ES2236010T3 - Composiciones de polipeptidos con estabilidad mejorada. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, en la que la concentración de glicerina es menor de 500 mg/ml y en la que la glicerina se deriva de una fuente no animal, para mejorar la estabilidad química de la composición.

Description

Composiciones de polipéptidos con estabilidad mejorada.

Campo de la invención

Esta invención está dentro del campo de la medicina humana. En particular, esta invención está dentro del campo de composiciones farmacéuticas para tratar diversas enfermedades, incluidas la diabetes e hiperglucemia.

Antecedentes de la invención

Muchas composiciones farmacéuticas de polipéptidos se utilizan para el tratamiento de enfermedades en el hombre y en otros mamíferos. Debido a su gran inestabilidad después de su administración oral, los fármacos polipeptídicos deben ser administrados generalmente por vías parenterales. Las principales entre estas vías son la subcutánea, intramuscular e intravenosa.

Los productos de fármacos polipeptídicos se suministran tradicionalmente a farmacias, hospitales y pacientes en forma de soluciones, suspensiones o productos liofilizados. En forma líquida, cada formulación de un fármaco polipeptídico requiere un cierto nivel mínimo de estabilidad física y química durante un tiempo definido, determinado por el régimen del tratamiento, conveniencia del paciente, seguridad del paciente y normas reguladoras.

Para evitar dolor o posible daño a los tejidos, las composiciones líquidas de fármacos polipeptídicos se diseñan de modo que proporcionen una tonicidad u osmolaridad próxima a la de los fluidos corporales existentes en el sitio de administración o que rodean a éste. Para este fin se usan frecuentemente excipientes, como glicerina, dextrosa, manitol, lactosa y sales, como cloruro sódico. Ejemplos de productos de fármacos polipeptídicos que emplean glicerina como agente de isotonicidad incluyen los que comprenden una insulina humana activa, insulina lispro, insulina aspart y glucagón.

También se ha usado glicerina en composiciones farmacéuticas como solubilizante, agente humectante, emulsionante, disolvente, sustancia de carga, antioxidante, agente quelante y conservante [A.J. Spiegel et al., J. Pharm. Sci., 52, 917-927 (1963); Y-C. Wang et al., J. Parenteral Drug Assoc., 34, 452-462 (1980); Pharmaceutical Sciences, de Remington, Mack Publishing Company, 18ª edición, pág. 1.316 (1990); S. Li et al., J. Pharm. Sci., 85, 868-872 (1996); G.M. Sieger et al., patente de los Estados Unidos nº 4.016.273, concedida el 5 de abril de 1977; y D.N. Heinz, publicación WIPO WO98/29131, de 9 de julio de 1998].

En algunas formulaciones de polipéptidos, la inestabilidad física impide el uso de sales para conseguir isotonicidad, un problema resuelto frecuentemente empleando glicerina. Sin embargo, se sabe que la glicerina contribuye a la inestabilidad química de productos polipeptídicos. En particular, se cree que las impurezas presentes en la glicerina, como aldehídos, inician reacciones de reticulación covalente que originan dímeros y polímeros del polipéptido [véase, por ejemplo, J. Bello et al., Arch. Biochem. Biophys., 172, 608-610 (1976)]. En productos de insulina, dichos dímeros y polímeros se han asociado a antigenicidad y alergia cutánea, como describen D.C. Robbins et al., Diabetes, 36, 838-841 (1987); D.C. Robbins et al., Diabetes, 36, 147-151 (1987); y R.E. Ratner et al., Diabetes, 39, 728-732 (1990). J. Brange et al., Pharm. Res., 9, 727-734 (1992), sacan la conclusión de que se debe minimizar los dímeros y polímeros covalentes de insulina para evitar estas reacciones alérgicas pero no se han descrito ni sugerido procedimientos para conseguir este objetivo.

Se pueden hacer tres observaciones acerca del problema de preparar composiciones fiablemente estables de polipéptidos, que contienen glicerina, para administración parenteral. Primera, se carece de un ensayo simple pero seguro para determinar el nivel de aldehídos reactivos presentes en la glicerina que origina polipéptidos reticulados. Segunda, en la técnica anterior no se ha descrito ni sugerido que se deben evaluar lotes comerciales de glicerina fabricados a partir de diferentes orígenes para determinar si ciertos orígenes son mejores que otros para minimizar las reacciones de reticulación del polipéptido. A continuación se describirán con más detalle cada una de estas tres observaciones.

Medición de aldehídos reactivos en la glicerina

La falta de un procedimiento simple y fiable para medir las impurezas del tipo de aldehídos reactivos en la glicerina que originan la formación de polipéptidos reticulados ha obstaculizado la solución del problema de la reticulación de polipéptidos en formulaciones que contienen glicerina.

El formaldehído puede iniciar la reticulación de polipéptidos por un enlace imino reactivo [S.P. Schwendeman et al., PNAS, 92, 11.234-11.238 (1995), y H. Fraenkel-Conrat et al., JACS, 70, 2.673-2.684 (1948)]. El gliceraldehído y el glicolaldehído reaccionan con grupos amino en soluciones de polipéptidos formando polipéptidos reticulados, como describen A.S. Acharya et al., PNAS, 80, 3.590-3.594 (1983), y A.S. Acharya et al., Biochemistry, 27, 4.522-4.629 (1988).

Se ha especulado que las impurezas del tipo de aldehídos, presentes en el glicerol, están implicadas en la formación de polímeros de peso molecular alto en formulaciones de insulina [J. Brange et al., Pharm. Res., 9, 727-734 (1992); J. Brange, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publishers, Boston, pág. 23-36 (1994); J. Brange et al., Hormone Drugs, publicado por la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos, Rockville, Maryland, pág. 95-105 (1982)], pero no se han descrito procedimientos para cuantificar o eliminar las impurezas del tipo de aldehídos para mejorar la estabilidad química de las formulaciones de insulina.

En la bibliografía hay muchos ensayos de aldehídos, pero su aplicabilidad para medir el contenido de aldehídos reactivos en la glicerina, como predicción de la reticulación de polipéptidos en formulaciones farmacéuticas, es cuestionable.

El suplemento 2000 de la Farmacopea Europea [Consejo de Europa, Estrasburgo, Francia, pág. 747-751 (1999)] describe un ensayo de aldehídos en su monografía del glicerol. Este ensayo emplea hidrocloruro de pararrosanilina como reactivo y una solución estándar de formaldehído como comparador.

La Farmacopea Británica 1999 [Comisión de la Farmacopea Británica, Londres, pág. 710-711 (1999)] describe un ensayo de aldehídos y sustancias reductoras en glicerina, que usa hidrocloruro de pararrosanilina y comparación visual con una solución estándar que contiene 5 ppm de formaldehído.

El reactivo "Purpald", 4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol [R.G. Dickinson et al., Chem. Commun., pág. 1.719 (1970)] reacciona con aldehídos y se ha usado para la determinación de formaldehído en aire, glicoles, vacunas, resinas y productos de plástico y para la detección de acetaldehído en secciones de tejido de hígado y frutas [Aldrich Technical Information Bulletin nº AL-145, Aldrich Chemical Co.; H.B. Hopps, Aldrichimica Acta, 33, 28-29 (2000)].

La reacción del formaldehído con la acetilacetona para formar un producto coloreado ha sido descrita por T. Nash, Biochem. J., 55, 416-425 (1953). Parece que este reactivo es bastante específico del formaldehído porque la interferencia del acetaldehído fue sólo 1% en base molar.

La monografía del glicerol de la Farmacopea Internacional [tercera edición, WHO, 4, 176-181 (1994)] describe un ensayo de aldehídos y sustancias reductoras que usa una solución de fucsina/ácido sulfuroso. La intensidad del color se compara con la de una solución 0,2M de permanganato potásico.

En un boletín promocional titulado "Discover the Origins of Some of the World's Most Consistently Pure Products; Synthetic Glycerine Products", de Dow Chemical Company (Freeport, TX, Estados Unidos), pág. 10-11, se usa espectroscopia ultravioleta para comparar glicerina OPTIM® 99,7% USP con muestras menos puras de glicerina. No se proporciona una valoración cuantitativa del nivel de aldehídos ni de otras impurezas orgánicas.

El gliceraldehído reacciona con el hidrocloruro de la hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH). En E. Sawicki et al., Anal. Chem., 33, 93-96 (1961), se indica que este reactivo reacciona con DL-gliceraldehído pero sólo se describe la medición de formaldehído en humos de tubos de escape de automóviles y en aire contaminado. M.A. Paz, Arch. Biochem. Biophys., 109, 548-559 (1965), indican que el L-gliceraldehído reacciona con MBTH y describen un ensayo para detectar cantidades trazas de aldehídos en presencia de cetonas, cetoácidos y diversos tipos de hidratos de carbono piranósidos durante reacciones químicas. M.A. Eberhardt et al., Marine Chemistry, 17, 199-212 (1985), describen el uso de MBTH para medir aldehídos, especialmente formaldehído, en agua del mar y en cultivos bacterianos. Se utiliza MBTH en un ensayo comercial usando glutaraldehído o 1,5-pentanodial como estándar [estuche de ensayo de glutaraldehído, modelo GT-1, de Hach (Loveland, CO, Estados Unidos). Este ensayo usa una rueda de colores para medir niveles de glutaraldehído tan bajos como 1 mg/l. B.W. Bailey et al., Anal. Chem., 43, 782-784 (1971), indican que el reactivo p-fenilenodiamina reacciona con formaldehído, acetaldehído y benzaldehído, pero es muy selectivo del formaldehído. Se usa para medir concentraciones bajas de formaldehído en el aire.

Hemos descubierto sorprendentemente un nuevo ensayo MBTH que usa gliceraldehído como estándar y que se puede usar eficazmente para determinar con precisión el nivel de aldehídos reactivos presentes en muestras de glicerina. También hemos descubierto que el nivel de reticulación en formulaciones de polipéptidos que contienen glicerina está claramente relacionado de una forma lineal con el nivel de aldehídos reactivos en la glicerina usada para preparar las formulaciones, medido por el ensayo antes mencionado. Así, nuestro nuevo ensayo MBTH se puede usar para predecir fácilmente la estabilidad química relativa de composiciones parenterales acuosas de polipéptidos que comprenden glicerina y también se puede emplear para seleccionar lotes adecuados de glicerina para preparar dichas composiciones.

Glicerina obtenida de diversos orígenes

Otro obstáculo para resolver el problema de la reticulación de polipéptidos en formulaciones que contienen glicerina ha sido no reconocer la importancia de considerar el origen del que de fabrica la glicerina comercial y el proceso por el que se fabrica la glicerina. En particular, no se describe ni sugiere que se deban evaluar lotes comerciales de glicerina fabricados a partir de orígenes diferentes para determinar si ciertos orígenes son mejores que otros para minimizar las reacciones de reticulación de polipéptidos.

Los aldehídos presentes en la glicerina se forman por oxidación autocatalítica o térmica, como indican J. Mohr et al., solicitud de patente canadiense 2.242.591, publicada el 13 de julio de 1998. Como indica N.W. Ziels, J. Amer. Oil Chemists's Soc., 33, 556-565 (1956), los procesos usados para fabricar y purificar comercialmente glicerina tienen una gran influencia sobre la pureza final de la glicerina, con independencia del material de partida. Se ha fabricado glicerina a partir de muchos orígenes, incluidas grasas animales, vegetales, fermentación y síntesis química a partir de moléculas orgánicas más pequeñas y de propileno. Los procedimientos para fabricar glicerina a partir de estos y otros orígenes son bien conocidos por los expertos en la materia. Sin embargo, no se ha investigado ni determinado la influencia que el origen tiene sobre el nivel de aldehídos reactivos encontrados en lotes de glicerina fabricados comercialmente y sobre la estabilidad química final de composiciones parenterales acuosas de polipéptidos que comprenden glicerina.

T.D. Rohde et al. [Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 33, 316-318 (1987)] describen una nueva formulación de insulina para uso en bombas implantables que contiene aproximadamente 80% de glicerina, en la que la glicerina de origen animal usada en formulaciones anteriores ha sido reemplazada por glicerina de un origen sintético no especificado y purificada adicionalmente por los autores usando una columna de intercambio iónico de lecho mixto. Las formulaciones nuevas y anteriores también difieren en pH, un factor clave que influye en la extensión de las reacciones de reticulación en formulaciones de insulina. En el tratamiento de pacientes diabéticos, un ciclo mayor de flujo y un uso menor de insulina sugieren una estabilidad mejorada que fue atribuida a la diferencia de pH y a la purificación extra de la glicerina sintética.

Usando el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria, hemos descubierto sorprendentemente que los lotes comerciales de glicerina de origen no animal contienen niveles más bajos de aldehídos reactivos que la glicerina de origen animal. Esto se demostró por glicerina de origen vegetal y obtenida de propileno. La glicerina obtenida de propileno tiene niveles particularmente bajos de aldehídos reactivos. También hemos descubierto que lotes fabricados comercialmente de glicerina de origen vegetal y obtenida de propileno tienen un contenido mucho más bajo de aldehídos reactivos, por mes de antigüedad, que lotes de glicerina de origen animal, lo cual sugiere que el nivel de aldehídos reactivos se incrementa más rápidamente con el tiempo en glicerina de origen animal que en glicerina de origen vegetal y que en glicerina obtenida de propileno.

Además, hemos descubierto que composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de polipéptidos, que comprenden glicerina obtenida de propileno, tienen mejor estabilidad química que composiciones similares preparadas con glicerina de origen animal.

Reducción de niveles de aldehídos reactivos en glicerina

Finalmente, no se ha descrito ningún procedimiento simple y eficiente para reducir el nivel de aldehídos reactivos en glicerina para mejorar la estabilidad química de composiciones farmacéuticas de polipéptidos que comprenden glicerina.

J. Bello [Biochemistry, 8, 4.535-4.541 (1969)] y J. Bello et al., [Arch. Biochem. Biophys., 172, 608-610 (1976)] investigaron prevenir la reticulación en una solución de proteínas que contenía glicerina purificando la glicerina. Se trató primero la glicerina con el agente reductor borohidruro sódico. La etapa de reducción fue seguida de tratamiento de la glicerina con resina MB-3 para eliminar sales inorgánicas y finalmente de destilación in vacuo. No se indica el nivel de aldehídos reactivos antes ni después de este tratamiento. La menor reticulación conseguida por esta purificación de la glicerina fue transitoria.

También describen diversas técnicas de purificación de glicerina J.A. Riddick et al. [Techniques of Chemistry II: Organic Solvents, Physical Properties and Methods of Purification, Wiley-Interscience, Nueva York, pág. 689-690 (1970)], Z. Díaz et al. (patente de los Estados Unidos nº 4.683.347, concedida el 28 de julio de 1987), D.M. Stromquist et al. [Ind. Eng. Chem., 43, 1.065-1.070 (1951) y Ziels (referencia antes indicada), pero ninguna implica reducir el nivel de aldehídos reactivos poniendo en contacto la glicerina con una resina polimérica que comprende grupos amino libres.

M.W. Washabaugh et al. [Anal. Biochem., 134, 144-152 (1983)] describen un procedimiento engorroso para reducir niveles de aldehídos en etilenglicol, que implica reducir con borohidruro sódico, diluir con agua hasta un volumen 4 veces mayor y pasar la solución acuosa a través de cuatro columnas de cromatografía que contienen resinas diferentes. Los aldehídos.

Se han combinado los descubrimientos antes descritos para proporcionar nuevas preparaciones de composiciones de polipéptidos para administración parenteral que contienen glicerina que tienen mejor estabilidad química que composiciones de polipéptidos conocidas anteriormente. Estas composiciones estabilizadas de polipéptidos proporcionan una mayor seguridad a pacientes que las usan para tratar su enfermedad o dolencia.

Breve resumen de la invención

En consecuencia, un aspecto de la presente invención es el uso de glicerina de origen no animal como componente glicerínico en una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, para mejorar la estabilidad química de la composición. La estabilidad química mejorada está relacionada con una reducción del nivel de polipéptidos covalentemente reticulados formados, porque un nivel menor de aldehídos reactivos está presente en la glicerina usada en la preparación de la composición. Más específicamente, la presente invención proporciona el uso de glicerina de origen vegetal u obtenida de propileno para mejorar la estabilidad química de composiciones farmacéuticas acuosas parenterales que comprenden un polipéptido y glicerina.

Otro aspecto de la invención es el uso de glicerina que tiene un contenido de aldehídos reactivos inferior a 8 ppm como componente glicerínico en una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, para mejorar la estabilidad química de la composición.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, en la que la glicerina es de origen no animal.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para preparar una composición farmacéutica acuosa parenteral combinando agua, un polipéptido y glicerina de origen no animal.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en forma de solución o en una suspensión en la que el polipéptido permanece parcial o completamente insoluble en la composición. Las composiciones también se pueden formar a partir de productos manufacturados del tipo de dos envases, en las que un polipéptido en forma sólida se combina, antes de la administración parenteral, con una solución diluyente separada que comprende glicerina.

El polipéptido de las composiciones farmacéuticas de esta invención se puede sintetizar químicamente o producir biosintéticamente usando técnicas de DNA recombinante.

La invención incluye el uso de una composición de la presente invención como medicamento para el tratamiento de enfermedades en mamíferos.

Breve descripción del dibujo

La figura 1 muestra la relación lineal (R^{2} = 0,90) entre análisis de lotes comerciales de glicerina de origen no animal, determinada por el ensayo con MBTH de la presente invención y por el ensayo 10X-GST modificado.

Descripción detallada de la invención

El término "glicerina" se refiere al producto químico propano-1,2,3-triol, número de registro del Chemical Abstract Service (CAS) [56-81-5]. La fórmula empírica del glicerol es C_{3}H_{8}O_{3} y tiene la estructura OH-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-OH. En algunas referencias de la bibliografía, se usa el término "glicerol" para referirse al compuesto químico, "glicerina" se refiere a productos comerciales purificados que contienen 95% o más de glicerol y se usa "glicerina" como nombre comercial de productos cuyo componente principal es glicerol. En la presente Memoria, la glicerina, que significa el producto químico propano-1,2,3-triol, se puede incorporar en las composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de la presente invención usando cualquier solución que comprenda el producto químico propano-1,2,3-triol. La concentración de glicerina en las composiciones farmacéuticas de polipéptidos de la presente invención se define como miligramos de propano-1,2,3-triol por mililitro de la composición y es menor de 500 mg/ml.

La glicerina fue descubierta primero en 1779 por Carl W. Scheele, que la produjo calentando aceite de oliva con litargirio. Desde esa fecha, para producir glicerina se han usado por lo menos cinco fuentes distintas de materiales.

Una fuente de la glicerina es animal. Se esterifican sebo o grasas de animales tales como vacas y ovejas y después se saponifican en un proceso que genera glicerina como subproducto de la fabricación de jabón. Las grasas animales también se hidrolizan o saponifican directamente generando glicerina.

Una segunda fuente comercial de la glicerina es vegetal. Generalmente, se usan aceites obtenidos de coco, palma, canola, soja u otros vegetales para generar glicerina por procedimientos comparables a los usados con grasas animales.

Una tercera fuente de la glicerina es por fermentación. La glicerina se fermenta de sustancias naturales, como melazas de remolacha o usando microorganismos modificados mediante tecnología de DNA recombinante, como la descrita por B.A. Bulthuis et al. (publicación WIPO WO98/21340, de 22 de mayo de 1998) y por R.V. Nair et al. (publicación WIPO WO98/28480, de 10 de junio de 1999).

Una cuarta fuente de la glicerina es la síntesis química partiendo de moléculas orgánicas que contienen menos de tres átomos de carbono. Uno de estos procedimientos, que usa metanol, lo describen D.C. Owsley et al. (patente de los Estados Unidos nº 4.076.758, concedida el 28 de febrero de 1978).

Una quinta fuente de la glicerina es propileno que se obtiene de productos petrolíferos. Se empezó a obtener glicerina a partir de propileno aproximadamente en 1948. Se dispone de muchas rutas de síntesis que convierten el propileno en glicerina, incluidas las descritas en D.C. Owsley et al. (referencia antes citada), en Kirk-Othmer [Encyclopedia of Chemical Technology, 12, 681-694 (1994)] y en Pharmaceutical Sciences, de Remington [Mack Publishing Company, 18ª edición, pág. 1.316 (1990)]. En una ruta de síntesis, por ejemplo, se clora propileno a cloruro de alilo, seguido de conversión con ácido hipocloroso para formar diclorhidrina, reacción con hidróxido cálcico para generar epiclorhidrina y finalmente hidrólisis a glicerina.

Se puede conseguir glicerina de diversos fabricantes, suministradores y distribuidores [véase Chemical Week, Special Issue Buyer's Guide, 159, 321-322 (1997), y Chemical Industry Europe 93; The Leading Guide for Today's European Chemical Industry (1993)].

Productos de glicerina de origen vegetal incluyen Pricerine 9091 (de Unichema North America; Chicago, IL, Estados Unidos), Kosher Superol Glycerine (de Procter and Gamble Chemicals; Cincinnati, OH, Estados Unidos), Glycerine-99,7% [de Chemical Associates of Illinois Inc.; Copley, OH, Estados Unidos), Emery® Glycerine-99,7% Kosher (de Henkel Corporation; Cincinnati, OH, Estados Unidos) y glicerol anhidro extra puro (de EM Industries; Hawthorne, NY, Estados Unidos).

Productos de glicerina obtenida de propileno incluyen Optim® Glycerine 99,7% USP (de Dow Chemical Company; Freeport,TX, Estados Unidos), glicerina sintética (de Solvay Fluorides Inc.; Greenwich, CT, Estados Unidos) y Optim® Glycerine 99,7% (de Dow Chemical Company, Stade, Alemania). Se ha usado glicerina obtenida de propileno como facilitador de sabor para recubrir palomitas de maíz (S.R. Schellhaass, patente de los Estados Unidos nº 5.750.166, concedida el 12 de mayo de 1998) y se ha usado a concentraciones bajas en una loción quirúrgica (M.T. Scholz et al., patente de los Estados Unidos nº 5.951.993, concedida el 14 de septiembre de 1999). También se ha usado glicerina obtenida de propileno en preparaciones alimenticias y farmacéuticas [Food Engineering, edición internacional (Chilton Company), pág. 14 (1997)].

El término "glicerina de origen no animal" se refiere a glicerina no obtenida de la grasa o de cualquier otro componente interno de un animal. Los orígenes de fabricación de glicerina no animal incluyen vegetales, propileno, fermentación y síntesis química a partir de moléculas orgánicas más pequeñas.

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas acuosas parenterales que comprenden un polipéptido y glicerina, en las que la concentración de glicerina en la composición es menor de 500 mg/ml. La concentración de glicerina se refiere a la concentración del producto químico propano-1,2,3-triol. Preferiblemente, la concentración de glicerina en la composición farmacéutica es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml. Más preferiblemente, la concentración de glicerina en la composición es de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml. Más preferiblemente, la concentración de glicerina en la composición farmacéutica acuosa parenteral del polipéptido es de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml. Más preferiblemente, la concentración de glicerina en la composición es de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml. Más preferiblemente, la concentración de glicerina en la composición es aproximadamente 22 mg/ml. Otro intervalo preferido de la concentración de glicerina en la composición es de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 18 mg/ml. Más preferiblemente, la concentración de glicerina en la composición es aproximadamente 16 mg/ml.

El término "aldehído" se refiere a la clase de compuestos orgánicos que contienen el radical o grupo funcional CHO.

El término "aldehído reactivo" se refiere a aldehídos que (a) están presentes como impureza en lotes comerciales de glicerina y (b) reaccionan con grupos amino presentes en polipéptidos en composiciones farmacéuticas acuosas originando la formación de dímeros y/o polímeros covalentes del polipéptido. Un ejemplo de aldehído reactivo es el gliceraldehído.

El término "MBTH" se refiere al producto químico hidrocloruro de la hidrazona de 3-metil-2-metil-benzotiazolinona, número de registro del CAS [14448-67-0].

El término "ensayo MBTH" se refiere a un procedimiento de medir el contenido de aldehídos reactivos en muestras de glicerina usando gliceraldehído como estándar y descrito en detalle como Procedimiento 1.

La abreviatura "ppm" se refiere a partes por millón, en base ponderal. Para los fines de la presente invención, ppm se refiere a partes por millón de aldehído reactivo presente en una muestra de glicerina. Más particularmente, ppm se refiere a la masa relativa de aldehido reactivo con respecto a la masa de glicerina. Por ejemplo, un valor del ensayo MBTH de 2 ppm en un lote particular de glicerina significa que contiene 2 partes de masa de aldehído reactivo por un millón de partes de masa de glicerina. Esto es equivalente a una concentración en la glicerina de 2 \mug/g o 2 mg/kg. Si se diluye una muestra de glicerina con otro disolvente, antes de su análisis, entonces el resultado de ppm del ensayo se debe multiplicar por la dilución para reflejar las partes de aldehído reactivo por millón de partes de la glicerina original sin diluir.

Una realización de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas acuosas de un polipéptido que comprenden glicerina de origen no animal. Se pueden preparar composiciones farmacéuticas dentro de esta realización de la invención sin medir el contenido de aldehídos en la glicerina antes de su uso. Sin embargo, preferiblemente la glicerina usada para preparar una composición de un polipéptido se ensaya antes de su uso y tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 24 ppm. Más preferiblemente, la glicerina tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 8 ppm. Lo más preferiblemente, la glicerina usada en las composiciones de polipéptidos de la presente invención tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 3 ppm o menos.

Si se elige medir el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina usada para preparar una composición de un polipéptido de la presente invención, se pueden emplear diversos ensayos. Uno de estos ensayos es el nuevo procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) descrito en la presente Memoria como Procedimiento 4. Alternativamente, se puede usar un ensayo de aldehídos conocido por los expertos en la materia. Preferiblemente, el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina usada en las composiciones de polipéptidos de la presente invención se mide por un ensayo en el que se usa gliceraldehído como estándar. Más preferiblemente, el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina se mide por el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria.

El término "10X-GST" se refiere a un ensayo de tensión de glicerina que incorpora aproximadamente 10 veces más glicerina que la normal en una preparación de insulina soluble, diseñado para acelerar la formación de dímeros y polímeros covalentes de la insulina. Este ensayo se describe más adelante en detalle como Procedimiento 2.

El término "Mod. 10X-GST" se refiere a un ensayo de tensión de glicerina que incorpora aproximadamente 10 veces más glicerina que la normal en una composición de suspensión de insulina, diseñado para acelerar la formación de dímeros y polímeros covalentes de la insulina. Este ensayo se describe más adelante en detalle como Pro-
cedimiento 3.

El término "polipéptido" se refiere a un compuesto que comprende tres o más aminoácidos y por lo menos un grupo amino libre e incluye análogos y derivados del mismo. Se pueden producir polipéptidos por síntesis química y/o biosíntesis usando tecnología de DNA recombinante. Los polipéptidos pueden contener una o más cadenas de aminoácidos conectadas entre sí por enlaces covalentes, como enlaces disulfuro, o por interacciones no covalentes. Los polipéptidos pequeños también se pueden denominar "péptidos". Los polipéptidos grandes también se pueden denominar "proteínas".

Los polipéptidos incorporados en las composiciones de la presente invención pueden contener L-aminoácidos naturales o aminoácidos no naturales, como D-aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos pueden ser idénticas a las que existen en la naturaleza en animales u otros organismos, o pueden ser análogos en los que la secuencia se ha alterado de diversas maneras. En análogos de polipéptidos, uno o más aminoácidos se pueden añadir, suprimir o sustituir por otros aminoácidos en el N terminal, C terminal o porciones internas del polipéptido. Los análogos de polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Los polipéptidos a incorporar en las composiciones de la presente invención también pueden tener una unión de grupos químicos orgánicos en las cadenas laterales de aminoácidos, en el grupo amino terminal o en el grupo carboxilo terminal del polipéptido. Dichos compuestos son ejemplos de "derivados" de polipéptidos. Otros ejemplos de derivados de polipéptidos incluyen glucopéptidos en los que se unen polisacáridos naturales a las cadenas laterales de los aminoácidos asparagina o treonina. Otros grupos derivatizantes que se pueden unir a polipéptidos incluyen grupos acilo y polietilenglicol. Los derivados de polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Un polipéptido incorporado en las composiciones de la presente invención puede estar presente de diversas formas, incluido en forma de sal farmacéuticamente aceptable. Una sal farmacéuticamente aceptable de un polipéptido significa una sal formada entre uno o más de los grupos cargados del polipéptido y uno o más cationes o aniones no tóxicos y farmacéuticamente aceptables. Las sales orgánicas e inorgánicas incluyen, por ejemplo, sales de amonio, sodio, potasio, Tris, calcio, zinc o magnesio y las preparadas a partir de ácidos tales como clorhídrico, sulfúrico, sulfónico, tartárico, fumárico, glicólico, cítrico, maleico, fosfórico, succínico, acético, nítrico, benzoico, ascórbico, p-toluenosulfónico, bencenosulfónico, naftalenosulfónico, propiónico, carbónico, etc.

Los polipéptidos incorporados en las composiciones de la presente invención se pueden aislar de orígenes tales como plantas transgénicas o animales transgénicos o se pueden preparar mediante técnicas de síntesis química, incluidos procedimientos clásicos (en solución), procedimientos en fase sólida, procedimientos semisintéticos u otros procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.

Los polipéptidos incorporados en las composiciones de la presente invención también se pueden producir biosintéticamente usando tecnología de DNA recombinante. Véase, por ejemplo, R.E. Chance et al., patente de los Estados Unidos nº 5.514.646, concedida el 7 de mayo de 1996; R.E. Chance et al., publicación EPO número 383.472, de 7 de febrero de 1996; J. Brangs et al., publicación EPO número 214.826, de 18 de marzo de 1987; y R.M. Belagaje et al., patente de los Estados Unidos nº 5.304.473, concedida el 19 de abril de 1994. Usando tecnología de rDNA, se pueden biosintetizar polipéptidos o precursores de los mismos en cualquier número de células huéspedes, incluidas bacterias, células de mamíferos, células de insectos, levaduras u hongos. Más preferida es la biosíntesis en bacterias, levaduras o células de mamíferos. La más preferida es la biosíntesis en E. coli o en una levadura. Ejemplos de biosíntesis en células de mamíferos y de animales transgénicos se describen en K. Hakola, Molecular and Cellular Endocrinology, 127, 59-69 (1997).

Polipéptidos excluidos específicamente para incorporarlos en las composiciones de la presente invención son polipéptidos naturales aislados de tejidos, glándulas, órganos, sangre, orina o cualquier otro componente interno de animales no transgénicos. Un ejemplo de polipéptido excluido es insulina porcina producida en el páncreas de cerdos.

Se cree que la presente invención se aplica a cualquier polipéptido e incluye, inter alia, anticuerpos, citoquinas, receptores, hormonas polipeptídicas y fragmentos de los mismos. Las composiciones de la presente invención también pueden comprender más de un polipéptido. Sin limitar la generalidad del alcance de la presente invención, se mencionarán varios polipéptidos específicos y grupos de polipéptidos para instruir mejor al lector.

Un grupo preferido de polipéptidos a incluir en las composiciones de la presente invención consiste en insulina recombinante humana, insulina recombinante porcina e insulina recombinante bovina.

Otro grupo preferido de polipéptidos a incluir en las composiciones de la presente invención consiste en análogos monoméricos de insulina. Véase, por ejemplo, P. Balschmidt et al., patente de los Estados Unidos nº 5.164.366, concedida el 17 de noviembre de 1992; J. Brange et al., patente de los Estados Unidos 5.618.913, concedida el 8 de abril de 1997; R.E. Chance et al., patente de los Estados Unidos 5.514.646, concedida el 7 de mayo de 1996; y J. Ertl et al., publicación EPO número 885.961, de 23 de diciembre de 1998. Particularmente preferidos son análogos de insulina en los que el resto aminoácido de la posición B28 es Asp, Lys, Ile, Leu, Val o Ala y el resto aminoácido de la posición B29 es Lys o Pro. Los análogos monoméricos de insulina más preferidos son Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana, Asp(B28)-insulina humana y Lys(B3)Ile(B28)-insulina humana.

Otro grupo preferido de polipéptidos a incluir en las composiciones de la presente invención consiste en análogos de insulina en los que el punto isoeléctrico del análogo de insulina es entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0. Estos análogos se denominan análogos de insulina con pI desplazado. Un grupo más preferido de de análogos con pI desplazado se compone de Arg(B31)ARg(B32)-insulina humana y Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-insulina humana.

Otro grupo preferido de polipéptidos a incluir en las composiciones de la presente invención consiste en derivados de insulina y derivados de análogos de insulina. Un grupo más preferido de polipéptidos a incluir en las composiciones de la presente invención consiste en derivados acilados de insulina y derivados acilados de análogos de insulina. Un grupo más preferido de polipéptidos consiste en derivados acilados de insulina y derivados acilados de análogos de insulina en los que el grupo acilo consiste en ácidos grasos saturados de cadena lineal. Ejemplos de ácidos grasos saturados de cadena lineal incluyen longitudes de 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 átomos de carbono. El grupo más preferido de polipéptidos a incluir en las composiciones de la presente invención consiste en palmitoil-\epsilon-Lys(B29)-insulina humana y miristoil-\epsilon-Lys(B29)-des(B30)-insulina humana, en los que los radicales grasos de cadena lineal palmitoíl (C_{16}) y miristoíl (C_{14}) están unidos al grupo amino épsilon (\epsilon) del resto Lys(B29).

Otro grupo preferido de polipéptidos a incorporar en las composiciones de la presente invención consiste en el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1), análogos de GLP-1, derivados de GLP-1 y derivados de análogos de GLP-1. Por costumbre, se asigna el número 7 al amino terminal y se asigna el número 37 al carboxilo terminal de GLP-1(7-37)OH.

Una descripción más detallada de análogos de GLP-1 se puede encontrar en J.A. Hoffman (patente WO99/29336, publicada el 17 de junio de 1999) y en L.B. Knudsen et al. [J. Med. Chem., 43, 1.664-1.669 (2000)]. Un ejemplo de derivado de un análogo de GLP-1 es Arg(34)-N-\epsilon-[\gamma-Glu(N-\alpha-hexadecanoil)]-Lys(26)-GLP-1(7- 37)OH, descrito por J. Nielson et al. (patente WO00/07617, publicada el 17 de febrero de 2000). Un grupo más preferido de polipéptidos a incorporar en las composiciones de la presente invención consiste en GLP-1(7-36)NH_{2} natural, GLP-1(7-37)OH natural, Val(8)-GLP-1(7-37)OH, Gly(8)-GLP-1(7-37)OH y Arg(34)-N-\epsilon-[\gamma-Glu(N-\alpha-hexadecanoil)]-Lys(26)-GLP-1(7- 37)OH.

Otro grupo preferido de polipéptidos a incluir en las composiciones de la presente invención consiste en exendina, análogos de exendina, derivados de exendina y derivados de análogos de exendina. Los polipéptidos y análogos de exendina incluyen exendina-3 y exendina-4, descritos por Young et al. (publicación WIPO WO00/41546, de 20 de julio de 2000). Ejemplos de derivados de exendina y derivados de análogos de exendina son los descritos por Knudsen et al. (publicación WIPO WO99/43708, de 2 de septiembre de 1999). Un polipéptido más preferido para uso en las composiciones de la presente invención es exendina-4.

Otro grupo preferido de polipéptidos a incorporar en las composiciones de la presente invención consiste en el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), descrito por M.S. Goldenberg et al. (publicación WIPO WO00/38562, de 6 de julio de 2000), análogos de G-CSF, derivados de G-CSF y derivados de análogos de G-CSF. Las composiciones de G-CSF de la presente invención pueden estar en forma de solución o suspensión. Se prefiere una composición de G-CSF en suspensión.

Otro grupo preferido de polipéptidos a incorporar en las composiciones de la presente invención consiste en leptina, análogos de leptina, derivados de leptina y derivados de análogos de leptina. Un grupo más preferido de polipéptidos consiste en análogos de leptina glucosilados. Una descripción más detallada de la secuencia de la leptina natural y ejemplos de análogos de leptina se encuentra en J.M. Beals et al. (publicación EPO número 849.276, de 24 de junio de 1998).

Otro grupo preferido de polipéptidos a incorporar en las composiciones de la presente invención consiste en la hormona paratiroidea humana de longitud completa [PTH(1-84)], fragmentos tales como PTH(1-38) y PTH(1-34) y análogos y derivados de los mismos (véase C-M. Chang et al., publicación WIPO WO99/29337, de 17 de junio de 1999). Un grupo más preferido de polipéptidos consiste en PTH(1-34) humana y PTH(1-84) humana.

Otro grupo preferido de polipéptidos a incorporar en las composiciones de la presente invención consiste en la hormona estimulante del folículo (FSH) recombinante y análogos recombinantes y derivados de los mismos. La FSH es una glucoproteína heterodimérica en la que las subunidades alfa y beta están unidas no covalentemente, como describen Shome et al. [J. Prot. Chem., 7, 325-339 (1988)]. Un grupo más preferido de polipéptidos consiste en FSH humana recombinante y análogos recombinantes de FSH en los que están suprimidos uno, dos, tres o más restos aminoácidos C-terminales de la subunidad beta codificada naturalmente y derivados glucosilados de los mismos.

Otro grupo preferido de polipéptidos a incorporar en las composiciones de la presente invención consiste en la hormona humana del crecimiento (HGH) recombinante, hormona bovina del crecimiento (BGH) recombinante y análogos y derivados de las mismas. Un grupo más preferido de polipéptidos consiste en HGH recombinante y BGH recombinante.

Un polipéptido preferido que se puede incorporar en las composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de la presente invención es FSH o un análogo o derivado de la misma, PTH o un fragmento, análogo o derivado de la misma, leptina humana o un análogo o derivado de la misma, GLP-1 o un análogo o derivado del mismo, insulina humana o un análogo o derivado de la misma o un derivado de un análogo de insulina humana.

En las composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de la presente invención se puede incorporar más de un polipéptido. Ejemplos de dichas combinaciones incluyen, inter alia, mezclas de amilina o un péptido agonista de la amilina y una insulina, descritas por G.J.S. Cooper (patente de los Estados Unidos nº 5.124.314, concedida el 23 de junio de 1992) y por J. L'Italien et al. (patente de los Estados Unidos nº 6.136.784, concedida el 24 de octubre de 2000).

Los polipéptidos de las composiciones farmacéuticas de la presente invención son biológicamente activos. Esta actividad puede ser demostrada in vitro o in vivo y resulta de la interacción del polipéptido con receptores y/o con otros sitios intracelulares o extracelulares que origina un efecto biológico.

El término "acuoso" describe un disolvente líquido que contiene agua. Los sistemas disolventes acuosos pueden estar compuestos sólo de agua o pueden estar compuestos de agua más uno o más disolventes miscibles y pueden contener solutos disueltos, como azúcares u otros excipientes.

El término "composición farmacéutica acuosa parenteral", usado en la presente invención, significa una composición farmacéutica para ser administrada por vía parenteral, en la que el contenido de agua es 500 mg/ml o más.

El término "farmacéutico" significa que contiene una sustancia o preparación medicinal usada para tratar una enfermedad. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen polipéptidos con actividad biológica. Las composiciones se preparan de una manera adecuada para su uso farmacéutico y acorde con éste.

El término "parenteral" significa aporte o administración de un fármaco, a un paciente que lo necesite, por una vía distinta de a través del intestino. Las vías preferidas de administración parenteral de las composiciones de polipéptidos de la presente invención son subcutánea, intramuscular, intravenosa, bucal, nasal, pulmonar, intraocular y transdérmica.

El término "estabilidad química" se refiere a la velocidad relativa de formación de dímeros y polímeros de un polipéptido unidos covalentemente, iniciada por aldehídos reactivos en una composición del polipéptido. Una formulación "estable" es una en la que la velocidad de formación de dímeros y polímeros covalentes del polipéptido está aceptablemente controlada y no se incrementa inaceptablemente con el tiempo. El término "mejorada", referido a la estabilidad química de una composición especificada, significa que su nivel de dímeros y polímeros de peso molecular incrementado del polipéptido después de un período de tiempo es menor que el nivel de una composición preparada y tratada de modo comparable. La estabilidad química puede ser evaluada por procedimientos bien conocidos en la técnica. En los procedimientos 10X-GST y 10X-GST modificado, descritos en la presente Memoria, se incluyen ejemplos de medición de la estabilidad química mediante HPLC de exclusión de tamaños.

En los comienzos del desarrollo de una formulación de un polipéptido para uso farmacéutico, se realizaron experimentos para determinar qué excipientes se deberían incluir en la formulación. Habitualmente las formulaciones se diseñan de modo que comprenden el menor número y las menores cantidades de excipientes necesarios para proporcionar un producto eficaz que satisfaga las necesidades de estabilidad e inocuidad del paciente y de las agencias reguladoras. Los requisitos de estabilidad incluyen estabilidad física y estabilidad química.

En las formulaciones que emplean glicerina, se puede minimizar la reticulación covalente de polipéptidos, iniciada por aldehídos reactivos, durante el almacenamiento normal del producto manufacturado. Como ejemplo, en soluciones de insulina, el nivel de proteína de peso molecular alto puede permanecer por debajo de 1,5% mediante almacenamiento refrigerado del producto [USP 2000, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, MD, Estados Unidos (1999)]. Los fabricantes se esfuerzan para satisfacer este tipo de especificación de almacenamiento y garantizar la inocuidad del producto al paciente.

En composiciones de polipéptidos que contienen glicerina, la reacción de polimerización covalente iniciada por aldehídos reactivos es un tema de interés. Se debe ser prudente al incorporar cualquier lote de glicerina comercial en formulaciones de polipéptidos para uso humano sin ensayar apropiadamente la reactividad. En realidad, en cada lote de glicerina obtenido de un fuente comercial se pudo evaluar en alguna manera para asegurar que los productos polipéptidos formulados con ella cumplieron requisitos de estabilidad.

Una manera de probar lo apropiado de la glicerina es preparar pequeños lotes del producto farmacéutico actual y después evaluar la formación de polímeros, generalmente mediante HPLC, a lo largo del periodo normal de vida media y bajo condiciones de almacenaje normales. Una variedad de técnicas de separación y detección para analizar polipéptidos en estudios de estabilidad se describe por Underberg, W. J. M., y col. [J. Chromatography B 742: 401-409 (2000)]. Esta aproximación de ensayo, sin embargo, no es práctica dado que toma demasiado tiempo y requiere excesivos recursos analíticos.

Una mejor manera de valorar lo apropiado de los lotes de glicerina comerciales es acelerar la velocidad de formación de polímeros de polipéptido covalentes. Estas reacciones se pueden acelerar incrementando la temperatura de almacenamiento [Brange, J., Galenics of Insulin, Springer-Verlag (1987)], incrementando el nivel de glicerina por encima del nivel normal, o incrementando ambos. Dos ejemplos de ensayos de "estrés" acelerado son el ensayo 10X-GST y el ensayo modificado 10X-GST descritos más adelante como Procedimientos 2 y 3.

En los típicos productos U100 de insulina, la insulina está presente a una concentración de 3,5 mg/ml, o aproximadamente 600 nmoles/ml. El nivel de glicerina encontrado en las formulaciones normales de insulina es de 16 mg/ml, o aproximadamente 174.000 nmoles/ml. Si el nivel de aldehído reactivo en un lote de glicerina es, por ejemplo, 10 ppm, entonces la concentración de aldehído reactivo en la insulina normal sería sólo aproximadamente 1,74 moles/ml, o 345 veces menos que la insulina. Incrementando este nivel de glicerina 10 veces se proporciona una composición en la cual los aldehídos reactivos están hasta 10 veces más bajos que insulina sobre una base molar, pero incrementarán la velocidad de reacción entre los aldehídos reactivos y las moléculas de insulina. Para los ensayos acelerados descritos en el Procedimiento 2 y el Procedimiento 3, se emplean tanto temperatura elevada (30ºC) como niveles de glicerina elevados (10 veces).

En condiciones apropiadamente controladas, los ensayos acelerados de estabilidad predicen de modo fiable la estabilidad relativa de formulaciones manufacturadas de polipéptidos. Esto es porque todos los ingredientes usados en la formulación final están contenidos en las soluciones de ensayo.

A partir de los resultados de los ensayos acelerados de estabilidad, se relacionan las velocidades relativas de formación de polímeros covalentes con las velocidades de formación en condiciones normales de almacenamiento. Esta relación se basa en consideraciones analíticas, por ejemplo, usando la ecuación de Arrhenius en un intervalo de temperaturas, usando cálculos cuantitativos basados en el mecanismo propuesto de reacción para cada molécula de aldehído reactivo con hasta dos moléculas del polipéptido y/o comparando las velocidades relativas de formación del polímero en las formulaciones. Los procedimientos para establecer un límite especificado de la estabilidad de composiciones de polipéptidos son bien conocidos por los expertos en la materia. De estas consideraciones, se puede establecer un nivel máximo de formación de polímeros en un ensayo acelerado, por ejemplo, 1% por semana a 30ºC, como límite especificado que se debe cumplir para proporcionar un grado elevado de seguridad que se puede conseguir con una estabilidad satisfactoria en condiciones normales de almacenamiento.

A pesar de los resultados fiables obtenidos, hay muchos inconvenientes en los procedimientos acelerados de evaluación de lotes formulados. Primero, la preparación de múltiples muestras de las composiciones farmacéuticas necesita una gran cantidad de tiempo, especialmente si se deben preparar de una manera idéntica al procedimiento usado para preparar composiciones manufacturadas. Como las velocidades de reacción de los aldehídos reactivos con cada polipéptido de cada formulación diferente son impredecibles, se debe ensayar independientemente cada formulación de polipéptido. Segundo, la preparación de múltiples muestras de composiciones de polipéptidos desperdicia material valioso y es especialmente antieconómica respecto al propio polipéptido terapéutico. Tercero, aunque se puedan acelerar las reacciones de reticulación, el tiempo necesario para generar suficientes impurezas reticuladas para permitir una cuantificación fiable puede durar una semana o más tiempo. Cuarto, los procedimientos de ensayo para determinar el nivel de productos reticulados en las composiciones de polipéptidos son complejos, largos y costosos. Los procedimientos de ensayo implican típicamente análisis por HPLC que requiere columnas especializadas, entrenamiento especializado de los operadores y un tiempo considerable para realizar los ensayos, recoger los datos e interpretar los resultados.

El análisis directo de cada lote de glicerina evita los inconvenientes de los ensayos acelerados de estabilidad.

Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para determinar en la glicerina la identidad y nivel de aldehídos reactivos. En particular, se desarrolló un nuevo procedimiento de HPLC (Procedimiento 4) para determinar qué aldehídos están presentes en lotes comerciales de glicerina y sus concentraciones relativas. Los resultados mostraron que, en todos los orígenes de glicerina ensayados, el gliceraldehído fue la impureza principal del tipo de aldehídos, con niveles mucho menores de formaldehído e, incluso, niveles menores de glicolaldehído presentes. Los niveles de formaldehído fueron algo mayores en glicerina de origen vegetal que en glicerina de origen animal y que en glicerina obtenida de propileno.

Sin embargo, como ensayo de valoración de lotes de glicerina, este procedimiento tiene los inconvenientes asociados con el análisis por HPLC antes descrito.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un nuevo ensayo colorimétrico, usando gliceraldehído como estándar, que cuantifica de modo sencillo y fiable el contenido de aldehídos reactivos de lotes comerciales de glicerina. Este ensayo es el ensayo MBTH descrito en detalle más adelante como Procedimiento 1. Como se indica en el Ejemplo 1, este ensayo proporciona una absortividad molar elevada tras la reacción con gliceraldehído, aldehído que el ensayo por HPLC (Procedimiento 4) identificó como predominante en lotes comerciales de glicerina.

De forma muy útil, el ensayo MBTH muestra una relación lineal excelente entre el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina y el nivel incrementado de dímeros y polímeros covalentes medido en un ensayo acelerado de estabilidad, a saber, el ensayo 10X-GST modificado (véase el Ejemplo 2 y la Figura 1). Se obtuvo una buena relación con lotes de glicerina de origen vegetal, animal y obtenida de propileno. Se ha inventado un análisis directo simple de lotes de glicerina usando el ensayo MBTH para sustituir a los ensayos acelerados ineficaces que emplean formulaciones de polipéptidos, tiempos largos de incubación y sistemas complejos de HPLC.

Para obtener un límite especificado del nivel de aldehídos reactivos, determinado por el ensayo MBTH, se puede usar simplemente la línea de correlación, por ejemplo, la mostrada en la Figura 1, para encontrar el nivel de aldehídos reactivos que se corta en la línea con el límite especificado determinado por el ensayo acelerado de estabilidad. Por ejemplo, de la Figura 1, un límite especificado de desarrollo de 1% de polímero, determinado por el ensayo 10X-GST modificado, origina un límite especificado de 14 ppm en el ensayo MBTH. El límite especificado es el nivel máximo de aldehído reactivo (medido, por ejemplo, por el ensayo MBTH) permitido en lotes de glicerina usados para preparar las composiciones manufacturadas de polipéptidos. Si se desean niveles menores de polipéptidos reticulados o una seguridad mayor de que las composiciones tengan la estabilidad requerida durante su almacenamiento, entonces se pueden establecer límites especificados menores.

En base a estas consideraciones, el límite máximo general especificado para el contenido de aldehídos reactivos en glicerina de origen animal usada para preparar composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de polipéptidos de la presente invención, si se ensaya, es 33 ppm. Un límite especificado más preferido para glicerina de origen no animal es 24 ppm. Un límite especificado más preferido es 15 ppm. Un límite especificado más preferido es 8 ppm. El límite especificado más preferido es 3 ppm. Preferiblemente, si el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina se mide antes de su uso para preparar una composición, el ensayo usa gliceraldehído como estándar. Más preferiblemente, si el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina se mide antes de su uso para preparar una composición, el ensayo usado es el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria.

Se ha usado el ensayo MBTH para evaluar lotes comerciales recién preparados y envejecidos de glicerina obtenidos de varios fabricantes. Lo más sorprendentemente, se ha encontrado que la glicerina de origen animal tenía un intervalo más amplio de contenido de aldehídos reactivos (10-1.069 ppm; n = 19) que glicerina de origen vegetal (4-153 ppm; n = 29) o que glicerina obtenida de propileno (0-169 ppm; n = 41). El nivel medio de aldehídos reactivos de lotes de glicerina de origen animal fue también mayor que el de lotes de origen no animal.

Se usó también el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria para evaluar lotes comerciales de glicerina de los que se conocía su fecha de fabricación, que variaba de 1 a 48 meses antes del ensayo. Estos ensayos, descritos en el Ejemplo 3, muestran claramente que, a tiempos comparables, los lotes de glicerina de origen vegetal u obtenidos de propileno tenían niveles medios de aldehídos reactivos mucho menores que lotes de glicerina de origen animal. Debido a la poca seguridad en los procesos de fabricación y en las condiciones de tiempo de almacenamiento y condiciones de almacenamiento usadas por fabricantes, suministradores y transportistas de glicerina, estos datos muestran una clara desventaja en seleccionar orígenes no animales de glicerina para la preparación de composiciones de polipéptidos para uso parenteral. Como los niveles de aldehídos reactivos se incrementan con el tiempo, incluso para glicerinas de origen no animal (véase la Tabla 2), es también desventajoso seleccionar los lotes comerciales disponibles más recientes de glicerina para uso para preparar composiciones de polipéptidos.

Al considerar diversos orígenes comerciales de glicerina usados para preparar composiciones de polipéptidos, se prefiere claramente glicerina de origen no animal. Más preferidos son lotes comerciales de glicerina obtenida de propileno o de origen vegetal. El uso de glicerina de origen no animal en lugar de glicerina de origen animal en composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de polipéptidos originará generalmente una estabilidad química mejorada debido a un contenido menor de aldehídos reactivos en la glicerina. La relación entre la estabilidad química mejorada y un contenido menor de aldehídos reactivos en la glicerina se ilustra para composiciones de un análogo de leptina, de insulina humana y de análogos de insulina en los Ejemplos 4-8 descritos en la presente Memoria.

Una realización preferida de la presente invención es el uso de glicerina de origen no animal como componente glicerínico en una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, para mejorar la estabilidad química de la composición. Una realización más preferida es el uso de glicerina obtenida de propileno o de origen vegetal como componente glicerínico en una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, para mejorar la estabilidad química de la composición. La realización más preferida es el uso de glicerina obtenida de propileno como componente glicerínico en una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, para mejorar la estabilidad química de la composición. Los Ejemplos 9-26 y 28-34 describen la preparación de composiciones de polipéptidos que incorporan glicerina de origen no animal.

La estabilidad química mejorada de una composición de un polipéptido de la presente invención significa que su nivel de dímeros y polímeros de peso molecular alto incrementado del polipéptido después de un período de tiempo es menor que el nivel en una composición comparativa tratada de modo similar. La formación de dímeros y polímeros covalentes puede ser cuantificada mediante ensayos realizados en diversas condiciones, tiempos y temperaturas. Los Ejemplos 4 a 8 de la presente Memoria proporcionan resultados de ensayos en los que son evidentes niveles menores de dímeros y polímeros de peso molecular alto incrementado en composiciones de polipéptidos de la presente invención después de períodos de tiempo y temperaturas especificados. Preferiblemente, la estabilidad química mejorada de composiciones de polipéptidos de la presente invención origina un nivel de dímeros y polímeros de peso molecular alto incrementado que es por lo menos 3% menor que el nivel en composiciones comparables antes conocidas. Más preferiblemente, el nivel de formación de dímeros y polímeros de peso molecular alto incrementado es por lo menos 30% menor. Lo más preferiblemente, el nivel de dímeros y polímeros de peso molecular alo incrementado en composiciones de la presente invención es por lo menos 60% menor que el nivel en composiciones antes conocidas.

Otra realización preferida de la presente invención es una composición acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, en la que la glicerina es de origen no animal. Una realización más preferida es una composición de un polipéptido que comprende glicerina, en la que la glicerina es de origen vegetal u obtenida de propileno. La realización más preferida es una composición de un polipéptido que comprende glicerina, en la que la glicerina se obtiene de propileno.

Como se puede ver por los datos de la Tabla 2, la selección de un lote comercial de glicerina de origen animal no garantiza obtener un nivel extremadamente bajo de aldehídos reactivos, por ejemplo, 3 ppm o menos. En cualquier composición de polipéptido que ha de ser preparada, lotes adquiridos de glicerina comercial de origen animal o no animal pueden no tener un nivel de aldehídos reactivos lo suficientemente bajo para cumplir el límite especificado deseado. Se pueden obtener rápida y eficientemente volúmenes grandes de glicerina con niveles menores de aldehídos reactivos.

Alternativamente, se puede realizar el contacto en un procedimiento discontinuo en el que se añaden el agente sólido de secado y la resina polimérica a la glicerina para formar una suspensión. En el procedimiento discontinuo, las etapas posteriores preferidas incluyen calentar la suspensión a una temperatura entre aproximadamente 40ºC y aproximadamente 100ºC, agitar la suspensión calentada durante un tiempo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 100 horas, pasar la suspensión a través de un filtro que retiene el agente sólido de secado y la resina polimérica y recoger después la glicerina que pasa a través del filtro. La glicerina tratada por el procedimiento discontinuo puede tener reducido su contenido de aldehídos reactivos. Este procedimiento discontinuo también se puede utilizar para reducir muy rápida y eficientemente el nivel de aldehídos reactivos de volúmenes muy grandes de glicerina.

También son factibles muchas técnicas para separar de la glicerina purificada el polímero y el agente de secado. Técnicas de separación de fases que se pueden utilizar en este aspecto de la invención incluyen centrifugación y filtración. Se prefiere un procedimiento de filtración. Para la separación de fases son adecuados diversos equipos y procedimientos de filtración, incluidos filtros compuestos de celulosa o de fibra de vidrio. Se prefiere un filtro de fibra de vidrio. Un filtro más preferido es una membrana de fibra de vidrio Corning de 5 micrómetros, parte #25981-PF (de Corning Inc., Corning, NY, Estados Unidos).

En el procedimiento discontinuo, no es esencial, aunque se prefiere, mantener al máximo un medio no oxidante alrededor de la glicerina que se ha de purificar, especialmente durante las etapas de calentamiento y agitación. Se puede obtener este medio no oxidante proporcionando una atmósfera inerte encima de la glicerina, por ejemplo, usando una vitrina o purgando la glicerina con argón o nitrógeno o proporcionando una atmósfera reductora o un vacío parcial.

Por lo tanto, después de seleccionar un lote comercial de glicerina de origen no animal, preferiblemente glicerina recién fabricada de origen vegetal u obtenida de propileno y lo más preferiblemente obtenida de propileno, se puede determinar el contenido de aldehídos reactivos mediante un ensayo apropiado. Si el contenido de aldehídos reactivos está por debajo del límite especificado fijado para una composición farmacéutica particular de un polipéptido, entonces se puede incorporar la glicerina directamente a la composición con la seguridad de que se conseguirá el nivel deseado de estabilidad química.

Las composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de la presente invención pueden comprender glicerina de origen no animal para mejorar su estabilidad química. Los Ejemplos 5-7 de la presente Memoria muestran claramente la estabilidad química mejorada de composiciones en solución y suspensión de polipéptidos farmacéuticos que comprenden glicerina de origen no animal, comparada con la de composiciones similares de polipéptidos que comprenden glicerina de origen animal.

Las composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de la presente invención pueden comprender glicerina de origen no animal. Si se mide el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina, la glicerina tendrá preferiblemente un contenido de aldehídos reactivos menor de 33 ppm, para mejorar más la estabilidad química de las composiciones de polipéptidos. Los Ejemplos 4 y 8 de la presente Memoria muestran claramente la estabilidad química mejorada de composiciones en solución y suspensión de polipéptidos farmacéuticos que comprenden glicerina de origen no animal que tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 33 ppm, comparada con la de composiciones similares de polipéptidos que comprenden glicerina de origen no animal que tiene un contenido de aldehídos reactivos mayor de 33 ppm.

Para mejorar la estabilidad química, las composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de la presente invención pueden comprender alternativamente glicerina obtenida de cualquier origen, incluida glicerina de origen vegetal, animal u obtenida de propileno, que tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 8 ppm. Los Ejemplos 4, 5 y 8 de la presente Memoria muestran claramente la estabilidad química mejorada de composiciones en solución y suspensión de polipéptidos farmacéuticos que comprenden glicerina que tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 8 ppm, comparada con la de composiciones similares de polipéptidos que comprenden glicerina que tiene un contenido de aldehídos reactivos de 8 ppm o más.

Se cree que la presente invención se aplica a cualquier composición acuosa de un polipéptido que comprenda glicerina. Dichas composiciones de polipéptidos comprenden frecuentemente otros componentes y excipientes y se preparan de la manera usada normalmente para preparar dichas composiciones. Sin limitar la generalidad de la presente invención, se describirán las siguientes composiciones, excipientes y procedimientos de prepararlas para instruir mejor al lector.

La presente invención proporciona composiciones que comprenden agua, un polipéptido y glicerina de origen no animal o glicerina obtenida de cualquier origen que tenga un contenido de aldehídos reactivos menor de 8 ppm. En particular, la invención proporciona composiciones que comprenden por lo menos un polipéptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El intervalo de concentraciones del polipéptido que se puede usar en la invención es de aproximadamente 1,0 \mug/ml a aproximadamente 100 mg/ml, aunque se pueden usar concentraciones menores y mayores, dependiendo de la vía de administración. Las concentraciones de polipéptido son preferiblemente de aproximadamente 5,0 \mug/ml a aproximadamente 20 mg/ml y lo más preferiblemente de aproximadamente 20 \mug/ml a aproximadamente 10 mg/ml. En base a la dosis requerida, la potencia del polipéptido y la estabilidad del polipéptido en la formulación, los expertos podrán conocer las concentraciones de polipéptido apropiadas a incorporar en composiciones de la presente invención.

En las composiciones de la presente invención se pueden usar otros excipientes, como agentes de isotonicidad además de la glicerina, conservantes, protamina, tampones, solubilizantes, detergentes, antioxidantes, estabilizadores de la solución y cationes metalicos, de acuerdo con formulaciones de polipéptidos usadas convencionalmente. También se dispone de otros excipientes para uso en las composiciones de polipéptidos de la presente invención.

El contenido de agua de las composiciones de la presente invención es 500 mg/ml o más. La concentración de glicerina de las composiciones de polipéptidos de la presente invención es menor de 500 mg/ml.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar mediante diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. La presente invención no requiere un orden predeterminado de adición de los componentes para que la composición sea factible. En base a la naturaleza del péptido, la aplicación terapéutica y la formulación deseada, los expertos podrán conocer los procedimientos y orden de adición apropiados para preparar las composiciones de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, se puede usar directamente glicerina de origen vegetal u obtenida de propileno, si está recién preparada, con gran confianza de mejorar la estabilidad química de composiciones de polipéptidos en comparación con el uso conocido de glicerina de origen animal en la misma composición. Sin embargo, se conseguirá la tolerancia máxima de la presente invención si primero se mide el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina a usar en una composición de un polipéptido. Más preferiblemente, se mide el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina dentro de los tres días anteriores a su incorporación en una composición. Preferiblemente, si se mide antes de usarla para preparar una composición de un polipéptido, el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina de origen no animal es menor de 33 ppm. Más preferiblemente, la glicerina tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 15 ppm. Más preferiblemente, la glicerina tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 8 ppm. Lo más preferiblemente, la glicerina tiene un contenido de aldehídos reactivos de 3 ppm o menos. Preferiblemente, el ensayo empleado para medir el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina usa gliceraldehído como estándar. Más preferiblemente, el ensayo empleado para medir el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina es el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas acuosas parenterales que comprenden un polipéptido y glicerina, en la que la glicerina se obtiene de cualquier origen, incluida glicerina de origen animal, vegetal u obtenida de propileno, y en la que la glicerina tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 8 ppm. Preferiblemente, el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina es 3 ppm o menos. Preferiblemente, el ensayo empleado para medir el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina usa gliceraldehído como estándar. Más preferiblemente, el ensayo empleado para medir el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina es el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria.

Las composiciones farmacéuticas acuosas parenterales de polipéptidos de la presente invención se usan como medicamentos o para preparar medicamentos para el tratamiento de enfermedades en mamíferos. Más particularmente, cuando el polipéptido es insulina o un análogo o derivado de insulina, o GLP-1 o un análogo o derivado de GLP-1, el medicamento se puede usar para el tratamiento de la diabetes o hiperglucemia.

Los pacientes pueden disponer de las composiciones de polipéptidos reivindicadas en forma de soluciones transparentes, mezclas en suspensión o envases de dos viales que comprenden un vial de un polipéptido seco o liofilizado que se reconstituye con diluyente de un segundo vial. Las composiciones de polipéptidos preferidas son soluciones transparentes y mezclas en suspensión.

Las composiciones reivindicadas pueden ser administradas a un paciente que las necesite mediante diversos procedimientos de aporte parenteral apreciados por los expertos. Los procedimientos preferidos incluyen inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intravenosa o infusión, administración pulmonar, aporte bucal, nasal, intraocular o transdérmico, y administración mediante bomba interna o externa. Los procedimientos de aporte más preferidos son inyecciones subcutáneas e intramusculares.

Durante su almacenamiento, sorprendentemente las composiciones reivindicadas son más estables químicamente que composiciones antes conocidas.

Procedimiento 1

Ensayo MBTH

Se prepara la "solución de MBTH" disolviendo aproximadamente 250 mg de una mezcla sólida de aproximadamente 20-25% en peso de hidrocloruro de la hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH) y aproximadamente 75-80% en peso de cloruro sódico en un volumen total de 100 ml de agua.

Se prepara la "solución de cloruro férrico" tomando aproximadamente 5,4 g de una solución compuesta de aproximadamente 20-35% en peso de cloruro férrico (FeCl_{3}) y aproximadamente 5% en peso de ácido clorhídrico en propilenglicol y añadiendo aproximadamente 1,5 g de ácido sulfámico. Se diluye después esta mezcla con agua hasta un volumen total de 100 ml.

En un tubo de ensayo de 15 ml se pesan con precisión muestras de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 400 mg de lotes de la glicerina a ensayar. Se añaden después 4,0 ml de la solución de MBTH y se mezcla perfectamente la preparación. Se calienta después la solución durante 60\pm5 segundos en un baño de agua hirviente. Después de enfriar a temperatura ambiente durante 5 minutos, se añaden 5,0 ml de la solución de cloruro férrico y se mezcla perfectamente.

Después de enfriar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos o más, se mide en un espectrofotómetro la absorbancia de la solución a 624 nm.

Se prepara una solución de ensayo en blanco como antes, excepto que se omite la glicerina. Se obtiene una curva estándar diluyendo con agua adicional una solución acuosa de gliceraldehído de 100 \mug/ml, para preparar estándares de gliceraldehído de aproximadamente 0,5 \mug/ml a aproximadamente 10 \mug/ml. Las soluciones estándares se tratan después con los mismos reactivos del ensayo.

Después de restar de los valores de la absorbancia de las soluciones estándar y de ensayo la absorbancia del ensayo en blanco, se cuantifica el nivel de aldehídos reactivos en las muestras de glicerina a partir de la curva estándar de gliceraldehído. En muestras de glicerina en las que el contenido de aldehídos reactivos está por debajo del estándar de 0,5 \mug/ml de gliceraldehído, se determina el contenido de aldehídos reactivos extrapolando la línea de ajuste óptimo obtenida con los estándares de gliceraldehído. Generalmente se ensayan las muestras por triplicado. Preferiblemente todo el agua usada en este ensayo está exenta de aldehídos.

Procedimiento 2

Ensayo de tensión de glicerina 10X (10X-GST)

El ensayo de tensión de glicerina 10X (10X-GST) mide la formación de dímeros y polímeros covalentes en una composición de insulina. Se añade la glicerina a ensayar a Humulin® R (U40; de Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN, Estados Unidos) hasta una concentración final de 160 mg de glicerina/ml, esto es, diez veces el nivel de glicerina usado normalmente en esta formulación. Se incuba a 30ºC durante 7 días una parte alícuota de la formulación resultante mientras que se almacena congelada una segunda parte alícuota durante el mismo período de tiempo. Después, se mide el nivel de proteínas de peso molecular alto (HMWP) de las dos partes alícuotas por HPLC de exclusión de tamaños en condiciones desnaturalizantes [por ejemplo, columna Zorbax GF 250 Special; fase móvil 65 partes de tampón fosfato amónico 0,1M (pH 7,5) y 35 partes de acetonitrilo; detección a 214 nm]. El desarrollo de HMWP en la formulación de ensayo es la concentración de HMWP en la muestra a 30ºC menos la concentración de HMWP en el control congelado.

Procedimiento 3

Ensayo de tensión de glicerina 10X modificado (10X-GST modificado)

Se mezcla un mililitro de Humulin® N (U40; de Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN, Estados Unidos) con aproximadamente 160 mg (aproximadamente 128 \mul) de la glicerina a ensayar. Este nivel de glicerina es aproximadamente diez veces el nivel normal encontrado en productos comerciales. Se mezcla otro mililitro de Humulin® N U40 con 128 \mul de agua. Se almacenan las dos muestras a 30ºC durante 7 días. Se mide después el nivel de proteínas de peso molecular alto (HMWP) de las dos muestras mediante HPLC de exclusión de tamaños en condiciones desnaturalizantes (por ejemplo, columna Waters con la etiqueta de "certificada para ensayo de insulina Protein-Pak 125"; de Waters Corporation, Milford, MA, Estados Unidos; parte número 20574; fase móvil 65 partes de una solución de L-arginina de 1 mg/ml, 20 partes de acetonitrilo y 15 partes de ácido acético glacial). Las muestras de ensayo se solubilizan acidificando con un volumen pequeño de HCl 9,6N antes del análisis.

Se calcula el desarrollo de HMWP en la muestra como el nivel de HMWP en la muestra de ensayo a 30ºC menos el nivel de HMWP en el control mezclado con agua. Se expresa el porcentaje de desarrollo por período de 7 días.

Procedimiento 4

Análisis por HPLC de aldehídos derivatizados en glicerina

Una muestra de 160 mg de un lote de la glicerina a ensayar se derivatiza con 1 ml de una solución de 0,5 mg/ml de 2-difenilacetil-1,3-indandiona-1-hidrazona (DPIH) (véase J.M. Rideout et al., Clin. Chim. Acta, 161, 29-35 (1986), y S. Swarin et al., J. Liquid Chromatography, 6, 425-444 (1983)] en acetonitrilo en un vial de vidrio de 3,5 ml. Se añaden diez microlitros de ácido trifluoroacético (TFA) y el vial se cierra herméticamente y se gira a 20 rpm durante 3 horas a temperatura ambiente. La glicerina es inmiscible con la solución de reactivo DPIH-acetonitrilo pero la rotación del vial esparce la glicerina formando una capa fina sobre la superficie del vial, maximizando el contacto superficial de las dos capas. Los aldehídos y cetonas presentes en la glicerina reaccionan con DPIH formando azinas que se extraen en la solución de reactivo DPIH-acetonitrilo.

Se inyecta después la solución en una columna Zorbax Rx C8 de HPLC (de Mac-Mod Analytical Inc.; Chadds Ford, PA, Estados Unidos). Las azinas se separan por un gradiente progresivo hecho de solución A (0,1% de TFA en agua) y solución B (0,1% de TFA en acetonitrilo) variando las mezclas de 48% de B a 66% de B durante los 30 minutos del ensayo. Los compuestos derivatizados se detectan usando un espectrofotómetro a 290 nm o usando un espectrofluorímetro a 425 nm de excitación y 525 nm de emisión. Se separan estándares de aldehídos según su orden de elución: gliceraldehído, glicolaldehído, hidroxipropionaldehído, formaldehído, acetaldehído y propionaldehído.

Se proporcionan los siguientes ejemplos simplemente para ilustrar más la invención. No se debe considerar que el alcance de la invención consiste sólo en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Selectividad de ensayos de aldehídos

A una muestra de glicerina de origen animal se añadieron los niveles definidos de aldehídos indicados en la Tabla 1. Se analizaron después las muestras de glicerina por el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria (Procedimiento 1) y otros tres ensayos.

En el ensayo "Nash", los aldehídos de la glicerina se extrajeron en tampón fosfato de pH 7,5 y se derivatizaron con acetilacetona en presencia de un exceso de acetato amónico [Du Chatinier et al., Analytical Letters, 22, 875-883 (1989)]. Los productos coloreados de la reacción se cuantificaron a 415 nm usando un espectrofotómetro.

En el ensayo "Purpald", se disolvió el reactivo 4-ami-no-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol (de Aldrich Chemical Company) en NaOH 1N. Se añadió después esta solución a soluciones de glicerina que habían sido diluidas con agua. Después de airear, se determinaron las absorbancias de las soluciones a 401 nm usando un espectrofotómetro.

En el ensayo de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.), se mezclaron las soluciones de glicerina con una solución de hidrocloruro de pararrosanilina (Farmacopea Europea 1997, pág. 906-907, Consejo de Europa, Estrasburgo). Después de una hora, se midió la absorbancia a 550 nm usando un espectrofotómetro.

En cada ensayo se calcularon los valores de la absorbancia restando de las respuestas de glicerina con aldehído añadido las respuestas de una muestra de glicerina sin aldehído añadido. Para cada aldehído se calcularon las absorbancias en base molar y se indican en la Tabla 1. Un valor negativo significa que la adición de aldehído disminuyó realmente la lectura de la absorbancia.

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TABLA 1 Absorbancia molar de aldehídos añadidos a glicerina

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El procedimiento Nash no generó mucha absorbancia con ninguno de los aldehídos. El procedimiento Purpald fue muy sensible al glicolaldehído pero no produjo absorbancia con el gliceraldehído. El procedimiento de la Farmacopea Europea generó una absorbancia moderada con el formaldehído pero fue relativamente insensible para medir el gliceraldehído.

Este experimentó mostró claramente que, de los cuatro ensayos comparados, la señal de absorbancia mayor por mol de gliceraldehído se obtuvo con el ensayo MBTH. El análisis de HPLC (Procedimiento 4) mostró que el gliceraldehído es el aldehído predominante en lotes comerciales de glicerina. En el ensayo MBTH, también se obtuvieron valores altos de la absorbancia con el formaldehído y el glicolaldehído, aldehídos reactivos que el análisis de HPLC (Procedimiento 4) mostró que estaban presentes a niveles bajos en lotes comerciales de glicerina. Por lo tanto, el ensayo MBTH es un procedimiento sensible para determinar el nivel de aldehídos reactivos en glicerina.

Ejemplo 2 Correlación del ensayo MBTH con el ensayo 10X-GST modificado

Se midió por el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria el contenido de aldehídos reactivos de lotes comerciales recién preparados y envejecidos de glicerina.

Se evaluó también cada muestra de glicerina usando el ensayo 10X-GST modificado (Procedimiento 3). En muestras combinadas de glicerina de origen vegetal y obtenida de propileno (n = 39 y n = 25, respectivamente), los resultados representados en la Figura 1 muestran una relación lineal clara (R^{2} = 0,90, para la línea de ajuste óptimo forzada desde el origen) entre el contenido de aldehídos reactivos medido por el ensayo MBTH (<100 ppm) y los picos de HMWP covalentes incrementados medidos en formulaciones de insulina Humulin® N por el ensayo 10X-GST modificado. Muestras de glicerina de origen animal mostraron también una relación lineal clara entre estos ensayos (R^{2} = 0,93; no se muestran datos).

Ejemplo 3 Contenido de aldehídos reactivos de lotes comerciales envejecidos de glicerina

Se almacenaron lotes comerciales de glicerina, cuyas fechas de fabricación se conocían, a temperatura ambiente durante 1 a 48 meses a partir de sus fechas de fabricación. En cada lote de glicerina, se midió el contenido de aldehídos reactivos por el ensayo MBTH descrito en la presente Memoria. En la siguiente Tabla 2 se indican los datos de estos lotes.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Análisis de aldehído reactivo en lotes de glicerina obtenida de tres orígenes

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Estos datos muestran claramente que los lotes envejecidos de glicerina de origen vegetal y obtenida de propileno tienen un intervalo menor de niveles de aldehídos reactivos que los de glicerina de origen animal. Estos datos también muestran que los lotes de glicerina de origen vegetal y obtenida de propileno tienen un contenido mucho menor de aldehídos reactivos por mes de edad que lotes de glicerina de origen animal.

Los datos de la última fila de la Tabla 2 se obtuvieron dividiendo el contenido de aldehídos reactivos de cada lote de glicerina por su edad a partir de la fecha de fabricación. Estos cálculos muestran que la glicerina de origen no animal tiene un nivel estadísticamente significativo menor de aldehído reactivo por mes de edad que la glicerina de origen animal. Una explicación razonable de estos datos es que el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina de origen animal se incrementa más rápidamente con el tiempo que el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina de origen vegetal u obtenida de propileno.

En base a este estudio, creemos que si se almacena en condiciones idénticas glicerina de origen animal y obtenida de propileno, con un contenido equivalente de aldehídos reactivos, el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina de origen animal se incrementará más rápidamente con el tiempo que el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina de origen vegetal y obtenida de propileno.

Ejemplo 4 Estabilidad de formulaciones de leptina

Se usó análogo Asp(72)Asp(100)-Ob de leptina humana (SEQ. ID. nº 6 en J.M. Beals et al., patente WO 98/28335, publicada el 24 de junio de 1998) para preparar formulaciones que contienen glicerina a una concentración de 220 mg/ml. La muestra 1 de glicerina (contenido de aldehídos reactivos = 1 ppm por el ensayo MBTH) se obtuvo de propileno y la muestra 2 de glicerina (contenido de aldehídos reactivos = 85 ppm por el ensayo MBTH) era de origen vegetal. Cada formulación contenía 15,2 mg/ml de la proteína en tampón fosfato 10 mM ajustado a pH 7,8.

Se preparó simultáneamente un volumen de 50 ml de cada una de las formulaciones y se filtraron en condiciones estériles. Después se cargaron asépticamente partes alícuotas (3 ml) en viales estériles de 5 ml de vidrio, se taparon, se sellaron y se almacenaron a 5ºC y 25ºC durante 3, 7, 10 y 24 días. Se analizaron las soluciones en condiciones disociantes por HPLC de exclusión de tamaños usando una columna TosoHaas TSK-GEL G3000SW-XL (de TosoHaas, Montgomeryville, PA, Estados Unidos) y una fase móvil de fosfato sódico 0,1M, sulfato sódico 0,1M y dodecilsulfato sódico del 0,6% a pH 8,5. Los picos del polipéptido en elución se detectaron por absorbancia ultravioleta a 214 nm.

Además del pico de la proteína principal, se observaron dos picos de elución más temprana (esto es, de peso molecular mayor). Uno de estos fue de un dímero covalente, representando más del 90% de la superficie de los picos de elución más temprana. El otro pico de elución más temprana contenía un polímero covalente de la proteína mayor que el dímero. El día de la preparación de la muestra, la superficie combinada de los picos de elución más temprana representaba 0,31% a 0,33% de la superficie total de picos del cromatograma de las muestras mientras que el pico del dímero representaba 0,30% a 0,32% de la superficie total del cromatograma.

Todas las muestras permanecieron transparentes e incoloras durante todo el estudio. En la siguiente Tabla 3 se indican los incrementos en los picos de proteínas de peso molecular alto (picos combinados de dímero y polímero de peso molecular mayor) expresados como porcentaje de la proteína total. Como con las soluciones de la proteína de partida, en todas las muestras los picos de elución más temprana se debieron principalmente al dímero.

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TABLA 3 Incrementos en picos de proteína de peso molecular alto (% de la proteína total)

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Este experimento mostró que, en el análogo Asp(72)-Asp(100)-Ob de leptina humana, las formulaciones que contienen glicerina con un contenido menor de aldehídos reactivos (muestra 1) tenían menos formación de impurezas de proteína de peso molecular mayor durante su almacenamiento, tanto a 5ºC como a 25ºC, que una composición comparable que contiene glicerina con un contenido mayor de aldehídos reactivos (muestra 2). Después de 24 días a 5ºC, el nivel de proteína de peso molecular alto incrementado en la composición preparada con glicerina que tiene un contenido de aldehídos reactivos de 1 ppm (muestra 1) era aproximadamente 50% menor que en la composición preparada con glicerina que tiene un contenido de aldehídos reactivos de 85 ppm (muestra 2). Después de 24 días a 25ºC, el nivel de proteína de peso molecular alto incrementado en la composición preparada con glicerina de la muestra 1 era aproximadamente 67% menor que en la composición preparada con glicerina de la muestra 2.

Ejemplo 5 Estabilidad de formulaciones de insulina y de análogos de insulina

Se cuantificó por el ensayo MBTH el contenido de aldehídos reactivos de tres lotes comerciales diferentes de glicerina. La muestra 3 de glicerina se obtuvo de propileno (1 ppm de aldehído reactivo) y las muestras 4 y 5 de glicerina eran de origen animal (45 y 156 ppm de aldehído reactivo, respectivamente).

Se añadió glicerina de las muestras 3, 4 y 5 a dos formulaciones manufacturadas de insulina humana (Humulin®
R soluble y Humulin® N en suspensión cristalina) y a cuatro formulaciones manufacturadas de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana {Humalog® soluble, Humalog® NPL en suspensión cristalina y mezclas fijas de los mismos denominadas LisPro Low Mix [Humalog®:Humalog® NPL 25:75; véase P. Roach et al., Diabetes Care, 22, 1.258-1.261, (1999)] y LisPro Mid Mix (Humalog®:Humalog® NPL 50:50}, cada una de 100 unidades por mililitro, hasta una concentración final de glicerina de 160 mg/ml.

Después de 7 días a 30ºC, se determinó el incremento del porcentaje de proteína de peso molecular alto (HMWP) de cada formulación como en el Procedimiento 3. En la siguiente Tabla 4 se indica el incremento de los niveles de HMWP.

TABLA 4 Incremento de picos de proteína de peso molecular alto después de 7 días a 30ºC (% de proteína total)

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Los resultados de este experimento muestran claramente que el uso de glicerina de origen no animal proporciona soluciones, suspensiones y soluciones/suspensiones mixtas de polipéptidos con estabilidad química mejorada, en comparación con composiciones similares preparadas con glicerina de origen animal. Después de 7 días a 30ºC, los niveles de proteína de peso molecular alto incrementado en las composiciones preparadas con glicerina obtenida de propileno (muestra 3) variaron de aproximadamente 87% menor en LisPro Low Mix (en comparación con la muestra 4 de glicerina de origen animal) a aproximadamente 99% menor en Humulin® N (en comparación con la muestra 5 de glicerina de origen animal).

Ejemplo 6 Preparación de suspensiones de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana

Se prepararon composiciones que corresponden a suspensiones del análogo Lys(B28)-Pro(B29)-insulina humana U100 (Humalog® NPL; de Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN, Estados Unidos), empleando cuatro lotes comerciales de glicerina que no habían sido purificados.

Se determinó primero el contenido de aldehídos reactivos de tres de los lotes de glicerina por el ensayo MBTH descrito en el Procedimiento 1. También se evaluaron los lotes de glicerina usando el ensayo de tensión de glicerina 10X (Procedimiento 2) y el ensayo de tensión de glicerina 10X modificado (Procedimiento 3). En la siguiente Tabla 5 se indican los resultados de estos análisis.

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TABLA 5 Análisis de lotes de glicerina usados para preparar suspensiones de Ly(B28)Pro(B29)-insulina humana

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Para preparar las formulaciones de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana, se prepararon varias soluciones intermedias.

Se preparó una "solución de conservante" que contiene 3,52 mg de m-cresol/ml y 1,43 mg de fenol/ml (calculados a 89% en peso) en agua desionizada.

Se prepararon "soluciones de glicerina", de cada muestra de glicerina, de 160 mg/ml en agua.

Se preparó una "solución de zinc" acidificando una solución de óxido de zinc con HCl del 10%.

Se prepararon "soluciones de conservante-glicerina-zinc" combinando volúmenes apropiados de la "solución de conservante", las "soluciones de glicerina" y la "solución de zinc", suficientes para originar una solución que contiene 1,76 mg de m-cresol/ml, 0,715 mg de fenol/ml, 16 mg de glicerina/ml y una concentración de zinc que, cuando se combina con el zinc presente en el material Lys(B28)-Pro(B29)-insulina humana bruto, da un total de 25 \mug/ml. En este momento, las soluciones de "conservante-glicerina-zinc" tienen un pH de aproximadamente 4,7.

Después se añadieron cantidades de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana (cristales de zinc brutos) a las soluciones de conservante-glicerina-zinc a un nivel suficiente para conseguir una concentración de 200 unidades por mililitro (U/ml) o de aproximadamente 7,0 mg/ml en las "soluciones de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana U200" descritas más adelante. La disolución de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana se realizó a temperatura ambiente bajando el pH a aproximadamente 2,8 por adición de partes alícuotas pequeñas de HCl del 10%. Después de clarificarse las soluciones, se reajustó el pH a aproximadamente 7,3 por adición de partes alícuotas pequeñas de NaOH del 10%. Se añadieron volúmenes de una solución de fosfato sódico dibásico heptahidrato de 75,6 mg/ml en agua desionizada, a niveles suficientes para originar una concentración de 3,78 mg/ml de fosfato sódico dibásico heptahidrato en esta solución. Después de agitar hasta disolución completa de todo el material en la solución, se añadió NaOH del 10% para ajustar el pH de cada una de las cuatro soluciones de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana a aproximadamente 7,4. Se añadió agua desionizada para originar soluciones de 200 U/ml de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana, que después se filtraron a través de filtros Sterivex GV de 0,22 micrómetros (de Millipore Products Division, Bedford, MA, Estados Unidos). Estas cuatro soluciones se denominan "soluciones de Lys(B28)-Pro(B29)-insulina humana U200".

Se preparó una "solución de protamina" disolviendo sulfato de protamina sólido (salmón Chum) en "solución de conservante" para conseguir una concentración equivalente a 0,6 mg/ml de protamina (base libre) en las "soluciones finales de protamina-conservante-glicerina" descritas más adelante. Después de agitar durante 45 minutos, se añadió un volumen de fosfato sódico dibásico heptahidrato de 75,6 mg/ml en agua desionizada para originar una concentración de 3,78 mg/ml de fosfato sódico dibásico heptahidrato en la "solución final de protamina-conservante-glicerina". Se ajustó después el pH de la solución a 7,4 por adición de partes alícuotas pequeñas de ácido clorhídrico del 10%. Se añadieron después volúmenes de las "soluciones de glicerina" de 160 mg/ml para originar soluciones que contienen 16 mg/ml de glicerina en cada solución. Se añadió agua desionizada para ajustar el volumen final y se filtraron las cuatro "soluciones de protamina-conservante-glicerina" a través de filtros Sterivex de 0,22 micró-
metros.

Después de equilibrar a 15ºC cada una de las cuatro soluciones de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana U200 y cada una de las cuatro soluciones de protamina-conservante-glicerina, se combinaron volúmenes iguales de cada solución y se incubaron a 15ºC durante 61 horas.

Cada mililitro de las cuatro formulaciones de suspensiones resultantes preparadas en este experimento contenía aproximadamente: 3,5 mg de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana, 3,78 mg de fosfato sódico dibásico heptahidrato, 16 mg de glicerina, 1,76 mg de m-cresol, 0,715 mg de fenol, 25 \mug de zinc y 0,3 mg de protamina.

Ejemplo 7 Estabilidad de suspensiones de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana

Se incubaron a 30ºC durante hasta 12 semanas las cuatro formulaciones de suspensiones de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana preparadas con lotes diferentes de glicerina como se ha descrito en el Ejemplo 6. A diversos tiempos, se midió el nivel de proteínas de peso molecular alto (HMWP) en las muestras, como porcentaje de proteínas totales, por el procedimiento de HPLC de exclusión de tamaños descrito en el ensayo 10X-GST modificado (Procedimiento 3). En la siguiente Tabla 6 se indican los resultados del ensayo de estabilidad.

TABLA 6 Niveles de HMWP en suspensiones de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana preparadas con diversos lotes de glicerina

6

Los resultados de este experimento muestran claramente que la glicerina obtenida de propileno mejoró la estabilidad química de formulaciones de suspensiones de Lys(B28)-Pro(B29)-insulina humana, en comparación con la de suspensiones preparadas con glicerina de origen animal. Después de 12 semanas a 30ºC, el nivel de proteína de peso molecular alto incrementado en las formulaciones de suspensiones preparadas con glicerina obtenida de propileno (muestras 6 a 8) fue, como media, aproximadamente 39% menor que el nivel de HMWP en la formulación preparada con glicerina de origen animal (muestra 9).

Ejemplo de referencia 8

Reducción del nivel de aldehídos reactivos en glicerina

Se colocó glicerina (3,0 g) de un lote obtenido de propileno en cada uno de cinco vasos que contenían varillas de agitación. Se prepararon de modo similar cinco vasos usando un lote de glicerina de origen vegetal. A los cuatro vasos de cada conjunto se añadieron aproximadamente 50 mg de sulfato magnésico sólido anhidro. A tres vasos de cada conjunto a los que se había añadido sulfato magnésico se añadió una cantidad pesada de una de las siguientes resinas poliméricas (de Advanced ChemTech Inc.; Louisville, KY, Estados Unidos): resina A, 0,1 g de resina de Tris-(2-aminoetil)amina (0,7 mmol/g, malla 100-200); resina B, 0,2 g de resina TantaGel® S NH_{2} (0,3 mmol/g, 90 \mum); resina C, 0,1 g de resina de aminometilpoliestireno (0,7 mmol/g, malla 100-200).

Se colocaron los diez vasos en una placa de agitación en una vitrina bajo una atmósfera de nitrógeno y se calentaron a aproximadamente 60ºC. Después de agitar durante 24 horas, se filtraron las muestras a través de una membrana de celulosa y se analizó su contenido de aldehídos reactivos (ppm) por el ensayo MBTH descrito en el Procedimiento 1. También se evaluaron varias de las muestras de glicerina por el ensayo 10X-GST modificado (Procedimiento 3). En la siguiente Tabla 7 se indican los resultados de este experimento.

TABLA 7 Resultados del tratamiento de muestras de glicerina con resinas poliméricas aminadas

7

Estos datos muestran claramente que los procedimientos de purificación empleados reducen mucho la concentración de aldehídos reactivos en lotes comerciales de glicerina. En las suspensiones de insulina examinadas en el ensayo 10X-GST modificado, los lotes de glicerina purificados con aminometilpoliestireno (resina C) no incrementaron los picos de HMWP mientras que los lotes de glicerina no purificados incrementaron significativamente los niveles de los picos de HMWP.

Ejemplo 9 Solución de insulina humana

Se disuelve insulina humana recombinante (35 mg) en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01N. Se añade solución de óxido de zinc (1 ml, 0,17 mg/ml de zinc como óxido de zinc disuelto en HCl 0,1N), seguido de 25 mg de m-cresol. Se añaden después 160 mg de glicerina recién fabricada, obtenida de propileno. La solución se ajusta a un pH de aproximadamente 7,4 con NaOH 1N y se diluye con agua hasta un volumen total de 10 ml. Cada mililitro de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,5 mg de insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, aproximadamente 2,5 mg de m-cresol y aproximadamente 0,017 mg de zinc.

Ejemplo 10 Solución de insulina humana

Se disuelve insulina humana recombinante (35 mg) en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01N. Se añade solución de óxido de zinc (1 ml, 0,17 mg/ml de zinc como óxido de zinc disuelto en HCl 0,1N), seguido de 16 mg de m-cresol, 6,5 mg de fenol y 1 ml de tampón fosfato sódico 140 mM en agua. Se añaden después 160 mg de glicerina recién fabricada, obtenida de propileno. La solución se ajusta a un pH de aproximadamente 7,4 con NaOH 1N y se diluye con agua hasta un volumen total de aproximadamente 10 ml. Cada mililitro de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,5 mg de insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, fosfato sódico 14 mM, aproximadamente 1,6 mg de m-cresol, aproximadamente 0,65 mg de fenol y aproximadamente 0,017 mg de zinc.

Ejemplo 11 Suspensión de insulina humana

Se prepara una suspensión de cristales de insulina humana-protamina disolviendo primero 35 mg de insulina humana recombinante en 5 ml de HCl 0,01N y añadiendo después 16 mg de m-cresol y 6,5 mg de fenol. Se añaden después 1 ml de una solución acuosa de 160 mg/ml de glicerina obtenida de propileno, 1 ml de una solución de óxido de zinc (0,25 mg de zinc/ml) en HCl 0,1N y 2,7 mg de protamina (como base libre), y se diluye con agua hasta un volumen total de 9 ml. Se añade después 1 ml de una solución de 38 mg/ml de fosfato sódico dibásico heptahidrato, originando un pH de aproximadamente 8. La solución resultante se ajusta a un pH de aproximadamente 7,4 y se deja cristalizar a aproximadamente 19ºC durante aproximadamente 24 horas. Cada mililitro de esta suspensión contiene aproximadamente 3,5 mg de insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, aproximadamente 0,27 mg de protamina (como base libre), aproximadamente 0,025 mg de zinc, aproximadamente 1,6 mg de m-cresol, aproximadamente 0,65 mg de fenol y aproximadamente 3,8 mg de fosfato sódico dibásico.

Ejemplo 12 Mezcla de insulina humana 70/30

Una mezcla que comprende 70 partes de la suspensión descrita en el Ejemplo 11 se combina con 30 partes de la solución de insulina humana descrita en el Ejemplo 10. Estas dos preparaciones emplean glicerina obtenida de propileno.

Ejemplo 13 Mezcla de insulina humana 50/50

Una mezcla que comprende 50 partes de la suspensión descrita en el Ejemplo 11 se combina con 50 partes de la solución de insulina humana descrita en el Ejemplo 10. Estas dos preparaciones emplean glicerina obtenida de propileno.

Ejemplo 14 Mezcla de insulina humana 30/70

Una mezcla que comprende 30 partes de la suspensión descrita en el Ejemplo 11 se combina con 70 partes de la solución de insulina humana descrita en el Ejemplo 10. Estas dos preparaciones emplean glicerina obtenida de propileno.

Ejemplo 15 Solución de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana

Se disuelve Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana recombinante (35 mg) en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01N. Se añade 1 ml de una solución de óxido de zinc (0,2 mg de zinc/ml) disuelto en HCl 0,1 N, seguido de 31,5 mg de m-cresol y 1 ml de una solución acuosa de tampón fosfato 70 mM. Se añaden después 160 mg de glicerina obtenida de propileno. La solución se ajusta a un pH de aproximadamente 7,4 con NaOH 1N y se diluye con agua hasta un volumen total de aproximadamente 10 ml. Cada mililitro de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,5 mg de Ly(B28)Pro(B29)-insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, fosfato sódico 7 mM, aproximadamente 3,15 mg de cresol y aproximadamente 0,02 mg de zinc.

Ejemplo 16 Solución de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana

Se disuelve Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana recombinante (35 mg) en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01N. Se añade 1 ml de una solución de óxido de zinc (0,2 mg de zinc/ml) disuelto en HCl 0,1 N, seguido de 16 mg de m-cresol, 6,5 mg de fenol y 1 ml de una solución acuosa de tampón fosfato 140 mM. Se añaden después 160 mg de glicerina obtenida de propileno. La solución se ajusta a un pH de aproximadamente 7,4 con NaOH 1N y se diluye con agua hasta un volumen total de aproximadamente 10 ml. Cada mililitro de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,5 mg de Ly(B28)Pro(B29)-insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, fosfato sódico 14 mM, aproximadamente 1,6 mg de m-cresol, aproximadamente 0,65 mg de fenol y aproximadamente 0,02 mg de zinc.

Ejemplo 17 Suspensión de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana

Se prepara una suspensión de cristales similares a NPH de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana usando glicerina obtenida de propileno y usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 6.

Ejemplo 18 Mezcla de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana 75/25

Una mezcla que comprende 75 partes de la suspensión de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana descrita en el Ejemplo 17 se combina con 25 partes de la solución de Lys(B28)-Pro(B29)-insulina humana descrita en el Ejemplo 16. Cada una de estas preparaciones emplea glicerina obtenida de propileno.

Ejemplo 19 Mezcla de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana 50/50

Una mezcla que comprende 50 partes de la suspensión de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana descrita en el Ejemplo 17 se combina con 50 partes de la solución de Lys(B28)-Pro(B29)-insulina humana descrita en el Ejemplo 16. Cada una de estas preparaciones emplea glicerina obtenida de propileno.

Ejemplo 20 Mezcla de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana 25/75

Una mezcla que comprende 25 partes de la suspensión de Lys(B28)Pro(B29)-insulina humana descrita en el Ejemplo 17 se combina con 75 partes de la solución de Lys(B28)-Pro(B29)-insulina humana descrita en el Ejemplo 16. Cada una de estas preparaciones emplea glicerina obtenida de propileno.

Ejemplo 21 Solución de Asp(B28)-insulina humana

Se disuelve Asp(B28)-insulina humana recombinante (35 mg) en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01N. Se añade 1 ml de una solución de óxido de zinc (0,2 mg de zinc/ml) disuelto en HCl 0,1N, seguido de 17 mg de m-cresol y 15 mg de fenol. Se añaden después 160 mg de glicerina obtenida de propileno, seguido de 1 ml de una solución acuosa de tampón fosfato 70 mM. La solución se ajusta después a un pH de aproximadamente 7,4 con NaOH 1N y se diluye con agua hasta un volumen total de 10 ml. Cada mililitro de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,5 mg de Asp(B28)-insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, fosfato aproximadamente 7 mM, aproximadamente 1,7 mg de m-cresol, aproximadamente 1,5 mg de fenol y aproximadamente 0,02 mg de zinc.

Ejemplo 22 Mezcla de Asp(B28)-insulina humana 70/30

Se prepara una solución de Asp(B28)-insulina humana disolviendo 76,5 mg de Asp(B28)-insulina humana en agua que contiene aproximadamente 0,32 ml de HCl 0,2N y añadiendo aproximadamente 0,16 ml de una solución de 0,4 mg/ml de cloruro de zinc. Después, se añade sulfato de protamina [(equivalente a aproximadamente 4,5 mg de protamina (base libre)] en agua, seguido de una mezcla que comprende 17,2 mg de m-cresol, 15 mg de fenol y 160 mg de glicerina obtenida de propileno, disueltos todos en agua. La solución resultante, cuyo pH es aproximadamente 2,7, se diluye con agua hasta 10 ml y se equilibra a aproximadamente 30ºC. A esta solución se añaden 10 ml de una solución que contiene 17,2 mg de m-cresol, 15 mg de fenol, 25 mg de fosfato disódico dihidrato y 160 mg de glicerina obtenida de propileno a pH 9 y equilibrada a aproximadamente 30ºC. Después de dos días a aproximadamente 30ºC, la cristalización es completa originándose una mezcla en suspensión, residiendo aproximadamente 70% de la Asp(B28)-insulina humana en los cristales insolubles similares a NPH y 30% en solución.

Ejemplo 23 Mezcla de Asp(B28)-insulina humana 50/50

Se prepara una solución de Asp(B28)-insulina humana disolviendo 76,5 mg de Asp(B28)-insulina humana en agua que contiene aproximadamente 0,32 ml de HCl 0,2N y añadiendo aproximadamente 0,16 ml de una solución de 0,4 mg/ml de cloruro de zinc. Después, se añade sulfato de protamina [(equivalente a aproximadamente 3,2 mg de protamina (base libre)] en agua, seguido de una mezcla que comprende 17,2 mg de m-cresol, 15 mg de fenol y 160 mg de glicerina obtenida de propileno, disueltos todos en agua. La solución resultante, cuyo pH es aproximadamente 2,7, se diluye con agua hasta 10 ml y se equilibra a aproximadamente 30ºC. A esta solución se añaden 10 ml de una solución que contiene 17,2 mg de m-cresol, 15 mg de fenol, 25 mg de fosfato disódico dihidrato y 160 mg de glicerina obtenida de propileno a pH 9 y equilibrada a aproximadamente 30ºC. Después de dos días a aproximadamente 30ºC, la cristalización es completa originándose una mezcla en suspensión, residiendo aproximadamente 50% de la Asp(B28)-insulina humana en los cristales insolubles similares a NPH y 50% en solución.

Ejemplo 24 Mezcla de Asp(B28)-insulina humana 30/70

Se prepara una solución de Asp(B28)-insulina humana disolviendo 76,5 mg de Asp(B28)-insulina humana en agua que contiene aproximadamente 0,32 ml de HCl 0,2N y añadiendo aproximadamente 0,16 ml de una solución de 0,4 mg/ml de cloruro de zinc. Después, se añade sulfato de protamina [(equivalente a aproximadamente 2,0 mg de protamina (base libre)] en agua, seguido de una mezcla que comprende 17,2 mg de m-cresol, 15 mg de fenol y 160 mg de glicerina obtenida de propileno, disueltos todos en agua. La solución resultante, cuyo pH es aproximadamente 2,7, se diluye con agua hasta 10 ml y se equilibra a aproximadamente 30ºC. A esta solución se añaden 10 ml de una solución que contiene 17,2 mg de m-cresol, 15 mg de fenol, 25 mg de fosfato disódico dihidrato y 160 mg de glicerina obtenida de propileno a pH 9 y equilibrada a aproximadamente 30ºC. Después de dos días a aproximadamente 30ºC, la cristalización es completa originándose una mezcla en suspensión, residiendo aproximadamente 30% de la Asp(B28)-insulina humana en los cristales insolubles similares a NPH y 70% en solución.

Ejemplo 25 Solución de miristoil-\epsilon-Lys(B29)-des(B30)-insulina humana

Se disuelve derivado del análogo de insulina miristoil-\epsilon-Lys(B29)-des(B30)-insulina humana (37 mg) en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01N. Se añade 1 ml de una solución de óxido de zinc (0,17 mg de zinc/ml) disuelto en HCl 0,1N, seguido de 32 mg de m-cresol, 1 ml de una solución acuosa de tampón fosfato 70 mM y 160 mg de glicerina obtenida de propileno. La solución se ajusta a un pH de aproximadamente 7,9 y se diluye con agua hasta un volumen total de 10 ml. Cada mililitro de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,7 mg de miristoil-\epsilon-Lys(B29)-des(B30)-insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, fosfato sódico 7 mM, aproximadamente 3,2 mg de m-cresol y aproximadamente 0,017 mg de zinc.

Ejemplo 26 Solución de Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-insulina humana

Se disuelve análogo de insulina Gly(A21)Arg(B31)-Arg(B32)-insulina humana (37 mg) en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01N. Se añade 1 ml de una solución de óxido de zinc (0,80 mg de zinc/ml) disuelto en HCl 0,1N. Se añade alcohol bencílico (100 mg), seguido de 188 mg de glicerina de origen vegetal. La solución se ajusta a un pH de aproximadamente 4,0 y se diluye con agua hasta un volumen total de 10 ml. Cada mililitro de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,7 mg de Gly(A21)-Arg(B31)Arg(B32)-insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, 0,08 mg de zinc y 10 mg de alcohol bencílico.

Ejemplo 27 Disolución de leptina humana

La leptina humana recombinante (10 mg) se disuelve en aproximadamente 5 ml de NaOH 0,01 N. Después, se añade m-cresol (30 mg), seguido por 160 mg de glicerina derivada de plantas y 1 ml de una disolución 70 mM de tampón fosfato en agua. La disolución se ajustó a pH 8,0 y se diluyó a 10 ml de volumen total con agua. Cada ml de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 1 mg de leptina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, 7 mM de fosfato de sodio y 3 mg de m-cresol.

Ejemplo 28 Disolución de FSH humano

El FSH humano recombinante (5 mg) se disolvió en una disolución de fosfato de sodio 10 mM a pH 7,4. A esta disolución se añaden 30 mg de m-cresol seguidos por 160 mg de glicerina derivada de propileno. La disolución se diluye a 10 ml de volumen total con disolución de fosfato de sodio 10 mM a pH 7,4. Cada ml de esta composición de polipéptido contiene 0,5 mg de FSH, aproximadamente 10 mM de fosfato de sodio, 3 mg de m-cresol y 16 mg de glicerina.

Ejemplo 29 Disolución de Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-insulina humana

El análogo de insulina Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-insulina humana (36 mg) se disuelve en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01 N. Se añade 1 ml de una disolución de óxido de cinc (0,30 mg/ml de cinc) disuelto en HCl 0,1 N. Después, se añade m-cresol (27 mg), seguido por 200 mg de una disolución de 85% de glicerina-15% de agua en la cual la glicerina se deriva de propileno. La disolución se ajusta a pH 4,0 y se diluye a aproximadamente 10 ml de volumen total con agua. Cada ml de esta composición de polipéptido acuosa contiene aproximadamente 3,6 mg de Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-insulina humana, aproximadamente 17 mg de glicerina derivada de propileno, aproximadamente de 0,03 mg de cinc y aproximadamente 2,7 mg de m-cresol.

Ejemplo 30 Disolución de Asp(B32)-insulina humana

Se disolvió Asp(B28)-insulina humana recombinante (35 mg) en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01 N. Se añade 1 ml de una disolución de óxido de cinc (0,2 mg/ml de cinc) disuelto en HCl 0,1 N, seguido por 17 mg de m-cresol y 15 mg de fenol. Después se añaden 160 mg de glicerina derivada de propileno, seguidos por 1 ml de una disolución 70 mM de tampón fosfato que contiene 5,8 mg/ml de cloruro de sodio (NaCL) en agua. La disolución se ajusta después a aproximadamente pH 7,4 con NaOH 1 N y se diluyó a aproximadamente 10 ml de volumen total con agua. Cada ml de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,5 mg de Asp(B28)-insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, aproximadamente 7 mM de fosfato, aproximadamente 1,7 mg de m-cresol, aproximadamente 1,5 mg de fenol, aproximadamente 0,58 mg de NaCl y aproximadamente 0,02 mg de cinc.

Ejemplo 31 Disolución de Arg(34), N-\epsilon-(\gamma-Glu(N-\alpha-hexadecanoil))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH

Se disuelve Arg(34), N-\epsilon-(\gamma-Glu(N-\alpha-hexadecanoil))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH (10 mg) en aproximadamente 5 ml de NaOH 0,01 N. Después, se añade m-cresol (20 mg), seguido por 160 mg de glicerina derivada de propileno. La disolución se ajustó a pH 8,0 y se diluyó a 10 ml de volumen total con agua. Cada ml de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 1 mg de Arg(34), N-\epsilon-(\gamma-Glu(N-\alpha-hexadecanoil))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH, aproximadamente 16 mg de glicerina y aproximadamente 2 mg de m-cresol.

Ejemplo 32 Composición exendin-4

Se añade exendin-4 (1 mg) a 5 ml de disolución de pH 4,5 que contienen 5 mg/ml de acetato de sodio. Después, se añade m-cresol (27 mg), seguido por 160 mg de glicerina derivada de propileno. La composición resultante se ajustó, si es necesario, a pH 4,5 y se diluyó a un volumen total de 10 ml con agua. Cada ml de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 0,1 mg de exendin-4, aproximadamente 2,5 mg de acetato de sodio, aproximadamente 16 mg de glicerina y aproximadamente 2,7 mg de m-cresol.

Ejemplo 33 Disolución de Lys(B3)Ile(B28)-insulina humana

La Lys(B3)Ile(B28)-insulina humana (35 mg) se disuelve en aproximadamente 5 ml de HCl 0,01 N. Se añade una disolución de 1 ml de óxido de cinc (0,2 mg/ml de cinc) disuelto en HCl 0,1 N, seguida por 31,5 mg de m-cresol y 1 ml de una disolución tampón fosfato de 70 mM en agua. Después se añaden 160 mg de glicerina derivada de propileno. La disolución se ajustó a aproximadamente pH 7,8 con NaOH 1 N y se diluyó a aproximadamente 10 ml de volumen total con agua. Cada ml de esta composición de polipéptido contiene aproximadamente 3,5 mg de Lys(B3)Ile(B28)-insulina humana, aproximadamente 16 mg de glicerina, aproximadamente 7 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 3,15 mg de m-cresol y aproximadamente 0,02 mg de cinc.

En la memoria precedente se han descrito los principios, realizaciones y modos de operar preferidos de la presente invención. Sin embargo, la invención que se pretende proteger no se debe considerar limitada a las formas particulares descritas puesto que estas se han de considerar como ilustrativas y no como limitativas. Los expertos en la materia pueden hacer variaciones y cambios sin salirse del espíritu de la invención.

Claims (30)

1. Una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende un polipéptido y glicerina, en la que la concentración de glicerina es menor de 500 mg/ml y en la que la glicerina se deriva de una fuente no animal, para mejorar la estabilidad química de la composición.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición es una solución.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición es una suspensión.

4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la concentración de glicerina en la composición farmacéutica es aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la concentración de glicerina es aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la concentración de glicerina es aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la concentración de glicerina es aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 18 mg/ml.

8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la glicerina se deriva de plantas o de propileno.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la glicerina se deriva de propileno.

10. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el polipéptido se produce biosintéticamente.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el polipéptido se sintetiza en bacterias o levadura.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el polipéptido se sintetiza en E. coli.

13. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el polipéptido es FSH o un análogo o derivado de la misma, PTH o un fragmento o análogo de la misma, HGH o un análogo de la misma, leptina humana o un análogo o derivado de la misma, GLP-1 o un análogo o derivado del mismo, insulina humana o un análogo o derivado de la misma o un derivado de un análogo de insulina humana.

14. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el polipéptido es insulina humana o un análogo o derivado de la misma o un derivado de un análogo de insulina humana.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el polipéptido es insulina humana.

16. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el polipéptido es un análogo de insulina humana.

17. La composición de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el análogo es Lys(B28)-Pro(B29)-insulina humana.

18. La composición de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el análogo es Asp(B28)-insulina humana.

19. La composición de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el análogo es Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-insulina humana.

20. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el polipéptido es un derivado de insulina humana o un derivado de un análogo de insulina humana.

21. La composición de acuerdo con la reivindicación 20, en la que el derivado de un análogo de insulina humana es miristoil-\epsilon-Lys(B29)-des(B30)-insulina humana.

22. La composición de acuerdo con la reivindicación 20, en la que el derivado de insulina humana es palmitoil-\epsilon-Lys(B29)-insulina humana.

23. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que la glicerina tiene un contenido de aldehídos reactivos menor de 33 ppm.

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24. La composición de acuerdo con la reivindicación 23, en la que la glicerina tiene contenido de aldehídos reactivos menor de 24 ppm.

25. La composición de acuerdo con la reivindicación 24, en la que la glicerina tiene contenido de aldehídos reactivos menor de 15 ppm.

26. La composición de acuerdo con la reivindicación 25, en la que la glicerina tiene contenido de aldehídos reactivos menor de 8 ppm.

27. La composición de acuerdo con la reivindicación 26, en la que la glicerina tiene contenido de aldehídos reactivos de 3 ppm o menos.

28. El uso de una glicerina derivada de un no animal como componente glicerínico en la composición farmacéutica acuosa parenteral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, para mejorar la estabilidad química de la composición.

29. Un procedimiento para preparar la composición farmacéutica acuosa parenteral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, que comprende combinar agua, el polipéptido y la glicerina derivada de un no animal.

30. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica acuosa parenteral que comprende combinar agua, un polipéptido y glicerina, en el que el contenido de aldehídos reactivos de la glicerina, antes de usarla para preparar la composición, se reduce poniendo en contacto la glicerina con un agente sólido de secado y con una resina polimérica que comprende grupos amino libres.