ES2226686T3 - Pelicula de envasado alimentario y metodo para el tratamiento de la superficie de los alimentos. - Google Patents

Pelicula de envasado alimentario y metodo para el tratamiento de la superficie de los alimentos.

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Abstract

Una película de envasado del alimento que incluye una película polimérica que contiene nisina; dicha película se adapta para transferir dicha nisina a la superficie de un producto alimentario en contacto con ésta en una cantidad eficaz para impedir o inhibir el crecimiento microbiano en dicha superficie del alimento después de la eliminación de dicha película y, comprendiendo dicha película dicha nisina en una cantidad eficaz para impedir o inhibir el crecimiento de Listeria tras contacto, en la que dicha película está entremezclada, recubierta y/o impregnada con dicha nisina, de modo que la nisina se puede liberar de dicha película y se transfiere a una superficie del producto alimentario en una cantidad controlada hasta el punto necesario para proporcionar un efecto antimicrobiano sobre dicha superficie del producto alimentario, incluso después de eliminar dicha película del contacto con dicha superficie del producto alimentario.

Description

Película de envasado alimentario y método para el tratamiento de la superficie de los alimentos.
El invento se refiere a películas de envasado y elaboración para productos alimentarios que contienen composiciones antimicrobianas y bactericidas y a un método para inhibir o impedir el crecimiento de microbios tales como bacterias, mohos y levaduras en las superficies de los alimentos.
La "conservación de los alimentos", según se emplea este término en esta memoria, incluye métodos que protegen frente a la intoxicación alimentaria, así como métodos que retrasan o impiden el deterioro de los alimentos debido a microbios. La conservación de los alimentos conserva los alimentos seguros para consumo e inhibe o impide el deterioro de los nutrientes o cambios organolépticos que provoquen que los alimentos se vuelvan menos apetitosos.
El "deterioro de los alimentos", según se emplea este término en esta memoria, incluye cualquier alteración en la condición del alimento que lo convierte en menos apetitoso, lo que incluye cambios en el sabor, olor, textura o apariencia. El alimento deteriorado puede ser tóxico o no serlo.
La "intoxicación alimentaria", según se emplea este término en esta memoria, se refiere a la enfermedad provocada en mamíferos por ingesta de alimentos contaminados por virus, mohos o bacterias patógenas y/o sus toxinas. El alimento contaminado por patógenos no muestra necesariamente ningún signo organoléptico de deterioro. La intoxicación alimentaria bacteriana puede estar provocada bien por infección del hospedante con el organismo bacteriano o bien por acción de una toxina producida por la bacteria en el alimento o en el hospedante.
La prevención del deterioro del alimento y de la intoxicación alimentaria se ha procurado a lo largo de la historia, a menudo mediante ensayo y error. Los primeros intentos han dado como resultado la adopción de métodos de conservación alimentaria tales como la desecación, la salazón y/o el ahumado de los alimentos con objeto de conservarlos. Es relativamente reciente en la historia registrada que la conservación alimentaria se está asentando sobre una fundación científica. En el siglo diecinueve, el trabajo de científicos tales como Louis Pasteur y Robert Koch elucidó los principios bacterianos de la intoxicación y deterioro alimentarios y proporcionó nuevos métodos de identificación de bacterias patógenas y de conservación de los alimentos.
Los tecnólogos de alimentos actuales emplean un conjunto de procedimientos y agentes físicos, químicos y biológicos para conservar el alimento e impedir la transmisión de enfermedades vía los productos alimentarios. Además de procedimientos tales como la irradiación, la fermentación, la pasteurización, el control de temperatura, el pH y/o la actividad del agua, existe una plétora de agentes químicos. Estos agentes incluyen antioxidantes para impedir la degradación química del alimento, así como composiciones que matan o inhiben bacterias deletéreas y/o otros microbios, de modo que conservan los alimentos, es decir, impiden tanto el deterioro como la transmisión de enfermedades. Los agentes químicos antimicrobianos empleados comúnmente incluyen nitritos, nitratos, dióxido de azufre, sulfitos y ácidos, tales como el ácido acético, propiónico, láctico, benzoico y sórbico y sus sales, humo de leña y humo líquido y antibióticos tales como natamicina y nisina.
La prevención de la intoxicación alimentaria es de capital importancia en la industria de fabricación alimentaria. La preocupación por la inocuidad de los alimentos ha llevado a la mayoría de los países a regular fuertemente la industria alimentaria para asegurar la salud pública. También, los fabricantes de alimentos elaborados invierten considerables recursos para asegurar la inocuidad de sus productos. A pesar de estos esfuerzos, la intoxicación alimentaria sigue ocurriendo. Muchos casos de intoxicación alimentaria se han atribuido a bacterias tales como Salmonella, Clostridium y Staphylococcus, entre otras.
Una preocupación creciente es el descubrimiento, relativamente reciente, en la industria de fabricación alimentaria de la contaminación extendida de Listeria en aves de corral y en alimentos elaborados como salchichas de Viena, otras salchichas, quesos, productos lácteos que incluyen helados novedosos y marisco. De especial preocupación es la evidencia reciente de que los alimentos elaborados, pasteurizados y totalmente cocidos, se están contaminando con microbios como Listeria monocytogenes después de la cocción o pasteurización y previamente al envasado para el punto de venta. Tal contaminación es típicamente contaminación de superficie que se cree originada por contacto de los microbios con las superficies de los alimentos subsiguiente al termotratamiento (es decir, cocción o pasteurización). Microbios tales como Listeria pueden ser transportados por el aire (es decir, llevados por el polvo) o estar presentes en superficies de contacto de los alimentos, tal como el equipo de elaboración.
En los años 80 se han notificado numerosos brotes de intoxicación alimentaria en todo el mundo, en los que el agente causante se sospechó o se identificó como alimentos contaminados por Listeria. Se han descrito brotes de listeriosis (infección por la bacteria Listeria) en humanos en Massachussetts, California y Pensilvania en los EE.UU. y también en Canadá y Suiza. Estos brotes se han atribuido a la ingesta de alimentos contaminados por Listeria, tales como ensalada de col fresca, queso fabricado a partir de leche cruda, quesos blandos maduros en su superficie y el salami. Cientos de personas se han visto afectadas con una tasa de mortalidad de hasta aproximadamente un tercio de los afectados. Particularmente susceptibles a la enfermedad (que es contagiosa) son las mujeres embarazadas, los fetos, los recién nacidos y los lactantes, así como adultos con sistemas inmunes comprometidos, por ejemplo, adultos en tratamiento con fármacos inmunosupresores como corticosteroides. La listeriosis es una enfermedad grave que puede provocar meningitis, abortos espontáneos y septicemia perinatal. Aunque es tratable con un diagnóstico temprano, la listeriosis sin tratar muestra una elevada tasa de mortalidad.
La conservación de los alimentos por inhibición del crecimiento de Listeria monocytogenes es difícil. Según se informa, Listeria puede reproducirse y crecer tanto aeróbica como anaeróbicamente, a pHs superiores a 4,85 y en un amplio intervalo de temperaturas que pueden ser tan bajas como 3ºC y tan altas como aproximadamente 45ºC. Ésto significa que Listeria puede crecer a temperaturas normales de refrigeración. También se ha descrito que Listeria puede crecer en una disolución acuosa de hasta un 10% de sal. Afortunadamente, la cocción o la pasteurización matan a Listeria. Desafortunadamente, la contaminación por microorganismos puede ocurrir después de la pasteurización por el fabricante. Mucha gente come alimentos elaborados después de que haya transcurrido un período significativo de tiempo desde una primera cocción o pasteurización por el fabricante del alimento, de tal modo que se permite crecer a la bacteria introducida por contaminación posterior a la pasteurización. Dado que este consumo de alimento puede llevarse a cabo sin recalentar el alimento elaborado hasta temperaturas suficientes durante el tiempo suficiente para matar cualquier microbio (como Listeria) que se haya podido introducir con posterioridad a la cocción inicial, hay riesgo de intoxicación alimentaria. El invento presente trata de mejorar el riesgo referido.
El documento US-A-4 597 972 describe un procedimiento para controlar el crecimiento de esporas de Clostridium botulinum y, de ahí, la elaboración de la toxina botulínica en un producto alimentario, exceptuando un procedimiento de pasteurización con elevado contenido de humedad de un producto de queso; dicho procedimiento incluye la adición a dicho producto de una cantidad de nisina, o de un cultivo productor de nisina, suficiente para inhibir el crecimiento de la espora botulínica.
Los documentos US-A-2 979 410, US-A-3 124 468 y GB-A-822 758 describen películas de envasado de alimentos que se recubren con fungicidas, tales como antibióticos derivados de mohos, como los antibióticos de tetraciclina.
El documento WO 89/12399 A1, que afecta sólo a la novedad y es técnica anterior de acuerdo con el Artículo 54(3) EPC, describe composiciones de nisina para uso como intensificadores de bactericidas de espectro amplio.
Un objetivo del invento es proporcionar una película que contiene una composición antibacteriana eficaz para matar y/o inhibir el crecimiento de Listeria.
Es un objetivo del invento proporcionar una película polimérica capaz de transferir una cantidad controlada de un agente antimicrobiano a una superficie del producto alimentario.
Otro objetivo del invento es matar, inhibir o impedir el crecimiento de microorganismos patógenos sobre la superficie de un producto alimentario por un método de transferir un agente antimicrobiano a la superficie de un producto alimentario en una cantidad controlada.
Otro objetivo del invento es transferir un agente antimicrobiano a un producto alimentario en una cantidad eficaz para impedir el crecimiento de bacterias patógenas sobre la superficie del producto alimentario después de eliminar la película para la duración en almacenamiento normal del producto alimentario.
Otro objetivo del invento es impedir o inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes en salchichas de Viena sin pellejo después de la cocción inicial y de la eliminación del envoltorio, a través del envasado para venta al consumidor hasta la apertura de las salchichas envasadas para consumo por el consumidor.
Otro objetivo del invento es aumentar la duración en almacenamiento de los alimentos elaborados por aplicación de una mezcla sinérgica, preferiblemente un líquido o una suspensión, de la bacteriocina nisina derivada de Streptococcus lactis (o su equivalente sintético) y, opcionalmente, un agente quelante.
De este modo, el presente invento proporciona una película de envasado del alimento, según se define en la reivindicación 1, así como un método de tratar la superficie de un producto alimentario, según se define en la reivindicación 15. Realizaciones adicionales se abarcan en las reivindicaciones dependientes respectivas.
Los objetivos antedichos y otros, que se harán aparentes a continuación, pueden llevarse a cabo al tratar un comestible, es decir, la superficie de un producto alimentario con un agente antimicrobiano, preferiblemente un agente quelante como ácido cítrico en combinación con la bacteriocina nisina derivada de Streptococcus. El tratamiento se lleva a cabo al poner en contacto el producto alimentario con una película que contiene un agente antimicrobiano (específicamente nisina). La película puede mantener el agente en contacto con la superficie del producto alimentario, de tal modo que transfiere una cantidad controlada del agente desde la película a la superficie del producto alimentario o puede transferir el agente antimicrobiano (con o sin empleo de un agente de difusión como la zeína) al producto alimentario, según lo cual la película puede retirarse con el restante agente antimicrobiano transferido sobre la superficie del producto alimentario en una cantidad eficaz para matar, impedir o inhibir el crecimiento sobre la misma tanto de organismos que deterioran el alimento como de microorganismos patógenos tales como Listeria.
En un aspecto del invento se proporciona una película de envasado del alimento que incluye una película polimérica que contiene la bacteriocina termorresistente nisina, derivada de Streptococcus (o su agente antibacteriano sintético equivalente). Este agente es eficaz preferiblemente frente al crecimiento de bacterias gram positivas, especialmente Listeria monocytogenes, y es termorresistente.
No es necesario que todos y cada uno de los objetivos anteriores estén presentes en todas las realizaciones del invento; es suficiente con que el invento pueda emplearse de forma ventajosa.
Lo fundamental de la composición del invento es la combinación sinérgica de un agente secuestrante o quelante, tal como una sal de EDTA o ácido cítrico, con la bacteriocina nisina derivada de Streptococcus (o su equivalente sintético). Una mezcla líquida o suspensión de nisina y de agente quelante se prefieren especialmente.
Un aspecto fundamental de un método del presente invento es la protección de la superficie del producto alimentario durante un período de tiempo sustancial después de la eliminación de la película.
Un aspecto fundamental de una realización de la película del invento es el empleo del agente antimicrobiano termorresistente nisina que es eficaz frente a bacterias después de pasteurización o termotratamiento.
Se ha descubierto que una composición antimicrobiana que incluye una combinación sinérgica de la bacteriocina nisina derivada de Streptococcus (o su equivalente sintético) y un agente quelante tal como el ácido cítrico presenta unas propiedades bactericidas inesperadamente buenas, especialmente contra bacterias patógenas, tales como Listeria monocytogenes. Además, tal composición es capaz, sorprendentemente, de prolongar la duración en almacenamiento de los alimentos al impedir el deterioro de los alimentos durante un período de tiempo mayor que el que se esperaría teniendo en cuenta la eficacia de cada componente separadamente.
Nisina es la bacteriocina empleada. Nisina es una bacteriocina polipeptídica producida por la bacteria del ácido láctico, Streptococcus lactis del grupo N.
Según se informa, nisina es un nombre colectivo que representa a varias sustancias relacionadas estrechamente, que se han designado nisinas A, B, C, D y E, que tienen una composición de aminoácidos similar. La estructura y propiedades de la nisina son más ampliamente comentadas en el artículo de E. Lipinska, titulado "Nisin and its Applications" en The 25th Proceedings of the Easter School in Agriculture Science at the University of Nottingham, 1976, páginas 103-130 (1977); artículo que se incorpora en esta memoria por referencia. El comité de estandarización biológica de la organización mundial de la salud (The World Health Organization Committee on Biological Standardization) ha establecido una preparación de nisina de referencia internacional y la unidad internacional (UI, de aquí en adelante) se define como 0,001 mg de esta preparación. NISAPLIN es el nombre de la marca comercial del concentrado de nisina que contiene 1 millón de UI por gramo, la cual está disponible comercialmente en Aplin & Barrett Ltd., Trowbridge, Wiltshire, Inglaterra.
La nisina es un conservante alimentario conocido del que también se sabe que es termoestable, estable a los ácidos y activo frente a bacterias gram positivas. La nisina se emplea como un conservante alimentario en productos lácteos y vegetales, normalmente junto con tratamiento térmico. La nisina también se encuentra de forma natural en la leche cruda y se ha empleado en la termoelaboración de pastas cárnicas. La nisina se considera no tóxica, con datos toxicológicos que indican que no presenta efectos adversos a niveles de 3,3 millones de UI por kg de peso corporal. Según se dice, la nisina puede soportar el calentamiento a 121ºC sin pérdida de actividad. Aunque se espera alguna pérdida de actividad cuando se emplea con alimentos elaborados, ésta puede mejorarse, por ejemplo, aumentando la cantidad de nisina aplicada. Los niveles eficaces de nisina para conservar los productos alimentarios varían, según se informa, desde 25-500 UI/g o más.
Agentes quelantes (secuestrantes) apropiados incluyen ácidos carboxílicos, ácidos policarboxílicos, aminoácidos y fosfatos. En particular, los siguientes compuestos y sus sales están entre los que se consideran útiles:
Ácido acético
Adenina
Ácido adípico
ADP
Alanina
\beta-Alanina
Albúmina
Arginina
Ácido ascórbico
Asparragina
Ácido aspártico
ATP
Ácido benzoico
Ácido n-butírico
Caseína
Ácido citracónico
Ácido cítrico
Cisteína
Ácido deshidrácetico
Desferri-ferricrisina
Desferri-ferricromo
Desferri-ferrioxamina E
Ácido 3,4-dihidroxibenzoico
Ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA)
Dimetilglioxima
O,O-dimetilpurpurogallina
EDTA
Ácido fórmico
Ácido fumárico
Globulina
Ácido glucónico
Ácido glutámico
Ácido glutárico
Glicina
Ácido glicólico
Glicilglicina
Glicilsarcosina
Guanosina
Histamina
Histidina
3-hidroxiflavona
Inosina
Inosina trifostato
Ferricromo sin hierro
Ácido isovalérico
Ácido itacónico
Ácido kójico
Ácido láctico
Leucina
Lisina
Ácido maléico
Ácido málico
Metionina
Metilsalicilato
Ácido nitrilotriacético (NTA)
Ornitina
Ortofosfato
Ácido oxálico
Oxistearina
\beta-fenilalanina
Ácido fosfórico
Fitato
Ácido pimélico
Ácido piválico
Polifosfato
Prolina
Ácido propiónico
Purina
Pirofosfato
Ácido pirúvico
Riboflavina
Salicilaldehído
Ácido salicílico
Sarcosina
Serina
Sorbitol
Ácido succínico
Ácido tartárico
Tetrametafosfato
Tiosulfato
Treoniona
Trimetafosfato
Trifosfato
Triptófano
Uridina difosfato
Uridina trifosfato
Ácido n-valérico
Valina
Xantosina
Muchos de los anteriores agentes secuestrantes son útiles para la elaboración de los alimentos en sus formas salinas, que son normalmente sales de álcalis metálicos o alcalinotérreos tales como sodio, potasio o calcio o sales cuaternarias de amonio. Los compuestos secuestrantes con múltiples valencias pueden emplearse de forma beneficiosa para ajustar el pH o introducir o sustraer de manera selectiva iones metálicos, por ejemplo, en un sistema de revestimiento del alimento. Información adicional acerca de agentes secuestrantes y quelantes se describe en T. E. Furia (Ed.), CRC Handbook of Food Additives, 2ª edición, páginas 271 -294 (1972, Chemical Rubber Co.) y M.S. Peterson y A.M. Johnson (Eds.), Encyclopedia of Food Science, páginas 694-699 (1978, AVI Publishing Company, Inc.); ambos artículos se incorporan en esta memoria por referencia.
Los términos "agente quelante" y "agente secuestrante" se emplean en esta memoria como sinónimos y se definen como compuestos orgánicos o inorgánicos capaces de formar complejos de coordinación con metales.
También, según se emplea el término "agente quelante" en esta memoria, incluye compuestos encapsuladores de moléculas tales como la ciclodextrina. El agente quelante puede ser inorgánico u orgánico, pero preferiblemente es orgánico.
Los agentes quelantes preferidos no son tóxicos para los mamíferos e incluyen ácidos aminopolicarboxílicos y sus sales, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o sus sales (particularmente sus sales di y trisódicas) y ácidos hidrocarboxílicos y sus sales, como el ácido cítrico. Sin embargo, agentes quelantes de tipo ácido hidrocarboxílico distintos del ácido cítrico y del citrato también se cree que son útiles en el presente invento, tales como ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico, ácido tartárico y sus sales.
Según se indicó anteriormente, el término "agente quelante" se define y se usa en esta memoria como un sinónimo de agente secuestrante y se define también como agente que incluye compuestos encapsuladores de moléculas, como la ciclodextrina. Las ciclodextrinas son moléculas de carbohidratos cíclicos que tienen seis, siete u ocho monómeros de glucosa dispuestos en un anillo en forma de "donut", que se marcan alfa, beta o gama ciclodextrina, respectivamente. Según se emplea en esta memoria, la ciclodextrina se refiere tanto a monómeros como a polímeros de ciclodextrina no modificados y modificados. Los encapsuladores moleculares de ciclodextrina están disponibles comercialmente de American Maize-Products de Hammond, Indiana. Las ciclodextrinas se describen más ampliamente en el Capítulo 11 titulado "Industrial Applications of Cyclodextrin" de J. Szejtli, páginas 331-390 de Inclusion Compounds, Vol. III (Academic Press, 1984), cuyo capítulo se incorpora en la presente memoria por
referencia.
Las mezclas de bacteriocina nisina derivada de Streptococcus con uno o más agentes quelantes pueden emplearse de forma útil de acuerdo con el presente invento. Tales mezclas pueden ser sólidos en suspensiones líquidas o soluciones. A menos que se indique de otro modo, el empleo del término "disolución" en esta memoria incluye no sólo sólidos o líquidos disueltos en un líquido, sino también suspensiones de sólido en líquido o mezclas. Solventes adecuados, diluyentes o soportes para la mezcla del agente quelante y de la bacteriocina son agua, alcoholes, propilenglicol, aceites como aceite mineral, animal o vegetal, glicerina o lecitina.
Aunque las bacteriocinas disponibles comercialmente pueden contener productos lácteos puede ser ventajoso para la composición bactericida o para la preparación de la conservación alimentaria del presente invento que no contengan productos lácteos añadidos tales como queso, suero, cuajadas o sólidos lácteos con calcio. Se ha descrito que los iones de calcio y magnesio pueden inactivar la nisina. Parece ser, sin dejarse llevar por las creencias, que los agentes que secuestran calcio y/o magnesio pueden ser particularmente convenientes. Las mezclas del presente invento que contienen una mezcla de bacteriocina y agente quelante se aplican a los productos alimentarios, incluyendo productos lácteos y productos no lácteos, como salchichas, otras carnes, vegetales y frutas, mediante empleo de una película impregnada o recubierta según se describe abajo. Tales soluciones pueden formularse a pHs muy variados, pero las más convenientes serán neutras o ácidas. Las soluciones ácidas se cree que intensifican o mantienen la eficacia antibacteriana de estas soluciones y, en consecuencia, se prefieren. Las soluciones que tienen un pH menor o igual que aproximadamente 6 se prefieren y las menores o iguales a 5 se prefieren especialmente. Las cantidades de los componentes bacteriocina y agente quelante pueden variar dependiendo de factores como: tipo de bacteriocina, tipo de agente quelante, pH, otros constituyentes presentes (p. ej., tipo de solvente de la solución), aplicación, es decir, tipo de producto alimentario sobre el que se aplicarán los materiales, modo de empleo, condiciones de elaboración subsiguientes (p. ej., termotratamiento), un período de tiempo deseado de eficacia para matar o inhibir bacterias y tipos de bacterias frente a las que se protege el producto alimentario, etc. La persona medianamente especializada en la técnica puede determinar las cantidades apropiadas de bacteriocina y de agente quelante sin experimentación excesiva. El agua es el disolvente preferido para preparar una solución. Las cantidades adecuadas de bacteriocina en una mezcla para tratar productos alimentarios como salchicha incluyen desde 5 hasta 250 ppm de bacteriocina (por peso de la mezcla total) o más. Cantidades menores que 5 ppm son factibles, pero dependiendo del uso pueden resultar menos eficaces que concentraciones mayores. Cantidades mayores que 250 ppm también son factibles, pero concentraciones crecientes tienen la desventaja de incrementar los costos debido al dispendio de bacteriocina. Se ha encontrado que las concentraciones entre 50 y 150 ppm son eficaces y no son caras, donde concentraciones de 150 ppm o más son muy eficaces para matar o inhibir bacterias patógenas como Listeria monocytogenes, p. ej., en las superficies de salchichas alemanas cocidas. La solución puede emplearse contra otras bacterias y es especialmente eficaz contra bacterias gram positivas. Las cantidades de agente quelante empleadas pueden variar ampliamente, p. ej., cantidades entre un 0,2 y un 0,8 ó 3,0 por ciento en peso o más pueden emplearse de manera provechosa. La composición también puede contener otros agentes antimicrobianos o antibacterianos u otros aditivos, tales como colorantes y aromatizantes, p. ej., humo gaseoso o líquido.
Las películas de envasado de alimentos apropiadas para el empleo en el presente invento incluyen películas poliméricas tales como película soplada, película orientada, película de estirada y contraída, bolsas termocontraibles y envoltorios de alimentos. "Películas de envasado de alimentos", según se emplea este término en esta memoria, son materiales en forma de lámina flexible que son convenientemente de 0,38 mm (15 mil) o menos y preferiblemente de menos de 0,25 mm (10 mil) de grosor.
Las películas adecuadas incluyen celulosa regenerada y películas termoplásticas estiradas y contraídas y pueden ser películas en monocapa o multicapa. Las películas contraídas se forman preferiblemente dentro de bolsas termocontraibles orientadas biaxialmente.
Las películas adecuadas incluyen envoltorios de alimentos que son generalmente películas flexibles, que son preferiblemente tubulares y pueden estar formadas por materiales poliméricos que incluyen materiales celulósicos como celulosa regenerada o carbamato de celulosa o por plásticos como homopolímeros o copolímeros de poliolefinas, p. ej., copolímeros de polipropileno, polietileno o poliamidas, poli(tereftalato de etileno), poli(cloruro de vinilideno) o copolímeros de etileno-acetato de vinilo o por películas proteínicas como colágeno. Preferiblemente, los envoltorios son envoltorios celulósicos tubulares que se preparan por uno cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Tales envoltorios son tubos generalmente flexibles, de pared fina sin costuras que están formados preferentemente por celulosa regenerada, y similares, con distintos diámetros. También son apropiados los envoltorios celulósicos tubulares que tienen una red reforzadora fibrosa embebida en su pared. Los envoltorios que tienen una red reforzada son normalmente denominados "envoltorios fibrosos del alimento", mientras que los envoltorios celulósicos sin el refuerzo fibroso se refieren en esta memoria como envoltorios celulósicos "no fibrosos". Ambos envoltorios naturales y sintéticos están contemplados por el presente invento.
Los envoltorios convencionalmente conocidos como "envoltorios de materia prima seca" pueden emplearse en la práctica de este invento. Tales envoltorios tienen generalmente un contenido de agua en el intervalo de entre aproximadamente un 5 y aproximadamente un 14 por ciento de agua en peso en envoltorio no fibroso y dentro del intervalo de entre aproximadamente un 3 y aproximadamente un 8 por ciento de agua en peso en envoltorio fibroso, según el peso total del envoltorio, agua incluida.
Los envoltorios convencionalmente conocidos como "envoltorios de materia prima gel" son envoltorios que tienen más elevados contenidos de humedad, ya que no se han secado previamente y tales envoltorios pueden emplearse en la práctica de este invento.
Los envoltorios convencionalmente conocidos como "envoltorios rehumedecidos" son envoltorios de materia prima seca a los que se añade humedad, por ejemplo, para facilitar el fruncido y/o relleno y tal envoltorio puede emplearse en la práctica de este invento. Tales envoltorios tienen generalmente un contenido en agua dentro del intervalo de aproximadamente un 15 a aproximadamente un 23 por ciento en peso en envoltorio no fibroso o dentro de aproximadamente un 16 a aproximadamente un 35 por ciento en peso en envoltorio fibroso, según el peso total del envoltorio, agua incluida.
El agente antimicrobiano empleado en el invento es nisina que puede ser eficazmente transferida desde una película de envasado de alimento hasta un producto alimentario para proporcionar una superficie de producto alimentario que contiene dicha nisina, lo que impide o inhibe el crecimiento de microorganismos encima incluso después de eliminar el contacto de la película con la superficie del producto alimentario.
El agente antimicrobiano (es decir, nisina) puede incluir aditivos tales como agentes aglutinantes, tampones, emulsionantes, adyuvantes de transferencia o agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraácetico (EDTA) o sus sales. Estos agentes pueden aumentar el efecto antimicrobiano de la nisina o ayudar en la transferencia desde la película de envasado hasta el producto alimentario.
En particular, los agentes aglutinantes, p. ej. agentes insolubles en agua como goma laca y zeína, pueden emplearse como medios o agentes de transferencia para proporcionar transferencia de la nisina incorporada en seguida desde una película de envasado hasta una superficie del producto alimentario bajo condiciones humidificantes. Los agentes aglutinantes o de transferencia preferidos tendrán sustantividad preferencial por la superficie del producto alimentario relativo a la película de envasado.
La película de envasado del alimento del presente invento contendrá sobre o dentro de la película el agente antimicrobiano y antibacteriano nisina. La nisina será eficaz para matar, inhibir o impedir el crecimiento de bacterias como aquellas del género Listeria, Salmonella y Clostridium y, preferiblemente, las especies de Listeria monocytogenes.
Nisina es resistente a la destrucción o inactivación por termotratamiento tal como temperaturas y tiempos de cocción o pasteurización. Ésto es esencial para sobrevivir al termotratamiento del producto alimentario dentro de una película de envasado y para ser eficaz después del termotratamiento y de la eliminación de la película.
"Termorresistente", según se emplea este término en esta memoria, significa que el agente antimicrobiano (es decir, nisina), que es capaz de aplicarse a una película en una cantidad controlada, soporta la destrucción, inactivación o pérdidas debidas al termotratamiento, p. ej., por pasteurización o cocción, de modo que después del termotratamiento aún permanece suficiente nisina que es eficaz para matar, inhibir o impedir el crecimiento de microorganismos sobre los productos alimentarios a los que se aplica. Debe entenderse que pueden ocurrir pérdidas parciales en la cantidad de agente o en la eficacia del agente y que también puede tener lugar inactivación parcial. Sin embargo, es suficiente que el agente activo restante sea capaz de proteger la superficie del producto alimentario frente a organismos patógenos como Listeria.
En una aplicación típica del invento un envoltorio de alimentos celulósico tubular que puede impregnarse o recubrirse con el agente antimicrobiano nisina se emplea en la producción de salchichas de Viena sin pellejo. En este procedimiento bien conocido de pasteurización de salchichas, el envoltorio se rellena con la emulsión cárnica y se forma en eslabones. La emulsión cárnica embutida, a la que se da su forma mediante el envoltorio, se cuece entonces (termotratada) a una temperatura adecuada durante suficiente tiempo para llevar a cabo la pasteurización. Típicamente, los productos cárnicos, incluidas las salchichas, se conservan (incluso durante pasteurización) a temperaturas por debajo de aproximadamente 88ºC (190ºF) antes de la venta para uso particular o institucional. Generalmente, durante la pasteurización los productos alimentarios, tales como carne elaborada, se llevarán hasta una temperatura interna por encima de los aproximadamente 63ºC (145ºF) y no superior a los aproximadamente 82ºC (180ºF) antes de eliminar cualquier película empleada para dar forma al producto durante la elaboración. La temperatura superficial de estos productos alimentarios pasteurizados no supera los 88ºC (190ºF) típicamente, ni es inferior normalmente a los 77ºC (170ºF). Las salchichas embutidas pueden procesarse adicionalmente, p. ej., mediante rociado con agua y/o enfriamiento. El envoltorio se elimina entonces, por medios bien conocidos de pelado, de las salchichas termotradas y las salchichas se envasan de nuevo para venta al por menor.
En una realización del invento, el envoltorio es un envoltorio pelable que está particularmente adaptado para pelado y eliminación por maquinaria a grandes velocidades. El envoltorio se conoce en la técnica como pelable a mano o por medio de máquinas. No todo envoltorio que es pelable a mano está adaptado para el pelado a alta velocidad llevado a cabo por máquinas como la bien conocida Apollo Peeler fabricada por la compañía Ranger Tool Company, Inc. de Bartlett, Tennessee. Éste y peladores comerciales similares son capaces de eliminar el envoltorio de 40.000 a 60.000 salchichas por hora.
Por eso, el agente antimicrobiano (es decir, nisina) que se aplica al envoltorio antes del rellenado debe resistir a los efectos de este termotratamiento y pasos de elaboración y permanecer eficaz para matar, inhibir o impedir el crecimiento de microorganismos indeseables después del termotratamiento. También, el agente (es decir, nisina) debe transferirse al producto alimentario en una cantidad eficaz porque el envoltorio se elimina. La contaminación microbiana de las superficies de las salchichas puede ocurrir en el espacio de tiempo después de la eliminación del envoltorio y antes del envasado.
Alternativamente, el agente antimicrobiano (es decir, nisina), p. ej., en forma de una composición antibacteriana, puede aplicarse a un producto alimentario por medio de un recubrimiento en una película que se aplica después del termotratamiento.
En consecuencia, el agente transferido o aplicado (es decir, nisina) debe estar presente en cantidad suficiente y permanecer suficientemente eficaz después del termotratamiento, elaboración y eliminación del envoltorio para matar, inhibir o impedir el crecimiento de microbios, preferiblemente Listeria monocytogenes, durante un período de tiempo suficiente. Este período de tiempo de eficacia para la nisina aplicada a la película debe extenderse, al menos, desde el momento de la eliminación del envoltorio hasta el envasado para venta, p. ej., a consumidores o instituciones. Convenientemente, la nisina permanecerá eficaz a lo largo de las fechas normales de "vender antes de" o "caduca" durante las cuales el producto alimentario se ofrece a la venta por el minorista. Preferiblemente, el tiempo eficaz debiera extenderse pasada la apertura del paquete por el consumidor hasta el final del período normal de frescura, cuando el deterioro del alimento se hace aparente. Para las salchichas de Viena sin pellejo los tiempos típicos son: aproximadamente entre diez minutos y una hora desde la eliminación del envoltorio hasta el envasado de consumo, alrededor de treinta días a sesenta días desde el envasado de consumo hasta la venta normal al por menor y aproximadamente siete días o más desde la apertura del envasado de consumo, bajo almacenamiento refrigerado normal, al uso. En cualquier caso, los períodos de tiempo deseados y la duración en almacenamiento normal variarán de un producto alimentario a otro producto alimentario y los especialistas en la técnica reconocerán que los tiempos de envasado y los tiempos de duración en almacenamiento variarán dependiendo del tipo de producto alimentario (p. ej., salchichas de buey, aves de corral o queso), del tamaño del producto alimentario, del número de piezas envasadas (tamaño de consumición o tamaño de paquete institucional), de las temperaturas de almacenamiento, de las condiciones de elaboración y del equipamiento de envasado.
La transferencia del agente antimicrobiano nisina desde la superficie interna de una película en contacto directo con una superficie contigua del producto alimentario, de acuerdo con una realización del invento, es tal que la nisina se transfiere de forma permanente, al menos en parte, al producto alimentario durante su elaboración en una cantidad suficiente eficaz para matar o inhibir el crecimiento de la bacteria Listeria sobre la superficie del producto alimentario a pesar del subsiguiente pelado y eliminación del envoltorio.
El ejemplo anterior es ilustrativo y no debe tomarse como limitante del invento para usar con las salchichas de Viena. El invento es aplicable a cualquier producto alimentario, en particular, a aquellos que pueden beneficiarse de la aplicación de una cantidad controlada del agente antimicrobiano nisina en la superficie del producto alimentario. Se contempla que las películas y métodos del invento tienen aplicación tanto en productos alimentarios de origen animal o vegetal, que incluyen, pero no está limitado a, salchichas de todos los tipos (de buey, de cerdo, de pollo, de pavo, de pescado, etc.) cortes de carne originales o secundarios, carnes de almuerzo, jamones, cordero, bistec, hamburguesa y aves de corral, que incluyen pollo, pavo, pato, ganso, así como pescado y productos lácteos como quesos semicurados y curados, quesos elaborados y productos vegetales que incluyen lechuga, tofú, ensalada de col fresca, proteína derivada de la soja sustituta de la carne, etc.
La película y/o método del presente invento emplea el agente termorresistente antimicrobiano, es decir, antibacteriano, nisina. Nisina es una bacteriocina polipeptídica según se describió anteriormente.
La nisina utilizada, de acuerdo con el método y la película del presente invento, puede aplicarse antes o después de la formación de la película para intercalar, recubrir y/o impregnar la película con una cantidad controlada de nisina por unidad de área de película. Los agentes quelantes, agentes aglutinantes, emulsionantes y otros aditivos pueden aplicarse de forma similar al envoltorio simultáneamente (bien en una mezcla o de forma separada) o pueden aplicarse en serie.
En el presente invento el agente antimicrobiano (es decir, nisina) y los aditivos pueden aplicarse sobre la superficie externa de una película, tal como un envoltorio tubular, pasando el envoltorio a través de un baño de una solución que contiene el agente y/o aditivos. Puede permitirse a la nisina infiltrarse en el envoltorio, durante un tiempo suficiente para que el envoltorio incorpore la cantidad deseada de nisina y aditivos, antes de retirar cualquier exceso de líquido al pasar el envoltorio a través de rodillos exprimidores o escurridores, y similares. El procedimiento de pasar el envoltorio a través de un baño de tratamiento (que puede también denominarse "baño de inmersión" o "depósito de inmersión") puede denominarse también paso de "inmersión". Alternativamente, la nisina y los aditivos pueden aplicarse externamente al envoltorio mediante métodos distintos de la inmersión, como pulverización, pincelación, chapado por laminación, impresión y similares.
Alternativamente, la nisina o aditivos pueden aplicarse a la superficie interna de una película tubo, tal como un envoltorio, por cualquiera de los diversos procedimientos bien conocidos descritos en la patente de EE.UU. nº 4.171.381 de Chiu, cuya descripción se incorpora por referencia. Éstos incluyen compresión o recubrimiento por burbujeo, pulverización y recubrimiento por fruncido.
El método de compresión para recubrir el interior de un envoltorio conlleva el relleno de una parte del envoltorio con el material de recubrimiento, de modo que el disco de material de recubrimiento generalmente se encuentra en la parte inferior de una forma en "U" que se origina cuando el envoltorio se pliega sobre dos rodillos paralelos y entones se mueve la longitud continua indefinida del envoltorio de modo que el disco de material de recubrimiento permanezca confinado dentro del envoltorio, mientras que el envoltorio se mueve pasado el disco y se recubre en
su pared interna del material de recubrimiento contenido dentro del disco.
También, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 3.451.827 se describe un método de pulverización por aplicación de una variedad de materiales de recubrimiento sobre la superficie interna de envoltorios de pequeño diámetro. En la patente de EE.UU. nº 3.378.379 de Shiner et al. se emplea un método de "compresión" para aplicar materiales de recubrimiento a la superficie interna de envoltorios de gran diámetro.
El agente antimicrobiano (es decir, nisina) puede aplicarse a cualquier cara de la película siempre y cuando la superficie de la película adaptada para el contacto con el producto alimentario sea capaz de permitir la transferencia de la nisina al producto alimentario. Por ejemplo, un envoltorio de alimento celulósico tubular puede recubrirse en su interior by compresión con una solución que contiene nisina como soluto o dispersión, o por pulverización de una cantidad controlada bien en seco o en forma líquida. Entonces, el interior del envoltorio puede rellenarse con un producto alimentario, tal como jamones, emulsión cárnica o queso, para poner en contacto el producto alimentario con la nisina. Alternativamente, la superficie externa del envoltorio puede recubrirse con la nisina y el envoltorio puede rellenarse por inversión por medios bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 4.162.693), para poner en contacto la superficie del producto alimentario con la nisina.
Debe señalarse que la nisina que recubre la superficie de la película, bien recubriendo externamente o recubriendo internamente, puede o no puede existir como una superficie de recubrimiento únicamente. Por ejemplo, la nisina puede penetrar la estructura celulósica de un envoltorio dado que la celulosa absorbe un solvente líquido de la solución que contiene la nisina. Alternativamente, puede emplearse una película no absorbente de termoplástico o una película celulósica que tiene un recubrimiento de barrera que impide la impregnación o una película multicapas que permite impregnación parcial hasta una capa barrera. En consecuencia, según se emplea en esta memoria, el término "recubrimiento" debe entenderse como que la pared de la película no está necesariamente impregnada, sino que puede tener solamente el agente antimicrobiano (es decir, nisina) sobre su superficie; pero el término puede también aplicarse cuando la pared de la película está entremezclada o impregnada con la nisina. En cualquier caso, en la práctica la nisina debe liberarse de la película y transferirse a una superficie de un producto alimentario hasta el punto necesario para proporcionar un efecto antimicrobiano sobre la superficie del producto alimentario.
Las soluciones que contienen nisina pueden, de acuerdo con el presente invento, contener también otros ingredientes que pueden usarse convenientemente para tratar una película. Por ejemplo, un envoltorio de alimento tubular puede estar recubierto con, p. ej., glicerina y/o propilenglicol que pueden funcionar como agentes humectantes o emolientes y similares, bien en una solución con nisina o separadamente.
Otros ingredientes que se emplean normalmente en la fabricación de, o en el tratamiento adicional de, la película de envasado del alimento también pueden estar presentes en, o sobre, la película si se desea y pueden emplearse de la misma manera y cantidades que si la nisina no se hubiera empleado. Por ejemplo, los éteres de celulosa y los aceites minerales se emplean frecuentemente con envoltorios celulósicos y los agentes antibloqueo y antiestáticos se emplean frecuentemente con las películas termoplásticas.
La película puede tener forma de hoja o tubular. Puede venir en rollos o con longitud exacta. La película tubular puede formarse dentro de bolsas por técnicas convencionales, p. ej., sellado térmico y corte a lo largo de un tubo o pueden fruncirse. La película puede fruncirse por métodos convencionales.
Algunos tipos de películas como los envoltorios de celulosa regenerada previamente al fruncido pueden secarse y/o humidificarse hasta un contenido de agua adecuado para el fruncido y/o procesamiento adicional. La necesidad de secado y/o humidificación convencional depende del contenido acuoso del envoltorio después del tratamiento, del tipo de envoltorio y del uso final. Los envoltorios de materia prima gel, de materia prima seca y rehumedecidos pueden emplearse, todos, de forma apropiada en el presente invento.
El invento se entenderá ahora más claramente por referencia a los siguientes ejemplos que se exponen como meramente ilustrativos del invento y que no pretenden, de ninguna manera, limitar el mismo. A no ser que se indique de otra manera, todas las partes y porcentajes están en peso y todos los porcentajes relativos a las películas o envoltorios se basan en el peso total de la película o envoltorio. Los recuentos bacterianos por placa son una media aritmética de tres placas, a no ser que se indique de otra manera. Los recuentos estimados por placa se llevaron a cabo mediante procedimientos aceptados de forma generalizada en la técnica de la microbiología.
Ejemplos 1-28
Las eficacias de varias soluciones de ensayo y de las concentraciones de los agentes antimicrobianos nisina (del invento) y pediocina (comparativa) se examinaron mediante un método de ensayo líquido frente al crecimiento de bacterias patógenas, tal como la bacteria gram positiva Listeria monocytogenes. El crecimiento de bacterias aeróbicas totales también se evaluó y se examinaron las eficacias de forma similar. El uso de los agentes quelantes ácido etilendiaminatetraacético (sal disódica), ácido cítrico y ciclodextrina también se examinó, aisladamente y con varias concentraciones de nisina o pediocina.
Estos ejemplos se llevaron a cabo mediante el empleo de técnicas asépticas bien conocidas por los especialistas en la técnica de microbiología. Se inoculó caldo de triptosa de doble potencia de la marca DIFCO esterilizado con, al menos, aproximadamente 10.000 unidades formadoras de colonias (ufc) por ml de una mezcla de dos cepas patógenas de Listeria monocytogenes serotipo 4b aisladas del alimento. Este caldo inoculado se añadió entonces a los tubos de ensayo con soluciones de ensayo antimicrobianas de doble potencia empleando partes iguales de caldo inoculado y de solución de ensayo. Entonces, los tubos de ensayo se taparon y los contenidos se mezclaron completamente. Las Tablas 1a y 1b dan una relación de los componentes de la solución de ensayo y de las cantidades. Después del ensayo, el pH se midió de forma similar para las soluciones mezcladas de caldo no inoculado y para las soluciones de ensayo; los valores de pH también se muestran en las Tablas 1a y 1b. Las cantidades de los componentes de la solución de ensayo se calcularon en base a una solución de "doble potencia" que fue luego diluida con un volumen igual de caldo inoculado, según se describe anteriormente. Las cantidades relacionadas en las Tablas 1a y 1b se calcularon asumiendo pesos iguales para volúmenes iguales de caldo inoculado y de soluciones de ensayo. Las soluciones de ensayo inoculadas mezcladas se hicieron por triplicado y se incubaron sin agitación a aproximadamente 30ºC. Por cada muestra de ensayo se apartó asépticamente una alícuota de 0,3 ml con pipeta inmediatamente después de agitar (cero (0) horas), así como a las 4, 8, 24 y 48 horas. Inmediatamente después de la remoción, estas alícuotas se sembraron sobre placas de agar LPM y de agar de soja tríptica de acuerdo con procedimientos de recuento de placas convencionales conocidos por los especialistas en la técnica de microbiología para determinar los recuentos de Listeria y de bacterias aeróbicas totales. El recuento selectivo de Listeria se llevó a cabo mediante el método de la División de Microbiología del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA) del Servicio de Seguridad e Inspección Alimentarias (FSIS) titulado "Método FSIS para el aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes a partir de carne elaborada y de productos de aves de corral" (para el uso en el programa provisional de reconocimiento de laboratorio), según se describe en el artículo titulado anteriormente, fechado el 4 de Noviembre de 1988 por A.B. Moran y fechado el 8 de Noviembre de 1988 por R.W. Johnston de FSIS y disponible del FSIS, que se incorpora en esta memoria por referencia. Los resultados del recuento bacteriano para los componentes de las soluciones de ensayo y para las concentraciones particulares se describen en las Tablas 1a y 1b como un recuento bacteriano promedio aritmético de las unidades formadoras de colonias (ufc) por ml de tres placas repetidas.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
2 
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Los ejemplos 1 y 2 son ejemplos control (no del invento). En los ejemplos 1 y 2 las soluciones de ensayo fueron agua desionizada, que se mezclaron con caldo según se describe anteriormente (a excepción de en el Ejemplo 1 que no fue inoculado) y se presentaron como controles. El Ejemplo 2 fue inoculado y se tomó como control. Los resultados del ensayo indican que para el control no inoculado (Ejemplo 1) no hubo niveles significativos de Listeria presentes durante las 48 horas del período del ensayo y que el crecimiento de bacterias aeróbicas no fue aparente hasta el período de ensayo de 8 horas, cuando tal crecimiento procedió a un ritmo rápido desde el período de 8 horas hasta los períodos de ensayo de 24 horas y de 48 horas. El control de agua desionizada inoculada (Ejemplo 2) exhibió una fase de estado latente desde el recuento inicial de aproximadamente 31.000 ufc por ml para la muestra de ensayo de 4 horas (37.000 ufc por ml) seguido de un crecimiento explosivo a las 8 horas (10.000.000 ufc por ml) y a las 24 horas (300.000.000 ufc por ml), seguido por una fase de muerte a las 48 horas (7.700.000 ufc por ml). Esta fase de muerte después de un crecimiento explosivo se cree debida a factores relacionados con el crecimiento elevado que precedió inmediatamente, tales como el agotamiento de los nutrientes o la producción por la bacteria a ensayo (Listeria) de productos inhibidores de desecho. De forma similar, los recuentos de bacterias aeróbicas totales exhibieron un período de crecimiento lento seguido por un crecimiento explosivo y luego un "ir muriendo". Al realizar el recuento de las bacterias aeróbicas totales de los Ejemplos 1-28, hubo evidencia de bacilos formadores de esporas en muchos ejemplos. Típicamente, estos organismos representan la diferencia entre los recuentos de bacterias aeróbicas totales y los de Listeria.
Dos agentes quelantes diferentes, específicamente (1) la sal disódica de EDTA (Na_{2}EDTA) y (2) el ácido cítrico se sometieron a ensayo en cuanto a su actividad antibacteriana colocando un 0,8 por ciento en peso de cada uno en agua desionizada e inoculando según se describió anteriormente. Se encontró que el Ejemplo 3 (Na_{2}EDTA) inhibía el crecimiento de los organismos de Listeria con un número máximo de organismos determinados a las 24 horas, seguido de fase de muerte a las 48 horas. El Ejemplo 4 (ácido cítrico) también resultó eficaz para matar e inhibir Listeria, aunque el nivel de organismos fluctuó a lo largo del período de 48 horas de ensayo con un recuento promedio elevado de 35.000 ufc por ml descrito a las 8 horas. Con respecto a los recuentos de bacterias aeróbicas totales, el Na_{2}EDTA resultó inhibitorio con un recuento promedio de placas descrito elevado de 88.000 ufc por ml a las 8 horas, comparado con las 560 millones de ufc por ml para el control inoculado (Ejemplo 2). El ácido cítrico resultó muy eficaz: Produjo una reducción estable en el número de bacterias aeróbicas totales a lo largo del período de ensayo a partir de un recuento promedio inicial de 6.500 ufc por ml hasta uno bajo de 640 ufc por ml a las 48 horas. La eficacia del ácido cítrico puede haberse debido al menos en parte a un efecto del pH, donde un bajo pH puede restringir el crecimiento de bacterias, como se conoce en la técnica.
En los Ejemplos 5-16 las soluciones de ensayo emplearon varias concentraciones de nisina sola y con ácido cítrico y Na_{2}EDTA. Los recuentos promedio de Listeria de las placas para todos estos ejemplos fueron de menos de 10 ufc por ml durante todos los períodos de ensayo, incluyendo el ensayo cero horas, llevado a cabo inmediatamente después de la inoculación. Se determinó que todos, el Ejemplo 2 (el control inoculado), así como los Ejemplos 3 y 4 (que sólo contienen los agentes quelantes), tenían recuentos promedio de Listeria de al menos 10.000 ufc por ml inmediatamente después de la inoculación (0 h). Por tanto, podría parecer que todas las muestras inoculadas de forma similar que contienen nisina bajo estas condiciones de ensayo actuasen matando sustancialmente toda Listeria tras la mezcla. El que no se observe crecimiento de Listeria después del período inicial de ensayo puede indicar bien una erradicación inicial o una reducción significativa de Listeria después de una inhibición muy eficaz.
Los resultados de los recuentos de las placas de bacterias aeróbicas totales para los Ejemplos 5-16 demuestran el efecto de la concentración de nisina en ausencia y presencia de un agente quelante sobre el crecimiento total de las bacterias.
Los Ejemplos 5-8 fueron soluciones de ensayo de diversas concentraciones de nisina (en forma de una preparación de nisina de la marca comercial Nisaplin disponible en Aplin & Barrett Ltd.) en agua desionizada. Todos los Ejemplos 5-8 muestran una muerte inicial de las bacterias inoculadas hasta un nivel inferior a 10 ufc para cada concentración de nisina. Los recuentos de bacterias aeróbicas totales obtenidos al sembrar las soluciones de ensayo inoculadas sobre agar no selectivo de soja tríptica debieran ser una mezcla de Listeria añadida intencionadamente y de contaminación fortuita de otros microorganismos. Por comparación, todos los Ejemplos 2-4 muestran unos recuentos iniciales de entre 5.900-9.100 ufc por ml, mientras que el control no inoculado (Ejemplo 1) tuvo un recuento inicial de menos de 10 ufc por ml.
La comparación del Ejemplo 5, que contiene 1 ppm de nisina, con el control inoculado (Ejemplo 2) muestra que la nisina es eficaz, en particular inicialmente al matar bacterias aeróbicas y controlar, al menos inicialmente, el crecimiento de las bacterias aeróbicas. Sin embargo, para el período de ensayo de 24 horas el recuento promedio de 130 ufc por ml a las 8 horas del Ejemplo 5 había crecido de forma explosiva hasta 9.100.000 ufc por ml. Este crecimiento es menor que el del control inoculado (Ejemplo 2) y aproximadamente igual al del control sin inocular (Ejemplo 1) a las 24 horas. El rápido crecimiento de las bacterias aeróbicas totales continuó en el Ejemplo 5, lo que resultó en un recuento de placas promedio de 45.000.000 ufc por ml a las 48 horas. La comparación del Ejemplo 5 con los Ejemplos 6-8 demuestra que el aumento de la concentración de nisina actuará retrasando el comienzo de la fase de crecimiento explosivo para las bacterias aeróbicas totales y reducirá el recuento promedio de bacterias aeróbicas totales para cada período de tiempo relativo a otras soluciones de ensayo que contienen menos nisina.
Los Ejemplos 9-12 igualan a los Ejemplos 5-8 en concentración de nisina, pero contienen también un 0,8 por ciento en peso de un agente quelante, la sal disódica de EDTA (de aquí en adelante Na_{2}EDTA). Los resultados para los recuentos promedio de placas de bacterias aeróbicas totales son, excepto para las 110 ufc por ml a las 48 horas del Ejemplo 9, todos menores de 10 ufc por ml. De este modo, una comparación de, por ejemplo, los recuentos promedio de bacterias a las 24 horas para el Ejemplo 3 (0,8% en peso de Na_{2}EDTA), Ejemplo 5 (1 ppm de nisina) y Ejemplo 9 (la combinación de 1 ppm de nisina y 0,8 de Na_{2}EDTA) muestra recuentos promedio de bacterias aeróbicas totales de 88.000 ufc por ml, 9,100.000 ufc por ml y < 10 ufc por ml, respectivamente. La reducción sorprendente de bacterias hasta menos de 10 ufc por ml para la combinación de nisina y agente quelante es inesperada. La nisina y agentes quelantes, tales como Na_{2}EDTA, parecen actuar sinérgicamente para reducir el número promedio de bacterias aeróbicas totales, según se muestra por comparación de los datos de las 24 horas y 48 horas de los Ejemplos 3 y 5-12. En los Ejemplos 13-16, se probó un segundo agente quelante combinado con nisina. Estos ejemplos fueron similares a los Ejemplos 5-8, pero cada uno de ellos contenía también un 0,8 por ciento en peso de ácido cítrico. A excepción de un recuento promedio inicial de 30 ufc por ml para el Ejemplo 16, todas estas soluciones de ensayo que contenían la combinación de ácido cítrico y nisina dieron recuentos promedio de placa de aeróbicos totales de menos de 10 ufc por ml. Los resultados del ensayo anterior demuestran la actividad antibacteriana de los agentes quelantes individuales y de nisina, así como la sorprendente e inesperada buena actividad de la combinación de nisina y agente quelante frente a los niveles de bacterias aeróbicas totales. Ésto sugiere que la combinación de nisina con un agente quelante tal como Na_{2}EDTA o ácido cítrico funciona con una eficacia inesperada para matar e inhibir bacterias y puede, por tanto, aplicarse a un producto alimentario para mejorar drásticamente la duración en almacenamiento.
En los Ejemplos 17-28 (ejemplos comparativos) las soluciones de ensayo contienen varias concentraciones de pediocina con y sin los agentes quelantes Na_{2}EDTA y ácido cítrico. La pediocina se añadió como una preparación que se produjo en la leche desnatada de acuerdo con procedimientos generalmente conocidos en la técnica de preparar pediocina por cultivo de Pediococcus acidilacti en leche desnatada.
En relación con los recuentos de placa promedio de Listeria en la Tabla 1a, es aparente que la pediocina sola mata e inhibe el crecimiento de Listeria, pero no tan eficazmente como la nisina en base a igual peso. Los resultados indican que el aumento de la concentración de pediocina por encima de 1 ppm reduce generalmente el número de Listeria en los recuentos iniciales. Las cantidades de pediocina hasta un nivel de 10 ppm o menos inhibieron el crecimiento de Listeria relativo al control inoculado (Ejemplo 2), pero Listeria continuó creciendo, mientras que Pediocina a un nivel de 50 ppm o superior no sólo parece reducir los recuentos de bacteria descritos inicialmente, sino también impidió que el recuento de Listeria incrementase exponencialmente, es decir, el recuento promedio mayor de Listeria durante el período de ensayo de las 48 horas fue 740 ufc por ml. En los Ejemplos 21-24 las soluciones analizadas fueron similares a las de los Ejemplos 17-20 salvo que el 0,8 por ciento en peso del agente quelante Na_{2}EDTA estaba presente con las concentraciones diversas de pediocina. Como se demostró por comparación de los Ejemplos 21-24 con el Ejemplo 3 y los Ejemplos 17-20, la combinación de pediocina y Na_{2}EDTA resultó inesperadamente eficaz para matar e inhibir el crecimiento de Listeria a lo largo del período de ensayo de 48 horas, particularmente para niveles bajos de pediocina (10 ppm o menos). En los Ejemplos 25-28, estas soluciones de ensayo sustituyeron otro agente quelante, el ácido cítrico, por el Na_{2}EDTA de los Ejemplos 21-24. Los recuentos promedio de Listeria por placa para las soluciones que contienen pediocina y ácido cítrico son sorprendentemente bajos e indican una eficacia sinérgica para matar e inhibir la bacteria Listeria. Por ejemplo, a continuación una comparación de los recuentos promedio de placa a las 24 horas: para 0,8% en peso de ácido cítrico solo, 70.000 ufc por ml (Ejemplo 4); para 1 ppm de pediocina, 170,000.000 ufc por ml (Ejemplo 17) y para la combinación de 0,8% en peso de ácido cítrico y 1 ppm de pediocina, 10 ufc por ml (Ejemplo 25). El resultado de 10 ufc por ml del Ejemplo 25 es extraordinariamente bajo. Las reducciones logarítmicas que pueden conseguirse por combinación de pediocina y agente quelante relativas a los componentes individuales solos es significativa e inesperada.
Con respecto a los recuentos promedio de bacterias aeróbicas totales, la pediocina parece retrasar y reducir el crecimiento, siendo las concentraciones mayores de pediocina más eficaces, particularmente en los períodos de ensayo de 24 y 48 horas. El empleo de pediocina y de los agentes quelantes Na_{2}EDTA y ácido cítrico también resultó eficaz para inhibir el crecimiento de las bacterias aeróbicas totales.
Los Ejemplos 1-28 anteriores demuestran la eficacia de varios agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas y aeróbicas. De forma inesperada, la combinación de nisina y un agente quelante, tal como Na_{2}EDTA o ácido cítrico, se mostró sorprendentemente eficaz frente a las bacterias aeróbicas totales relativo al empleo de cualquiera de los componentes por separado. También, inesperada es la sorprendente eficacia de la combinación de pediocina y un agente quelante, tal como Na_{2}EDTA o ácido cítrico, relativo a los componentes individuales frente a la bacteria patógena Listeria.
Ejemplos 29-43
Varios agentes antimicrobianos aplicados a productos alimentarios, como salchichas de Viena, se sometieron a ensayo para determinar su eficacia frente al deterioro subsiguiente. Las salchichas alemanas pasteurizadas preparadas frescas sin pellejo (eliminación de la envoltura) tendrán típicamente bacterias de superficie en menos de 1.000 ufc por salchicha directamente después de hacer vacío al envasado durante los procedimientos de fabricación comercial típicos. Cuando los recuentos de bacterias alcanzan los 10^{7} a 10^{8} o mayores órdenes de magnitud de ufc por salchicha alemana, entonces el deterioro se hace típicamente evidente visualmente. Bacterias comunes en el deterioro de carnes procesadas, refrigeradas y envasadas al vacío incluyen Lactobacillus. En particular, se ha sometido a ensayo la eficacia de varias soluciones para proteger los productos alimentarios sumergidos en ellas frente al crecimiento de bacterias patógenas como Listeria monocytogenes.
Se emplearon salchichas alemanas formadas a partir de emulsiones cárnicas y procesamiento típico. Las salchichas alemanas se prepararon mediante relleno de emulsión cárnica de buey y cerdo dentro de los envoltorios celulósicos de la marca comercial E-Z Peel NOJAX® (disponibles comercialmente en la Viskase Corporation de Chicago, Illinois) y por cocción (aproximadamente 1 hora) en un ahumadero de gas controlado por humedad a una humedad relativa de aproximadamente un 20% hasta que las salchichas alemanas alcanzaron una temperatura interna de, al menos, 71ºC (160ºF), bajo condiciones sin humo añadido. Entonces se desprendió el envoltorio mediante un pelador comercial y se desechó. Las salchichas alemanas peladas se almacenaron brevemente en una bolsa de polietileno a aproximadamente 4ºC hasta que comenzó el ensayo microbiológico. La emulsión cárnica se fabricó a partir de los ingredientes referidos en la Tabla A mediante picado y mezclado durante unos cinco minutos en una picadora comercial y después desmenuzado a través de un moledor de emulsiones comercial para obtener una emulsión cárnica uniforme. Un análisis químico de las salchichas pasteurizadas reveló un 56,9% de humedad, un 27,2% de grasa, un 12,2% de proteína, un 2,5% de ceniza, un 1,90% de sal, 65 ppm de nitrito sódico y un pH de 6,40 en la superficie de la salchicha.
TABLA A
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Las salchichas refrigeradas almacenadas a 4ºC (40ºF) se recubrieron en su superficie con soluciones de ensayo al sumergir individualmente las salchichas en un líquido de ensayo durante aproximadamente 30 segundos con la menor manipulación posible, seguido de un período de aproximadamente 30 segundos durante el cual cada salchicha se mantuvo verticalmente para escurrirse. Las salchichas recubiertas se inocularon entonces (salvo un control no inoculado) con una mezcla de tres cepas de Listeria monocytogenes patógena (que se cultivaron a partir de cepas aisladas bien de carne animal o carne vegetal) hasta un nivel de aproximadamente 10.000 - 30.000 unidades formadoras de colonias (ufc) por salchicha alemana. Inmediatamente después de la inoculación, las salchichas alemanas de cada ejemplo se sometieron a ensayo por lavado con un tampón estéril que fue entonces sembrado empleando métodos descritos anteriormente tanto en agar de levadura triptona glucosa (TGY) no selectivo de Listeria como en agar LPM selectivo de ésta y se incubaron para determinar la presencia de bacterias aeróbicas totales y Listeria.
A continuación de la inoculación, las salchichas se envasaron de forma individual en bolsas disponibles comercialmente de PERFLEX® 51B Barrier Bags (manufacturadas por Viskase Corporation de Chicago, Illinois). Estas bolsas se sometieron a vacío y se sellaron por calor bajo un vacío elevado con un aparato para hacer vacío y sellador comercial para proporcionar una barrera al oxígeno y a la humedad del medio ambiente. Las muestras de ensayo se almacenaron a temperatura ambiente (alrededor a 25ºC) durante dos días y entonces se analizaron los recuentos de bacterias totales y de Listeria según se describió con anterioridad para las muestras después de la inoculación. Las soluciones de ensayo y los recuentos de bacterias se describen en la Tabla 2.
4 
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En los Ejemplos 29-43, los agentes antimicrobianos se disolvieron o suspendieron en agua desionizada. Todas las soluciones de ensayo descritas en la Tabla 2 fueron acuosas.
El Ejemplo 29 difirió de los otros ejemplos en que sus salchichas alemanas se sumergieron en una muestra de sólo agua desionizada y no fueron posteriormente inoculadas con organismos de Listeria. El Ejemplo 29 se tomó como un control no inoculado (no del invento) para examinar el crecimiento de cualquier organismo ya presente en el entorno, por ejemplo, de las salchichas o introducido por contaminación accidental. Los resultados del Ejemplo 29 indican que no hubo niveles significativos de Listeria detectados durante el período de ensayo de dos días, mientras que el recuento promedio de las placas para las bacterias aeróbicas totales aumentó desde 2.600 hasta unas 590.000 ufc estimadas por salchicha.
El Ejemplo 30 se llevó a cabo como un control inoculado (no del invento) con agua desionizada como solución de ensayo. Este Ejemplo resultó idéntico al Ejemplo 24, salvo que las salchichas alemanas sumergidas se inocularon con organismos de Listeria. A lo largo del periodo de ensayo de dos días, el crecimiento de Listeria resultó explosivo y alcanzó un recuento promedio estimado por placa de 38.000.000 ufc por salchicha alemana. El recuento de bacterias aeróbicas totales mostró un crecimiento explosivo similar.
En el Ejemplo 31, una solución del 3 por ciento en peso de la sal trisódica de EDTA no afectó apreciablemente ni al crecimiento de Listeria ni al crecimiento de aeróbicos totales en las salchichas a lo largo del período de ensayo de los dos días.
En los Ejemplos 32-35 se analizaron varias concentraciones de nisina sola y en combinación con el agente quelante Na_{3}EDTA en las salchichas. En estos ejemplos, la nisina se añadió como una preparación producida por fermentación de la leche. Esta preparación de nisina está disponible comercialmente bajo el nombre comercial "Nisaplin" en Aplin & Barrett de Trowbridge, Inglaterra. En las soluciones de ensayo para obtener, por ejemplo, un 0,01 por ciento en peso de nisina fue necesario añadir un 0,4 por ciento de la preparación de nisina (Nisaplin).
Aunque se cree que todas las salchichas recubiertas de la solución de ensayo de los Ejemplos 30-43 se inocularon inicialmente con, al menos, aproximadamente 10.000 ufc de Listeria por salchicha, los recuentos iniciales promedio por placa para Listeria para los Ejemplos 32-35 fueron todos menores que 10 ufc. Estos recuentos iniciales bajos se cree que indican que cantidades sustanciales de Listeria murieron al entrar en contacto con el recubrimiento que contenía nisina. Todas las soluciones de recubrimiento que contenían nisina resultaron eficaces en la reducción del crecimiento de Listeria a lo largo del período de dos días, siendo las soluciones con mayores cantidades de nisina las más eficaces en inhibir Listeria. El Ejemplo 32, en el que el recubrimiento de la salchicha alemana contenía sólo nisina a nivel de 100 ppm en la solución de ensayo se mostró más eficaz a lo largo del período de dos días. Sin embargo, ésto puede deberse bien a una erradicación inicial o a una reducción significativa después de una inhibición muy eficaz. Los resultados de los ensayos para las bacterias aeróbicas totales sugieren que 100 ppm de nisina y un 3,0 por ciento en peso de Na_{3}EDTA actúan sinérgicamente para detener el crecimiento de las bacterias aeróbicas totales sobre las superficies cárnicas recubiertas, cocinadas o pasteurizadas, según se observa de la comparación del Ejemplo 35 con los Ejemplos 31 y 32.
En los Ejemplos 36-39, se empleó una preparación no comercial de nisina. Esta preparación de nisina se obtuvo cultivando Streptococcus lactis en leche desnatada empleando procedimientos conocidos habitualmente. El Ejemplo 36 analizó las salchichas recubiertas con una solución de nisina a 52 ppm sin el agente quelante Na_{3}EDTA. La comparación de los resultados del Ejemplo 36 con los Ejemplos 31 y 39 indican que el empleo de la combinación de nisina y del agente quelante Na_{3}EDTA proporcionaron una reducción sorprendente e inesperada en ambos recuentos promedio de Listeria por placa y de bacterias aeróbicas totales durante el período de ensayo de dos días.
Se examinaron otros agentes quelantes con una acción inhibitoria y de muerte inesperadamente buena frente a las bacterias aeróbicas totales para la combinación de nisina y ácido cítrico o ciclodextrina. La combinación de nisina y ciclodextrina y de nisina y ácido cítrico también mostró una eficacia muy buena frente al crecimiento de Listeria sobre las superficies de los alimentos. La ciclodextrina empleada en estos ejemplos fue beta-ciclodextrina, que está disponible comercialmente de la compañía American Maize-Products de Hammond, Indiana.
Los Ejemplos 29-43 demuestran que una composición bactericida que contiene nisina y un agente quelante, tal como Na_{3}EDTA, ácido cítrico o ciclodextrina, puede emplearse para matar e inhibir bacterias patógenas y prolongar la duración en almacenamiento de los alimentos. La composición novedosa que contiene una combinación de nisina y agente quelante parece útil como conservante alimentario. En esta memoria la solución se aplicó sobre las superficies de salchichas por inmersión, pero se cree que pueden emplearse otros métodos de aplicación, según se comentó anteriormente, como pulverización, mezclado o contacto con una película de recubrimiento desprendible y que la combinación del invento puede emplearse, no sólo con carne elaborada, sino con otros alimentos que incluyen frutas, verduras, productos de cereales, productos lácteos, huevos, así como carnes, aves de corral y pescados. Se cree que la composición tiene utilidad para productos alimentarios frescos, crudos, cocinados, pasteurizados y esterilizados. La eficacia sinérgica, para matar e inhibir patógenos y organismos que deterioran los alimentos, se demuestra por los resultados de los ensayos anteriores.
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Ejemplos 44-55
Varios agentes antimicrobianos se aplicaron a las salchichas alemanas sumergiendo cada una de ellas dentro de las soluciones de ensayo basadas en agua que contienen los agentes. Las salchichas sumergidas se inocularon con bacterias y se analizó el crecimiento de bacterias en su superficie a lo largo del tiempo. Los procedimientos para este ensayo fueron sustancialmente idénticos a los seguidos en los Ejemplos 29-43 anteriores, salvo en lo que se indica a continuación. La emulsión cárnica empleada aquí fue sustancialmente la misma receta empleada en los Ejemplos 29-43, salvo que no se empleó dextrosa en la emulsión cárnica de los Ejemplos 44-55. Las condiciones de cocción y elaboración de las salchichas fueron las mismas con la salvedad de que la humedad relativa fue del 25% y que las salchichas alemanas se cocieron hasta alcanzar una temperatura interna de 72ºC (162ºF). Un análisis químico de las salchichas una vez pasteurizadas reveló un pH de la superficie de 6,36 y una humedad del 56,3%, un 28,7% de grasa, un 12,4% de proteína, un 2,6% de ceniza, un 1,94% de sal y 56 ppm de nitrito sódico. Aunque no se añadió humo, se realizó un análisis de humo que indicó 24,6 mg de ácido, 0,3 mg de fenol y 7,1 mg de compuestos de tipo carbonilo por cada 100 g de salchicha alemana cocida. Estas cantidades se cree que se deben a una acumulación residual de constituyentes del humo del ahumadero.
Las salchichas alemanas se recubrieron en las soluciones de ensayo mediante inmersión durante treinta segundos, seguido de escurrido durante treinta segundos. Entonces, las salchichas recubiertas se inocularon con una mezcla de tres cepas de Listeria monocytogenes patógena al pipetear 0,05 ml (alrededor de 100 células) de inóculo sobre cada salchicha. El inóculo se esparció con un bastoncillo de algodón estéril. Las salchichas se envasaron entonces en dos capas de cuatro en bolsas PER-FLEX® 51B Barrier Bags disponibles comercialmente (fabricadas por Viskase Corporation de Chicago, Illinois). En estas bolsas de película de termoplástico se hizo vacío y se sellaron por calor bajo vacío elevado con un aparato para hacer vacío/sellador comercial para proporcionar una barrera al oxígeno y a la humedad del medio ambiente. Grupos separados de paquetes se prepararon para las salchichas recubiertas con cada solución de ensayo. Cada paquete sellado de ocho salchichas se almacenó a aproximadamente 4,4ºC (40ºF). Se analizaron triplicas de los paquetes inicialmente (Día 0) y a los 14, 28 y 42 días de almacenado. Para el ensayo, una salchicha se retiró asépticamente de cada paquete siendo analizada y colocada en una bolsa con 10 ml de tampón fosfato, entonces se agitó para aclarar las células bacterianas adheridas a la superficie de la salchicha. Se sembraron diluciones decimales seriadas en agar LMP y agar TGY como en los ejemplos anteriores 29-43. Los resultados del recuento promedio aritmético por placa de los tres paquetes replicados sometidos a ensayo se describen en la Tabla 3.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Las salchichas alemanas de los Ejemplos 44 y 45 fueron recubiertas al sumergir cada salchicha dentro de una solución diluyente de fostato tamponado de Butterfield que contenía aproximadamente 42,5 ppm de ortofosfato potásico en agua desionizada ajustada a pH de 7,2. Los Ejemplos 44 y 45 difirieron en que sólo las salchichas del Ejemplo 45 se inocularon con Listeria. Por tanto, el Ejemplo 44 sirvió como control no inoculado (no del invento) y el Ejemplo 45 sirvió como control inoculado (no del invento) similar a los Ejemplos anteriores 29 y 30. El diluyente de fostato tamponado de Butterfield se empleó para minimizar cualquier interrupción debida a las fuerzas osmóticas de cualquier bacteria ya presente o añadida. Los resultados indican niveles no significativos de Listeria a lo largo del período de ensayo de 42 días para el control no inoculado, mientras que el recuento promedio de las placas para las bacterias aeróbicas totales ascendió hasta 3.200.000 ufc por salchicha para el día 42 de ensayo. Las salchichas del control inoculado (Ejemplo 45) mostraron un crecimiento rápido de Listeria a partir de un recuento promedio inicial de placas de 340 ufc por salchicha hasta un promedio de 1.400.000.000 ufc por salchicha a los 28 días. El recuento de bacterias por placa para la muestra del día 42 no se determinó debido a los números de bacterias excesivamente elevados según se determinó por examen visual de los paquetes que revelaron turbiedad del fluido contenido dentro del paquete evacuado. Los expertos en la técnica de microbiología de los alimentos saben que esta turbiedad indica niveles extremadamente elevados de bacterias. Los números de bacterias excesivos a los 42 días resultaron aparentes en todos los ejemplos, salvo para el control no inoculado (Ejemplo 44) y los Ejemplos 54 y 55 comentados a continuación. Los resultados del recuento de placas de mesófilos aeróbicos totales muestran que el crecimiento de bacterias aeróbicas totales que incluyen tanto Listeria (un anaerobio facultativo) como cualquier aumento accidental de bacterias desde un promedio de 120 ufc por salchicha hasta un promedio de 1.900.000.000 ufc por salchicha en el día 28 de ensayo.
En los Ejemplos 46-53, se analizaron las soluciones basadas en agua de la sal disódica de EDTA. Se analizó sobre las salchichas Na_{2}EDTA en solución solo o en combinación con propilenglicol, benzoato sódico, sorbato potásico, lisozima y como un sistema de tres componentes con propilenglicol y parabenos. El propilenglicol también se sometió a ensayo solo y con un humo líquido disponible comercialmente vendido bajo el nombre comercial de Charsol®, C-10 por Red Arrow Products Co. de Manitowoc, Wisconsin. Todas las salchichas recubiertas con estas soluciones de ensayo mostraron un crecimiento de bacterias inaceptablemente elevado al final del período de ensayo de 42 días. Sin embargo, los Ejemplos 46, 49-52 resultaron de algún provecho en la inhibición del crecimiento de las bacterias según se mostró por los reducidos recuentos promedio de bacterias aeróbicas totales hasta el día 28 de ensayo relativo al control inoculado, pero sólo las soluciones que contenían lisozima, benzoato sódico y sorbato potásico de los Ejemplos 52, 50 y 51, respectivamente, mostraron algún efecto en producir reducciones logarítmicas en los recuentos promedio de Listeria por placa a los 28 días.
Los Ejemplos 54 y 55 analizaron soluciones basadas en agua que contenían 100 ppm y 250 ppm de nisina (la nisina se añadió en forma de Nisaplin) en combinación con un 0,8 por ciento en peso de Na_{2}EDTA como un recubrimiento antibacteriano para las salchichas alemanas pasteurizadas. Estos recubrimientos resultaron eficaces frente a la inoculación de las salchichas con Listeria patógena, reduciendo el recuento inicial promedio de placa a menos de 10 ufc por salchicha y manteniendo un recuento promedio de placa de 20 ufc o menos por salchicha durante el período completo de 42 días de ensayo. El empleo de agar LMP selectivo de Listeria puede reducir, a través de la naturaleza selectiva del agar, el número de organismos de Listeria presentes originalmente. Por tanto, el recuento de bacterias aeróbicas totales se llevó a cabo empleando un agar de métodos convencionales no selectivo como el agar TGY. Los recuentos realizados para bacterias aeróbicas totales incluyen no sólo colonias de Listeria, sino también cualquier colonia casual de otras bacterias que puedan crecer en competición con, o además de, Listeria, tales como Staphlococcus. Los recuentos promedio por placa para el total de bacterias aeróbicas de los Ejemplos 54 y 55 indican una reducción logarítmica sorprendente en organismos relativo al control inoculado del Ejemplo 45. Los recuentos promedio por placa fueron no sólo de 10 ufc o menos por salchicha inicialmente y en el día 14, sino que los recuentos a los 28 días fueron < 10, < 10 y 3.900 ufc por salchicha para el Ejemplo 54 y < 10, 230 y 70.000 ufc por salchicha para el Ejemplo 55 comparado con los 80 millones, 440 millones y 5,2 miles de millones de ufc por salchicha para las tres placas control inoculadas (promedio: 1,9 miles de millones de ufc). A los 42 días las salchichas recubiertas de la solución de 100 ppm de nisina y Na_{2}EDTA tuvieron un recuento promedio de placa menor a 10 ufc por salchicha, mientras que las tres placas sometidas a ensayo para las salchichas recubiertas de la solución de 250 ppm de nisina y Na_{2}EDTA del Ejemplo 55 se contaron en <10; 270.000 y 1.300.000 ufc por salchicha. De ese modo, los recuentos de bacterias aeróbicas totales en el día 42 para las salchichas alemanas inoculadas del Ejemplo 54 y 55 pueden compararse favorablemente con los recuentos de las tres placas de 130.000, 180.000 y 9.200.000 ufc por salchicha (promedio: 3,2 millones de ufc) sometidos a ensayo a los 42 días para el control no inoculado del Ejemplo 44. Estos resultados espectaculares indican además que las composiciones que contienen nisina y un agente quelante pueden usarse para proteger frente al crecimiento de bacterias patógenas y que deterioran los alimentos durante largos períodos de tiempo a temperaturas reducidas. De este modo, la conservación de los alimentos puede mejorarse con tiempos mayores de conservación. Las composiciones pueden emplearse para recubrir películas de envasado con el subsiguiente contacto con la superficie del alimento.
Ejemplos 56-65
Los ejemplos 56-65 valoraron el potencial antimicrobiano del uso de envoltorios de salchichas recubiertos para el control de Listeria monocytogenes y de otros microorganismos que tienen lugar de forma natural en las salchichas alemanas a las que se han retirado los envoltorios antes del envasado al vacío.
Las salchichas se fabricaron empleando la receta de emulsión de buey y cerdo y el procedimiento descrito anteriormente para los Ejemplos 29-43, salvo que el nivel de dextrosa en la receta de los Ejemplos 56-65 fue la mitad de la descrita en la Tabla A. La elaboración fue similar, pero a una humedad relativa de 25% y las salchichas se cocieron hasta alcanzar una temperatura interna de aproximadamente 71ºC (160ºF). Una excepción adicional al procedimiento anterior para fabricar salchichas fue que el envoltorio empleado se recubrió internamente con los componentes del ensayo por adición de nisina y/o sal di o trisódica de EDTA a la solución de fruncido antes del frunce del envoltorio. Los componentes a ensayo se añadieron en cantidades suficientes para dar los porcentajes en peso referidos en la Tabla 4, los cuales están basados en el peso total del envoltorio rehumedecido terminado de fruncir. Los Ejemplos 56 y 57 se sometieron a ensayo, respectivamente, como controles no inoculado e inoculado (no del invento) y emplearon el envoltorio disponible comercialmente que contenía sustancialmente los mismos componentes de la solución de fruncido que los Ejemplos 58-65, salvo que sin nisina ni tampoco una sal sódica de EDTA. Las soluciones típicas de fruncido se describen, p. ej., en la patente de EE.UU. nº 3.898.348 que se incorpora en esta memoria por referencia. Después de la eliminación de los envoltorios, las salchichas se refrigeraron a aproximadamente 4ºC hasta el inicio del ensayo microbiológico. Las salchichas refrigeradas recién hechas se inocularon con una mezcla de Listeria monocytogenes y se analizaron inicialmente (día 0) y a los 7, 14, 28 y 42 días, siguiendo los procedimientos descritos con anterioridad para los Ejemplos 44-55, salvo por lo ya señalado en esta memoria. La inoculación de las salchichas con Listeria se llevó a cabo a un nivel de, al menos, aproximadamente 1.000 organismos por salchicha. Las salchichas inoculadas se almacenaron ocho en un paquete, con grupos separados de paquetes para las salchichas de cada envoltorio a ensayo, de forma similar a los procedimientos de los Ejemplos 44-55 y se almacenaron a aproximadamente 4,4ºC (40ºF) hasta su análisis. El promedio aritmético de los resultados del ensayo se describen en las Tablas 4a y 4b.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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En relación a las Tablas 4a y 4b, las salchichas no inoculadas, no tratadas, del Ejemplo 56 no mostraron evidencia de Listeria a lo largo de los 42 días de ensayo y el recuento promedio por placa de aeróbicos totales creció desde 900 ufc por salchicha, inicialmente, hasta 4,300.000 ufc por salchicha en el día 28 y 22.000 ufc por salchicha en el día 42.
El control no inoculado exhibió un nivel inicial promedio de Listeria de 8.500 ufc por salchicha, las cuales crecieron hasta 200.000.000 ufc por salchicha para el día 42 y tuvieron un recuento inicial de bacterias aeróbicas totales por placa de 6.700 ufc por salchicha, que crecieron hasta 680 millones de ufc por salchicha para el día 42. Ambos controles se realizaron empleando envoltorios celulósicos no fibrosos disponibles comercialmente E-Z Peel Nojax®, sin modificar, fabricados por Viskase Corporation de Chicago, Illinois. El examen de los datos de los Ejemplos 58-65 indica que los agentes antimicrobianos aplicados al envoltorio antes del relleno con emulsión cárnica y cocción se transfirieron a las superficies de las salchichas cocidas en cantidades suficientes para inhibir el crecimiento tanto de Listeria como de las bacterias aeróbicas totales relativas al control no inoculado (Ejemplo 57), después de eliminación del envoltorio de la salchicha.
Envoltorios celulósicos corrientes pueden emplearse también en el presente invento. Tales envoltorios pueden no contener adyuvantes químicos de pelado. De forma conveniente, tales envoltorios pueden tratarse con ácidos o los productos alimentarios embutidos, particularmente productos alimentarios que contienen proteína y grasa como salchichas rellenas frescas, pueden rociarse con una solución ácida previamente al termotratamiento (cocción o pasteurización). Tal tratamiento ácido puede tener un efecto beneficioso, el cual mejora o mantiene la capacidad de los agentes antimicrobianos tales como nisina o pediocina, bien solos o en conjunción con un agente quelante, para proteger el producto alimentario embutido antes y después del termotratamiento y/o de la eliminación del envoltorio.
Ejemplos I-IV
Los ejemplos I a III son ejemplos comparativos, no del invento. El Ejemplo IV es del presente invento.
En todos los ejemplos siguientes la película de envasado del alimento a la que se hace referencia incluye un envoltorio no fibroso de celulosa regenerada de pequeño diámetro del tipo de los bien conocidos en la técnica por los fabricantes de salchichas alemanas sin pellejo, de salchichas de Viena y similares. Tal envoltorio puede recubrirse o impregnarse con varios aditivos para mejorar la duración en almacenamiento, el pelado, etc.
El envoltorio de materia prima seca, no fibroso, es convencionalmente fruncido en ristras de envoltorio para su uso en una máquina de rellenado convencional. Durante la operación de fruncido, justo antes de la reunión del envoltorio en pliegues, se aplica una solución pulverizada uniformemente a una velocidad constante sobre la superficie interna del envoltorio. Este es un método convencional (véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 3.462.794, la cual se incorpora en esta memoria por referencia) para aplicar un recubrimiento interno a un envoltorio.
Cuatro soluciones diferentes, según se describe en la Tabla I, pueden aplicarse mediante el procedimiento anterior para proporcionar cuatro muestras diferentes de envoltorio, donde cada muestra tiene una cantidad controlada equivalente de solución uniformemente aplicada sobre ella.
La composición de la solución del Ejemplo I comparativo es una solución típica pulverizada en el interior de un envoltorio justo antes del fruncido. El agua humedece el envoltorio y actúa también como un transportador para los otros componentes, que pueden incluir un plastificador y/o humectante como el propilenglicol, un lubricante como el aceite mineral o un emulsionante como una mezcla de monodiglicéridos etoxilados vendidos bajo el nombre comercial Mazol 80 por Mazer Chemicals, Inc. de Gurnee, Illinois y un adyuvante de pelado como la carboximetilcelulosa.
La solución del Ejemplo II comparativo es de la misma composición que la del Ejemplo I, salvo que se añade un agente quelante, es decir, viz la sal disódica de etilendiaminotetraacético (Na_{2}EDTA.2H_{2}O).
La solución del Ejemplo III comparativo es similar a la del Ejemplo II comparativo, salvo que un 0,025 por ciento en peso de la solución incluye un agente antimicrobiano en la forma de lisozima.
La solución del Ejemplo IV del invento es similar a la del Ejemplo II comparativo, salvo que se añade un 1,0 por ciento en peso de Nisaplin. Nisaplin es una preparación comercial de marca registrada de nisina fabricada a partir de la fermentación de un cultivo puro de las cepas de Streptococcus lactis no patógenas pertenecientes a Lancefield grupo N con un digerido de leche desnatada esterilizada, termotratada, sin penicilina. El producto de fermentación se concentra por un procedimiento espumante y se extrae por precipitación de sal bajo condiciones ácidas y secas mediante un procedimiento de pulverización para producir una mezcla que tiene una actividad que es 1/40 de la de la nisina pura. La preparación de la nisina se describe más ampliamente en el Registro Federal, vol. 53, nº 66, páginas 11.247-11.251 (6 de Abril, 1988), que se incorpora en esta memoria por referencia. Se emplea desde un 1,0 por ciento en peso de Nisaplin; la solución del Ejemplo IV contiene un 0,025 por ciento en peso de nisina. La actividad de la nisina pura es de aproximadamente 40 x 10^{6} UI por gramo.
Cada una de las cuatro soluciones anteriores se aplica uniformemente sobre muestras similares, aunque distintas, de envoltorios. Cada solución se pulveriza a una velocidad constante, que se ajusta para cada solución, para proporcionar un envoltorio pulverizado que tiene un contenido de humedad acuosa de aproximadamente un 19,3 por ciento en peso respecto al peso total de humedad del envoltorio recubierto. Las cuatro muestras de envoltorio fruncido, cada una recubierta internamente con una solución diferente, pueden rellenarse de forma convencional con una emulsión cárnica típica de salchicha de vaca en una máquina disponible comercialmente, tal como una máquina rellenadora de salchichas de la marca comercial Frank-A-Matic fabricada por Townsend Engineering Co. de Des Moines, Iowa, hasta un diámetro de relleno de aproximadamente 21-22 milímetros. Las salchichas de Viena embutidas pueden reunirse entonces en rejillas y colocarse en un ahumadero para el termotratamiento convencional.
Un procedimiento de termotratamiento típico incluye dar entrada a aire caliente humedecido desde un calentador de gas hasta que la temperatura del ahumadero se incrementa (habitualmente lleva 15-30 minutos) hasta una temperatura de bola seca de aproximadamente 60ºC (140ºF) y una humedad relativa (HR) de aproximadamente un 25%. Los tiros del ahumadero se cierran entonces; se da entrada al humo y la temperatura y humedad se mantienen constantes a 60ºC/25%HR durante quince minutos. Entonces se deja de dar entrada al humo, los tiros del ahumadero se abren según se necesite y la temperatura del ahumadero aumenta (durante un período de tiempo de normalmente 15-20 minutos) hasta una temperatura de bola seca de aproximadamente 71ºC (160ºF) a una humedad relativa constante de aproximadamente 25% y se mantiene ahí durante quince minutos. Entonces la temperatura de bola seca se aumenta de nuevo (normalmente precisa 15-20 minutos) hasta aproximadamente 82ºC (180ºF) a una humedad relativa constante de 25% y se deja ahí durante 45 minutos hasta que la temperatura interna de las salchichas embutidas alcanza 68-71ºC (155-169ºF).
Después de alcanzar una temperatura interna de 68-71ºC (155-160ºF), la fuente de calor se apaga y se rocía agua del grifo fría sobre las salchichas durante aproximadamente diez minutos, después de lo cual las salchichas se trasladan a un túnel de ducha de salmuera donde las salchichas embutidas se rocían en una solución salmuera (8% de sal) acuosa a aproximadamente -4ºC (25ºF) durante aproximadamente diez minutos hasta que la temperatura interna de la salchicha se enfríe hasta aproximadamente 2ºC (35ºF).
El envoltorio puede eliminarse entonces de las salchichas embutidas enfriadas mediante equipamiento convencional, tal como un pelador de Range Apollo para producir salchichas "sin pellejo".
Las salchichas sin pellejo de cada ejemplo pueden inocularse ahora con una solución tamponada que contiene tres cepas de Listeria monocytogenes patógena. Listeria puede aplicarse a cada superficie de salchicha mediante un bastoncillo de algodón estéril, el cual se sumerge en la solución que contiene Listeria y se limpia una vez a lo largo de la longitud de la salchicha, de modo que, al menos, aproximadamente 100 y, preferiblemente, al menos 1.000 células de Listeria monocytogenes se depositen sobre la superficie de cada salchicha.
Las salchichas inoculadas pueden envasarse entonces en dos capas; cada capa con cuatro salchichas, de modo que las ocho salchichas están en una bolsa de contención termoplástica multicapa, la cual tiene una capa central barrera para el oxígeno y la humedad, que incluye una mezcla de copolímero cloruro de vinilideno-acrilato de metilo y copolímero de cloruro de vinilideno-cloruro de vinilo y las capas externas de copolímero de etileno acetato de vinilo a cada lado de la capa central. Para cada ejemplo, se hace el vacío a 29 pulgadas de mercurio de una pluralidad de bolsas cada una con ocho salchichas y se termosellan.
Las salchichas envasadas inoculadas pueden entonces refrigerarse a aproximadamente 4ºC (40ºF); muestras de los paquetes de cada ejemplo se someten a ensayo inicialmente y a partir de ahí cada dos semanas durante seis semanas.
En los intervalos anteriores, las salchichas de muestra pueden analizarse retirando una salchicha y eliminando por lavado cualquier microorganismo con un tampón estéril. El tampón de lavado se analiza entonces por (1) un recuento de placas estándar con agar de triptona glucosa levadura por métodos convencionales y (2) un recuento selectivo para Listeria monocytogenes empleando agar LPM y el método FSIS descrito anteriormente para los Ejemplos 1-28.
El muestreo inicial de salchicha se espera confirme la presencia de Listeria en todas las muestras y de lisozima y nisina en las salchichas de los Ejemplos III y IV, respectivamente.
Tanto después de las cuatro como de las seis semanas se espera que ambos Ejemplos I y II comparativos anteriores muestren crecimiento de colonias vivas de Listeria monocytogenes con respecto a la inoculación inicial. Las salchichas del Ejemplo III tratadas con lisozima se espera muestren menos organismos viables de Listeria comparados con las muestras inoculadas control. Las salchichas del Ejemplo IV tratadas con nisina se espera muestren una disminución en los organismos viables de Listeria con respecto a las salchichas control inoculadas a las cuatro y seis semanas.
Los anteriores Ejemplos I a III comparativos y el Ejemplo IV del presente invento prueban el método y la película del presente invento.

Claims (21)

1. Una película de envasado del alimento que incluye una película polimérica que contiene nisina; dicha película se adapta para transferir dicha nisina a la superficie de un producto alimentario en contacto con ésta en una cantidad eficaz para impedir o inhibir el crecimiento microbiano en dicha superficie del alimento después de la eliminación de dicha película y, comprendiendo dicha película dicha nisina en una cantidad eficaz para impedir o inhibir el crecimiento de Listeria tras contacto, en la que dicha película está entremezclada, recubierta y/o impregnada con dicha nisina, de modo que la nisina se puede liberar de dicha película y se transfiere a una superficie del producto alimentario en una cantidad controlada hasta el punto necesario para proporcionar un efecto antimicrobiano sobre dicha superficie del producto alimentario, incluso después de eliminar dicha película del contacto con dicha superficie del producto alimentario.
2. Una película, de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha bacteriocina o agente recubre al menos una superficie de dicha película.
3. Una película, de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha superficie recubierta tiene un pH \leq 6.
4. Una película, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha película contiene además aditivos tales como agentes aglutinantes, tampones, emulsionantes, adyuvantes de transferencia y/o agentes quelantes (secuestrantes).
5. Una película, de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicho agente quelante (secuestrante) se selecciona de entre el grupo constituido por ácidos aminopolicarboxílicos y sus sales, como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o sus sales y por ácidos hidrocarboxílicos y sus sales, como el ácido cítrico.
6. Una película, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha película incluye materiales celulósicos como celulosa regenerada.
7. Una película, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha película incluye plásticos como los homopolímeros o copolímeros de poliolefinas o poliaminas, poli(tereftalato de etileno), copolímeros de poli(cloruro de vinilideno) o copolímeros de etileno-acetato de vinilo.
8. Una película, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha película incluye un envoltorio de alimentos tubular.
9. Una película, de acuerdo con la reivindicación 8, en la que dicha película incluye un envoltorio de alimentos no fibroso, celulósico, tubular.
10. Una película, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha película incluye una bolsa termocontraible.
11. Una película, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que incluye además un producto alimentario encerrado por dicha película.
12. Una película, de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicho producto alimentario incluye un producto alimentario de origen animal o de origen vegetal.
13. Una película, de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en la que dicho producto alimentario incluye productos cárnicos.
14. Una película, de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 11 a 13, en la que dicho producto alimentario incluye salchichas de todos los tipos.
15. Un método para tratar una superficie de un producto alimentario con nisina; dicho método incluye las siguientes etapas:
(a)
poner en contacto un producto alimentario con una película de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14;
(b)
transferir una cantidad controlada de dicha nisina y
(c)
eliminar dicha película por medio de la cual una cantidad de dicha nisina transferida permanece sobre la superficie del producto alimentario para impedir o inhibir el crecimiento de microorganismos sobre la misma.
16. Un método, de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dichos microorganismos incluyen Listeria monocytogenes.
17. Un método, de acuerdo con la reivindicaciones 15 ó 16, en el que dicho producto alimentario incluye un producto alimentario de origen animal o de origen vegetal.
18. Un método, de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho producto alimentario incluye productos cárnicos.
19. Un método, de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho producto alimentario incluye salchichas de todos los tipos.
20. Un método, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que dicho producto alimentario, desde la etapa de contacto hasta después de la etapa de eliminación de dicha película, se mantiene a una temperatura inferior a aproximadamente 88ºC (190ºF).
21. Un método, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que dicho producto alimentario se pasteuriza llevando dicho producto alimentario hasta una temperatura interna por encima de aproximadamente 63ºC (145ºF) y no superior a aproximadamente 82ºC (180ºF) antes de la eliminación de dicha película, en el que dicha temperatura superficial de dicho producto alimentario no excede 88ºC (190ºF).
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