ES2246314T3 - Administracion intratumoral de moleculas desnudas de acido nucleico que codifican il-12. - Google Patents

Abstract

El uso de una molécula desnuda de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor, en el que la composición farmacéutica se administra intratumoralmente.

Description

Administración intratumoral de moléculas desnudas de ácido nucleico que codifican IL-12.

La presente invención se refiere al uso de una molécula desnuda de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12, en particular un heterodímero p75 que comprende dos subunidades, es decir, p40 y p35, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor, en el que la composición farmacéutica se administra intratumoralmente.

El cáncer es todavía una de las principales causas de muerte en la humanidad. Por lo tanto, se ha investigado mucho para entender el origen del cáncer y para desarrollar métodos para la prevención y/o tratamiento de los diversos tipos de cáncer.

Un tipo de moléculas que se han probado como agentes antineoplásicos son las citocinas, tales como IL-2, GM-CSF e IL-12. A este respecto, IL-12 mostró una actividad antitumoral superior (Rakhmilevich et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1303-1311). En la inmunoterapia previa de tumores se ha usado proteína IL-12 recombinante. Sin embargo, su eficacia de corta duración a concentraciones altas creó efectos secundarios considerables. En un estudio de fase I en humanos la aplicación intravenosa de IL-12 (rh) indujo toxicidad hematológica, hiperglucemia, hipoalbuminemia, alteración de la función hepática e incluso muerte, así como fiebre/escalofríos, cansancio, náuseas, vómitos y cefalea (Atkins et al., Clin. Cancer Research 3 (1997), 409-417). Para evitar estos efectos secundarios se probaron aproximaciones usando administración intradérmica o intramuscular de ADN que codifica IL-12. Por ejemplo, la inyección intramuscular de ADN que codifica IL-12 evitó la formación de metástasis de melanoma maligno de ratón (Schultz et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 407-417). Aunque estas aproximaciones mostraron efectos prometedores, no fueron lo suficientemente eficaces para permitir un tratamiento satisfactorio de los tumores con un efecto de larga duración y sin efectos secundarios negativos.

Así, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar medios para un tratamiento más eficaz de los tumores.

Este problema se resuelve mediante la provisión de las realizaciones como se definen en las reivindicaciones. Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de una molécula desnuda de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor, en el que la composición farmacéutica se administra intratumoralmente.

Se ha descubierto sorprendentemente que la aplicación intratumoral de ADN desnudo que codifica IL-12 induce un retraso significativo del crecimiento y una remisión tumoral drástica y duradera. Más sorprendentemente, la aplicación intratumoral de ADN desnudo de IL-12 no induce los efectos secundarios graves observados con la aplicación directa del polipéptido IL-12.

La expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico posible que codifica un polipéptido IL-12, p.ej. ARN o ADN, lineal o circular, monocatenaria o bicatenaria, modificada o sin modificar. En una realización preferida, el ácido nucleico es ADN. Preferiblemente, el ADN es un ADN bicatenario, más preferiblemente uno circular, e incluso más preferiblemente un plásmido.

El ADN de la invención es ADN desnudo. "Desnudo", a este respecto, significa preferiblemente que el ADN no está acomplejado con estructuras virales, proteínas o liposomas o similares, más preferiblemente el ADN está presente en medio líquido que no contiene ningún componente aparte de agua y un tampón.

La expresión "polipéptido IL-12" significa cualquier polipéptido que tiene actividad de IL-12. IL-12 se ha descrito de forma extensa en la bibliografía y, p.ej., en los documentos EP-B1 433 827 y EP-A1 790 308. Es un heterodímero de alrededor de 75 kD compuesto de dos subunidades polipeptídicas, una subunidad de 40 kD y una subunidad de 35 kD, que se unen por medio de uno o más enlaces disulfuro. Un polipéptido que tiene actividad de IL-12 es, en particular, un polipéptido que tiene al menos una de las siguientes características:

(a) como mediador biológico, IL-12 puede activar linfocitos NK;

(b) puede aumentar los mecanismos inmunitarios celulares dirigiendo las células T CD4^{+} hacia una respuesta de tipo TH1;

(c) puede estimular la secreción de interferón \gamma e interleucina 2;

(d) puede aumentar la inmunogenicidad de los tumores favoreciendo la expresión de la clase I de HLA, la clase II de HLA e ICAM-I en células de melanoma humano; y

(e) tiene propiedades antiangiógenas.

Para evaluar un efecto antitumoral potencial de la terapia con ADN de IL-12 intramuscular, se puede aplicar un modelo animal de fibrosarcoma que usa células MC57 en ratones C57BL/6.

El polipéptido IL-12 puede ser de cualquier organismo que produce tal polipéptido, preferiblemente de mamíferos, p.ej. de ratones, más preferiblemente de humanos.

Se conocen las moléculas de ácido nucleico que codifican IL-12. El documento EP-B1 433 827, p.ej., describe la secuencia de cADN que codifica IL-12 humano. Schultz et al. (Hum. Gen. Ther. 10 (1999), 407-417) describe un plásmido que contiene el cADN de IL-12 murino.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico codifica ambas subunidades del heterodímero de IL-12.

En una realización preferida, el polipéptido IL-12 es el heterodímero que comprende ambas subunidades, más preferiblemente es un polipéptido IL-12 humano, más preferiblemente el polipéptido IL-12 que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en los números de acceso a Genebank AF 180563 (p40) y NM 000882 (p35) o en Gubler et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 4143-4147). En una realización particularmente preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12 es el cADN que codifica IL-12 humano.

En el contexto de la presente invención, el término "tumor" significa cualquier tumor posible. En una realización preferida, el tumor es un tumor sumamente vascularizado. La expresión "sumamente vascularizado" significa que el tumor contiene vasos sanguíneos y puede formar nuevos vasos sanguíneos para un mayor aporte de sangre (angiogénesis) y crecimiento del tumor.

Los ejemplos de tales tumores son los carcinomas (colon, mama, pulmón, pancreático, escamoso, cabeza y cuello, adenocarcinoma, células renales, etc.) y sarcomas (fibrosarcoma, osteosarcoma, Ewing, Kaposi, etc.) y mastocitoma, carcinoma basocelular, hemangioma, etc.

En una realización particularmente preferida, el tumor es un melanoma. El melanoma representa una entidad tumoral con una incidencia creciente (Dennis et al., Arch. Dermatol. 135 (1999), 275-280). La prognosis de la enfermedad depende en general del grosor del tumor primario en el momento del diagnóstico. Cuando se diagnostica en estadios iniciales, la escisión con un margen de seguridad puede ser curativa. Sin embargo, una vez metastatizado, no se ha demostrado hasta la fecha que ninguna terapia induzca la erradicación del tumor.

Actualmente, se evalúan dos aproximaciones terapéuticas inmunitarias principales por su efectividad contra el melanoma avanzado: (i) Vacunación con antígenos asociados al tumor y sus péptidos, para inducir o aumentar la actividad de los linfocitos citotóxicos específicos del tumor (Marchand et al., Int. J. Cancer 80 (1999), 219-230; Nestle et al., Nat. Med. 4 (1998), 328-332; Jaeger et al., Int. J. Cancer 66 (1996), 162-169), (ii) Estimulación de la respuesta inmunitaria al tumor con moléculas coestimulantes y citocinas tales como IL-2, IFN-\alpha, GM-CSF e IL-12 (Dummer et al., Cancer 75 (1995), 1038-1044; Agarwala et al., Ann. Surg. Oncol. 2 (1995), 365-371; Leong et al., J. Immuntherap. 22 (1999), 166-174; Lotze et al., Ann. NY Acad. Sci. 795 (1996), 440-454). En el melanoma maligno, se han identificado varios antígenos asociados al tumor (MAGE, MART, gp100, tirosinasa; Rosenberg et al., Immunol. Today 18 (1997), 175-182).

La vacunación con antígenos asociados al tumor, sin embargo, es dependiente de, y por lo tanto está restringida por, el tipo de HLA del paciente (Nestle et al. (1998), loc. cit.). Además, los mecanismos de escape inmunológico por la selección de células tumorales con inmunogenicidad baja impiden a menudo resultados duraderos (Geertsen et al., Int. J. Mol. Med. 3 (1999), 49-57). Las citocinas tales como IL-2 e IFN-\alpha se han usado ampliamente para tratar el melanoma maligno. Sus efectos pueden actuar de forma sinérgica in vitro y posiblemente in vivo en la terapia inmunitaria del cáncer, que incluye melanoma (Keilholz et al., Cancer 72 (1993), 607-614). En los estudios clínicos actuales estas proteínas se están usando en combinación con quimioterapia. Sin embargo, un inconveniente importante de las terapias sistémicas con citocinas recombinantes es su corta semivida y su toxicidad (Bear et al., Semin. Surg. Oncol. 12 (1996), 436-445).

Se ha descubierto sorprendentemente que la inyección intratumoral de ADN desnudo que codifica IL-12 induce una remisión drástica del crecimiento tumoral y tiene un efecto duradero. Además, no se observaron efectos secundarios negativos.

En el contexto de la presente invención, la expresión "administración intratumoral" significa que la molécula desnuda de ácido nucleico que codifica IL-12 se administra directamente en el tumor, es decir, en las células tumorales que se dividen activamente y que rodean la parte central necrótica del tumor y no, p.ej., solamente en las células peritumorales o en el centro del tumor. El término "tumor" en este contexto no se refiere solamente al tumor primario, sino también a las metástasis. Los medios apropiados para la administración intratumoral son, p.ej., inyección, instrumentos balísticos, electroporación, electroinserción, formación de heridas, raspado, instrumentos de inserción presurizada, inyectores a chorro, etc.

En una realización preferida, la administración intratumoral se lleva a cabo mediante inyección, preferiblemente mediante una aguja y una jeringa. En este caso, la molécula desnuda de ácido nucleico que codifica IL-12 está contenida en una disolución que se puede administrar mediante una jeringa. Una disolución adecuada a este respecto es, p.ej., solución salina tamponada con fosfato (PBS), tampón citrato, tampón Tris-HCl o cualquier tampón
fisiológico.

Preferiblemente, la molécula desnuda de ácido nucleico que codifica IL-12 se administra más de una vez. En particular, puede ser ventajoso administrar la molécula de ácido nucleico mediante administración intratumoral repetidamente, p.ej. al menos dos o tres veces, en los días 1, 3 y/o 5. Cuando la administración se lleva a cabo mediante inyección, se prefiere más de una inyección (p.ej. cinco a seis inyecciones). Además, la aguja preferiblemente se inserta tangencialmente al tumor y no apunta al centro del tumor. Un ejemplo de un protocolo de terapia es 50 \mug de ADN como predosis, 7 días antes de una dosis triple, es decir, 3 dosis en los días 1, 3, 5 ó 1, 8, 15. La dosis triple se puede repetir después de 2 ó 3 semanas, también se puede repetir varias veces (3 ó 4 veces) y repetirse cuando el tumor reaparece. Así, el tratamiento puede consistir en uno, dos o más ciclos.

La cantidad de molécula de ácido nucleico a administrar depende, p.ej., de la longitud de la molécula de ácido nucleico, del peso corporal del organismo a tratar y del tamaño del tumor. En general, se usan alrededor de 5 a 500 \mug de ADN plasmídico que contiene el cADN que codifica IL-12, preferiblemente 20 a 300 \mug, más preferiblemente 50 a 250 \mug.

Se prefiere particularmente que se administre una predosis de la molécula desnuda de ácido nucleico que codifica IL-12 alrededor de 14 días antes de que el verdadero tratamiento comience. Preferiblemente, la predosis comprende alrededor de 50 \mug del ADN plasmídico desnudo. Tal predosis evita los efectos secundarios tóxicos del compuesto administrado (Leonard et al., Blood 90 (1997), 2541-2548).

Una realización particularmente preferida para el modo de administración es un régimen en el que la administración de la predosis va seguida por dos ciclos de administración, y en la que en el ciclo uno se administran 100 \mug a 750 \mug de ADN plasmídico desnudo en los días 1, 8 y 15, y en la que en el ciclo dos se administran 200 \mug a 1000 \mug de ADN plasmídico desnudo en los días 23, 36 y 43.

En otra realización preferida de la presente invención, la administración intratumoral de una molécula desnuda de ácido nucleico que codifica IL-12 se combina con la administración de otra citocina. De esta forma se puede aumentar el efecto antitumoral de IL-12. La administración de la otra citocina se puede conseguir, p.ej., administrando una molécula de ácido nucleico que codifica la citocina respectiva, o administrando la propia citocina respecti-
va.

En una realización preferida, la otra citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-15, IL-2, IP-10, GM-CSF, IFN-\alpha (interferón \alpha), TNF (factor de necrosis tumoral) y PAI-1 (inhibidor del activador de plasminógeno).

En una realización adicionalmente preferida, la administración intratumoral de una molécula desnuda de ácido nucleico que codifica IL-12 se combina con la administración de un antígeno asociado a tumor (AAT). La administración del AAT se puede conseguir, p.ej., administrando una molécula de ácido nucleico que codifica el AAT respectivo o administrando el propio AAT respectivo. El AAT es preferiblemente un AAT que está asociado al tumor a tratar. Los ejemplos de AATs y los tipos correspondientes de tumores se muestran en la siguiente lista:

melanoma:

gp100, tirosinasa, MAGE-1, MAGE-3, MART, BAGE, TRP-1

cáncer de estómago:

CEA (antígeno carcinoembrionario), CA 19-9, CA 50, CA 72-4

cáncer de colon:

CEA, CA 19-9, Muc-1

carcinoma de páncreas:

CA 19-9, CA 50, CEA

cáncer de pulmón de células pequeñas:

CEA, NSE (enolasa específica de neurona), receptor de EGF

cáncer de pulmón:

CEA

carcinoma hepático:

\alpha-fetoproteína (AFP)

cáncer de próstata:

PSA

cáncer de vesícula biliar:

CA 19-9

carcinoma escamoso:

SCC (antígeno de carcinoma escamoso), CEA

carcinoma mamario:

CA 15-3, CEA, BRCA-1, BRCA-2, Muc-1, receptor Her2/Neu

cáncer de testículos:

AFP, hCG

carcinoma ovárico:

CA 125, CEA, CA 15-3, AFP, TAG-72

linfoma de células B:

CD20, CD21

En una realización adicionalmente preferida, la molécula desnuda de ácido nucleico que codifica IL-12 se administra junto con oligonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, ricos en C y G, tales como oligonucleótidos CpG. Tales oligonucleótidos tienen preferiblemente una longitud de 20 nucleótidos, con CpG en el centro rodeado de secuencias que pueden ser palindrómicas, p.ej. 5'-GCTATGACGTTCCAAGG-3' (Schultz et al., Human Gene Therapy 10 (1999), 407-417; Chu et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1623-1631). Otros oligonucleótidos de ADN bicatenarios o monocatenarios, p.ej., son aptámeros, de una longitud de alrededor de 14 nucleótidos, que se unen a, p.ej., integrinas y muestran un efecto antiproliferativo (Bachmann et al., Molecular Med. 76 (1998), 126-132), u oligonucleótidos de ADN como se describen en el documento WO 94/23751.

En aún otra realización preferida, la molécula desnuda de ácido nucleico que codifica IL-12 se administra junto con péptidos, en particular con péptidos de antígenos asociados a tumor.

Finalmente, la composición farmacéutica preparada según el uso de la invención se puede aplicar en combinación con un tratamiento de quimioterapia, tal como quimioterapia antineoplásica o una HAART (terapia antirretroviral de VIH sumamente activa).

Figura 1 Muestra el crecimiento tumoral después de inyección intramuscular de ADN. Volúmenes tumorales medios y desviación estándar de melanoma B16F10 subcutáneo en ratones C57BL/6 durante la inyección de ADN plasmídico y en el seguimiento. Se inyectaron 2 x 10^{5} células de melanoma B16F10 en crecimiento exponencial subcutáneamente en los flancos de ratones C57BL/6, y formaron tumores después de 9 días. Se inyectó a los animales a un diámetro tumoral medio de 5 mm intramuscularmente en los días 1, 3 y 5 con VR1012-muIL12 (n=7; cuadrados negros) o vector vacío (n=6; rombos claros).

Figura 2 Muestra el retraso del crecimiento tumoral mediante inyección intratumoral de ADN. Volúmenes tumorales medios y desviación estándar de melanoma B16F10 subcutáneo en ratones C57BL/6. Se inyectaron 2 x 10^{5} células de melanoma B16F10 en crecimiento exponencial subcutáneamente en los flancos de ratones C57BL/6, y formaron tumores después de 9 días. Se inyectó a los animales a un diámetro tumoral medio de 5 mm intratumoralmente en los días 1, 3 y 5 con VR1012-muIL12 (n=7; cuadrados claros) o vector vacío (n=6; rombos claros). * implica una diferencia significativa (p < 0,05) cuando se compara con el otro grupo con la prueba t de Student.

Figura 3 Muestra la remisión tumoral de melanoma humano mediante inyección intratumoral de ADN que codifica citocina. Volúmenes tumorales medios y desviación estándar de melanoma MeMM 941209 humano subcutáneo en ratones BALB/c nu/nu. Se inyectaron 2 x 10^{5} células de melanoma MeMM 941209 humano en crecimiento exponencial subcutáneamente en los flancos de ratones atímicos, y se formaron tumores después de 18 días. Se inyectó a los animales a un volumen tumoral medio de 500 mm^{3} intratumoralmente en los días 1, 3 y 5 con VR1012-muIL12 (n=5; cuadrados claros) o vector vacío (n=5; rombos claros). * implica una diferencia significativa (p < 0,05) cuando se compara con el otro grupo con la prueba t de Student.

Figura 4 Muestra los cambios histológicos en la angiogénesis después de la vacunación intratumoral con ADN que codifica IL-12 murino en melanoma humano (véase la Figura 3). (A) tinción de hematoxillina-eosina de biopsia tomada de ratón de control (B) tinción de hematoxillina-eosina de biopsia tomada de ratón inyectado con ADN que codifica IL-12 (C) tinción de PAS de biopsia tomada de ratón de control (D) tinción de PAS de biopsia tomada de ratón inyectado con ADN que codifica IL-12. (Aumento y tamaño correspondiente de la barra: A 200x, 20 \mum; B 400x, 10 \mum; C 25x; D 100x, 40 \mum).

Figura 5 Muestra que el efecto terapéutico tumoral no se abroga completamente reduciendo los linfocitos NK. Los volúmenes tumorales medios y la desviación estándar del melanoma MeMM 941209 humano subcutáneo en ratones BALB/c nu/nu reducidos de linfocitos citolíticos naturales (NK). Se inyectaron 2 x 10^{5} células de melanoma MeMM 941209 humano en crecimiento exponencial subcutáneamente en los flancos de ratones atímicos y formaron tumores después de 10 días. La reducción de linfocitos NK se realizó inyectando anticuerpos anti-asialo GM1 intraperitonealmente 3 días y 24 horas antes de comenzar el tratamiento. Se inyectó a los animales a un diámetro tumoral medio de 4 mm intratumoralmente en los días 1, 3 y 5 con VR1012-muIL12 (n=5; cuadrados) o vector vacío (n=5; rombos claros). * implica una diferencia significativa (p < 0,05) cuando se compara con el otro grupo con la prueba t de
Student.

Figura 6 Muestra el efecto del tratamiento con ADN plasmídico sobre el desarrollo de metástasis de melanoma en caballos blancos. A los caballos blancos que desarrollaron melanoma metastásico de forma espontánea se les inyectó intratumoralmente en los días 1, 3 y 5 de cada ciclo de tratamiento 250 \mug de ADN plasmídico que codifica IL-12 humano (A, B) ó 250 \mug de ADN plasmídico con el inserto inverso de IL-12 humano (C). Se dejaron sin tratar algunas lesiones de referencia para determinar el desarrollo tumoral sin tratamiento (D). Se realizaron biopsias con sacabocados o con aguja gruesa de todas las metástasis de referencia y tratadas, y las muestras de biopsia se examinaron histológicamente antes de la terapia y en los días 14 y 30. Los tumores se midieron usando calibradores y mediante ultrasonidos (US), y los volúmenes tumorales se calcularon según la fórmula: diámetro pequeño^{2} x diámetro grande x 0,5.

Figura 7 Muestra los volúmenes tumorales medios y la desviación estándar de tumor de colon CT26 subcutáneo después de inyección de ADN que codifica IL-12 (cuadrados) o vector de control (rombos). Se inyectaron a los ratones subcutáneamente 5 x 10^{4} células de la línea celular de carcinoma de colon CT26. Cuando se detectaron tumores palpables, se realizó terapia intratumoral en los días 1, 3 y 5, administrando cada vez 50 \mug de ADN plasmídico VR1012-muIL-12 que codifica IL-12 (n=3) o vector de control (n=3) mediante inyección intratumoral.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar adicionalmente la invención.

Ejemplo 1 Inyección intratumoral de ADN plasmídico que codifica IL-12 en tumores de melanoma humanos y murinos

ADN plasmídico. El cADN de IL-12 murino fue una donación de M. Gately (New Jersey, EE.UU.) y fue subclonado por S. Hemmi (Zúrich) de pBLKs IRES-muIL-12, en el sitio de restricción BamHI de la estructura. El plásmido VR1012-muIL12 contiene el cADN de IL-12 murino bajo control de la región intensificadora/promotora inmediatamente temprana de CMV (Schultz et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 407-417). Las dos subunidades de IL-12, p35 y p40, se unen mediante un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). El ADN plasmídico se purificó con columnas de Qiagen (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) usando reactivos sin endotoxinas según el protocolo del proveedor. Se disolvió en PBS y se inyectó a 50 \mug/50 \mul. La expresión de ambas subunidades en muestras de suero después de la inyección intramuscular de ADN plasmídico se ha verificado usando equipos de ELISA disponibles comercialmente (Genzyme, Biosource). La expresión de proteína IL-12 después de la inyección intratumoral de ADN plasmídico se ha medido en suero usando equipos de ELISA disponibles comercialmente (Genzyme, Biosource). Los límites de detección de los ensayos de ELISA usados fueron 5 pg/ml, Genzyme, y 15 pg/ml, Biosource, respectivamente.

Ratones y tumores. Se criaron ratones C57BL/6 y BALB/c nu/nu en instalaciones animales. Se cultivó la línea celular B16F10 de melanoma murino metastásico, donación de M. Burger, Basel, en Dulbecco's Modified Eagles Media (DMEM), suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FCS), 100 \mug/ml de estreptomicina, 100 UI/ml de penicilina y 1 mmol/ml de L-glutamina. Se estableció el cultivo celular de melanoma humano MM 941209 como se describió anteriormente (Yue et al., Int. J. Cancer 71 (1997), 630-637). Se cultivaron células MM 941209 en medio completo RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FCS), estreptomicina (100 \mug/ml), penicilina (100 UI/ml) y L-glutamina (1 mmol/ml). Para la inoculación tumoral a los ratones, se recogieron células B16F10 o células MM 941209 en crecimiento exponencial mediante tripsinización, se lavaron dos veces con PBS y se inyectaron subcutáneamente 1 x 10^{5} células viables, determinadas mediante exclusión con colorante azul Trypan, en ratones C57BL/6 y BALB/c nu/nu, respectivamente. Cuando se establecieron los tumores subcutáneos, se inyectó a los ratones de forma intralesional en los días 1, 3 y 5. El ADN plasmídico se disolvió en PBS para alcanzar un volumen total de 50 \mul y 50 \mug de ADN por cada dosis. La medida de los tumores se realizó cada dos días usando calibradores. El volumen tumoral se calculó según la fórmula: 0,5 x diámetro grande x (diámetro pequeño)^{2}.

Anticuerpos. Se tomaron biopsias para su evaluación histológica e inmunohistoquímica en los días 9, 13, 16 y 19 en los ratones C57BL/6 y en el día 12 ó 14 en los ratones BALB/c nu/nu. Se realizó la reducción de linfocitos NK inyectando intraperitonealmente 30 \mul de anticuerpos policlonales anti-asialo GM1 de conejo, WAKO Chemicals (Osaka, Japón), a los ratones tres días y 24 horas antes del tratamiento con ADN.

Se realizaron tinciones de hematoxilina-eosina y de PAS en cortes de tejido incrustados en parafina.

Se realizaron tinciones con CD4, CD8 (anticuerpos adquiridos de Pharmingen) y CD 31 (anticuerpos adquiridos de Beckton and Dickinson) en cortes de criostato.

Análisis estadísticos

Los resultados se presentan como media +/- desviación estándar (DE) de la media. Las diferencias entre las medias se analizaron usando la prueba t de Student para datos no pareados (bilateral). No se excluyó ninguno de los animales del análisis. El valor de probabilidad p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Se inyectó la línea celular B16F10, extensamente descrita, subcutáneamente en ratones C57BL/6. Se inició el tratamiento con ADN a un tamaño tumoral medio de 55 mm^{3} medido con calibradores, mediante inyección intramuscular de ADN plasmídico VR1012 que codifica ambas subunidades de IL-12, p40 y p35. En el vector de expresión eucariótico usado, el cADN estaba bajo control de la región promotora/intensificadora inmediatamente temprana (IE-1) de citomegalovirus (CMV) humano como se describió anteriormente (Schultz et al., loc. cit.). La inyección intramuscular de este vector indujo la expresión de las dos subunidades y concentraciones medibles del heterodímero de IL-12 bioactivo in vivo. El ADN plasmídico vacío sin inserto de IL-12 usado como control no dio como resultado concentraciones séricas medibles de IL-12 (Schultz et al., loc. cit.). La inyección intramuscular se llevó a cabo inyectando ADN plasmídico en los cuadriceps de los ratones. El tratamiento se realizó una vez en el día 1 a un volumen tumoral medio de 55 \pm 22 mm^{3}. Los resultados de este experimento se muestran en la Fig. 1. No se pudieron observar diferencias en el crecimiento tumoral entre el grupo inyectado con el vector de control y el grupo inyectado con el plásmido que codifica IL-12 hasta el día 9. Por ello, se emprendió un cambio en el modo de aplicación.

Se iniciaron inyecciones directas en tumores de melanoma B16 subcutáneos a un volumen tumoral medio de 158 mm^{3} en el grupo de tratamiento y de 139 mm^{3} en el grupo de control. Se administraron inyecciones intratumorales a una dosis de 50 \mug de ADN plasmídico cada una en los días 1, 3 y 5. Después de dos días se observó una diferencia significativa en los volúmenes de los tumores entre los dos grupos, dando como resultado menos de un tercio del volumen tumoral medio en el grupo de tratamiento comparado con el grupo de control (Fig. 2). Este efecto se acentuó adicionalmente a lo largo del tiempo, dando como resultado un volumen tumoral medio final de 3482 mm^{3} en el grupo tratado con ADN que codifica IL-12, en comparación con 8428 mm^{3} en el grupo de control después de 14 días.

Se tripsinizaron y propagaron in vitro tumores primarios, secundarios y metastásicos resecados de pacientes. Se inyectaron subcutáneamente células en crecimiento exponencial en ratones atímicos BALB/c, aplicando 1 x 10^{5} células viables. Solamente uno de 3 cultivos de células tumorales (MM 941209, MM 950504, MM 960104) dio como resultado tumores después de la inyección subcutánea de las células en el flanco de los animales. En la línea celular que formó tumores, MM 941209, no fue posible favorecer la expresión de la clase I de HLA o inducir la clase II de HLA e ICAM estimulando con interleucina 12 murina o humana durante 48 horas, aunque fue ligeramente positivo para el receptor de IL-12 (resultados no mostrados).

Se iniciaron inyecciones directamente en melanomas MM 941209 humanos de ratones atímicos a un volumen tumoral medio de 461 \pm 87 mm^{3} en el grupo de tratamiento y 486 \pm 88 mm^{3} en el grupo de control. Las inyecciones intratumorales de 50 mg de ADN plasmídico se administraron en los días 1, 3 y 5. Hasta el día 3, el grupo tratado con ADN que codifica IL-12 mostró un incremento ligeramente mayor en los volúmenes tumorales. A partir del día 5 hubo una disminución marcada en los volúmenes tumorales del grupo de tratamiento (Fig. 3). En el día 14, dos de cinco animales tratados no tenían tumores, según se verificó mediante examen histológico minucioso. El volumen tumoral medio de los otros tres animales fue 175 \pm 44 mm^{3}. El grupo de control mostró un incremento notable de los volúmenes tumorales, hasta una media de 740 \pm 208 mm^{3}.

Ejemplo 2 Determinación de concentraciones séricas de proteína IL-12

Para determinar las concentraciones séricas de proteína IL-12 se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola de los ratones C57BL/6 descritos en el Ejemplo 1 en los días 0, 3, 5, 10 y 14. No se encontraron diferencias significativas en las muestras de suero en la expresión de IL-12 total, medido mediante concentraciones de p40 de IL-12 en ensayos de ELISA entre los ratones tratados de forma intralesional con ADN que codifica IL-12 y los ratones tratados con plásmido vacío (resultados no mostrados). Así, en contraste con la aplicación intramuscular, la inyección intratumoral de ADN plasmídico que codifica IL-12 no induce la expresión sistémica detectable de la proteína. La evaluación de las concentraciones de proteína IL-12 en el suero de ratones atímicos no se emprendió para evitar el riesgo de infección.

Ejemplo 3 Análisis histológico e inmunohistoquímico de muestras de tumor

Las biopsias se recogieron en los días 9, 13, 16 y 19 en los ratones C57BL/6 y en el día 12 ó 14 en los ratones atímicos BALB/c descritos en el Ejemplo 1, y se analizaron mediante microscopía óptica.

En las biopsias de tumores de melanoma B16 a los que se les inyectó de forma intralesional ADN que codifica IL-12, se observó un infiltrado peritumoral que consistía principalmente en linfocitos CD4 positivos, pero también CD8 positivos. Se pudieron observar en los tumores tratados algunos linfocitos que infiltraban el tumor.

Los tumores extraídos de ratones atímicos eran morfológicamente indiferenciables del melanoma humano normal. Mostraron tinción positiva para HMB 45, el anticuerpo se unía específicamente a gp100/pmel 17, Melan A y tirosinasa (no mostrado). En el grupo de tratamiento, que consistía en los animales con MM 941209 humano subcutáneo, el patrón de la vasculatura de los tumores, analizado mediante tinciones de PAS y anti-CD31, también difirió significativamente al compararlo con los controles inyectados con ADN plasmídico de control solamente (Figura 4). En el grupo tratado con ADN de IL-12 había presente engrosamiento endotelial, coagulación dentro de la luz y cambios bruscos de diámetro de los vasos. En el grupo de control, se observó un patrón regular con paredes endoteliales finas y lisas, y sin coagulación en los vasos. Los tres tumores tratados que todavía existían presentaban grandes áreas de necrosis. En dos de cinco animales no se pudieron observar células tumorales en la muestra de biopsia.

Ejemplo 4 Reducción de linfocitos NK

Para determinar el papel de los linfocitos citolíticos naturales (NK) como células efectoras en el tratamiento con ADN de IL-12, se realizó la reducción de linfocitos NK inyectando intraperitonealmente anticuerpos anti-asialo GM 1 de conejo dirigidos al gangliósido de superficie presente en los linfocitos NK. Después de 10 días se habían establecido tumores MM 941209 humanos subcutáneos palpables. La reducción de linfocitos NK se realizó durante tres días, y otra vez un día antes de la terapia. La inyección intratumoral de vector vacío o de ADN que codifica IL-12 se inició a un volumen tumoral medio de 15 mm^{3} y se realizó en los días 1, 3 y 5. Se eligió el volumen tumoral medio más pequeño para obtener mejores resultados en la evaluación histológica. La reducción de linfocitos NK antes del comienzo del tratamiento con ADN indujo un retraso significativo del crecimiento de los tumores subcutáneos. El efecto antitumoral del ADN que codifica IL-12 disminuyó, sin embargo, en los ratones reducidos de linfocitos NK. Hasta el día 14, ninguno de los animales dejó de tener tumores, comparado con dos de cinco en el grupo con linfocitos NK normales (Fig. 5). Así, los linfocitos NK contribuyen al efecto antitumoral del tratamiento con ADN que codifica IL-12.

Los resultados demuestran que la inyección intratumoral de ADN que codifica IL-12 indujo la regresión tumoral de melanoma maligno humano en ratones atímicos y, en 2 de 5 casos, la erradicación completa del tumor. El retraso del crecimiento de melanomas B16 subcutáneos de ratón se indujo también mediante inyección intralesional de ADN plasmídico que codifica IL-12 en ratones C57BL/6. El mecanismo de este efecto notable se puede atribuir a los cambios inducidos por la expresión de IL-12 a partir del ADN inyectado in vivo.

Los efectos biológicos de IL-12 abarcan la estimulación de la inmunidad inespecífica, la estimulación de la inmunidad específica y la inhibición o alteración de la angiogénesis. Con los experimentos descritos anteriormente se podría demostrar que el efecto terapéutico del ADN que codifica IL-12 depende probablemente de forma predominante del efecto antiangiógeno. Los análisis histológicos confirmaron diferencias profundas en la vasculatura entre los animales tratados y los de control. Los infiltrados peritumorales de células CD4+ y células CD8+, así como los linfocitos CD4 y CD8 que infiltraban el tumor, inducidos por el tratamiento con ADN de IL-12, desempeñan posiblemente un papel en la reacción inmunitaria. Además, la activación de los linfocitos NK contribuye al rechazo del tumor inducido por el tratamiento con ADN de IL-12. El efecto antitumoral se redujo pero no se abrogó en ratones carentes de células T y NK.

Los cambios inducidos en la vasculatura del tumor se caracterizaron por la interrupción de la elastina, con engrosamiento endotelial y cambios bruscos en el diámetro del vaso, así como trombosis intravascular. Se pudieron detectar grandes áreas necróticas dentro del tejido tumoral. Las causas posibles incluyen apoptosis, necrosis debido a hipoxia, falta de factores de supervivencia y/o liberación de factores de destrucción celular. Al principio de la terapia ya se habían establecido vasos en el tumor. Así, se puede concluir que el régimen de tratamiento afectó no solamente a los vasos nuevos que se formaban, sino también a la vasculatura tumoral preexistente. Estos efectos antiangiógenos no dependen de la participación de células T, ya que se observaron en ratones atímicos BALB/c que carecen de células derivadas de timo. Aunque la inyección de proteína inducible por IFN (IP-10) indujo cambios morfológicamente similares caracterizados por necrosis tumoral in vivo con necrosis central, lesión vascular difusa con engrosamiento endotelial y trombosis capilar, a menudo distal del tumor necrótico, los resultados indican que el efecto del ADN que codifica IL-12 no está mediado solamente por IP-10, ya que esta quimiocina CXC inhibió el crecimiento tumoral en ratones con timo, pero no en la mayoría de ratones nu/nu (Sgadari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 13791-13796). IP-10 recombinante no indujo la remisión tumoral completa cuando se inyectó intratumoralmente en linfomas de Burkitt subcutáneos (Sgadari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 13791-13796). Comparado con endostatina, por ejemplo, los tumores no volvieron a crecer en el espacio de tiempo de 5 a 14 días (O'Reilly et al., Cell 88 (1997), 277-285). Se puede excluir un efecto antiproliferativo directo de IL-12 expresado in vivo, ya que IL-12 recombinante no exhibe ningún efecto antiproliferativo directo sobre las células de melanoma, según se evalúa por la incapacidad de la proteína para alterar la proliferación de células tumorales incluso a concentraciones altas (Sun Y et al., Gene Therapy 5 (1998), 481-490).

Ejemplo 5 Remisión tumoral inducida mediante inyección intratumoral de ADN que codifica IL-12 humano en metástasis de melanoma equino en caballos blancos

Los caballos blancos desarrollan espontáneamente tumores similares al melanoma humano, con tumores primarios en labios o cola que subsiguientemente metastatizan a otras partes de la piel y a diversos órganos, que incluyen intestino delgado, colon y vejiga. Hasta ahora, no se aplica tratamiento para los tumores o las metástasis.

A caballos blancos que presentaban varios nódulos tumorales de melanoma metastásico se les inyectaron mediante aguja intratumoralmente, en los días 1, 3 y 5 de cada ciclo de tratamiento, 250 \mug de ADN plasmídico que codifica interleucina 12 humana (IL-12) ó 250 \mug de ADN plasmídico de control, que contiene el inserto inverso de IL-12 humano. Se dejaron sin tratar algunas lesiones de referencia para determinar la evolución tumoral espontánea sin tratamiento local. Se realizaron biopsias con sacabocados o con aguja gruesa de todas las metástasis de referencia y tratadas antes de la terapia y en los días 14 y 30, y se examinaron histológicamente las muestras de biopsia. Se tomaron muestras de sangre para evaluar los cambios hematológicos o las alteraciones químicas del suero en los días 1, 5, 14 y 30 de los ciclos de tratamiento. Los tumores se midieron usando calibradores y mediante ultrasonidos, y los volúmenes tumorales se calcularon según la fórmula: diámetro pequeño^{2} x diámetro grande x 0,5 (los resultados se muestran en la Figura 6).

Los nódulos tumorales inyectados con ADN plasmídico que codifica interleucina 12 humana disminuyeron rápidamente de volumen. Histológicamente se pudo observar un engrosamiento de las células y un pigmento extracelular, así como macrófagos. El tejido tumoral fue sustituido por tejido conectivo cicatrizado. Los tumores sin tratamiento local o los tumores inyectados con ADN plasmídico de control que contiene IL-12 inverso no mostraron cambios de volumen.

Ejemplo 6 Inyección intratumoral de ADN plasmídico que codifica IL-12 en carcinoma de colon en ratones

La remisión tumoral inducida mediante inyección intratumoral de ADN que codifica IL-12 murino en carcinoma de colon CT26 en tumores de ratón distintos de melanoma maligno respondió al tratamiento con ADN de IL-12. Se hicieron crecer tumores derivados de células de carcinoma de colon CT26 de ratones mediante inyección subcutánea de 5 x 10^{4} células hasta que fueron palpables. Entonces se trataron con 50 \mug de ADN VR1012-muIL-12 (n=3) o plásmido de ADN VR1012 sin inserto (n=3) mediante inyección intratumoral en los días 1, 3 y 5. Los tamaños de los tumores se midieron mediante calibrador y se representaron gráficamente (Fig. 7).

Claims (17)

1. El uso de una molécula desnuda de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor, en el que la composición farmacéutica se administra intratumoralmente.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el tumor es un tumor sumamente vascularizado.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el tumor es un sarcoma, carcinoma, melanoma o hemangioma.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición farmacéutica comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica otra citocina, o que comprende otro polipéptido de citocina.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que la otra citocina es IL-15, IL-2, IFN-\alpha, GM-CSF, IP-10, TNF o PAI-1.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composición farmacéutica comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a tumor o una proteína antigénica asociada a tumor.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tratamiento del tumor comprende además quimioterapia.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que la quimioterapia es una quimioterapia antineoplásica.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que la quimioterapia es HAART (terapia antirretroviral de VIH sumamente activa).

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la composición farmacéutica es tal que la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12 se administra como una predosis alrededor de 14 días antes del verdadero tratamiento.

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la composición farmacéutica es tal que la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12 se administra en un régimen que comprende dos o más ciclos.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que el régimen comprende dos ciclos de administración, y en el que en el ciclo uno se administran 100 \mug a 750 \mug de ADN plasmídico desnudo en los días 1, 8 y 15, y en el que en el ciclo dos se administran 200 \mug a 1000 \mug de ADN plasmídico desnudo en los días 23, 36 y 43.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que el régimen es precedido por la administración de una predosis alrededor de 14 días antes del verdadero tratamiento.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la composición farmacéutica es tal que la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-12 se administra en un régimen que comprende:

administración de 50 \mug de ADN como predosis, 7 días antes de la administración de una dosis triple, en la que la dosis triple se administra como 3 dosis en los días 1, 3 y 5 ó en los días 1, 8 y 15.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que la dosis triple se repite después de 2 ó 3 semanas.

16. El uso de la reivindicación 14, en el que la administración de la dosis triple se repite varias veces.

17. El uso de la reivindicación 14, en el que la administración de la dosis triple se repite cuando el tumor reaparece.