ES2233426T3 - Modulacion de la estimulacion inmunitaria medida por cpg de oligonucleotido por modificacion de la posicion de los nucleosidos. - Google Patents

Modulacion de la estimulacion inmunitaria medida por cpg de oligonucleotido por modificacion de la posicion de los nucleosidos.

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ES2233426T3 ES00955527T ES00955527T ES2233426T3 ES 2233426 T3 ES2233426 T3 ES 2233426T3 ES 00955527 T ES00955527 T ES 00955527T ES 00955527 T ES00955527 T ES 00955527T ES 2233426 T3 ES2233426 T3 ES 2233426T3
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Abstract

Oligonucleótido que contiene CpG que presenta aumento de los efectos inmunoestimulantes, comprendiendo el oligonucleótido un nucleósido sustituido en 2¿ en una posición seleccionada de entre el grupo constituido por 5¿ del segundo nucleósido en el dinucleótido CpG, 5¿ del 3er nucleósido en el dinucleótido CpG, 5¿ del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5¿ del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5¿ del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3¿ del 1er nucleósido en el dinucleótido CpG, 3¿ del 2º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3¿ del 3er nucleósido en el dinucleótido CpG, 3¿ del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3¿ del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3¿ del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG y combinaciones de las mismas o cuatro nucleósidos continuos en 3¿ del 7º al 10º nucleósido en el dinucleótido CpG.

Description

Modulación de la estimulación inmunitaria medida por CpG de oligonucleótido por modificación de la posición de los nucleósidos.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La invención se refiere a la utilización terapéutica de oligonucleótidos, tanto en el método de la cadena complementaria como de los agentes inmunoestimulantes.
Sumario de la técnica anterior
Los oligonucleótidos se han convertido en herramientas indispensables en la moderna biología molecular, siendo utilizados en una amplia variedad de técnicas, que van desde los procedimientos de sondeo por diagnóstico para PCR a la inhibición de la expresión génica de la cadena complementaria. Esta utilización muy extendida de los oligonucleótidos ha conducido a una demanda creciente de procedimientos rápidos, económicos y eficaces para la síntesis de oligonucleótidos.
La síntesis de oligonucleótidos para aplicaciones en la cadena complementaria y en diagnóstico se pueden llevar a cabo ahora de forma rutinaria. Véase p. ej., Methods in Molecular Biology, vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs págs. 165-189 (S. Agrawal, ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, ed., 1991); y Uhlmann y Peyman, supra. Agrawal e Iyer, Curr. Op. en Biotech. 6: 12 (1995); y Antisense Research and Applications (Crooke y Lebleu, eds., CRC Press, Boca Raton, 1993). Los métodos de síntesis iniciales incluyen las químicas de fosfodiéster y de fosfotriéster. Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972) da a conocer la química del fosfodiéster para la síntesis de oligonucleótidos. Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978), da a conocer la química del fosfotriéster para la síntesis de oligonucleótidos y polinucleótidos. Estos enfoques iniciales han dado paso en gran medida a los métodos de fosforamidita y de H-fosfonato más eficaces para la síntesis. Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981), dan a conocer la utilización de fosforamiditas de desoxinucleósido en la síntesis de polinucleótidos. Agrawal y Zamecnik, patente U.S. nº 5.149.798 (1992), dan a conocer la síntesis optimizada de oligonucleótidos por el método del H-fosfonato.
Ambos métodos modernos se han utilizado para sintetizar oligonucleótidos con diversos enlaces internucleótido modificados. Agrawal y Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542 (1987), dan a conocer la síntesis de metilfosfonatos de oligonucleótido utilizando la química de la fosforamidita. Connolly et al., Biochemistry 23:3443 (1984), da a conocer la síntesis de fosforotioatos de oligonucleótido utilizando la química de la fosforamidita. Jager et al., Biochemistry 27: 7237 (1988), da a conocer la síntesis de fosforamiditas de oligonucleótido utilizando la química de la fosforamidita. Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988), da a conocer la síntesis de fosforamiditas de oligonucleótido y de los fosforotioatos utilizando la química del H-fosfonato.
Más recientemente, varios investigadores han demostrado la validez del enfoque de la cadena complementaria para el tratamiento terapéutico de la enfermedad. Crooke, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: vii-viii, da a conocer la aprobación de la comercializacion exitosa de un fosforotioato oligonucleótido para el tratamiento de la retinitis provocada por el citomegalovirus humano. Desgraciadamente, la utilización de oligonucleótidos de fosforotioato ha llegado a ser más compleja de lo que se esperaba al principio. Determinados efectos producidos por los fosforotioatos oligonucleótidos no se podrían explicar mediante el mecanismo esperado de cadena complementaria. Por ejemplo, McIntyre et al., Antisense Res. Dev. 3: 309-322 (1993) da a conocer que un fosforotioato oligonucleótido de "cadena transcrita" produce estimulación inmunitaria específica. Este y otros efectos secundarios han complicado la situación para los fosforotioato oligonucleótidos. Zhao et al., Biochemical Pharmacology 51: 173-182 (1996) da a conocer la estimulación inmunitaria mediada por dos oligonucleótidos que contienen CpG, uno complementario del gen gag del VIH-1 (5'-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT-3') y del otro complementario al gen rev de VIH-1 (5'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTGCC-3').
Por otra parte, la observación de que los fosfodiéster y fosforotioato oligonucleótidos pueden provocar estimulación inmunitaria ha creado interés en el desarrollo de este efecto secundario como herramienta terapéutica. Estos esfuerzos se han enfocado a los fosforotioato oligonucleótidos que contienen el dinucleótido CpG. Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992) da a conocer que los fosfodiéster oligonucleótidos que contienen un capicúa que incluye un dinucleótido de CpG puede provocar la síntesis de interferón-alfa y gamma y mejorar la actividad destructora natural. Krieg et al., Nature 371: 546-549 (1995) da a conocer que los oligonucleótidos que contienen fosforotioato CpG son inmunoestimulantes. Liang et al., J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996) da a conocer que dichos oligonucleótidos activan los linfocitos B humanos. Moldoveanu et al., Vaccine 16: 1216-124 (1998) da a conocer que los fosforotioato oligonucleótidos que contienen CpG aumentan la respuesta inmunitaria contra el virus de la gripe. McCluskie y Davis, The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (1998) da a conocer que los oligonucleótidos que contienen CpG actúan como potentes agentes inmunoestimulantes, aumentando la respuesta inmunitaria contra el antígeno de superficie de la hepatitis B. Agrawal, patente U.S. nº 5.968.909, da a conocer que la modificación del eje central de C o G suprime este efecto.
Estos informes aclaran que existe necesidad de poder manipular la respuesta inmunitaria producida por oligonucleótidos que contienen CpG. En teoría, dicha modulación debería incluir la disminución del efecto inmunoestimulante para aplicaciones en cadena complementaria, así como aumentar el efecto inmunoestimulante en aplicaciones de inmunoterapia.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona procedimientos para modular la respuesta inmunitaria producida por oligonucleótidos que contienen CpG. Los procedimientos según la invención permiten aumentar el efecto inmunoestimulante para aplicaciones en inmunoterapia. De este modo, la invención proporciona además oligonucleótidos con niveles óptimos de efecto inmunoestimulante para la aplicación y los procedimientos para utilizar dichos oligonucleótidos.
El presente inventor ha descubierto sorprendentemente que la modificación de la posición de los oligonucleótidos que contienen CpG afecta de manera drástica sus capacidades inmunoestimulantes. En particular, la alquilación en 2' o la alcoxilación de oligonucleótidos en las posiciones concretas 5' ó 3' en el dinucleótido de CpG aumentan o reducen su efecto inmunoestimulante.
En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar el efecto inmunoestimulante de un oligonucleótido que contiene CpG, en el que el oligonucleótido no es un oligonucleótido con cadena complementaria complementario del gen Ha-ras o del gag o del rev del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. El procedimiento según este aspecto de la invención comprende la introducción en el oligonucleótido de un nucleósido sustituido en 2' en una posición seleccionada de entre el grupo constituido por 5' del segundo nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 1^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 2º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG y combinaciones de las mismas o cuatro nucleósidos continuos en 3' del 7º al 10º nucleósido en el dinucleótido CpG. En determinadas formas de realización preferidas, el oligonucleótido no es un oligonucleótido de cadena complementaria. En formas de realización alternativas, el oligonucleótido puede ser un oligonucleótido con cadena complementaria.
En un aspecto adicional, la invención proporciona oligonucleótidos que contienen CpG con efectos inmunoestimulantes aumentados, comprendiendo el oligonucleótido un nucleósido sustituido en 2' en una posición seleccionada de entre el grupo constituido por 5' del segundo nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 1^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 2º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG y combinaciones de las mismas o cuatro nucleósidos continuos en 3' del 7º al 10º nucleósido en el dinucleótido CpG., en el que el oligonucleótido no es un oligonucleótido de cadena complementaria complementario del gen Ha-ras o del gag o del rev del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. En determinadas formas de realización preferidas, el oligonucleótido no es un oligonucleótido de cadena complementaria.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición para su utilización farmacéutica que comprende un oligonucleótido que contiene CpG de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 presenta los resultados de un ensayo de proliferación de las células de bazo de ratón sin oligonucleótido (C), en presencia de lipopolisacárido (LPS), o de varios oligonucleótidos.
La Figura 2 presenta el ensanchamiento del bazo en ratones a los que no se ha administrado oligonucleótido o se ha administrado varios oligonucleótidos.
La Figura 3 presenta las formas de realización preferidas de las bases modificadas.
Descripción detallada de las formas de realización preferidas
La invención se refiere a la utilización terapéutica de oligonucleótidos, tanto en el método de la cadena complementaria como en el de los agentes inmunoestimulantes. Las patentes y publicaciones citadas en la presente memoria reflejan el nivel de conocimiento en el campo y están incorporadas en la presente memoria como referencia en su totalidad. En caso de conflicto entre cualquier instrucción de cualquier referencia citada en la presente memoria y la presente memoria, prevalecerá esta última, para el objeto de la invención.
La invención proporciona procedimientos para modular la respuesta inmunitaria producida por oligonucleótidos que contienen CpG. Los procedimientos según la invención permiten aumentar el efecto inmunoestimulante para aplicaciones en inmunoterapia. De este modo, la invención proporciona además oligonucleótidos con niveles óptimos de efecto inmunoestimulante para la aplicación y los procedimientos para utilizar dichos oligonucleótidos.
El presente inventor ha descubierto sorprendentemente que la modificación de la posición de los oligonucleótidos que contienen CpG afecta de manera drástica sus capacidades inmunoestimulantes. En particular, la sustitución en 2', incluyendo sin limitación la alquilación o la alcoxilación de oligonucleótidos en las posiciones concretas 5' ó 3' en el dinucleótido CpG aumentan su efecto inmunoestimulante.
En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar el efecto inmunoestimulante de un motivo inmunoestimulante oligonucleótido que contiene (p. ej., CpG), en el que el oligonucleótido no es un oligonucleótido con cadena complementaria complementario del gen Ha-ras o del gag o del rev del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. El procedimiento según este aspecto de la invención comprende la introducción en el oligonucleótido de un nucleósido sustituido en 2' en una posición seleccionada de entre el grupo constituido por 5' del segundo nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 1^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 2º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG y combinaciones de las mismas o cuatro nucleósidos continuos en 3' del 7º al 10º nucleósido en el dinucleótido CpG. En determinadas formas de realización preferidas, el oligonucleótido no es un oligonucleótido de cadena complementaria.
El procedimiento según este aspecto de la invención se puede llevar a cabo de forma conveniente utilizando cualquiera de las técnicas de síntesis bien conocidas utilizando simplemente el sintón apropiado del monómero sustituido en 2' en el proceso de síntesis en el ciclo inmediatamente después de la incorporación del dinucleótido CpG. Los monómeros preferidos incluyen fosforamiditas, fosfotriésteres y H-fosfonatos. De este modo, para el objeto de la invención, "la introducción en el oligonucleótido de un nucleósido sustituido en 2' en una posición seleccionada de entre el grupo constituido por 5' del segundo nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 1^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 2º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG y combinaciones de las mismas o cuatro nucleósidos continuos en 3' del 7º al 10º nucleósido en el dinucleótido CpG" significa simplemente sintetizar un oligonucleótido que tenga un nucleósido sustituido en 2' en tal posición o posiciones.
Para el objeto de todos los aspectos de la invención, un "oligonucleótido con cadena complementaria" es un oligonucleótido que es exactamente complementario con un gen o un transcrito del gen y es capaz de reducir la expresión del gen o del transcrito del gen con el que es exactamente complementario.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un motivo inmunoestimulante oligonucleótidos que contienen (p. ej., CpG), con efectos inmunoestimulantes aumentados, comprendiendo el oligonucleótido un nucleósido sustituido en 2' en una posición seleccionada de entre el grupo constituido por 5' del segundo nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 1^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 2º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG y combinaciones de las mismas o cuatro nucleósidos continuos en 3' del 7º al 10º nucleósido en el dinucleótido CpG, en el que el oligonucleótido no es un oligonucleótido con cadena complementaria complementario del gen Ha-ras o del gag o del rev del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. En determinadas formas de realización preferidas, el oligonucleótido no es un oligonucleótido de cadena complementaria. Los oligonucleótidos preferidos según todos los aspectos de la invención son desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud y pueden comprender además enlaces de internucleótido modificados o azúcares modificados para mejorar la estabilidad.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición para utilización farmacéutica destinada a provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. La composición comprende un motivo inmunoestimulante un oligonucleótido que contiene (p. ej., CpG), que comprende un nucleósido sustituido en 2' en una posición seleccionada de entre el grupo constituido por 5' del segundo nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 1^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 2º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG y combinaciones de las mismas o cuatro nucleósidos continuos en 3' del 7º al 10º nucleósido en el dinucleótido CpG, en el que el oligonucleótido no es un oligonucleótido con cadena complementaria complementario con el gen Ha-ras o del rev o del gag del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. En determinadas formas de realización preferidas de este primer aspecto de la invención, el oligonucleótido no es un oligonucleótido de cadena complementaria.
En la utilización según este aspecto de la invención, preferentemente la administración de los oligonucleótidos debería ser parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, intravitrea o intrarrectal. La administración de las composiciones terapéuticas se puede realizar utilizando procedimientos conocidos a dosis y periodos de tiempo eficaces para reducir los síntomas o sustituir los marcadores de la enfermedad. Cuando se administra de forma generalizada, la composición terapéutica se administra preferentemente en una dosis suficiente para alcanzar una concentración de oligonucleótido en la sangre desde aproximadamente 0,01 micromolar hasta aproximadamente 10 micromolar. Para la administración localizada, pueden ser eficaces concentraciones mucho menores que ésta y se pueden tolerar concentraciones mucho más elevadas. Preferentemente, la dosis total de oligonucleótido oscilará entre aproximadamente 0,01 mg de oligonucleótido por paciente al día hasta aproximadamente 200 mg de oligonucleótido por kg de peso corporal al día. Puede ser deseable administrar simultánea o sucesivamente una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones terapéuticas de la invención a un individuo como un único episodio de tratamiento. En una forma de realización preferida, después de administrar la composición en cuestión, se toman una o más medidas de los efectos biológicos seleccionados de entre el grupo constituido por inducción de IL-12 y mitogénesis de la célula inmunitaria. Los oligonucleótidos se pueden administrar solos o en combinación con antígenos específicos, que pueden estar o no unidos físicamente al oligonucleótido. Dicha administración puede incluir opcionalmente la utilización de
adyuvantes.
La composición según este aspecto de la invención es útil para estudios de modelo del sistema inmunitario y es además útil para el tratamiento terapéutico de enfermedades humanas.
Para los fines de todos los aspectos de la invención, el término "oligonucleótido" incluye polímeros de dos o más desoxirribonucleótidos, o cualquier nucleósido modificado, incluyendo 2'-halo-nucleósidos, nucleósidos sustituidos en 2'-O-, ribonucleótidos, desazanucleósidos o cualquier combinación de los mismos. Dichos monómeros pueden acoplarse entre sí mediante cualquiera de los numerosos enlaces internucleósido conocidos. En determinadas formas de realización preferidas, estos enlaces de internucleósido pueden ser enlaces no iónicos, bóricos, fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato o fosforamidato, enlaces 2'-5', 3'-5', 3'-3' de cualquiera de los anteriores o de combinaciones de los mismos. El término oligonucleótido también abarca dichos polímeros con bases o azúcares químicamente modificados y/o con sustituyentes adicionales, incluyendo sin limitación grupos lipófilos, agentes de intercalado, diaminas y adamantano. Para los fines de la invención la expresión "sustituido en 2'-O-" significa la sustitución de la posición 2' del grupo pentosa por un halógeno (preferentemente Cl, Br o F) o un grupo alquilo-O- inferior que contiene 1 a 6 átomos de carbono saturados o insaturados o con un grupo -O-arilo o alilo con 2 a 6 átomos de carbono, en los que dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede estar insustituido o puede estar sustituido, p. ej., con grupos halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxilo o amino; o dicha sustitución en 2' puede estar en un grupo hidroxi (para producir un ribonucleótido), un grupo amino o halo, pero no con un grupo 2'-H. Dichos oligonucleótidos incluyen oligonucleótidos con azúcares modificados (p. ej. arabinosa, hexosa) y otras modificaciones del eje central, p. ej., como en un ácido péptido nucleico y un ácido nucleico cerrado. Dichos oligonucleótidos pueden también tener bases naturales o anillos heterocíclicos modificados, incluyendo sin limitación los mostrados en la Figura 3. Para los fines de todos los aspectos de la invención, las expresiones "CpG" o "dinucleótido CpG" significa el 5'-citidina-guanidina-3' del dinucleótido, en el que p es un enlace internucleótido, y en el que el eje azúcar del dinucleótido desoxirribosa o un azúcar modificado o combinaciones de los mismos. En las formas de realización preferidas de los tres primeros aspectos de la invención, p se selecciona de entre enlaces covalentes de fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforotioato estereoespecífico (Rp o Sp) de cualquiera de los anteriores. Las formas de realización sin fosfodiéster, sin fosforotioato reducirán más los efectos inmunoestimulantes. En las formas de realización preferidas de los aspectos de la invención, p se selecciona de entre fosfodiéster, fosforotioato y fosforditioato.
Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar más determinadas formas de realización preferidas de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Modulación del efecto inmunoestimulante in vitro
Para estudiar el impacto del punto de la modificación química de los PS-oligos que contienen el motivo CpG, se eligió dos oligonucleótidos. Oligo 1, que contiene un motivo CpG y Oligo 2, que contiene dos motivos CpG. Estos dos oligos han sido estudiados al principio y han demostrado que son inmunoestimulantes. Para evaluar la actividad inmunoestimulante de los oligonucleótidos en el presente estudio, se ha utilizado el ensayo de proliferación de células de bazo de ratón.
TABLA 1 Fosforotioatos de oligodesoxinucleótido y punto de las modificaciones
1
Se cultivaron linfocitos de bazo de ratón con oligonucleótidos a la concentración de 0,1, 1 y 10 \mug/ml. Oligo 1 produjo un efecto dependiente de la dosis en la proliferación celular. A 0,1 \mug/ml, el índice de proliferación fue 2,87 (Fig. 1). La sustitución de los desoxinucleósidos GA que flanquean 5' del motivo CpG de Oligo 1 con 2'-OMe, (oligo 2), produjo la supresión completa de la proliferación celular a todas las concentraciones utilizadas (Fig. 1). A 0,1 \mug/ml, el índice de proliferación celular fue similar al del medio solo. La sustitución de los desoxinucleósidos TT que flanquean 3' del motivo CpG de Oligo 1 con 2'-OMe (Oligo 6) no tuvo tal impacto sobre la proliferación celular. El índice de proliferación con Oligo 6 fue 2,07 (Fig. 1). Para entender mejor si la sustitución de dos desoxinucleósidos en la zona que flanquea 5' con 2'-OMe lejos del motivo CpG produciría algún impacto sobre la proliferación celular inducida, se sintetizaron los oligos 3, 4 y 5 (Tabla 1). Se sustituyeron dos desoxinucleósidos con 2'-OMe dejando uno, dos y tres desoxinucleósidos respectivamente entre el punto de sustitución y el motivo CpG. El índice de proliferación de oligo 3, 4 y 5 fue 3,42, 8,44 y 10,38 respectivamente que es un aumento del 29, 297 y 400 por ciento, respectivamente, comparado con oligo 1 (Fig. 1). La sustitución de los desoxinucleósidos restantes más hacia el extremo 5' que el oligo 5 no presentó más aumento en el índice de proliferación (datos no mostrados).
Se hicieron sustituciones similares en oligo 1 en la zona que flanquea 3' para el motivo CpG. Se sintetizaron oligo 7, 8, 9, 10 y 11 en los que se sustituyeron dos desoxinucleósidos con 2'-OMe dejando dos, tres, cuatro y cinco desoxinucleósidos respectivamente entre el motivo CpG y la sustitución 2'-OMe. Los índices de proliferación de oligo 7, 8, 9, 10 y 11 fueron 3,63, 7,22, 7,01, 8,85 y 9,24 respectivamente. Comparados con los del oligo 1, el aumento en el índice de proliferación para oligo 7, 8, 9, 10 y 11 fue 39, 231, 221, 317 y 338 por ciento respectivamente.
A partir de estos resultados, es evidente que la sustitución de dos desoxinucleótidos en el extremo 5' y en el extremo 3' del motivo CpG (p. ej. Oligo 5 ó 9) aumenta la actividad inmunoestimulante. ¿Es posible que la sustitución realizada en Oligo 5 y Oligo 9 tenga efectos aditivos al aumentar más la actividad inmunoestimulante? Se sintetizó oligo 12, que tenía dos desoxinucleósidos que se sustituyeron con 2'-OMe tanto en el extremo 3' como en el extremo 5'. Oligo 12 no presentaba más aumento en el índice de proliferación cuando se comparó con Oligo 5, sin embargo, hubo aumento del índice de proliferación en comparación con Oligo 9.
Para explorar si las observaciones anteriores realizadas con utilización de los Oligos 3 a 5 y de los Oligos 7 a 11 son específicas de la secuencia o generales, se hicieron las mismas modificaciones en Oligo 15, que contiene dos motivos CpG. Oligo 15 tenía un índice de proliferación de 5,83 a una concentración de 0,1 g/ml. La sustitución de dos desoxinucleósidos en los extremos 5' de los motivos CpG individuales dejando dos desoxinucleósidos entre el motivo CpG y la sustitución con 2'-OMe, oligo 16 y 17, presentó índices de proliferación de 7,34 y 7,13 respectivamente, que es solamente un aumento del veinte por ciento en comparación con el oligo 15. La sustitución de dos desoxinucleósidos en la zona que flanquea a 5' de ambos motivos CpG (Oligo 18) presentó un índice de proliferación mayor 10,62, que es un aumento de aproximadamente el cincuenta por ciento en comparación con Oligo 15.
Ejemplo 2 Efecto de la estabilidad de la nucleasa sobre la actividad inmunoestimulante
Además de la sustitución específica en el punto, se cuestionó si el aumento de estabilidad metabólica de PS-oligo que contiene el motivo CpG puede producir aumento de la proliferación celular y si éste puede estar combinado con sustituciones en 5' para aumentar más la actividad de la proliferación celular. Se sintetizó Oligo 13 en el cual se sustituyeron cuatro desoxinucleósidos continuos en el extremo 3' de oligo 1 con 2'-OMe, que produce un aumento significativo de estabilidad hacia las nucleasas. Oligo 13 presentaba un índice de proliferación de 11,92, que es un aumento de aproximadamente el 480% en comparación con oligo 1 (Fig. 1). Otra modificación de oligo 13 por sustitución de dos desoxinucleósidos en el extremo 5' (oligo 14) no produjo un aumento adicional en el índice de proliferación.
Después de observar que las sustituciones anteriores en PS-oligos modulan su actividad inmunoestimulante basada en el ensayo del cultivo celular, se administró los oligonucleótidos relacionados en la Tabla 1 por vía intraperitoneal a ratones y se hicieron las pesadas del bazo para confirmar si las sustituciones presentaban el mismo efecto in vivo. La administración de oligo 1 produjo aproximadamente un aumento del 50 por ciento en el peso del bazo (Fig. 2). Oligo 2, que no había presentado actividad inmunoestimulante en el ensayo del cultivo celular, no presentó aumento en los pesos del bazo (Fig. 2). La sustitución de dos desoxinucleótidos lejos del motivo CpG hacia el extremo 5', oligo 3, 4 y 5 presentaron un aumento progresivo de los pesos del bazo que fueron de 67, 95 y 157 por ciento respectivamente más en comparación con los ratones tratados con oligo 1 (Fig. 2), confirmando un aumento en su actividad inmunoestimulante. Las sustituciones de dos desoxinucleósidos con 2'-OMe hacia el extremo 3' del motivo CpG, presentaron un aumento menos significativo del peso del bazo. Solamente los oligos 6 y 11 produjeron un aumento en el peso del bazo del 97 y 95 por ciento en comparación con oligo 1. Oligo 12, que tenía sustituciones realizadas tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' presentó un aumento del 95 por ciento en el peso del bazo en comparación con oligo 1 (Fig. 2).
Los oligos 15, 16, 17 y 18, todos los cuales contenían dos motivos CpG, presentaban aumento en el peso del bazo tras la administración de una dosis de 5 mg/kg. Oligo 15 produjo un aumento del 175 por ciento del peso del bazo en comparación con los ratones no tratados. Oligo 16, en el que dos de los motivos CpG del extremo 5' estaban sustituidos con 2'-OMe, produjo un aumento del 93 por ciento en el peso del bazo en comparación con el oligo 15 (Fig. 2). El oligo 17, que tenía sustituciones en el extremo 5' de una CpG (pero en el extremo 3' del otro motivo CpG) no presentó más aumento en el peso del bazo. La sustitución del extremo en 5' de ambos motivos CpG no produjo más aumentos en el peso del bazo en comparación con el oligo 16, sin embargo tenía solamente alrededor del 60 por ciento de aumento sobre el oligo 15 (Fig. 2).
El oligo 13, que es metabólicamente estable en comparación con el oligo 1, presentó un aumento del 114 por ciento en el peso del bazo en comparación con oligo 1 y era concordante con los datos de la proliferación celular. Resultados similares se observaron en el Oligo 14, que presentaba aumento de estabilidad metabólica y está sustituido en el extremo 5' del motivo CpG (Fig. 2).

Claims (4)

1. Oligonucleótido que contiene CpG que presenta aumento de los efectos inmunoestimulantes, comprendiendo el oligonucleótido un nucleósido sustituido en 2' en una posición seleccionada de entre el grupo constituido por 5' del segundo nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 5' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 1^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 2º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 3^{er} nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 4º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 5º nucleósido en el dinucleótido CpG, 3' del 6º nucleósido en el dinucleótido CpG y combinaciones de las mismas o cuatro nucleósidos continuos en 3' del 7º al 10º nucleósido en el dinucleótido CpG.
2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido tiene una longitud comprendida entre aproximadamente 6 a aproximadamente 50 nucleótidos.
3. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende además enlaces de internucleótido modificados, bases modificadas o azúcares modificados.
4. Composición para utilización farmacéutica que comprende un oligonucleótido que contiene CpG según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
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