ES2245824T3 - Nuevo proceso de separacion de proteinas utilizando un eluyente que contiene ca++. - Google Patents
Nuevo proceso de separacion de proteinas utilizando un eluyente que contiene ca++.Info
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Abstract
Proceso de separación de proteínas glicosiladas de proteínas no glicosiladas sometiendo una solución que comprende proteínas glicosiladas y no glicosiladas a una cromatografía utilizando un eluyente que contiene Ca++, y obteniendo una fracción que comprende proteínas no glicosiladas, dicha fracción estando esencialmente libre de proteínas glicosiladas.
Description
Nuevo proceso de separación de proteínas
utilizando un eluyente que contiene Ca^{++}.
La presente invención se refiere al proceso de
separación por cromatografía de proteínas glicosiladas o de
precursores de proteínas a partir de proteínas no glicosiladas o
precursores de proteínas usando un eluyente que contiene
Ca^{++}.
En la producción de proteínas o de precursores de
proteínas la separación de las proteínas glicosiladas de las
proteínas no glicosiladas representa un campo independiente de
investigación. Las implicaciones industriales de la presente
invención se refieren a la optimización de la purificación de
proteínas. El propósito de la purificación optimizada consiste en
conseguir un producto final de uso comercial que comprenda proteínas
no glicosiladas, esencialmente libres de proteínas
glicosiladas.
Las proteínas o precursores de proteínas se
pueden producir a partir de sistemas de expresión de levadura. Se
ha observado una correlación entre un nivel elevado de expresión y
un aumento de los precursores de proteínas glicosiladas. Como
consecuencia resulta todavía más evidente la necesidad de un
proceso más eficiente de separación de las proteínas no glicosiladas
de las proteínas glicosiladas.
En el sistema de expresión de la levadura un
organismo de levadura produce proteínas o precursores de proteínas
sintetizadas intracelularmente. El microorganismo huésped de
levadura es transformado por un vehículo de expresión que incluye
ADN que codifica la proteína deseada. El proceso comprende la
preparación de un cultivo del organismo huésped de levadura
transformado, el crecimiento del cultivo y la recuperación de la
proteína del medio de cultivo.
La recuperación según la técnica precedente de la
proteína deseada comprendía varias fases de purificación utilizando
el proceso de cromatografía, tal como la cromatografía de
intercambio fónico que incluía un eluyente con un contenido de sal.
Usando el método de cromatografía líquida de alto rendimiento en
fase inversa (RP-HPLC) se puede llevar a cabo el
procedimiento de separación de las proteínas no glicosiladas de las
proteínas glicosiladas. El eluyente utilizado para la elución de las
muestras de la prueba es preferiblemente un solvente orgánico con un
contenido de sal, tal como el KCl. Aunque se han aplicado varias
sales al solvente orgánico en la técnica precedente el efecto de un
eluyente que contiene Ca^{++} no ha sido nunca descrito. La
patente US-A-3.649.456 y
US-A- 5.633.350 describe el uso de un eluyente que
contiene Ca^{++} en separaciones cromatográficas de proteínas. No
obstante, ninguno de estos documentos trata la separación de las
proteínas glicosiladas.
En el presente contexto el término eluyente es
sinónimo del tampón utilizado para la elución. La presente
invención proporciona una purificación mejorada de las proteínas
glicosiladas usando un eluyente que contiene Ca^{++}.
La presente invención proporciona un proceso
mejorado de separación de las proteínas glicosiladas de las
proteínas no glicosiladas En consecuencia la presente invención se
refiere a un proceso de separación de las proteínas glicosiladas de
las proteínas no glicosiladas mediante una solución que comprende
proteínas glicosiladas y no glicosiladas sometida a una
RP-HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento
en fase inversa) usando un eluyente que contiene Ca^{++}, y a la
obtención de una fracción que comprende proteínas no glicosiladas,
dicha fracción está esencialmente libre de proteínas
glicosiladas.
En la presente invención el término proteína se
refiere a todas las proteínas o precursores de proteínas y el
término proteínas glicosiladas incluye las proteínas glicosiladas o
los precursores de proteínas. En una forma de realización preferida
la proteína es insulina o un análogo o un precursor de ésta.
Otro objetivo de la presente invención es una
fracción que se puede obtener usando el proceso según la invención,
que comprende proteínas no glicosiladas esencialmente libres de
proteínas glicosiladas.
Las proteínas o precursores de proteínas y
análogos de éstos pueden producirse a partir de sistemas de
expresión de levadura. En el proceso de fabricación de las
proteínas o de los precursores de proteínas es habitual el uso de
la purificación cromatográfica. Las proteínas o los precursores de
proteínas son a menudo sometidos a modificaciones químicas y a una
serie de fases de purificación cromatográfica, tal como la
RP-HPLC, cromatografía de interacción hidrófoba y
de intercambio iónico. La presente invención se refiere a una fase
de purificación en la que el uso de la cromatografía en la
separación de las proteínas glicosiladas de las proteínas no
glicosiladas ha demostrado ser particularmente adecuado. El proceso
comprende la aplicación a una solución que comprende proteínas
glicosiladas y no glicosiladas de una cromatografía usando un
eluyente que contiene Ca^{++}, y obteniendo así una fracción que
comprende proteínas no glicosiladas, dicha fracción estando
esencialmente libre de proteínas glicosiladas.
El principio de purificación de la proteína
utilizando una cromatografía de columna se basa en las diferencias
de equilibrio entre la fase fija y la móvil de las proteínas que
deben ser separadas. Mediante el uso de una combinación apropiada
de las fases fija y móvil, las proteínas saldrán de la columna en
intervalos distintos.
El método de cromatografía puede ser cualquier
método de cromatografía de columna, preferiblemente
RP-HPLC, o cromatografía de interacción
hidrófoba.
En la presente invención la ventaja reside en la
pureza aumentada de la fracción de proteínas no glicosiladas. La
fracción de proteínas glicosiladas puede consistir en proteínas
monoglicosiladas y proteínas poliglicosiladas. La presente
invención proporciona unos medios para la mejora de la separación
de las proteínas glicosiladas, como las proteínas monoglicosiladas y
las proteínas poliglicosiladas, de las proteínas no
glicosiladas.
Otro aspecto de la presente invención consiste en
obtener una fracción adicional que comprende proteínas glicosiladas
y esencialmente ninguna proteína no glicosilada.
En función de la composición del material
precursor las proteínas glicosiladas pueden ser monoglicosiladas, o
al menos una parte de las proteínas glicosiladas pueden ser
diglicosiladas, o al menos una parte de las proteínas glicosiladas
pueden ser poliglicosiladas.
En comparación con otros métodos de
cromatografía, en los que no se utiliza ningún eluyente que
contenga Ca^{++}, la presente invención conserva la ventaja de
una mayor productividad debido a una carga de columna aumentada de
aproximadamente el 50%. La eficiencia de la purificación está
influenciada por el ligando y por el tamaño de partícula del poro de
la matriz. El tamaño de la partícula del poro puede variar según la
naturaleza de la proteína que debe ser purificada. Cuando la
proteína es insulina o un análogo de ésta la matriz de columna
óptima es 200 \ring{A} y la columna puede estar cargada hasta 150
- 250 mg/cm^{2} cuando el material precursor pertenece a la
composición descrita a continuación, y la longitud de la columna
utilizada es tal como se describe a continuación.
La temperatura de la columna puede ser de
10-30ºC, preferiblemente de
18-25ºC. Cualquier temperatura, inferior a la gama
de temperatura preferida puede llevar a un aumento de los costes de
la purificación por un retraso del proceso.
Usando los métodos para la purificación de
proteínas no glicosiladas descritos por la técnica anterior,
todavía no se puede conseguir una fracción sustancialmente libre de
proteínas glicosiladas manteniendo al mismo tiempo esta
productividad elevada. No obstante la introducción de la presente
invención ha mejorado el proceso de purificación de forma evidente,
y la fracción final que comprende proteínas no glicosiladas está
esencialmente libre de proteínas glicosiladas.
Usando los medios de la presente invención se
puede obtener una fracción que comprende proteínas no glicosiladas,
dicha fracción estando esencialmente libre de proteínas
glicosiladas, al mismo tiempo que el nivel de productividad de
dicha fracción aumenta.
La presente invención ha demostrado ser
particularmente ventajosa para la separación de insulinas
glicosiladas de las insulinas no glicosiladas. Preferiblemente, la
concentración de insulinas glicosiladas en la fracción de insulina
no glicosilada es inferior al 0.2%, y también inferior al 0.1%. Esto
supone una reducción de aproximadamente diez veces en la
concentración de insulinas glicosiladas del material precursor.
El material precursor para la separación o la
purificación puede ser cualquier solución proteínica que comprenda
proteínas glicosiladas y no glicosiladas. El material precursor
puede ser el medio obtenido directamente a partir de los sistemas
de expresión de levadura, o bien, el material precursor puede estar
sujeto a diversas etapas de purificación o de modificación química
antes de la separación según la invención.
Sin limitarse en la teoría, en general se
considera que la interacción de las proteínas con Ca^{++} produce
un cambio en la hidrofobicidad de las proteínas. Se cree que el
cambio diferencial de la hidrofobicidad producido por unas
diferencias moleculares menores, tales como el azúcar o los grupos
estéricos, constituye el núcleo del principio para la separación de
las proteínas glicosiladas de las proteínas no glicosiladas o por
otro lado de proteínas modificadas. El grado en el que el cambian
las proteínas durante la hidrofobicidad en presencia de Ca^{++}
depende de la naturaleza de la proteína, como por ejemplo la
presencia de grupos glicosilo y/o estéricos.
De esta manera, el método según la presente
invención puede ser utilizado para separar cualquier variante de
proteínas, en el que la hidrofobicidad de las variantes cambia en
función de la adición de Ca^{++} en el eluyente.
La aplicación de Ca^{++} a un eluyente orgánico
a base de solvente mejora en gran medida la separación de las
proteínas glicosiladas de las proteínas no glicosiladas en
comparación con la de un eluyente que comprende K^{+} o Na^{+} o
NH_{4}^{+} sólo o en combinación. Este hecho se debe al efecto
selectivo del Ca^{++} con el aumento de la hidrofobicidad de
proteínas no glicosiladas. Además de iones Ca^{++} el eluyente
puede comprender cationes tales como K^{+} y/o Na^{+} y/o iones
NH4^{+}. Los iones Ca^{++} pueden estar proporcionados mediante
cualquier fuente adecuada, como por ejemplo CaCl_{2}.
\newpage
El inventor de la presente ha descubierto que la
combinación de iones Ca^{++} y K^{+} en el eluyente mejora las
propiedades cromatográficas. En la presente invención la
composición preferida del eluyente es una mezcla de KCl y
CaCl_{2} donde la concentración de Ca^{++} en el eluyente es
inferior a 300 mM, así como inferior a 200 mM, preferiblemente
inferior a aproximadamente 100 mM, más preferiblemente
aproximadamente entre 5-50 mM, y una concentración
de K^{+} de 100-300 mM, como por ejemplo
aproximadamente 200 mM. En la concentración indicada, la
concentración de KCl en el eluyente varía y excede preferiblemente
la concentración de eluyentes de CaCl_{2}.
Cuando los iones Na^{+} y/o NH_{4}^{+}
están presentes, la concentración de Na^{+} y/o de NH_{4}^{+}
en el eluyente es de 100-300 mM, como por ejemplo
aproximadamente 200 mM.
El valor del pH preferido de los eluyentes es
superior al punto isoeléctrico de la proteína, y a sus análogos,
que deben ser separados. Con respecto a la insulina, muchas
insulinas presentan un punto isoeléctrico no inferior a un pH
5.0.
En la presente invención el volumen de retención
se sitúa entre 5 y 10 CV (volumen de columna) en una elución
isocrática.
El eluyente puede en principio comprender
cualquier solvente orgánico. El solvente orgánico puede ser etanol,
metanol, isopropanol o acetonitrilo. En la presente invención el
solvente orgánico preferido es el etanol y tiene una concentración
situada en la gama del 20-30% en peso.
La invención se refiere también a una fracción
que se puede obtener utilizando el proceso según la invención que
comprende proteínas no glicosiladas, donde la fracción está
esencialmente libre de proteínas glicosiladas. La invención se
utiliza de manera ventajosa para la separación de insulinas, donde
la fracción puede tener una concentración de insulinas glicosiladas
inferior al 0.2% en peso/volumen.
Las proteínas no glicosiladas purificadas, en
particular las insulinas, pueden tener una aplicación en cualquier
campo técnico, como el campo médico, como por ejemplo en el
tratamiento de la diabetes.
El texto siguiente es una descripción de los
experimentos realizados para mejorar la separación de las insulinas
no glicosiladas de las insulinas glicosiladas. Usando un eluyente
que contiene iones Ca^{++} se descubrió que la separación mejoró
mucho, y que se consiguió un producto final más puro de insulinas
no glicosiladas.
Todos los experimentos fueron realizados en
depósitos que contenían formas glicosiladas y no glicosiladas del
análogo de insulina X14 o del análogo de insulina DesB30. El X14
posee las mismas cadenas a y b que la insulina humana, la única
diferencia es la sustitución en la posición b28 de la prolina en la
insulina humana por ácido aspártico en el X14. El DesB30 posee las
mismas cadenas a y b que la insulina humana, la única diferencia es
la falta de treonina en la posición b30. Todos los porcentajes
están proporcionados en % en peso.
Los ejemplos 1-3 fueron
realizados con X14, y el ejemplo 4 con DesB30.
Unos depósitos seleccionados fueron fraccionados
y analizados en RP-HPLC. Los depósitos fueron
analizados para el producto principal así como para las variantes
glicosiladas. Unas fracciones de X14 fueron analizadas también para
el etilester.
La cromatografía se realizó en un sistema BioCAD
HPLC de PerSeptive Biosystems equipado con una celda de flujo de 6
o 3 mm. Los datos siguientes fueron constantes para todos los
experimentos, excepto cuando se especifica como una variable en un
experimento:
\newpage
| Matriz | Partículas de fase inversa FD* 200\ring{A} C18 15 \muM |
| Temperatura | 25°C |
| Columna | 250 mm x I.D. 10mm (0.785 cm^{2}), volumen de columna = 19.6 ml |
| Flujo | 2.5 cm/min |
| Tampón de regeneración | 70% de etanol + 1 M de Ácido acético |
| *FD: Fuji Davison |
Todos los productos químicos utilizados en forma
de tampones presentaban un grado analítico. El agua era de calidad
WFI (agua de inyección). Todos los tampones fueron regulados a pH
7.0 con HCl.
| Parámetros del proceso: | ||
| Funcionamiento de la columna | ||
| Equilibrado | 16% de etanol | 5 CV * |
| Aplicación | variable | |
| Lavado | 16% de etanol | 1 CV |
| Elución | <12 CV | |
| Regeneración | 5 CV | |
| * (CV = volumen de columna) |
\vskip1.000000\baselineskip
| Parámetros de la prueba: | |||
| Eluyente | Elución [EtOH] | Carga (mg/cm^{2}) | Figura. N° |
| 2.5 g/kg de Tris, | 28% | 30 | 3 |
| 100 mM de CaCl_{2} | |||
| 2.5 g/kg de Tris, | Aprox. 29% | 30 | 4 |
| 50 mM de CaCl_{2} |
El CaCl_{2} era extremadamente diferente de
cualquier otra sal sometida a la prueba (ver el Ejemplo 2 como
comparación). Con 100 mM, el valor máximo que representaba las
formas glicosiladas X14 era casi una línea de base separada. El
valor máximo del X14 era grande y presentaba una pendiente del lado
anterior muy ligera, mientras que el lado posterior en cambio,
presentaba una pendiente muy empinada. En el recorrido de 50 mM la
concentración de etanol durante el recorrido fue regulada
manualmente, y por lo tanto no se puede comparar directamente, pero
sin embargo, ésta indica un resultado muy similar.
Se comprobó que la hidrofobicidad de X14
aumentaba de forma selectiva por el CaCl_{2}, demostrado por la
alta concentración de etanol necesaria para la elución de X14 en
comparación con el KCl solo (ver Ejemplo 2 como comparación). Las
formas glicosiladas de X14 y el etilester parecen estar menos
alteradas por el CaCl_{2}.
De esta manera, los experimentos muestran que los
tampones de CaCl_{2} aumentan de manera selectiva la
hidrofobicidad de X14, dando como resultado una separación completa
de las formas glicosiladas de X14.
(Comparación)
Estas pruebas fueron realizadas para mostrar el
perfil de purificación de los procesos mediante el uso de KCl sin
CaCl_{2}.
| Parámetros de la prueba: | |||
| Eluyente | Elución [EtOH] | Carga (mg/cm^{2}) | Figura. N° |
| 10 mM Bis-tris, | 26.6% | 30 | 5 |
| 50 mM KCl | |||
| 10 mM Bis-tris, | 26.6% | 30 | 6 |
| 200 mM KCl |
Con una concentración de 50 mM de KCl el lado
anterior del valor máximo de la elución empezaba con una pendiente
empinada seguida de una pendiente aún más empinada. Esto indicaba
la presencia de unos valores máximos de la elución más próximos y
más pequeños. El aumento de la concentración de KCl a 200 mM mejoró
la separación pero no el nivel de separación utilizando un eluyente
que contenía Ca^{++}. Estas observaciones fueron confirmadas
mediante un análisis de las fracciones.
Estas pruebas se realizaron para examinar la
influencia de un sistema de tampón que combina KCl y CaCl_{2} en
la separación simultánea de etilester y de formas glicosiladas de
X14.
Prueba 1
| Parámetros de la prueba: | |||
| Eluyente | Elución [EtOH] | Carga (mg/cm^{2}) | Figura. N° |
| 2.5 g/kg Tris, 25 mM CaCl_{2}, | 28% | 30 | 7 |
| 100 mM KCl | |||
| 2:5 g/kg Tris, 12.5 mM CaCl_{2}, | 28% | 30 | 8 |
| 150 mM KCl |
Una mezcla de KCl y de CaCl_{2} (100/25 mM)
produjo una separación mejor del etilester que con tampones de
CaCl_{2} solo. La combinación 150/12.5 mM proporcionaba una
separación aún mejor del etilester. No obstante, al mismo tiempo el
valor máximo que representaba las formas glicosiladas de X14 estaba
menos separado, pero mucho mejor que con KCl solo. El aumento lento
de la pendiente del lado anterior fue menos pronunciado.
Los experimentos muestran que KCl y CaCl_{2}
son componentes de tampón importantes. Los experimentos muestran
que la presencia de Ca^{++} en el tampón mejora mucho el proceso
de purificación. El aumento de las concentraciones de Ca^{2+}
aumentó de manera selectiva la hidrofobicidad de X14 si se compara
con el etilester y las formas glicosiladas de X14.
\newpage
Prueba 2
Este experimento se realizó como en la prueba 1
excepto para los parámetros siguientes cambiados: 180 mM KCl y 5 mM
CaCl_{2}, 27.4% de etanol (elución) y la carga era de 150
mg/cm^{2}. El perfil del conjunto fue examinado antes y después
de la purificación.
Mediante esta purificación se puede obtener una
fracción de X14 no glicosilado esencialmente libre de X14
glicosilado. Según se ha indicado, el contenido de X14 en el
conjunto era de 89.98%. Aquí se ha demostrado que el contenido de
X14 aumentaba hasta 98.38% después de la purificación, y el
contenido de X14 monoglicosilado disminuía de forma significativa de
0.50% a 0.02%.
Se realizaron estas pruebas para demostrar el
efecto de Ca^{++} sobre el perfil de elución del análogo de
insulina DesB30. Todos los experimentos fueron realizados con pH:
7.2. Se utilizaron los datos siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
| Matriz | Partículas de fase inversa FD* 200\ring{A} C18 15 \muM |
| Temperatura | 22°C |
| Columna | 250 mm x I.D. 10Mm (0.785 cm^{2}, volumen de columna = 19.6 ml |
| Flujo | 3.0 cm/min |
| Tampón de regeneración | equilibrado con 16% de etanol, 0.1 M de Ácido cítrico |
| *FD: Fuji Davison |
| Funcionamiento de la columna | ||
| Equilibrado | 16% de etanol | 2.5 CV* |
| Aplicación | variable | |
| Lavado | 16% de etanol | 1 CV |
| Elución | <12 CV | |
| Regeneración | 2 CV | |
| *(CV = volumen de columna) |
Prueba 1
| Parámetros de la prueba: | |||
| Eluyente | Elución [EtOH] | Carga (mg/cm^{2}) | Figura N° |
| 15 mM Tris, 5 mM ácido maleico, | 27% | 190 | 9 |
| 0 mM CaCl_{2}. 200 mM KCl | |||
| 15 mM Tris, 5 mM ácido maleico, | 27% | 190 | 9 |
| 20 mM CaCl_{2}, 200 mM KCl |
\newpage
La diferencia entre el perfil de elución de
DesB30 cuando se utiliza un eluyente que contiene 20 mM de
CaCl_{2} comparado con el uso de un eluyente que no contiene
CaCl_{2} muestra que cuando el Ca^{++} está presente en el
eluyente, la separación de la insulina no glicosilada de la insulina
glicosilada es mejorada.
Prueba 2
| Parámetros de la prueba: | |||
| Eluyente | Elución [EtOH] | Carga (mg/cm^{2}) | Figura N° |
| 15 mM Tris, 5 mM de ácido maleico, | 26.8% | 190 | 10 |
| 0 mM CaCl_{2}. 200 mM KCl | |||
| 15 mM Tris, 5 mM de ácido maleico, | 27.8% | 190 | 10 |
| 20 mM CaCl_{2}, 200 mM de KCl |
En comparación con la prueba 1 se cambió la
concentración de etanol (elución) para obtener una retención
similar.
El contenido del conjunto fue examinado antes y
después de la elución. Antes de la elución había un 1.22% de DesB30
monoglicosilado en el conjunto de elución. Después de la
purificación utilizando un eluyente que contenía Ca^{++} la
cantidad de DesB30 monoglicosilado se redujo aproximadamente cinco
veces menos hasta un 0.21%. Cuando se compara con el 1.10% de DesB30
monoglicosilado dejado después de la elución utilizando un eluyente
que no contenía Ca^{++}, es evidente que cuando el Ca^{++} está
presente en el eluyente la separación de la insulina no glicosilada
de la insulina glicosilada mejora.
Claims (23)
1. Proceso de separación de proteínas
glicosiladas de proteínas no glicosiladas sometiendo una solución
que comprende proteínas glicosiladas y no glicosiladas a una
cromatografía utilizando un eluyente que contiene Ca^{++}, y
obteniendo una fracción que comprende proteínas no glicosiladas,
dicha fracción estando esencialmente libre de proteínas
glicosiladas.
2. Proceso según la reivindicación 1, en el que
la forma de cromatografía es RP-HPLC (cromatografía
líquida de alto rendimiento en fase inversa).
3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, en el
que se obtiene una fracción adicional que comprende proteínas
glicosiladas, y dicha fracción está esencialmente libre de
proteínas no glicosiladas.
4. Proceso según la reivindicación 1, 2 y 3, en
el que las proteínas glicosiladas son monoglicosiladas.
5. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que al menos una parte de las
proteínas glicosiladas son poliglicosiladas.
6. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la proteína es insulina o
un análogo de insulina.
7. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el eluyente comprende
cationes, tales como NH_{4}^{+} y/o K^{+} y/o Na^{+}.
8. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el eluyente comprende
CaCl_{2} o acetato de calcio.
9. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de
Ca^{++} en el eluyente es inferior a 300 mM, como por ejemplo
inferior a 200 mM, preferiblemente inferior a 100 mM, más
preferiblemente de 5-50 mM.
10. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de
NH_{4}^{+} en el eluyente es de 100-300, como
por ejemplo aproximadamente 200 mM.
11. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de K^{+}
en el eluyente es de 100-300 mM, como por ejemplo
aproximadamente 200 mM.
12. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de
Na^{+} en el eluyente es de 100-300 mM, como por
ejemplo aproximadamente 200 mM.
13. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el eluyente tiene un valor
de pH superior al punto isoeléctrico para las proteínas o los
precursores de proteínas.
14. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura es de
10-30°C, preferiblemente de
18-25°C.
15. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el eluyente comprende un
solvente orgánico.
16. Proceso según la reivindicación 15, en el que
el solvente orgánico está seleccionado entre etanol, metanol,
isopropanol, y acetonitrilo.
17. Proceso según la reivindicación 16, en el que
el eluyente tiene una concentración de etanol del
20-30% en peso
18. Composición que comprende insulina
recombinante, no glicosilada, o un derivado análogo, en la que la
composición está esencialmente libre de proteínas glicosiladas e
incluye insulina glicosilada, y en la que la concentración de
insulina glicosilada es inferior al 0.2% en peso/volumen.
19. Composición según la reivindicación 18, en la
que la insulina no glicosilada, recombinante, o un derivado
análogo, es producido en un sistema de expresión de levadura.
20. Composición según las reivindicaciones
18-19, en la que la concentración de insulina
glicosilada es inferior al 0.1% en peso/volumen.
21. Composición según la reivindicación 18, en la
que el análogo de insulina es X14.
22. Composición según la reivindicación 18, en la
que el análogo de insulina es DesB30.
23. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 22, en la que la composición puede ser
obtenida por el proceso según se ha definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK52898 | 1998-04-15 | ||
| DK52898 | 1998-04-15 |
Publications (1)
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