ES2236208T3 - Analogos biologicamente activos de discodermolida. - Google Patents
Analogos biologicamente activos de discodermolida.Info
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Abstract
Uso de un compuesto seleccionado del grupo consistente en 2- desmetildiscodermolida (II); 19- desaminocarbonildiscod ermolida (III); metildiscodermolato (V), 3-deoxi-2- discodermolida (VI); 3- deoxi-2-discodermolida- 17-acetato (VII); 3- deoxi-2-discodermolida- 11, 17-diacetato (VIII); 3-deoxi-2- discodermolida-7, 11, 17- triacetato (IX); 3- deoxi-2-discodermolida- 11-acetato (X); 3- deoxi-2-discodermolida- 7-succinate (XI); 8, 21, 23- hexahidrodiscodermolid a (XII); 7 -deoxi- 8, 21, 23- hexahidrodiscodermolid a (XIII); y 7-deoxi- 8, 21, 23- hexahidrodiscodermolid a-3, 11, 17-triacetato (XIV) en la preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de células cancerígenas.
Description
Análogos biológicamente activos de
discodermolida.
Esta invención se refiere a compuestos orgánicos
y composiciones que tienen propiedades terapéuticas útiles. Más
particularmente, la invención se refiere a nuevos compuestos de
discodermolida que tienen actividades inmunomoduladora y
antitumoral, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos
compuestos y a métodos para su uso con fines terapéuticos. Otro
aspecto de la presente invención se refiere a la identificación de
regiones de la molécula de discodermolida que son responsables de
ciertos aspectos de la bioactividad de discodermolida.
De gran importancia para el hombre es el control
de la proliferación celular patológica tal como aquella que se
presenta en el caso de cáncer. Se han dedicado considerables
investigaciones y recursos en relación con la oncología y medidas
antitumorales incluyendo quimioterapia. Si bien se han desarrollado
ciertos métodos y composiciones químicas que ayudan a inhibir,
remitir o controlar el crecimiento de tumores, por ejemplo, se
necesitan nuevos métodos y composiciones químicas antitumorales.
Durante la investigación de nuevos compuestos
biológicamente activos, se ha comprobado que algunos productos
naturales y organismos constituyen fuentes potenciales de moléculas
químicas que tienen actividad biológica útil de gran diversidad.
Por ejemplo, el diterpeno conocido comúnmente como Taxol, aislado a
partir de diversas especies de tejos, es un veneno de la red
mitótica que estabiliza a los microtúbulos e inhibe su
despolimerización a tubulina libre (Fuchs, D.A., R.K. Johnson [1978]
Cancer Treat.Rep. 62:1219-1222; Schiff, P.B., J.
Fant, S.B. Horwitz [1979] Nature (London)
22:665-667).También se sabe que el Taxol tiene
actividad antitumoral y se ha sometido a numerosos ensayos clínicos
que han demostrado que es eficaz en el tratamiento de una amplia
serie de cánceres (Rowinski, E.K. R.C. Donehower [1995] N. Engl. J.
Med. 332:1004-1014).Véanse también, por ejemplo, las
Patentes US Nos. 5,157,049; 4,960,790; y 4,206,221.
También se ha demostrado que las esponjas marinas
son una fuente de moléculas químicas biológicamente activas. Varias
publicaciones describen compuestos orgánicos derivados de esponjas
marinas, incluyendo Scheuer, P.J. (ed.) Marine Natural Products,
Chemical and Biological Perspectives, Academic Press, New York,
1978-1983, Vol. I-V; Uemura, D., K.
Takahashi, T. Yamamoto, C. Katayama, J. Tanaka, Y. Okumura, Y.
Hirata (1985). J: Am. Chem. Soc. 107:4790-4798;
Minale, L. et al, (1976) Fortschr. Chem, org. Naturst,
33:1-72; Faulkner, D.J. (1998) Natural Products
Reports 15: 113-158; Gunasekera, S.P., M.
Gunasekera, R.E. Longley and G.K. Schulte (1990) "Discodermolide:
A new bioactive polyhydroxy lactone from the marine sponge
Discodermia dissoluta".J. Org. Chem.,
55:4912-4915 [correction (1991). J. Org. Chem.
56:1346]; Hung, Deborah T., Jenne B. Nerenberg, Stuart Schreiber
(1994) "Distinct binding and cellular properties of synthetic (+)-
and (-) discodermolides" Chemistry and Biology
1:67-71; Hung, Deborah T., Jie Cheng, Stuart
Schreiber (1996) (+)-Discodermolide binds to
microtubules in stoichiometric ratio to tubulin dimers, blocks Taxol
binding and results in mitotic arrest'' Chemistry and Biology
3:287-293; Nerenberg, Jennie B., Deborah T. Hung,
Patricia K. Somers, Stuart L. Schreiber (1993) "Total synthesis
of immunosuppressive agent
(-)-discodermolide".J: Amer. Chem, Soc.
115:12621-12622; Smith III, Amos B., Yuping Qiu,
David R. Jones, Karoru Kobayashi (1995) "Total synthesis of (-)
discodermolide" .J: Amer. Chem. Soc.
117:12011-12012; Harried, Scott H., Ge Yang, Marcus
A. Strawn, David C. Myles (1997) "Total synthesis of
(-)-discodermolide: an application of a
chelation-controlled alkylation reaction". J.
Org. Chem, 62:6098-6099; Balachandran, R., ter
Haar, E.,Welsh, M.J., Grant, S.G., and Day, B.W. (1998) "The
potent microtubule-stabilizing agent (+)-
discodermolide induces apoptosis in human breast carcinoma
cells-preliminary comparisons to paclitaxel."
Anticancer Drugs 9: 67-76 y referencias allí
citadas. La Patente US No. 4.808.590 describe compuestos, que tienen
propiedades antivíricas, antitumorales y antifúngicas, aislados a
partir de la esponja marina Theonella sp. (Solicitud de Patente
Internacional No. WO 9824429; Kowalski, R.J., P. Giannakakou, S.P.
Gunasekera et al. (1997) Mol.
Pharmacol52:613-622; ter Haar, E., R.J. Kowalski, E.
Hamel et al. (1996) Biochemistry 35:243-250;
Stafford, J. A.and M. M. Mehrotra (1995) Chemtract: Org, Chem,
8:41-47;U.S. Patente No. 5,789,605; U.S Patent No.
4,939,168, M.gunasekera et al., Discodermolide compounds,
compositions containing same and methods of preparation and use;
and Solicitud de Patente Internacional WO 9720835, Harbor Branch
Oceanographic Instit., Discodermolide compounds and pharmaceutical
compositions containing the same.
El principal objeto de la presente invención es
la provisión de nuevas composiciones de análogos biológicamente
activos de discodermolida que se pueden emplear convenientemente
para la inmunomodulación y/o tratamiento del cáncer. Los compuestos
de la presente invención tienen utilidad en el tratamiento del
cáncer y como polimerizadores de tubulina y como agentes para la
estabilización de los microtúbulos.
En una modalidad específica, las nuevas
composiciones y métodos de la presente invención se pueden emplear
en el tratamiento de un animal que hospeda células cancerígenas
incluyendo, por ejemplo, la inhibición del crecimiento de células
tumorales en un mamífero hospedante. Más particularmente, los
presentes compuestos se pueden emplear para inhibir, en un ser
humano, el crecimiento de células tumorales, incluyendo células de
tumores de mama, colon, SNC, ovario, riñón, próstata, hígado,
páncreas, útero o pulmón, así como leucemia humana o células de
melanomas. Los mecanismos para conseguir la actividad
anticancerígena exhibida por los presentes compuestos conducirá al
experto en la materia a reconocer la aplicabilidad de los presentes
compuestos, composiciones y métodos con respecto a otros tipos de
cáncer tal como aquí se describe.
La presente invención proporciona nuevos análogos
de discodermolida que,convenientemente, poseen actividad biológica
útil contra tumores y otras formas de cáncer. Otro aspecto de la
presente invención se refiere a la identificación de regiones de la
molécula de discodermolida que son responsables de ciertos aspectos
de la bioactividad de discodermolida.
En modalidades específicas, la presente invención
proporciona cuatro nuevos análogos de discodermolida aislados de la
naturaleza y nueve nuevos análogos de discodermolida producidos por
medio de síntesis orgánica. Los compuestos de la presente invención
no han sido aislados con anterioridad a partir de una fuente natural
ni tampoco han sido sintetizados con anterioridad. Estos compuestos
indican los efectos sobre la actividad biológica causados por 1)
modificación de la funcionalidad localizada en el extremo de
lactona de la molécula; 2) reducción de los dobles enlaces
seleccionados presentes en la molécula; y 3) la contribución de la
funcionalidad carbamato a la actividad biológica.
En estas modalidades se incluyen análogos que
pueden ser preparados a través de modificaciones en cinco regiones
de la molécula de discodermolida, a saber 1) la lactona
C-1 a C-7 y la región conectora, 2)
la primera horquilla C-8 a C-15, 3)
la segunda horquilla C-16 a C-20, 4)
el dieno C-21 a C-24 y 5) el
carbamato en C-19. La actividad de los compuestos
varía según la región o regiones modificadas. Los datos de
actividad de la estructura promueven las regiones de horquilla
C-8 a C-15 y C-16 a
C-20 como críticas respecto a la actividad de la
molécula de discodermolida al proporcionar una relación espacial
óptima entre las funcionalidades hidroxilo C-11 e
hidroxilo C-17 encontradas en análogos naturales y
sintéticos y que son esenciales para la inducción de la
polimerización de tubulina y estabilización de la red de
microtúbulos, causando así un bloque en el ciclo celular en el
punto de verificación G_{2}/M. Además, la lactona
C-1 a C-7 y la región conectora
proporcionan un aceptor de enlace hidrógeno tal como un grupo
carbonilo y la región de dieno C-21 a
C-24 sirve para proporcionar un grupo hidrófobo;
estando situadas ambas funcionalidades en la misma relación
espacial con respecto a los grupos hidroxilo C-11 y
C-17 como la encontrada en discodermolida y análogos
activos.
De acuerdo con la presente invención, los métodos
para inhibir células cancerígenas en un hospedante incluyen poner en
contacto las células tumorales con una cantidad eficaz de las
nuevas composiciones farmacéuticas de la invención. Las células
cancerígenas inhibidas por la invención son aquellas susceptibles a
los presentes compuestos aquí descritos o a composiciones que
comprenden tales compuestos.
Otros aspectos de la invención incluyen la
provisión de métodos para producir los nuevos compuestos y
composiciones.
Otros objetos así como un alcance adicional de la
capacidad de aplicación de la presente invención llegarán a ser
evidentes a partir de la descripción detallada aquí ofrecida; sin
embargo, ha de entenderse que la descripción detallada a la que se
hace referencia, si bien indica modalidades preferidas de la
invención, se ofrece solo a título ilustrativo, puesto que a partir
de dicha descripción llegarán a ser evidentes diversos cambios y
modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención.
La figura 1 muestra la molécula de discodermolida
que puede ser dividida en cinco regiones generales: la región de
lactona y conectora C-1 a C-7, la
primera horquilla C-8 a C-15, la
segunda horquilla C-16 a C-20, el
tieno C-21 a C-24 y el carbamato en
C-19. La actividad de la molécula de discodermolida
varía según la región o regiones modificadas. Los datos de actividad
de la estructura identifican las regiones de horquilla
C-8 a C-15 y C-16 a
C-20 como críticas con respecto a la actividad de la
molécula de discodermolida al proporcionar una relación espacial
óptima para las funcionalidades hidroxilo C-11 e
hidroxilo C-17 encontradas en análogos naturales y
sintéticos y que son esenciales para la inducción de la
polimerización de tubulina y estabilización de la red de
microtúbulos, causando así un bloque en el ciclo celular en el punto
de verificación G_{2}/M. Además, la región de lactona y conectora
C-1 a C-7 proporciona un aceptor de
enlace hidrógeno tal como un grupo carbonilo y la región diénica
C-21 a C-24 sirve para proporcionar
un grupo hidrófobo; estando situadas ambas funcionalidades en la
misma relación espacial, con respecto a los grupos hidroxilo
C-11 y C-17, como la encontrada en
discodermolida y análogos activos.
La figura 2 muestra las estructuras de
discodermolida y de ciertos análogos naturales de discodermolida
(compuestos II-V) de la presente invención.
Las figuras 3A-B muestran las
estructuras de ciertos análogos semi-sintéticos de
discodermolida (compuestos VI-XIV) de la presente
invención.
La figura 4 muestra la inducción de la
polimerización de tubulina cerebral bovina purificada tal como se
determina por el control de los cambios de la densidad óptica a 350
nm durante 61 minutos. Los compuestos fueron ensayados a 10 \muM
con 1 mg/ml de tubulina. La temperatura se varió durante el
transcurso del experimento como sigue: el experimento se comenzó
con una temperatura inicial de 4ºC y se mantuvo durante 1 minuto; la
temperatura se aumentó entonces a 35ºC a una velocidad de 1ºC/min,
se mantuvo a 35ºC durante 1 minuto, se hizo descender a 4ºC a una
velocidad de 2ºC/min y finalmente se mantuvo a 4ºC durante 14
minutos. Las curvas mostradas son para los compuestos:
discodermolida (1); 2-desmetildiscodermolida (II);
19-desaminocarbonildiscodermolida (III);
2-epi-discodermolida (IV); y
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
(VI).
La figura 5 muestra la inducción de la
polimerización de tubulina cerebral bovina purificada tal como se
determina por el control de los cambios de la densidad óptica a 350
nm durante 61 minutos. Los compuestos fueron ensayados a 10 \muM
con 1 mg/ml de tubulina. La temperatura se varió durante el
transcurso del experimento como sigue: el experimento se comenzó
con una temperatura inicial de 4ºC y se mantuvo durante 1 minuto; la
temperatura se aumentó entonces a 35ºC a una velocidad de 1ºC/min,
se mantuvo a 35ºC durante 1 minuto, se hizo descender a 4ºC a una
velocidad de 2ºC/min y finalmente se mantuvo a 4ºC durante 14
minutos. Las curvas mostradas son para discodermolida (I);
8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XII) y
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida
(XIII).
Las figuras 6A-F muestran
histogramas de citómetro de flujo que ilustran los efectos de
ciclos celulares sobre células de adenocarcinoma de pulmón humano
A549 sin tratar versus tratadas:
(6A) - muestra células de control sin tratar;
(6B) - muestra células tratadas con 100 nM de
discodermolida (I);
(6C) - muestra células tratadas con 100 nM de
8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XII);
(6D) - muestra células tratadas con 100 nM de
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida
(XIII);
(6E) - muestra células tratadas 1.000 nM de
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida
(XIII); y
(6F) - muestra células tratadas con 1.000 nM de
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida-3,11,17-triacetato
(XIV).
(XIV).
La presente invención proporciona nuevas
composiciones de compuestos de discodermolida biológicamente activos
que son útiles para la inmunomodulación y/o tratamiento del cáncer.
Más concretamente, los nuevos compuestos, composiciones y métodos
de uso se pueden emplear convenientemente para inhibir el
crecimiento de células tumorales y otras células cancerígenas en un
mamífero hospedante. Tal como aquí se describe, los compuestos de
la presente invención tienen utilidad para emplearse en el
tratamiento de cáncer, como polimerizadores de tubulina y como
agentes para la estabilización de microtúbulos. Más particularmente,
los presentes compuestos se pueden emplear para inhibir en un ser
humano el crecimiento de células tumorales, incluyendo células de
tumores de mama, colon, SNC, ovario, riñón, próstata, hígado,
páncreas, útero o pulmón, así como células de leucemia o melanomas
humanos.
De acuerdo con la invención, los métodos para
inhibir cáncer en un hospedante incluyen poner en contacto las
células cancerígenas con una cantidad eficaz de las nuevas
composiciones farmacéuticas de la invención. Las células tumorales
inhibidas por la invención son aquellas susceptibles a los presentes
compuestos aquí descritos o composiciones que comprenden tales
compuestos.
La presente invención proporciona además métodos
de uso de los nuevos compuestos y composiciones de la invención, por
ejemplo, métodos para mejorar las respuestas inmunológicas y
métodos para inhibir tumores y otras células cancerígenas en un
animal, preferentemente un mamífero. Con suma preferencia, la
invención comprende un método para el tratamiento antitumoral de un
ser humano necesitado de dicho tratamiento, es decir, un ser humano
que hospeda células cancerígenas, incluyendo células tumorales de
mama, colon, hígado, páncreas, útero o pulmón, o bien células de
leucemia. Además de los tipos de células cancerígenas que se han
indicado anteriormente y para las cuales las presentes
discodermolidas y composiciones resultan particularmente útiles,
los presentes compuestos han demostrado también útiles por su
actividad antiproliferativa contra ciertas líneas de células
cancerígenas del SNC, líneas de células de melanomas, líneas de
células cancerígenas de ovario, líneas de células cancerígenas de
riñón y líneas de células cancerígenas de próstata. Cabe esperar,
en base a los modos de acción antiproliferativa particulares aquí
identificados, que otras líneas de células cancerígenas puedan ser
también inhibidas por estos
compuestos.
compuestos.
Los expertos en la materia podrán sintetizar
diversos enantiómeros de las discodermolidas, como se han definido
anteriormente. La discodermolida natural aislada de esponjas
marinas se encuentra predominantemente como el enantiómero (+).
En modalidades preferidas de la invención, los
compuestos son sustancialmente puros, es decir, contienen al menos
95% del compuesto tal como se determina por métodos analíticos ya
establecidos.
Los compuestos de discodermolida y métodos para
la preparación de tales compuestos o composiciones que comprenden
dichos compuestos, se describen en las Patentes US Nos. 4.939.168;
5.010.099; 5.681.847 y 5.840.750 y 6.127.406, las cuales se
incorporan aquí solo con fines de referencia.
Según otros métodos preferidos de la invención,
se preparan sales dentro del alcance de la invención por adición de
ácidos minerales, por ejemplo, HCl, H_{2}SO_{4}, o ácidos
orgánicos fuertes, por ejemplo, fórmico, oxálico, en cantidades
adecuadas para formar la sal de adición de ácido del compuesto
parental o su derivado. Igualmente, se pueden emplear reacciones de
tipo síntesis según procedimientos conocidos para añadir o
modificar varios grupos en los compuestos preferidos y producir así
otros compuestos dentro del alcance de la invención.
El alcance de la invención no queda limitado por
los ejemplos específicos y procedimientos sugeridos y usos aquí
relacionados, puesto que para los expertos en la materia serán
evidentes modificaciones dentro de dicho alcance a partir de la
información ofrecida en esta descripción.
Los análogos son compuestos estructuralmente
relacionados con discodermolida, incluyendo derivados naturales y
sintéticos, metabolitos y compuestos intermedios.
De acuerdo con la presente invención, se ha
determinado que los análogos de discodermolida en donde el lado
izquierdo de la molécula está acetilado en las posiciones
C-3 y C-7, presentan una mayor
citotoxicidad. Esto puede apreciarse, por ejemplo, en el caso de
discodermolida-3-acetato,
discodermolida-7-acetato y
discodermolida-3,7-diacetato. Véase
la Patente US No. 6.127.406. Los análogos con grupos acetilo en la
posición C-11, por ejemplo,
discodermolida-3,11-diacetato y
discodermolida-3,7,11-triacetato,
muestran una menor citotoxicidad en comparación con la molécula
parental, mientras que los compuestos que incluyen una acetilación
en la posición C-17 causan una reducción drástica
en la actividad de los análogos, como se puede apreciar para
discodermolida-3,7,11,17-tetraacetato,
discodermolida-3,7,17-triacetato y
discodermolida-3,17-diacetato. A
partir de estos datos se puede llegar a la conclusión de que los
grupos hidroxilo C-11 y C-17
contribuyen a la citotoxicidad global de la molécula de
discodermolida.
La molécula de discodermolida se puede dividir en
cinco regiones generales: la región de lactona y conectora
C-1 a C-7, la primera horquilla
C-8 a C-15, la segunda horquilla
C-16 a C-20, el dieno
C-21 a C-24 y el carbamato en
C-19 (véase figura 1). La actividad de la molécula
de discodermolida varía de acuerdo con la región o regiones
modificadas. Los datos sobre actividad de la estructura establecen
que las regiones de horquilla C-8 a
C-15 y C-16 a C-20
son críticas respecto a la actividad de la molécula de
discodermolida al proporcionar una relación espacial óptima para las
funcionalidades hidroxilo C-11 e hidroxilo
C-17 encontradas en análogos naturales y sintéticos
que son esenciales para la inducción de la polimerización de
tubulina y estabilización de la red de microtúbulos, causando así
un bloque en el ciclo celular en el punto de verificación
G_{2}/M. Además, la región de lactona y conectora
C-1 a C-7 proporciona un aceptor de
enlace de hidrógeno tal como un grupo carbonilo y la región diénica
C-21 a C-24 sirve para proporcionar
un grupo hidrófobo; estando situadas ambas funcionalidades en la
misma relación espacial con respecto a los grupos hidroxilo
C-11 y C-17 como la encontrada en
discodermolida y análogos activos.
La invención podrá entenderse mejor con
referencia a los siguientes ejemplos específicos de compuestos,
composiciones y métodos de la invención. Los siguientes ejemplos
ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Dichos
ejemplos no deberán ser considerados como limitativos. Todos los
porcentajes son en peso y todas las proporciones de las mezclas
disolventes son en volumen, salvo que se indique otra cosa. Para
los expertos en la materia será evidente que los ejemplos implican
el uso de materiales y reactivos que son comercialmente disponibles
a partir de fuentes conocidas, por ejemplo, casas de suministro de
productos químicos, de manera que no se ofrecen más detalles
respecto a los mismos.
La muestra de esponja,
23-XI-98-3-002,
identificada como Discodermia sp. (HBOI Cat No. 003:00973) fue
recogida por un sumergible tripulado en Lucaya, Grand Bahama
Island, Bahamas (Latitud: 26º 30.727' N Longitud: 78º 35.026' W), a
una profundidad de 515 pies y se guardó a -20ºC hasta la extracción.
La esponja mojada (2.000 g) fue impregnada en etanol (EtOH) y el
extracto etanólico concentrado fue repartido entre acetato de etilo
(EtOAc) y agua (H_{2}O). La fracción soluble en EtOAc fue
cromatografiada sobre gel de sílice empleando un gradiente
escalonado de EtOAc-MeOH como eluyente. Las
fracciones fueron controladas mediante cromatografía de capa
delgada y espectros ^{1}H NMR respecto a la presencia de
discodermolida y análogos de discodermolida. El modelo TLC y el
espectro ^{1}H NMR de la fracción que eluyó con 2,5% de
MeOH/EtOAc reveló la presencia de un análogo de discodermolida
además de discodermolida. Esta fracción tras la purificación
adicional por HPLC (SiO_{2}, 5 \mum, 250 x 10 mm) con 7%
MeOH/CH_{2}Cl_{2} como eluyente proporcionó
2-desmetildiscodermolida como un sólido blanco
(rendimiento: 0,5 mg, 0,00002% en peso húmedo).
2-desmetildiscodermolida:
[\alpha]^{21}D 10,0º (c 0,1, MeOH); IR (neto/NaCl)
\nu_{max} 3374, 1721, 1710, 1323, 1037 cm^{-1}; HRFABMS
(glicerol) m/z 580.3853, \Delta 0,4 mmu para
C_{32}H_{53}NO_{8} (M+H)^{+}. Véase tablas 1 y 2
respecto a los espectros ^{1}H y ^{13}C NMR,
respectivamente.
El espectro ^{1}H NMR de
2-desmetildiscodermolida fue muy similar al de
discodermolida, siendo la principal diferencia la presencia de
resonancias para solo siete grupos metilo en lugar de los ocho
grupos metilo observado para discodermolida. El análisis detallado
del ^{1}H NMR indicó la ausencia de la señal del grupo metilo
C-2 que generalmente aparece campo abajo debido al
despantallamiento por el grupo carbonilo adyacente. El espectro
DEPT mostró la sustitución del carbono metínico C-2
por un carbono metilénico que aparece en 40,3 ppm. El espectro COSY
mostró claramente el acoplamiento de estos nuevos protones
metilénicos observados en 2,25 y 2,56 ppm al hidroxi metino
C-3 observado en 3,95 ppm. Estos datos junto con los
datos del espectro de masas confirmaron la estructura de
2-desmetildiscodermolida.
La muestra de esponja,
23-XI-98-3-001,
identificada como Discodermia sp. (HBOI Cat No. 003:00972) fue
recogida por un sumergible tripulado en Lucaya, Grand Bahama
Island, Bahamas (Latitud: 26º 30.727' N Longitud: 78º 35.026' W), a
una profundidad de 515 pies y se guardó a -20ºC hasta la extracción.
La esponja mojada (2.480 g) fue impregnada en etanol (EtOH) y el
extracto etanólico concentrado fue repartido entre acetato de etilo
(EtOAc) y agua (H_{2}O). La fracción soluble en EtOAc fue
cromatografiada sobre gel de sílice EtOAc-MeOH como
eluyente. Las fracciones fueron controladas mediante cromatografía
de capa delgada y espectros ^{1}H NMR respecto a la presencia de
discodermolida y análogos de discodermolida. El espectro ^{1}H
NMR de la fracción que eluyó con 0-2% de MeOH/EtOAc
reveló la presencia de un análogo de discodermolida además de
discodermolida. Esta fracción tras la purificación adicional por
HPLC (SiO_{2}, 5 \mum, 250 x 10 mm) con 6%
MeOH/CH_{2}Cl_{2} como eluyente, seguido por HPLC en la misma
columna empleando MeOH/CH_{2}Cl_{2}proporcionó
19-desmetildiscodermolida como un sólido blanco
(rendimiento: 1,1 mg, 0,00006% en peso húmedo).
19-desmetildiscodermolida:
[\alpha]^{21}D 18,2º (c 0,1, MeOH); IR (neto/NaCl)
\nu_{max} 3393, 1103, 1030 cm^{-1}; HRFABMS (glicerol) m/z
551.3937, \Delta 1,0 mmu para C_{32}H_{54}O_{7}
(M+H)^{+}. Véase tablas 1 y 2 respecto a los espectros
^{1}H y ^{13}C NMR, respectivamente.
El espectro ^{1}H NMR de
19-desaminocarbonildiscodermolida fue casi idéntico
al de discodermolida. El espectro ^{1}H NMR indicó la ausencia de
la señal característica de dos protones para el grupo
aminocarbonilo que aparece como una señal amplia en 5,05 ppm en
discodermolida. El protón de aminocarboniloxi metino que aparece en
4,71 ppm en discodermolida mostró un desplazamiento de campo arriba
a 3,41 ppm, indicando ello la presencia de un protón típico de
hidroxi metino sustituido en lugar de un protón de aminocarboniloxi
metino en la posición C-19. El espectro ^{13}C NMR
mostró la ausencia de una señal correspondiente al carbono
aminocarboniloxi que aparece en 158,4 ppm en discodermolida. Estos
datos junto con los datos del espectro de masas, confirmaron la
estructura de
19-desaminocarbonil-discodermolida.
(Ejemplo de
referencia)
La muestra de esponja,
23-XI-98-1-005,
identificada como Discodermia sp. (HBOI Cat No. 003:00971) fue
recogida por un sumergible tripulado en Bell Channel Buoy, Grand
Bahama Island, Bahamas (Latitud: 26º 30.662' N Longitud: 78º 34.976'
W), a una profundidad de 482 pies y se guardó a -20ºC hasta la
extracción. La esponja mojada (1.931 g) fue impregnada en etanol
(EtOH) y el extracto etanólico concentrado fue repartido entre
acetato de etilo (EtOAc) y agua (H_{2}O). La fracción soluble en
EtOAc fue cromatografiada sobre gel de sílice con CH_{2}Cl_{2}
seguido por un gradiente EtOAc-MeOH. Las fracciones
fueron controladas mediante cromatografía de capa delgada y
espectros ^{1}H NMR respecto a la presencia de discodermolida y
análogos de discodermolida. La fracción que eluyó con 5% de
MeOH/EtOAc reveló la presencia de un análogo de discodermolida que
tras la purificación adicional por HPLC (SiO_{2}, 5 \mum, 250 x
10 mm) con 6% MeOH/CH_{2}Cl_{2} como eluyente proporcionó
2-desmetildiscodermolida como un sólido blanco
(rendimiento: 0,3 mg, 0,00001% en peso húmedo).
2-epidiscodermolida:
[\alpha]^{21}D 10,7º (c 0,1, MeOH); IR (neto/NaCl)
\nu_{max} 3394, 1720, 1041, 1028 cm^{-1}; HRFABMS (alcohol
nitrobencílico) m/z 594.4003, \Delta 0,2 mmu para
C_{33}H_{55}NO_{8} (M+H)^{+}. Véase tablas 1 y 2
respecto a los espectros ^{1}H y ^{13}C NMR,
respectivamente.
Los espectros ^{1}H y ^{13}C NMR de
2-epidiscodermolida fueron muy similares a los de
discodermolida e indicaron pequeñas diferencias en cuanto a
desplazamiento químico y constante de acoplamiento alrededor de la
funcionalidad lactona. El espectro NOESY de discodermolida muestra
correlaciones entre el C-2 Me y C-3
H, el C-2 H y C-3 H, el
C-4 Me y C-3 H y el
C-3 H y C-4 H, todas ellas de
acuerdo con la estructura registrada en donde existe un metilo
axial en C-2, un hidroxilo axial en
C-3 y un metilo ecuatorial en C-4.
El espectro NOESY de 2-epidiscodermolida mostró
correlaciones entre el C-2-Me y
C-3-H, el
C-2-H- y
C-4-H, el
C-4-Me y
C-3-H y el
C-3-H y
C-4-H. La fuerte correlación NOE
entre C-2-H y
C-4-H indicó la disposición diaxial
uno-tres de estos hidrógenos. Estos datos
confirmaron que el C-2-Me, que tiene
una disposición axial en discodermolida, ha saltado a una
disposición ecuatorial en 2-epidiscodermolida. Los
datos anteriores junto con los datos del espectro de masas de alta
resolución confirmaron la estructura de
2-epidiscodermolida.
La muestra de esponja Discodermia sp.
(23-XI-98-1-003,
HBOM Catálogo Número 003:00970) fue recogida el 23 de noviembre de
1998 por un sumergible tripulado en Bell Channel Bouy, Grand Bahama
Islands, Bahamas, (Lat. 26º 30.662' N; Long. 78º 34.976' W) a una
profundidad de 493 pies y se guardó a -20ºC hasta la extracción. La
esponja mojada (3.570 g) se impregnó en EtOH y el extracto
etanólico concentrado se repartió entre EtOAc y H_{2}O. La
fracción soluble en EtOAc fue cromatografiada sobre gel de sílice
con un gradiente de MeOH/EtOAc y las fracciones se controlaron
mediante cromatografía de capa delgada y espectros ^{1}H NMR para
discodermolida y análogos de discodermolida. El espectro ^{1}H NMR
de la fracción que eluyó con 0,2% de MeOH/EtOAc mostró la presencia
de un análogo de discodermolida además de discodermolida. Esta
fracción tras la purificación adicional por HPLC (SiO_{2}, 5
\mum, 250 x 10 mm) con 7% MeOH/CH_{2}Cl_{2} seguido por HPLC
con 4% MeOH/CH_{2}Cl_{2} proporcionó metildiscodermolato como
un sólido blanco (1,1 mg, rendimiento: 0,00003% de peso en húmedo).
Metildiscodermolato: [\alpha]^{21}D 14,6º (c 0,1, MeOH);
IR (neto/NaCl) \nu_{max} 3361, 1710, 1393, 1046
cm-1; HRFABMS (glicerol) m/z 626.4252, D 1.6 mmu
para C_{34}H_{59}NO_{9} (M+H)^{+}. Véase la tabla 3
respecto a los espectros ^{1}H y ^{13}C NMR.
El espectro ^{1}H NMR de metildiscodermolato,
como cabía esperar, fue muy similar al de discodermolida. El
espectro ^{1}H NMR mostró un singlete adicional de tres protones
para un grupo metoxi en 3,63 ppm. El protón de lactona
C-5 que aparece en 4,46 ppm en discodermolida se ha
desplazado campo arriba a 3,90 ppm, indicando ello la presencia de
un grupo hidroxi en esta posición. El espectro ^{13}C NMR mostró
un desplazamiento campo arriba de 4,6 ppm para C-5 y
una señal en 52,2 ppm característica de un grupo metoxi. El
espectro INAPT mostró una correlación de tres enlaces de los
protones metoxi al carbonilo del éster en 176,7 ppm. Estos datos
junto con los datos del espectro de masas confirmaron la estructura
del éster metílico de discodermolida.
Se trató
discodermolida-3-acetato (2,4 mg),
preparado como se describe en la Patente US No. 6.127.406, con 2 ml
de Na_{2}CO_{3} acuoso saturado en EtOH (1:9) y la mezcla se
agitó durante 24 horas. El disolvente se concentró por destilación
bajo presión reducida y el producto se repartió entre EtOAc y
H_{2}O. La fracción soluble en EtOAc se concentró y el residuo,
después de la purificación por HPLC (SiO_{2}, 5 \mum, 250 x 10
mm) con 4,5% MeOH/CH_{2}Cl_{2} como eluyente proporcionó
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
como un sólido blanco (1,2 mg, rendimiento 50%).
Los espectros ^{1}H y ^{13}C NMR de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
(tablas 4 y 6, respectivamente) fueron similares a los observados
para discodermolida. El espectro ^{1}H NMR indicó señales para
ocho grupos metilo. Sin embargo, mostró la presencia de dos
singletes de metilo vinílico en comparación con un metilo vinílico
en discodermolida. La comparación del espectro ^{1}H NMR de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
con el de discodermolida indicó que el doblete de metilo campo
abajo correspondiente al C-2-Me en
discodermolida ha sido cambiado a un grupo metilo vinílico en
3-deoxi-2\Delta-discodermolida.
El espectro ^{1}H-^{1}H COSY indicó el
acoplamiento entre el metilo vinílico en 1,88 ppm con el singlete
olefínico amplio recientemente formado, observado en 6,33 ppm.
Aunque no se apreció un acoplamiento entre el singlete olefínico en
6,33 ppm y el C-4-H observado en
2,44 ppm, la naturaleza alílica del último protón estableció la
posición de la nueva insaturación. El resto del espectro ^{1}H NMR
fue idéntico al de discodermolida. Los datos del espectro COSY
fueron empleados para asignar los valores de desplazamiento químico
para todos los protones del compuesto. Estos datos confirmaron la
estructura de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida.
Se trató
discodermolida-3,7,11,17-tetraacetato
(4,0 mg), preparado como se describe en la Patente US No.
6.127.
406, con 2 ml de Na_{2}CO_{3} acuoso saturado en EtOH (1:9) y la mezcla se agitó a 40ºC durante 4 horas. El disolvente se concentró bajo presión reducida y el producto se repartió entre EtOAc y H_{2}O. La fracción soluble en EtOAc fue concentrada y el residuo, después de la purificación por HPLC (SiO_{2}, 5 \mum, 250 x 10 mm, con 3,5% MeOH/CH_{2}Cl_{2} como eluyente) proporcionó 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-17-acetato (1,0 mg) como un sólido blanco y 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato como un sólido blanco (2,0 mg).
406, con 2 ml de Na_{2}CO_{3} acuoso saturado en EtOH (1:9) y la mezcla se agitó a 40ºC durante 4 horas. El disolvente se concentró bajo presión reducida y el producto se repartió entre EtOAc y H_{2}O. La fracción soluble en EtOAc fue concentrada y el residuo, después de la purificación por HPLC (SiO_{2}, 5 \mum, 250 x 10 mm, con 3,5% MeOH/CH_{2}Cl_{2} como eluyente) proporcionó 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-17-acetato (1,0 mg) como un sólido blanco y 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato como un sólido blanco (2,0 mg).
El espectro ^{1}H NMR de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-17-acetato
(tabla 5) se asemejaba estrechamente al de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
(tabla 4) y
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato
(tabla 4). Sin embargo, el espectro indicó la presencia de un grupo
acetilo en 2,07 ppm implicando ello que tres grupos acetilo han
experimentado hidrólisis durante la reacción. La presencia del
metilo vinílico en 1,88 ppm junto con el singlete olefínico en 6,32
indicó la presencia de la funcionalidad
3-deoxi-2\Delta tal como en
3-deoxi-2\Delta-discodermolida.
El desplazamiento de campo arriba de
C-7-H (observado a 4,72 ppm) en
0,89 ppm y de C-11-H (observado a
3,12 ppm) en 1,49 ppm, cuando se comparan con
C-7-H y
C-11-H de
discodermolida-tetraacetato, estableció la ausencia
de grupos acetilo en estas posiciones. El resto del espectro ^{1}H
se asemejaba al de
discodermolida-3,7,11,17-tetraacetato.
El análisis cuidadoso del espectro COSY asignó los valores de
desplazamiento químico para los restantes protones del compuesto.
Los datos de ^{13}C NMR se ofrecen en la tabla 6. Estos datos
confirmaron la estructura de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-17-acetato.
El espectro ^{1}H NMR de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato
(tabla 4) se asemejaba estrechamente al de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
(tabla 4). Sin embargo, el espectro indicó la presencia de dos
grupos acetilo observados en 2,08 y 2,04 ppm, implicando ello que
dos grupos acetilo han experimentado hidrólisis durante la
reacción. la presencia del metilo vinílico en 1,88 ppm junto con el
singlete olefínico en 6,32 indicó la presencia de la funcionalidad
3-deoxi-2\Delta tal como en
3-deoxi-2\Delta-discodermolida.
El desplazamiento campo arriba de
C-7-H (observado a 4,66 ppm) en 0,95
ppm, cuando se comparó al C-7-H de
discodermolida-tetraacetato (observado a 5,61 ppm)
estableció la ausencia de un grupo acetilo en esta posición. El
resto del espectro ^{1}H se asemejaba al de
discodermolida-3,7,11,17-tetraacetato.
El análisis cuidadoso del espectro COSY asignó los valores de
desplazamiento químico para los restantes protones del compuesto.
Estos datos confirmaron la estructura de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se disolvió
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato
(1,0 mg) en piridina seca (0,5 ml) y se trató con 20 ml de anhídrido
acético. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas.
La destilación del disolvente bajo presión reducida proporcionó
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7,11,17-triacetato
como un sólido blanco (1,0 mg, rendimiento: 100%). El espectro
^{1}H NMR de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7,11,17-triacetato
(tabla 5) se asemejaba estrechamente al de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato
(tabla 4). El espectro ^{1}H indicó la presencia de tres grupos
acetilo observados en 2,08, 2,01 y 1,99 ppm, indicando ello la
acetilación del grupo C-7-OH de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato.
La presencia del metilo vinílico en 1,88 ppm junto con el singlete
olefínico en 6,30 ppm indicó la presencia de la funcionalidad
3-deoxi-2\Delta tal como en
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato.
El desplazamiento campo abajo de
C-7-H a 5,64 ppm desde 4,66 ppm en
el compuesto de partida, indicó la acetilación del grupo
C-7-OH. Las restantes señales del
espectro ^{1}H se asemejaban a las de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11-17-diacetato.
Los valores de desplazamiento químico para los restantes protones
fueron asignados por análisis del espectro COSY del compuesto. Los
datos de ^{13}C NMR se ofrecen en la tabla 6. Estos datos
confirmaron la estructura de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7,11,17-triacetato.
Se trató
discodermolida-3,7,11-triacetato
(3,0 mg) con 2 ml de Na_{2}CO_{3} acuoso saturado en EtOH (1:9)
y la mezcla se agitó a 25ºC durante 24 horas. El disolvente se
separó por destilación bajo presión reducida y el residuo se
repartió entre CH_{2}Cl_{2} y H_{2}O. La fracción soluble en
CH_{2}Cl_{2} se concentró y el residuo tras la purificación por
HPLC (SiO_{2}, 5 \mum, 250 x 10 mm) usando 2,5%
MeOH/CH_{2}Cl_{2} como eluyente proporcionó
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11-acetato
como un sólido blanco y como el principal producto (1,5 mg).
El espectro ^{1}H NMR de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11-acetato
(tabla 5) se asemejaba estrechamente al de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
(tabla 4). El espectro ^{1}H indicó la presencia de un grupo
acetilo observado en 2,08 ppm, indicando ello un producto
monoacetilado. La comparación del espectro ^{1}H NMR de este
compuesto con el de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
indicó la presencia de un acetato en C-11. El
protón de acetoxi metina C-11-H
apareció en 4,72 ppm indicando ello un desplazamiento campo abajo
de 1,55 ppm en comparación con el observado para
C-11-H en
3-deoxi-2\Delta-discodermolida.
Las restantes señales en el espectro ^{1}H se asemejaban a las de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida.
El análisis del espectro COSY alcanzó los valores de desplazamiento
químico para todos los protones del compuesto. Los datos de ^{13}C
NMR se ofrecen en la tabla 6. Estos datos confirmaron la estructura
de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11-acetato.
Se disolvió discodermolida (10 mg) en 4 ml de
piridina seca y se trató con 2 mg de anhídrido succínico. La mezcla
se agitó a temperatura ambiente durante 1 semana y luego a 40ºC
durante otra semana. El disolvente se evaporó bajo una corriente de
nitrógeno para proporcionar un sólido blanco (0,10 mg). La mezcla se
separó mediante HPLC empleando una columna
semi-prep de SiO_{2} (columna Phenomenex Luna, 5
\mu, 250 x 10 mm) con 7% MeOH en CH_{2}Cl_{2} como eluyente
para proporcionar tres fracciones: una mezcla no polar;
2-epidiscodermolida (0,1 mg); y discodermolida sin
reaccionar (5 mg). La mezcla no polar se volvió a cromatografiar
por HPLC empleando una columna semi-prep de
SiO_{2} (columna Phenomenex Luna, 5 \mu, 250 x 10 mm) con 5%
MeOH en CH_{2}Cl_{2} como eluyente para proporcionar tres
fracciones: una segunda mezcla no polar,
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
(2 mg) y
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7-succinato
(1 mg).
La comparación de los datos de ^{1}H y ^{13}C
NMR de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7-succinato
(tabla 7) con aquellos de
3-deoxi-2\Delta-discodermolida
(tabla 4) revelaron estrechas similitudes e indicaron la posible
deshidratación del grupo hidroxilo C-3 durante la
reacción. La ausencia del doblete de metilo C-25 así
como del protón de hidroxi metina
C-3-H junto con la observación de un
nuevo grupo metilo olefínico (\delta 1,80, 3H, s) y un protón
olefínico (\delta 6,40, 1H, s) en los espectros de este compuesto
confirmó este supuesto. La presencia de dos grupos carbonilo
adicionales (\delta 173,8, s; 172,3, s) y dos grupos metileno
adicionales (\delta 2,51, 4H, m; 13C \delta 30,0, t; 29,2, t)
sugirió la formación del succinato. El desplazamiento de campo abajo
del protón de 7-hidroximetina observado en 5,68
ppm, comparado con 4,76 ppm en
3-deoxi-2\Delta-discodermolida,
confirmó la estructura como
3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7-succinato.
Se disolvió discodermolida (34,0 mg) en EtOH (20
ml) y se hidrogenó con H_{2} en presencia de catalizador de
PtO_{2} durante 0,5 horas bajo la presión de balón. El
catalizador se separó por filtración y la solución resultante se
concentró bajo una corriente de N_{2} para proporcionar una
mezcla de productos hidrogenados. La mezcla se separó mediante HPLC
empleando una columna semi-prep de SiO_{2}
(Phenomenex, 5 \mu, 250 x 10 mm) con 7% MeOH en CH_{2}Cl_{2}
como eluyente para proporcionar
8,21,23-hexahidrodiscodermolida (9,0 mg);
[\alpha]^{21}D -29,20º (c 1,2, MeOH) y
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida
(2,3 mg); [\alpha]^{21}D -19,8º (c 0,3, MeOH). Las
tablas 8 y 9 siguientes muestran los datos de ^{1}H y ^{13}C NMR
para estos dos análogos, respectivamente.
Se disolvió
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida
(2 mg) en 0,5 ml de piridina seca y se trató con 2 \mul de
anhídrido acético. La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante la noche. El disolvente se evaporó bajo una corriente de
nitrógeno para proporcionar un sólido blanco (0,2 mg). La mezcla se
separó mediante HPLC empleando una columna
semi-prep de SiO_{2} (columna Phenomenex Luna, 5
\mu, 250 x 10 mm) con 3% MeOH en CH_{2}Cl_{2} como eluyente
para proporcionar
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida-3,11,17-triacetato
puro (1,5 mg). Los datos de ^{1}H NMR para este compuesto se
muestran en la tabla 10.
Se analizaron discodermolida y análogos de
discodermolida respecto a sus efectos sobre la proliferación de
líneas de células de adenocarcinoma humano A549 y de leucemia
murínica P388. Las células P388 fueron obtenidas en Dr. R. Camaller,
National Cancer Institute, Bethesda, MD y las células A549 fueron
obtenidas en American Type Cultura Collection, Rockville, MD. Todas
las líneas celulares se mantuvieron en medio de cultivo de tejido
(TCM; Roswell Park Memorial Institute RPMI 1460 suplementado con
100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 60 mg/ml de
1-glutamina, 18 mM de HEPES, 0,05 mg/ml de
gentamicina (Life Technologies, Gaithersburg, MD) y 10% de suero
bovino fetal) y se cultivaron en matraces de plástico para el
cultivo de tejido a 37ºC en aire humidificado que contiene 5% de
CO_{2}. Cada 2-3 días, cultivos madre de células
P388 fueron subcultivados 1:20 en TFM nuevo. Cada
3-4 días, cultivos madre de células A549 fueron
subcultivados 1:10. Para evaluar los efectos antiproliferativos de
los agentes contra las células, se establecieron cultivos de 200 ml
(placas de cultivo de tejido de 96 pocillos, Nunc, Denmark) en 1 x
10^{5} células/ml en TFM o TFM conteniendo el agente de ensayo a
0,03-5,0 \mug/ml. Después de exposiciones de 48
horas, las células P388 fueron enumeradas empleando bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltrazolio
(MTT) como se describe en la bibliografía al respecto (M.C. Alley,
et al., Cancer Res. 48:589, 1988). Las células A549 fueron
enumeradas de la misma manera después de una exposición de 72
horas. Los resultados fueron expresados como un porcentaje de
inhibición en comparación con el control negativo (sin fármaco).
Para controlar la sensibilidad al fármaco de la línea celular, se
incluyeron controles positivos (con fármaco) de diluciones
variables de 5-fluoruracilo y adriamicina (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO).
Para cuantificar los efectos sobre la
proliferación resultante y los valores IC_{50} resultantes, se
añaden a cada pocillo 75 ml de medio de crecimiento caliente que
contiene 5 mg/ml de MTT, se retornan los cultivos al incubador y se
dejan en reposo durante 3 horas. Para cuantificar
espectrofotométricamente la formación de formazano reducido, se
centrifugan las placas (500 x g, 10 minutos), se separan los fluidos
de cultivo por aspiración y se añaden, por pocillo, 200 \mul de
isopropanol acidificado (2 ml de HCl concentrado/l de isopropanol).
Se mide la absorbancia de las soluciones resultantes en un lector
de placas (TECAN Spectra SLT; TECAN U.S. Research Triangle Plark,
NC) a 570 nm y con un filtro de referencia de 650 nm. La
absorbancia de los pocillos de ensayo se divide por la absorbancia
de los pocillos libres de fármaco y la concentración de agente que
se traduce en un 50% de la absorbancia de los cultivos sin tratar
(IC_{50}) se determina por regresión lineal de datos
logia-transformados (D.J. Finney, Statistical Method
in Biological Assay, third ed., pp. 316-348,
Charles Griffin Co., London, 1978). De forma rutinaria se ha
observado una relación lineal entre el número de células tumorales y
la producción de formazano en el intervalo de densidades celulares
observadas en estos experimentos. Los dos controles de fármaco
estándar (indicados anteriormente) se incluyen en cada ensayo como
verificación para controlar la sensibilidad al fármaco de cada una
de las líneas celulares y se determinan los valores IC_{50} para
cada combinación de fármaco-células.
En la tabla 11 puede encontrarse un resumen de
los resultados de estos ensayos en comparación con discodermolida
(I) para los compuestos II-V. Los resultados para
los compuestos VI-XIV pueden encontrarse en la tabla
12.
Se evaluaron discodermolida y análogos de
discodermolida con respecto a sus efectos sobre la morfología de la
red de microtúbulos de células, empleando anticuerpo monoclonal de
ratón anti-alfa-tubulina. Las
células tratadas con discodermolida exhiben de forma rutinaria la
formación anormal de múltiples microtúbulos de radiación centriolar
con extensivos racimos de "paquetes" microtubulares asociados,
al contrario que la "malla" fina de microtúbulos individuales
que constituyen la red citoesquelética en las células de control
sin tratar.
En el día uno, se cultivaron 7 x 10^{4} células
tumorales de adenocarcinoma humano A549 adherentes en TCM, durante
la noche a 37ºC en 5% de CO_{2} sobre cubreobjetos de 22 mm^{2}
en placas de microvaloración de 6 pocillos. En el día dos, se
retiró TCM y se sustituyó por 10-1.000 nM de
discodermolida o análogo en TCM o TCM sin fármaco (control) y se
incubó durante la noche a 37ºC en 5% de CO_{2}. En el día tres,
se retiró TCM y las células unidas a los cubreobjetos se fijaron con
una solución de formaldehído al 3,7% en PBS de Dulbecco durante 10
minutos a temperatura ambiente. Las células fueron peneabilizadas
con una solución de Triton X-100 al 2%, 2 ml por
pocillo, durante 5 minutos a temperatura ambiente y lavadas dos
veces en PBS de Dulbecco antes de la tinción.
A cada pocillo que contiene células unidas a los
cubreobjetos, se añadió un volumen de 2 ml de anticuerpo monoclonal
de ratón anti-alfa-tubulina (Cat#
T-5168, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) diluido
1:1.000 en salina tamponada con fosfato de Dulbecco
(D-PBS) y las células se incubaron a temperatura
ambiente durante 45 minutos. Los cubreobjetos se enjuagaron una vez
con D-PBS. Se añadió un volumen de 2 ml de
anticuerpo conjugado IgG-FITC de
cabra-anti-ratón (Cat#
T-5262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) diluido
1:1.000 en D-PBS y las células se incubaron a
temperatura ambiente durante 45 minutos. Los cubreobjetos fueron
enjuagados una vez en D-PBS y el DNA fue teñido con
0,02 mg/ml de yoduro de propidio junto con 0,1 mg/ml de ribonucleasa
A (RNAsa) A en D-PBS a 37ºC durante 30 minutos. Los
cubreobjetos fueron enjuagados tres veces con agua destilada
estéril, secados al aire y montados en portaobjetos con solución
anti-decolorante SlowFade™ (Molecular Probes,
Eugene, OR) y observados al microscopio empleando iluminación de
epifluorescencia respecto a la presencia de formaciones anormales de
ásteres y paquetes de microtúbulos.
En la tabla 11 puede encontrarse un resumen de
los resultados de este ensayo en comparación con discodermolida (I)
para los compuestos II-V. Los resultados para los
compuestos VI-XIV pueden encontrarse en la tabla
12.
La polimerización de tubulina cerebral bovina
purificada (Cytoskeleton Inc., Denver, CO) fue seguida mediante los
cambios en la densidad óptica de soluciones de tubulina a 350 nm en
un espectrofotómetro Hitachi U-3010 equipado con un
porta-células electrónico termostatazo
SPR-10. Se diluyeron soluciones madre de tubulina en
hielo en tampón G-PEM (1 mM GTP, 80 mM PIPES, 1 mM
EGTA, 0,5 mM cloruro de magnesio; pH 6,8) a una concentración final
de 1 mg/ml. El instrumento se puso a cero en esta solución a 4ºC.
Se añadieron entonces discodermolida, y sus análogos, a la solución
de tubulina hasta una concentración final de 10 \muM, se mezcló
rápidamente y se controló la absorbancia durante un periodo de 61
minutos. En el plazo de este tiempo, la temperatura del
porta-células termoeléctrico se mantuvo en 4ºC
durante 1 minuto, se aumentó a 35ºC a una velocidad de 1ºC/min, se
redujo de nuevo a 4ºC a una velocidad de 2ºC/min y se mantuvo a 4ºC
durante 14 minutos más.
En la tabla 11 puede encontrarse un resumen de
los resultados de este ensayo en comparación a discodermolida (I)
para los compuestos II-V. Los resultados para los
compuestos VI-XIV pueden encontrarse en la tabla 12.
La figura 4 muestra las curvas de polimerización para los
compuestos I-IV y VI. La figura 5 muestra las curvas
de polimerización para los compuestos I, XII y XIII.
Se iniciaron estudios del ciclo celular con el
fin de localizar con precisión una fase específica dentro del ciclo
celular en donde los análogos de discodermolida estuvieran
ejerciendo su efecto antiproliferativo. Como blancos de los ciclos
celulares se emplearon células de pulmón humano A549, para comparar
los efectos de discodermolida y análogos de discodermolida sobre la
perturbación del ciclo celular. Se efectuaron análisis del ciclo
celular como sigue: las células A549 fueron incubadas a 37ºC en 5%
de CO_{2} en aire en presencia o ausencia de concentraciones
variables de discodermolida o análogos de discodermolida durante 24
horas. Las células fueron recogidas, fijadas en etanol, lavadas y
teñidas con 0,2 mg/ml de yoduro de propidio (P.I.) junto con 0,1
mg/ml de RNAsa A. Los preparados teñidos fueron analizados en un
citómetro de flujo Coulter EPICS ELITE con excitación de 488 nM. Se
recogieron las mediciones de fluorescencia y los histogramas de DNA
resultantes a partir de al menos 10.000 células teñidas con P.I. a
una longitud de onda de emisión de 690 nM. Los datos de los
histogramas en bruto fueron analizados adicionalmente empleando un
programa de análisis de ciclos celulares (Multicycle, Phoenix Flow
Systems).
En la tabla 11 puede encontrarse un resumen de
los resultados de este ensayo en comparación con discodermolida (I)
para los compuestos II-V. Los resultados para los
compuestos VI-XIV pueden encontrarse en la tabla 12.
Las figuras 6A-F muestran ejemplos de los
histogramas citométricos de flujo observados para células de control
sin tratar y compuestos I, XII, XIII y XIV.
Empaquetamiento de microtúbulos en células
tumorales humanas A549: a 1.000 nM, los cambios morfológicos
fueron equivalentes a los observados en células expuestas a 1.000
nM de discodermolida. Estaban presentes muchas menos células que en
la muestra de control de disolvente. La mayoría de las células
estaban redondeadas con un extensivo empaquetamiento de
microtúbulos. Las células no redondeadas mostraron que la mayoría
de la matriz de microtúbulos estaba condensada en forma de paquetes
perinucleares. Se produjo poca polinucleación o evidencia
morfológica de células que experimentan apoptosis. A 100 nM, los
efectos morfológicos apreciados fueron similares a aquellos de las
células expuestas a 20-50 nM de discodermolida. Se
observó cierto empaquetamiento de microtúbulos periféricos delgados
o cortos. La característica de micronucleación de apoptosis fue
extensiva y muchas células tenían múltiples formaciones de aster.
Además, muchas células tenían una morfología delgada y alargada que
no era característica del tratamiento con discodermolida.
Polimerización de tubulina: Este análogo
indujo la polimerización de tubulina a partir de 9ºC
aproximadamente. La tubulina polimerizada era estable a 4ºC. Este
compuesto mostró efectos casi equivalentes a aquellos del compuesto
parental discodermolida, puesto que la adición de discodermolida
causó solo un pequeño incremento en la densidad óptica.
Efecto sobre el ciclo celular: Este
compuesto indujo efectos apoptóticos muy fuertes (pico
sub-G_{1}) así como un incremento del porcentaje
de células que residen en la fase G_{2}/M del ciclo celular.
Estas actividades biológicas se resumen en la
tabla 11.
Empaquetamiento de microtúbulos en células
tumorales humanas A549: A 1.000 nM, estaban presentes menos
células que en el grupo de control negativo. La mayoría de las
células estaban redondeadas y se levantaban de la superficie y con
frecuencia tenían múltiples formaciones de aster. Las restantes
células tenían una cantidad moderada de empaquetamiento de
microtúbulos el cual tendió a asumir una posición central y
perinuclear. Se produjo cierta polinucleación, así como degradación
nuclear indicativa de apoptosis, pero nunca fue extensiva. Los
cambios morfológicos fueron equivalentes a aquellos inducidos por
50-100 nM de discodermolida. A 100 nM, estaban
presentes más células que en el grupo de 1.000 nM, pero menos que
en el control negativo. Se produjo cierto empaquetamiento de
microtúbulos que tendió a ser periférico, radiante y con frecuencia
de longitudes más cortas que las observadas con concentraciones de
100 nM de discodermolida. La polinucleación así como la degradación
nuclear indicativa de apoptosis fueron ambas extensivas a través de
esta población de células. También se encontraron fácilmente
células con múltiples formaciones de aster. Los cambios morfológicos
fueron equivalentes a los inducidos por 10-20 nM de
discodermolida.
Polimerización de tubulina: Este análogo
indujo bajos niveles de polimerización de tubulina comenzando a 25ºC
aproximadamente. La polimerización máxima fue de solo
30-50% respecto a la inducida por discodermolida y
los polímeros fueron relativamente estables cuando la muestra se
mantuvo a 4ºC.
Efectos sobre el ciclo celular: Fuerte
apoptosis; bloque G_{2}/M moderado.
Dichas actividades biológicas se resumen en la
tabla 11.
Empaquetamiento de microtúbulos en células
tumorales humanas A549: A 1.000 nM, los cambios morfológicos
respecto a estas células fueron aproximadamente equivalentes a los
de 20 nM de discodermolida. Se observó alguna polimerización
pequeña, periférica, de la matriz de microtúbulos, pero la misma no
fue extensiva. La micronucleación característica de apoptosis fue
bastante más grande que la ocurrida en las células de control de
disolvente. Se presentó un número grande de células con múltiples
formaciones de aster. A 100 nM, la mayoría de las células se
parecían a la muestra de control negativa. No se produjo
empaquetamiento de la matriz de microtúbulos y no se observaron
cambios en la distribución o morfología celular. Se encontraron unas
cuantas células con múltiples formaciones de aster, pero ello
constituyó menos del 10% de la población que experimenta mitosis.
No se produjo ningún incremento notable en la aparición de células
polinucleadas o de aquellas con los cambios morfológicos
indicativos de apoptosis.
Polimerización de tubulina: Este análogo
indujo bajos niveles de polimerización de tubulina comenzando en
12ºC aproximadamente. La polimerización máxima fue de solo
30-50% respecto de la inducida por discodermolida y
los polímeros fueron relativamente estables cuando la muestra se
mantuvo a 4ºC.
Efectos sobre el ciclo celular: Apoptosis
y bloque G_{2}/M débil.
Dichas actividades biológicas se resumen en la
tabla 11.
Empaquetamiento de microtúbulos en células
tumorales humanas A549: A 1.000 nM, las células aparecían
aplanadas con núcleos individuales; los microtúbulos estaban
dispuestos según una malla fina sin empaquetamiento alguno,
múltiples ásteres o polinucleación. A 100 nM y 10 nM, la apariencia
morfológica era indistinguible de aquella de las células sin tratar
(control).
Polimerización de tubulina: Debido a la
similitud de las células tratadas con respecto a las de control, no
se ensayó la polimerización de tubulina purificada.
Efectos sobre el ciclo celular: A la
concentración más alta ensayada (3.000 nM), no se apreciaron efectos
sobre el ciclo celular. Realmente apareció una ligera inducción de
apoptosis y una indicación de necrosis general. A 1.000 nM, 100 nM
y 10 nM, los efectos eran indistinguibles respecto de las células
sin tratar (control).
Dichas actividades biológicas se resumen en la
tabla 12.
Empaquetamiento de microtúbulos en células
tumorales humanas A549: Se presentaron menos células que en los
grupos de control o tratados con discodermolida tanto en 1.000 nM
como en 100 nM. El empaquetamiento de microtúbulos resultó evidente
a ambas concentraciones ensayadas, si bien no fue tan extensivo como
en el caso de discodermolida a estas mismas concentraciones. La
mayoría de las células estaban redondeadas y presentaban múltiples
ásteres, o bien estaban en la fase mitótica del ciclo celular.
Entre las pocas células que se encontraban adheridas y esparcidas,
no se puso de manifiesto realmente un incremento importante en la
micronucleación característica de la apoptosis. Los paquetes que se
habían formado se encontraban frecuentemente curvados a lo largo de
la periferia de las células.
Polimerización de tubulina: La
8,21,23-hexahidrodiscodermolida indujo una fuerte
polimerización de tubulina comenzando en 16ºC aproximadamente. La
polimerización máxima fue de alrededor de 80% de aquella inducida
por discodermolida y los polímeros eran relativamente estables
cuando la muestra se mantuvo a 4ºC. Esto se muestra en la figura
5.
Efectos sobre el ciclo celular: A 100 nM
se presentó un pequeño porcentaje de incremento en las células
acumuladas en la fase G_{2}/M. Esta concentración indujo un alto
porcentaje de apoptosis. Esto se muestra en la figura 6C.
Dichas actividades biológicas se resumen en la
tabla 12.
Empaquetamiento de microtúbulos en células
tumorales humanas A549: A 10 nM, no se apreció ningún efecto
visible sobre la matriz de microtúbulos y únicamente se observó
células ocasionales con múltiples formaciones de ásteres. Las
células expuestas a 100 nM del análogo presentaban efectos
comparables a los de las células expuestas a 10 nM de
discodermolida. Un alto porcentaje de células de la fase M tenían
múltiples formaciones de ásteres, pudiéndose ver una pequeña
cantidad de empaquetamiento de microtúbulos en algunas células y
existiendo una alta incidencia de células con degradación nuclear
característica de apoptosis. Las células incubadas con 1.000 nM del
análogo mostraron un fuerte empaquetamiento de microtúbulos
equivalente a los cambios morfológicos inducidos por 100 nM de
discodermolida. Surgió un alto porcentaje de células que
experimentan apoptosis, como resulta evidente por la degradación
nuclear y la mayor parte de las células redondeadas tenían múltiples
formaciones de
ásteres.
ásteres.
Polimerización de tubulina: La
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida
indujo bajos niveles de polimerización de tubulina comenzando en
24ºC aproximadamente. La polimerización máxima fue del 39% respecto
de la inducida por discodermolida y los polímeros eran
relativamente estables cuando la muestra se mantuvo a 4ºC. Esto se
muestra en la figura 5.
Efectos sobre el ciclo celular: Se acumuló
aproximadamente el 50% de la población celular en la fase G_{2}/M
después de 24 horas de incubación con 1.000 nM de
7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida.
Las concentraciones más bajas no produjeron efectos sobre el ciclo
celular. Esto se muestra en las figuras 6D y 6E.
Dichas actividades biológicas se resumen en la
tabla 12.
Empaquetamiento de microtúbulos en células
tumorales humanas A549: A concentraciones de 10 nM a 1.000 nM,
la apariencia de las células coincidían con aquellas de las células
no tratadas/control; núcleos individuales centrados en las células;
los microtúbulos eran lineales, distintivos y de tipo malla; no se
apreció empaquetamiento; ausencia de ásteres múltiples; ausencia de
núcleos apoptóticos; ausencia de polinucleación.
Polimerización de tubulina: Con este
compuesto no se realizaron estudios de polimerización de tubulina
dado que se consideró que no tenía efecto alguno sobre cualesquiera
otros parámetros ensayados.
Efectos sobre el ciclo celular: No se
apreciaron efectos sobre el ciclo celular a concentraciones de 10
nM, 100 nM o 1.000 nM. El porcentajes de células en cada fase del
ciclo celular apareció como similar al del control (sin
tratamiento). Esto se muestra en la figura 6F.
Dichas actividades biológicas se resumen en la
tabla 12.
Los compuestos de la invención son útiles para
diversos propósitos terapéuticos y no terapéuticos. Según los
ensayos, es evidente que los compuestos de la invención son
eficaces para inhibir el crecimiento celular. Debido a las
propiedades antiproliferativas de los compuestos, los mismos son
útiles para prevenir el crecimiento celular no deseado en una
amplia diversidad de entornos, incluyendo usos in vitro.
También son útiles como patrones y para demostraciones didácticas.
Se pueden usar también como tamices ultravioletas en la industria
del plástico, ya que absorben eficazmente los rayos UV. Como se
describe en este documento, también son útiles profiláctica y
terapéuticamente para tratar células cancerosas en animales y seres
humanos.
Se puede contemplar que la aplicación terapéutica
de los nuevos compuestos y de las composiciones que los contienen
se puede conseguir por cualquier método terapéutico y técnica
adecuada conocida por los especialistas en la técnica actualmente o
en el futuro. Además, los compuestos de la invención se usan como
materiales de partida o intermedios para preparar otros compuestos
y composiciones útiles.
La administración de dosificación a un hospedante
en las indicaciones anteriores dependerá de la identidad de las
células cancerosas, del tipo de hospedante implicado, de su edad,
peso, salud, clase de tratamiento actual, si lo hubiera, de la
frecuencia de tratamiento y de la proporción terapéutica.
Los compuestos de la presente invención se pueden
formular de acuerdo con métodos conocidos para preparar
composiciones farmacéuticamente útiles. Las formulaciones se
describen con detalle en varias fuentes que son bien conocidas y
están fácilmente disponibles para los especialistas en la técnica.
Por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science de E.W.
Martin describe formulaciones que se pueden usar en relación con la
presente invención. En general, las composiciones de la presente
invención se formularán de manera que una cantidad eficaz del
compuesto o de los compuestos bioactivos se combine con un vehículo
adecuado para facilitar la administración eficaz de la
composición.
De acuerdo con la invención, las composiciones
farmacéuticas comprenden, como ingrediente activo, una cantidad
eficaz de uno o más de los nuevos compuestos y uno o más vehículos
o diluyentes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos. Los ejemplos
de tales vehículos para uso en la invención incluyen etanol,
dimetilsulfóxido, glicerol, sílice, alúmina, almidón y vehículos y
diluyentes equivalentes.
Para proporcionar la administración de tales
dosificaciones para el tratamiento terapéutico deseado, las nuevas
composición farmacéuticas de la invención comprenderán
ventajosamente entre aproximadamente un 0,1% y un 45% y
especialmente entre un 1 y un 15% en peso del total de uno o más de
los nuevos compuestos con respecto al peso de la composición total,
incluyendo un vehículo o diluyente. A modo de ilustración, los
niveles de dosificación de los ingredientes activos administrados
pueden ser: por vía intravenosa, de 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg;
por vía intraperitoneal, de 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg; por
vía subcutánea, de 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg; por vía
intramuscular, de 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg; por vía oral, de
0,01 a aproximadamente 200 mg/kg y preferiblemente de
aproximadamente 1 a 100 mg/kg; por instilación intranasal, de 0,01 a
aproximadamente 20 mg/kg; y mediante aerosol, de 0,01 a
aproximadamente 20 mg/kg de peso (corporal) del animal.
Ha de entenderse que los ejemplos y modalidades
que aquí se describen solo son con fines ilustrativos y que, a la
luz de lo aquí descrito, para los expertos en la materia resultarán
evidentes diversas modificaciones o cambios, cuyas modificaciones y
cambios quedan incluidas dentro del espíritu y esfera de esta
solicitud y dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (22)
-
\global\parskip0.880000\baselineskip
1. Uso de un compuesto seleccionado del grupo consistente en 2-desmetildiscodermolida (II); 19-desaminocarbonildiscodermolida (III); metildiscodermolato (V), 3-deoxi-2\Delta-discodermolida (VI); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-17-acetato (VII); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato (VIII); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7,11,17-triacetato (IX); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11-acetato (X); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7-succinate (XI); 8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XII); 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XIII); y 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida-3,11,17-triacetato (XIV) en la preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de células cancerígenas. - 2. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho compuesto es 2-desmetildiscodermolida (II).
- 3. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho compuesto es 19-desaminocarbonildiscodermolida (III).
- 4. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho compuesto es metildiscodermolato (V).
- 5. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho compuesto es 3-deoxi-2\Delta-discodermolida (VI).
- 6. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho compuesto es 8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XII).
- 7. Uso según la reivindicación 1, en donde dicho compuesto es 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XIII).
- 8. Uso según la reivindicación 1, en donde dichas células cancerígenas se eligen del grupo consistente en leucemia humana, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de SNC, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de páncreas y cáncer de útero.
- 9. Un compuesto para inhibir el crecimiento de células cancerígenas, en donde dicho compuesto se elige del grupo consistente en 2-desmetildiscodermolida (II); 19-desaminocarbonildiscodermolida (III); metildiscodermolato (V), 3-deoxi-2\Delta-discodermolida (VI); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-17-acetato (VII); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato (VIII); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7,11,17-triacetato (IX); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11-acetato (X); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7-succinate (XI); 8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XII); 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XIII); y 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida-3,11,17-triacetato (XIV).
- 10. Un compuesto según la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 2-desmetildiscodermolida (II).
- 11. Un compuesto según la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 19-desaminocarbonildiscodermolida (III).
- 12. Un compuesto según la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es metildiscodermolato (V).
- 13. Un compuesto según la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 3-deoxi-2\Delta-discodermolida (VI).
- 14. Un compuesto según la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XII).
- 15. Un compuesto según la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XIII).
- 16. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo consistente en 2-desmetildiscodermolida (II); 19-desaminocarbonildiscodermolida (III); metildiscodermolato (V), 3-deoxi-2\Delta-discodermolida (VI); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-17-acetato (VII); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11,17-diacetato (VIII); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7,11,17-triacetato (IX); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-11-acetato (X); 3-deoxi-2\Delta-discodermolida-7-succinate (XI); 8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XII); 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XIII); y 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida-3,11,17-triacetato (XIV).
- 17. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16, en donde dicha composición es 2-desmetildiscodermolida (II).
- 18. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16, en donde dicha composición es 19-desaminocarbonildiscodermolida (III).
- 19. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16, en donde dicha composición es metildiscodermolato (V).
- 20. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16, en donde dicha composición es 3-deoxi-2\Delta-discodermolida (VI).
- 21. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16, en donde dicha composición es 8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XII).
- 22. Una composición farmacéutica según la reivindicación 16, en donde dicha composición es 7-deoxi-8,21,23-hexahidrodiscodermolida (XIII).
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