ES2239545A1 - Elisa competitivo para la deteccion de gluten hidrolizado y sus aplicaciones. - Google Patents
Elisa competitivo para la deteccion de gluten hidrolizado y sus aplicaciones.Info
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Abstract
ELISA competitivo para la detección de gluten hidrolizado y sus aplicaciones. La presente invención consiste en un kit de ELISA competitivo para identificar gluten hidrolizado en alimentos y materias primas, y su uso. La ventaja que presenta este kit sobre otros es la de permitir la identificación de gluten hidrolizado.
Description
ELISA competitivo para la detección de gluten
hidrolizado y sus aplicaciones.
Esta invención se relaciona, en general, con el
análisis de alimentos para enfermos celiacos, y, en particular, se
refiere a un procedimiento para la identificación de gluten
hidrolizado en alimentos y materias primas, y en concreto a un
ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) competitivo, y
a los kits que comprende dicho ELISA.
Se está descubriendo, con el perfeccionamiento de
técnicas diagnósticas y analíticas, que la Enfermedad Celiaca
presenta una prevalencia muy elevada, de alrededor de 1 de cada 160
individuos (Fasano A. European and North American populations should
be screened for coeliac disease. Gut 2003 Feb; 52(2):
168-9). El único tratamiento válido que tiene esta
enfermedad, hasta el momento, es la supresión del gluten en la dieta
del enfermo (Luchtefeld W, Burton MS, Donavon P. The importance of a
gluten-free diet. Nurse Pract. 2003 Jul;
28(7 Pt 1): 47-9); y desde hace años se está
trabajando en el desarrollo de alimentos especiales para celiacos,
en los que esté controlada la ausencia de gluten. Por tanto, es muy
importante el desarrollo que se lleve a cabo en cuanto a técnicas de
detección y cuantificación de gluten, tanto en alimentos ya
preparados como en las materias primas con las que se van a
preparar. El gluten, que forma parte de un grupo de proteínas
denominadas prolaminas, está compuesto por diversas proteínas y se
encuentra en los cereales, siendo el de algunos de ellos tóxico para
los celiacos, como es el caso del trigo (gliadinas), la cebada
(hordeinas) y el centeno (secalinas). Gran parte de los alimentos
para enfermos celiacos han sido sometidos a procesos de hidrólisis
en su elaboración. El gluten se encuentra frecuentemente hidrolizado
en productos tales como siropes, alimentos infantiles, cervezas,
etc, no pudiéndose medir con exactitud usando el sistema
ELISA-R5 tipo Sándwich (Valdes I, Garcia E, Llorente
M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten
determination in foods using a novel sándwich
enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J
Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15 (5): 465-74).
Dado que el ELISA-R5 Sándwich está diseñado para
cuantificar gluten (gliadinas, hordeinas y secalinas) que se
encuentre intacto, podría ser ideal el desarrollo de un sistema de
ELISA-R5 Competitivo que sea capaz de detectar y
cuantificar gluten hidrolizado incluso a nivel de muy pocos
aminoácidos, necesitando simplemente que aparezca un solo epítopo en
los fragmentos. La capacidad de necesitar tan sólo la existencia de
un solo epítopo en los fragmentos hidrolizados seria la gran ventaja
de la utilización de un ELISA-R5 Competitivo.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar nuevos procedimientos y herramientas para la
identificación de gluten en alimentos y materias primas.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que es posible cuantificar, por primera vez, con gran
exactitud prolaminas hidrolizadas, o más preferentemente
parcialmente hidrolizadas, mediante un ELISA Competitivo basado en
el anticuerpo monoclonal R5 utilizado en el ELISA-R5
Sándwich (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative
approach to low-level gluten determination in foods
using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent
assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May; 15
(5): 465-74), y en el uso de un estándar de
gliadinas nativas, hidrolizadas mediante una serie de enzimas
proteólíticas, y, sorprendentemente, gliadinas no hidrolizadas, y
obteniéndose en ambos casos unos valores de recuperación
cuantitativa superiores a los del ELISA-R5 Sándwich
convencional.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye un "equipo" kit de ELISA Competitivo, en adelante
kit de ELISA Competitivo de la presente invención, basado en el
uso de un único anticuerpo monoclonal que reconoce un fragmento de
gluten con uno o más epítopos relacionados con la toxicidad del
gluten en enfermos con enfermedad celiaca, preferentemente el
anticuerpo monoclonal R5 (Osman AA, Uhlig HH, Valdes I, Amin M,
Mendez E, Mothes T. A monoclonal antibody that recognizes a
potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide
epitope in gliadins. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001
Oct;13(10): 1189-93), y un estándar
seleccionado entre el siguiente grupo: a) un estándar elaborado a
partir de un conjunto de gliadinas nativas no hidrolizadas,
preferentemente, el estándar EE "nativo" o b) de un
"pool" de diferentes digestiones realizadas sobre un estándar
elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas,
preferentemente, a partir del EE, con distintas enzimas
proteolíticas, para la detección y cuantificación de prolaminas
(gliadinas, hordeinas y secalinas) parcialmente hidrolizadas
presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que
han sido sometidos a tratamiento proteolítico.
Por ello, otro objeto de la invención lo
constituye el uso del "kit" de ELISA Competitivo de la
presente invención para la identificación y cuantificación de
prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas presentes
como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido
sometidos a tratamiento proteolítico, entre otros, los
pertenecientes al siguiente grupo: siropes, alimentos infantiles
(papillas sin gluten, papillas hidrolizadas, etc) y cervezas.
Lo más importante de dicho desarrollo es que, por
una parte se resuelve el problema que existía hasta entonces para
la correcta detección y cuantificación de gluten hidrolizado en
alimentos que han pasado por procesos proteolíticos, y por otra
parte es que el uso de un estándar de reconocimiento europeo (BE) da
robustez al método, y el que se use en su estado nativo (sin ningún
tipo de tratamiento enzimático) hace el método más reproducible y
preciso.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye un kit de ELISA Competitivo, en adelante kit de ELISA
Competitivo de la presente invención, basado en el uso de un único
anticuerpo monoclonal que reconoce un fragmento de gluten con uno o
más epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos
con enfermedad celiaca, preferentemente el anticuerpo monoclonal R5
(Osman AA, Uhlig HH, Valdes I, Amin M, Mendez E, Mothes T. A
monoclonal antibody that recognizes a potential
coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in
gliadins. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001 Oct;13(10):
1189-93), y un estándar seleccionado entre el
siguiente grupo: a) un estándar elaborado a partir de un conjunto
de gliadinas nativas no hidrolizadas, preferentemente, el estándar
EE "nativo" o b) de un "pool" de diferentes digestiones
realizadas sobre un estándar elaborado a partir de un conjunto de
gliadinas nativas, preferentemente, a partir del EE, con distintas
enzimas proteolíticas, para la detección y cuantificación de
prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) parcialmente
hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias
primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico.
El término "epítopos relacionados con la
toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca" tal
como se utiliza en la presente invención se refiere a los epítopos
pertenecientes al siguiente grupo: QQPFP, LQPFP, QLPYP, QLPTP,
QQSFP, QQTFP, PQPFP, QQPYP, PQPFP (Valdes I, Garcia E, Llorente M,
Mendez E. Innovative approach to low-level gluten
determination in foods using a novel sándwich
enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J
Gastroenterol Hepatol 2003 May;15 (5): 465-74)
y epítopos presentes en el recientemente descrito péptido
33-mer supuestamente tóxico para los enfermos
celiacos (Lu Shan, \Phiyvind Molberg, Isabelle Parrot, Felix
Hausch, Ferda Filiz, Gary M. Gray, Ludvig M. Sollid, Chaitan
Khosla. Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue.
Science 2002 Sep;297: 2275-2279).
Un objeto específico de la presente invención lo
constituye el kit de ELISA Competitivo de la presente invención en
el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal R5 y el
estándar seleccionado es el EE "nativo".
Otro objeto específico de la presente invención
lo constituye el kit de ELISA Competitivo de la presente invención
en el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal R5 y
el estándar seleccionado es un "pool" de diferentes
digestiones realizadas sobre el EE con distintas enzimas
proteolíticas, preferentemente con las enzimas pertenecientes al
siguiente grupo: pepsina, tripsina/pepsina, tripsina y
quimiotripsina.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso del kit de ELISA Competitivo de la presente
invención para la identificación y cuantificación de prolaminas
(gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas presentes como
contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos
a tratamiento proteolítico, entre otros, los pertenecientes al
siguiente grupo: siropes, alimentos infantiles (papillas sin
gluten, papillas hidrolizadas, etc) y cervezas.
En resumen, las ventajas de este nuevo ELISA R5
Competitivo son:
a) La utilización como estándar de gliadinas
completas, preferentemente el Estándar Europeo (en adelante, EE) de
gliadinas "nativo", que está validado por el Prolamin Working
Group, y recomendado para su utilización en ELISAs para la
detección de gluten, se puede conseguir comercialmente y no requiere
una preparación especial. Esta ventaja es la más relevante en el
desarrollo de este ELISA Competitivo dado que puede universalizar
su uso, de manera fiable y reproducible, resolviendo el problema de
la búsqueda de un estándar hidrolizado representativo de todos los
tipos de procesos que pueden sufrir las materias primas desde su
origen hasta que llegan a formar parte de un producto final.
b) También se puede usar como estándar un
"pool" de digeridos enzimáticos del EE en el
ELISA-R5 Competitivo con una eficacia similar a la
del "nativo", con el inconveniente de que la preparación del
"pool" de digeridos es más laboriosa y menos reproducible.
c) La ventaja del ELISA-R5
Competitivo es que permite cuantificar en su totalidad fragmentos
de prolaminas de trigo/cebada/centeno de alto o bajo peso molecular
que contengan uno o más epítopos, en comparación con el
ELISA-R5 Sándwich que está limitado a cuantificar
fragmentos con más de dos epítopos.
d) Dicha ventaja del ELISA-R5
Competitivo basado en el EE "nativo" respecto al
ELISA-R5 Sándwich, se confirma en los altos valores
obtenidos en alimentos que contienen gluten hidrolizado (siropes y
cervezas) en comparación con los resultados obtenidos con el
ELISA-R5 Sándwich que infravaloran la presencia de
gluten, tóxico para los enfermos celiacos, en dichos alimentos
(Figura 3).
Figura 1. SDS-PAGE (Izquierda) y
Western-Blot R5 (derecha) de los resultados del EE
"nativo" (Nat.) de las digestiones del EE de gliadinas, con
Pepsina (P), Tripsina (T), Tripsina+Pepsina (T+P), Quimiotripsina
(QT), y del Pool (preparado a partes iguales,
P:T:T+P:QT:Nativo;1:1:1:1:1).
Figura 2. Curvas utilizando como estándar el EE
"nativo" o el "pool" para la cuantificación de prolaminas
(gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas, en un ELISA
Competitivo basado en el anticuerpo monoclonal R5.
Figura 3. Valores superiores de gliadinas
obtenidos con el ELISA-R5 Competitivo en el
análisis de alimentos que tienen gliadinas hidrolizadas (siropes y
cervezas) respecto al ELISA-R5 Sándwich.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
Para el diseño de un ELISA Competitivo (Crowther
J R (1995) ELISA, theory and practice. Methods in Molecular
Biology, vol 42, pp 35-50. New Jersey: Humana
Press Inc.) que sea capaz de detectar y cuantificar fragmentos
pequeños de prolaminas hidrolizadas presentes en determinados
alimentos como siropes, cervezas, alimentos infantiles, etc,
existen dos problemas que hay que afrontar:
a) El primero de ellos es seleccionar qué tipo de
estándar hidrolizado debería usarse, que sea similar al de las
gliadinas hidrolizadas en los alimentos, para detectar prolaminas
hidrolizadas, y con el que realizar la curva estándar. Por este
motivo hemos diseñado estándares basados en el Estándar de
Referencia Europeo de Gliadinas, a partir de ahora EE, (Ref.:
IRMM-480: Klein C, Franchini F, Schimmel H. Towards
a certified reference material for "Gliadin from European
Wheat": study design and methodological approaches. Proceedins of
the 17^{th} Meeting. Working Group on Prolamin Analysis and
Toxicity 2002 Oct; 113-117) digerido con enzimas
proteolíticas, y un "pool" de estos digeridos, y el propio EE
"nativo".
b) El segundo de ellos es qué anticuerpo usar
para que sea capaz de detectar pequeños fragmentos hidrolizados,
incluso hasta un nivel de pocos aminoácidos (4-5
aa). Hemos seleccionado el anticuerpo monoclonal R5 porque tiene la
ventaja de su gran capacidad de reconocer numerosos epítopos
relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad
celiaca (QQPFP, LQPFP, QLPYP, QLPTP, QQSFP, QQTFP, PQPFP, QQPYP y
PQPFP) (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative
approach to low-level gluten determination in foods
using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent
assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May;15 (5):
465-74), que aparecen muy repetidos en las
prolaminas, y cuya secuencia es muy corta, pudiendo ser el idóneo
para reconocer fragmentos digeridos hasta incluso a nivel de pocos
aminoácidos.
Para comprobar que las digestiones del EE habían
funcionado tal y como se esperaba se llevaron a cabo dos tipos de
análisis, primero se realizó un SDS-PAGE, con el
fin de observar el perfil de bandas que se obtenían en las
distintas digestiones por separado, en un "pool" de dichas
digestiones y en el EE nativo, y si realmente estaba digerido el
material y a qué nivel, y segundo un Western-Blot
R5 (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach
to low-level gluten determination in foods using a
novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay
protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003 May;
15(5): 465-74) para comprobar si los
fragmentos obtenidos eran susceptibles de ser reconocidos por el
anticuerpo R5 con el que posteriormente se iba a desarrollar el
ELISA Competitivo (Figura 1). En ella se puede observar a la
izquierda el patrón de péptidos que presentan las distintas muestras
analizadas mediante un gel SDS-PAGE. En el carril
de la izquierda se ve el patrón que presenta el EE nativo (Nat),
donde se puede observar la zona con bandas más oscuras,
correspondientes a las fracciones de gliadinas, en las columnas
situadas a continuación hacia la derecha se puede apreciar como el
tratamiento enzimático al que se le ha sometido provoca un cambio
en el perfil peptídico de dicho EE, en mayor o menor grado,
quedando demostrado que las distintas digestiones habían actuado
sobre el mismo, degradándolo en mayor o menor medida. Cuando se
completó el estudio realizando un Western Blot con el anticuerpo
monoclonal R5, se observó (a la derecha en la Figura 1) que aún
estando hidrolizados, los péptidos que se generaban presentaban
inmunorreactividad frente a dicho anticuerpo, observándose también
el grado distinto de hidrólisis que obtenido según las enzimas
usadas para ello, todo eso nos empujó a pensar en el anticuerpo
monoclonal R5 como idóneo para el desarrollo de este ELISA
Competitivo.
Se procedió a la realización de un ELISA
Competitivo basado en el anticuerpo monoclonal R5 de cantidades
controladas de cada uno de los estándares preparados. Representadas
las curvas obtenidas con los estándares de las distintas
digestiones, así como el "pool" de digeridos con "nativo",
y el nativo original, se observó, que todas las curvas eran muy
similares y próximas, incluyendo las más digeridas y el
"nativo" sin digerir (Figura 2). Por lo tanto, se puede
concluir que el EE "nativo" puede ser usado perfectamente como
estándar para el desarrollo del ELISA-R5
Competitivo (Figura 2).
Al evaluar el nuevo prototipo de
ELISA-R5 Competitivo se pensó en la posibilidad de
realizar el proceso usando tanto el EE "nativo", como estándar
para la curva del ELISA, como el "pool" de digeridos, con el
fin de dilucidar cuál seria el más apropiado, dado que como se
observa en la Figura 2 dan ambos unas curvas casi solapadas. Hay
que tener en cuenta que la utilización como estándar del EE de
gliadinas "nativo", que está validado por el Prolamin Working
Group, y recomendado para su utilización en ELISAs para la
detección de gluten, se puede conseguir comercialmente y no
requiere una preparación especial, mientras que un estándar de un
"pool" de digeridos enzimáticos del EE presenta el
inconveniente de que la preparación del "pool" de digeridos es
más laboriosa y menos reproducible.
Entonces, con las distintas soluciones de las
muestras de cada digestión y de sus controles nativos se prepararon
unas muestras a concentraciones conocidas de gliadinas (5, 12.5, 25
y 50 partes por millón, teóricas), con el fin de comprobar el
grado de recuperación que se obtenía usando el EE tanto
"nativo" como el "pool" (ver Tabla 1 y 2,
respectivamente). Se obtuvo un rendimiento alto, unos valores muy
elevados de recuperación entre los valores teóricos de las muestras
cuantificadas (en el caso de las digestiones con Pepsina, Tripsina,
y el "pool" de digeridos más nativo), valores que se encuentran
entre el 90.2-96% (Tabla 1), y cuando se evalúan
usando como estándar un pool de digeridos enzimáticos del EE, se
obtienen unos valores cuantitativos, aunque sobrestiman ligeramente
las muestras (Tabla 2).
Además se usó el ELISA-R5
Sándwich con el fin de comprobar el resultado que daban las
muestras nativas y digeridas por cada uno de los dos sistemas. Los
resultados obtenidos en el análisis de estas muestras teóricas
rindieron los porcentajes de recuperación que se muestra en la
Tabla 3.
Estos datos obtenidos con el
ELISA-R5 Competitivo son cuantitativos y contrastan
con los valores de entre el 70-80% de recuperación
obtenidos usando el ELISA-R5 Sándwich (que no
permite cuantificar péptidos con un solo epítopo).
Dichos resultados avalan la validez del método de
cuantificación de prolaminas hidrolizadas, mediante un ELISA
Competitivo en el que se usa como estándar el EE "nativo" y el
anticuerpo monoclonal R5, para el análisis de alimentos (siropes,
alimentos infantiles (papillas hidrolizadas, papillas sin gluten) y
cervezas, entre otros, y materias primas, tales como los almidones
de trigo, que pueden venir contaminados con prolaminas de trigo
(gliadinas) que se encuentren parcialmente hidrolizadas.
Además, se realizó un estudio sobre la
sensibilidad del método y el límite de detección, y se obtuvieron
los siguientes valores:
- \circ
- Sensibilidad del método: 1.22 ng/ml de gliadinas (0.12 mg/100 g, ó 1.2 partes por millón de gliadinas).
- \circ
- Límite de detección teórico: 0.3 ng/ml de gliadinas (0.03 mg/100 g, ó 0.3 partes por millón de gliadinas).
- \circ
- Dilución de trabajo mínima de la muestra: 1:25 (extraída de la siguiente forma 0.250 mg/10 ml de etanol 60%).
Se usaron para el experimento un total de 40
siropes y 25 cervezas diferentes, y fueron extraídas las prolaminas
usando el siguiente procedimiento:
Lo primero fue pesar un total de 250 mg de cada
una de las muestras y llevarlas a un volumen de 10 ml de Etanol
60%. Esto se preparó en tubos de polipropileno de 12 ml, que se
pusieron en un agitador rotatorio durante 1 hora a temperatura
ambiente y a una velocidad de unas 60 rpm, tras la extracción de las
gliadinas con el Etanol 60%, se procedió a centrifugar durante 10
minutos a 3500 rpm las muestras, para recoger posteriormente con el
sobrenadante obtenido. Dicho sobrenadante fue recogido en tubos
limpios de 10 ml, y posteriormente se pasó a analizar las muestras
por ambos sistemas de ELISA, el Competitivo (para prolaminas
hidrolizadas) y el tipo Sándwich (para prolaminas intactas),
observándose las diferencias que se muestran en la Figura 3, donde
se reflejan únicamente alguna de las muestras analizadas. En
cualquier caso los valores de prolaminas contenidas en las muestras
fueron siempre iguales o superiores cuando se analizaban las
muestras por el ELISA Competitivo, siendo más notables las
diferencias en las muestras de cervezas, que presentaban mayor nivel
de hidrólisis.
A continuación se describen los Materiales y
Métodos utilizados para la realización de los ejemplos de la
invención.
Se trata de una mezcla de 30 variedades de trigo
diferentes, representando las diferentes composiciones de gliadinas
que pueda haber entre distintas variedades, con el fin de que se
pueda usar como referencia a nivel europeo. Se trata de un material
que está a disponible a través del Prolamin Working Group (Van
Eckert R. The PWG gliadin, a new reference material. Proceedins of
the 16^{th} Meeting. Working Group on Prolamin Analysis and
Toxicity 2001 Nov; 25-28).
Se pesaron 6 mg de gliadina de estándar europeo
(EE) y se disolvieron en 6 ml de etanol 60% (1 mg/ml). De acuerdo
con el factor 0.86 (corrección según determinación de nitrógeno
por Kjendals) Una vez preparado se procedió a ajustarlo a una
concentración 1 mg/ml reales secando la cantidad de 581.4 \mul y
resuspendiéndolo en 500 µl en cada una de las alícuotas que se
preparan para las digestiones posteriores a las que será sometido.
(Concentración final: 4 g/100g, ó 40.000 partes por millón (ppm) de
gliadinas).
Para tratar de encontrar el estándar adecuado se
realizaron primero unas cinéticas de digestiones del EE de
gliadinas con las siguientes enzimas:
- \circ
- Digestión con Pepsina (P). Se prepara a una concentración de 1 mg de pepsina/ml de ácido fórmico 1% (pH 2.5). Se incuba a una relación enzima:Estándar Europeo de 1:200, a Temperatura ambiente (26°C) durante 18 horas.
- \circ
- Digestión con Tripsina (T). Se prepara a una concentración de 2 mg de tripsina/ml de bicarbonato amónico 50 mM (pH 8.5). Se incuba a una relación enzima:Estándar Europeo de 1:100, a Temperatura ambiente (26°C) durante 18 horas.
- \circ
- Tripsina seguido de Pepsina (T/P), combinando de forma sucesiva las condiciones mencionadas en los puntos anteriores.
- \circ
- Digestión con Quimiotripsina (QT). Se prepara a una concentración de 2 mg de tripsina/ml de bicarbonato amónico 50 mM (pH 8.5). Se incuba a una relación enzima:Estándar Europeo de 1:100, a Temperatura ambiente (26°C) durante 18 horas.
Se añadieron 2.5 \mul de enzima sobre todas las
alícuotas, con sus soluciones correspondientes de EE (1 mg/ml)
volumen final 500 \mul Los reactivos (ácido fórmico, bicarbonato
amónico) se eliminaron de las muestras por medio de
liofilización.
Una vez realizadas todas las digestiones
"overnight" 18h del estándar de referencia europeo de
gliadinas, se realizó un "pool", mezclando todos los digeridos
y el EE nativo tal como se indica a continuación:
Se tomaron volúmenes iguales de cada una de las
digestiones llevadas a cabo sobre el EE de gliadinas, y además se
añadió una parte más de EE nativo (P+T+T/P+QT+Nativo), quedando en
la relación 1:1:1:1:1.
Se prepararon a concentraciones teóricas
conocidas de gliadinas (5, 12.5, 25 y 50 partes por millón,
teóricas) todos los digeridos y nativos, con el fin de analizarlos
por los dos sistemas en paralelo, el Competitivo nuevo y el Sándwich
tradicional. Además se usó el ELISA-R5 Sándwich con
el fin de comprobar el resultado que daban las muestras nativas y
digeridas por cada uno de los dos sistemas.
Para la muestra de 50 ppm se diluye la solución
de etanólica del EE a 1 mg/ml (real, 40.000 ppm) con etanol 60%,
hay que realizar una dilución 1:800 de la solución de partida. Se
preparan las de 25 y 12.5 en diluciones seriadas a Y2 en etanol
60%, y la de 5 ppm 1/2.5 con respecto a la de 12.5.
1. - Tapizado de la placa ELISA
Finalmente se llegó a la conclusión de que la
mejor concentración para el tapizado de la placa de ELISA era de
0.125 \mug gliadinas EE/ mL
- A.
- Se prepara la solución de recubrimiento a partir de la solución de EE (a 1mg/ml), haciendo una dilución 1:8000 en tampón de recubrimiento.
- B.
- Se echan 100 \muL de la solución de recubrimiento/pocillo, 12.5ng de gliadinas EE/100 \mul.
- C.
- Se incuba a 4°C durante toda la noche.
2. - Lavado de la placa (3 veces con solución de
lavado, PBS + Tween20 0.5%).
3. - Bloqueo de la placa: PBS + Tween20 (0.5%) +
2% BSA (albúmina de suero bovino) \rightarrow Solución de Bloqueo
(SB).
- A.
- Se añaden 280 \mul de SB/pocillo en la placa de ELISA.
- B.
- Se incuba en estufa, a 37°C, durante 1 hora.
4. - Preparación de las muestras y la curva
estándar de gliadinas.
Una vez establecida la concentración del
tapizado, se ajustaron las concentraciones de partida de los
distintos digeridos para realizar la curva estándar usando un total
de 8 puntos de estándares. Quedando de la siguiente forma los
distintos estándares: S_{1} 2.5 \mug/ml a S_{8} 0.152
ng/ml.
- a)
- Para el primer punto de la curva estándar (S1) (2.5 \mug gliadina/ml) se diluye la solución de gliadina del EE a 1:400 en PBS + Tween20 (0.5%) + 1% BSA, (SD).
- b)
- El resto de los puntos de la curva estándar (8 en total), se obtienen a partir de la primera solución (S1) por dilución seriada con factor 1/4. Como sigue:
S1 | [2.5 \mug/ml] |
S2 = 0,1 ml S1 + 0,3 ml SD | [0.625 \mug/ml] |
S3 = 0,1 ml S2 + 0,3 ml SD | [0.156 mug/ml] |
S4 = 0,1 ml S3 + 0,3 ml SD | [0.039 \mug/ml] |
S5 = 0,1 ml S4 + 0,3 ml SD | [0.0097 \mug/ml] |
S6 = 0,1 ml S5 + 0,3 ml SD | [0.0024 \mug/ml] |
S7 = 0,1 ml S6 + 0,3 ml SD | [0.00061 \mug/ml] |
S8 = 0.1 ml S7 + 0.3 ml SD | [0.000152 \mug/m |
Las muestras se analizan a diluciones a partir de
1:25 en SD. Las diluciones siempre se preparan el doble de
concentradas de la que finalmente se desea analizar*. Dilución 1:25
y 1:50, si son necesarias diluciones más elevadas pueden prepararse
a partir de estas anteriores por dilución 1:2.
*Nota: Al calcular la concentración de
gliadinas en las muestras debe tenerse en cuenta que estas antes de
aplicarse a la placa de ELISA se preincuban con el conjugado,
mezclándolos 1:1 (v/v) de modo que en el ensayo las muestras quedan
diluidas al doble que la dilución preparada inicialmente.
5. - Preparación del anticuerpo R5 conjugado:
Como conjugado se utiliza el anticuerpo
monoclonal R5 conjugado con peroxidasa diluido 1:166667. La
dilución del anticuerpo conjugado se prepara justo antes de la
preincubación con las muestras.
6. - Preincubación de las muestras y la curva
estándar con el conjugado.
Las muestras y el anticuerpo conjugado ya
diluidos se mezclan v/v para preincubarlos antes de aplicarlos en
la placa de ELISA.
Se mezclan 0.3 ml de las muestras diluidas y los
estándares con 0.3 ml del anticuerpo conjugado diluido 1:166667. Se
incuba a temperatura ambiente agitando constantemente en el
agitador orbital a la mínima velocidad.
Las concentraciones finales de los estándares
quedan así:
C_{1} | (1.25 \mug/ml) |
C_{2} | (0.31 \mug/ml) |
C_{3} | (0.078 \mug/ml) |
C_{4} | (0.019 \mug/ml) |
C_{5} | (0.00488 \mug/ml) |
C_{6} | (0.00122 \mug/ml) |
C_{7} | (0.0003 \mug/ml) |
C_{8} | (0.000076 \mug/ml) |
La dilución del conjugado queda en 1:333334
7. - Aplicación de las muestras y la curva
estándar en la placa.
Se aplican por duplicado en la placa de ELISA 100
µl de cada mezcla preincubada y se incuba 1 hora a temperatura
ambiente en cámara húmeda y en oscuridad.
8. - Se lava la placa 6 veces con solución de
lavado.
9. - Aplicación de la solución sustrato
(TMB-plus).
Se añaden 100 \mul de la solución sustrato con
TMB-plus en cada pocillo de la placa de ELISA. Se
incuba durante 13 - 15 minutos a temperatura ambiente y en
oscuridad.
10. - Parada de la reacción.
La reacción se para echando 50 \mul/pocillo de
solución de parada (H_{2}SO_{4} 2.5 M).
11. - Lectura.
Se lee la absorbancia en un lector de placas
ELISA a 450 nm.
Claims (5)
1. Kit de ELISA Competitivo para la detección y
cuantificación de prolaminas hidrolizadas caracterizado
porque está, al menos, constituido por único anticuerpo monoclonal
que reconoce un fragmento de gluten con uno o más epítopos
relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad
celiaca, preferentemente, el anticuerpo monoclonal R5 y por un
estándar seleccionado entre el siguiente grupo:
- a)
- un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas completas no hidrolizadas, preferentemente, el estándar EE "nativo", o
- b)
- un estándar consistente en un "pool" de diferentes digestiones realizadas sobre el EE con distintas enzimas proteolíticas.
2. Kit ELISA Competitivo según la reivindicación
1 caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es el
anticuerpo monoclonal R5 y el estándar elaborado a partir de un
conjunto de gliadinas completas no hidrolizadas es el EE
"nativo".
3. Kit ELISA Competitivo según la reivindicación
1 caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es el
anticuerpo monoclonal R5 y el estándar es un estándar consistente
en un "pool" de diferentes digestiones realizadas sobre el EE
con distintas enzimas proteolíticas, preferentemente con las
enzimas: pepsina, tripsina/pepsina, tripsina y quimiotripsina.
4. Uso del Kit ELISA Competitivo según las
reivindicaciones 1 a la 3 para la identificación y cuantificación de
prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas presentes
como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido
sometidos a tratamiento proteolítico.
5. Uso del ELISA Competitivo según la
reivindicación 4 caracterizado porque los alimentos
pertenecen al siguiente grupo: siropes, alimentos infantiles
(papillas hidrolizadas, papillas sin gluten) y cervezas.
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WO2002092633A1 (es) * | 2001-05-14 | 2002-11-21 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Procedimiento para la extracción de gluten en alimentos, procesados y no procesados por calor, compatible con elisa, composición y kits que comprenden dicha composición |
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- 2004-03-15 ES ES200400636A patent/ES2239545B1/es not_active Expired - Fee Related
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2005
- 2005-03-11 WO PCT/ES2005/070025 patent/WO2006051145A1/es active Application Filing
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WO2002092633A1 (es) * | 2001-05-14 | 2002-11-21 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Procedimiento para la extracción de gluten en alimentos, procesados y no procesados por calor, compatible con elisa, composición y kits que comprenden dicha composición |
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ELENA BAZZIGALUPPI et al. Comparison of Tissue Traniglutaminase- Specific Antibody Assay with Established Antibody Measurements for Coeliac Disea. Journal Autoinmunity, 1999, 12, paginas 51-56. * |
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