ES2242456B1

ES2242456B1 - PROCEDURE FOR NUCLEOPHILIC PROTEIN MODIFICATION AND ITS APPLICATION TO THE IMMOBILIZATION OF THE SAME.

Info

Publication number: ES2242456B1
Application number: ES200001965A
Authority: ES
Inventors: Elena Dominguez Cañas; Guillaume Suarez; Arantzazu Narvaez Garcia
Original assignee: Universidad de Alcala de Henares UAH
Current assignee: Universidad de Alcala de Henares UAH
Priority date: 2000-08-02
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2020-08-02
Also published as: ES2242456A1

Abstract

Procedimiento de modificación nucleofilica de proteínas y su aplicación a la inmovilización de las mismas. El objeto de la invención es desarrollar un procedimiento de modificación de proteínas y su aplicación a la inmovilización de las mismas. El procedimiento consiste en la reacción química entre los grupos nucleofílicos libres de los residuos proteínicos y un derivado halogenado permite, a su vez el controlar las características de la proteína, tales como su carga neta e hidrofobicidad. El procedimiento descrito para la modificación de la carga neta de las proteínas resulta en un punto isoeléctrico independiente del pH. En el caso de oxidorreductasas, este procedimiento permite el control de la constante de transferencia de electrones tanto mediada como directa. Este procedimiento permite la incorporación de grupos negativos, positivos, hidrofobóbicos, hirofílicos o con cualquier funcionalidad preservando su actividad enzimática hasta un 80% o su constante de afinidad en el caso de anticuerpos. La modificación de la carga neta de las proteínas permite su deposición e inmovilización controlada mediante la obtención de estructuras supramoleculares a través de interacciones electrostáticas y que resulten en dispositivos con fines analíticos y/o sintéticos. El procedimiento de inmovilización se basa en la formación de bicapas a través de técnicas Langmuir-Blodgett o por fusión de vesículas. El procedimiento de modificación aquí descrito y su aplicación a la inmovilización de proteínas permite la construcción de biosensores enzimáticos e inmunosensores, así como sensores de DNA mediante el uso de estas enzimas modificadas como marcadores.Nucleophilic protein modification procedure and its application to their immobilization. The object of the invention is to develop a method of protein modification and its application to the immobilization thereof. The procedure consists in the chemical reaction between the free nucleophilic groups of the protein residues and a halogenated derivative, in turn, allows controlling the characteristics of the protein, such as its net charge and hydrophobicity. The procedure described for the modification of the net charge of the proteins results in an isoelectric point independent of the pH. In the case of oxidoreductases, this procedure allows the control of the electron transfer constant both mediated and direct. This procedure allows the incorporation of negative, positive, hydrophobic, hydrophilic or any functional groups, preserving their enzymatic activity up to 80% or their affinity constant in the case of antibodies. The modification of the net charge of the proteins allows their deposition and controlled immobilization by obtaining supramolecular structures through electrostatic interactions and resulting in devices for analytical and / or synthetic purposes. The immobilization procedure is based on the formation of bilayers through Langmuir-Blodgett techniques or by vesicle fusion. The modification procedure described herein and its application to protein immobilization allows the construction of enzymatic and immunosensory biosensors, as well as DNA sensors through the use of these modified enzymes as markers.

Description

Procedimiento de modificación nucleofílica de proteínas y su aplicación a la inmovilización de las mismas.Nucleophilic Modification Procedure of proteins and their application to their immobilization.

Dicha invención se refiere a cualquier proteína modificada por procedimientos químicos y usada en la construcción de heteroestructuras supramoleculares con fines analíticos, y/o sintéticos y/o para estabilización. A través de una sencilla modificación química, una sustitución nucleofílica, la carga neta de las proteínas puede ser modulada, de tal manera que su punto isoeléctrico puede ser variado incluso tres unidades. Igualmente, la incorporación de ésteres de ácidos grasos (lipofilización) o de grupos hidrofóbicos a través de derivados halogenados permiten su inmovilización en estructuras hidrofóbicas o la formación de bicapas que ya incorporan el elemento de biorreconocimiento. Adicionalmente la capacidad de manipular la carga neta de las proteínas permite la deposición secuencial de múltiples capas de proteínas modificadas con cargas opuestas permitiendo controlar propiedades del sistema analítico tales como sensibilidad, límite de detección o estabilidad.Said invention relates to any protein modified by chemical procedures and used in construction of supramolecular heterostructures for analytical purposes, and / or synthetic and / or for stabilization. Through a simple chemical modification, a nucleophilic substitution, net charge of proteins can be modulated, such that its point Isoelectric can be varied even three units. Likewise, the incorporation of fatty acid esters (lipophilization) or of hydrophobic groups through halogenated derivatives allow their immobilization in hydrophobic structures or the formation of bilayers that already incorporate the biorecognition element. Additionally the ability to manipulate the net charge of proteins allows the sequential deposition of multiple layers of modified proteins with opposite charges allowing control analytical system properties such as sensitivity, limit of detection or stability.

Sector de la técnicaTechnical sector

La modificación del elemento biorreconocimiento en la construcción de un sistema analítico, por ejemplo un biosensor, resulta una herramienta indispensable para la optimización no sólo de su inmovilización (orientada y/o controlada) sino también para el control de algunos de los parámetros que determinan su respuesta. Como consecuencia, los biosensores pueden ser diseñados "a la carta" para una aplicación concreta tanto en el análisis clínico, medioambiental como en el control de alimentos y procesos.The modification of the biorecognition element in the construction of an analytical system, for example a biosensor, is an indispensable tool for the optimization not only of its immobilization (oriented and / or controlled) but also for the control of some of the parameters that Determine your answer. As a consequence, biosensors can be designed "on demand" for a specific application both in clinical, environmental analysis and in the control of Food and processes

Existen numerosos métodos para el ensamblaje de los elementos de un biosensor sobre una superficie transductora (óptica, térmica, piezoeléctrica o electricoquímica) [Gopel, W.; Heiduschka, P. (1998) Biosens. Bioelectron. 10, 853-883]. No obstante, los métodos que ofrecen una inmovilización controlada o una arquitectura organizada de los elementos constitutivos son laboriosos en términos sintéticos y preparativos y no siempre garantizan la consecución de los objetivos planteados [Zhang,JK.; Cass,AEG. (2000) Anal. Chim. Acta 408, 241-247]. Entre ellos, un elevado recubrimiento o una transducción eficaz del evento catalítico o de afinidad.There are numerous methods for assembling the elements of a biosensor on a transducer surface (optical, thermal, piezoelectric or electricochemical) [Gopel, W .; Heiduschka, P. (1998) Biosens. Bioelectron 10 , 853-883]. However, the methods that offer controlled immobilization or an organized architecture of the constituent elements are laborious in synthetic and preparative terms and do not always guarantee the achievement of the stated objectives [Zhang, JK .; Cass, AEG. (2000) Anal. Chim. Minutes 408 , 241-247]. Among them, a high coating or an effective transduction of the catalytic or affinity event.

La posibilidad de modificar proteínas mediante procedimientos sintéticos sencillos preservando su actividad biológica proporciona una herramienta única para el ensamblado de las mismas en estructuras supramoleculares organizadas que pueden ser diseñadas para una aplicación específica. Por ejemplo, si como resultado de la modificación, la proteína adquiere una carga global positiva o negativa, el autoensamblado mediante interacciones electrostáticas con otras estructuras portadoras de carga opuesta (estabilizantes o mediadoras de transferencia de electrones) resulta en la posibilidad de depositar múltiples capas de proteínas resultando en un sistema integrado que puede ser empleado con fines analíticos y/o sintéticos.The possibility of modifying proteins by simple synthetic procedures preserving their activity Biological provides a unique tool for assembling the same in organized supramolecular structures that can Be designed for a specific application. For example, if I eat result of the modification, the protein acquires a global load positive or negative, self-assembled through interactions electrostatic with other carrier structures of opposite charge (stabilizers or electron transfer mediators) results in the possibility of depositing multiple layers of proteins resulting in an integrated system that can be used for purposes analytical and / or synthetic.

Estado actual de la técnicaCurrent state of the art

El desarrollo de la ingeniería genética ha permitido en los últimos años producir proteínas con las características deseadas ("a la carta"). La introducción de aminoácidos específicos [Hill,HA.; Page,D.; Walton,NJ.; Whitford,D. Patente US 4,655,885, 07/04/1987), la creación de proteínas quiméricas [Lewis,J.C.; Feltus,A.; Ensor,C.M.; Ramanathan,S.; Daunert,S. (1998) Anal. Chem. 70, 579A-585A; Madoz,J.; Boris,AK; Medrano, FJ.; García,JL; fernández,VM. (1997) J. Am. Chem. Soc., 119, 1043-1051], o la fusión de tags o flag® [Vishwanath,S.K.; Watson,C.R.; Huang,W.; Bachas,L.G.; Bhattacharyya,D. (1997) Biotechnol. Bioeng. 5, 608-616] son atractivas pero sofisticadas alternativas que permiten la manipulación de las proteínas gracias a lo cual pueden ser inmovilizadas de una manera orientada o no, covalentemente, por afinidad. Estos métodos resultan muy sofisticados, complejos e inciertos y requieren a su vez el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína a modificar con el fin de reemplazar aminoácidos "naturales" por otros que confieren las nuevas propiedades.The development of genetic engineering has allowed in recent years to produce proteins with the desired characteristics ("à la carte"). The introduction of specific amino acids [Hill, HA .; Page, D .; Walton, NJ .; Whitford, D. US Patent 4,655,885, 04/07/1987), the creation of chimeric proteins [Lewis, JC; Feltus, A .; Ensor, CM; Ramanathan, S .; Daunert, S. (1998) Anal. Chem 70 , 579A-585A; Madoz, J .; Boris, AK; Medrano, FJ .; Garcia, JL; Fernandez, VM. (1997) J. Am. Chem. Soc ., 119 , 1043-1051], or the fusion of tags or flag® [Vishwanath, SK; Watson, CR; Huang, W .; Bachas, LG; Bhattacharyya, D. (1997) Biotechnol. Bioeng 5 , 608-616] are attractive but sophisticated alternatives that allow the manipulation of proteins thanks to which they can be immobilized in a covalently oriented way or not, by affinity. These methods are very sophisticated, complex and uncertain and in turn require knowledge of the amino acid sequence of the protein to be modified in order to replace "natural" amino acids with others that confer the new properties.

Una forma más sencilla y directa ha sido la modificación química de proteínas, la cual ha sido una importante herramienta que ha permitido no sólo ahondar en el conocimiento de su estructura, principalmente del centro catalítico o de biorreconocimiento, en enzimas y anticuerpos o receptores respectivamente, sino que también ha permitido cambios en sus propiedades.A simpler and more direct way has been the chemical modification of proteins, which has been an important tool that has allowed not only to delve into the knowledge of its structure, mainly from the catalytic center or from biorecognition, in enzymes and antibodies or receptors respectively, but has also allowed changes in their properties.

Una de estas modificaciones químicas más empleadas ha sido la oxidación de los oligosacáridos (polialcoholes) a polialdehidos a través de periodato sódico. Mediante la formación de bases de Schiff con aminas primarias portadoras de determinados grupos funcionales (H_{2}N-R) y su posterior reducción con una agente reductor como borohidruro sódico, se produce la modificación de la proteína que incorpora covalentemente el grupo R. En US 5,543,326 [Heller,A.; Katakis,I.; Ye,L. Patente US 5,543,326, 06/08/1996] se describe la modificación de la carga neta de glicoenzimas a través de grupos aminos y carboxílicos covalentemente unidos a oxidoreductasas. Mediante este método el pI de las enzimas modificadas se incrementa al menos 2 unidades permitiendo su inmovilización y la consecuente construcción de biosensores enzimáticos. Este método presenta una alternativa química sencilla si bien sólo puede ser realizado sobre glicoproteínas.One of these chemical modifications more used has been the oxidation of oligosaccharides (polyalcohols) to polyaldehydes through sodium periodate. By forming Schiff bases with primary amines carriers of certain functional groups (H 2 N-R) and its subsequent reduction with a reducing agent such as sodium borohydride, modification occurs of the protein that covalently incorporates the R group. In US 5,543,326 [Heller, A .; Katakis, I .; And the. US Patent 5,543,326, 06/08/1996] describes the modification of the net charge of glycoenzymes through amino and carboxylic groups covalently bound to oxidoreductases. Through this method the pI of the modified enzymes is increased by at least 2 units allowing its immobilization and the consequent construction of enzymatic biosensors. This method presents an alternative simple chemistry although it can only be performed on glycoproteins

Otros métodos propuestos han permitido la modificación de la hidrofilicidad en proteínas mediante la introducción de moléculas de monosacáridos (glucosa) o la introducción de ésteres de ácidos grasos a través de una reacción química realizada a una temperatura de 5-10ºC, tanto en medios acuosos como en disolventes orgánicos [Bonnaffe,D.; Lubineau,A.; Seris,JL.; Therisod, M. Patente US 5,262,525, 16/11/1993]. Si bien este último método resulta laborioso ya que requiere la síntesis de los reactivos con el dieno correspondiente en temperaturas extremas con alto consumo de tiempo.Other proposed methods have allowed the modification of hydrophilicity in proteins by means of introduction of monosaccharide molecules (glucose) or the introduction of fatty acid esters through a reaction chemical performed at a temperature of 5-10 ° C, both in aqueous media and in organic solvents [Bonnaffe, D .; Lubineau, A .; Seris, JL .; Therisod, M. US Patent 5,262,525, 11/16/1993]. While this last method is laborious since requires the synthesis of the reagents with the corresponding diene in extreme temperatures with high time consumption.

La combinación de la ingeniería genética con la modificación química de proteínas ha sido protegida en US 5,208,158 y WO 9,823,732, [Bech,LM.; Breddam,K.; Groen,H:; Branner.S. Patente. US 5,208,158, 04/05/1993;
Bott,RR.; Desantis,G.; Graycar,T.; Mitchinson,C. Patente WO 9,823,732, 04/06/1998]. Se describen enzimas "detergentes" químicamente modificadas donde uno o más aminoácidos han sido mutados a cisteínas, cuyos grupos mercapto (-SH) permiten la introducción de una cadena alquílica C16 para mejorar la estabilidad frente a agentes oxidantes (US 5,208,158). En WO 9,823,732 se plantea la misma estrategia, es decir incorporación de cisteínas mediante mutagénesis y posterior derivatización con (a) -SR1R2 donde R1 es un alquil y R2 es un grupo polar o cargado, (b) -SR3 donde R3 es un fenil sustituido o no sustituido, (c) SR4 donde R4 es un ciclohexil sustituido o no sustituido, y (d) -SR5 donde R5 es un alquil derivado C10-C15.The combination of genetic engineering with chemical protein modification has been protected in US 5,208,158 and WO 9,823,732, [Bech, LM .; Breddam, K .; Groen, H :; Branner S. Patent. US 5,208,158, 04/05/1993;
Bott, RR .; Desantis, G .; Graycar, T .; Mitchinson, C. WO 9,823,732, 06/04/1998]. Chemically modified "detergent" enzymes are described where one or more amino acids have been mutated to cysteines, whose mercapto groups (-SH) allow the introduction of a C16 alkyl chain to improve stability against oxidizing agents (US 5,208,158). In WO 9,823,732 the same strategy is proposed, that is, incorporation of cysteines by mutagenesis and subsequent derivatization with (a) -SR1R2 where R1 is an alkyl and R2 is a polar or charged group, (b) -SR3 where R3 is a substituted phenyl or unsubstituted, (c) SR4 where R4 is a substituted or unsubstituted cyclohexyl, and (d) -SR5 where R5 is a C10-C15 derived alkyl.

Todo lo anterior pone de manifiesto que no se dispone de un método genérico para la modificación de las propiedades de las proteínas sin necesidad de acudir a la ingeniería genética o a rutas sintéticas muy sofisticadas o sin la limitación de utilizar los restos glicosídicos de las glicoproteínas.All of the above shows that it is not It has a generic method for modifying the protein properties without the need to go to the genetic engineering or to very sophisticated synthetic routes or without the limitation of using the glycosidic remains of glycoproteins

Resumen de la invenciónSummary of the Invention

La carga neta de las proteínas así como la hidrofobicidad puede ser directamente modificada mediante reacción de los grupos nucleofílicos libres (-NH_{2}, -OH, -SH) constitutivos de las proteínas con derivados halogenados portadores de las funcionalidades responsables de las nuevas propiedades.The net protein load as well as the hydrophobicity can be directly modified by reaction of the free nucleophilic groups (-NH2, -OH, -SH) constitutive of proteins with halogenated carrier derivatives of the functionalities responsible for the new properties.

Mediante una sencilla sustitución nucleofílica con un derivado halogenado realizada a pH 9,5 en agua bidestilada o en disolventes orgánicos, en dos horas y a temperatura ambiente, la proteína incorpora los grupos funcionales deseados, Figura 1.Through a simple nucleophilic substitution with a halogenated derivative made at pH 9.5 in double distilled water or in organic solvents, in two hours and at room temperature, the Protein incorporates the desired functional groups, Figure 1.

El derivado halogenado (X-R) consiste en cualquier compuesto en el que R puede contener grupos polares y/o con carga y/o derivados alifáticos y/o derivados aromáticos o hererociclos.The halogenated derivative (X-R) consists of any compound in which R can contain groups polar and / or charged and / or aliphatic derivatives and / or derivatives aromatic or hererocycles.

La carga neta de la proteínas viene determinada fundamentalmente por su contenido en grupos aminos y ácidos carboxílicos y su estado de protonación al pH del entorno. Mediante la modificación indicada es posible la manipulación de la carga neta mediante la sustitución nucleofílica en las aminas primarias por grupos cuya carga no depende del pH. Para ello se han utilizado derivados halogenados (preferentemente bromuros), que bien contienen grupos sulfónicos (carga negativa, X-SO_{3}^{-}) o grupos amonio cuaternario (carga positiva, X-N^{+}(CH_{3})_{3}). Una demostración de la modificación resulta en la medida del punto isoeléctrico, pI de las proteínas resultantes, Figura 2A. El pI de las proteínas puede resultar modificado hasta tres unidades dependiendo obviamente del grado de modificación y manteniendo su actividad catalítica o de afinidad, Figura 2B.The net protein load is determined fundamentally because of its content in amino and acidic groups carboxylic and its protonation state at the pH of the environment. Through the indicated modification is possible cargo handling net by nucleophilic substitution in primary amines by groups whose load does not depend on pH. For this they have been used halogenated derivatives (preferably bromides), which well contain sulfonic groups (negative charge, X-SO 3 {-}) or quaternary ammonium groups (charge positive, X-N + (CH 3) 3). A demonstration of the modification results in the measurement of the point isoelectric, pI of the resulting proteins, Figure 2A. The pI of proteins can be modified up to three units obviously depending on the degree of modification and maintaining its catalytic or affinity activity, Figure 2B.

Las proteínas modificadas presentan múltiples ventajas, por una parte pueden se fácilmente inmovilizadas a través de interacciones electrostáticas (formación de monocapas autoensambladas), de una manera muy estable sobre estructuras modificadas, siendo éstas preferentemente arquitecturas construidas en multicapas mediante la deposición secuencial de polímeros redox o no, o bien mediante la deposición secuencial de proteínas modificadas con carga opuestas.Modified proteins have multiple advantages, on the one hand can be easily immobilized through electrostatic interactions (formation of monolayers self-assembled), in a very stable way on structures modified, these being preferably built architectures in multilayers by sequential deposition of redox polymers or not, or by sequential protein deposition modified with opposite charges.

Este es el caso de tres proteínas utilizadas como moléculas modelo, dos oxidorectuctasas y un anticuerpo. La peroxidasa de rábano de caballo (HRP) es modificada negativamente mientras que a la alcohol oxidasa (AOX) y un anticuerpo antidigoxina se les confiere carga positiva.This is the case of three proteins used as model molecules, two oxidorectuctases and one antibody. The Horse radish peroxidase (HRP) is negatively modified while to alcohol oxidase (AOX) and an antibody Antidigoxin is given a positive charge.

Las figuras 3 y 4 muestran las respuestas electrocatalíticas cuando estas proteínas se inmovilizan sobre arquitecturas autoensambladas sobre polímeros redox con carga opuesta.Figures 3 and 4 show the answers electrocatalytic when these proteins are immobilized on self-assembled architectures on redox polymers with charge opposite.

La HRP se inmoviliza sobre una interfase electroquímica compuesta por un polímero redox cargado positivamente depositado a su vez sobre una monocapa de carga negativa formada con un mercapto derivado sobre un material de oro (electrodo o coloide): Au/MPS donde MPS es cualquier mercapto derivado portador de un grupo con carga negativa (-COO^{-} ó -SO_{3}^{-}). La adicción de H_{2}O_{2} resulta en una elevada corriente electrocatalítica, figura 3. El anticuerpo antidigoxina y la alcohol oxidasa pueden depositarse sobre la interfase transductora de H_{2}O_{2}, es decir sobre una estructura conteniendo Au / MPS / Polímero redox (+) / HRP modificada negativamente. Igualmente se pueden construir estructuras similares a partir de un mercapto derivado portador de carga positiva y autoensamblando polímeros redox de carga negativa y enzimas de carga positiva. La configuración con la AOX positiva resulta en corrientes electrocatalíticas tras la adicción de etanol, figura 4. Estas configuraciones pueden ser igualmente aplicadas a sistemas de inmunodetección tras la deposición de los anticuerpos cargados positivamente sobre la peroxidasa negativa. Se pueden realizar entonces cualquier tipo de inmunoensayo en los que el inmunoconjugado va marcado con glucosa
oxidasa.The HRP is immobilized on an electrochemical interface composed of a positively charged redox polymer deposited in turn on a negatively charged monolayer formed with a mercapto derived on a gold material (electrode or colloid): Au / MPS where MPS is any mercapto derived bearer of a group with a negative charge (-COO - or -SO 3 -). The addiction of H 2 O 2 results in a high electrocatalytic current, Figure 3. The antidigoxin antibody and alcohol oxidase can be deposited on the transducer interface of H 2 O 2, that is to say on a structure containing Au / MPS / Redox Polymer (+) / HRP negatively modified. Similarly, similar structures can be constructed from a positively charged mercapto derivative and self-assembling negative charge redox polymers and positively charged enzymes. The configuration with the positive AOX results in electrocatalytic currents after ethanol addiction, Figure 4. These configurations can also be applied to immunodetection systems after the deposition of positively charged antibodies on the negative peroxidase. Any type of immunoassay can then be performed in which the immunoconjugate is labeled with glucose.
oxidase

La versatilidad que proporciona la modificación "a la carta" permite la construcción de arquitecturas supramoleculares con deposición de tantas capas como se requieran y cuya composición puede ser determinada según las necesidades analíticas de cada aplicación. Como ejemplo se demuestra un sensor para detectar alcohol cuya respuesta aumenta linealmente con el número de capas de AOX(+), Figura 5.The versatility that modification provides "a la carte" allows the construction of architectures supramolecular with deposition of as many layers as required and whose composition can be determined according to the needs Analytics of each application. An example demonstrates a sensor to detect alcohol whose response increases linearly with the number of AOX layers (+), Figure 5.

Adicionalmente las proteínas modificadas presentan otras ventajas. En el caso de oxidorreductasas la modificación de la carga neta favorece la interacción con el polímero o mediadores redox. Así, cuando una oxidorredutasa como es el caso de la HRP es modificada confiriéndola carga negativa la constante de transferencia con un mediador redox cargado positivamente aumenta más de un orden de magnitud, como lo demuestra la Figura 6. Asimismo una mayor transferencia de electrones directa entre el centro redox y la superficie del electrodo es también observada cuando esta proteína modificada es adsorbida sobre electrodos de grafito, pudiendo ser debido a una diferente conformación de la proteína que deja su centro redox más expuesto.Additionally modified proteins They have other advantages. In the case of oxidoreductases the modification of the net charge favors interaction with the polymer or redox mediators. Thus, when an oxidoredutase as is the case of the HRP is modified by giving it a negative charge the transfer constant with a redox mediator loaded positively increases more than one order of magnitude, as demonstrates Figure 6. Also a greater transfer of direct electrons between the redox center and the surface of the electrode is also observed when this modified protein is adsorbed on graphite electrodes, and may be due to a different conformation of the protein that leaves its redox center more exposed.

Para que todas estas mejoras se produzcan es necesario que el cambio en el pI de las proteínas sea significativo, de al menos dos unidades de pH, es decir que se incorporen un número suficiente de grupos sulfónicos o aminas cuaternarias como para que el cambio de carga neta permita una inmovilización estable o una mayor transferencia de electrones. Para aumentar la estabilidad en la aplicación es recomendable aumentar lo máximo posible el cambio en el pI (siempre preservando la actividad de la proteína) dado que la fuerzas electrostáticas serán mayores asi como la interacción proteína-mediador y proteína-electrodo.For all these improvements to occur is it is necessary that the change in protein pI be significant, of at least two pH units, that is to say incorporate a sufficient number of sulfonic groups or amines quaternary so that the change in net charge allows a stable immobilization or greater electron transfer. To increase application stability it is recommended increase as much as possible the change in pI (always preserving protein activity) since electrostatic forces they will be older as well as the interaction protein mediator and protein-electrode

Por otra parte mediante el control del pH, del disolvente orgánico, de la fuerza fónica y de la temperatura es posible modular la modificación de la proteína, siendo posible la incorporación selectiva de cadenas alquílicas en la proteína que permiten su inmovilización en capas bilipídicas. Preferentemente la modificación se ha de realizar con 1-bromotridecano, 1-bromotetradecano o 1-bromoundecano que permiten mediante un presión y temperatura controlada su incorporación a estas membranas artificiales. Resulta imprescindible que exista una modificación adecuada de tal manera que la hidrofilicidad quede compensada así como una disposición orientada de la modificación (opuesta al centro activo o a la zona de reconocimiento o de afinidad). Mediante la obtención de la isoterma de Langmuir-Blodgett se caracteriza la proteína modificada permitiendo la obtención de parámetros característicos como la presión crítica (momento cuando la monocapa colapsa), el área media molecular, el potencial superficial o calcular los ciclos de histéresis. Una vez caracterizado se forma la monocapa a una presión menor a la de colapsamiento transfiriendo la monocapa al electrodo de oro. También es posible la formación de estas bicapas mediante la fusión de vesículas en la superficie del electrodo.On the other hand by controlling the pH of organic solvent, phonic strength and temperature is it is possible to modulate the modification of the protein, being possible the selective incorporation of alkyl chains in the protein that allow its immobilization in bilipid layers. Preferably the modification must be done with 1-bromotridecan, 1-bromotetradecane or 1-bromoundecane that allow through a pressure and temperature controlled its incorporation into these membranes artificial. It is essential that there is a modification adequate so that hydrophilicity is compensated as well as an oriented provision of the modification (opposite to active center or to the zone of recognition or affinity). By obtaining the isotherm of Langmuir-Blodgett is characterized protein modified allowing to obtain characteristic parameters as the critical pressure (when the monolayer collapses), the mean molecular area, surface potential or calculate cycles of hysteresis. Once characterized the monolayer is formed to a pressure lower than collapse transferring the monolayer to gold electrode The formation of these bilayers is also possible by melting vesicles on the electrode surface.

Otra posibilidad contemplada en esta patente es la modificación de proteínas mediante su reacción con compuestos halogenados derivatizados con un grupo hidrofóbico preferentemente anillos aromáticos o tipo éter, mediante esta modificación la proteína presenta una superficie hidrófoba, permitiendo su inmovilización o interacción electroquímica sobre superficies hidrofóbicas o mediadores no solubles respectivamente. La ventaja adicional en estas proteínas con una menor solubilidad estriba en su uso en electrodos de pasta unida o "binder paste" (EP0757246), [Domínguez,E.; Parellada,J.; Narváez,A.; Katakis,I. Patente, EP0757246, 05/02/1997]. Dado que este material resulta altamente hidrofilico, el uso de estas proteínas modificadas evitaría su desorción. Esta última aplicación de biosensores y/o inmunosensores construidos con "binder paste" también puede aplicarse a proteínas cargadas negativamente ya que las mayores interacciones electrostáticas entre la proteína modificada, el mediador redox y el polímero binder aumentarán la estabilidad de dicha configuración. La alta hidrofilicidad del medio permitirá una transferencia de materia favoreciendo las reacciones de afinidad en su interior con anticuerpos y/o receptores modificados mediante el procedimiento descrito anteriormente.Another possibility contemplated in this patent is protein modification by reaction with compounds halogenated derivatized with a hydrophobic group preferably aromatic rings or ether type, by this modification the protein has a hydrophobic surface, allowing its immobilization or electrochemical interaction on surfaces hydrophobic or non-soluble mediators respectively. The advantage additional in these proteins with a lower solubility lies in its use in electrodes of united paste or "binder paste" (EP0757246), [Domínguez, E .; Parellada, J .; Narváez, A .; Katakis, I. Patent, EP0757246, 05/02/1997]. Since this material is highly hydrophilic, the use of these modified proteins I would avoid his desorption. This last application of biosensors and / or Immunosensors built with "binder paste" can also apply to negatively charged proteins since the largest electrostatic interactions between the modified protein, the redox mediator and binder polymer will increase the stability of such configuration. The high hydrophilicity of the medium will allow matter transfer favoring affinity reactions in inside with antibodies and / or receptors modified by procedure described above.

Descripción de los dibujosDescription of the drawings

Figura 1: Esquema de la reacción química para diferentes compuestos halogenados.Figure 1: Scheme of the chemical reaction for different halogenated compounds.

Figura 2: A) Demostración de la variación del pI de la peroxidasa con la modificación química propuesta. B) Actividad catalítica de la peroxidasa modificada.Figure 2: A) Demonstration of the variation in pI of peroxidase with the proposed chemical modification. B) Catalytic activity of modified peroxidase.

Figura 3: Se muestra la respuesta electrocatalítica de la peroxidasa nativa sin modificar (A) y de la peroxidasa modificada (B) cuando el H_{2}O_{2} es añadido a la celda electroquímica En el "inset" se muestra una curva de calibrado para la peroxidasa modificada.Figure 3: The answer is shown electrocatalytic of the unmodified native peroxidase (A) and of the modified peroxidase (B) when H 2 O 2 is added to the electrochemical cell The "inset" shows a curve of Calibrated for modified peroxidase.

Figura 4: Curva de calibrado del sensor para etanol y metanol construido por la deposición secuencial de cinco capas de AOX modificadas con carga positiva e interfaciada con poliestirenosulfonato (PSS).Figure 4: Sensor calibration curve for ethanol and methanol built by the sequential deposition of five AOX layers modified with positive charge and interfaced with polystyrene sulfonate (PSS).

Figura 5: Modificación de la sensibilidad según el número de capas enzimáticas depositadas.Figure 5: Sensitivity modification according to the number of enzyme layers deposited.

Figura 6: Variación de la constante de transferencia de electrones para diferentes mediadores redox con distinta carga positiva e idéntico potencial redox.Figure 6: Variation of the constant of electron transfer for different redox mediators with different positive charge and identical redox potential.

Ejemplos Examples Ejemplo 1Example 1 Modificación de la HRP para conferirle carga neta negativaModification of HRP to confer negative net charge

5 mg de HRP (EC 1.11.1, 7 290 U mg^{-1} sólido tipo VI) son diluidos en 5 ml de agua bidestilada. Posteriormente se añade 0.1 M de Br(CH_{2})_{2}SO_{3}Na y el pH de la disolución se eleva a 9,5 mediante la adición de una disolución de NaOH diluida. La mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente ultrafiltrada por membranas de 10 000 Da. MWCO.5 mg HRP (EC 1.11.1, 7 290 U mg -1 solid type VI) are diluted in 5 ml of double distilled water. Later 0.1 M of Br (CH 2) 2 SO 3 Na is added and the pH of the solution rises to 9.5 by adding a dilute NaOH solution. The mixture is stirred for 2 hours at ambient temperature and subsequently ultrafiltered by membranes of 10,000 Da. MWCO

Ejemplo 2Example 2 Modificación de la AOX para conferirle carga neta positivaAOX modification to confer positive net charge

5 mg de AOX (EC 1.1.3.13, 4 U mg^{-1} sólido de Hansenula sp) son diluidos en 5 ml de agua bidestilada. Posteriormente se añade 0.1 M de Br(CH_{2})_{2}NBr(CH_{3})_{3} y el pH de la disolución se eleva a 9,5 mediante la adición de una disolución de NaOH diluida. La mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente ultrafiltrada por membranas de 100 000 Da. MWCO.5 mg of AOX (EC 1.1.3.13, 4 U mg -1 solid of Hansenula sp ) are diluted in 5 ml of double distilled water. Subsequently, 0.1 M of Br (CH 2) 2 NBr (CH 3) 3 is added and the pH of the solution is raised to 9.5 by the addition of a dilute NaOH solution. The mixture is stirred for 2 hours at room temperature and subsequently ultrafiltered by 100,000 Da membranes. MWCO

Ejemplo 3Example 3 Modificación del anticuerpo para conferirle carga neta positivaModification of the antibody to confer net charge positive

Se prepara en agua bidestilada una dilución 12.5 de la preparación comercial del anticuerpo anti-digoxina. Una concentración 0.1 M de Br(CH_{2})_{2}NBr(CH_{3})_{3} es añadida y el pH de la disolución se eleva a 9,5 mediante la adición de una disolución de NaOH diluida. La mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente ultrafiltrada por membranas de 10 000 Da. MWCO.A 12.5 dilution is prepared in double-distilled water of the commercial preparation of the antibody anti-digoxin A 0.1 M concentration of Br (CH 2) 2 NBr (CH 3) 3 is added and the pH of the solution is raised to 9.5 by the addition of a dilute NaOH solution. The mixture is stirred for 2 hours at room temperature and subsequently ultrafiltered by 10,000 Da membranes. MWCO

Ejemplo 4Example 4 Modificación de la proteína para conferirle mayor hidrofobicidadModification of the protein to confer greater hydrophobicity

5 mg de la proteína HRP son diluidos en 5 ml de agua bidestilada. Posteriormente 0.1 M de Br (CH_{2})_{2}pyr o derivados halogenados conteniendo cadenas alquílicas son añadidos y el pH de la disolución es llevado hasta el pH óptimo de la reacción dependiendo el grado de modificación deseado, mediante la adición de una disolución de NaOH diluida. La mezcla es agitada durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente ultrafiltrada por membranas de 10 000 Da. MWCO.5 mg of the HRP protein is diluted in 5 ml of bidistilled water. Subsequently 0.1 M of Br (CH 2) 2 pyr or halogenated derivatives containing alkyl chains are added and the pH of the solution is brought up to the optimum pH of the reaction depending on the degree of desired modification, by adding a NaOH solution diluted The mixture is stirred for 2 hours at temperature ambient and subsequently ultrafiltered by 10,000 Da membranes. MWCO

Ejemplo 5Example 5 Interfase transductora de H_{2}O_{2} en la cual la peroxidasa modificada es inmovilizada sobre un polímero redox positivoH 2 O 2 transducer interface in which the modified peroxidase is immobilized on a redox polymer positive

Electrodos de oro o coloides de oro son modificados con 3-mercapto-1-propano ácido sulfónico. Posteriormente un polímero redox cargado positivamente es depositado según el procedimiento descrito por [Narvaez,A.; Suarez,G.; Popescu,I.C.; Katakis,I.; Dominguez,E. (2000) Biosens. Bioelectron. 15, 43-52]. Posteriormente los electrodos modificados se sumergen en una disolución 0.1 M tampón fosfato pH 7.0 durante 2 horas, a 4ºC conteniendo 200 \mug.ml^{-1} de peroxidasa cargada negativamente.Gold electrodes or gold colloids are modified with 3-mercapto-1-propane sulfonic acid. Subsequently a positively charged redox polymer is deposited according to the procedure described by [Narvaez, A .; Suarez, G .; Popescu, IC; Katakis, I .; Dominguez, E. (2000) Biosens. Bioelectron 15 , 43-52]. Subsequently, the modified electrodes are immersed in a 0.1 M phosphate buffer solution pH 7.0 for 2 hours, at 4 ° C containing 200 µg.-1 of negatively charged peroxidase.

Ejemplo 6Example 6 Interfase de afinidad y/o transductora de alcohol construida sobre los electrodos del ejemplo 5Affinity interface and / or built-in alcohol transducer on the electrodes of example 5

Una vez construida la interfase transductora de H_{2}O_{2}, los electrodos modificados se sumergen en una disolución conteniendo los anticuerpos modificados o la enzima AOX ambos modificados positivamente. En el caso de los anticuerpos los electrodos se incuban durante 30 min a 4ºC, mientras que en el caso de la enzima se incuban durante 2 horas, a 4ºC en una disolución conteniendo 1 mg mL^{-1} de AOX cargada positivamente.Once the transducer interface of H2O2, the modified electrodes are immersed in a solution containing the modified antibodies or the AOX enzyme both positively modified. In the case of antibodies the electrodes are incubated for 30 min at 4 ° C, while in the case of the enzyme are incubated for 2 hours, at 4 ° C in a solution containing 1 mg mL -1 of positively charged AOX.

Ejemplo 7Example 7 Manipulación de la sensibilidad del biosensor por la deposición de múltiples capas alternas de una misma proteína modificada con carga opuestaManipulation of biosensor sensitivity due to deposition of multiple alternating layers of the same modified protein with opposite load

Sobre la interfase transductora de H_{2}O_{2} se deposita una capa de AOX cargada positivamente mediante la inmersión de los electrodos durante 2 horas a 4ºC en una disolución conteniendo 1 mg mL^{-1} de proteína, tras el lavado con tampón fosfato pH 7.0, los electrodos se vuelven a sumergir por otras 2 h a 4ºC en una disolución que contiene 1 mg mL^{-1} de AOX cargada negativamente y así sucesivamente.About the transducer interface of H 2 O 2 a positively charged AOX layer is deposited by immersing the electrodes for 2 hours at 4 ° C in a solution containing 1 mg mL -1 protein, after washing with pH 7.0 phosphate buffer, the electrodes are returned to immerse for another 2 h at 4 ° C in a solution containing 1 mg mL -1 of negatively charged AOX and so on.

Ejemplo 8Example 8 Fabricación de electrodos estables en pasta de unión o "binder paste" mediante la utilización de proteínas modificadasManufacture of stable electrodes in union paste or "binder" paste "by using modified proteins

25 mg de grafito son mezclados con 1 mg de proteína modificada y 5 mg de polímero binder, se añaden 40 \muL de agua bidestilada, se mezcla bien la pasta, se deja secar parcialmente y se empaqueta en electrodos que poseen un diámetro de 0.85 mm.25 mg of graphite are mixed with 1 mg of modified protein and 5 mg of binder polymer, 40 µL are added of double-distilled water, the paste is mixed well, allowed to dry partially and is packed in electrodes that have a diameter of 0.85 mm

Claims

1. Procedimiento de modificación de proteínas que resulta en la transformación de sus propiedades físico-químicas y caracterizado por una sustitución nucleofílica mediante el tratamiento con un derivado halogenado (X-R), -siendo R un grupo polar y/o con carga y/o derivado alifático y/o derivado aromático o heterociclo-.1. Protein modification procedure that results in the transformation of its physicochemical properties and characterized by a nucleophilic substitution by treatment with a halogenated derivative (XR), where R is a polar group and / or with charge and / or derivative aliphatic and / or aromatic derivative or heterocycle-.

2. Procedimiento de modificación de proteínas, según la reivindicación 1, caracterizado porque, en el derivado halogenado (X-R), R puede ser un grupo sulfónico o amonio cuaternario cuya carga es independiente del pH del medio o R puede ser un grupo alifático y/o derivado aromático o heterociclo con diferente hidrofobicidad.2. Method of protein modification according to claim 1, characterized in that, in the halogenated derivative (XR), R can be a sulfonic or quaternary ammonium group whose charge is independent of the pH of the medium or R can be an aliphatic group and / or aromatic derivative or heterocycle with different hydrophobicity.

3. Procedimiento de modificación de proteínas, según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque con derivados halogenados conteniendo grupos sulfónicos o amonios cuaternarios es posible modular la carga neta resultando una proteína con un pI modificado o porque con derivados alifáticos y/o derivados aromáticos o heterociclos es posible modular la hidrofobicidad resultando una proteína con una hidrofobicidad modificada.3. Method of protein modification according to claims 1 and 2, characterized in that with halogenated derivatives containing sulphonic groups or quaternary ammoniums it is possible to modulate the net charge resulting in a protein with a modified pI or because with aliphatic derivatives and / or aromatic derivatives or Heterocycles can be modulated hydrophobicity resulting in a protein with a modified hydrophobicity.

4. Procedimiento de inmovilización de proteínas en el que la proteína que se inmoviliza ha sido modificada mediante el procedimiento descrito en las reivindicaciones 1, 2 y 3, y porque el procedimiento de inmovilización se basa en la obtención de estructuras supramoleculares a través de interacciones electrostáticas y que resulten en dispositivos con fines analíticos y/o sintéticos.4. Protein immobilization procedure in which the protein that is immobilized has been modified by the procedure described in claims 1, 2 and 3, and because the immobilization procedure is based on obtaining of supramolecular structures through interactions electrostatic and resulting in devices for analytical purposes and / or synthetic.

5. Procedimiento de inmovilización de proteínas en el que la proteína que se inmoviliza ha sido modificada mediante el procedimiento descrito en las reivindicaciones 1, 2 y 3, y porque el procedimiento de inmovilización se basa en la formación de bicapas a través de técnicas de Langmuir-Blodgett o por fusión de vesículas.5. Protein immobilization procedure in which the protein that is immobilized has been modified by the procedure described in claims 1, 2 and 3, and because the immobilization procedure is based on training of bilayers through Langmuir-Blodgett techniques or by fusion of vesicles.

6. Utilización del procedimiento de modificación de proteínas según las reivindicaciones 1-3, en los procesos de inmovilización de las mismas.6. Use of the modification procedure of proteins according to claims 1-3, in the immobilization processes thereof.