huso anómalas con 18 horas de tratamiento de fármaco,
y por lo tanto, parece que la interacción de DIME
putativo-proteína de microtúbulo (MTP) es un
componente de respuestas celulares tempranas al fármaco, Zhen, y
col., 1997. "Cellular Analysis of the mode of action of
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoate
(DIME) on tumor cells", Intl. J. Oncol. Las estructuras de
huso anómalas podrían ser el resultado de la interacción de
DIME-MTP o reacciones de DIME con componentes del
centro que organiza los microtúbulos o con sistemas hasta ahora
indefinidos secuencialmente o simultáneamente. Puesto que el
análisis cuantitativo dependiente del tiempo del sistema de MTP
in situ no es adecuado para la medición de la velocidad
inicial, se adaptó el sistema de unión de neurotúbulos in
vitro como modelo para un análisis cuantitativo de la
interacción de DIME con MTP. Gaskin , y col., 1974, "Turbidimetric
studies of the in vitro assembly and disassembly of porcine
neurotubules", J. Mol. Biol. 89:737-758; y
Kirschner, y col., 1974, "Microtubules from mammalian brain: some
properties of their depolymerization products and a proposed
mechanism of assembly and disassembly", Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 71:1159-1163; este sistema es
adecuado para el ensayo cinético de la unión de MTP in vitro.
El transcurso del tiempo de la unión de MTP consiste en las etapas
de inicio, propagación y terminación, Gaskin, y col., 1974,
"Turbidimetric studies of the in vitro assembly and
disassembly of porcine neurotubules", J. Mol. Biol.
89:737-758. La velocidad de propagación en
condiciones definidas es suficientemente lineal para permitir el
análisis cinético, que se puede evaluar respecto a las
concentraciones de DIME y GTP. Como se muestra en el presente
documento la inhibición de la unión de MTP por DIME se produce en el
mismo intervalo de concentración de fármaco que es necesario para
inhibir la tumorigénesis in vivo, o para inhibir la
replicación celular o inducir la muerte celular final; Mendeleyev y
col., 1997, "Structural specificity and tumoricidal action of
methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)
benzoate (DIME)" Int. J. Oncol.
10:689-695, y Tabla 8 anteriormente; por lo tanto,
la interacción de DIME-MTP probablemente es un
componente del mecanismo celular pleiotrópico de la acción de
DIME.
Se adoptó la preparación de MTP y un ensayo
óptico para la polimerización de procedimientos publicados, Gaskin,
y col., 1974, "Turbidimetric studies of the in vitro
assembly and disassembly of porcine neurotubules", J. Mol.
Biol. 89: 737-758; Tiwari y col., 1993, "A pH
and temperature-dependent cycling method that
doubles the yield of microtubule protein", Anal. Biochem.,
215:96-103. Se homogeneizó cerebro bovino o de
conejo en un volumen igual de tampón enfriado con hielo que contenía
Pipes/K^{+} 100 mM (pH 7,4), EGTA 4 mM, MgCl_{2} 1 mM, DTT 0,5
mM y PMSF 0,1 mM, y se centrifugó a 39,000 g durante 1 hora a 4ºC.
Se añadieron al líquido sobrenadante DMSO (concentración final 8%) y
GTP (concentración final 1 mM), seguido de incubación a 37ºC durante
30 minutos. Los microtúbulos se sedimentaron a 100.000 a 37ºC
durante 30 minutos. Los sedimentos se incubaron en hielo durante 15
minutos, seguido de resuspensión en tampón de PEM enfriado con hielo
(Pipes/K^{+} 100 mM (pH 6,9), EGTA 1 mM, MgCl_{2} 1 mM). Este
ciclo de polimerización en caliente y despolimerización en frío se
repitió una vez más y la MTP monómera fría resuspendida
(8-10 mg/ml de proteína) se usó para el ensayo
óptico de la cinética de polimerización. Tanto el cerebro de conejo
como el bovino dieron preparaciones de MTP idénticas.
La composición del ensayo óptico se describe en
las leyendas de las Figuras y en la Tabla 12. La reacción de
polimerización se inició por adición de 100 \mul de solución de
MTP (equivalente a 0,8-1,0 mg de proteína) y se
siguieron y registraron las velocidades lineales iniciales de
aumento de absorbancia a 350 nm (véase la Figura 1) en un
espectofotómetro Perkin-Elmer 552 de doble haz,
equipado con un portacubeta controlado con termostato.
La precisión del ensayo óptico para la
polimerización de la MTP se ilustra en la Figura 18. Las condiciones
experimentales eran las mismas que las dadas en la leyenda de la
Tabla 7, excepto que la concentración de GTP era 1 mM (curva de la
derecha) y la de DIME era 4 \muM (curva de la izquierda). Es
evidente que la velocidad de polimerización de MTP transcurre de una
forma lineal, y por lo tanto parece que se cumplen las condiciones
para las velocidades de polimerización máximas definidas por Berne,
B. 1974, "Interpretaron of light scattering from long rods",
J. Mol. Biol. 89:755-758. Por lo tanto se
puede determinar la correlación cuantitativa entre [DIME] y [GTP]
comparando la velocidad lineal en presencia de diferentes
concentraciones de fármaco y activador. Con una concentración de GTP
1 mM, concentraciones crecientes de DIME inhiben progresivamente la
polimerización de MTP (Figura 1B).
Como se muestra en la Figura 20, la inhibición de
DIME 1 \muM se correlaciona cuantitativamente con la [GTP] y una
representación gráfica de la recíproca doble producía una inhibición
de tipo "mixto", Dixon, y col., 1964 Enzymes, pp.
234-237, Acad. Press, Inc., New York. Tanto el valor
de V_{max} como de k_{m} cambiaron, casi 50% el de k_{m} de
GTP de 6,7 \muM a 14 \muM, mientras que V_{max} disminuyó casi
el 50%. La interpretación más sencilla de una inhibición mixta,
basándose en la ecuación de Briggs-Haldane
(compárese con 7) es que k_{2}, es decir, la disociación de [ES] a
E y P (producto), está afectada directamente, de modo que modifica
tanto k_{m} como V_{max}. La naturaleza exacta de k_{2} se
desconoce en este momento, y su determinación requiere el análisis
de los productos de reacción de la hidrólisis de GTP, un trabajo que
se describe en otra parte. Las modificaciones alostéricas también
pueden dar resultados similares, Dixon, y col., 1964 Enzymes,
pp. 234-237, Acad. Press, Inc., New York. El
propósito de los presentes experimentos es comparar la eficacia de
DIME con algunos de sus análogos en la polimerización de MTP (véase
la Tabla 12) y correlacionar los resultados con procesos
citopatológicos (por ejemplo, inhibición de la tumorigénesis in
vivo).
Hay una evidente correlación entre la estructura
química de DIME y 7 de sus análogos que pueden actuar en la
polimerización de MTP (Tabla 13), y su potencia inhibidora en la
tumorigénesis in vivo (compárese con la Tabla 8 o Mendeleyev
y col., véase antes). Por ejemplo, la sustitución de R_{1} de
CH_{3}O a EtO y n-BuO disminuye progresivamente la
inhibición de la polimerización de MTP, casi exactamente de forma
paralela a la disminución del efecto tumorigénico (compárese con la
Tabla 8 o Mendeleyev y col., véase antes). Por otra parte, la
sustitución en R_{2} de éster de metilo a ácido carboxílico
elimina completamente el efecto de inhibición en la polimerización
de MTP pero sólo reduce a la mitad la acción antitumorigénica,
ensayada con células E-ras 20 (véase la Tabla 8 y
Figura 5 o Mendeleyev y col.,
véase antes). Es posible que dichas diferencias cuantitativas puedan reflejar variaciones específicas del tipo de célula.
véase antes). Es posible que dichas diferencias cuantitativas puedan reflejar variaciones específicas del tipo de célula.
| Compuesto nº | R_{1} | R_{2} | Porcentaje de inhibición de |
| la velocidad inicial | |||
| 1 | CH_{3}O | CH_{3}O | 93 |
| 2 | EtO | CH_{3}O | 76 |
| 4 | n-BuO | CH_{3}O | 8 |
| 6 | CH_{3}O | HO | 0 |
| 5 | CH_{3}O | EtO | 35 |
| 7 | CH_{3}O | H_{2}N | 43 |
| 9 | CH_{3}O | (CH_{3})_{2}N | 6 |
| 18 | CF_{3}O | CH_{3}O | 7 |
El sistema de ensayo consistía en 240 \mul de
tampón de PEM que contenía DMSO al 8% y GTP (concentración final 1
mM), concentración final de fármaco 10 \muM (añadido en 3 \mul),
o control con disolvente y 0,6 mg de MTP (60 \mul). La unión de
microtúbulos a 37ºC se controló a \lambda = 350 nm, y las
velocidades iniciales se calcularon como mA_{350}/min. El control
tenía una velocidad inicial de 180 mA_{350}/min. Los valores son
medias de los ensayos por duplicado.
La inhibición de la polimerización de MTP puede
tener consecuencias celulares muy complejas. En la citocinesis esta
inhibición puede interferir con las fuerzas de tracción de la
tubulina y evitar la formación de un surco de escisión que es
esencial para la división celular, Burton, y col., 1997, "Traction
forces of cytokinesis measured with optically modified elastic
substrate", Nature 385:450-454. La
inhibición de la polimerización de MTP por DIME debería
correlacionarse con los sitios bioquímicos de este fármaco. Cuando
se compara con Mendeleyev y col., véase antes, DIME activa
directamente la pp2-asa, y por lo tanto es necesario
coordinar este efecto con el fenómeno relacionado con la mitosis
inducido por DIME. Por ejemplo, recientemente se ha publicado,
Kawabe, y col., 1997, "HOXII interacts with protein phosphatase
pp2a and pp1 and disrupts G2/M cell cycle check point"
Nature 385:454-458, que la
pp2-asa puede regular la transición G2/M y la
pp2-asa también es un potencial oncogén, cuya
inhibición promueve la oncogénesis. Es posible que la activación de
la pp2-asa por DIME sea antagónica a la
oncogénesis.
Basándose en estos experimentos, se puede ver que
los análogos de tipo tiroxina, tales como DIME, pueden bloquear la
mitosis en células cancerígenas. La presente invención proporciona
una rápida selección de dichos compuestos usando estas técnicas y
usando separadores celulares, transferencia de cromosoma y otros
análisis de ADN en las células.
Claims (8)
1. Uso de un análogo de tiroxina, opcionalmente
combinado con un vehículo fisiológicamente aceptable, para preparar
una composición farmacéutica para tratar un tumor maligno en un
mamífero, en el que dicho análogo de tiroxina se caracteriza
por ser un compuesto capaz de producir aproximadamente 35 por ciento
o más de inhibición de la velocidad inicial de la unión de las
proteínas de microtúbulos in vitro y en el que el análogo de
tiroxina tiene la fórmula:
y sales farmacéuticamente
aceptables del mismo, en la
que:
X = O, S, CH_{2}, carboxi o está ausente;
Y = O o S;
R_{1} = metilo o etilo;
R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en: H,alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxilo, alcoxi
(C_{1}-C_{4}) y halógeno; y
R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxilo, alcoxi
(C_{1}-C_{4}), halógeno, NO_{2} y
NH_{2}.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que el
análogo de tiroxina tiene la fórmula:
y sales farmacéuticamente
aceptables del mismo en la
que:
X = O, S, CH_{2}, carboxi o está ausente;
Y = O o S;
R_{1} = metilo o etilo;
R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxilo, alcoxi
(C_{2}-C_{4}) y halógeno; y
R_{7} y R_{8} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxilo, alcoxi
(C_{1}-C_{4}), halógeno, NO_{2} y NH_{2}.
3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que
el análogo de tiroxina es el
3,5-diyodo-4-(4'-metoxi-fenoxi)benzoato
de metilo.
4. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el análogo de tiroxina está en una
cantidad eficaz para producir la regresión del tumor maligno.
5. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el tumor maligno es carcinoma o
sarcoma.
\newpage
6. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha composición farmacéutica es
para administración oral.
7. Uso de un análogo de tiroxina, opcionalmente
combinado con un vehículo fisiológicamente aceptable, para preparar
una composición farmacéutica para tratar el cáncer, en el que dicho
análogo de tiroxina tiene la fórmula estructural:
y sales farmacéuticamente
aceptables del mismo, en la
que:
X = O, S, CH_{2}, carboxi o está ausente;
Y = O o S;
R_{1} = metilo o etilo;
R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxilo, alcoxi
(C_{1}-C_{4}) y halógeno; y
R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en: H, alquilo
(C_{1}-C_{4}), alquenilo
(C_{2}-C_{4}), alquinilo
(C_{2}-C_{4}), hidroxilo, alcoxi
(C_{1}-C_{4}), halógeno, NO_{2} y
NH_{2}.
8. El uso de la reivindicación 7, en el que el
cáncer es carcinoma o sarcoma.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/655,267 US5736576A (en) | 1996-06-04 | 1996-06-04 | Method of treating malignant tumors with thyroxine analogues having no significant hormonal activity |
| US655267 | 1996-06-04 | ||
| US08/833,272 US6017958A (en) | 1996-06-04 | 1997-04-03 | Method of treating malignant tumors with thyroxine analogues having no significant hormonal activity |
| US833272 | 1997-04-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2246514T3 true ES2246514T3 (es) | 2006-02-16 |
Family
ID=27096941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97927813T Expired - Lifetime ES2246514T3 (es) | 1996-06-04 | 1997-05-30 | Analogos de tiroxina desprovistos de actividad hormonal importante para tratar tumores malignos. |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6017958A (es) |
| EP (1) | EP0954299B1 (es) |
| JP (1) | JP4188416B2 (es) |
| CN (1) | CN1154486C (es) |
| AT (1) | ATE300292T1 (es) |
| AU (1) | AU730261B2 (es) |
| BR (1) | BR9710686A (es) |
| CA (1) | CA2257235C (es) |
| DE (1) | DE69733834T2 (es) |
| DK (1) | DK0954299T3 (es) |
| ES (1) | ES2246514T3 (es) |
| IL (1) | IL127384A0 (es) |
| NZ (1) | NZ333356A (es) |
| PT (1) | PT954299E (es) |
| WO (1) | WO1997046228A1 (es) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5922775A (en) * | 1997-10-23 | 1999-07-13 | Octamer, Inc. | Method of treating malignant tumors with ketone thyroxine analogues having no significant hormonal activity |
| US6433012B1 (en) * | 1998-03-25 | 2002-08-13 | Large Scale Biology Corp. | Method for inhibiting inflammatory disease |
| US6150407A (en) * | 1998-03-25 | 2000-11-21 | Large Scale Biology Corporation | Methods for inhibiting angiogenesis |
| US6740680B1 (en) * | 1999-04-26 | 2004-05-25 | Becton Pharma, Inc. | Pharmaceutical compositions to tetrac and methods of use thereof |
| US6677473B1 (en) | 1999-11-19 | 2004-01-13 | Corvas International Inc | Plasminogen activator inhibitor antagonists |
| US6638977B1 (en) | 1999-11-19 | 2003-10-28 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists |
| US7504435B2 (en) | 2001-01-31 | 2009-03-17 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Method for stimulating weight loss and/or for lowering triglycerides in patients |
| US20050159490A1 (en) * | 2001-01-31 | 2005-07-21 | Eugene Morkin | Method to treat chronic heart failure and/or elevated cholesterol levels |
| AUPR500201A0 (en) | 2001-05-14 | 2001-06-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Recovery of minerals by flotation |
| JP4919598B2 (ja) | 2002-06-06 | 2012-04-18 | 株式会社 キャンバス | Ｄｎａ損傷誘発性細胞周期ｇ２チェックポイントを排除し、そして／またはｄｎａ損傷処置の抗癌活性を増強する化合物 |
| JP2007501608A (ja) * | 2003-08-08 | 2007-02-01 | 株式会社 キャンバス | 抗癌治療の効力を推定するための感受性試験 |
| US20050249667A1 (en) * | 2004-03-24 | 2005-11-10 | Tuszynski Jack A | Process for treating a biological organism |
| SG164368A1 (en) * | 2005-07-18 | 2010-09-29 | Bipar Sciences Inc | Treatment of cancer |
| ES2380236T3 (es) | 2005-10-28 | 2012-05-09 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Compuesto de amida heterocíclica y uso del mismo |
| US20100279327A1 (en) * | 2006-06-12 | 2010-11-04 | Bipar Sciences, Inc. | Method of treating diseases with parp inhibitors |
| US20080262062A1 (en) * | 2006-11-20 | 2008-10-23 | Bipar Sciences, Inc. | Method of treating diseases with parp inhibitors |
| JP2010504079A (ja) * | 2006-06-12 | 2010-02-12 | バイパー サイエンシズ，インコーポレイティド | Ｐａｒｐ阻害剤を用いる疾病の治療方法 |
| WO2008030892A2 (en) * | 2006-09-05 | 2008-03-13 | Bipar Sciences, Inc. | Drug design for tubulin inhibitors, compositions, and methods of treatment thereof |
| CA2662337A1 (en) * | 2006-09-05 | 2008-03-13 | Bipar Sciences, Inc. | Inhibition of fatty acid synthesis by parp inhibitors and methods of treatment thereof |
| WO2008030883A2 (en) * | 2006-09-05 | 2008-03-13 | Bipar Sciences, Inc. | Treatment of cancer |
| WO2008030887A2 (en) * | 2006-09-05 | 2008-03-13 | Bipar Sciences, Inc. | Methods for designing parp inhibitors and uses thereof |
| WO2008039941A2 (en) | 2006-09-27 | 2008-04-03 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dpt. Of Health And Human Services | Scgb3a2 as a growth factor and anti-apoptotic agent |
| US20090149417A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-06-11 | Valeria Ossovskaya | Methods and compositions for the treatment of cancer using benzopyrone-type PARP inhibitors |
| SG185952A1 (en) * | 2007-11-12 | 2012-12-28 | Bipar Sciences Inc | Treatment of breast cancer with 4-iodo-3-nitrobenzamide in combination with anti-tumor agents |
| US20090123419A1 (en) * | 2007-11-12 | 2009-05-14 | Bipar Sciences | Treatment of uterine cancer and ovarian cancer with a parp inhibitor alone or in combination with anti-tumor agents |
| RU2010128107A (ru) * | 2007-12-07 | 2012-01-20 | Байпар Сайенсиз, Инк. (Us) | Лечение рака ингибиторами топоизомеразы в комбинации с ингибиторами parp |
| CN101999002A (zh) * | 2008-02-04 | 2011-03-30 | 彼帕科学公司 | 诊断和治疗parp-介导的疾病的方法 |
| BR112012027463A2 (pt) | 2010-04-28 | 2015-09-29 | Aleck Hercbergs | método terapêutico, composição farmacêutica, uso de tri-iodotironina (t3) ou de análogo bioquímico da mesma, tri-iodotironina (t3) ou um análogo bioquímico da mesma, e, kit |
| BR112015003116B1 (pt) * | 2012-08-20 | 2020-05-12 | Merck Patent Gmbh | Preparação farmacêutica sólida contendo levotiroxina |
| US10874641B2 (en) | 2016-07-28 | 2020-12-29 | Mitobridge, Inc. | Methods of treating acute kidney injury |
| SG11201903842YA (en) | 2016-11-02 | 2019-05-30 | Immunogen Inc | Combination treatment with antibody-drug conjugates and parp inhibitors |
| EP3655418A4 (en) | 2017-06-22 | 2021-05-19 | Triact Therapeutics, Inc. | METHOD OF TREATMENT OF GLIOBLASTOMA |
| US11628144B2 (en) | 2017-09-29 | 2023-04-18 | Triact Therapeutics, Inc. | Iniparib formulations and uses thereof |
| US11874276B2 (en) | 2018-04-05 | 2024-01-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | STING levels as a biomarker for cancer immunotherapy |
| US20220305048A1 (en) | 2019-08-26 | 2022-09-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Use of heparin to promote type 1 interferon signaling |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB642159A (en) * | 1947-10-23 | 1950-08-30 | Glaxo Lab Ltd | Improvements in or relating to the preparation of diphenyl ethers |
| GB643089A (en) * | 1947-10-23 | 1950-09-15 | Glaxo Lab Ltd | Improvements in or relating to the preparation of 2:6-dihalogeno diphenyl ethers |
| US4724234A (en) * | 1982-09-17 | 1988-02-09 | Therapeutical Systems Corp. | Method for producing oncolysis |
| US4816255A (en) * | 1985-07-31 | 1989-03-28 | Ghent William R | Treatment of iodine deficiency breast syndrome |
| WO1993002444A1 (en) * | 1991-07-24 | 1993-02-04 | Vladislav Vladimirovich Volkov | Tensioning device for keyboard stringed musical instrument |
| AU4090093A (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-30 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Medicine containing benzoic acid derivative and novel benzoic acid derivative |
| US5736576A (en) * | 1996-06-04 | 1998-04-07 | Octamer, Inc. | Method of treating malignant tumors with thyroxine analogues having no significant hormonal activity |
| US5883294A (en) * | 1997-06-18 | 1999-03-16 | The Regeants Of The University Of California | Selective thyroid hormone analogs |
| US5922775A (en) * | 1997-10-23 | 1999-07-13 | Octamer, Inc. | Method of treating malignant tumors with ketone thyroxine analogues having no significant hormonal activity |
-
1997
- 1997-04-03 US US08/833,272 patent/US6017958A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-30 JP JP50067098A patent/JP4188416B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-30 BR BR9710686-0A patent/BR9710686A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-05-30 CA CA002257235A patent/CA2257235C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-30 NZ NZ333356A patent/NZ333356A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 DE DE69733834T patent/DE69733834T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-30 CN CNB971969795A patent/CN1154486C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-30 PT PT97927813T patent/PT954299E/pt unknown
- 1997-05-30 EP EP97927813A patent/EP0954299B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-30 DK DK97927813T patent/DK0954299T3/da active
- 1997-05-30 IL IL12738497A patent/IL127384A0/xx unknown
- 1997-05-30 AU AU32182/97A patent/AU730261B2/en not_active Ceased
- 1997-05-30 ES ES97927813T patent/ES2246514T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-30 WO PCT/US1997/009086 patent/WO1997046228A1/en active IP Right Grant
- 1997-05-30 AT AT97927813T patent/ATE300292T1/de active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ333356A (en) | 2000-06-23 |
| AU730261B2 (en) | 2001-03-01 |
| AU3218297A (en) | 1998-01-05 |
| ATE300292T1 (de) | 2005-08-15 |
| CN1154486C (zh) | 2004-06-23 |
| EP0954299A1 (en) | 1999-11-10 |
| JP2001501590A (ja) | 2001-02-06 |
| EP0954299A4 (en) | 2000-09-06 |
| US6017958A (en) | 2000-01-25 |
| CA2257235C (en) | 2007-01-30 |
| CA2257235A1 (en) | 1997-12-11 |
| EP0954299B1 (en) | 2005-07-27 |
| CN1226826A (zh) | 1999-08-25 |
| PT954299E (pt) | 2005-11-30 |
| JP4188416B2 (ja) | 2008-11-26 |
| WO1997046228A1 (en) | 1997-12-11 |
| DE69733834D1 (de) | 2005-09-01 |
| DE69733834T2 (de) | 2006-06-01 |
| IL127384A0 (en) | 1999-10-28 |
| BR9710686A (pt) | 2000-01-11 |
| DK0954299T3 (da) | 2005-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2246514T3 (es) | Analogos de tiroxina desprovistos de actividad hormonal importante para tratar tumores malignos. | |
| WO1997046228A9 (en) | Method of treating malignant tumors with thyroxine analogues having no significant hormonal activity | |
| US5736576A (en) | Method of treating malignant tumors with thyroxine analogues having no significant hormonal activity | |
| EP1024800B1 (en) | Thyroxine analogues having no significant hormonal activity to treat malignant tumors | |
| ES2660782T3 (es) | Inhibidores de la vía de señalización de Notch y uso de los mismos en el tratamiento de los cánceres | |
| CA2180658C (en) | Treatment of platelet derived growth factor related disorders such as cancers using inhibitors of platelet derived growth receptor | |
| ES2715769T3 (es) | Procedimiento de cribado de un agente terapéutico contra cáncer mutante K-Ras | |
| JP2002534400A (ja) | 血管損傷剤としてのコルヒノール誘導体 | |
| US11584718B2 (en) | Activators of the unfolded protein response | |
| CN103502219A (zh) | 作为治疗剂的新型小分子 | |
| CA2944069A1 (en) | Sigma-2 receptor ligand drug conjugates as antitumor compounds, methods of synthesis and uses thereof | |
| ES2349746T3 (es) | Compuestos derivados del cromeno con actividad de diana anti-tibulina y vascular. | |
| ES2232634T3 (es) | Utilizacion de la aloe-emodina en el tratamiento de los tumores neuroectodermicos. | |
| Liu et al. | Fluoroindole chalcone analogues targeting the colchicine binding site of tubulin for colorectal oncotherapy | |
| US10882852B1 (en) | 3-vinylquinolines as cancer cells inhibitors | |
| KR100484014B1 (ko) | 호르몬활성을가지지않는티록신유사체로악성종양을치료하는방법 | |
| CN102633668B (zh) | 化合物在转录因子失调相关疾病的治疗药物中的应用 | |
| US8809368B2 (en) | Compounds affecting gap junction activity | |
| RU2527526C2 (ru) | Индолил-замещенные пиразино-хинолины и их применение для лечения рака | |
| WO2017072374A1 (es) | Derivados de 5-nitroindazol y su uso como agentes antiprotozoarios | |
| Ma et al. | ML162 derivatives incorporating a naphthoquinone unit as ferroptosis/apoptosis inducers: Design, synthesis, anti-cancer activity, and drug-resistance reversal evaluation | |
| Rehan | Design, synthesis and biological evaluation of novel targeted anthelmintic agents | |
| WO2021222738A1 (en) | Compounds for estrogen receptor positive cancers |