ES2242456B1 - Procedimiento de modificacion nucleofilica de proteinas y su aplicacion a la inmovilizacion de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de modificación nucleofilica de proteínas y su aplicación a la inmovilización de las mismas. El objeto de la invención es desarrollar un procedimiento de modificación de proteínas y su aplicación a la inmovilización de las mismas. El procedimiento consiste en la reacción química entre los grupos nucleofílicos libres de los residuos proteínicos y un derivado halogenado permite, a su vez el controlar las características de la proteína, tales como su carga neta e hidrofobicidad. El procedimiento descrito para la modificación de la carga neta de las proteínas resulta en un punto isoeléctrico independiente del pH. En el caso de oxidorreductasas, este procedimiento permite el control de la constante de transferencia de electrones tanto mediada como directa. Este procedimiento permite la incorporación de grupos negativos, positivos, hidrofobóbicos, hirofílicos o con cualquier funcionalidad preservando su actividad enzimática hasta un 80% o su constante de afinidad en el caso de anticuerpos. La modificación de la carga neta de las proteínas permite su deposición e inmovilización controlada mediante la obtención de estructuras supramoleculares a través de interacciones electrostáticas y que resulten en dispositivos con fines analíticos y/o sintéticos. El procedimiento de inmovilización se basa en la formación de bicapas a través de técnicas Langmuir-Blodgett o por fusión de vesículas. El procedimiento de modificación aquí descrito y su aplicación a la inmovilización de proteínas permite la construcción de biosensores enzimáticos e inmunosensores, así como sensores de DNA mediante el uso de estas enzimas modificadas como marcadores.
Description
Procedimiento de modificación nucleofílica de
proteínas y su aplicación a la inmovilización de las mismas.
Dicha invención se refiere a cualquier proteína
modificada por procedimientos químicos y usada en la construcción
de heteroestructuras supramoleculares con fines analíticos, y/o
sintéticos y/o para estabilización. A través de una sencilla
modificación química, una sustitución nucleofílica, la carga neta
de las proteínas puede ser modulada, de tal manera que su punto
isoeléctrico puede ser variado incluso tres unidades. Igualmente, la
incorporación de ésteres de ácidos grasos (lipofilización) o de
grupos hidrofóbicos a través de derivados halogenados permiten su
inmovilización en estructuras hidrofóbicas o la formación de
bicapas que ya incorporan el elemento de biorreconocimiento.
Adicionalmente la capacidad de manipular la carga neta de las
proteínas permite la deposición secuencial de múltiples capas de
proteínas modificadas con cargas opuestas permitiendo controlar
propiedades del sistema analítico tales como sensibilidad, límite
de detección o estabilidad.
La modificación del elemento biorreconocimiento
en la construcción de un sistema analítico, por ejemplo un
biosensor, resulta una herramienta indispensable para la
optimización no sólo de su inmovilización (orientada y/o controlada)
sino también para el control de algunos de los parámetros que
determinan su respuesta. Como consecuencia, los biosensores pueden
ser diseñados "a la carta" para una aplicación concreta tanto
en el análisis clínico, medioambiental como en el control de
alimentos y procesos.
Existen numerosos métodos para el ensamblaje de
los elementos de un biosensor sobre una superficie transductora
(óptica, térmica, piezoeléctrica o electricoquímica) [Gopel, W.;
Heiduschka, P. (1998) Biosens. Bioelectron. 10,
853-883]. No obstante, los métodos que ofrecen una
inmovilización controlada o una arquitectura organizada de los
elementos constitutivos son laboriosos en términos sintéticos y
preparativos y no siempre garantizan la consecución de los
objetivos planteados [Zhang,JK.; Cass,AEG. (2000) Anal. Chim.
Acta 408, 241-247]. Entre ellos, un
elevado recubrimiento o una transducción eficaz del evento
catalítico o de afinidad.
La posibilidad de modificar proteínas mediante
procedimientos sintéticos sencillos preservando su actividad
biológica proporciona una herramienta única para el ensamblado de
las mismas en estructuras supramoleculares organizadas que pueden
ser diseñadas para una aplicación específica. Por ejemplo, si como
resultado de la modificación, la proteína adquiere una carga global
positiva o negativa, el autoensamblado mediante interacciones
electrostáticas con otras estructuras portadoras de carga opuesta
(estabilizantes o mediadoras de transferencia de electrones)
resulta en la posibilidad de depositar múltiples capas de proteínas
resultando en un sistema integrado que puede ser empleado con fines
analíticos y/o sintéticos.
El desarrollo de la ingeniería genética ha
permitido en los últimos años producir proteínas con las
características deseadas ("a la carta"). La introducción de
aminoácidos específicos [Hill,HA.; Page,D.; Walton,NJ.; Whitford,D.
Patente US 4,655,885, 07/04/1987), la creación de proteínas
quiméricas [Lewis,J.C.; Feltus,A.; Ensor,C.M.; Ramanathan,S.;
Daunert,S. (1998) Anal. Chem. 70,
579A-585A; Madoz,J.; Boris,AK; Medrano, FJ.;
García,JL; fernández,VM. (1997) J. Am. Chem. Soc.,
119, 1043-1051], o la fusión de tags o flag®
[Vishwanath,S.K.; Watson,C.R.; Huang,W.; Bachas,L.G.;
Bhattacharyya,D. (1997) Biotechnol. Bioeng. 5,
608-616] son atractivas pero sofisticadas
alternativas que permiten la manipulación de las proteínas gracias
a lo cual pueden ser inmovilizadas de una manera orientada o no,
covalentemente, por afinidad. Estos métodos resultan muy
sofisticados, complejos e inciertos y requieren a su vez el
conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína a
modificar con el fin de reemplazar aminoácidos "naturales" por
otros que confieren las nuevas propiedades.
Una forma más sencilla y directa ha sido la
modificación química de proteínas, la cual ha sido una importante
herramienta que ha permitido no sólo ahondar en el conocimiento de
su estructura, principalmente del centro catalítico o de
biorreconocimiento, en enzimas y anticuerpos o receptores
respectivamente, sino que también ha permitido cambios en sus
propiedades.
Una de estas modificaciones químicas más
empleadas ha sido la oxidación de los oligosacáridos
(polialcoholes) a polialdehidos a través de periodato sódico.
Mediante la formación de bases de Schiff con aminas primarias
portadoras de determinados grupos funcionales
(H_{2}N-R) y su posterior reducción con una
agente reductor como borohidruro sódico, se produce la modificación
de la proteína que incorpora covalentemente el grupo R. En US
5,543,326 [Heller,A.; Katakis,I.; Ye,L. Patente US 5,543,326,
06/08/1996] se describe la modificación de la carga neta de
glicoenzimas a través de grupos aminos y carboxílicos
covalentemente unidos a oxidoreductasas. Mediante este método el pI
de las enzimas modificadas se incrementa al menos 2 unidades
permitiendo su inmovilización y la consecuente construcción de
biosensores enzimáticos. Este método presenta una alternativa
química sencilla si bien sólo puede ser realizado sobre
glicoproteínas.
Otros métodos propuestos han permitido la
modificación de la hidrofilicidad en proteínas mediante la
introducción de moléculas de monosacáridos (glucosa) o la
introducción de ésteres de ácidos grasos a través de una reacción
química realizada a una temperatura de 5-10ºC,
tanto en medios acuosos como en disolventes orgánicos [Bonnaffe,D.;
Lubineau,A.; Seris,JL.; Therisod, M. Patente US 5,262,525,
16/11/1993]. Si bien este último método resulta laborioso ya que
requiere la síntesis de los reactivos con el dieno correspondiente
en temperaturas extremas con alto consumo de tiempo.
La combinación de la ingeniería genética con la
modificación química de proteínas ha sido protegida en US 5,208,158
y WO 9,823,732, [Bech,LM.; Breddam,K.; Groen,H:; Branner.S.
Patente. US 5,208,158, 04/05/1993;
Bott,RR.; Desantis,G.; Graycar,T.; Mitchinson,C. Patente WO 9,823,732, 04/06/1998]. Se describen enzimas "detergentes" químicamente modificadas donde uno o más aminoácidos han sido mutados a cisteínas, cuyos grupos mercapto (-SH) permiten la introducción de una cadena alquílica C16 para mejorar la estabilidad frente a agentes oxidantes (US 5,208,158). En WO 9,823,732 se plantea la misma estrategia, es decir incorporación de cisteínas mediante mutagénesis y posterior derivatización con (a) -SR1R2 donde R1 es un alquil y R2 es un grupo polar o cargado, (b) -SR3 donde R3 es un fenil sustituido o no sustituido, (c) SR4 donde R4 es un ciclohexil sustituido o no sustituido, y (d) -SR5 donde R5 es un alquil derivado C10-C15.
Bott,RR.; Desantis,G.; Graycar,T.; Mitchinson,C. Patente WO 9,823,732, 04/06/1998]. Se describen enzimas "detergentes" químicamente modificadas donde uno o más aminoácidos han sido mutados a cisteínas, cuyos grupos mercapto (-SH) permiten la introducción de una cadena alquílica C16 para mejorar la estabilidad frente a agentes oxidantes (US 5,208,158). En WO 9,823,732 se plantea la misma estrategia, es decir incorporación de cisteínas mediante mutagénesis y posterior derivatización con (a) -SR1R2 donde R1 es un alquil y R2 es un grupo polar o cargado, (b) -SR3 donde R3 es un fenil sustituido o no sustituido, (c) SR4 donde R4 es un ciclohexil sustituido o no sustituido, y (d) -SR5 donde R5 es un alquil derivado C10-C15.
Todo lo anterior pone de manifiesto que no se
dispone de un método genérico para la modificación de las
propiedades de las proteínas sin necesidad de acudir a la
ingeniería genética o a rutas sintéticas muy sofisticadas o sin la
limitación de utilizar los restos glicosídicos de las
glicoproteínas.
La carga neta de las proteínas así como la
hidrofobicidad puede ser directamente modificada mediante reacción
de los grupos nucleofílicos libres (-NH_{2}, -OH, -SH)
constitutivos de las proteínas con derivados halogenados portadores
de las funcionalidades responsables de las nuevas propiedades.
Mediante una sencilla sustitución nucleofílica
con un derivado halogenado realizada a pH 9,5 en agua bidestilada o
en disolventes orgánicos, en dos horas y a temperatura ambiente, la
proteína incorpora los grupos funcionales deseados, Figura 1.
El derivado halogenado (X-R)
consiste en cualquier compuesto en el que R puede contener grupos
polares y/o con carga y/o derivados alifáticos y/o derivados
aromáticos o hererociclos.
La carga neta de la proteínas viene determinada
fundamentalmente por su contenido en grupos aminos y ácidos
carboxílicos y su estado de protonación al pH del entorno. Mediante
la modificación indicada es posible la manipulación de la carga
neta mediante la sustitución nucleofílica en las aminas primarias
por grupos cuya carga no depende del pH. Para ello se han utilizado
derivados halogenados (preferentemente bromuros), que bien
contienen grupos sulfónicos (carga negativa,
X-SO_{3}^{-}) o grupos amonio cuaternario (carga
positiva, X-N^{+}(CH_{3})_{3}).
Una demostración de la modificación resulta en la medida del punto
isoeléctrico, pI de las proteínas resultantes, Figura 2A. El pI de
las proteínas puede resultar modificado hasta tres unidades
dependiendo obviamente del grado de modificación y manteniendo su
actividad catalítica o de afinidad, Figura 2B.
Las proteínas modificadas presentan múltiples
ventajas, por una parte pueden se fácilmente inmovilizadas a través
de interacciones electrostáticas (formación de monocapas
autoensambladas), de una manera muy estable sobre estructuras
modificadas, siendo éstas preferentemente arquitecturas construidas
en multicapas mediante la deposición secuencial de polímeros redox
o no, o bien mediante la deposición secuencial de proteínas
modificadas con carga opuestas.
Este es el caso de tres proteínas utilizadas
como moléculas modelo, dos oxidorectuctasas y un anticuerpo. La
peroxidasa de rábano de caballo (HRP) es modificada negativamente
mientras que a la alcohol oxidasa (AOX) y un anticuerpo
antidigoxina se les confiere carga positiva.
Las figuras 3 y 4 muestran las respuestas
electrocatalíticas cuando estas proteínas se inmovilizan sobre
arquitecturas autoensambladas sobre polímeros redox con carga
opuesta.
La HRP se inmoviliza sobre una interfase
electroquímica compuesta por un polímero redox cargado
positivamente depositado a su vez sobre una monocapa de carga
negativa formada con un mercapto derivado sobre un material de oro
(electrodo o coloide): Au/MPS donde MPS es cualquier mercapto
derivado portador de un grupo con carga negativa (-COO^{-} ó
-SO_{3}^{-}). La adicción de H_{2}O_{2} resulta en una
elevada corriente electrocatalítica, figura 3. El anticuerpo
antidigoxina y la alcohol oxidasa pueden depositarse sobre la
interfase transductora de H_{2}O_{2}, es decir sobre una
estructura conteniendo Au / MPS / Polímero redox (+) / HRP
modificada negativamente. Igualmente se pueden construir
estructuras similares a partir de un mercapto derivado portador de
carga positiva y autoensamblando polímeros redox de carga negativa
y enzimas de carga positiva. La configuración con la AOX positiva
resulta en corrientes electrocatalíticas tras la adicción de
etanol, figura 4. Estas configuraciones pueden ser igualmente
aplicadas a sistemas de inmunodetección tras la deposición de los
anticuerpos cargados positivamente sobre la peroxidasa negativa. Se
pueden realizar entonces cualquier tipo de inmunoensayo en los que
el inmunoconjugado va marcado con glucosa
oxidasa.
oxidasa.
La versatilidad que proporciona la modificación
"a la carta" permite la construcción de arquitecturas
supramoleculares con deposición de tantas capas como se requieran y
cuya composición puede ser determinada según las necesidades
analíticas de cada aplicación. Como ejemplo se demuestra un sensor
para detectar alcohol cuya respuesta aumenta linealmente con el
número de capas de AOX(+), Figura 5.
Adicionalmente las proteínas modificadas
presentan otras ventajas. En el caso de oxidorreductasas la
modificación de la carga neta favorece la interacción con el
polímero o mediadores redox. Así, cuando una oxidorredutasa como es
el caso de la HRP es modificada confiriéndola carga negativa la
constante de transferencia con un mediador redox cargado
positivamente aumenta más de un orden de magnitud, como lo
demuestra la Figura 6. Asimismo una mayor transferencia de
electrones directa entre el centro redox y la superficie del
electrodo es también observada cuando esta proteína modificada es
adsorbida sobre electrodos de grafito, pudiendo ser debido a una
diferente conformación de la proteína que deja su centro redox más
expuesto.
Para que todas estas mejoras se produzcan es
necesario que el cambio en el pI de las proteínas sea
significativo, de al menos dos unidades de pH, es decir que se
incorporen un número suficiente de grupos sulfónicos o aminas
cuaternarias como para que el cambio de carga neta permita una
inmovilización estable o una mayor transferencia de electrones.
Para aumentar la estabilidad en la aplicación es recomendable
aumentar lo máximo posible el cambio en el pI (siempre preservando
la actividad de la proteína) dado que la fuerzas electrostáticas
serán mayores asi como la interacción
proteína-mediador y
proteína-electrodo.
Por otra parte mediante el control del pH, del
disolvente orgánico, de la fuerza fónica y de la temperatura es
posible modular la modificación de la proteína, siendo posible la
incorporación selectiva de cadenas alquílicas en la proteína que
permiten su inmovilización en capas bilipídicas. Preferentemente la
modificación se ha de realizar con
1-bromotridecano, 1-bromotetradecano
o 1-bromoundecano que permiten mediante un presión
y temperatura controlada su incorporación a estas membranas
artificiales. Resulta imprescindible que exista una modificación
adecuada de tal manera que la hidrofilicidad quede compensada así
como una disposición orientada de la modificación (opuesta al
centro activo o a la zona de reconocimiento o de afinidad).
Mediante la obtención de la isoterma de
Langmuir-Blodgett se caracteriza la proteína
modificada permitiendo la obtención de parámetros característicos
como la presión crítica (momento cuando la monocapa colapsa), el
área media molecular, el potencial superficial o calcular los ciclos
de histéresis. Una vez caracterizado se forma la monocapa a una
presión menor a la de colapsamiento transfiriendo la monocapa al
electrodo de oro. También es posible la formación de estas bicapas
mediante la fusión de vesículas en la superficie del electrodo.
Otra posibilidad contemplada en esta patente es
la modificación de proteínas mediante su reacción con compuestos
halogenados derivatizados con un grupo hidrofóbico preferentemente
anillos aromáticos o tipo éter, mediante esta modificación la
proteína presenta una superficie hidrófoba, permitiendo su
inmovilización o interacción electroquímica sobre superficies
hidrofóbicas o mediadores no solubles respectivamente. La ventaja
adicional en estas proteínas con una menor solubilidad estriba en
su uso en electrodos de pasta unida o "binder paste"
(EP0757246), [Domínguez,E.; Parellada,J.; Narváez,A.; Katakis,I.
Patente, EP0757246, 05/02/1997]. Dado que este material resulta
altamente hidrofilico, el uso de estas proteínas modificadas
evitaría su desorción. Esta última aplicación de biosensores y/o
inmunosensores construidos con "binder paste" también puede
aplicarse a proteínas cargadas negativamente ya que las mayores
interacciones electrostáticas entre la proteína modificada, el
mediador redox y el polímero binder aumentarán la estabilidad de
dicha configuración. La alta hidrofilicidad del medio permitirá una
transferencia de materia favoreciendo las reacciones de afinidad en
su interior con anticuerpos y/o receptores modificados mediante el
procedimiento descrito anteriormente.
Figura 1: Esquema de la reacción química para
diferentes compuestos halogenados.
Figura 2: A) Demostración de la variación del pI
de la peroxidasa con la modificación química propuesta. B)
Actividad catalítica de la peroxidasa modificada.
Figura 3: Se muestra la respuesta
electrocatalítica de la peroxidasa nativa sin modificar (A) y de la
peroxidasa modificada (B) cuando el H_{2}O_{2} es añadido a la
celda electroquímica En el "inset" se muestra una curva de
calibrado para la peroxidasa modificada.
Figura 4: Curva de calibrado del sensor para
etanol y metanol construido por la deposición secuencial de cinco
capas de AOX modificadas con carga positiva e interfaciada con
poliestirenosulfonato (PSS).
Figura 5: Modificación de la sensibilidad según
el número de capas enzimáticas depositadas.
Figura 6: Variación de la constante de
transferencia de electrones para diferentes mediadores redox con
distinta carga positiva e idéntico potencial redox.
5 mg de HRP (EC 1.11.1, 7 290 U mg^{-1} sólido
tipo VI) son diluidos en 5 ml de agua bidestilada. Posteriormente
se añade 0.1 M de Br(CH_{2})_{2}SO_{3}Na y el pH
de la disolución se eleva a 9,5 mediante la adición de una
disolución de NaOH diluida. La mezcla se agita durante 2 horas a
temperatura ambiente y posteriormente ultrafiltrada por membranas
de 10 000 Da. MWCO.
5 mg de AOX (EC 1.1.3.13, 4 U mg^{-1} sólido
de Hansenula sp) son diluidos en 5 ml de agua bidestilada.
Posteriormente se añade 0.1 M de
Br(CH_{2})_{2}NBr(CH_{3})_{3} y
el pH de la disolución se eleva a 9,5 mediante la adición de una
disolución de NaOH diluida. La mezcla se agita durante 2 horas a
temperatura ambiente y posteriormente ultrafiltrada por membranas
de 100 000 Da. MWCO.
Se prepara en agua bidestilada una dilución 12.5
de la preparación comercial del anticuerpo
anti-digoxina. Una concentración 0.1 M de
Br(CH_{2})_{2}NBr(CH_{3})_{3} es
añadida y el pH de la disolución se eleva a 9,5 mediante la adición
de una disolución de NaOH diluida. La mezcla se agita durante 2
horas a temperatura ambiente y posteriormente ultrafiltrada por
membranas de 10 000 Da. MWCO.
5 mg de la proteína HRP son diluidos en 5 ml de
agua bidestilada. Posteriormente 0.1 M de Br
(CH_{2})_{2}pyr o derivados halogenados conteniendo
cadenas alquílicas son añadidos y el pH de la disolución es llevado
hasta el pH óptimo de la reacción dependiendo el grado de
modificación deseado, mediante la adición de una disolución de NaOH
diluida. La mezcla es agitada durante 2 horas a temperatura
ambiente y posteriormente ultrafiltrada por membranas de 10 000 Da.
MWCO.
Electrodos de oro o coloides de oro son
modificados con
3-mercapto-1-propano
ácido sulfónico. Posteriormente un polímero redox cargado
positivamente es depositado según el procedimiento descrito por
[Narvaez,A.; Suarez,G.; Popescu,I.C.; Katakis,I.; Dominguez,E.
(2000) Biosens. Bioelectron. 15,
43-52]. Posteriormente los electrodos modificados se
sumergen en una disolución 0.1 M tampón fosfato pH 7.0 durante 2
horas, a 4ºC conteniendo 200 \mug.ml^{-1} de peroxidasa cargada
negativamente.
Una vez construida la interfase transductora de
H_{2}O_{2}, los electrodos modificados se sumergen en una
disolución conteniendo los anticuerpos modificados o la enzima AOX
ambos modificados positivamente. En el caso de los anticuerpos los
electrodos se incuban durante 30 min a 4ºC, mientras que en el caso
de la enzima se incuban durante 2 horas, a 4ºC en una disolución
conteniendo 1 mg mL^{-1} de AOX cargada positivamente.
Sobre la interfase transductora de
H_{2}O_{2} se deposita una capa de AOX cargada positivamente
mediante la inmersión de los electrodos durante 2 horas a 4ºC en
una disolución conteniendo 1 mg mL^{-1} de proteína, tras el
lavado con tampón fosfato pH 7.0, los electrodos se vuelven a
sumergir por otras 2 h a 4ºC en una disolución que contiene 1 mg
mL^{-1} de AOX cargada negativamente y así sucesivamente.
25 mg de grafito son mezclados con 1 mg de
proteína modificada y 5 mg de polímero binder, se añaden 40 \muL
de agua bidestilada, se mezcla bien la pasta, se deja secar
parcialmente y se empaqueta en electrodos que poseen un diámetro de
0.85 mm.
Claims (6)
1. Procedimiento de modificación de proteínas
que resulta en la transformación de sus propiedades
físico-químicas y caracterizado por una
sustitución nucleofílica mediante el tratamiento con un derivado
halogenado (X-R), -siendo R un grupo polar y/o con
carga y/o derivado alifático y/o derivado aromático o
heterociclo-.
2. Procedimiento de modificación de proteínas,
según la reivindicación 1, caracterizado porque, en el
derivado halogenado (X-R), R puede ser un grupo
sulfónico o amonio cuaternario cuya carga es independiente del pH
del medio o R puede ser un grupo alifático y/o derivado aromático o
heterociclo con diferente hidrofobicidad.
3. Procedimiento de modificación de proteínas,
según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque con
derivados halogenados conteniendo grupos sulfónicos o amonios
cuaternarios es posible modular la carga neta resultando una
proteína con un pI modificado o porque con derivados alifáticos y/o
derivados aromáticos o heterociclos es posible modular la
hidrofobicidad resultando una proteína con una hidrofobicidad
modificada.
4. Procedimiento de inmovilización de proteínas
en el que la proteína que se inmoviliza ha sido modificada mediante
el procedimiento descrito en las reivindicaciones 1, 2 y 3, y
porque el procedimiento de inmovilización se basa en la obtención
de estructuras supramoleculares a través de interacciones
electrostáticas y que resulten en dispositivos con fines analíticos
y/o sintéticos.
5. Procedimiento de inmovilización de proteínas
en el que la proteína que se inmoviliza ha sido modificada mediante
el procedimiento descrito en las reivindicaciones 1, 2 y 3, y
porque el procedimiento de inmovilización se basa en la formación
de bicapas a través de técnicas de Langmuir-Blodgett
o por fusión de vesículas.
6. Utilización del procedimiento de modificación
de proteínas según las reivindicaciones 1-3, en los
procesos de inmovilización de las mismas.
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| ES200001965A ES2242456B1 (es) | 2000-08-02 | 2000-08-02 | Procedimiento de modificacion nucleofilica de proteinas y su aplicacion a la inmovilizacion de las mismas. |
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| ES2242456A1 ES2242456A1 (es) | 2005-11-01 |
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| ES (1) | ES2242456B1 (es) |
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|---|---|---|---|---|
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