ES2436861B2 - Aptámeros específicos contra el gluten y método de detección del gluten asociado - Google Patents

Abstract

Aptámeros específicos contra el gluten y método de detección del gluten asociado.#La presente invención se refiere a unas moléculas de ADN de cadena sencilla, también denominadas aptámeros, capaces de reconocer y unirse específicamente al gluten, a un método de reconocimiento, captura y/o detección de gluten que emplea dichos aptámeros y a un kit que comprende dichos aptámeros.

Description

APTÁMEROS ESPECíFICOS CONTRA EL GLUTEN Y MÉTODO DE DETECCiÓN DEL GLUTEN ASOCIADO

DESCRIPCiÓN

La presenle invención se refiere a unas moléculas de ADN de cadena sencilla, también denominadas aptámeros, capaces de reconocer y unirse específicamente al glulen, y a un mélodo de reconocimienlo, caplura ylo delección de glulen que emplea dichos aptámeros. Por tanto, la invención se pOdría encuadrar en el campo de la biolecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La enfermedad celiaca es una enfermedad autoinmune de origen genético, que se caracleriza por un proceso inflamalorio permanenle del inleslino delgado inducido por la ingeslión de las proteínas de almacenamiento (glulen) del trigo (todas las especies denominadas Triticum como el trigo duro, espelta y kamut), la cebada, el centeno, sus variedades híbridas y probablemente la avena. Según los datos actuales esta enfermedad tiene una prevalencia de aproximadamente el 1 por 100 de la población (SK Lee et al. 2006 Curr Opin Rheumatol18, 101-107). La única terapía efectiva conocida se basa en seguir una díeta exenla de gluten de por vida, lo cual resulta complejo y costoso dado el uso masivo de estos cereales en la alimentación actual. Aunque la relación causal entre la ¡ngesta de gluten y la enfermedad celiaca esta perfectamente eSlablecida, no esla definida la relación enlre la cantidad de glulen ingerida y la gravedad de las manifestaciones clínicas. La variación individual asi como la heterogeneidad clínica de los pacientes supone un problema para establecer valores umbral que permitan la protección de todos los individuos susceptibles, ya que incluso trazas de alimentos conlaminados con gluten pueden ser perjudiciales para algunos celíacos.

Para satisfacer las necesidades de este sector de la población, la industria alimentaria ha desarrollado una gama de productos con limitadas cantidades de gluten, ya que su supresión total en cereales que lo contienen naturalmente es

técnicamente difícil y costosa. Además, existen otros productos que, aunque no contienen gluten de forma natural, pueden resultar contaminados durante su recolección, almacenamiento, procesamiento ylo transporte. La Unión Europea ha homogeneizado las normas sobre la composición y etiquetado de productos

alimenticios destinados a este colectivo, basándose en las más recientes directrices de la Comisión del Codex Alimentarius (Codex Alimentarius ALlNORM 08/31/REP, Appendix VII, p 107), que indican un umbral de 20 ppm para

alimentos denominados "exentos de gluten", con el fin de que encuentren

alimentos adaptados a sus necesidades y nivel de sensibilidad.

Este valor es un compromiso entre la detectabilidad que alcanzan los métodos

analíticos actuales basados en ensayos de afinidad con anticuerpos marcados con enzimas y la capacidad tecnológica para reducir la contaminación sin

aumentar los costes económicos y medioambientales. Desafortunadamente, este

valor no es suficientemente seguro para muchos enfermos celiacos. En 1999, la

Federación de Asociaciones de Celiacos de España (FACE) creó la marca de garantía "Controlado por FACE" para aquellos productos que garanticen un valor máximo de 10 ppm, valor muy próximo a los limites de detección de los métodos actuales.

Los métodos de análisis del gluten se basan en la detección directa de la proteína

alergénica. El gluten está formado por cientos de proteínas caracterizadas por su

alto contenido en prolina y glutamina y bajos contenidos en aminoácidos con cadenas laterales cargadas. Tradicionalmente se subdivide en dos grandes fracciones según su solubilidad en alcohol:agua (60%): las solubles prolaminas

(gliadina en trigo, hordeína en cebada, secalina en centeno, avenina en avena) y las insolubles gluteninas. Se han identificado diversos fragmentos tóxicos o inmunogénicos en las prolaminas que son resistentes a la digestión por proteasas

humanas (R. Ciccocioppo et al. 2005 Clin Exp Immunol 140, 408-416), aunque estudios recientes apuntan a que las gluteninas también son tóxicas (OH Dewar et al. 2006 Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 18, 483-491). Shan et al. identificaron un péptido de 33 aminoacidos en la a-2-gliadina (L. Shan et al. 2002 Science 297, 2275-2279) que resultó ser inmunodominante (L.Shan et al. 2005 J Proteome Res 4, 1732-1741). Hoy en día, los métodos estándar para la detección de gluten se basan en ensayos tipo ELlSA, empleando diferentes anticuerpos que reconocen diferentes epítopos de las prolaminas. Sin embargo, los resultados obtenidos dependen fuertemente del anticuerpo así como del material de referencia empleado (R. van Eckert et al. 2010 J. Cereal Sci. 51 , 198-204). El anticuerpo denominado MAb 401 .21 desarrollado en 1990 por Skerrit (J.H. Skerritt et al. 1990

J. Agric. Food Chem. 38, 1771-1778) Y descrito en la patente australiana AU572955, se comercializa en un ensayo tipo sandwich aprobado por la AOAC International ("the scientific associafion dedicated to ana/ytica/ exce/ence®", (J.H. Skerritt et al. 1991 J. AOAC 74, 257-264) descrito en las solicitudes de patente GB2207921 , CA1294903 y AU1891788, aunque no es capaz de cuantificar hordeínas (detecta s610 un 4-5%), subestima el trigo duro y sobreestima el triticale y las secalinas (T. Thompson et al. 2008 J. Am. Diel. Assoc. 108, 1682-1687).

Tampoco detecta gluten parcialmente hidrolizado debido al formato tipo sándwich.

Estudios recientes muestran que también reacciona contra gluteninas (R . van Eckert et al. 2010 J. Cereal Sci. 51 , 198-204). Posteriormente se ha desarrollado

el anticuerpo denominado R5, que reconoce el epítopo potenCialmente tóxico

QQPFP y otras secuencias similares presentes en las prolaminas, incluído el 33mer (L. Sorell et al. Febs Lett 439, 46-50; 1. Valdes et al. 2003 Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 15, 465-474). El ensayo sándwich con el R5 ha sido designado como método tipo I por el Comité de métodos de analisis y muestreo del Codex Alimentarius (Codex Alimentarius ALlNORM 06/29/23, Appendix 11, p.

40) Y permite la detección de gluten en muestras naturales o procesadas con

calor, previa extracción con una disolución que contiene reductores para eliminar

los puentes disulfuro intercatenarios que se forman tras el calentamiento (E.

Garcia et al. 2005 Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 17, 529-539) descrita en la patente española con número de publicación ES2182698 y familia de patentes (EP1424345, US7585529). Sin embargo, este método no sirve para medir las prolaminas hidrolizadas. Se han desarrollado otros anticuerpos como el PN3 (H.J. Ellis et al. 1998 Gut 43, 190-195), el CDC5 (H.M. Nassef et al. 2008 Anal. Chem.

80,9265-9271) Y el G12 (B. Moron et al. 2008 Am. J. CI;n. Nutr. 87405-414; B. Moron et al. 2008 Plos One 3) contra los epitopos tóxicos o immunogénicos comprendidos entre los aminoácidos 31-49, 56-75 Y 57-89 de la u-gliadina,

respectivamente.

Con el fin de detectar el gluten hidrolizado, se han propuesto ensayos

competitivos, que requieren un único epítopo, y que han sido comercializados

usando los anticuerpos R5 descritos en la patente española con número de publicación ES2304874 (ver también W02008110655) y G12. Sin embargo, estos métodos no son compatibles con el procedimiento de extracción anteriormente citado debido a que desnaturalizan los anticuerpos y marcadores enzimáticos

durante la inevitable incubación entre la muestra y el único anticuerpo de detección usado.

Los aptámeros son un tipo de receptor molecular no proteico, son estables

térmica y químicamente en condiciones extremas y, por tanto, constituyen una

alternativa prometedora respecto a los anticuerpos. Los aptámeros son

oligonucleótidos que se seleccionan in vitro mediante un método combinatorio

denominado SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) y se caracterizan por presentar una gran afinidad y especificidad hacia un ligando determinado (A.D. Ellington et al. 1990 Nature 346, 818-822; C. Tuer1< et al. 1990 Science 249, 505-510). La presencia del ligando puede inducir

un cambio conformacional en el oligonucleótido que permite el reconocimiento molecular. Una vez conocida la secuencia del oligonucleótido, su síntesis es

quimica (no requiere el uso de animales), muy reproducible y barata.

El procedimiento SELEX consiste en encontrar la secuencia de mayor afinidad por

un ligando en las condiciones experimentales deseadas entre la mayor cantidad posible de hebras diferentes (-1013 _10" ) mediante un sistema iterativo de puesta en contacto entre las hebras de ácido nucleico y el ligando, separación de las hebras con afinidad por el ligando y amplificación por PCR de las mismas. La selección de aptámeros contra proteínas se suele realizar empleando como diana

la proteína completa. Sin embargo, la obtención de aptámeros contra epítopos

específicos de proteínas es también posible siguiendo varias estrategias (AV.

Kulbachinsky et al. 2007 Biochemistry-Moscow 72, 1505-1518). Una de ellas

consiste en emplear la secuencia peptídica específica, mucho más corta que la

proteina completa. Se ha demostrado que los aptámeros asi obtenidos son capaces de reconocer el péptido dentro de la proteina completa (D. Proske et al. 2002 Chembiochem 3, 717-725), aunque en algunos casos con menor afinidad

(w. Xu et al. 1996 Proc. Na!1. Acad. Sci. USA 93, 7475-7480).

Aunque a priori podria pensarse que la selección de aptámeros es posible para cualquier ligando, hay una serie de prerrequisitos para tener altas probabilidades

de encontrar un aptámero de alta afinidad y especificidad. Ugandos con grupos cargados positivamente, capaces de formar puentes de hidrógeno o estructuras aromáticas planas, son más favorables que los que tienen grupos cargados

negativamente y, especialmente, que los que tienen una fuerte naturaleza hidrof6bica (R. Stoltenburg et al. 2007 Biomolecular Engineering 24, 381-403). Aunque el reconocimiento del ARN/AON de estructuras hidrofóbicas es conocido, es bastante raro (BA Gilbert et al. 1997 Bioorgan Med Chem 5, 1115-1122). La

estrategia para facilitar la interacción de ácidos nucleicos con moléculas

hidrof6bicas podria ser el uso de nucleótidos modificados con grupos que le confieran hidrofobicidad, compatibles con las enzimas de amplificación (S.O. Jayasena 1999 Clin. Chem. 45, 1628-1650). Por tanto, no es evidente que la selección de aptámeros contra ligandos muy hidrofóbicos, como el péptido 33-mer

empleado en esta invención, usando nucle6tidos no modificados con grupos hidrofóbicos, dé lugar a secuencias consenso de alta afinidad.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere en un primer aspecto a una molécula de ADN de cadena sencilla caracterizada por que dicha molécula reconoce y se une

específicamente al gluten.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la detección de gluten caracterizado por que comprende una molécula de ADN de cadena

sencilla del primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un uso de la molécula de

ADN de cadena sencilla del primer aspecto de la invención o del kit del segundo aspecto de la invención, para la detección del gluten.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método de detección

del gluten basado en la molécula de ADN de cadena sencilla del primer aspecto de la invención.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

La presente invención supone una solución a la necesidad de detectar la presencia de gluten en muestras de productos alimentarios o de otro tipo que puedan provocar intolerancia en individuos celiacos,

Los inventores de la presente invención han demostrado la utilidad de unas secuencias de ADN de cadena sencilla, también llamados aptámeros, capaces de unir específicamente gluten, para la separación y/o detección de esta proteína.

Una ventaja de la presente invención es que los aptámeros son moléculas que

pueden ser modificadas fácilmente para unirlas a moléculas marcadoras, a

diferencia de los anticuerpos, y por tanto presentan una alta versatilidad a la hora

de su detección. Además, los aptámeros son moléculas altamente estables, lo cual supone una gran ventaja a la hora de desarrollar ensayos in vitro para la

detección del gluten. Es importante resaltar que los aptámeros son también

mucho más baratos y fáciles de sintetizar que los anticuerpos, que son las

moléculas usadas actualmente para la detección del gluten.

La presente invención permite la detección de gluten a nivel de trazas, concretamente menos de 50 ppb (partes por billón) de gliadina patrón PWG

pueden ser detectadas con seguridad. Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula

de ADN de cadena sencilla caracterizada por que dicha molécula reconoce y se une específicamente al gluten. Preferiblemente, dicho gluten es de trigo, cebada, centeno o avena. Más preferiblemente, dicho gluten es de trigo.

La expresión "molécula de ADN de cadena sencilla", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una única hebra de nuc/eótidos unidos, que a su

vez están compuestos cada uno de ellos por un azúcar, una base nitrogenada y

un grupo fosfato. A diferencia del ADN que se presenta como una doble cadena

de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí por unas

conexiones denominadas puentes de hidrógeno, el ADN de cadena sencilla

presenta una única hebra. En la presente descripción, la expresión "molécula de

ADN de cadena sencilla" y el término "aptámero" se usan indistintamente.

La expresión ureconoce y se une específicamente", tal y como se emplea en la

presente descripción, se refiere a la capacidad de los aptámeros de la presente

invención de interaccionar con el gluten de manera específica, es decir, de unirse con una determinada afinidad a dicha proteína y de no unirse a otras. Esta capacidad de los aptámeros de la invención de reconocer y unirse

especificamente a gluten es similar a la de los anticuerpos.

En la presente descripción, se entiende por gluten una proteína amorfa que se encuentra en la semilla de algunos cereales, como el trigo, el centeno, la cebada y la avena, combinada con almidón. El gluten representa un 80% de las proteínas del trigo. Cuando la harina de uno de estos cereales se mezcla con agua, dos proteínas del grano pertenecientes al grupo de las prolaminas, las gliadinas y las gluteninas, se unen para formar una red proteica llamada gluten. Esta proteína genera en una pequeña parte de la población una enfermedad llamada celiaquía, en la cual el sistema inmunológico responde dañando el intestino delgado de las

personas que la ingieren al no poder digerirla. La gliadina parece ser la proteína

que presenta el mayor problema en la enfermedad celiaca o intolerancia al gluten, es modificada por la transglutaminasa y presentada por el alelo DQ2 del complejo mayor de histocompatibilidad. Esto hace que cada vez que se consuma un alimento con gluten se produzca una reacción inmunológica que deteriora

progresivamente el intestino, pudiéndose además complicar con episodios de

dermatitis herpetiforme y otras patologias neurológicas, reumáticas, etc.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula de ADN de cadena sencilla reconoce y se une especificamente a gliadina, hordeina,

secalina o avenina. Preferiblemente, la molécula de ADN de cadena sencilla reconoce y se une específicamente a gliadina. los autores de la presente invención han demostrado la capacidad de los aptámeros de la presente

invención de reconocer y unir especificamente gliadina, como muestra el ejemplo 5 y la figura 46.

El término "gliadina", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una prolamina que forma parte de la porción proteica del gluten (soluble en etanol) de las semillas del trigo. Las prolaminas son proteinas que poseen grandes cantidades de prolina y ácido glutámico. Existen homólogos de la gliadina en la cebada (hordeina), el centeno (secalina) y algunas variedades de avena (avenina), lo que explica que dichos cereales puedan también provocar la

enfermedad celiaca.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula de

ADN de cadena sencilla es incapaz de reconocer y unir específicamente proteínas

de maíz, soja o arroz. Preferiblemente, la molécula de ADN de cadena sencilla es

incapaz de reconocer y unir específicamente proteínas de arroz. Los autores de la presente invención han demostrado que los aptámeros de la presente invención son incapaces de unir y detectar proteínas de arroz, lo cual implica la ventaja de

que no van a dar resultados de falsos positivos en ensayos de detección de gluten.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula de

ADN de cadena sencilla reconoce y se une específicamente a un péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEO ID NO: 1. El péptido con SEO ID NO: 1 es el conocido como péptido 33-mer. En la presente descripción, se entiende por péptido 33-mer un péptido de la a-gliadina de trigo, que es resistente a

proteasas y que se ha considerado como el iniciador primario de la respuesta

inflamatoria al gluten en los enfermos celiacos. Asi, se ha demostrado mediante ensayos in vi/ro que el péptido 33-mer es el péptido del gluten más bioactivo (inmunodominante) que es reconocido por células T procedentes de donantes celiacos HLA-D02+ En la presente invención el péptido 33-mer se ha elegido como diana para la evolución de las moléculas de ADN de cadena sencilla (aptámeros), concretamente la secuencia entre los aminoácidos 57 y 89 de la gliadina, que corresponde a SEO ID NO: 1.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula de

ADN de cadena sencilla comprende la secuencia nucleotidica X-GTCT-Y, donde X comprende entre 3 y 29 nucleótidos e Y comprende entre 7 y 33 nucleótidos. Preferiblemente, la molécula de ADN de cadena sencilla comprende una secuencia nucleotidica que se selecciona de entre SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Preferiblemente, dicha molécula se une a la secuencia aminoacídica SEO ID NO: 1 con una constante de disociación Ko igualo menor de 55 nM.

En la presente descripción, se entiende por constante de disociación Ko una

constante que mide la afinidad con la que un ligando, en la presente invención la molécula de ADN de cadena sencilla, se une a una proteina, en la presente invención el gluten. La afinidad ligando-proteína depende de interacciones

intermoleculares no covalentes entre dos moléculas como puentes de hidrógeno,

interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals e hidrofóbicas. Cuanto

menor sea la Ko. mayor será la afinidad con la que el aptámero se una al gluten. En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula de

ADN de cadena sencilla comprende la secuencia nucleotídica SEO ID NO: 2.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula de ADN de cadena sencilla comprende la secuencia nucleotidica SEO ID NO: 7.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula de ADN de cadena sencilla comprende además una molécula marcadora.

Preferiblemente, la molécula marcadora se selecciona de entre un fluoróforo, una enzima, un péptido, una nanopartícula, una molécula electroactiva, una digoxigenina y una biotina.

En la presente descripción, se entiende por molécula marcadora una molécula

fácilmente detectable mediante distintos métodos, que puede por ejemplo tener

receptores específicos o puede ser una enzima que cataliza una reacción

detectable directa o indirectamente tras la adición de los correspondientes sustratos para la detección de la molécula de ADN de cadena sencilla de interés.

El término "f1uoróforo", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a un compuesto químico fluorescente que emite luz tras su excitación. Un

fluoróforo unido a la molécula de ADN de cadena sencilla de interés perrnrte por lo

tanto su detección. En una realización preferida del primer aspecto de la

invención, el fluoróforo se selecciona de entre fluoresceina, boro-dipirrometeno,

cianina, naftaleno y rodamina y cualquiera de sus derivados.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la enzima se

selecciona de entre peroxidasa, fosfatasa alcalina, DNAzimas y NADH

deshidrogenasas.

El término "DNAzimas", tal y como se emplea en la presente descripción, se

refiere a ácidos nucleicos con actividad catalítica que pueden generar con dicha

actividad un marcaje detectable asociado a la presencia de dicha DNAzima.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el péptido se selecciona de entre una polihistidina, un epi topo myc y un epítopo FLAG. Una polihistidina es un péptido de entre 2 y 12 histidinas, preferiblemente de 6

histidinas. Un epítopo myc es un péptido de 10 aminoácidos derivado del gen cmyc y que por ser altamente inmunogénico es fácilmente detectable mediante

anticuerpos, como por ejemplo el anticuerpo monoclonal llamada 9El0 del Developmental Studies Hybridoma Bank. Un epítopo FLAG es un octapéptido que también es altamente inmunogénico y por tanto fácilmente detectable mediante

anticuerpos. Ambos epítopos son bien conocidos en el estado de la técnica.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la nanopartícula

se selecciona de entre una nanopartícula metálica, nanopartícula semiconductora

y micro o nanopartícula magnética.

El término "nanopartícula metálica", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a un nanoobjeto con sus tres dimensiones en la nanoescala (entre 1 y 100 nm), formada por oro, plata, platino u otros metales, que unida a la molécula de ADN de cadena sencilla de interés permite su detección a través de sus propiedades ópticas. electroquímicas o catalíticas.

El término "inmovilizado", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere

a que el péptido 33-mer, la proteína inmun6gena o la molécula de ADN de cadena

sencilla de la invención pueden estar unidos a un soporte sin perder su actividad.

El soporte puede ser la superticie de una placa de microtitulación, superficies de materiales conductores, micro y nanopartículas magnéticas, soportes de vidrio, partículas de látex, nanotubos de carbono, entre otras.

El término "nanopartícula semiconductora", tal y como se emplea en la presente

descripción, se refiere a un nanoobjeto con sus tres dimensiones en la nanoescala de material semiconductor, como por ejemplo sulfuros, seleniuros y

telururos de Cd, Zn o Pb, que unido a la molécula de ADN de cadena sencilla de

inlerés permite su detección mediante sus propiedades ópticas o electroquímicas.

El término "micro o nanopartícula magnética", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una partícula microscópica con propiedades magnéticas,

que unida a la molécula de ADN de cadena sencilla de interés permite su detección mediante el cambio en las propiedades ópticas que tienen lugar tras la unión entre la proteína y la cadena de ADN así marcada. En la presente invención

dicha nanopartícula se utiliza para la detección como molécula marcadora y

también como soporte sólido para la inmovilización de la molécula de ADN de cadena sencilla, del péptido 33-mer o de la proteína ínmunógena (gliadina o gluten).

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula eleclroactiva se selecciona de entre azul de metileno, ferroceno, antraquinona y

tionina, y cualquiera de sus derivados, entre otras.

El término molécula electroactiva, tal y como se emplea en la presente

descripción, se refiere a una molécula que puede oxidarse o reducirse dentro de la ventana de potencial de un material electródico y que, por tanto, su presencia puede ser detectada mediante técnicas electroquímicas faradaicas bien conocidas

en el estado de la técnica.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula marcadora es biotina. La biotina es también conocida como vitamina H y es una molécula muy usada en biotecnología para marcar otras moléculas, por lo que se conoce como biotiniJación. Las proteínas avidina y estreptavidina se unen con una

altísima afinidad y especificidad a la biotina, por lo que dicha molécula es un buen

marcador. En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula

marcadora es digoxigenina. la digoxigenina es un hapteno y puede conjugarse a

las moléculas de ADN de cadena sencilla de la presente invención como marcador de las mismas, ya que puede ser detectado fácilmente mediante

anticuerpos especificos anti-digoxigenina.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la molécula de

ADN de cadena sencilla comprende un cebador en cada uno de sus extremos

para su detección mediante PCR.

En la presente descripción , se entiende por cebador una cadena de ácido nucleico que sirve como punto de partida para la amplificación de ADN. Es una secuencia corta de ácido nucleico que contiene un grupo 3' hidroxilo libre que

forma pares de bases complementarios a la hebra molde y actúa como punto de

inicio para la adición de nucleólidos con el fin de copiar y amplificar la hebra

molde. En la presente invención los cebadores se unen a los extremos de la molécula de ADN de cadena sencilla para su amplificación y detección mediante

PCR. Los cebadores pueden estar marcados con biotina o el f1uoróforo 6

carboxilfuoresceina (6-FAM), o sin marcar.

En la presente descripción, se entiende por PCR la reacción en cadena de la

polimerasa. Es una técnica de biología molecular cuyo objetivo es obtener un gran

número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un minimo. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN partiendo de cebadores que se unen en los extremos de

las hebras, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas

para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de

replicación y la unión del cebador y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las

polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. En la presente invención la PCR se emplea para la amplificación y posterior detección de la molécula de ADN de cadena sencilla unida al gluten, péptido 33-mer, péptido recombinante 33-mer o péptido control. Existen varios tipos de PCR como la PCR a tiempo real, PCRELlSA o PCR-ELOSA. La principal característica de la PCR a tíempo real o cuantitativa es que permite cuantificar la cantidad de ADN presentes en la muestra original o identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especificas a partir de su temperatura de fusión. La PCR-ELlSA (reacción en cadena de polimerasa -ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica hibrida entre PCR y ELlSA para la cuantificación de productos de ADN . En este ensayo los productos de PCR están marcados con una biotina y con un

hapteno para permitir su captura sobre superficies con (estrept)avidina y posterior cuantificación usando un anticuerpo contra el hapteno conjugado con una enzima.

La PCR-ELOSA es una técnica muy similar a la PCR-ELlSA, en la que los productos de PCR sólo están marcados con el hapteno, de manera que se

hibridan con una sonda de captura inmovilizada y se cuantifica mediante la utilización de un anticuerpo contra dicho hapteno conjugado con un enzima.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, al menos un

enlace fosfodiéster de la molécula de ADN de cadena sencilla contiene al menos un oxigeno (O) sustituido por un azufre (S).

La expresión "enlace fosfodiéster", tal y como se emplea en la presente

descripción, se refiere a un enlace covalente que se produce entre un grupo

hidroxilo (OH-) en el carbono 3' y un grupo fosfato (p0.'-) en el carbono 5' del azúcar ribosa de los nucleótidos de la molécula de ADN de cadena sencilla,

formándose así un doble enlace éster. Para mejorar la resistencia de los

aptámeros frente a la degradación por nucleasas, se incluyen en la presente

invención aptámeros modificados, en los cuales se ha sustituido al menos uno de los átomos de oxígeno que participan en el enlace fosfodiéster, por un átomo de azufre.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la detección

de gluten caracterizado por que comprende al menos una molécula de ADN de cadena sencilla del primer aspecto de la invención. Preferiblemente, dicho kit además comprende un soporte sólido. Más preferiblemente, la molécula de ADN de cadena sencilla está anclada al soporte sólido. En una realización preferida, el kit comprende al menos dos aptámeros, uno de captura y otro de detección.

En una realización preferida, el kit además comprende el péptido con SEO ID NO: 1 o gliadina o gluten, anclado al soporte sólido. Un kit de este tipo permitiria llevar

a cabo un ensayo ELlSA competitivo, que consistiría en la competición entre el

gluten presente en la correspondiente muestra y el péptido SEO ID NO: 1 inmovilizado sobre soportes sólidos por una cantidad fija y limitada de aptámero en disolución previamente marcado y/o modificado como se ha descrito arriba.

Preferiblemente, dicho kit comprende además un anticuerpo que reconooe y se une especifica mente a gluten. El gluten tiene varias repeticiones de la SEO ID

NO: 1, es decir, tiene varios sitios de unión por los que tanto los aptámeros de la

invención como un anticuerpo especifico podrian unirse al mismo tiempo. Por

tanto, más de un aptámero o uno o varios aptámeros y uno o varios anticuerpos podrían usarse de manera combinada para la separación y/o detección de gluten.

El kit de la invención pueden comprender además, sin ningún tipo de limitación,

anticuerpos primarios conjugados o no conjugados, péptidos, cebadores

marcados o sin marcar, tampones, anticuerpos secundarios conjugados, proteínas o péptidos patrones, agentes para prevenir la contaminación, compuestos marcadores, aunque sin limitarnos, fluorocromos, etc. Por otro lado, el kit de la invención puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. El kit de la invención pueden contener

además otras proteinas o péptidos que sirvan como controles positivos y

negativos. Preferiblemente, este kit comprende además las instrucciones para

llevar a cabo la detección y/o cuantificación de la molécula de ADN de cadena

sencilla de la invención.

El término "anticuerpo", tal como se emplea en esta memoria, se refiere a

moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de

fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con la proteína gluten, con alguno de sus fragmentos o con otras moléculas indicadoras utilizadas en el proceso de detección.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un uso de la molécula de ADN de cadena sencilla del primer aspecto de la invención o del kit del segundo aspecto de la invención, para la detección del gluten. Como se demuestra en los ejemplos y figuras de la presente descripción, los aptámeros de la invención han probado ser útiles en la detección específica del gluten.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método de detección

del gluten que comprende las siguientes etapas: a) poner en contacto una molécula de ADN de cadena sencilla del primer aspecto de la invención con una muestra problema; y b) detectar la presencia del complejo formado por dicha molécula y el gluten de la muestra problema en la etapa (a).

Se entiende por Umuestra problema" cualquier muestra, ya sea una muestra

alimentaria o de otro tipo, susceptible de contener gluten o fragmentos derivados

del gluten que puedan provocar la intolerancia en un individuo celiaco.

En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (a) se

lleva a cabo en disolución.

En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (a) se

lleva a cabo en un soporte sólido.

En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (b) se lleva a cabo mediante PCR.

En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (b) se lleva a cabo mediante un aptaensayo. El término "aptaensayo", tal y como se

emplea en la presente descripción, se refiere a ensayos de unión donde la

molécula receptora que enlaza al gluten es una cadena de ADN sencilla o aptámero de fonna completamente análoga a los inmunoensayos donde la molécula receptora es un anticuerpo. Por analogia con los inmunoensayos, en este término se incluyen toda la variedad de formatos conocidos para los

inmunoensayos, sin más que sustituir anticuerpo por aptámero.

En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (b) se

lleva a cabo mediante un inmunoensayo. Preferiblemente, dicho inmunoensayo se

selecciona de entre wesfem blof, dof blof o ELlSA. Más preferiblemente, dicho inmunoensayo es un ELlSA.

Los aptámeros de la presente invención pueden ser usados para capturar, concentrar ylo detectar gluten en disolución o anclados sobre superficies sólidas.

Por ejemplo, para capturar ylo preconcentrar gluten se podrian usar los aptámeros biotinilados conjugados a un soporte sólido que contenga

estreptavidina o alguna de sus variantes (micropartículas magnéticas, placas de microtitulación, etc) que permita su separación de la matriz que contenga el

gluten.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus

variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,

componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y

características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. los siguientes ejemplos y figuras se

proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. A) Representación de la concentración de aptámeros de cada ciclo de selección que no se enlazan (gris oscuro) y que se enlazan (gris claro) al péptido con SEO ID NO: 1 tras su interacción con el mismo durante 1 °min en BS (tampón de enlace) obtenidas por fluorescencia. B) Evolución del porcentaje de enriquecimiento en secuencias de ADN de afinidad hacia el péptido con SEO ID

NO: 1 con las sucesivas rondas de selección.

FIG. 2. Estructura secundaria más estable de los aptámeros con A) SEO ID NO: 2, B) SEO ID NO: 5, C) SEO ID NO: 7, O) SEO ID NO: 8, E) SEO ID NO: 9 y F) SEO ID NO: 10, obtenidos mediante el servidor en red (mfold) de acceso libre, alojado por "The RNA Institute, College of Arts and Sciences, State University of New York at Albany".

FIG. 3. Valoración calorimétrica de 33,4 ~M del aptámero con SEO ID NO: 2 con 0,338 mM del péptido con SEO ID NO: 1 en BS (50 mM TRIS pH 7,4+0,25 M NaCI+5 mM MgCI,) a 15 oC (A) y 35 oC (B). Gráficas superiores: Potencia en función del tiempo obtenida tras cada adición de péptido. Gráficas inferiores:

Valores integrados de la variación de calor en cada adición tras la corrección con

el calor de dilución.

FIG. 4. Curvas de enlace de los aptámeros con SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 9 y SEO ID NO: 10 a partículas magnéticas modificadas A) con el péptido con SEO ID NO: 1 B) con el estándar de gliadina PWG (Prolamin Working Group).

FIG. 5. Curvas de enlace de los aptámeros con SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 7 y SEO ID NO: 8 a partículas magnéticas modificadas con extractos etanólicos de harina de A) centeno (en porcentaje de fracción enlazada) y B) avena (en intensidad de corriente).

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la eficacia de los aptámeros de la invención y

del método de detección de gluten de la invención.

Ejemplo 1: Obtención de aptámeros para el péptido con SEO ID NO: 1 de la a -2gliadina.

Materiales La diana seleccionada, el péptido con SEO ID NO: 1, se obtuvo mediante técnicas de ADN recombinante. A partir de un oligonucleotido sintético (SEO ID NO: 20) obtenido en Sigma-Genosys con la secuencia que codifica para los 33 aminoácidos que van desde la posición 57 a la 89 de la gliadina (Gen Bank, ntimero de acceso AJ133612.1) y los cebadores directo (SEO ID NO: 11) e inverso (SEO ID NO: 12), se obtuvieron mtiltiples copias por PCR. El péptido recombinante fue obtenido tras clonar este producto de PCR y expresarlo en el sistema pETBlue-2, siguiendo las instrucciones del fabricante (Novagen), por el cual se le añade una cola de histidinas. Para la purificación del péptido con la cola de histidinas (SEO ID NO: 13) se utilizó una columna HisTrap FF de 1 mL en un equipo AKTA FPLC (GE Healthcare). Para la contraselección se empleó la cola de histidinas (péptido control, SEO ID NO: 14) obtenida con el sistema pETBlue-2.

La colección de secuencias de ADN de 80 nucleótidos fue diseñada de forma que su secuencia general corresponde a la SEO ID NO: 15. La colección fue

sintetizada y purificada por PAGE por Sigma-Genosys. Las secuencias de los

cebadores empleados en la etapa de amplificación por PCR corresponden a SEO ID NO: 16 (cebador directo) y SEO ID NO: 17 (cebador inverso biotinilado). Para

cada ronda se emplearon micropartículas magnéticas (MagneHis™ Ni partides,

de Promega, USA) modificadas con el péptido diana o con el control. El protocolo

de modificación consistió en equilibrar las particulas en tampón de modificación (BM, 100 mM HEPES pH 7,5+10 mM imidazol+0,5 M NaCI). Después se incubaron con péptido con SEO ID NO: 1 o con péptido control con SEO ID NO: 14 en concentración comprendida entre 0,25 y 1 ~g/~L en BM durante 15 min con rotación a temperatura ambiente. Tras decantar y lavar 2 veces con BM + 0,01 % Tween-20 y 1 vez con tampón de enlace (BS: 50 mM TRIS pH 7,4+0,25 M NaCI+5 mM MgCI2) , las particulas magnéticas modificadas fueron diluidas a 5 pmol de diana/~L en BS.

Procedimiento Para cada ronda de selección se usaron 250 pmoles de la colección de ADN

seleccionada y amplificada en la ronda anterior (1 nmol de la colección inicial en la primera ronda para asegurar una variedad de secuencias de 5x1014_1x1015

moléculas) diluidos en BS. Se calentaron a 98 oc durante 4 min e inmediatamente se enfriaron en hielo otros 4 mino El medio de selección consistió en BS al que se

le añadió 1 I-Ig/mL de BSA (albúmina de suero bovino) para evitar uniones ¡nespecíficas y un ARN transferente competidor en una concentración 10 veces inferior a la de la colección de ADN. En este medio se pusieron en contacto las

moléculas de ADN con una concentración de péptido (péptido con SEO ID NO: 1

o péptido control con SEO ID NO: 14 en las contraselecciones) 10 veces inferior a la de ADN para limitar la cantidad de diana y favorecer la competición. Tras un

tiempo de incubación que fue disminuyendo progresivamente en las rondas

sucesivas según la tabla 1, se hicieron varios lavados en BS+O,OI Tween-20 (ver tabla 1).

Finalmente se eluyó el complejo ADN-péptido incubando las particulas en 100 mM HEPES pH 7,5+500 mM imidazol (BME) durante 10 min bajo agitación. El eluato fue transferido a tubos de PCR para proceder a su amplificación. Cada 100 ~L de PCR contenia: 2 ~L de molde (eluato), 1 ~M de cada cebador (SEO ID NO: 16 Y SEO ID NO: 17), 0,2 mM de dNTP, 3 mM de Mg2', Ix buffer PCR y 2,8 U de inmolase DNA polymerase (Disbiotec). Las condiciones de PCR fueron: incubación inicial a 37 oC durante 10 min, 20 min a 95 oC para activar la enzima y 15 ciclos de 94 ·C-57 ·C-72 ·C durante 45 s cada uno. La extensión final fue realizada a 72 ·C durante 10 mino La amplificación fue confirmada por electroforesis en gel de agarosa al 2%. La cuantificación del ADN de cadena

doble amplificado se realizó fluorimétricamente con un "MiniFluorímetro" modelo

5 TBS-380 de la casa Tumer Biosystems. La obtención de la hebra de ADN de cadena simple se logró usando partículas magnétícas modificadas con estreptavidina (Dynabeads® MyOne™ Streptavidin Cl, Lile Technologies, Madrid). Estas partículas se pusieron en contacto con el ADN durante 15 min a

temperatura ambiente y bajo rotación tras lo cual, se procedió a la separación de

10 las hebras por incubación en NaOH 100 mM durante 10 min bajo agitación. El sobrenadante resultante contiene el ADN de cadena simple que se emplea en la

siguiente ronda.

Tabla 1. Condiciones experimentales variables empleadas en las sucesivas 15 rondas de la selección.

Ronda

Contraselección Tiempo de incubación (min) Número de lavados

1

60 2

2

60

2

3

si 60 2

4

30 2

5

30

5

6

si 30 5

7

15 5

8

15 10

9

si 15 10

10

15 15

Antes de las rondas 3, 6 Y 9 se procedió a hacer una contraselección incubando el

ADN de la ronda anterior con partículas magnéticas modificadas con el péptido 20 control con SEQ ID NO: 14 en las mismas condiciones que con el péptido con SEO ID NO: 1, pero en este caso se desecharon las partículas y se us6 el

sobrenadante en la correspondiente ronda de selección.

Tras 10 rondas de selección, el 12,8% del ADN seleccionado fue capaz de unirse

al péptido recombinante, mientras que no se detectaron secuencias que se

uniesen al péptido control. El porcentaje de unión se determinó con alícuotas de

cada ciclo amplificadas por PCR en las mismas condiciones experimentales que

en cada ciclo salvo que se empleó un cebador directo con SEO ID NO: 16 marcado con 6-FAM (SEO ID NO: 18). La hebra marcada con 6-FAM fue separada de la marcada con biotina de manera idéntica a la separación de hebras previa a cada ronda y su concentración fue determinada fluorimétricamente (Biotek Instrument flx800) frente a un calibrado realizado con secuencias aleatorias de ADN-6-FAM de concentración conocida empleando una )" de excitación de 480 nm y una )" de emisión de 528 nm.

El ensayo de unión se realizó poniendo en contacto cantidades equimolares de

ADN-6-FAM de cada ciclo y péptido recombinante (SEO ID NO: 13) inmovilizados sobre partículas magnéticas (15 pmoles) durante 10 minutos en BS. La fracción no enlazada se recogió y tras 2 lavados en BS + 0,01 % Tween-20, se eluyeron los aptámeros enlazados en BME durante 10 min bajo agitación, obteniendo así la

fracción enlazada. Ambas fracciones fueron analizadas fluorimétricamente (figura 1A), observándose una progresiva disminución de la fracción no enlazada con los

ciclos simultáneamente a un aumento de la fracción enlazada (figura 1 B). Se realizó un ensayo de unión con el péptido control y las secuencias de ADN obtenidas en el ciclo 10. La fluorescencia emitida por la fracción no enlazada fue

inferior al límite de detección, lo que indica que no se amplificaron secuencias con afinidad por la cola de histidinas ni por el soporte sólido.

Ejemplo 2: Identificación de las aptámeros de ADN obtenidos.

Para identificar los aptámeros con afinidad por el péptido SEO ID NO: 1 se procedió a amplificar una alícuota del ciclo 10 usando los cebadores no modificados (SEO ID NO: 16 y SEO ID NO: 19) usando las mismas condiciones

que en anteriores etapas de amplificación, y se clonó utilizando el sistema 5 pETBlue-1 Acceptor Vector Kit de la casa Novagen . Tras clonarlo se sembraron

placas de la cepa huésped (Nova Competent cells, Novagen) y se secuenciaron 25 clones utilizando el kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) y un equipo Abi PRISM 3130xl Genetic Analyzer. Las secuencias obtenidas se analizaron mediante el software Chromas Lite 2.01 .

10 Se determinó la estructura secundaria de los seis aptámeros SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 9 y SEO ID NO: 10 usando el servidor en red "mfold" en las condiciones de enlace (25 oC, 250 mM de NaCI y 5 mM de MgCI,). En la figura 2 y en la tabla 2 se muestra la estructura más

15 estable y las energias libres de Gibbs para cada uno de los aptámeros,

respectivamente.

Tabla 2. Parámetros termodinámicos de los aptámeros.

Aptámero

"G (kcal mor')

SEO ID NO: 2

-1.24

SEO ID NO: 5

-3.21

SEO IDNO: 7

-1 .72

SEO ID NO: 8

-306

SEO ID NO: 9

-2.95

SEO ID NO: 10

-4.11

20 Ejemplo 3: Caracterización del aptámero SEO ID NO: 2.

El aptámero con SEO ID NO: 2 se seleccionó para su posterior caracterización

mediante valoración calorimétrica isoterma. Se empleó como molécula diana el péptido SEO ID NO: 1 sintetizado químícamente por Biomedal (Sevilla, España). El enlace del aptámero con SEO ID NO: 2 al péptido SEO ID NO: 1 fue estudiado

5 mediante valoración calorimétrica isoterma. La concentración del aptámero en la

celda calorimétrica fue de 33,4 ~M, mientras que la concentración de péptido en la jeringa fue de 0,338 mM. Se realizó la siguiente serie de inyecciones de péptido: una primera inyección de 4 ~L seguida de 18 inyecciones de 15 ~L. En la figura 3

se muestran las valoraciones a ambas temperaturas 15 o e y 35 o C. El análisis de

10 las medidas han proporcionado los valores termodinámicos resumidos en la tabla

3.

Tabla 3. Parámetros termodinámicos hallados por ITe.

15° C

35° C

Constante de enlace, KB

(2,2 ± 0,5) "10' (6±2) "10

Constante de disociación, Ka

45±10nM 17 ±10 nM

Cambio de energia libre de enlace, 11GB

-10,0 kcal mol" -10,6 kcal mor'

Cambio de entalpía de enlace, IIH.

+0,70 ± 0,01 kcal mor1 +0,57 ± 0,01 kcal mor1

Cambio de entropía de enlace, LIS.

+36 ,0 cal/(K mor') +37,4 cal/(K mor')

15 La KD fue detenninada mediante valoración calorimétrica isoterma (ITC), técnica habitual para este tipo de medidas. El aptámero fue valorado mediante adiciones sucesivas de péptido SEO ID NO: 1 sintetizado químicamente, a 15 y 35 oC, obteniéndose unas KD de 45 ± 10 nM y 17 ±10 nM, respectivamente.

20 Estos datos confirman la unión entre el aptámero con SEO ID NO: 2 objeto de la invención y el péptido SEO ID NO: 1. Además el aptámero con SEO ID NO: 2 presenta una gran afinidad por la diana, como se deduce de una constante de disociación nM para una molécula hidrofóbica, que no contiene los grupos funcionales que favorecen la interacción con los ácidos nucleicos.

Ejemplo 4 CUlvas de enlace de los aptámeros seleccionados al péptido con SEO ID NO: 1.

La evaluación de la afinidad de los aptámeros por el péptido con SEO ID NO: 1 se

realizó mediante ensayos de unión sobre partículas magnéticas recubiertas de

estreptavidina, sobre los que se inmovilizó el péptido con SEO ID NO: 1

biotinilado en su extremo e terminal. La fracción de cada uno de los seis

apta meros modificados con biotina que se une a dichas particulas fue medida cronoamperométricamente Iras adición del conjugado de estreptavidina-HRP y del sustrato de la enzima (tetrametilbencidina + H20 2). Todos los aptameros

seleccionados presentaron afinidad por la diana.

Para ello se modificaron partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina

(Dynabeads® MyOne~ Streptavidin C1 , Life Technologies, Madrid) con péptido SEO ID NO: 1 biotinilado en su extremo C terminal (Biomedal, Sevilla) 2 ~M en PBS + 0,01 % Tween-20 durante toda la noche. Tras dos lavados con PBS + 0,01 % Tween-20, se bloquearon con 500 ~M de biotina en PBS + 0,01 % Tween-20

durante 30 min o Tras 2 nuevos lavados se reconstituyeron en SS . Se pusieron en contacto concentraciones crecientes de cada uno de los aptámeros biotinilados

(SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 9 y SEO ID NO: 10) en BS durante 30 mino Tras 2 lavados con BS + 0,01 % Tween20, se añadieron 2,5 ~g/mL estreptavidina-HRP de Sigma-Aldrich durante 30 mino Tras 3 lavados con BS + 0,01 % Tween-20, una alícuota se colocó sobre un

electrodo serigrafiado de carbono (Dropsens, Oviedo) y se añadió el sustrato. Tras 1 minuto de reacción enzimática se midió cronoamperométricamente a O V la

cantidad de producto generado usando un potencias tato ~-AutoLab tipo 11 PGstat12 equipado con el software GPES 4.9 (EcoChemie, Holanda). En la figura 4A se observa que todos los aptámeros presentan afinidad por la diana (péptido SEO ID NO: 1).

Ejemplo 5 Curvas de enlace de los aptámeros seleccionados a PWG.

Se realizó la evaluación de la afinidad de los aptámeros por el patrón de gliadina

comúnmente usado en los inmunoensayos comerciales obtenido a partir de una

mezcla de harinas de trigo de diferente procedencia, denominado PWG. Se llevaron a cabo ensayos de unión sobre partículas magnéticas activadas con grupos tosilo superficiales, sobre los que se inmovilizó el PWG. La fracción de cada uno de los seis aptámeros modificados con biotina que se une a dichas partículas fue medida cronoamperométricamente tras adición del conjugado de estreptavidina-HRP y del sustrato de la enzima (tetrametilbencidina + H20 2).

Para ello se modificaron partículas magnéticas con grupos tosilo superficiales

(Dynabeads® MyOne™ Tosylactivated, Life Technologies, Madrid) con PWG (estándar de gliadina de Pro/amin Worl<ing Group) en 0,32 mg/mL en Borato 0,058 M pH 9,5 +(NH.)zSO. 1M durante 24 h a 37 oC. Tras dos lavados en PBS +0,01 % Tween-20. se dejan en el mismo tampón durante la noche a 37 oC. Tras

2 nuevos lavados se reconstituyeron en PBS +0,01 % Tween-20 y se utilizaron

para la obtención de las curvas de enlace. Para ello alícuotas idénticas de las

micropartículas modificadas con PWG se pusieron en contacto con

concentraciones crecientes de cada uno de los aptámeros biotinilados (SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8 y SEO ID NO: 9) en BS + 0,01 % Tween-20 durante 30 mino Tras 2 lavados con BS +0,01 % Tween-20. se añadieron 2,5 ~9/mL estreptavidina-HRP de Sigma-Aldrich y se incubó durante 30

mino Tras 2 lavados con SS + 0,01 % Tween-20 y uno en SS, se resuspendieron

en BS. Una alícuota se colocó sobre un electrodo serigrafiado de carbono

(Dropsens, Oviedo) y se añadió el sustrato. Tras 1 minuto de reacción enzimática

se midió cronoamperométricarnente a °V la cantidad de producto generado usando un potenciostato ~-AutoLab tipo 11 PGstat-12 equipado con el software GPES 4.9 (EcoChemie, Holanda). En la figura 4B se observa que todos los aptámeros presentan afinidad por la proteína gliadina completa, como cabe esperar tras la exigente selección efectuada mediante SELEX.

Ejemplo 6: Especificidad de la interacción.

Se evaluó la especificidad de la afinidad de los aptámeros hacia otras proteínas susceptíbles de desencadenar la enfermedad celiaca y se evaluó su reactividad

cruzada con otras proteínas presentes en cereales que no la desencadenan. Se llevaron a cabo ensayos de unión sobre partículas magnéticas activadas con

grupos tosilo superficiales, sobre los que se inmovilizó un extracto etanólico

diluido de harinas de centeno, avena y arroz. La fracción de cada uno de los

aptámeros modfficados con biotina que se une a dichas partículas fue medida cronoamperométricamente tras adición del conjugado de estreptavidina-HRP y del sustrato de la enzima (tetrametilbencidina + H,O,) (Figura 5).

Para ello, se realizaron curvas de enlace de los aptámeros con secuencias SEO

ID NO: 7, SEQ ID NO: 2 y SEO ID NO: 8, hacia las prolaminas de otros cereales que provocan la enfermedad celiaca (centeno y posiblemente avena) y otros que no la ocasionan (arroz). La extracción de 1 g de cada harina se realizó con 10 mL de etanol al 60% durante 30 min bajo agitación, tras lo cual se centrifugó a 2500 g

durante 45 mino El extracto volvió a ser centrifugado y el sobrenadante resultante

recogido para su uso. Se modificaron partículas magnéticas tasi ladas de la forma

indicada en el ejemplo 5 y se realizaron las curvas de enlace de manera

totalmente análoga. En la figura 5 se observa que todos los aptámeros ensayados

tienen afinidad por el centeno, aunque menor que por el trigo. Como se muestra

en la figura SB el aptámero SEO ID NO: 7 muestra afinidad por la avena, aunque a concentraciones más elevadas que para el trigo y el centeno, por lo que es

capaz de reconocer las aveninas, cuyo papel en el desencadenamiento de la enfemnedad celiaca no está aún completamente esclarecido. El aptámero SEO ID NO: 2 no mostró afinidad por las proteínas de arroz puesto que las señales amperométricas obtenidas son indistiguibles del blanco.

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Una molécula de ADN de cadena sencilla, donde dicha secuencia reconoce y se une específicamente a un péptido que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:1.
2. 2.-La molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada por que dicha

   molécula reconoce y se une específicamente al gluten.
3. 3.-La molécula de ADN según la reivindicación 2, donde dicho gluten es de trigo,

   cebada, centeno o avena.
4. 4.-La molécula de ADN según la reivindicación 3, donde dicho gluten es de trigo.
5. 5.-La molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde

   dicha molécula reconoce y se une específicamente a gliadina, hordeína, secalina

   o avenina.
6. 6.-La molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha molécula reconoce y se une especifica mente a gliadina.
7. 7.-La secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde

   dicha secuencia es incapaz de reconocer y unir específicamente proteínas de maíz, soja o arroz.
8. 8.-La secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde

   dicha secuencia comprende la secuencia nucleotídica X-GTCT-Y, donde X

   comprende entre 3 y 29 nucleótidos e Y comprende entre 7 y 33 nucleótidos.
9. 9.-La secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde

   dicha secuencia comprende una secuencia nucleotídica que se selecciona de

   entre SEO ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 4, SEO ID NO: 5, SEO ID NO: 6, SEO ID NO: 7, SEO ID NO: 8, SEO ID NO: 9 y SEO ID NO: 10.
10. 10.-La secuencia de AON según la reivindicación 9, donde dicha secuencia se

    une a la secuencia aminoacídica SEO ID NO: 1 con una constante de disociación

    KD igualo menor de 55 nM.
11. 11 .-La secuencia de AON según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicha secuencia comprende la secuencia nucleotidica SEO ID NO: 2.
12. 12. La secuencia de AON según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde dicha secuencia comprende la secuencia nucleotidica SEO ID NO: 7.
13. 13.-La secuencia de AON según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha secuencia comprende además una molécula marcadora.
14. 14.-La secuencia de AON según la reivindicación 13, donde dicha molécula marcadora se selecciona de entre un fluoróforo, una enzima, un péptido, una nanopartícula, una molécula electroactiva, una digoxigenina y una biotina.
15. 15.-La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde dicha molécula electroactiva se selecciona de entre azul de metíleno, ferroceno, antraquinona y t;on;na.
16. 16.-La secuencia de AON según la reivindicación14, donde dicho fluoróforo se selecciona de entre f1uoresceína, boro-dipirrometeno, cianina, naftaleno y rodamina.
17. 17.-La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde dicha enzima se selecciona de entre peroxidasa, fosfatasa alcalina, ONAzimas y NAOH deshidrogenasas.
18. 18.-La secuencia de ADN según la reivindicación 14, donde el péptido se selecciona de entre una polihistidina, un epi topo myc y un epítopo flag.
19. 19.-La secuencia de ADN según la reivindicación 14, donde dicha nanopartícula se selecciona de entre una nanopartícula metálica, nanopartícula semiconductora y micro o nanopartícuJa magnética.
20. 20.-La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde la molécula marcadora es biotina.
21. 21.-La secuencia de AON según la reivindicación 14, donde la molécula

    marcadora es digoxigenina.
22. 22.-La secuencia de AON según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , donde al menos un enlace fosfodiéster de dicha secuencia contiene al menos un O

    sustituido por un S.
23. 23.-Un kit para la detección de gluten caracterizado por que comprende al menos

    una secuencia de ADN de cadena sencilla según cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 22.
24. 24.-El kit según la reivindicación 23, caracterizado por que además comprende un soporte sólido.
25. 25.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, donde la secuencia de ADN está anclada al soporte sólido.
26. 26.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, que además comprende el péptido con SEQ ID NO: 1 o gliadina o gluten, anclado al soporte sólido.
27. 27.-El kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, donde además

    comprende un anticuerpo que reconoce y se une específicamente a gluten.
28. 28.-Uso de la secuencia de ADN de cadena sencilla según cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 22 o del kit según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27,

    para la detección del gluten.
29. 29.-Un método de detección del gluten que comprende las siguientes etapas:

    a) poner en contacto una secuencia de ADN de cadena sencilla según

    cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 con una muestra problema; y b} detectar la presencia del complejo formado por dicha secuencia y el gluten de la muestra problema en la etapa (a).
30. 30.-El método según la reivindicación 29, donde la etapa (a) se lleva a cabo en disolución.
31. 31 .-El método según la reivindicación 29, donde la etapa (a) se lleva a cabo en

    un soporte sólido.
32. 32.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, donde la etapa

    (b)

    se lleva a cabo mediante PCR.

    (b)

    se lleva a cabo mediante un aptaensayo.

33. 33.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 , donde la etapa
34. 34.-El método según la reivindicación 33, donde el aptaensayo es un ELOSA.