ES2228128T3 - Complejos de acido hialuronico/carnitinas y composiciones farmaceuticas y cosmeticas. - Google Patents

Abstract

Complejos de ácido hialurónico/carnitinas y composiciones farmacéuticas y cosméticas. La presente invención se refiere a complejos de ácido hialurónico y ¿carnitinas¿, este último término significa en la presente memoria descriptiva carnitina como tal y, más específicamente, sus derivados acilo con ácidos carboxílicos alifáticos de cadena lineal o ramificada, opcionalmente insaturados o poliinsaturados, que contienen de 2 a 20 átomos de carbono. Aunque los complejos según la invención pueden contener, como componente de carnitina, DL-carnitina o mezclas de D y L carnitina en proporciones variables, así como los derivados acilo relacionados como se ha indicado antes, la forma de realización preferida se refiere a complejos de ácido hialurónico y L-carnitina o de acil-L-carnitina, en el que ¿acil¿ tiene los significados definidos anteriormente. Por tanto, en la presente invención, ¿carnitina¿ significará, a menos que se indique otra cosa, L-carnitina; los mismo se aplica a las diversas acilcarnitinas que se citarán a continuación. En la presente memoria descriptiva, ¿ácido hialurónico¿ significará un ácido hialurónico de peso molecular variable desde aproximadamente 2 x 103 aproximadamente 5 x 106, preferentemente de aproximadamente 2 x 105 a aproximadamente 3 x 106.

Description

Complejos de ácido hialurónico/carnitinas y composiciones farmacéuticas y cosméticas.

La presente invención se refiere a complejos de ácido hialurónico y "carnitinas", este último término significa en la presente memoria descriptiva carnitina como tal y, más específicamente, sus derivados acilo con ácidos carboxílicos alifáticos de cadena lineal o ramificada, opcionalmente insaturados o poliinsaturados, que contienen de 2 a 20 átomos de carbono.

Aunque los complejos según la invención pueden contener, como componente de carnitina, DL-carnitina o mezclas de D y L carnitina en proporciones variables, así como los derivados acilo relacionados como se ha indicado antes, la forma de realización preferida se refiere a complejos de ácido hialurónico y L-carnitina o de acil-L-carnitina, en el que "acil" tiene los significados definidos anteriormente. Por tanto, en la presente invención, "carnitina" significará, a menos que se indique otra cosa, L-carnitina; los mismo se aplica a las diversas acilcarnitinas que se citarán a continuación.

En la presente memoria descriptiva, "ácido hialurónico" significará un ácido hialurónico de peso molecular variable desde aproximadamente 2 x 10^{3} aproximadamente 5 x 106, preferentemente de aproximadamente 2 x 10^{5} a aproximadamente 3 x 10^{6}.

Como se hace evidente de lo que se ha indicado antes, ambos componentes de los complejos según la invención son conocidos por sí mismos. La información en cuanto al ácido hialurónico así como las numerosas referencias acerca de la carnitina (página 281) y acetilcarnitina (página 13) se pueden encontrar, entre otros, en el Índice de Merck, 11ª edición, páginas 751, 281 y 13, respectivamente; mientras que las acilcarnitinas y/o el uso de las mismas son objeto de una serie de patentes (véase, por ejemplo, los documentos US 4.346.107, US 4.194.006, US 4.343.816).

El documento EP 0 951 909 describe combinaciones de L-carnitina y derivados con ácido hialurónico, que son antiinflamatorios y protectores de cartílago.

Las indicaciones terapéuticas de los componentes citados también son bien conocidas. En particular, el ácido hialurónico se usa como coadyuvante en el tratamiento de la sinovitis y en los procesos de reparación tisular.

En la actualidad se ha descubierto que los complejos (o incluso las simples combinaciones) de ácido hialurónico y "carnitinas" (que quiere decir carnitina como tal y sus derivados acilo) pueden estar en forma de y actuar como un complemento alimentario o un medicamento real, según su acción favorable, preventiva o terapéutica, que se pretende que dichos complejos o combinaciones ejerzan, en función de los usuarios finales específicos.

Además, se ha descubierto que dichos complejos y combinaciones pueden ser valiosos en la cosmética.

De hecho, los complejos y las combinaciones indicados anteriormente poseen: a) una mayor actividad protectora sobre los tejidos y la membrana plasmáticas de las células, b) actividades antiinflamatorias y antioxidantes; c) actividad antienvejecimiento, en particular actividades de restauración o mantenimiento de la elasticidad de la piel; d) una acción general trófica, de importancia cosmética. En particular, los complejos y las combinaciones según la invención son adecuadas para el tratamiento de la sinovitis y la gonartrosis, la enfermedad de Crohn, la rectocolitis ulcerosa y la enfermedad celíaca. Dichas actividades pueden ser más o menos marcadas, dependiendo de la única "carnitina" usada.

Por tanto, otro objeto de la invención son las composiciones farmacéuticas y cosméticas que contienen como ingrediente activo: a) combinaciones de ácido hialurónico y carnitina o acilcarnitina o b) según un aspecto preferido de la invención, complejos de ácido hialurónico y carnitina o acilcarnitina, donde dichas combinaciones y complejos contienen los dos componentes en proporciones en peso variables de 3:1 a 1:3, preferentemente en proporciones equiponderales.

Más particularmente, un objeto de la invención son composiciones farmacéuticas que contienen como ingrediente activo las combinaciones a) o los complejos b) definidos anteriormente, con actividad protectora sobre los tejidos y las membranas plasmáticas celulares; con actividades antiinflamatorias y antioxidantes; para el tratamiento de sinovitis y gonartrosis; para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la rectocolitis ulcerosa y la enfermedad celíaca; es más, composiciones cosméticas que contienen las combinaciones a) o los complejos b), con actividad antienvejecimiento, actividades de restauración y de mantenimiento sobre la elasticidad de la piel y una acción trófica general.

Como ya se ha mencionado, la carnitina y las acilcarnitinas contenidas en las composiciones farmacéuticas y cosméticas mencionadas anteriormente son, preferentemente, L-carnitina y acil-L-carnitina. En particular se prefieren acetil-L-carnitina, propionil-L-carnitina y palmitoíl-L-carnitina.

Los complejos de la invención contienen los dos componentes en proporciones ponderales variables de 1:3 a 3:1, preferentemente en proporciones equiponderales. Se obtienen mediante: a) la adición de ácido hialurónico a una suspensión o una solución de acilcarnitina (o carnitina) en PBS y/o etanol (suero salino tamponado con fosfato), en agitación enérgica, a una temperatura de 20-60ºC, b) la adición de acilcarnitina (o carnitina) a una solución de ácido hialurónico en PBS, sometiendo todo, en primer lugar, a ultrasonidos a temperaturas variables de entre 10 y 30ºC, preferentemente a 15-20ºC, después a centrifugación, con recuperación del sobrenadante. Se ha probado que el producto resultante es un complejo real por medio de las determinaciones químico-físicas que se describirán a continuación.

El procedimiento para la preparación de los complejos de la invención se ilustra en los siguientes ejemplos no limitantes. A continuación, el ácido hialurónico se denominará AH. Además, AH significará un ácido hialurónico de peso molecular variable desde aproximadamente 2 x10^{5} a aproximadamente 3 x 10^{6}, como el ácido y como las sales de metales alcalinos o alcalino-térreos.

Ejemplo 1

Se disolvió palmitoíl-L-carnitina (PC) en etanol absoluto, después la solución se añadió a una solución de PBS (pH 7,4) para obtener concentraciones finales de PC de 0,1 y 0,5 y 1 mg/ml. Las suspensiones resultantes se agitaron en vórtex durante 3 minutos a temperatura ambiente, después se dejaron en agitación durante 1 hora a 50ºC. Durante este tiempo, a la suspensión se añadió lentamente ácido hialurónico (AH) en polvo de diferentes pesos moleculares (2 x 10^{5} a 3 x 10^{6}) hasta alcanzar una concentración final de 0,1, 0,5 y 1 mg/ml. En cada adición de AH, la muestra se agitó en vórtex durante al menos 1 minuto y después se incubó en las mismas condiciones de temperatura.

Ejemplo 2

A una solución de PBS se añadió PC en polvo y después, la suspensión resultante se sometió a ultrasonidos en frío durante un tiempo variable desde 5 a 15 minutos. Posteriormente se añadió AH y la mezcla resultante se agitó en vórtex durante algunos minutos, después se incubó en agitación durante aproximadamente una hora a temperaturas que varían desde 21ºC a 50ºC.

Ejemplo 3

A una solución de 2 ml de AH con peso molecular 3,4 x 10^{6} ó 2 x 10^{5}, respectivamente, en PBS (1 mg ml^{-1}) se añadió una alícuota de PC (20 \muM) en etanol (20 \mul). Los componentes se mezclaron durante 15-20 minutos a 20ºC en un baño de agua con ultrasonidos, a 100 W. Las soluciones opalescentes resultantes se centrifugaron (3000 g) durante 10 minutos y se separaron los sobrenadantes. Está solución no mostró ningún signo de separación de fases, incluso después de haber estado en reposo a 4ºC durante varios días.

Evaluación del complejo AH/carnitina Determinación de los efectos de los ultrasonidos sobre la dispersidad molecular del AH

Con el fin de determinar los efectos de los ultrasonidos sobre el AH solo, el protocolo usado anteriormente (Ejemplo 3) se repitió durante periodos de hasta 2 h en ausencia de PC. A continuación, una alícuota (0,5 ml) de la solución resultante sometida o no a ultrasonidos (1 mg ml^{-1}) en PBS (pH 7,2) que contenía 20 \mul de etanol se aplicó a una columna de filtración en gel de sefarosa CL-2B (30 x cm) equilibrada con el mismo tampón. La columna se eluyó a 3-6 ml/h con PBS, y los niveles de AH en las fracciones recogidas se determinaron mediante análisis con hexuronato usando el procedimiento de Blumenkranze y Asboe-Hansen.

Estudios de la interacción de AH con ^{3}H-PC mediante cromatografía en gel de exclusión molecular

Mezclas de AH (1 mg ml-1 en PBS) y PC-^{3}H etanólico (20 \mul; 20 \muM) se sometieron a ultrasonidos durante 2 horas usando el protocolo descrito anteriormente. Los sonicados se fraccionaron en una columna de sefarosa CL-2B (1 x 60 cm) eluyendo a 3,6 ml h^{-1} con PBS como tampón de elución. Las fracciones (1 ml) se recogieron y analizaron para detectar ácido hexurónico y radioactividad (desintegración por minuto) mediante espectrometría por centelleo.

Estudios de la interacción de AH con PC usando fotometría MALLS

En estos experimentos se usó un fotómetro MALLS junto con un detector del índice de refracción (IR), una columna de permeación en gel de superosa 6 HR30 (GPC) y una bomba de reciprocidad de pistón doble P500. Las mezclas de AH (1,0 mg ml-1 en PBS) y PC (20 \mul; 20 \muM en etanol) se sometieron a ultrasonidos durante 0, 15, 30, 60 ó 120 minutos. Después, las soluciones se diluyeron con un volumen igual de PBS, se centrifugaron (3000 g) y el sobrenadante se aplicó a la columna 6 de superosa, eluyendo a 24 ml h^{-1} con tampón PBS usando la bomba P500. Las fracciones se examinaron en serie con el fotómetro MALLS y el detector de IR. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. El peso molecular promedio en número (Mn), el peso molecular promedio en peso (Mw), el peso molecular promedio en Z (Mz) y la raíz cuadrada media (RCM) de los radio calculada para cada uno de estos parámetros se determinaron a partir de la cantidad de variación angular de la luz dispersada para las fracciones eluidas de la columna. La proporción Mw/Mn se usó para valorar la polidispersidad molecular.

Espectroscopia RMN-^{1}H

Se obtuvo la RMN-^{1}H de alta resolución (199,5 MHz) de las muestras usando un espectrómetro JEOLFX-200 en modo de transformada de Fourier. Las muestras se introdujeron en tubos de vidrio Wilmard de 10 mm junto con un tubo coaxial de 5 mm con tetrametilsilano en óxido de deuterio. Esto se usó cono una referencia de integración externa. La temperatura de la muestra se mantuvo a 37ºC. Toda las muestras se desgasificaron con argón antes de proceder a las mediciones. La movilidad conformacional (flexibilidad) de la solución de AH se determinó usando un procedimiento que requirió la determinación de la anchura de la línea a la altura de la mitad del pico (-V ½) para la resonancia de metil protón de los residuos de acetamidodesoxiglucosa de los espectros RMN-^{1}H del hialuronato.

Espectroscopia RMN-^{13}C

Los espectros de desacoplamiento de protón RMN-^{13}C (50,1 MHz) de las preparaciones de AH (10% p/v) disueltas en D_{2}O se obtuvieron usando un espectrómetro JEOLFX-200 FT. Las muestras se introdujeron en tubos de vidrio Wilmard de 10 mm en los que se había colocado un tubo coaxial de 4 mm con acetonitrilo como referencia externa. La temperatura de la muestra se mantuvo a 37ºC y se usaron una anchura del espectro de 1 kHz y 6000 puntos de datos.

Resultados Cromatografía en gel de exclusión molecular de los sonicados de AH con PC-^{3}H

La cromatografía de los sonicados de AH con PC-^{3}H en las mismas condiciones que el AH solo mostró que, aunque la mayoría del PC marcado radioactivamente apareció en el volumen total (V_{L}), una porción del PC marcado radioactivamente aplicado eluyó a V_{0}. El PC-^{3}H eluyó en fracciones que correspondían en gran medida a las fracciones de AH de mayor peso molecular.

Estudios de los efectos de PC y ultrasonidos de las características moleculares del AH usando fotometría MALLS

Aunque los ultrasonidos del AH disminuye de progresiva los Mn, Mw y Mz con respecto al AH no sometido a ultrasonidos (nativo) (Mw= 3,4 x 10^{6}), estos parámetros fueron mayores en los correspondientes sonicados en los que se había incluido PC. Los radios RMS correspondientes también fueron consistentemente superiores que en los sonicados de AH sin PC, pero la polidispersidad (Mw/Mn) era independiente de la presencia de PC o del tiempo de ultrasonidos.

Estudios RMN

Los valores RMN-^{13}C de desplazamiento químico para el AH muestran que los valores para los carbonos del anillo de la unidad repetitiva del disacárido N-acetilglucosamina y ácido glucurónico de AH eran comparables en todas las preparaciones, lo que confirma que las estructuras primarias son idénticas. Los ultrasonidos de una preparación con AH de alto peso molecular o AH de bajo peso molecular con PC durante periodos de tiempo de hasta 2 h aumentaron marcadamente la proporción de dominios flexibles presentes, como se determina a partir de los valores de la anchura de línea de los protones de acetamidometilo en sus respectivos espectro de RMN-^{1}H. En los experimentos control en los que se omitió el PC y se aplicaron ultrasonidos durante los mismos periodos de tiempo, se observó una ligera disminución del porcentaje de flexibilidad de las preparaciones de AH.

Los efectos de la variación de las concentraciones de AH sobre el porcentaje de segmentos flexibles y rígidos presente en la solución de AH sometida a ultrasonidos durante 60 minutos en presencia de PC mostraron que las proporciones relativas presentes no cambiaron de forma sustancial en un intervalo de diez veces la dilución.

Actividad antiinflamatoria

Una reacción inflamatoria cutánea específica, causada por diferentes factores proinflamatorios de origen exógeno y endógeno, incluida la formación de radicales libres, lipoperóxidos, prostaglandinas y citocinas, es la inducida mediante inyección intradérmica de ditranol, como describe Mustakallio (Mustakallio K., DERMATOVENER, 54, 125, 1979).

El ditranol se inyecta por vía intradérmica a dosis de 20 \mug en el lomo de cobayas que se han afeitado previamente. En el lado opuesto al lomo, antes de la inyección de la misma cantidad de ditranol, se extienden AH solo o acetil-L-carnitina sola (AC) o AH y AC juntos o el complejo AH y AC.

Para diseminar estos compuestos se usa una mezcla de lanolina y monoestearato de etilenglicol. Después de 48 horas de este tratamiento, mediante la evaluación del área de inflamación cutánea inducida por ditranol se probó que el AH es capaz de inhibir el área de inflamación aproximadamente un 30%. Por el contrario, el AL solo no posee actividad protectora alguna.

La combinación de AC y AH induce un efecto inhibidor más evidente sobre la inflamación inducida por ditranol.

La administración simultánea de AC y AH induce un efecto inhibidor en la superficie del área de inflamación de aproximadamente el 50%. Cuando se usa el complejo de AH que contienen la misma cantidad de AH y AC se hace evidente de forma global una inhibición muy significativa (alrededor del 75%).

Mediante estos experimentos se probó el sorprendente y potente efecto protector inducido por el complejo AH/AC en comparación con el ejercido por los compuestos únicos solos o juntos (Tabla 1).

Este efecto inesperado y sorprendente ejercido por el complejo de AH y AC en comparación con sus componentes usados solos o juntos, se ha demostrado con otra prueba diferente, la de la teleocidina, que como otros sorbolmiristatos, si se inyecta, induce en la piel de ratones importantes alteraciones y la formación de reacciones tumorales (Fujikl H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 90, 976, 1979). Estas alteraciones cutáneas la enzima ornitinadescarboxilasa, y este incremento está relacionado con la gravedad del daño cutáneo inducido.

En estos experimentos, la teleocidina se inyecta en la piel afeitada del lomo de ratones a una dosis de 5 \mug/ratón disueltos en 0,2 cm^{3} de solución.

El AH y la AC, administrados solos o juntos, o en la forma de un complejo según la invención, se diseminan cinco minutos antes que la teleocidina en los lomos de los animales. Se aplican dosis de ornitinadescarboxilasa en la epidermis homogeneizada de los animales, cinco horas después de la inyección de teleocidina, según el procedimiento de O'Brien y Nakadate (O'Brien T.G., Cancer Res., 35, 1662, 1975- Nakadate T. Cancer Res., 42, 2841, 1982). La concentración proteica de un extracto de epidermis se evalúa siguiendo el procedimiento descrito por Lowry (Lowry O. H., J. Biol. Chem., 193, 265, 1951).

Como se muestra en la Tabla 2, en estos experimentos también se muestra un efecto sorprendente, inesperado y más potente del complejo de AH y AC según la invención en comparación con los dos componentes distintos.

TABLA 1

Actividad antiinflamatoria sobre la inflamación inducida por ditranol
Tratamiento	% de inhibición del área flogística en comparación con los controles
AC 50 mg	9 \pm 0,19
AC 100 mg	14 \pm 0,34
AH 10 mg	39 \pm 1,6
AH 50 mg	38 \pm 2,9
AC 100 mg + AH 50 mg	52 \pm 4,9
Complejo AH/AC 50 mg	65 \pm 5,1
Complejo AH/AC 100 mg	78 \pm 6,8

TABLA 2

Incremento de la actividad ornitinadescarboxilasa inducida por teleocidina
Tratamiento	Actividad orinitinadescarboxilasa (nmol de CO_{2}/60 min/mg proteína)
AC 50 mg	5 \pm 0,45
AC 100 mg	11 \pm 1,49
AH 10 mg	21 \pm 2,8
AH 50 mg	31 \pm 4,1
AC 100 mg + AH 50 mg	41 \pm 4,9
Complejo AH/AC 50 mg	55 \pm 5,7
Complejo AH/AC 100 mg	75\pm 6,9

Ensayos clínicos Efecto del ácido hialurónico/carnitina sobre la función de barrera del epitelio corneano en el caso del síndrome del "ojo seco"

Se ha reconocido que la sequedad de la conjuntiva, aislada o asociada con otra enfermedad ocular o extraocular, es capaz de inducir daño local sobre el epitelio corneano que puede, entre otras cosas, perder su función de barrera. Sobre la base de un experimento preliminar con conejos, en el que se probó la eficacia de una combinación de 1:1 p/p de ácido hialurónico/carnitina en la prevención de erosiones inducidas por vapores de yodo, se llevó a cabo un ensayo clínico con 27 pacientes con "sequedad de ojo" tratados con ácido hialurónico sólo o con ácido hialurónico/carnitina. Según el protocolo, cada paciente recibió durante 4 semanas una medicación (ácido hialurónico) en forma de colirio en un ojo y un tratamiento diferente (ácido hialurónico/carnitina) en el otro ojo, de forma que cada uno de los pacientes también actuaba como control. Dos semanas después del comienzo del tratamiento, así como al final (4 semanas) se llevaron a cabo una evaluación subjetiva y exploraciones clínicas, asociados con una prueba de fluoresceína. Los resultados obtenidos probaron que el ácido hialurónico solo no proporcionaba ventajas significativas en la mejora de los síntomas que afectan a los pacientes ni en el mantenimiento de la función de barrera eficaz en el epitelio corneano. Por el contrario, la fluorofotometría del ojo tratado con ácido hialurónico/carnitina para evaluar la captación de fluoresceína en áreas específicas de la córnea mostró una mejora significativa de la función de barrera, ya tras 2 semanas de tratamiento en las áreas inferiores de la córnea y tras 4 semanas en las zonas centrales.

Evaluación de la eficacia de la combinación de ácido Hialurónico/carniyina en el tratamiento de úlceras tróficas de las extremidades inferiores

Las úlceras vasculares de las extremidades inferiores son patologías multidisciplinares.

Por úlcera se entiende la pérdida de sustancia relacionada con cambios hemodinámicos, hemoreológicos y de coagulación; la implicación de la microcirculación, primaria o secundaria, es importante en la génesis de una úlcera y causa un deterioro del trofismo tisular, con pérdida de tejido.

A menudo, las úlceras son la manifestación de una serie de patologías subyacentes a una circulación sanguínea insuficiente, que causa hipoxia. De hecho, mediante oximetría transcutánea se hace evidente que, en el caso de las lesiones vasculares, la pO_{2} alcanza 5-10 mm de Hg, niveles capaces de afectar en gran medida las capacidades metabólicas celulares y la producción de energía. Además, los leucocitos proliferan y ejercen su actividad fagocítica a una pO_{2} de 30-40 mm Hg.

El tratamiento todavía es un problema sin resolver, que no resiste el gran número de ayudas farmacológicas y físicas.

Desde el punto de vista estadístico, según numerosos estudios, las úlceras tróficas de las extremidades inferiores afectan al 1-3% de la población, con un 5% máximo entre los sujetos mayores de sesenta años de edad. Los factores más frecuentes causantes de úlceras son las flebopatías, las arteriopatías, la diabetes con la neuropatía microanglo relacionada. Las áreas afectadas son, en orden de frecuencia, la cara medial del tobillo seguido por la cara lateral del tobillos, la parte trasera y frontal, la pantorrilla y los pies. La duración media de una úlcera en de aproximadamente 26 semanas, con un intervalo variable de 4 a 30 años, y las recaídas son muy frecuentes.

El proceso de cicatrización implica inflamación con migración celular, neovascularización y regeneración; la reparación celular está mediada por varios factores que actúan como estimuladores de la regeneración tisular.

Es fundamental la observación de las características de la úlcera con el fin de prever su evolución, y particularmente importantes es la caracterización según: el sitio, la forma, el tamaño, el número, los bordes, el tejido de granulación, la epidermidis periulcerativa.

Úlceras venosas: son ulceraciones más o menos profundas relacionadas con la hipertensión secundaria a la enfermedad varicosa o la trombosis venosa. El primum movens es una hipertensión venosa crónica que afecta a los microvasos, con el consiguiente enlentecimiento de la circulación y modificaciones funcionales y estructurales.

Úlceras arteriales: principalmente están relacionadas con la enfermedad aterosclerótica periférica. Las ulceraciones son lesiones tróficas que afectan a los sujetos con arteriosclerosis obliterante crónica. Aparecen cuando se produce una disminución del flujo sanguíneo superior al 50%, en el que ya no es posible la compensación por la microcirculación y se pone en peligro el ya precario equilibrio hemodinámico.

El protocolo usado es el siguiente:

1) Administraciones tópicas de una combinación de ácido hialurónico y carnitina (1:1 en peso); o de carnitina sola o de ácido hialurónico solo, previa humidificación de la lesión con suero salino durante un periodo de 10 minutos. En los primeros tratamientos, es posible usar ácido hialurónico a una concentración superior que la carnitina, para estimular la limpieza de la úlcera. En los tratamientos siguientes, se han usado unas concentraciones de las dos moléculas tales que se pueda hacer un mejor uso del papel de la carnitina en la normalización del trofismo tisular. El tratamiento normalmente comenzó durante la hospitalización y después se continuó en la clínica de terapia analgésica.

Como norma, los pacientes se someten a tal tratamiento sin problemas; algunos sujetos sufrieron episodios de ligeras irritaciones de corta duración y, a veces, de quemaduras locales durante las primeras sesiones del tratamiento.

Los pacientes incluidos en este ensayo procedían de los Departamentos de Medicina y Cirugía, donde habían recibido sin éxito varios tratamientos médicos (mesiglicano, Connactivina, mucopolisacáridos).

Se trataron 18 mujeres y 12 varones, de 62 a 80 años de edad, con úlceras tróficas de varios tamaños y en diferentes sitios, en cualquier caso en las extremidades o los pies.

Resultados

Los resultados se puntuaron del siguiente modo: MUY BUENOS, cuando la úlcera cicatrizó por completo; BUENOS, cuando se consiguió al menos un 50% de reducción de la lesión; NULOS, cuando, tras 30 días de tratamiento, no se produjeron cambios significativos en la lesión.

Los resultados fueron los siguientes:

MUY BUENOS: en 15 pacientes, es decir un 50%;

BUENOS: en 11 pacientes, es decir un 36,7%,

NULOS: en 4 pacientes, es decir un 13,3%.

En el caso del tratamiento con ácido hialurónico solo o con carnitina sola, los resultados fueron marcadamente peores, en sólo el 16% de los pacientes tratados durante el mismo tiempo con ácido hialurónico se obtuvo una respuesta puntuada como BUENA, mientras que en ningún paciente se observó una respuesta MUY BUENA. Además, desde el punto de vista histológico, las biopsias de los pacientes tratados con la combinación de ácido hialurónico/carnitina mostraron una normalización de la capa de la epidermis que no se pudo observar en los controles.

Por último, e ha probado la eficacia terapéutica del uso de una combinación de ácido hialurónico/carnitina incluso en las ulceraciones crónicas, es decir, las presentes durante al menos un año. Después de 23 semanas, el 89% de las lesiones más difíciles de curar estaban completamente cerradas en comparación con el 15% de las tratadas con el tratamiento tradicional, que principalmente consistía en ejercer presión, usar ácido hialurónico y mantener la lesión húmeda.

No se produjo sustancialmente ninguna complicación, considerando los síntomas mencionados anteriormente.

Conclusiones

En vista de los resultados obtenidos, se puede afirmar que el protocolo terapéutico sugerido es completamente satisfactorio en casi todos los pacientes, y tal evidencia es incluso más significativa al considerar que el tratamiento médico previo no había ejercido ningún resultado favorable. Los cuatro pacientes en los que no se obtuvieron resultados (nulos) se sometieron con éxito a un transplante cutáneo.

Anemia drepanocítica

Los casos descritos a continuación se refieren a algunos sujetos con anemia drepanocítica, una hemoglobinopatía frecuente en la población africana de regiones de malaria, en el que son evidentes las grandes áreas ulcerativas con pérdida de sustancia en las extremidades inferiores.

El término anemia drepanocítica comprende un grupo grande de trastornos hematológicos con síntomas y genotipos diferentes. La forma más habitual es la herencia homocigota de hemoglobina S (que deriva de la sustitución de valina con ácido glutámico en la posición 6 de la cadena de \beta-hemoglobina). Más raramente, la anemia drepanocítica se debe a la heterocigosis doble para la hemoglobina S y para la talasemia y la hemoglobina C. La formación de fibras intracelulares, que derivan de la polimerización de la hemoglobina S, causa la típica deformación falciforme de los eritrocitos. Esto tiene como resultado la rigidez de los eritrocitos, lo que deteriora la microcirculación y la vasooclusión. Además, tales cambios estructurales conllevan la reducción de la supervivencia de los eritrocitos y, por tanto, una anemia hemolítica crónica.

Manifestaciones clínicas

La anemia drepanocítica aparece en los dos primeros años de visa. Los síntomas se pueden dividir en dos categorías principales, los relacionados con la hemolisis y los derivados de los acontecimientos vasooclusivos. Por tanto, en estos pacientes se pueden observar con facilidad las úlceras vasculares tórpidas normalmente resistentes a los tratamientos terapéuticos tradicionales.

Tratamiento

El tratamiento que se lleva a cabo en estos sujetos con la combinación de ácido hialurónico/carnitina produce resultados terapéuticos extremadamente favorables, con "restitutio ad integrum" del área dañada en periodos de tiempo relativamente cortos.

Actividad antidesgaste de AH/carnitina Procedimientos Fundamentos

La Prueba de las cuatro bolas es una prueba estándar de desgaste usado por los ingenieros durante muchas décadas (Instituto del Petróleo). Extreme pressure properties: friction and wear tests for lubricants, Four ball machine. En: Standard Methods for Analysis of Petroleum and related Products, volumen I. Chichester, Wiley, 1990, páginas 256). Su descripción formal como prueba sencilla para determinar las propiedades antidesgaste de los aceites y grasas industriales "en condiciones de presión extrema", es decir, presión extrema según los estándar de ingeniería, indicó que podría ser muchos órdenes de magnitud demasiado grave para un lubricante biológico al comparar las cargas típicas de la ingeniería y la fisiología. Por tanto, fue de lo más sorprendente y bienvenido cuando los datos preliminares mostraron que el líquido sinovial sintético no solo superó las pruebas, sino que lo hizo mejor que varios lubricantes industriales, (Hills, B. A., Hyaluronic acid lubricating compounds. Patente australiana nº 620821, 1992). En consecuencia, se adoptó esta prueba como una prueba extrema necesaria para diferenciar las capacidades
antidesgaste.

Prueba de las cuatro bolas

La "máquina de las cuatro bolas para el lubricante en condiciones de presión extrema" se ha descrito en procedimientos de pruebas estándar (véase la referencia anterior). Si la lubricación es mala en estas cargas extremas (carga vertical de 40 kg) o se rompe tras un periodo de tiempo, la cuarta bola se fusiona con las otras tres y la prueba se para automáticamente. Si esto no se produce, la prueba continúa durante 1 hora y, mediante un microscopio móvil, se miden los diámetros de las cicatrices en cada uno de los dos planos de cada una de las tres bolas fijas en dos planos mutuamente perpendiculares. Los resultados se comunican como la media de seis valores obtenidos, el diámetro medio de la cicatriz (DMC). La velocidad de deslizamiento es de 23,3 cm/s para una tensión Hertz inicial de 3.400 MPa que se reduce a aproximadamente 700 MPa para un DMC de 0,8 mm; este valor corresponde a un volumen de simetría del desgaste de aproximadamente 2 x 10^{-2} mm^{3} (Willermet P. A. y Kandah S. J., Wear asymmetry-A comparison of the wear volumes of the rotating and the stationary balls in the four-ball machine. Trans. Am. Soc. Lubricating Eng. 28: 173-178, 1982). La prueba se repite tres veces en cada muestra. Los aceites más lubricantes proporcionan valores de aproximadamente 0,35 mm, mientras que los mejores lubricantes acuosos poseen un intervalo típico de aproximadamente 0,8-0,9 mm (Castrol Mean Scar Daimeters for Typical Commercial Lubricants, Sidney: Castrol (Australia) Pty. Ltd). Los lubricantes malos tales como agua o suero salino no completan la prueba; las bolas se fusionan tras sólo 10-1 2 segundos.

Materiales

Se probaron los siguientes fluidos:

1.

Se aspiró fluido sinovial de la articulación de la rodilla de voluntarios sanos. El fluido con cualquier indicio de sangre se desechó. Se juntó los fluidos de todas las articulaciones para adquirir los 9 ml necesarios para cada prueba y se usaron inmediatamente para el ensayo. El intervalo de pH de los grupos fue de 6,5-6,9.

2.

Una solución de hialuronano (10 mg/ml; Healon, LKB-Pharmacia) se tamponó hasta u pH 6,7.

3.

Una solución de carnitina o sus acil derivados (es decir, acetil-, propionil-, palmitoíl-, etc.) se tamponó hasta un pH 6,7.

4.

Se preparó un fluido sinovial sintético mediante el uso de diferentes cantidades de AH y de carnitinas. Por ejemplo, e mezclaron 10 mg/ml de AH y 10 mg/ml de carnitina o sus derivados y se tamponaron hasta un pH de 6,7.

TABLA 3

1

\bullet Media= EME

Resultados y discusión

Dado que los lubricantes que reducen la fricción no necesariamente reducen el desgaste, los inventores han abordado la nueva propiedad de una asociación química entre el AH y los derivados para disminuir de forma significativa el desgaste.

El valor del fluido sinovial se acercó a los de los mejores aceites lubricantes, 0,35 mm, y excedió los valores para la "reserva basal" de aceites lubricantes; incluso más impresionante fue el hecho de que el DMC de o,66 mm fue inferior al de cualquiera de los lubricantes comercializados con base acuosa. Mientras que el AH o las carnitinas solos no mostraron signos de capacidades antidesgaste en estas condiciones, al usar AH con derivados de carnitina se conservó un valor del DMC similar al valor medido para el fluido sinovial. Por ejemplo, en presencia de palmitoíl-L-carnitina y AH, se obtuvo un valor de 0,51 mm. Los análisis estadísticos no mostraron diferencias significativas entre los valores para acetil-, propionil- o palmitoíl-L-carnitina, aunque los resultados con palmitoíl-L-carnitina fueron bastante mejores. Por otro lado, se ha mostrado que la carnitina y el AH poseía un valor peor, de 1,57 mm, lo que demuestra que los residuos acilo eran importantes para las propiedades antidesgaste.

Los valores del DMC para la mezcla de AH más derivados de carnitina podrían atribuirse sólo a la adquisición de sinergismo entre los dos componentes. Es más, al medir el coeficiente de fricción cinética en condiciones de carga, la misma muestra mostró una propiedad lubricante soberbia, proporcionando coeficientes de fricción cinética tan bajos como de 0,002-0,005 en condiciones de carga elevada, es decir, dentro del intervalo fisiológico.

Propiedades tróficas de AH/carnitina sobre el tejido cartílaginoso Materiales y procedimientos Muestras de tejido cartilaginoso

En el estudio se incluyeron treinta y cinco sujetos. Los criterios de exclusión fueron septicemia, trastornos del tejido conjuntivo, artritis reumatoide, enfermedades de deposición de cristales, defectos congénitos o hereditarios conocidos, inmovilización durante varias semanas así como tratamiento con corticoides y fármacos citotóxicos.

Procedimientos de cultivo

Las muestras de tejido obtenidas de cada donante se cortaron en trozos de 3-6 mg en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con penicilina (5.000 UI. ml^{-1}). El tejido se lavó tres veces con este medio de cultivo. Los trozos de cartílago se tomaron al azar, se pesaron y se distribuyeron en pocillos diferentes de placas de cultivo de múltiples pocillos (típicamente de entre 30 y 60 mg de tejido/pocillo). No se cultivaron piezas adicionales, pero se guardaron a -20ºC para valorar los contenidos iniciales en proteoglicanos (PG) y AH del cartílago. A continuación, a cada pocillo se añadió medio de cultivo complementado con un 20% (v/v) de suero bovino fetal (medio de cultivo A) y las placas de cultivo se colocaron en un incubador humidificado con una proporción entre aire:CO_{2} de 90%:10% (v/v), durante 48 horas a 37ºC.

Para cada experimento se usó cartílago de un individuo y los cultivos tisulares se realizaron por triplicado: es decir, para el cultivo control, así como para cada cultivo de AH, acetil-carnitina (ALC) o AH + ALC, se cultivaron 3 explantes cartilaginosos por separado. Los valores comunicados son la media de los tres cultivos del triplicado.

Estudios de pulsos

Después de 2 días de cultivo, se aspiró el medio de cultivo y los explantes se lavaron 3 veces con 1 ml de DMEM. Los explantes se resuspendieron en medio de cultivo con 5% de SBF (1 ml 50 mg^{-1} de tejido) complementado con glucosamina-^{3}H (50 \muCi ml^{-1}) (medio de cultivo B). A cada pocillo, se añadió una solución de AH, acetil-carnitina (ALC) o AH + ALC (10 ml/ml en medio de cultivo), hasta alcanzar la concentración final de 100 \mug de ALC. El cultivo control recibió medio solo. Después se incubaron los pocillos de cultivo durante 12 horas.

Estudios de seguimiento

Tras un día de cultivo en medio A, las piezas de cartílago se aspiraron sin medio, se lavaron 3 veces con 1 ml de DMEM, se resuspendieron en medio de cultivo B (1 ml 50 mg^{-1} de tejido) y se cultivaron durante 12 horas. Después del marcaje con pulsos, las piezas de cartílago se lavaron con DMEM y se resuspendieron en medio de cultivo A. A cada pocillo (10 \mul ml^{-1}) se añadió medio solo o las moléculas adecuadas (AH, ALC o AH + ALC) disueltas en medio, como se ha indicado anteriormente, y se realizó un periodo de seguimiento durante 24 horas.

Aislamiento y purificación de hialuronano y proteoglicanos

Al final del marcaje con pulsos y de los periodos de seguimiento no radioactivos, se eliminaron los medios de cultivo y las piezas de cartílago se lavaron con cloruro sódico 0,15M/acetato sódico 0,05M, a pH 6,0 (tampón A). Se combinaron los medios y los correspondientes lavados. Se añadieron PG bovinas nasales (500 \mug ml^{-1}) y hialuronano (10 \mug ml^{-1}). Las mezclas se dializaron contra tampón A y después se incubaron con papaína (10 mg ml-1) durante 24 horas a 60ºC. Las muestras de cartílago se resuspendieron en tampón A; a cada vial se añadió papaína (0,1 mg/ml-1) y los tejidos se digirieron durante 24 horas a 60ºC. Se obtuvieron alícuotas de las muestras para realizar las determinaciones de hidroxiprolina o se sometieron a cromatografía de intercambio iónico en un cartucho Econo-Pak Q.

La columna Econo-Pak Q (5 ml) se equilibró previamente en tampón A a un caudal de 2 ml min-^{1}. Alícuotas de las muestras digeridas con papaína (100-200 \mul para el digerido tisular y 0,5-1 ml para los digeridos del medio) se ajustaron a 2 ml con tampón A y se aplicaron a la columna, que después se lavó con 6 volúmenes de columna de tampón A. Las macromoléculas aniónicas eluyeron de la columna a 2 ml min^{-1} con el siguiente gradiente de NaCl (0,15-0,23 M en 2 minutos, 0,23-0,23 M en 15 minutos, 0,23-1,5 en 15 minutos) en acetato sódico 0,05M a pH 6,0. Se tomaron fracciones de 2 ml y se analizaron en busca de radioactividad. El rendimiento del radioisótopo en la cantidad combinada y las fracciones del gradiente fue> 90%.

Dos picos marcados con ^{3}H eluyeron de la columna de forma consistente: el pico A a NaCl 0,23 M y el pico B a NaCl a aproximadamente 1 M: Para cada muestra (tejidos y medio) las fracciones con los picos radiomarcados se agruparon por separado, se calentaron a 80ºC durante 10 minutos y se aplicaron a una columna (0,7 x 50 cm) de Sephadex G-50 equilibrada en tampón bicarbonato amónico 0,1M a pH 8,5. En cada caso, más del 90% del material radiomarcado presente en ambos picos A y B, eluyó en el volumen excluido de la columna G-50. Por tanto, alícuotas de los picos A y B se digirieron con Streptomyces hyaluronidasa (0,1 \mu/alícuota en acetato Na 0,05M a pH 5,0, durante 6 horas a 60ºC) y condroitinasa ABC (0,5 \mu/alícuota en Tris-fluoruro 0,1M a pH 8,0, durante 6 horas a 37ºC) y los productos de la digestión se aplicaron a la columna G-50. Por otro lado, los productos de la digestión de la condroitinasa ABC también se incluyen en la columna G-50, pero, en contraste con Streptomyces hyaluronidasa, la condroitinasa ABC digieren las cadenas de AH y de condroitina. En consecuencia, la cantidad de AH-^{3}H presente en cada pico se calculó mediante la multiplicación de la radioactividad total del pico por el porcentaje relativo de material marcado radioactivamente que era sensible a Streptomyces hyaluronidasa, mientras que la cantidad de PG-^{3}H presente en cada pico se calculó mediante la multiplicación de la radioactividad total del pico por el porcentaje relativo de material marcado radioactivamente que era resistente a la digestión con Streptomyces hyaluronidasa y susceptible a la digestión con condroitinasa ABC.

Procedimientos analíticos

La hidroxiprolina se determinó mediante el procedimiento de Woessner y el ácido hexuronato mediante el procedimiento de Bitter y Muir. El AC se cuantificó mediante una técnica específica de ensayo de radioabsorción.

Expresión de los resultados y estadísticas

La tasa de biosíntesis de PG y AC se determinó mediante la suma de y PG-[^{3}H] y AH-[^{3}H] desintegraciones por minuto (d.p.m.) que se encuentran en los tejidos y medio digeridos con papaína y en los medios al final del periodo de 12 horas de marcaje en pulsos y se expresó como d.p.m. de PG-[^{3}H] y AH-[^{3}H] por hora y por mg de hidroxiprolina. De hecho, la pérdida de hidroxiprolina (y por tanto de colágeno) de las muestras de tejido hacia el medio en un periodo de 72 horas de cultivo fue menor del 5% de la cantidad presente en los trozos de cartílago antes del cultivo. Al final del periodo de seguimiento no radioactivo de 24 horas, la incorporación total de glucosamina-[^{3}H] en el AG y las PG se determinó mediante la suma de d.p.m. de AH-[^{3}H] y PG-[^{3}H] que se encuentran en los medios y en las correspondientes muestras de tejido digerido con papaína. La significación estadística de las diferencias observadas entre grupos se evaluó mediante la prueba U de Mann-Whitney, mientras que en cada grupo, la significación de las diferencias en el metabolismo de PG y AH en presencia de concentraciones diferentes de carnitina \pm AH se evaluaron mediante la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon.

Resultados y discusión

Los contenidos en PG y AH de las muestras de cartílago se distribuyeron en un amplio abanico de valores (media \pm de = 0,77 \pm 0,09 y 0,05 \pm 0,03 para los contenidos de PG y AH, respectivamente). En los diferentes experimentos de seguimiento y de pulsos llevados a cabo en ausencia y en presencia de los compuestos a probar, el análisis de las muestras de tejidos y medios dio los siguientes resultados: el 50-70% del material marcado presente en el pico A era sensible a Streptomyces hyaluronidasa y, por tanto, se identificó como AH-[3H]. Por otro lado, todo el material marcado presente en el pico B se identificó como condroitín sulfato (y por tanto, como proteoglicanos), dado que era consistentemente resistente a la digestión con Streptomyces hyaluronidasa y susceptible a la digestión completa con condroitinasa. En ausencia de AH y/o de acetil-L-carnitina (ALC), las tasas de síntesis de PG y AH se distribuyeron en un intervalo específico de valores (38,11 \pm 8,1 para la síntesis de PG y de 3,9 \pm 0,8 para la síntesis de AH). Cuando se cultivaron los explantes de cartílago marcado en ausencia de fármacos, la pérdida neta de moléculas de AH-[^{3}H] y de PG-[^{3}H] fue de 33,5 \pm 7,3 y 25,3 \pm 5,9 respectivamente.

En presencia de AH o de acetil-L-carnitina solos, se observó un ligero incremento de la síntesis de PG y de AH pero sólo la presencia de ambas moléculas al mismo tiempo fue capaz de aumentar de forma significativa de la síntesis de PG y AH (tabla 4). En cartílago normal, 100 \mug de AH y ALC respectivamente produjeron un incremento significativo de la pérdida neta de PG y AH marcado (p< 0,001). Es más, AH más ALC sí indujeron un cambio significativo en la pérdida neta de PG y AH marcados (p < 0,01) desde el cartílago durante el periodo de seguimiento de 24 horas (tabla 5), mientras que el AH o el ALC solos sólo redujeron la pérdida neta de AH marcado.

Estos resultados proporcionan, por primera vez, pruebas de que en el cartílago articular, la asociación química de AH y ALC es capaz de incrementar de forma concomitante la síntesis de AH y de PG y reducir la pérdida de moléculas de AH recién sintetizadas des tejido. De hecho, el equilibrio metábolico negativo de AH conduce a cambios del tipo de osteoartritis (OA) en el tejido articular normal, ya que la matriz de cartílago OA se caracteriza por una depleción progresiva de su contenido en AH. En consecuencia, el incremento de la síntesis de PG sin que se produzca ninguna reducción en la pérdida neta de PG es un efecto beneficioso, ya que la disminución de la concentración de PG es proporcional a la gravedad del proceso de OS.

TABLA 4

2

TABLA 5

3

La adición de los dos componentes por separado (en este caso, cualquier interacción química es extremadamente probable o aleatoria en los ambientes acuosos en los que las moléculas se añaden) no reveló ningún efecto agonista de las dos sustancias. Por otro lado, la cinética de disociación de las interacciones químicas entre AH y los derivados de carnitina obtenidas en condiciones adecuadas in vitro es, también en presencia de agua, extremadamente lenta y parece estar relacionada con la presencia de residuos acilo. Esto implica que cualquier lubricación límite de la articulación es, en realidad, un subtipo conocido en ingeniería como "lubricación sólida lamelada". Por último, probablemente los efectos biológicos adicionales presentes en nuestro compuesto en comparación con la simple combinación de los dos productos están relacionados con la presencia en el microambiente celular de esta nueva especie química.

A continuación se exponen ejemplos de composiciones farmacéuticas según la invención:

- viales de 1-2 ml para inyección intraarticular, que contienen:

A)

2-5 mg de AH + 2-5 mg de L-carnitina (o acetil-, propionil-, palmitoíl-L carnitina); o

B)

4-10 mg del complejo 1:1 (p/p) de AH/L-carnitina (0 de AH/acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina); administrándose dicha inyección una o más veces a la semana;

- cápsulas para administración oral, que contienen:

C)

0,5-2 g de AH + 0,5-2 g de L-carnitina (o de acetil-, propionil-palmitoíl-L-carnitina); o

D)

1-4 g del complejo 1:1 (p/p de AH/acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina); administrándose dichas cápsulas 1-3 veces al día en el caso de la enfermedad de Crohn, rectocolitis ulcerosa, enfermedad celíaca;

-gel para la administración tópica, que contiene:

E)

1-5% de AH + 1-5% de L-carnitina (o acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina); o

F)

2-10% de complejo 1:1 (p/p) de AH/L-carnitina (o AH/acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina, para su aplicación 1-3 veces al día en el área de inflamación.

Ejemplos de composiciones cosméticas según la invención son geles similares a E) y F), o lociones, cremas, mascarillas de belleza y similares, que contienen cantidades similares de los dos componentes ácido hialurónico/L-carnitina ( o acetil-, propionil-, palmitoíl-L-carnitina) o, preferentemente, de los correspondientes complejos según la invención.

Claims (22)

1. Complejos de ácido hialurónico con carnitina o acilcarnitinas.

2. Complejos de ácido hialurónico con L-carnitina o acil-L-carnitinas.

3. Complejos de ácido hialurónico con acil-L-carnitina seleccionada del grupo constituido por acetil-L-carnitina, propionil-L-carnitina y palmitoíl-L-carnitina.

4. Complejos según las reivindicaciones 1-3, en los que el ácido hialurónico tiene un peso molecular promedio en peso (M_{w}) que varía de aproximadamente 2 x 10^{5} a 3 x 10^{6}.

5. Complejos según las reivindicaciones 1-4, en los que los dos componentes se encuentran presentes en proporciones variables de 1:3 a 3:1.

6. Complejos según la reivindicación 5, en los que los dos componentes se encuentran en cantidades ponderales equivalentes.

7. Complejos según las reivindicaciones 1-5, caracterizados porque el ácido hialurónico tiene un peso molecular promedio en peso (M_{w}) variable de aproximadamente 2 x 10^{5} a aproximadamente 3 x 10^{6}.

8. Un procedimiento para la preparación de complejos según las reivindicaciones precedentes, que se caracteriza porque los dos componentes se mezclan en un disolvente y la mezcla se somete a ultrasonidos y, posteriormente, a centrifugación, con la recuperación del sobrenadante.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, que se caracteriza porque el disolvente está compuesto por suero salino tamponado con fosfato (PBS) a un pH sustancialmente neutro.

10. Un procedimiento según la reivindicación 8, que se caracteriza porque el disolvente está compuesto por etanol/PBS.

11. Un procedimiento según la reivindicaciones 8-10, que se caracteriza porque los ultrasonidos se llevan a cabo durante un tiempo variable de 5 a 120 minutos a 50-150 W.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, que se caracteriza porque los ultrasonidos se llevan a cabo durante un tiempo de 10 a 30 minutos.

13. Un procedimiento según la reivindicaciones 8-12, que se caracteriza porque los ultrasonidos se llevan a cabo a temperaturas variables de 15 a 50ºC.

14. Un procedimiento según la reivindicaciones 8-13, que se caracteriza porque la centrifugación se lleva a cabo a aproximadamente 3.000 g, durante un tiempo de 5 a 30 minutos.

15. Composiciones farmacéuticas que contienen uno o más complejos según las reivindicaciones 1-7.

16. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 15, con actividad protectora sobre los tejidos y la membrana plasmática celular y actividades antiinflamatorias y antioxidantes.

17. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 15, para usar en el tratamiento de la sinovitis y la gonartrosis, la enfermedad de Crohn, la rectocolitis y la enfermedad celíaca.

18. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 15, para usar en el tratamiento de patologías del epitelio corneano.

19. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 15, para el tratamiento de las úlceras de las extremidades inferiores.

20. Composiciones que contienen los complejos según las reivindicaciones 1-7, para la administración oral en forma de complementos alimentarios.

21. Composiciones según la reivindicación 20, que además contienen vitaminas, coenzimas, sustancias minerales y antioxidantes.

22. Composiciones cosméticas que contienen los complejos según las reivindicaciones 1-7.