ES2228520T3 - Capatura rapida y eficaz de adn de una muestra sin usar reactivo de lisis celular. - Google Patents
Capatura rapida y eficaz de adn de una muestra sin usar reactivo de lisis celular.Info
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Abstract
Un procedimiento para proporcionar un ácido nucleico a partir de una muestra sin el uso de un reactivo de lisis celular, que comprende las etapas de: A) a un pH de menos de 7, poner en contacto una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico con un polímero soluble en agua, débilmente básico que comprende unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de: 1) entre aproximadamente 15 y 100% en peso de un monómero polimerizable débilmente básico etilénicamente insaturado que tiene al menos un grupo que se puede protonar a pH ácido y que se selecciona entre el grupo constituido por aminoalquilo, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y quinazolinilo 2) entre 0 y aproximadamente 35% en peso de un monómero no iónico, hidrófilo etilénicamente insaturado, y 3) entre 0 y aproximadamente 85% en peso de un monómero polimerizable, no iónico, hidrófobo etilénicamente insaturado en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de dicho polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en dicho lisado, B) separar dicho precipitado insoluble en agua de dicha muestra, y C) poner en contacto dicho precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar dichos ácidos nucleicos de dicho polímero débilmente básico, comprendiendo dicho polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido.
Description
Captura rápida y eficaz de ADN de una muestra sin
usar reactivo de lisis celular.
Esta invención se refiere a un procedimiento para
preparar una muestra mediante captura y liberación selectiva de
ácidos nucleicos para detección. En particular, se refiere a un
procedimiento para la captura y liberación de ácidos nucleicos para
tratamiento posterior tal como amplificación. También se refiere a
un kit se ensayo para uso en el procedimiento.
La tecnología para detectar cantidades minúsculas
de ácidos nucleicos ha avanzado rápidamente a lo largo de las dos
últimas décadas incluyendo el desarrollo de técnicas de
amplificación altamente sofisticadas tales como la reacción en
cadena de la polimerasa (abreviadamente en inglés PCR). Los
investigadores han reconocido fácilmente el valor de tal tecnología
para detectar ácidos nucleicos que son indicadores de enfermedades
y características genéticas en especímenes de ensayos de seres
humanos y de animales. El uso de sondas y cebadores en tal
tecnología se basa en el concepto de complementariedad, es decir, la
unión de dos cadenas de un ácido nucleico mediante enlaces hidrógeno
entre nucleótidos complementarios (también conocidos como pares de
nucleótidos).
La PCR es un avance significativo en la técnica
para permitir la detección de concentraciones muy pequeñas de un
ácido nucleico diana. Los detalles de la PCR se describen en, por
ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.683.195 (Mullis y col.,),
la patente de Estados Unidos Nº 4.965.188 (Mullis y col.,), aunque
existe un volumen rápidamente creciente de bibliografía en este
campo.
Con el fin de ampliar y detectar eficazmente un
ácido nucleico diana, por lo general es necesario aislar ese ácido
nucleico de los desechos celulares y de otros especímenes. Se
conocen diversos procedimientos de lisis, que incluyen congelación,
tratamiento con enzimas digestivas tales como proteasas (por
ejemplo, la proteinasa K), ebullición, y uso de diversos detergentes
(véase, por ejemplo, El documento de Estados Unidos Nº de serie
178.202, presentado el 6 de abril de 1988 por Higucji, y el
documento EP-A-0 428 197, publicado
el 22 de mayo de 1991), precipitaciones con disolvente y protocolos
de calentamiento.
El ADN circulante se ha detectado en plasma y
suero sanguíneo. Cantidades en nanogramos se detectan en sujetos
normales (Steinman, C. R., J Clin. Invest. 56:
512-515, 1975 y Raptis, L., y col., J Clin. Invest.
66: 1391-1399, 1980) y se detectan niveles
aumentados en enfermedades autoinmunes crónicas (Leon, S. A., y
col., Cancer Res., 37: 646-650, 1977) y en los
pacientes con cáncer (Stroun, M., y col., Eur. J. Cancer Clin.
Oncol. 28: 707-712, 1987; Maebo., Jpn. J. Thorac.
Dis. 28: 1085-1091, 1990; Fournie, G. J., y col.,
Cancer Lett., 91: 221-227, 1995; Lin, A., y col.,
BioTecniques 24: (6) 937-940, 1998; y Sorenson, G.
D., y col., Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 3:
67-71., 1994). Recientemente, se ha hecho evidente
que el ADN extracelular libre presente en el suero y plasma
sanguíneo se puede usar para análisis de genotipo (Lin, A., y col.,
BioTecniques 24: (6) 937-940, 1998), para la
detección de cáncer (Mulcahy, H. E., y col., Clin. Cancer Res. 4:
271-275, 1998), y ADN en suero materno se puede usar
en diagnóstico prenatal (Lo Dennis, y col., Am. J. Human Genet. 62:
768-775, 1998). La mutaciones presentes en un tumor
primario, a menudo se pueden detectar usando ADN de plasma sanguíneo
o de suero (Sorenson, G. D., y col., Cancer Epidemiology, Biomarkers
and Prevention 3: 67-71., 1994; Vasyukhin, V., y
col., en Challenges of Modern Medicine, Vol. 5, Biotechnology Today,
R. Verna, y A. Shamoo, eds, 141-150.
Aera-Serono Simposia Publications, Rome; Mulcahy, H.
E., y col., anteriormente; Kopreski, M. S., y col., Brit. J. Cancer
76: 1293-1299, 1997; Chen, X., y col., Nature
Medicine 2: 1033-1035, 1996; Vasioukin, V., y col.,
Brit. J. Haematology 86: 774-779, 1994; y Tada, M.,
y col., Cancer Res. 53.: 2472-2474, 1993). Así pues,
el ADN presente en suero y plasma representa una fuente invasiva en
forma mínima para la información relacionada con diagnosis,
prognosis, y terapia de cáncer.
Para ampliar y detectar eficazmente un ácido
nucleico diana, usualmente es necesario separar el ácido nucleico de
sustancias que interfieren presentes en un espécimen de interés. Se
ha usado varios planteamientos diferentes para concentrar y
purificar ADN de suero o plasma sanguíneo. Muchos de estos
procedimientos implican múltiples etapas incluyendo tratamiento con
fenol, éter, y cloroformo, diálisis, paso a través de Concanavalina
Sefarosa A para eliminar los polisacáridos y después centrifugación
en un gradiente de cloruro de cesio (Vasyukhin, V., y col.,
anteriormente). Más recientemente, Qiagen ha comercializado un
sistema para la concentración y purificación basándose en un
protocolo de columna de centrifugación de sílice. El protocolo de
Qiagen es complejo, implicando un total de ocho etapas, tratamiento
con una proteasa, incubaciones a 70ºC, y requiere el uso de al menos
3 tampones diferentes, además de una etapa de centrifugación en
columna de centrifugación de sílice.
Recientemente, Goecke y col., (documento
97/34015) describieron la detección de ácido nucleico extracelular
asociado a tumores en plasma y suero sanguíneo usando ensayos de
amplificación de ácidos nucleicos. En su procedimiento preferido, el
ADN se co-precipita a partir de plasma y suero
usando un protocolo de múltiples etapas que implica una
co-precipitación inicial por gelatina, seguida de
tratamiento con disolvente y centrifugación. También se describen
otros protocolos de larga duración y complejos que implican el uso
de perlas de vidrio, partículas de sílice o tierra de diatomeas
para la extracción de ADN de suero y plasma.
El uso de polímeros débilmente básicos para la
captura y liberación selectiva de ácidos nucleicos se ha descrito en
la patente de Estados Unidos Nº 5.622.822 (Ekeze y col.), la patente
de Estados Unidos Nº. 5.582.988 (Backus y col.), y la patente de
Estados Unidos Nº 5.434.270 (Ponticello, y col.). Los protocolos
descritos en las patentes anteriormente mencionadas tras el uso de
un agente de lisis de células o una etapa de lisis de células. Los
tensioactivos se usan a menudo como agentes de lisis de células. El
uso de tensioactivos y otros agentes de lisis dan como resultado la
liberación de ácidos nucleicos de las células y componentes
celulares en sangre; produciendo una gran concentración de ADN de
fondo.
El documento WO 97/34015 describe un
procedimiento para detectar y aislar ADN extracelular de plasma
sanguíneo. La muestra de plasma que contiene el ADN extracelular se
trata primero con una etapa de extracción con fenol; cloroformo:
alcohol isoamílico seguida de una etapa de precipitación con
gelatina del ADN en presencia de etanol. Después de la
centrifugación el ADN se liofiliza y se vuelve a suspender en agua
destilada dispuesta para una reacción de amplificación.
El documento WO 95/16792 describe el aislamiento
de ADN circulante libre a partir del plasma. El ADN se aísla después
de una etapa de extracción con fenol/cloroformo y se usa una columna
de afinidad ConA-sefarosa.
El documento EP 707.077 describe el uso de un
polímero débilmente básico que se usa para capturar ADN a pH ácido
por consiguiente para proporcionar un procedimiento para aislar
ácido nucleico para tratamiento posterior.
Anker P. y col., Gastroenterology, 1997, 112 (4),
p. 1114-1120 describe un procedimiento de detección
de las mutaciones K-ras en ADN circulante libre a
partir del plasma de pacientes con cáncer.
Los problemas asociados al uso de agentes de
lisis o etapas de lisis en los procedimientos de la técnica
anterior se han superado con el procedimiento de la presente
invención.
El procedimiento de esta invención implica el
uso de un polímero débilmente básico, como se describe en las
patentes de Estados Unidos indicadas anteriormente, para la captura
y liberación selectiva de los ácidos nucleicos capturados a partir
del polímero, pero sin el uso de una etapa de lisis o agente de
lisis, como se realiza usando los procedimientos de la técnicas
anterior.
Según un aspecto de la invención, se proporciona
un procedimiento simplificado, fácil de usar para recuperar ADN a
partir de suero y plasma sanguíneo. El procedimiento incluye el uso
de un polímero débilmente básico para unirse al ADN de una muestra
tal como suero o plasma sanguíneo. Tras la unión al ADN, el polímero
se hace insoluble. Después el ADN unido al polímero se separa de la
mezcla líquida que comprende sustancias solubles no deseables.
Después el ADN se libera del polímero mediante la adición de álcali.
Así pues, el procedimiento de la presente invención requiere
solamente tres etapas: (a) contacto de la muestra con tampón, (b)
contacto e incubación de la mezcla formada en la etapa (a) con un
polímero débilmente básico, y (c) liberación del ADN unido al
polímero en la etapa (b) mediante contacto con álcali. El
procedimiento elimina la necesidad de extracción con alcohol u otro
disolvente y materiales tóxicos tales como fenol o cloroformo, y no
se usan agentes de lisis. El procedimiento no solamente simplifica
la recuperación de ADN, sino también da como resultado una mejora en
la producción de ADN diana amplificable. Aunque el procedimiento se
usa preferiblemente con suero y sangre como muestra, es aplicable a
otros fluidos corporales que incluyen, pero sin limitación, orina,
bilis, fluido de la médula espinal, lavado bronquial (BAL), lavados
de colon, y evacuación de vientre. Además, se pueden usar muestras
de cualquier otro tipo, incluyendo las recogidas de animales, seres
humanos, especímenes ambientales y microbianos.
En otro aspecto la presente invención se refiere
a la amplificación y detección de ADN diana usando el procedimiento
de recuperación de ADN descrito en esta memoria descriptiva
anteriormente.
Los procedimientos inventivos de la invención
comprenden las etapas de:
- A)
- a un pH de menos de 7, poner en contacto una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico con un polímero soluble en agua, débilmente básico en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua del polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en la muestra,
- B)
- separar el precipitado insoluble en agua de la muestra, y
- C)
- poner en contacto el precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar los ácidos nucleicos del polímero débilmente básico, comprendiendo el polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante la polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a un pH ácido.
Esta invención también proporciona un
procedimiento para la amplificación y detección de un ácido nucleico
diana que comprende:
- I)
- proporcionar un ácido nucleico diana usando las etapas de:
- A)
- a un pH de menos de 7, poner en contacto una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico diana con un polímero soluble en agua, débilmente básico en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de un polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en la muestra, incluyendo el ácido nucleico diana,
- B)
- separar el precipitado insoluble en agua de la muestra, y
- C)
- poner en contacto el precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar los ácidos nucleicos, incluyendo el ácido nucleico diana, del polímero débilmente básico, comprendiendo el polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido
- II)
- amplificar el ácido nucleico diana presente entre los ácidos liberados, y
- III)
- detectar el ácido nucleico diana amplificado.
Un kit de ensayo para la amplificación de un
ácido nucleico comprende, empaquetado separadamente:
- a)
- una mezcla de reacciones de amplificación que comprende uno o más reactivos de amplificación, y
- b)
- un polímero débilmente básico que comprende unidades recurrentes derivadas mediante la reacción de polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido.
La presente invención proporciona un
procedimiento rápido, sencillo y eficaz para aislar y proporcionar
selectivamente ácidos nucleicos para tratamiento adicional, tales
como ensayos de hibridación o procedimientos de amplificación. Esta
invención supera los problemas indicados anteriormente relativos a
medios de aislamiento convencionales, incluyendo el uso de
polietilenimina. Además, los problemas presentados por el uso de
polietilenimina combinada con un tensioactivo de fosfato fluorado
también se evitan porque el tensioactivo no se necesita. El
procedimiento de preparación de muestras de esta invención no es
tedioso y requiere un mínimo de etapas, por lo tanto lo hace más
fácilmente automatizable. Usualmente se puede llevar a cabo en
menos de 15 minutos (preferiblemente en menos de diez minutos).
Estas ventajas se proporcionan usando en lugar de
la polietilenimina un polímero "débilmente básico" que es
catiónico e insoluble en agua a pH ácido, pero se desprotona a un
pH básico que es significativamente superior al pKa del polímero.
"Débilmente básico" significa que el pKa del polímero es menor
que 7, y más probablemente menor que 6,5. Por lo tanto, el polímero
se puede usar a pH bajo para precipitar ácidos nucleicos debido a
la interacción iónica del polímero catiónico y la estructura
principal del fosfato aniónico de los ácidos nucleicos.
Después de eliminar los materiales no
complejados, y tras el ajuste de pH hasta condiciones básicas, los
ácidos nucleicos se liberan (o se descomplejan) del polímero
débilmente básico del precipitado y están disponibles para
tratamiento posterior, tal como amplificación. Los procedimientos de
amplificación se pueden llevar a cabo en condiciones básicas.
La Figura 1 ilustra una curva patrón para el ADN
evaluada mediante la amplificación de TaqMan con el gen actina
\beta después de 40 ciclos de PCR.
La figura 2 ilustra los resultados del análisis
para una mutación K-12 ras como se determina
mediante electroforesis en gel después de REMS-PCR
de acuerdo con el ejemplo 7.
La presente invención es especialmente adecuada
para la extracción y detección de uno o más ácidos nucleicos diana
presentes en una muestra de cualquier tipo recogida de especímenes
animales, humanos, ambientales o microbianos. Los ácidos nucleicos
así obtenidos se pueden tratar posteriormente sometiéndolos a
ensayos de hibridación convencionales, los procedimientos de los
cuales se conocen bien en la técnica (por ejemplo, la patente de
Estados Unidos Nº 4.994.373).
Sin embargo, la descripción restante se dirigirá
a realizaciones preferidas mediante las que los ácidos nucleicos se
someten a procedimientos de amplificación, particularmente la PCR.
Sin embargo, el alcance de esta invención no se intenta que se
limite debido a que también se pueden usar otras técnicas de
amplificación (tal como la LCR).
Los principios y condiciones generales para la
amplificación y detección de ácidos nucleicos que usan la reacción
en cadena de la polimerasa se conocen bastante bien, los detalles
de los cuales se proporcionan en numerosas referencias incluyendo
la patente de Estados Unidos Nº 4.683.195 (Mullis y col, la patente
de Estados Unidos Nº 4.683.202 (Mullis), la patente de Estados
Unidos Nº 4.965.188 (Mullis y col) y el documento
WO-A-91/12342. En vista de la
descripción proporcionada en esta memoria descriptiva, los expertos
en la técnica no deben tener ninguna dificultad en poner en
práctica la presente invención combinando el procedimiento
preparatorio de esta invención con procedimientos de la reacción en
cadena de la polimerasa, o con cualquier otro procedimiento de
amplificación conocido en la técnica.
Otros procedimientos de amplificación que se
pueden usar en la práctica de esta invención incluyen, pero sin
limitación, la reacción en cadena de la ligasa como se describe,
por ejemplo, en el documento EP-A-0
320 308 (publicado en diciembre de 1987) y el documento
EP-A-0 439 182 (publicado en enero
de 1990).
Los especímenes de ensayo ("muestras")
pueden incluir fluidos corporales u otros materiales que contienen
ADN o RNA genético. El ácido nucleico diana se puede extraer a
partir de cualquier fuente humana, animal, microbiana, viral o
vegetal.
El avance descrito en esta memoria descriptiva
contempla que antes de poner en contacto con el polímero débilmente
básico definido en esta memoria descriptiva, no se requiere
extracción de ácidos nucleicos del espécimen. Aunque la técnica
anterior describe diversos procedimientos de lisis conocidos en al
técnica (incluyendo los descritos por Maure y col en The Lancet,
pp. 538-540 (3 de septiembre de 1988), Maniatis y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp.
280-281 (1982), Gross-Belland y
col., en Eur. J. Biochem., 36, 32 (1973) y la patente de Estados
Unidos Nº 4.965.188 (indicada anteriormente)). La extracción de ADN
a partir de sangre entera de componentes de la misma se describe,
por ejemplo, en EP-A-0 393 744
(publicada el 24 de octubre de 1990), la patente de Estados Unidos
Nº 5.231.015 (Cumins y col.) y la patente de Estados Unidos Nº
5.334.499 (Burdick y col); el procedimiento de lisis dependiendo
del ciclo de espécimen que se usa como la fuente de ácidos
nucleicos; un procedimiento de lisis preferidos incluye el
calentamiento del espécimen en presencia de un tensioactivo no
iónico adecuado, numerosos de los cuales se conocen en la
técnica.
La muestra, primero diluida y mezclada con un
tampón a pH por debajo de aproximadamente 7,0, se mezcla con un
polímero débilmente básico (definido más adelante) en una cantidad
suficiente para formar complejos con todos los ácidos nucleicos
presentes en la muestra, formando un precipitado soluble en agua.
Este polímero es soluble en agua a pH ácido. En general, la
cantidad de polímero presente en al menos aproximadamente 0,01 por
ciento en peso, siendo preferido entre aproximadamente 0,05 y
aproximadamente 0,5 por ciento en peso. Por supuesto, los expertos
en la técnica conocerían cómo ajustar la cantidad de polímero para
acomodar cualquier cantidad de ácidos nucleicos. La mezcla se puede
llevar a cabo de cualquier manera adecuada durante hasta 30 minutos
(generalmente menos de cinco minutos) y a cualquier temperatura
adecuada (generalmente entre 15º y 35ºC).
Los tampones adecuados para mezclarse con la
muestra incluyen los tampones que tienen un pKa menor que 7, más
preferiblemente menor que un pKa 6,5, incluyendo MES (ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico) a pKa 6,1,
BIS-TRIS (bis
[2-hidroxietil]iminotris[hidroximetil]metano;
2-bis[2-hidroxietil]amino-2-[hidroximetil]-1,3-propanodiol)
a pK 6,5, ADA ácido
(N-[2-acetamido]-2-iminodiacético;
ácido N-[carbamoilmetil]iminodiacético) a pK 6,6, ACES
(ácido
N-[carbamoilmetil]-2-aminoetanosulfónico;
ácido
N-[2-acetamido]-2-aminoetanosulfónico)
a pK 6,8, PIPES (ácido
piperazina-N,n'-bis[2-etanosulfónico];
ácido 1,4-piperazinidadietanosulfónico) a pK 6,8,
MOPSO (ácido
3-[N-morfolino]-2-hidroxipropanosulfónico)
a pK 6,9, BIS-TRIS propano
(1,3-bis[tris(hidroximetil)matilamino]propano
a pK 6,8, PBS (solución salina tamponada con fosfato), y TRIS
(tris(hidroximetil)aminometil)metano), el
polímero débilmente básico se puede usar en su forma libre soluble
en agua, o unido a un sustrato insoluble en agua, tal como en una
columna de afinidad, o unido a partículas poliméricas, de vidrio u
otras partículas inorgánicas. Así pues, los polímeros se pueden
unir usando medios convencionales (por ejemplo, absorción, enlaces
covalentes o reacciones de unión específicas) a un sustrato
adecuado, incluyendo partículas de vidrio, poliméricas o
magnéticas, filtros o películas. Donde el polímero débilmente
básico es insoluble en agua incluso a pH básico, se puede retirar a
través de filtración, centrifugación u otros medios convencionales
después que se liberan los ácidos nucleicos.
Sin embargo, aunque unidos al polímero débilmente
básico, los ácidos nucleicos no son útiles. Entonces es necesario
separar el precipitado insoluble en agua del resto de la muestra
que puede contener desechos celulares considerables y polímero en
exceso. Esta separación se puede lograr usando cualquiera de los
diversos procedimientos, incluyendo centrifugación o filtración
después de los cual se desecha el líquido. Se prefiere la
centrifugación en la práctica de esta invención y se puede llevar a
cabo a más de 1000 x g, durante entre un minuto y cinco minutos.
Después de la etapa de separación, los ácidos
nucleicos se pueden separar del complejo o liberar del polímero
débilmente básico, poniendo en contacto el precipitado con una
base, con o sin calentar. Las bases fuertes se pueden usar sin
calentar, e incluyen, pero sin limitación, hidróxido sódico,
hidróxido potásico, hidróxido amónico, hidróxido de litio,
carbonato sódico, bicarbonato sódico, una amina terciaria (tal como
trietilamina, diisopropiletilamina y lutidina), tricina, bicina o
cualquier otra base orgánica e inorgánica que sería fácilmente
evidente para los expertos en la técnica. Las bases más débiles
útiles pueden incluir tampones básicos tales como
tris(hidroximetil)aminometano (o las sales de adición
de ácido del mismo),
N,N-bis(2-hidroxietil)glicina,
N-tris(hidroximetil)metilglicina, y
otros bien conocidos en la técnica. Cuando se usan bases más
débiles puede ser necesario calentamiento.
Tal calentamiento se puede llevar a cabo durante
hasta 15 minutos (en general menos que 5 minutos) a una temperatura
que es al menos aproximadamente 50ºC, y preferiblemente está entre
aproximadamente 95ºC y aproximadamente 125ºC, a presión adecuada.
Como se usa en este párrafo, "aproximadamente" se refiere a
+/- 0,5ºC.
En las realizaciones preferidas, las bases más
débiles se pueden usar con calentamiento, para liberar los ácidos
nucleicos del precipitado. Esto proporciona una solución que
contiene ácidos nucleicos que están dispuestos para amplificación
sin tratamiento adicional. Tales bases más débiles pueden ser
tampones, tales como clorhidrato de
tris(hidroximetil)aminometano.
En algunas realizaciones, los polímeros usados en
tales realizaciones son aquellos (definidos más adelante) que son
insolubles en agua incluso a pH básico. Tales polímeros se pueden
retirar del sistema después de la liberación de los ácidos
nucleicos y antes de la amplificación si se desea.
La solución resultante que contiene ácidos
nucleicos liberados tiene un pH básico. En algunos casos, los
ácidos nucleicos se pueden además tratar sin ningún ajuste
posterior de pH. En otras realizaciones en las que se usa una base
fuerte, el pH de la solución se puede ajustar (generalmente hacia
abajo) hasta entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9
(preferiblemente entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 9),
usando cualquier ácido o tampón adecuado, tales como clorhidrato de
tris(hidroximetil)aminometano,
N,N-bis(2-hidroxietil)glicina,
N-tris(hidroximetil)metilglicina y
otros que serían fácilmente evidentes para los expertos en la
técnica. Las cantidades de tales materiales necesarios para lograr
el pH deseado serían fácilmente evidentes para los expertos en la
técnica.
A pH básico, el polímero usado para captura de
ácidos nucleicos puede ser bien soluble en agua o insoluble en
agua, y los monómeros necesarios para proporcionar tales
propiedades se describen más adelante.
El procedimiento descrito de captura y liberación
de ácidos nucleicos de esta invención típicamente se lleva a cabo
dentro de aproximadamente 20 minutos, y preferiblemente dentro de
aproximadamente 10 minutos.
Como se usa en esta memoria descriptiva, salvo
que se indique otra cosa, el modificador "aproximadamente" se
refiere a una variación de 110% de los valores indicados. Cuando se
usa con valores de pH, "aproximadamente" se refiere a +/- 0,5
de unidad de pH.
En una realización preferida de esta invención,
un procedimiento para la amplificación y detección de un ácido
nucleico diana comprende:
- I)
- proporcionar una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico diana,
- II)
- someter el ácido nucleico diana a las etapas de:
- A)
- a un pH de menos de 7, poner en contacto el ácido nucleico diana con un polímero soluble en agua, débilmente básico en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de un polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en la muestra, incluyendo el ácido nucleico diana,
- B)
- separar el precipitado insoluble en agua de la muestra, y
- C)
- poner en contacto el precipitado con una base para elevar el pH de la solución a uno mayor que 7, y por lo tanto liberar los ácidos nucleicos, incluyendo el ácido nucleico diana, del polímero débilmente básico, comprendiendo el polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables, etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido
- III)
- sin ajuste posterior de pH, amplificar el ácido nucleico diana liberado, y
- IV)
- detectar el ácido nucleico diana amplificado.
En el procedimiento anterior, se prefiere todavía
más que el polímero débilmente básico sea insoluble en agua a pH
básico, y el procedimiento además comprende la etapa de eliminar el
polímero insoluble en agua después de la liberación del ácido
nucleico diana pero antes de la amplificación del mismo.
El polímero débilmente básico usado en la
práctica de esta invención se prepara a partir de uno o más
monómeros polimerizables, etilénicamente insaturados, al menos uno
de los cuales tiene un grupo amina que se puede protonar a pH
ácido. Así pues, a pH ácido, el polímero se protona para formar la
sal de adición de ácido de la amina.
A pH básico, el polímero existe en forma de la
base libre.
Los "grupos débilmente básicos" particulares
que pueden ser parte de los monómeros polimerizables útiles en esta
invención incluyen, pero sin limitación, grupos aminas cíclicas, o
grupos aminoalquilos primarios, secundarios o terciarios que se
pueden protonar a pH ácido. Los grupos de aminas cíclicas útiles
incluyen, pero sin limitación, grupos imidazolilo, isoxazolilo,
piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo,
tetrazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo,
quinolinilo y quinazolinilo. Los grupos preferidos son grupos
cíclicos que son aromáticos, y el grupo imidazolilo es el más
preferido. Los grupos aminoalquilos o aminas cíclicas útiles se unen
a grupos vinilo de los monómeros usando grupos de unión
convenientes que incluyen grupos alquileno, amido o éster, y
grupos alquileno múltiple se pueden unir junto con grupos imino,
oxi, amida, carbonilo o éster.
En general los polímeros útiles para capturar
ácidos nucleicos comprenden unidades recurrentes derivadas mediante
la polimerización por adición de:
a) entre aproximadamente 15 y 100 por ciento en
peso de un polímero soluble en agua, débilmente básico
etilénicamente insaturado que tiene al menos un grupo que se puede
protonar a pH ácido y que se selecciona entre el grupo constituido
por aminoalquilo, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo,
piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadoazolilo,
piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y
quinazolinilo,
b) entre 0 y aproximadamente 35 por ciento en
peso de un monómero polimerizable no iónico, hidrófilo
etilénicamente insaturado, y
c) entre 0 y aproximadamente 85 por ciento en
peso de un monómero polimerizable no iónico, hidrófobo
etilénicamente insaturado.
Preferiblemente, el polímero débilmente básico
comprende unidades recurrentes de entre aproximadamente 20 y
aproximadamente 100 por ciento en peso de a), entre 0 y
aproximadamente 25 por ciento en peso de b), y entre
aproximadamente 0 y aproximadamente 80 por ciento en peso de c).
Una clase más específica de monómeros útiles en
a) anterior son los representados por la estructura (I):
en la que R^{3} es hidrógeno o
metilo, y X es oxi o imino. Además, R^{4} es un grupo de unión
hidrocarburo divalente que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono y
átomos hetero en la cadena y que comprende uno o más grupos
alquileno (tales como metileno, etileno,
n-propileno, isopropileno y
n-pentileno), con tal que cuando existe más de un
grupo alquileno, se unen juntos en R^{4} con uno o más grupos
carbonilo, oxi, imino, éster o amido en una combinación operable.
"Combinación operable" significa que los grupos se pueden
combinar con los grupos alquileno en cualquier configuración
químicamente posible, y se puede usar en combinación (conectado a
cada uno) en las formas químicamente posibles (tales como
oxicarbonilo, carbonamido y otras fácilmente evidentes para los
expertos en la técnica). También se entiende que R^{4} puede
terminar (o conectarse a R^{5}) con un grupo carbonilo, oxi,
imino, éster o
amido.
R^{5} es un grupo amina cíclica o aminoalquilo
primario, secundario o terciario, como se ha definido
anteriormente, que se puede protonar a pH ácido.
Los ejemplos de monómeros de tipo a) útiles
incluyen, pero sin limitación, 1-vinilimidazol,
2-metil-1-vinilimidazol,
2-vinilpiridina,
1-hidroxi-6-vinil-1H-benzotriazol,
clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo,
clorhidrato de acrilato de 2-aminoetilo,
N-(3-aminopropil)metacrilamida,
2-vinilquinolina,
N-(3-imidazililpropil)metacrilamida,
N-(2-imidazoliletil)metacrilamida,
N-(3-imidazolilpropil)acrilamida,
N-(1,1-dimetil-3-N-imidazolilpropil)acrilamida,
N-(imidazolilmetil)acrilamida,
1-vinilpirrolidinona, metacrilato de
3-(N,N-dimetilamino)propilo y las sales de
adición de ácido de las bases libres indicadas.
Una clase de monómeros novedosos del tipo a) de
esta invención se pueden usar para preparar bien homopolímeros o
copolímeros. Estos monómeros se definen por la estructura (II):
en la que R es hidrógeno o metilo.
Preferiblemente R es metilo. Además R^{1} es alquileno lineal o
ramificado de 1 a 3 átomos de carbono (tales como metileno,
etileno, trimetileno o propileno). Preferiblemente, R^{1} es
alquileno de 2 ó 3 átomos de carbono. Más preferiblemente, R^{1}
es
trimetileno.
Los monómeros particularmente útiles que tienen
la estructura (II) incluyen, pero sin limitación,
N-(3-imidazililpropil)metacrilamida,
N-(2-imidazoliletil)metacrilamida,
N-(3-imidazolilpropil)acrilamida,
N-(1,1-dimetil-3-N-imidazolilpropil)acrilamida,
N-(imidazolilmetil)acrilamida, y sus sales de adición de
ácido. De los monómeros novedosos descritos en esta memoria
descriptiva, el primer compuesto es el más preferido.
Los monómeros de tipo a) preferidos incluyen
1-vinilimidazol y
N-2-metil-1-vinilimidazol.
Si los monómeros de tipo a) tienen baja o ninguna
solubilidad en agua, también se pueden polimerizar en forma de sus
sales de adición de ácido (tales como el clorhidrato o
bromhidrato).
Los monómeros identificados como monómeros como
tipo b) son los que se definen en esta memoria descriptiva como
"hidrófilos", significando aquellos que, cuando se
homopolimerizan, proporcionan homopolímeros que son solubles en
agua a pH 7 o superior. En general, tales monómeros tienen grupos
hidrófilos tales como grupos hidroxi, amina (primaria, secundaria,
terciaria o cíclica), amida, sulfonamida y poietilenoxi, pero no es
necesario que comprendan tales grupos si el homopolímero indicado
reúne el parámetro de solubilidad en agua.
Los monómeros representativos de tipo b)
incluyen, pero sin limitación, acrilamida, acrilato de
2-hidroxietilo, acrilato de
2,3-dihidroxipropilo, metacrilato de
2,3-dihidroxipropilo, metacrilato de
poli(etilenoxi)etilo (que tiene entre 2 y 10 grupos
etilenoxi), y N,N-dimetilacrilamida. Un monómero
preferido es acrilamida.
Los monómeros identificados como monómeros de
tipo c) son los que se definen en esta memoria descriptiva como
"hidrófobos", significando aquellos que, cuando se
homopolimerizan, proporcionan homopolímeros que son insolubles en
agua a pH 7 o superior, independientemente del tipo de grupos
pendientes que puedan poseer.
Los monómeros representativos del tipo c)
incluyen, pero sin limitación, metacrilamida, metacrilato de
2-hidroxietilo,
N-t-butilmetacrilamida, acrilato de
etilo, acrilato de butilo, metacrilato de metilo, estireno,
viniltolueno y otros vinilos aromáticos y otros que serían
fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Un monómero
preferido es metacrilato de 2-hidroxietilo.
Los monómeros de tipo a), b) y c) que no son
novedosos son generalmente y fácilmente disponibles de fuentes
comerciales, o preparados usando procedimientos y materiales de
partida convencionales.
Los monómeros novedosos de estructura (II) se
pueden preparar generalmente mediante condensación de un
1-(amidoalquil)imidazol con cloruro de (met)acriloílo
usando condiciones apropiados que serían fácilmente aparentes para
los expertos en la técnica. Una preparación representativa de un
monómero preferido se proporciona más adelante precediendo los
ejemplos. Más detalles sobre tales monómeros se pueden obtener a
partir de la patente de Estados Unidos de cesión común Nº 5.434.270,
Ponticello y col., titulada "Weakly Basic Polymerizable Monomers
and Polymers Prepared Therefrom".
Los homopolímeros y copolímeros descritos en esta
memoria descriptiva se pueden preparar usando técnicas de
polimerización en solución convencionales que se conocen bien en la
técnica, aunque existen algunas condiciones preferidas que se
ilustran en los procedimientos preparatorios proporcionados más
adelante precediendo a los ejemplos. La relación de diversos
monómeros se pueden ajustar, como saben los expertos en la técnica,
para proporcionar polímeros que son bien solubles en agua o
insolubles en agua a pH básico, mientras tales polímeros
permanezcan solubles en agua a pH ácido.
La polimerización en solución generalmente
implica disolver los monómeros en un disolvente adecuado
(incluyendo agua o diversos disolventes orgánicos miscibles en
agua) y polimerizar en presencia de un iniciador adecuado de
radical libre. El polímero resultante es soluble en agua a pH
ácido, así precipita usando un disolvente tal como acetona, se
purifica y se redisuelve en agua para uso futuro.
Los polímeros particularmente útiles descritos en
esta memoria descriptiva, incluyen, pero sin limitación,
poli[N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida
clorhidrato-co-acrilamida],
poli[N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida
clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato],
poli(1-vinilimidazol), metacrilato de
poli(2-aminoetilo
clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato),
poli(1-vinilimidazol
clorhidrato-co-2-hidroxiletilmetacrilato),
poli[N-(1,1-dimetil-3-imidazolilpropil)acrilamida]poli(N-2-metil-1-vinilimidazol)
y las sales de adición de ácido de los polímeros de base libre.
En las realizaciones preferidas, los polímeros
usados son insolubles en agua a pH básico. Tales polímeros se
preparan usando monómeros de tipo a) así como monómeros de tipo c)
pero sin cantidades limitadas (menos del 15 por ciento de peso de
los monómeros de tipo b) para evitar la solubilización del polímero
a pH básico. Los polímeros representativos de este tipo incluyen,
pero sin limitación,
poli[N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida
clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato],
poli(1-vinilimidazol),
poli(2-aminoetilmetacrilato
clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato)
y poli(1-vinilimidazol
clorhidrato-co-hidroxietilmetacrilato).
La presente invención también se refiere a la
amplificación o detección de una o más secuencias de ácidos
nucleicos específicos presentes en uno o más ácidos nucleicos
liberados como se ha indicado anteriormente. Además, una pluralidad
de ácidos nucleicos diana se pueden amplificar y detectar
simultáneamente usando un conjunto de cebadores y medios de
detección correspondientes para cada ácido nucleico específico.
También se pueden amplificar y detectar múltiples secuencias en el
mismo ácido nucleico.
Un "reactivo de la PCR" se refiere a
cualquiera de los reactivos generalmente considerados útiles en la
PCR, a saber un conjunto de cebadores para cada ácido nucleico
diana, una ADN polimerasa, un cofactor de la ADN polimerasa y dos o
más
desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos
(abreviadamente en inglés dNTP).
Como se usa en esta memoria descriptiva con
relación a los cebadores o sondas, el término
"oligonucleótido" se refiere a una molécula que comprende
cuatro o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, y
preferiblemente más de diez. Su tamaño exacto no es crítico pero
depende de muchos factores incluyendo el uso o función última del
oligonucleótido. El oligonucleótido se puede derivar mediante
cualquier procedimiento conocido en la técnica.
El término "cebador" se refiere a un
oligonucleótido, bien de origen natural o producido sintéticamente,
que es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis
cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de
un producto de extensión del cebador complementario a una cadena de
ácido nucleico (es decir, molde). Tales condiciones incluyen la
presencia de nucleótidos (tales como los cuatro
desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos
habituales), una ADN polimerasa y un cofactor de ADN polimerasa, y
temperatura y pH adecuados. Normalmente, tales condiciones son las
que se conocen en la técnica como condiciones "altamente
rigurosas" de manera que se minimiza la amplificación no
específica. El cebador debe ser bastante largo para iniciar la
síntesis de los productos de extensión en presencia de la ADN
polimerasa. El tamaño exacto de cada cebador variará dependiendo del
uso contemplado, la complejidad de la secuencia diana, la
temperatura de reacción y la fuente del cebador. En general, los
cebadores usados en esta invención tendrán entre 10 y 60
nucleótidos.
Los cebadores útiles en esta invención se pueden
obtener a partir de numerosas fuentes o prepararse usando técnicas
y equipos conocidos, incluyendo por ejemplo, un sintetizador de ADN
ABI (disponible de Applied Biosystems) o un sintetizador de
Biosearch de serie 8600 o de serie 8800 (disponible de
Milligen-Biosearch, Inc.) y procedimientos conocidos
para sus uso (por ejemplo como se describe en la patente de Estados
Unidos Nº 4.965.188). Son también útiles los cebadores de origen
natural aislados a partir de fuentes naturales (tales como
digestiones con endonucleasas de restricción). Como se usa en esta
memoria descriptiva, el término "cebador" también se refiere a
una mezcla de cebadores. Así pues, cada conjunto de cebadores para
un ácido nucleico diana dado puede incluir dos o más cebadores para
cada cadena diana opuesta.
Uno o ambos cebadores se pueden marcar con el
mismo o diferente marcador para la detección o captura de producto
amplificado. Los procedimientos para unir marcadores y preparar
cebadores se conocen bien en la técnica, por ejemplo, como se
describe en el documento de Agrawal y col., Nucleic Acid Res., 14,
pp. 6227-45 (1986), la patente de Estados Unidos Nº
4.914.210 (Levenson y col) con relación a marcadores de biotina, la
patente de Estados Unidos Nº 4.962.029 (Levenson y col.,) con
relación a marcadores de enzimas, y las referencias indicadas en
esos documentos. Los marcadores útiles también incluyen
radioisótopos, reactivos con densidad electrónica, cromógenos,
fluorógenos, restos fosforescentes, ferritina y otras partículas
magnéticas (véase la patente de Estados Unidos Nº 4.795.698 de Owen
y col., y la patente de Estados Unidos Nº 4.920.061 de Pontyon y
col.,), restos quimioluminiscentes (tales como luminol), y otras
especies de unión específica (avidina, estreptavidina, biotina,
azúcares o lectinas). Los marcadores preferidos son enzimas,
radioisótopos y especies de unión específica (tales como biotina).
Las enzimas útiles incluyen, glucosaoxidasa, peroxidadasas, uricasa,
fosfatasa alcalina y otras conocidas en la técnica y se pueden unir
a oligonucleótidos usando procedimientos conocidos. Se conocen bien
los reactivos que proporcionan una señal colorimétrica o
quimioluminiscente con tales enzimas.
Cuando el marcador es una enzima tal como una
peroxidasa, en algún punto del ensayo, peróxido de hidrógeno y
composiciones formadoras de tintes adecuadas se añaden para
proporcionar un tinte detectable. Por ejemplo, los reactivos útiles
que proporcionan tintes incluyen tetrametilbenzidina y los derivados
de los mismos, y tintes leuco, tales como tintes leuco de
triarilimidazol insolubles en agua (como se describe en la patente
de Estados Unidos Nº 4.089.747 de Bruschi), u otros compuestos que
reaccionan para proporcionar un tinte en presencia de peroxidasa y
peróxido de hidrógeno. Las composiciones particularmente útiles que
proporcionan tintes se describen en el documento
EP-A-0 308 236 (publicado el 22 de
marzo de 1989). Las señales quimioluminiscentes en respuesta a un
marcador de peroxidasa también se pueden generar usando los
reactivos apropiados.
Si uno o ambos cebadores están biotinilados, el
ácido nucleico amplificado se puede detectar usando avidina
detectablemente marcada o un equivalente de la misma (tal como
estreptavidina). Por ejemplo, la avidina se puede conjugar con una
enzima, o tener un radioisótopo usando tecnología conocida. Se usan
biotina sobre complejos de productos amplificados con la avidina, y
detección apropiada para detectar una señal radiactiva,
colorimétrica o quimioluminiscente.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
"sonda" de captura es un oligonucleótido que es sustancialmente
complementario a una secuencia de ácido nucleico de una o más
cadenas del ácido nucleico diana, y que se usa para insolubilizar
el ácido nucleico amplificado. El oligonucleótido de sonda
generalmente se une a un sustrato adecuado insoluble en agua tal
como perlas poliméricas o de vidrio, pocillo de placas de
microtitulación, película polimérica o celulósica fina u otros
materiales fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. El
oligonucleótido está generalmente entre aproximadamente 12 y
aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, aunque la longitud no
es crítica.
Una ADN polimerasa es una enzima que añadirá
moléculas de monofosfato de desoxinucleósido al extremo 3 + -hidroxi
del cebador en un complejo de cebador y molde, pero esta adición es
de una manera dependiente del molde (es decir, dependiente de los
nucleótidos específicos en el molde). Se conocen en la técnica
muchas ADN polimerasas útiles. Preferiblemente, la polimerasa es
"termoestable", significando que es estable al calor,
especialmente a las altas temperaturas usadas para la
desnaturalización de las cadenas de ADN. Más particularmente, las
ADN polimerasas termoestables no se inactivan sustancialmente por
las altas temperaturas usadas en la PCR como se describe en esta
memoria descriptiva.
Se han descrito numerosas ADN polimerasas en la
técnica, incluyendo las mencionadas en detalle en la patente de
Estados Unidos Nº 4.965.188 (indicada anteriormente) y la patente de
Estados Unidos Nº 4.889.818 (Gelfand y col). Las polimerasas
particularmente útiles son las obtenidas a partir de diversas
especies de bacterias Thermus, tales como Thermus
aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis o
Thermus flavus. Otras polimerasas termoestables se obtienen
a partir de una diversidad de otras fuentes microbianas incluyendo
Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp.
Y las descritas en el documento
WO-A-89/06691 (publicada el 27 de
julio de 1989). Algunas polimerasas útiles están comercialmente
disponibles. Se conocen numerosas técnicas para aislar polimerasas
de origen natural a partir de organismos, y para producir enzimas
modificadas por ingeniería genética usando técnicas recombinantes,
como las indicadas en la técnica citada en este párrafo.
Un cofactor de la ADN polimerasa se refiere a un
compuesto no proteico de la que depende la enzima para actividad.
Numerosos de tales cofactores son conocidos, incluidos las sales de
magnesio y manganeso. Los cofactores útiles incluyen, pero sin
limitación, cloruros, sulfatos acetatos y sales de ácidos grasos de
magnesio y magnesio (por ejemplo, las sales de ácidos butírico,
caproico, caprílico, capricho y laúrico). Se prefieren las sales más
pequeñas, es decir cloruros, sulfatos y acetatos.
También son necesarios para la PCR dos o más
desoxirribonucleótido-5'-trifosfatos,
tales como dTA, dCTP, dGTP, dUTP o dTTP. Usualmente, dATP, dCTP,
dGTP y dTTP se usan todos en la PCR. También son útiles los
análogos tales como dITP y
7-deaza-dGTP.
También es útil en la práctica de la invención un
anticuerpo específico para la ADN polimerasa, dicho anticuerpo
inhibe su actividad enzimática a temperaturas inferiores a
aproximadamente 50ºC, pero dicho anticuerpo se desactiva a
temperaturas superiores. Los anticuerpos monoclonales
representativos que tienen estas propiedades se describen en la
patente de Estados Unidos Nº 5.338.671 (Scalice y col.) Se pueden
usar fragmentos de anticuerpos en lugar de la molécula entera si
tienen propiedades equivalentes.
Los reactivos de la PCR descritos en esta memoria
descriptiva se proporcionan y se usan en la PCR en concentraciones
adecuadas para proporcionar la amplificación del ácido nucleico
diana. La cantidad mínima de la ADN polimerasa es generalmente al
menos aproximadamente 1 unidad/100 \mul de solución, siendo
preferida entre aproximadamente 4 y aproximadamente 25 unidades/100
\mul. Una "unidad" se define en esta memoria descriptiva
como la cantidad de actividad enzimática requerida para incorporar
10 nmoles nucleótidos totales (dNTP) en una cadena de ácido
nucleico extensible en 30 minutos a 74ºC. La concentración de cada
cebador es al menos aproximadamente 0,075 \mumolar prefiriéndose
entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1 \mumolar. Todos los
cebadores están presentes en aproximadamente la misma cantidad
(dentro de una variación de 10% de cada uno). El cofactor
generalmente está presente en una cantidad entre aproximadamente 1
aproximadamente 15 mmolar, y cada dNTP está generalmente presente a
entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 3,5 mmolar en la mezcla
de reacción. Como se usa en este párrafo, el modificador
"aproximadamente" se refiere a una variación de +/- 10% del
valor indicado.
Los reactivos de PCR se pueden suministrar
individualmente, o en una solución tamponada que tiene un pH en el
intervalo de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 9 usando
cualquier tampón adecuado.
Ya que el ácido nucleico diana a amplificar y
detectar está usualmente en forma de doble cadena, las dos cadenas
se deben separar (es decir, desnaturalizar) antes de que tenga
lugar el cebado. Esto se puede producir durante el procedimiento de
extracción, pero preferiblemente, se produce en una etapa separada
después. El calentamiento a una temperatura adecuada (identificada
como "primera temperatura" o T_{1} en esta memoria
descriptiva) es un medio preferido para la desnaturalización. En
general, esta primera temperatura está en el intervalo entre
aproximadamente 85º y aproximadamente 100ºC durante un tiempo
adecuado, por ejemplo entre 1 y aproximadamente 240 segundos
(preferiblemente entre 1 y aproximadamente 40 segundos). Esta etapa
de desnaturalización inicial también puede estar incluida en el
primer ciclo de amplificación. En tales casos, la desnaturalización
puede ser más larga en el primer ciclo (por ejemplo, hasta 240
segundos) mientras que ciclos posteriores pueden tener muchas
etapas de desnaturalización más cortas (por ejemplo, hasta 30
segundos).
Las cadenas desnaturalizadas se ceban después con
los conjuntos de cebadores apropiados enfriando la mezcla de
reacción hasta una segunda temperatura, T_{2}, que está
generalmente dentro del intervalo de entre aproximadamente 55ºC y
aproximadamente 70ºC. Se desea que el enfriamiento se hace tan
rápidamente como sea posible, pero con el equipo actualmente
conocido, generalmente tiene lugar durante un período de tiempo de
entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 segundos, y más
preferiblemente durante entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20
segundos.
Una vez que se enfrían las cadenas
desnaturalizadas, la mezcla de reacción que contiene los reactivos
de la PCR se incuba a una tercera temperatura, T_{3},
generalmente durante entre 1 y aproximadamente 120 segundos, y
preferiblemente entre 1 y aproximadamente 80 segundos, para
efectuar la formación de productos de extensión de cebadores. En
general, la tercera temperatura está dentro del intervalo de entre
aproximadamente 55º y aproximadamente 74ºC. Preferiblemente, está
dentro del intervalo de entre aproximadamente 62º y aproximadamente
70ºC.
En una realización más preferida, la segunda y
tercera temperaturas son las mismas y están dentro del intervalo de
entre aproximadamente 62º y aproximadamente 70ºC. Así pues, el cebo
y la extensión del cebador se llevan a cabo preferiblemente en la
primera etapa.
Así pues, un ciclo de amplificación comprende las
etapas de desnaturalización, cebo (o hibridación) y extensión del
cebador descritas anteriormente. En general, al menos 15 de tales
ciclos de amplificación se llevan a cabo en la práctica de esta
invención estando el máximo número de ciclo a discreción del
usuario particular. En la mayoría de los casos, se usan 15 a 50
ciclos de amplificación en el procedimiento prefiriéndose 15 a 40
ciclos. Cada ciclo de amplificación generalmente está entre 20 y
aproximadamente 360 segundos, prefiriéndose un tiempo de ciclo de
entre aproximadamente 30 y aproximadamente 120 segundos y
prefiriéndose más entre aproximadamente 30 y aproximadamente 90
segundos. Sin embargo, tiempos de ciclo más cortos o más largos se
pueden usar si se desea.
Cuando se usa con relación al tiempo para una
etapa dada en el procedimiento de amplificación, el término
"aproximadamente" se refiere a +/- 10% de ese tiempo límite.
Además, cuando se usa en relación a temperaturas, el
"aproximadamente" se refiere a +/- 0.5ºC.
La detección de productos amplificados se puede
lograr usando cualquier procedimiento conocido, incluyendo técnicas
de transferencia de Southern, como se describe en la patente de
Estados Unidos Nº 4.965.188 (indicada anteriormente), o mediante el
uso de sondas o cebadores marcados, como se conoce en la
técnica.
Como alternativa a las realizaciones descritas
anteriormente, los productos amplificados se pueden detectar usando
un oligonucleótido marcado que es complementario a uno de los
productos de extensión del cebador.
Todos los reactivos para realizar el ensayo de
TapMan se compraron en Appied Biosystems, una división de
Perkin-Elmer Co., Foster City, CA, incluyendo:
reactivos de detección de Actina \beta (número de catálogo
401846), reactivos de moldes de ADN (número de catálogo 401970) y
kit de los reactivos centrales de la PCR TaqMan (número de catálogo
N808-0228). Los ensayos se realizaron usando la
mezcla maestra de la PCR y perfiles de ciclación térmica para el
ensayo de TaqMan de actina \beta proporcionados por el
fabricante. Un microlitro de reactivo de molde de ADN se añadió a
49 \mul de la mezcla maestra de la actina \beta de la PCR en un
sistemma de detección de secuencias ABI Prism 7700 (Applied
Biosystems) y se midió la fluorescencia durante los 40 ciclos de la
PCR.
La figura 1 muestra una curva de calibración para
diferentes niveles de partida de ADN frente al recuento de ciclos
umbrales, que es un valor determinado por el instrumento y
representa el número estimado de ciclos de la PCR al que se
obtendrá una señal fluorescente preseleccionada. Así pues, el
ensayo TaqMan para un fragmento génico de la actina \beta
proporciona una buena herramienta analítica para medir la
concentración de ADN presente en una muestra.
En los ejemplos que siguen, se extrajo ADN del
gen de la actina \beta de la copia individual (por célula) de las
muestras indicadas según el procedimiento de la invención o usando
el procedimiento de la técnica anterior indicada que utiliza un
reactivo de lisis celular. Por lo tanto el ADN de la actina \beta
extraído se amplificó usando la mezcla maestra de la PCR y
perfiles de ciclación térmica y detección de TaqMan según los
procedimientos recomendados por el fabricante.
En los sistemas de detección heterogéneos de esta
invención, los productos amplificados se capturan sobre un sustrato
insoluble en agua de alguna clase, y los otros materiales en la
mezcla de reacción se retiran de una manera adecuada, tal como
mediante filtración, centrifugación, lavado u otra técnica de
separación.
Las sondas de captura se pueden unir a soportes
insolubles en agua usando técnicas de unión conocidas (incluyendo
absorción y reacciones covalentes). Una de dichas técnicas se
describe en el documento EP-A-0 439
222 (publicado el 18 de septiembre de 1991). Se describen otras
técnicas, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 4.713.326
(Dattagupta y col), la patente de Estados Unidos Nº 4.914.210
(Levenson y col.,) y el documento
EP-B-0 070 687 (publicado el 26 de
enero de 1983). Los medios de separación útiles incluyen filtración
a través de membranas tales como membranas microporosas de
poliamida comercialmente disponibles de Pall Corporation.
Sin embargo, cualquier soporte sólido se puede
usar para anclar la sonda de captura y el producto de hibridación
eventual, incluyendo placas de microtitulación, tubos de ensayo,
vasos de precipitados partículas magnéticas o poliméricas, metales,
productos cerámicos, y lana de vidrio por nombrar unos pocos. Los
materiales particularmente útiles son partículas magnéticas o
poliméricas que tiene grupos reactivos útiles para unirse
covalentemente a la sonda de captura. Tales partículas están
generalmente entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 10
\mumetros. Los detalles adicionales sobre los ejemplos de tales
materiales se proporcionan en la patente de Estados Unidos Nº
4.997.772 (Sutton y col., la patente de Estados Unidos Nº 5.147.777
(Sutton y col), la patente de Estados Unidos Nº 5.155.166
(Danielosn y col) y la patente de Estados Unidos Nº 4.795.698 (Owen
y col),
La sonda de captura se puede fijar a un soporte
plano tal como una película polimérica, membranas, papeles de
filtro, o papel revestido de resina o sin revestir. La sonda de
captura fijada a partículas poliméricas también se pueden
inmovilizar sobre tales soportes planos de una manera adecuada, por
ejemplo, como depósitos secos, o adheridos mediante fusión por
calor o con adhesivos. La sonda se captura se puede fijar, por
ejemplo, a un soporte plano en el dispositivo de ensayo
independiente de esta invención. Otros detalles de tales materiales
se proporcionan en el documento
EP-A-0 408 738 (publicado el 23 de
enero de 1991), documento WO 92/16659 (publicado el 1 de octubre de
1992) y la patente de Estados Unidos 5.173.260 (Sutton y col.)
Las sondas de captura se pueden disponer en un
soporte adecuado en cualquier configuración, por ejemplo filas de
depósitos redondos o bandas.
La presente invención también se puede usar en
los que se conocen como procedimientos de amplificación
"homogénea" en los que los ácidos nucleicos se detectan sin la
necesidad de reactivos de captura. Los detalles de tales ensayos se
conocen en la técnica, tales como en el documento
EP-A-0 487 218 (publicada en 27 de
mayo de 1992) y el documento EP-A-0
512 334 (publicado el 11 de noviembre de 1992).
La composición de las reacciones de amplificación
se puede incluir como un componente empaquetado individualmente de
un kit de ensayo útil para diversos ensayos de amplificación. El
kit puede incluir otros reactivos, soluciones, equipo e
instrucciones útiles en el procedimiento de esta invención,
incluyendo reactivos de captura inmovilizados sobre un sustrato
insoluble en agua, soluciones de lavado, reactivos de detección y
otros materiales fácilmente evidentes para los expertos en la
técnica. Además, el kit de ensayo puede incluir un polímero
débilmente básico empaquetados separadamente como se ha descrito
anteriormente, tampones, bases débiles o fuertes y otros reactivos
necesarios para cualquiera o tanto amplificación como preparación de
la muestra de especímenes. El kit de ensayo también puede incluir
un dispositivo de ensayo que contiene uno o más otros componentes
del kit. Este dispositivo de ensayo es preferiblemente
"independiente" como se entiende ese término en la técnica.
Otros kits pueden incluir el polímero débilmente básico descrito en
esta memoria descriptiva y uno o más reactivos (tales como sondas
de detección o de captura) usados en ensayos de hibridación.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar
la práctica de esta invención, y no significa que la limiten de
ninguna forma. Todos los porcentajes son en peso salvo que se
indique otra cosa.
Este procedimiento muestra la preparación de un
monómero novedoso de estructura (I), identificado anteriormente,
pero la preparación es representativa de cómo se pueden preparar
fácilmente otros monómeros dentro del alcance de esta
invención.
Se preparó una mezcla de disolventes mezclando
agua (100 ml) que contiene hidróxido sódico (12,8 g, 0,32 moles) y
diclorometano (200 ml) conteniendo
1-(3-aminopropil)imidazol (37,5 g, 0,3
moles), y se enfrió en un baño de hielo. A esta mezcla enfriada se
le añadió todo de una vez, cloruro de metacriloílo (34,8 g, 0,3
moles) en diclorometano (100 ml) con agitación vigorosa en una
atmósfera de nitrógeno. Se desprendió calor alcanzando la
temperatura de la mezcla aproximadamente 60ºC, y la mezcla se agitó
vigorosamente durante otros 10 minutos, y después se dejó que se
separara la fase orgánica. La fase orgánica se extrajo dos veces
con diclorometano (100 ml cada vez). La solución orgánica combinada
(la fase de los disolventes orgánicos y los extractos) se lavó con
cloruro sódico saturado (100 ml), se secó sobre sulfato sódico
anhidro, se filtró, y se retiró el disolvente. El residuo se
disolvió en cloroformo (50 ml), seguido de la adición de éter
etílico (50 ml) hasta el punto de turbidez.
El producto de reacción resultante cristalizó a
aproximadamente 0ºC, y se filtró proporcionando un sólido blanco
que tenía un punto de fusión de 45º-46ºC. El rendimiento fue del
70%.
Los datos analíticos incluyeron: m/e
(M-193),
^{1}H RMN (DMSO d6) 1,8 (m, 2H,
C-CH_{2}-C, CH_{3}), 3,02 (m,
2H, N-CH_{2}), 3,95 (t, 2H,
im-CH_{2}), 5,25 y 5,6 (AB, 2H,
vinil-CH_{2}), 6,82 y 7,15 (AB, 2H,
5-H de im), 7,6 (s, 1H, 2-H de im),
7,95 (m, 1H, NH).
Un homopolímero preferido preparado a partir de
un monómero novedoso descrito en esta memoria descriptiva se
preparó a añadiendo
2,2'-azobis(2-metilpropiontitrilo)
(300 mg) a una solución de
N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida (12,5 g,
0,065 moles) en agua (90 ml) e isopropanol (10 ml), se mantuvo en
una atmósfera de nitrógeno.
La solución resultante se calentó, mientras se
agitaba, hasta 65-70ºC en un baño de agua durante 3
horas. Después de 1,5 horas de este tiempo, se añadió HCl
concentrado (3 ml), y la agitación continuó en atmósfera de
nitrógeno durante el tiempo restante. Después la solución se
concentró en un evaporador rotatorio hasta aproximadamente 25 ml, y
el producto polimérico resultante se precipitó en acetona (sobre 4
litros), se filtró y se disolvió en agua desionizada (80 ml). La
solución contenía 12% de sólidos.
El
poli[N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida
clorhidrato-co-acrilamida] (90:10
de relación de peso) se preparó añadiendo
2,2'-azobis(2-metilpropionitrilo)
(400 mg) a una solución de
N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida (18 g,
0,09 moles) y acrilamida (2 g, 0,028 moles) en agua desionizada
(120 ml) e isopropanol (15 ml), mantenida en una atmósfera de
nitrógeno. La solución se calentó hasta 65-70ºC con
agitación durante 4 horas, seguido de la adición de HCl diluido para
reducir el pH hasta aproximadamente 2. La agitación y el
calentamiento se continuaron durante otra hora, y después se dejó
que la solución alcanzara la temperatura ambiente durante toda una
noche.
La solución se concentró hasta aproximadamente 75
ml usando un evaporador rotatorio, y el polímero resultante se
precipitó en acetona (aproximadamente 4 litros), se filtró y se
disolvió en agua desionizada (150 ml). La concentración adicional
hasta aproximadamente 125 ml se llevó a cabo para retirar la acetona
residual. El polímero estaba presente con 15,5% de sólidos.
Poli[metacrilato de
2-aminoetilo
clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato]
(20:80 de relación de peso) se preparó añadiendo
2,2'-azobis(2-metilpropionitrilo)
(400 mg) a una solución de clorhidrato de metacrilato de
2-aminoetilo (4 g, 0,02 moles) y metacrilato de
2-hidroxietilo (16 g, 0,12 moles) en agua
desionizada (180 ml) y etanol (20 ml), mantenidos en una atmósfera
de nitrógeno. La solución se calentó hasta 65º-70ºC con agitación
durante 4 horas. La agitación y calentamiento se continuaron
durante otra hora, y después la solución se dejó que alcanzara la
temperatura ambiente durante toda una noche.
El polímero resultante se precipitó en acetona
(aproximadamente 4 litros), se filtró y se disolvió en agua
desionizada (150 ml). Se llevó a cabo una concentración posterior
hasta aproximadamente 125 ml para retirar la acetona residual. El
polímero estaba presente con 5,6% de sólidos.
El
poli[1-vinilimidazol-co-2-hidroxietilmetacrilato]
(50:50 de relación de peso) se preparó añadiendo
2,2'-azobis(2-propilmetionitrilo)
(350 mg) a una solución de 1-vinilimidazol (10 g,
0,1 moles) y metacrilato de 2-hidroxietilo (10 g,
0,077 moles) en N,N-dimetilformamida (160 ml),
mantenida en una atmósfera de nitrógeno. La solución se calentó
hasta 65-70ºC con agitación durante 7 horas.
Después de agitar a temperatura ambiente durante
toda una noche, el polímero se precipitó en acetona (aproximadamente
4 litros), se filtró y se disolvió en agua desionizada (200 ml)
conteniendo HCl concentrado (8,5 ml). La concentración posterior se
llevó a cabo para retirar la acetona residual. El polímero estaba
presente con 12,4% de sólidos.
El
poli(1-vinilimidazol-co-2-hidroxietilmetacrilato)
(27:75 de relación de peso) se preparó de una manera similar al
"tercer copolímero". La solución resultante contenía 13,7% de
sólidos.
Los desoxirribonucleótidos (dNTP), tampón
tris(hidroximetil)aminometano y ADN de timo de ternera
liofilizado se obtuvo de Sigma Chemical Co.
La electroforesis en gel se llevó a cabo
añadiendo la mezcla de los productos de amplificación (6,75 \mul)
a geles de agarosa (2,5%) que se habían teñido previamente con
bromuro de etidio (0,4 mg/ml de concentración final). Los geles se
sometieron a electroforesis a aproximadamente 8 voltios/cm durante
aproximadamente 1 hora usando un tampón de electroforesis (600 ml)
conteniendo bromuro de etidio (0,4 mg/ml) de concentración final).
El tampón era una mezcla de
tris(hidroximetil)aminoetano, borato y ácido
etilendiaminotetraacético. Las bandas resultantes se compararon con
marcadores de pesos moleculares convencionales, y la intensidad de
las bandas de los productos se puntuaron (115-meros
para HIVI y 383-meros para M. tuberculosis) sobre
una escala de 0 a 5, representando 0 señal no detectable y
representando 5 la señal más alta.
Otros reactivos y materiales se obtuvieron bien a
partir de fuentes comerciales o se prepararon usando materiales de
partida fácilmente disponibles y procedimientos convencionales.
La invención se ha descrito en detalle con
referencia particular a las realizaciones preferidas de la misma,
pero se entenderá que se pueden efectuar variaciones y
modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención.
Este ejemplo ilustra la práctica de la presente
invención para capturar y liberar un ácido nucleico usando
poli(1-vinilimidazol).
Se mezclaron diversos volúmenes de
poli(1-vinilimidazol) [de una dilución 1:10
de solución madre al 2,4% (pH 2,3)] con ADN de timo de ternera (100
\mul, 0,5 \mug/\mul) y se agitaron en un aparato vortex para
formar un precipitado de ácido nucleico y polímero. Después se
llevó a cabo la centrifugación durante 1 minuto. Se añadió una
cantidad adicional de polímero (10 \mul de la solución madre al
2,4%) a cada sobrenadante y la mezcla resultante se agitó en un
aparato vortex y se centrifugó para determinar si la primera
precipitación era cuantitativa. La tabla I más adelante muestra la
cantidad de polímero usada y el tipo de precipitación observada
para cada muestra.
Se observó que la precipitación ocurrió en
condiciones ácidas (pH 2,3), y que se podrían usar 50 \mul de la
dilución 1:10 de la solución madre del polímero para precipitar
100 \mul de la solución de ADN de timo de ternera (0,5
\mug/\mul) Sigma Chemical Co., San Luis, MO, de una manera casi
cuantitativa. Esta observación también se confirmó usando
procedimientos convencionales electroforéticos sobre gel.
Se llevaron a cabo experimentos para determinar
cómo solubilizar el precipitado, por lo tanto liberando el ácido
nucleico para uso posterior. La tabla II más adelante muestra las
diversas condiciones intentadas de solubilización del sedimento y
el tamaño del sedimento resultante. La técnica más útil fue el uso
de calor en combinación con pH básico (sin sedimento). La
electroforesis sobre gel convencional indicó claramente que a pH
básico, el polímero y los ácidos estaban presentes como materiales
libres. Así pues, los ácidos nucleicos estaban disponibles para uso
posterior, tal como en la PCR.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
- *Tampón "TE" incluye ácido etilendiaminotetraacético (1 mmolar) en tampón clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (10 mmolar, pH 8).
La tabla III más adelante muestra el efecto del
pH sobre la formación de un precipitado entre el polímero (50
\mul de dilución 1:10 de la solución madre) y ADN de timo de
ternera (100 \mul de solución de 0,5 \mug/\mul). Claramente
se requería pH ácido para la captura eficaz del ácido nucleico
mediante la formación de un precipitado (sedimento).
| pH | Tamaño del sedimento |
| 2,3 | Grande |
| 3 | Grande |
| 4 | Grande |
| 7 | Transparente, masa espesa |
| 12 | Escasamente visible |
La cantidad de ADN liberado de los glóbulos
blancos puestos en contacto con un agente de lisis (control) se
compara con la cantidad liberada de las células no puestas en
contacto con un reactivo de lisis (procedimiento de invención) pero
tratada por lo demás de manera idéntica.
En este ejemplo, se sacaron 10 ml de sangre en un
tubo de preparación de células VACUTAINER CPT (Becton Dickinson
Co., Franklin Lakes, NJ), y se separaron los glóbulos blancos
(abreviadamente en inglés WBC) mediante centrifugación según el
protocolo recomendado por el fabricante. La concentración final de
WBC se determinó que era 3,5 x 10^{5}/ml, basándose en
microscopía.
Se colocaron doscientos microlitros de la
suspensión de WBC en cada uno de los ocho tubos de microcentrífuga
de 1,5 ml (Eppendorf North America, Inc., Madison, WI). Se
centrifugaron los glóbulos blancos, y se lavaron tres veces con
solución salina tamponada con fosfato, (PBS NaCl 0,15 M, y tampón
fosfato potásico 0,05 M, pH 7,5).
Para las muestras puestas en contacto con
reactivo de lisis, el sedimento en cada uno de los cuatro tubos
separados se trató como sigue: se añadieron ochenta microlitros de
tampón de lisis (Tris HCl 10 mM, pH 8,0 y Tween 20 al 0,5%),
seguido de 10 \mul de la proteasa termoestable
Pre-Taq, (1 U/\mul, Boehringer Mannheim
Biochemicals, Indianápolis, IN), y los tubos se calentaron a 100ºC
durante 5 minutos. Después del tratamiento por calor, se añadieron
10 \mul de NaOH 250 mM, y se calentaron los tubos otra vez a
105ºC durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 14.000 rpm
durante 2 minutos.
Las muestras no puestas en contacto con reactivo
de lisis se trataron como sigue: el sedimento de cada uno de los
cuatro tubos separados se volvió a suspender en 100 \mul de
PBS.
Las muestras preparadas usando ambos
procedimientos anteriores se trataron de manera idéntica: los tubos
se centrifugaron a 14.000 rpm durante 2 minutos, el fluido
sobrenadante de cada tubo se decantó cuidadosamente en nuevos tubos
y se almacenaron a temperatura ambiente antes de análisis. El
contenido de ADN de cada tubo se analizó usando el ensayo de TaqMan
actina \beta y un detector de secuencias ABI Prism 7700 como se
ha descrito anteriormente, basándose la calibración en los patrones
de ADN comprados a Perkin Elmer. Los resultados se resumen en la
tabla
IV.
IV.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Estos datos indican que en presencia de reactivo
de lisis, hay aproximadamente una cantidad mayor que 300 veces de
ADN liberado de los glóbulos blancos. Ya que el ADN liberado de los
glóbulos blancos no se espera que albergue mutaciones, las
supresiones u otros marcadores de cáncer específicos circulantes en
la sangre de un tumor primario, tal como ADN relativo al no diana
incrementa el fondo no específico, y por lo tanto, tiene un efecto
perjudicial sobre un ensayo para cualquier ADN circulante libre en
fluidos corporales basándose en la detección de alteraciones
específicas en ADN asociado a cáncer.
El ejemplo siguiente muestra una comparación del
kit de Qiagen comercial y el procedimiento de la presente invención
para extraer ADN del mismo acúmulo de suero.
Para el aislamiento de ADN a partir de suero o
plasma basándose en el procedimiento de la invención, todas las
etapas iniciales se realizaron sobre hielo para minimizar la
posible degradación de ADN mediante las nucleasas del suero. Se
preparó tampón ACES ácido
(N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico
de Sigma Co., San Luis, Mo en forma de una solución madre 250 mM,
pH 6,8. El polímero de captura de ADN,
poli(1-vinilimidaziol
clorhidrato-co-hidroxietilmetacrilato)
a una relación en peso de 76:24 de monómero y a 2,4% de sólidos, se
sintetizó mediante los protocolos descritos en la patente de
Estados Unidos Nº 5.582.988. Es un copolímero de adición de vinilo
lineal aleatorio preparado usando copolimerización en solución
convencional en N,N-dimetilformamida con un
iniciador azo. El copolímero (o simplemente polímero) se mezcló con
un exceso de agua y se añadió HCl concentrado hasta que se obtuvo
una solución transparente. Después la solución se diafiltró.
Doscientos microlitros de suero o plasma se
añadieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml seguido de la adición
de 100 \mul de la solución tampón ACES. Después de mezclar
mediante un mezclador vortex, se añadieron 15 \mul de la solución
acuosa de polímero de captura al tubo y la muestra se mezcló otra
vez durante 5 segundos usando un mezclador vortex. El tubo se
centrifugó mediante una microcentrífuga Eppendrf modelo 5415
(Brinkman Instruments, Westbury, N. Y.) a una velocidad máxima
durante 2 minutos, y se decantó el fluido sobrenadante. Se
añadieron cien microlitros de NaOH 20 mM al tubo que contenía el
sedimento, y el tubo se mezcló mediante un mezclador vortex,
seguido de calentamiento a 100ºC durante 5 minutos. Las muestras se
mantuvieron bien a 4ºC y se ensayaron inmediatamente después de la
extracción o se almacenaron congeladas antes de uso.
Para comparación, también se extrajo ADN a partir
de suero o plasma usando un kit QIAmp Blood (nº de catálogo 29104)
de Qiagen Corp., Chatsworth, CA. según el procedimiento recomendado
por el fabricante. Los tampones AL, AW y AE se suministraron en el
kit. Se combinaron doscientos microlitros de suero con 200 \mul
de tampón fosfato potásico 0,05 M, pH 7,5, y 200 \mul de tampón AL
y 25 \mul de la solución de la proteinasa K (reactivo de lisis)
suministrado en el kit y los contenidos se mezclaron inmediatamente
durante 15 segundos usando un mezclador vortex. Después de la
incubación a 70ºC durante 10 minutos, se añadieron 210 \mul de
etanol, y la muestra se mezcló otra vez usando el mezclador vortex.
Se extrajo ADN mediante una columna de centrifugación QIAamp en un
tubo de recogida de 2 ml. Después de aplicar la muestra, el tubo se
centrifugó a 6000 x g durante 1 minuto. El tubo que contenía el
filtrado se desechó. Se añadieron quinientos mililitros de tampón
AW, y la columna se centrifugó de nuevo durante 1 minuto, y se
desechó el tubo que contenía el filtrado. La columna se lavó un
tiempo adicional con tampón AW y después de eluyó ADN de la columna
con 200 \mul de tampón AE o agua destilada precalentada a 70ºC.
Después de la adición del tampón o agua, el tubo se incubó a
temperatura ambiente durante 1 minuto y después se centrifugó a 600
x g durante 1 minuto.
Una comparación de las etapas en el procedimiento
del kit de Qiagen y el procedimiento de la presente invención se
muestran en la tabla V. El kit de Qiagen requiere al menos 8 etapas
comparado con el procedimiento de la invención, que requiere 3
etapas.
| Izan (76/24) | |
| Captura del polímero | Kit de Qiagen |
| 1 Adición de tampón ACES | 1 adición de tampón PBS |
| 2 adición de polímero | 2 tratamiento con proteasa de Qiagen |
| 3 liberación de ADN mediante NaOH | 3 incubación a 70ºC durante 10 minutos. |
| 4 adición de etanol | |
| 5 carga de la columna de centrifugación QIAamp y centrifugación. | |
| 6 Lavar la columna con tampón, | |
| 1 min centrifugación | |
| 7 Lavar la columna con tampón, | |
| 3 min centrifugación | |
| 8 Eluir la columna con tampón |
Una comparación del ADN de actina \beta
amplificable medida mediante el protocolo de TaqMan actina \beta
(8 réplicas) se muestra en la Tabla VI e indica un 58% de mejora en
ADN amplificable recuperable usando el procedimiento de la
invención (60,6 ng/ml en suero) comparado con el procedimiento
Qiagen (25,3 ng/ml en suero).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Este ejemplo proporciona los resultados de los
experimentos que proporcionan una medición cuantitativa de la
cantidad de ADN de actina \beta recuperado a partir del suero de
pacientes normales y con cáncer pancreático usando el procedimiento
de la invención de acuerdo con los materiales y procedimientos del
ejemplo 8 en esta memoria descriptiva. El ADN de actina \beta así
recuperado de cada muestra se cuantificó usando el protocolo de
TaqMan actina \beta descrito anteriormente.
Como se muestra en la tabla VII, usando el
procedimiento de la invención un total de 8 réplicas del mismo
acúmulo de suero humano produjo una media de 12 ng de ADN de
actina \beta/ml de suero, mientras que el ADN de actina \beta
en el suero de 10 pacientes diferentes de cáncer pancreático
recuperado usando el procedimiento de la invención se elevó en gran
medida (media = 146 ng/ml). Estos hallazgos de ADN de actina
\beta elevado en el suero de los individuos que tienen cáncer
pancreático comparado con el de los normales se soportan mediante
varias reseñas en la bibliografía (4,9).
En este ejemplo, la recuperación de ADN de actina
\beta a partir de 6 pacientes con cáncer pancreático confirmado
se comparó usando el procedimiento de la invención y el
procedimiento de Qiagen de acuerdo con los materiales y los
procedimientos del ejemplo 3 en esta memoria descriptiva. En
general, como se muestra en la tabla VIII, el procedimiento de la
invención produjo niveles más altos o comparables de ADN de actina
\beta según se ensayó mediante en ensayo de TaqMan actina
\beta. Dependiendo de la muestra, las concentraciones de ADN
medible variaba entre 31 y 310 ng/ml.
Los resultados son la media de 4 réplicas por
muestra, excepto para la muestra 1 y 2 que son la media de 6
réplicas. La muestra 2 evaluada con el protocolo de Qiagen es la
media de 2 réplicas.
Este ejemplo ilustra la utilidad del
procedimiento de la invención para aislar el ADN circulante a
partir de suero de 20 individuos normales y 30 individuos que
tienen una diagnosis de cáncer confirmado. El suero de pacientes
con cáncer incluyó 10 pacientes con cáncer pancreático confirmado, y
20 muestras de cáncer de colon (8 Dukes B, 5 Dukes C, y 7 Dukes D).
El ADN se aisló según el procedimiento de la invención como en el
procedimiento descrito en el ejemplo 3 en esta memoria descriptiva.
El ADN se cuantificó usando el ensayo TaqMan de actina \beta. La
captura de polímero sin el uso de un reactivo de lisis permitió que
el ADN circulante se concentrara con una contaminación mínima o sin
contaminación con ADN a partir de lisis de células indeseables y
eliminación de las interferencias de la PCR que pueden estar
presentes en suero. El ADN en cada suero se cuantificó mediante el
ensayo de TaqMan para el gen de actina \beta usando la curva
patrón en esta memoria descriptiva en la figura 1.
Los resultados se los análisis para el ADN
circulante libre en cada muestra se muestran en las tablas IX y IX B
e indican que los niveles de ADN son elevados en suero de pacientes
con cáncer comparados con el suero de los individuos normales.
En este ejemplo, se empleó una realización de la
invención que implica la captura con polímero de ADN a partir del
suero de pacientes con cáncer pancreático. Se realizó la PCR
selectiva mediada por la endonucleasa de restricción
(abreviadamente en inglés REMS-PCR) (Roberts, N. J.
y col., 1999, Biotechniques 27: (3) 418-422, Ward,
R. y col., 1998, Am. J. Pathol. 153 (2): 373-379, y
el documento WO 96/32500) seguido de análisis sobre gel que se usó
para detectar la presencia de una mutación K-ras en
el codón 12 (K12-ras).
Suero o plasma (300 \mul) de cada uno de los
pacientes de cáncer pancreático se añadió a tubos separados de
microcentrífuga, seguido de la adición de 100 \mul de tampón ACES
250 mM (ácido
N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico)
(pH 6,8 a 23ºC). Se añadieron quince microlitros (15 \mul) de
polímero
poli(1-vinilimidazol-co-2-hidroxietilmetacrilato
(relación en peso 77/23) (véanse las patentes de Estados Unidos
números 5.434.270; 5.523.368 y 5.582.988) y los tubos se mezclaron
mediante un mezclador minivortex (VWR Scientific, Rochester, N. Y.)
durante 10 segundos. Después los tubos se centrifugaron en una
microcentrífuga Eppendorf, modelo 5415, a la velocidad máxima
durante 2 minutos. El fluido sobrenadante se decantó y se añadieron
a cada tubo 100 \mul de hidróxido sódico 20 mM, y el sedimento se
volvió a suspender mezclando y se calentó hasta 100ºC durante 10
minutos.
Cada mezcla de PCR contenía tres conjuntos de
cebadores. Los cebadores de diagnóstico inducen un sitio de
restricción Bstn1 en ras de tipo salvaje, pero no en una
mutación en el codón 12 de ras. Así pues, el ADN de tipo
salvaje de ras se escinde selectivamente durante
termociclación con la PCR, y se enriquecen las secuencias mutantes
de ras en el codón 12. El par de cebadores de control de la
PCR se usa para confirmar que se ha extraído el ADN amplificable de
la PCR, y el par de cebadores de control de enzimas confirma que la
enzima de restricción funcionó durante la termociclación. Las
mezclas de reacción contenían 12 unidades/100 \mul de la Taq
polimerasa recombinante, y un exceso 5 veces en peso (0,842 \mul)
de anticuerpos inhibidores de Taq TPA-9,2 (véanse
las patentes de Estados Unidos números 5.338.671 y 5.587.287) sobre
la polimerasa, tampón HT50 1 mM (cloruro sódico 100 mM, y Tris
(tris(hidroximetil)aminometano) 50 mM, pH 8,3, 0,3
\muM de cebadores de diagnóstico (véase más adelante), 5K15S
(SEC ID Nº 1) y 5K37 (SEC ID Nº 2), 0,05 \muM de pares de
cebadores de control de la PCR), 3K42 (SEC ID Nº 3) y 5BK5 (SEC ID
Nº 4), 0,1 \muM de pares de cebadores control, 5N12A (SEC ID Nº
5) y 3N13A (SEC ID Nº 6), 0,2 mM de trifosfatos de disnucleósidos
(dNTP) totales, 0,3 unidades/\mul de Bsl1 (New England BioLabs,
Beverly MA), ditiotreitol 1 mM (DTT), cloruro de magnesio 5 mM,
muestra (típicamente 3 \mul) y agua desionizada hasta un volumen
final de 100 \mul. La polimerasa Taq y anticuerpos
anti-Taq se combinaron y se incubaron durante
10-15 minutos antes de la adición de los otros
componentes de la PCR. Los parámetros de termociclación eran como
sigue: 1 ciclo a 94ºC durante 100 segundos, y 36 ciclos a 92ºC
durante 15 segundos, y 60ºC durante 60 segundos. Las secuencias de
cebadores eran como sigue:
Las muestras se analizaron mediante
electroforesis sobre gel de agarosa NUSieve (FMC Bioproducts,
Rockaland, ME) al 4% p/v y se representó mediante un sistema de
video Stratagene Eagle Eye II (La Jolla, CA).
La figura 2 muestra los resultados de análisis
para una mutación ras K-12 como se determina
mediante electroforesis sobre gel después de
REMS-PCR. La banda 1 muestra los resultados para
K-562, que es de tipo salvaje para ras. La
banda 2 muestra los resultados para un ADN Calul, heterocigoto para
una mutación K-ras en el codón 12 (Capon, D. J. y
col., 1983, Nature 403: 507-513) y un exceso
de 10 veces de ADN de tipo salvaje K-562. Esta
muestra presenta una banda control de PCR fuerte en 167 pares de
bases y una banda de diagnosis fuerte en 68 pares de bases. Tanto el
suero como el plasma del paciente 1 perdieron una banda de
diagnosis en 68 pares de bases y son negativas para una
K-ras. La presencia del ADN amplificable de la PCR se indica
mediante la banda de control de la PCR en 167 pares de bases. Las
muestras de plasma y suero del paciente 2 perdieron una banda de
control de la PCR en 167 pares de bases indicando que no existe ADN
amplificable circulante detectable en esta muestra. Tanto el suero
como el plasma del paciente 3 con cáncer pancreático eran positivos
para una mutación K-12 ras indicada mediante
la banda en 68 pares de bases así como una banda de control de la
PCR fuerte en 167 pares de bases. Una banda de control de enzimas
en 126 pares de bases está ausente en todas las muestras en la
figura 2, indicando que la enzima de restricción era activa durante
la ciclación por la PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Belly, Robert T
\hskip1cmSun, Jianbo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CAPTURA RÁPIDA Y EFICAZ DE ADN A
PARTIR DE UNA MUESTRA SIN USAR REACTIVO DE LISIS CELULAR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
CDS219CKG_PCT-SECUENCIAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/132.443
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaatataaa cttgtggtac ctggagct
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatataaactt gtggtagttc cagctggt
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattagctg tatcgtcaag gcactc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagcaaaga caagacaggt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatagatggt gaaacctgtt tgttgg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HUMANO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgctatta ttgatggcaa ccacacaga
\hfill29
Claims (9)
1. Un procedimiento para proporcionar un ácido
nucleico a partir de una muestra sin el uso de un reactivo de lisis
celular, que comprende las etapas de:
- A)
- a un pH de menos de 7, poner en contacto una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico con un polímero soluble en agua, débilmente básico que comprende unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de:
- 1)
- entre aproximadamente 15 y 100 por ciento en peso de un monómero polimerizable débilmente básico etilénicamente insaturado que tiene al menos un grupo que se puede protonar a pH ácido y que se selecciona entre el grupo constituido por aminoalquilo, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y quinazolinilo
- 2)
- entre 0 y aproximadamente 35 por ciento en peso de un monómero no iónico, hidrófilo etilénicamente insaturado, y
- 3)
- entre 0 y aproximadamente 85 por ciento en peso de un monómero polimerizable, no iónico, hidrófobo etilénicamente insaturado en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de dicho polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en dicho lisado,
- B)
- separar dicho precipitado insoluble en agua de dicha muestra, y
- C)
- poner en contacto dicho precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar dichos ácidos nucleicos de dicho polímero débilmente básico, comprendiendo dicho polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 que
además comprende la etapa:
- D)
- ajustar el pH de dicha solución que contiene dichos ácidos nucleicos liberados a entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que dicha base es hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido
amónico, hidróxido de litio, carbonato sódico, bicarbonato sódico,
una amina terciaria o
tris(hidroximetil)aminometano.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que dicho polímero débilmente básico se usa en la etapa A) en una
cantidad de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,5% en
peso.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que en la etapa C) se usa una base débil, acompañado de
calentamiento de dicho precipitado insoluble en agua a entre
aproximadamente 50º y aproximadamente 125ºC.
6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que en la etapa C) se usa una base fuerte sin calentar dicho
precipitado insoluble en agua.
7. Un procedimiento para la amplificación y
detección de un ácido nucleico diana sin el uso de un reactivo de
lisis celular, que comprende:
- I)
- proporcionar una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico diana,
- II)
- someter dicha muestra que contiene el ácido nucleico diana a las etapas de:
- A)
- a un pH menor de 7, poner en contacto dicho ácido nucleico diana con un polímero soluble en agua, débilmente básico que comprende unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de:
- 1)
- entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100 por ciento en peso de un monómero polimerizable débilmente básico etilénicamente insaturado que tiene al menos un grupo que se puede protonar a pH ácido y que se selecciona entre el grupo constituido por aminoalquilo, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y quinazolinilo
- 2)
- entre 0 y aproximadamente 35 por ciento en peso de un monómero polimerizable no iónico, hidrófilo etilénicamente insaturado, y
- 3)
- entre 0 y aproximadamente 85 por ciento en peso de un monómero polimerizable no iónico, hidrófobo etilénicamente insaturado en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de dicho polímero débilmente básico con todos los ácido nucleicos presentes en dicha muestra, incluyendo dicho ácido nucleico diana,
- B)
- separar dicho precipitado insoluble en agua de dicha muestra, y
- C)
- poner en contacto dicho precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar dichos ácidos nucleicos, incluyendo dicho ácido nucleico diana, de dicho polímero débilmente básico, comprendiendo dicho polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido.
- III)
- sin ajuste adicional de pH, amplificar dicho ácido nucleico diana liberado, y
- IV)
- detectar dicho ácido nucleico diana amplificado.
8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el
que dicho polímero débilmente básico es insoluble en agua a pH
básico, y comprendiendo dicho procedimiento además la etapa de
retirar dicho polímero insoluble en agua después de la liberación
de dicho ácido nucleico diana de él y antes de la amplificación del
mismo.
9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el
que el ácido nucleico diana es una secuencia
K-ras.
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