ES2231980T3

ES2231980T3 - Descelurizacion de un tejido.

Info

Publication number: ES2231980T3
Application number: ES98918067T
Authority: ES
Inventors: Steven Goldstein; Kirby S. Black
Original assignee: Cryolife Inc
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 2005-05-16
Anticipated expiration: 2018-04-10
Also published as: US20010000804A1; US7318998B2; JP2001520542A; US20030228692A1; DE69827001T2; AU7105898A; EP0987998B1; CA2286655A1; PT987998E; DE69827001D1; EP0987998A1; CA2286655C; DK0987998T3; EP0987998A4; WO1998046165A1; ATE279163T1; AU746318B2

Abstract

La presente invención se refiere en general a la descelurización de tejido y, en particular a un procedimiento de tratamiento de tejidos, por ejemplo, válvulas cardiacas, tendones y ligamentos, así como a hacerlos acelulares y por tanto limitar la mineralización y/o inmunoreactividad mediante implementación en vivo.

Description

Descelularización de un tejido.

Campo de la técnica

La presente invención está, en general, relacionada con la descelularización de tejidos y, en particular, con el tratamiento de tejidos, por ejemplo, de válvulas de corazón, ligamentos y tendones, con vistas a convertirlos en acelulares, limitando de este modo la mineralización y/o la inmunorreactividad tras la implantación in vivo. Los tejidos tratados son utilizados en la fabricación de un medicamento para sustituir un tejido defectuoso en un mamífero.

Antecedentes

Los trastornos en las válvulas de corazón pueden ser graves y de hecho resultan a menudo fatales. El tratamiento puede requerir la sustitución de la válvula por una válvula protésica, mecánica o bioprotésica. Las válvulas bioprotésicas incluyen habitualmente una parte de valva y una parte de conducto vascular, ambas generalmente de un material biológico y, posiblemente, una endoprótesis.

Si bien las válvulas bioprotésicas presentan un determinado número de ventajas en relación con las válvulas mecánicas, incluyendo un riesgo más bajo de complicaciones resultantes de la formación de trombos, las mismas se asocian con un riesgo más elevado de mineralización. Este riesgo incrementado limita de forma significativa la duración de la válvula de sustitución. La presente invención permite a los tejidos, incluyendo las válvulas de corazón, convertirse en resistentes a la mineralización, a la vez que conserva las propiedades biomecánicas del tejido. La presente invención permite también la reducción de la inmunorreactividad de los tejidos transplantados que no están fijados a través de medios químicos y físicos, con anterioridad a la implantación.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero, para sustituir un tejido defectuoso en el mamífero, en el que el tejido defectuoso es seleccionado de entre el grupo que comprende una válvula de corazón, un tendón, un ligamento, una arteria, una vena, un diafragma, un pericardio, una fascia, una duramáter y una membrana del tímpano, en el que el medicamento comprende un tejido bioprotésico que está descelularizado y no fijado y en el que el procedimiento comprende los pasos de:

(i): lavar un tejido de partida con un antibiótico, a los efectos de que el tejido de partida esté desinfectado, en el que el tejido de partida es seleccionado de entre el grupo que comprende una válvula de corazón, un tendón, un ligamento, una arteria, una vena, un diafragma, un pericardio, una fascia, una duramáter y una membrana de tímpano;

(ii): después del paso (i), poner en contacto el citado tejido desinfectado con una solución hipotónica para que tenga lugar la lisis de las células del citado tejido desinfectado; e

(iii): incubar el tejido tratado con la solución hipotónica que resulta del paso (ii), con una solución de nucleasa.

Entre los ejemplos de tejidos de válvula de corazón que pueden ser sometidos a la presente invención se incluyen valvas y conductos vasculares asociados con válvulas.

Breve descripción de los gráficos

Las Figuras 1A y B muestran el efecto de la descelularización sobre la extensibilidad y el módulo elástico de valvas pulmonares y aórticos.

Las Figuras 2A y B muestran el efecto de la descelularización sobre las velocidades de relajación de tensión de las valvas pulmonares y aórticos.

Las Figuras 3A, B y C muestran el efecto de la descelularización sobre la carga de rotura, la tensión máxima y el módulo elástico de las valvas aórticas y pulmonares.

Las Figuras 4A, B, C y D muestran el efecto de la descelularización sobre la calcificación de aortas de corazón porcino y sobre tejidos de válvula de corazón pulmonares.

Breve descripción de la invención

La presente invención está relacionada con la conversión de un tejido biológico en acelular. El procedimiento comprende la exposición del tejido a una solución hipotónica, en condiciones tales que se produce lisis celular y el sometimiento del tejido resultante a tratamiento con nucleasa, para eliminar los ácidos nucleicos y los grupos que contienen fósforo asociado, los cuales pueden capturar calcio. El tratamiento con nucleasa detiene de forma eficaz la replicación celular y la síntesis proteínica. En un aspecto preferido de esta realización, el tejido es convertido en esencialmente acelular, significando el término "esencialmente" el hecho de tener al menos el 70% menos de células que el material biológico de origen natural. La extensión de la descelularización puede ser determinada histoquímicamente, por ejemplo, a través del teñido del tejido con hematoxilina y eosina, utilizando técnicas habituales. Puede también utilizarse el teñido inmunohistoquímico, por ejemplo, para visualizar marcadores celulares específicos, tales como actina de músculo liso y antígenos de histocompatibilidad- constituyendo una ausencia de los citados marcadores una nueva indicación de descelularización.

De acuerdo con el presente procedimiento, el tejido biológico es primero lavado en una solución de un antibiótico. El tejido puede ser después descelularizado inmediatamente o el mismo puede ser crioconservado. El tejido crioconservado es descongelado con anterioridad a la descelularización, en condiciones tales que el crioprotector es eliminado y la toxicidad resultante del mismo evitada de esta forma. Las condiciones de descongelación adecuadas son bien conocidas en el estado de la técnica. El tejido (fresco o crioconservado descongelado) es después colocado en solución hipotónica, con vistas a llevar a cabo la lisis celular. Entre las soluciones adecuadas se incluye el agua o una solución que tenga una concentración de soluto (por ejemplo, una sal como NaCl) de hasta 80 miliosmolar (por ejemplo, una solución de NaCl 10-20 ó 20-40 mM). La lisis puede ser efectuada, por ejemplo, a una temperatura comprendida en la banda que oscila entre 30 y 40ºC, preferiblemente 37ºC, de forma ventajosa en atmósfera con un 5% de CO_{2}, por ejemplo, durante un período de entre aproximadamente 4 y 24 horas. El tejido es después transferido a una solución de nucleasa (por ejemplo, conteniendo DNAasa- y/o RNA asa) y sometido a incubación, por ejemplo, a una temperatura comprendida en la banda que oscila entre 30 y 40ºC, preferiblemente 37º, de forma ventajosa en atmósfera con 5% de CO_{2}, por ejemplo durante un período de tiempo comprendido entre aproximadamente 4 y 24 horas. Subsiguientemente, el tejido es transferido a una solución que puede mantener la integridad de la estructura del tejido, por ejemplo, una solución fisiológicamente normal (isotónica), tal como un medio de cultivo celular, por ejemplo DMEM. La lisis celular puede continuar durante el mantenimiento del tejido en la solución fisiológicamente normal y de esta forma el tejido puede ser extraído de las soluciones lítica/nucleasa antes de que se haya logrado el 70% de la descelularización.

Los tejidos que han sido descelularizados pueden ser esterilizados terminalmente utilizando cualquiera de entre una diversidad de esterilizadores. Por ejemplo, el tejido puede ser sometido a irradiación gamma, óxido de etileno, ácido peracético, \beta-propiolactona, yoduro de povidona, o irradiación UV en presencia o ausencia de fotosensibilizadores. Las condiciones adecuadas para llevar a cabo la esterilización terminal son bien conocidas en el estado de la técnica.

Entre los tejidos biológicos que resultan adecuados para ser utilizados en el presente procedimiento se incluyen aquellos que resultan apropiados para la implantación en humanos o animales. Los tejidos pueden ser humanos o no humanos (por ejemplo, bovinos, porcinos o primates no humanos) en origen. Tal y como se ha indicado anteriormente, los tejidos pueden ser frescos o crioconservados. En cualquier caso, el tejido es descelularizado con anterioridad a llevar a cabo cualquier fijación. Si bien la presente invención resulta ejemplarizada por referencia a valvas de válvula de corazón, el procedimiento de descelularización resulta aplicable también a otros tejidos, incluyendo tendones, ligamentos, diafragma, pericardio, cordones umbilicales, duramáter o membranas de tímpano.

Una vez completada la descelularización, el tejido biológico puede ser procesado y/o fabricado según resulte adecuado, en función del uso final al que se destine el tejido. En un medicamento fabricado utilizando la presente invención se utiliza tejido no fijado. El tejido no fijado puede ser impregnado con una diversidad de agentes, incluyendo aquellos que estimulan la recelularización tras la implantación del tejido descelularizado in vivo. Entre los ejemplos de los citados agentes se incluyen factores del crecimiento, factores de adherencia, tales como glicosaminoglicanos y glicoproteínas de matriz extracelular soluble, tales como fibronectina, laminina, vitronectina, etc. Entre otros agentes que pueden ser utilizados se incluyen aquellos que aumentan la hemocompatibilidad, trombomoduladores y antibióticos. Las técnicas de impregnación adecuadas resultan conocidas en el estado de la técnica. Cuando el tejido es una válvula de corazón, la fabricación con una endoprótesis biológica o no biológica puede ser efectuada utilizando protocolos estándar.

Las bioprótesis producidas según la presente invención se destinan al uso como sustituciones de tejidos defectuosos en mamíferos, particularmente en humanos. Los procedimientos para llevar a cabo la sustitución de, por ejemplo, válvulas de corazón, tendones, ligamentos, vasos, etc., resultan conocidas en el estado de la técnica.

El tejido descelularizado según la presente invención esta sujeto a una mineralización más baja (por ejemplo, calcificación) in vivo que las de los tejidos no tratados. La descelularización da lugar también a un tejido que presenta una inmunogenicidad reducida.

Determinados aspectos de la presente invención se describen con mayor detalle en los Ejemplos no limitativos que siguen a continuación. Si bien la metodología de descelularización de la presente invención y la de la USP 5.595.571 son diferentes, se apreciará el hecho de que determinados detalles de esa descripción son igualmente aplicables aquí, incluyendo la fuente de tejidos biológicos, los procedimientos de monitorización de la extensión de la descelularización y los procedimientos para el procesado y la fabricación post-descelularización.

Ejemplo I Descelularización de valvas y valores completos

En los protocolos que se indican a continuación de utilizan las siguientes soluciones:

Tris 1M pH 7,6: a 80 ml de agua desionizada se le añaden 11,21 gm de Tris, se ajusta el pH a 7,6 con NaOH 1N y se enrasa el volumen hasta alcanzar un volumen de 100 ml y se almacena a 4ºC.

CaCl_{2} 1M: a 10 ml de agua desionizada se le añaden 2,033 gm de MgCl_{2} y se almacena a 4ºC.

Solución de DNAsa I: a 4,95 ml de agua esterilizada se le añaden 5 ml de glicerol (concentración final 50%), 20 mg de DNAsa I (Sigma D5025) (concentración final 2 mg/ml), y 50 \mul de CaCl_{2} 1 (concentración final 5 mM). Se preparan alícuotas de 1 ml en tubos micrófugos de 1,5 ml marcados refrigerados y se almacena a -20ºC.

Solución de RNAsa A: a 10 ml de agua esterilizada se le añaden 100 mg de RNAsa A, y se mezclan para disolver. Se añaden alícuotas de 500 \mul de solución a cada uno de 20 tubos micrófugos de 1,5 ml pre-refrigerados y se almacena a -20ºC.

Solución de nucleasa: a 93,66 ml de agua esterilizada se le añaden 4,8 ml de Tris 1M pH 7,6 (final 48 mM), 288 \mul de MgCl_{2} 1M (concentración final 2,88 mM), 96 \mul de CaCl_{2} 1M (concentración final 0,96 mM), se esteriliza mediante filtro utilizando un filtro de 0,2 micras, se añaden 960 \mul de DNAsa a razón de 2 mg/ml (concentración final 19,2 \mug/ml) y 192\mul de RNAsa A a razón de 10 mg/ml (concentración final 19,2 \mug/ml).

Descelularización de valvas

Dia 1

Una válvula es extraída de un congelador de nitrógeno líquido y sumergida en un baño de agua a 37ºC, durante un período aproximado de 15 min. En condiciones estériles, la válvula es extraída del embalaje y colocada en una copa estéril para muestra de 7 oz., con aproximadamente 50 ml solución de dextrosa con lactato de Ringer al 5% (LRD5), durante un período de 15 min., a temperatura ambiente. La válvula es diseccionada mediante un corte sencillo hacia la comisura localizada entre las arterias coronarias derecha e izquierda. La válvula se deja abierta con la valva de la válvula mitral hacia arriba, la valva coronaria izquierda hacia la izquierda, la valva coronaria derecha hacia la derecha y la valva no coronaria en el centro. Se liberan las valvas de la válvula por medio de disección, lo más próximo posible de la pared del conducto y se colocan en tubos de centrifugación separados, cónicos, marcados, de 15 ml de capacidad, rellenados con 10 ml de solución LRD5, durante un período de 10 minutos a temperatura ambiente. Las valvas son desplazadas hacia unos segundos tubos cónicos de centrifugación marcados, de 15 ml de capacidad, rellenados con 10 ml de solución LRD5 y se dejan en reposo a temperatura ambiente durante un período de 10 minutos. Las valvas son entonces desplazadas hacia unos terceros tubos de centrifugación cónicos de 15 ml de capacidad, marcados, rellenados con 10 ml de agua esterilizada y colocados en una incubadora a 37ºC, con CO_{2} al 5%, durante un período de 2 horas. Las valvas son colocadas en placas de cultivo de 6 pocillos
y sujetadas con anillos de vidrio estériles. A cada uno de los pocillos se le añaden 5 ml de solución de nucleasa y las valvas son sometidas a incubación durante el transcurso de una noche a 37ºC, con 5% de CO_{2}.

Dia 2

La solución de nucleasa es retirada y se añaden 5 ml de DMEM a cada uno de los pocillos y las valvas son devueltas a la incubadora.

Dias 3-16

Se cambia el medio a días alternos, durante un período de dos semanas.

Procedimiento alternativo para válvulas completas

Si las válvulas han sido crioconservadas, las mismas son descongeladas y lavadas tal y como se ha indicado anteriormente; si las válvulas son frescas, las mismas son lavadas una vez en 80 ml de LRD5, durante un período de 15 minutos, en una copa de muestra estéril de 7 oz.

Una vez lavada la válvula, la misma es transferida a una copa de muestra estéril de 7 oz que contiene aproximadamente 80 ml de H_{2}O estéril y es colocada en una incubadora a 37ºC, 5% de CO_{2}, durante un período de 4 horas.

La válvula es retirada a una copa de muestra estéril de 7 oz que contiene aproximadamente 80 ml de solución de nucleasa y devuelta a la incubadora durante el transcurso de una noche.

Dia 2

La válvula es retirada a una copa de muestra estéril de 7 oz que contiene aproximadamente 80 ml de solución (ALT+) (conteniendo netilmicina, 54\mug/ml; lincomicina, 131 \mug/ml; cefotaxima, 145 \mug/ml; vancomicina, 109 \mug/ml; rifampina, 65 \mug/ml; fluconazol, 100 \mug/ml; y amfotericina B, 84 \mug/ml.

Dia 3-16

El medio es cambiado a días alternos durante un período de dos semanas, utilizando solución ALT+ durante la primera semana y DMEM durante la segunda.

Los siguientes procedimientos son procedimientos de cultivo abiertos. Así pues, las tapas de la copa de muestra son soltadas cuando se coloca en la incubadora.

Ejemplo II

Detalles experimentales

Válvulas de corazón porcino. Se obtuvieron válvulas de corazón porcino procedentes de cerdos de mercado (>120 kg). Una vez enjuagados en solución salina estéril tamponada con fosfato, los corazones fueron diseccionados sobre el terreno (se extrajeron las puntas) y enviados a 4ºC en PBS estéril. La totalidad de los corazones llegaron dentro de las 24 horas siguientes al sacrificio del animal. Las válvulas aórticas y pulmonares fueron diseccionadas como raíces. Estos tejidos fueron sometidos a un paso de reducción de biocarga de incubación en una mezcla de antibióticos y antimicóticos, durante un período de 48 horas a 48ºC. Los tejidos desinfectados fueron o bien crioconservados (10% de DMSO (v/v) y 10% (v/v) de suero bovino fetal, -1ºC/min) o fueron descelularizados a través de un procedimiento que conlleva el tratamiento con medio hipotónico, seguido de digestión con una mezcla de desoxirribonucleasa I y ribonucleasa A. Transcurridos 12 días, las válvulas descelularizadas fueron o bien crioconservadas tal y como se ha indicado con anterioridad o fijadas químicamente en 0,35% de glutaraldehido (peso/volumen), a 2 mmHg, en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), durante un período total de 7 días; la fijación a baja presión asegura el mantenimiento del ondulado natural de la matriz de colágeno. Los tejidos fijados no fueron crioconservados pero fueron almacenados en una solución de glutaraldehido al 0,35%.

Con anterioridad a llevar a cabo cualquier tipo de examen (calcificación, biomecánico, histología), los tejidos crioconservados fueron descongelados rápidamente para evitar la recristalización por hielo, a través de la inmersión del tejido embalado en un baño de agua a 37ºC. El medio de crioconservación fue eluido de las válvulas descongeladas con 500 ml de solución de lactato de Ringer que contenía 5% de dextrosa. Los tejidos fijados con glutaraldehido fueron lavados tres veces, utilizando cada vez 200 ml de solución salina normal.

Calcificación estática in vivo. La calcificación de los tejidos tratados fue valorada in vivo a través de implantación subdérmica en ratas. Se obtuvieron ratas destetadas macho Sprague-Dawley, procedentes de Charles Rivers Laboratories. Después de una semana de equilibrado, los animales promediaron un peso de 136 \pm 18 gramos. Las válvulas de corazón fueron diseccionadas para proporcionar valvas pulmonares y aórticas y secciones de conducto vascular, cada uno de ellos de 0,5 cm cuadrados. Una vez las ratas hubieron recibido anestesia de ketamina y xilacina (10 mg/kg y 5 mg/Kg, respectivamente, IP) y después de la preparación de un campo estéril, se formaron bolsas de 2 cm de diámetro en el subcúbito dorsal, cuatro por animal, y se insertaron secciones de tejido. Las incisiones fueron cerradas con grapas de acero inoxidable. Se permitió que las ratas se recuperaran y se les permitió tener libre acceso a comida y agua. Las muestras de tejido fueron recuperadas al cabo de 1, 2 y 4 meses de su implantación, con vistas a determinar su contenido en calcio.

Procedimiento para la determinación del calcio en muestras de tejidos. Los tejidos recuperados fueron lavados en calcio estéril y solución salina tamponada con fosfato exenta de magnesio, tres veces, 10 ml cada una de ellas. Se midió el peso en húmedo y, una vez desmenuzadas, las piezas fueron secadas durante el transcurso de una noche en un evaporador de centrifugación (Savant Speed-Vac). Una vez registrado el peso en seco, los tejidos fueron sometidos a digestión en 10 ml de HNO_{3} al 25% (v/v), durante al menos 24 horas a 70ºC. Una alícuota de la solución digerida fue diluida 10 veces en HCl 0,2 N. conteniendo un 1% (peso/volumen) de nitrato de lantano. Finalmente, se midió el contenido en calcio utilizando un espectrómetro de absorción atómica Perkin-Elmer 300, calibrado con un estándar de calcio certificado por SPEX Plama Standars (Cat. PLCA2-3Y). La respuesta en este sistema era lineal entre 0,2-20 \mug/ml.

Comprobación biomecánica. Se cortaron valvas pulmonares y aórticas mediante troquel, con dimensión de circunferencia, para proporcionar muestras de forma de "hueso de perro", de una anchura de 0,5 cm en la parte central. El grosor de cada una de las muestras procedía del promedio de tres mediciones tomadas con una clavija de poca masa unida a un circuito de conductancia y calibrador digital. Las valvas fueron montadas en pinzas especialmente diseñadas con una longitud de calibre estándar de 1 cm. La totalidad de las comprobaciones fue llevada a cabo con en tejido en solución de sal equilibrada de Hank, conservada a 37 \pm 2ºC. Cada una de las muestras fue preacondicionada hasta una carga de 150 g, hasta que las sucesivas curvas de alargamiento de carga fueron superimponible (-20 ciclos). Las siguientes mediciones fueron entonces tomadas: 1) alargamiento a baja carga, para derivar relaciones de tensión-deformación, a la vez de imponer hasta un total de 150 g de carga sobre el tejido a una velocidad de extensión de 10 mm/min, una velocidad que refleja estudios reportados con anterioridad de biomecánica de valvas (Leesson-Dietrich et al., J. Heart Valve Disease 4:88 (1995)), 2) examen de propiedades viscoelásticas de las muestras en estudio de relajación de tensión (tejido alargado hasta una carga de 150 g y después seguido de cargas residuales, durante hasta 1.000 seg) - se determinaron ambos % de carga inicial remanente en estos momentos temporales, al igual que la velocidad de relajación de tensión (a saber, la inclinación del porcentaje de tensión remanente frente al tiempo); y 3) prueba de tracción uniaxial última para fallo de tejido. Se examinaron al menos 8 muestras de cada uno de los tipos de tejido.

Histoquímica. Muestras de tejidos frescos y explantados fueron sumergidos en 10% de solución de sacarosa durante un período de 4-18 horas, a 4º. Después de una breve fijación en 10% de formalina, las piezas fueron colocadas en moldes y congeladas en OCT, utilizando un baño de nitrógeno líquido. Se cortaron criosecciones, de un grosor de entre 6-10 \mum, utilizando un criostato IEC (Needham Heights, MA). Se tiñeron secciones, o bien con hematoxilina e eosina o se tiñeron específicamente para calcio, según el procedimiento de von Kossa (Theory and Practice of Histological techniques, editado por Bancroft and Stephens, Churchill Livingstone, Edimburgh (1990)). Las secciones fueron observadas y fotografiadas utilizando un microscopio Nikon Optiphot.

Estadísticas. Las diferencias estadísticas en los medios del grupo de parámetros biomecánicos fueron valoradas a través de comprobaciones-t independientes. Se eligió un valor p de 0,5 como el nivel de diferencias significativas. Los datos de calcio fueron analizados según comprobación ANOVA, llevada a cabo con el programa estadístico para el IBM-PC, SPSS-PC.

Resultados

Biomecánica. Comprobación a baja carga - extensibilidad y módulo bajo. Se compararon las propiedades biomecánicas de tiras de valvas de válvula de corazón de cerdo pulmonares y aórticas, entre tejidos frescos-crioconservados y tejidos descelularizados-crioconservados. Se averiguó que los valvas frescas de aorta y las valvas pulmonares tenían diferencias significativas en cuanto a la extensibilidad; las valvas pulmonares tenían una extensión 2,3 veces más elevada que la de las valvas aórticas (p < 0,1)). No obstante, el módulo elástico de estos tejidos no era diferente en pre-descelularización (10,6 \pm 1,1 frente a 9,15 \pm 0,64, p = 0,255, Fig. 1). Con la descelularización, la extensibilidad de los dos tipos de valvas se convirtió en indistinguible (30,4 \pm 2,5 frente a 30,2 \pm 3,3, p = 0,981). El módulo elástico de las valvas aórticas no se modificó a través de la descelularización (p = ns (no significativo)), en comparación con la del tejido fresco). Por el contrario, los tejidos de valva pulmonar adquirían una marcada rigidez a través de la descelularización, elevándose el módulo elástico un 660%, (p0 <0,05). Como resultado, el módulo elástico del tejido pulmonar descelularizado era un 50% más elevado que el de la valva aórtica descelularizada.

Comprobación de la relajación de tensión. La velocidad inicial (10 seg.) y final (1.000 seg.) de la relajación de tensión para las valvas aórticas y pulmonares frescas eran comparables y no resultaban estadísticamente diferentes (p = 0,103 y p = 0,115, respectivamente, Fig. 2). Para tejidos descelularizados, tan solo la velocidad inicial de relajación de tensión o las valvas aórticas se habían obtenido; y no resultaban diferentes a los valores del tejido fresco. La rigidez incrementada de las valvas pulmonares observada con la descelularización con comprobaciones a baja carga se reflejó a través de un nivel final más elevado de la tensión remanente (incremento desde 64,1 \pm 2,18 hasta 81,5 \pm 2,5). La inclinación de relajación para las valvas pulmonares resultaba modificada recíprocamente a través de la descelularización, descendiendo desde 9,8 \pm 0,8 en el tejido fresco hasta 4,7 \pm 1,5 en el tejido tratado.

Comprobación de la tracción final-carga de rotura, tensión máxima y módulo elástico (Fig. 3). En tejidos frescos, las valvas aórticas fallaban al doble de carga que en los tejidos de válvula pulmonar (p < 0,001). No obstante, no existían diferencias estadísticas en la tensión máxima de fallo entre las valvas pulmonares y las valvas aórticas (8,0 \pm 1,2 Mpa frente a 6,0 \pm 0,9, p = 0,202). Asimismo, los módulos de las valvas frescas no resultaban estadísticamente diferentes (p = 0,333).

Las valvas de aorta descelularizadas fallaban a la misma carga y tensión máxima que los tejidos frescos. La carga de rotura de las valvas pulmonares se incrementó ligeramente pero no de modo significativo, pero se alcanzaron valores de hasta el triple en la tensión de rotura.

La rigidez de las valvas pulmonares observada con la comprobación de carga se reflejó de nuevo cuando el tejido fue sometido a carga de rotura. Los módulos de las valvas pulmonares hasta obtener rotura se incrementaron después de la descelularización 2,6 veces; por el contrario, los módulos elásticos de las valvas aórticas descelularizadas se reducían ligeramente (45,5 \pm 6,2 Mpa frente a 38,3 \pm 5,2 Mpa).

Calcificación del tejido. En la Figura 4 se presenta la cinética de la calcificación de tejidos de válvula de corazón porcino a los 1,2 y 4 meses de su implantación. Los tejidos de válvula de corazón pulmonares porcino fijados con glutaraldehido aparecían como especialmente proclives a la calcificación en el modelo de rata subdérmico. Las valvas pulmonares y el conducto vascular calcificaban más rápidamente que sus contrapartidas de válvula aórtica, las valvas pulmonares fijadas calcificaban más rápidamente que la totalidad de tejidos examinados. Además, las valvas pulmonares fijadas con glutaraldehído alcanzaban el contenido de calcio en tejido más elevado a lo largo de los cuatro meses de implantación subcutánea. En general, los conductos vasculares calcificaban más lentamente que las valvas obtenidas a partir del mismo tipo de válvula y el contenido final en calcio resultaba significativamente más bajo (p < 0,05, tanto para las válvulas aórticas como para las válvulas pulmonares), a los 4 meses.

El impacto de la despoblación sobre la calcificación en la válvula de corazón es contemplado como un enlentecimiento de la calcificación del tejido fijado o no fijado (valva pulmonar) o como una mesetización de la calcificación, después de transcurridos dos meses desde la implantación (valva aórtico, conducto aórtico, arteria pulmonar). El fenómeno de la mesetización fue observado tanto en tejidos no fijados como en aquellos descelularizados con anterioridad a la fijación con glutaraldehido. No se encontró ninguna diferencia estadísticamente significativa en la calcificación del conducto aórtico entre los grupos de tratamiento, a lo largo de los 4 meses subsiguientes a la implantación. La calcificación del conducto aórtico descelularizado tenía lugar más rápidamente que en el tejido fijado durante los dos primeros meses desde la implantación y después se nivelaba, mientras que el contenido en calcio del conducto fijado continuaba incrementándose. Se observó también un efecto atenuante sobre el incremento en contenido de calcio en la arteria pulmonar, en relación con cualquiera de los grupos de tejido fijado.

Las valvas aórtica y pulmonar presentaban respuestas algo diferentes frente a la descelularización. La descelularización de las valvas aórticas con la subsiguiente fijación daban lugar a un contenido en calcio más bajo (tejido con 73 \pm 17 mg Ca^{2+}/g) que las valvas aórticas que no estaban fijadas (121 \pm 8 mg/g, p < 0,05). Si bien el tejido no se encontraba disponible desde el punto temporal de los 4 meses, en las valvas pulmonares, el tejido descelularizado tendía de por sí a presentar un contenido más bajo en calcio (152 \pm 5 frente a 101 \pm 34 mg, a los 2 meses de la implantación).

Exámenes histológicos. Dentro de la matriz del tejido pueden observarse áreas de valvas aórticas porcinas descelularizadas, libres de células endógenas, así como ausencia de depósitos, al cabo de 1 mes. La medición del calcio en tejido en este grupo fue de 60 \pm 14 mg/g, localizándose tan solo depósitos de calcio en áreas localizadas. Ras un examen con mayor profundidad utilizando teñido Kossa, las citadas áreas resultaron evidentes. Dentro de las citadas áreas los depósitos de calcio aparecían en asociación con estructuras no específicas. Por el contrario, la calcificación temprana de los tejidos fijados con glutaraldehido estaba siempre asociada con los núcleos celulares. La extensión creciente de la involucración del tejido de velo con el tiempo de implantación resulta evidente a partir de la secuencia de los meses 1, 2 y 4. La parte central de las valvas calcificaba antes, mientras que los márgenes calcificaban más tarde. Tanto en los componentes vasculares de la válvula aórtica como la válvula pulmonar las áreas calcificadas permanecían habitualmente en la periferia del implante, y solo en casos pocos frecuentes los tejidos mostraban evidencia de mineralización de la sustancia central del implante.

Claims

1. Procedimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero para reemplazar un tejido defectuoso en el mamífero, en el que el tejido defectuoso es seleccionado de entre el grupo que comprende una válvula de corazón, un tendón, un ligamento, una arteria, una vena, un diafragma, un pericardio, una fascia, una duramáter y una membrana de tímpano, en el que el medicamento comprende un tejido bioprotésico que está descelularizado y no fijado, y en el que el procedimiento comprende los pasos de:

(i): lavar un tejido de partida con un antibiótico, a los efectos de que el citado tejido de partida esté desinfectado, en el que el tejido de partida es seleccionado de entre el grupo que comprende una válvula de corazón, un tendón, un ligamento, una arteria, una vena, un diafragma, un pericardio, una fascia, una duramáter y una membrana de tímpano;

(ii): después del paso (i), poner en contacto el citado tejido desinfectado con una solución hipotónica, para que tenga lugar la lisis de las células del citado tejido desinfectado; e

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende, además:

(iv): después del paso (iii), poner en contacto el tejido que resulta del paso (iii) con una solución fisiológicamente isotónica.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el citado tejido de partida es tejido humano.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el cual el citado tejido de partida es tejido de válvula de corazón humano.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el citado tejido que resulta del paso (iii) está descelularizado al menos en un 70%.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la solución de nucleasa contiene DNAasa o RNAasa.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la solución de nucleasa contiene DNAasa y RNAasa.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el citado tejido de partida es tejido no humano.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el citado paso (ii) se lleva a cabo a una temperatura comprendida en la banda que oscila entre 30 y 40ºC.