CN1068198C - 骨形态发生蛋白与胶原颗粒复合剂型的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学材料领域。主要涉及骨形态发生蛋白与胶原颗粒复合剂型的制备。该方法首先是将胶原溶于醋酸缓冲液中，另将骨形态发生蛋白加入到盐酸胍与醋酸缓冲液的混合液中。将上述两种液体混合，经搅拌静置一定时间后，加入乙醇，随即进行离心沉淀。将沉淀物冲洗凉干后，即成为本发明所需制取的骨形态发生蛋白与胶原复合剂型。

Description

骨形态发生蛋白与胶原颗粒复合剂型的制造方法

本发明属生物医学材料领域。主要适用于随人工骨植入人体，促进新骨发育生长，加速生理固定。

骨形态发生蛋白(bone morphogenefic protein，简称BMP)是一种具有独特诱导成骨功能的机体蛋白因子，在机体骨组织再生和修复过程中发挥关键作用，可使断骨快速再接，在骨科和口腔科中具有广泛和应用前景。

目前，制备BMP有两种方法：一种是利用生化提取法直接从牛、马、猪、羊、兔、鼠等畜牲骨或骨肉瘤中提取混合型BMP；另一种是利用基因重组法合成单一型的人BMP。基因重组人BMP的诱骨或骨活性强，比生化提取法制备的BMP高10³-10⁶倍。BMP虽具有很强的诱导成骨活性，但植入人体时，吸收代谢快，作用时间短，难以充分发挥其诱导成骨效应；另外，BMP在修复大尺寸骨缺损时无支架作用。因此，BMP在临床应用时还需要与某一载体材料复合，才以使其自身得到缓释与支撑。

胶原(collagen)是构成生物体组织结构的一种含量最多的蛋白质，约占人体蛋白质总量的25-30％，其功能主要是承受负荷、连接组织和器官、保护机体等，在机体发育过程中还有协助引导组织分化和器官形成的作用。根据多肽链类型的不同、胶原可分5个类型，在生物体内是以Ⅰ型胶原为主。医用胶原是从牛皮、牛肌腱或猪皮、猪肌腱中提取。胶原具有优良的生物相容性，对组织无毒性、无刺激、抗原性弱，对血小板有较高的亲合性，能促进细胞增殖、加快伤口愈合，是BMP的理想载体材料之一。将BMP与胶原复合，既有利于BMP的诱导成骨效应的发挥，又能使胶原组织修复作用得到加强。

在现有技术中，文献(《The Journal of Biologi cal Chemistry》vol.265,No.22,PP13198-13205)提供了一各骨形态发生蛋白与胶原复合的方法，该方法是将骨形态发生蛋白加入到约6M盐酸胍中，制成含有骨形态发生蛋白的盐酸胍溶液，然后再将胶原置于其中，经搅拌、混合，加乙醇低温沉淀，最后用乙醇冲洗，无毒下凉干，冷冻干燥，保存待用。该方法的主要缺点是：(1)在制备过程中，没有加醋酸缓冲液，因此，不能有效地使BMP与胶原复合；(2)没有加明胶，粒状胶原与BMP沉淀物难于调制成型；(3)没有强调胶原粒度，以增加其骨传导作用。

本发明的目在于提供一种方法简单和效果好的骨形态发生蛋白与胶原颗粒复合剂型的制造方法，所制得复合剂型能有效地使骨形态发生蛋白在体内得到缓释，能充分发挥蛋形态发生蛋白的诱导成骨效应。

根据上述目的，本发明以盐酸胍溶液和醋酸缓冲液为介质制备上述所需的骨形态发生蛋白与胶原颗粒复合剂型。其制造方法的具体工艺步骤如下：

(1)制备胶原醋酸缓冲液

将粒状的胶原溶于50-60℃醋酸缓冲液中，浸泡0.3-1.0小时，醋酸缓冲液中胶原的加入量为0.1-0.6mg/ml，

醋酸缓冲液的酸碱度PH为4.5-5.0，醋酸浓度15-25mM，由此得胶原醋酸缓冲液；

(2)制备骨形态发生蛋盐酸胍-醋酸缓冲液，将骨形态发生蛋白加入盐酸胍与醋酸缓冲液的混合液中，骨形态发生蛋白的加入量为盐酸胍-醋酸缓冲液混合液的0.3-0.7mg/ml，

盐酸胍的浓度为5-7M，

醋酸缓冲液的酸碱度PH为4.5-5.0，浓度为12-25mM，

盐酸胍与醋酸缓冲液的配比(ml/ml)为(0.5-1.5)∶(1.5-2.5)；

(3)将上述分别制备的胶原醋酸缓冲液与骨形态发生蛋白盐酸胍-醋酸缓冲液混合液混合，并在20-30℃温度下搅拌，之后静置0.5-2小时；两者的混合比例为1∶1；

(4)将乙醇加入上述混合液中，经振荡混匀后在-50--80℃温度下保存0.5-1.5小时，随即进行离心沉淀，

乙醇的加入量(ml)为混合液的1.5-2.5倍；

(5)用85％和100％的乙醇对沉淀物分别进行冲洗，用85％乙醇冲洗两次，用100％乙醇冲洗一次，冲洗后无毒下凉干，凉干后，加入10％的明胶，在30℃温度下将粒状沉淀物调制成型，经冷冻干燥后，保存待用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)所用介质盐酸胍溶液和醋酸缓冲液来源广泛，原材料成本低。

(2)本发明采用醋酸缓冲液能有效地使BMP与胶原相互吸附，提高其复合效率。

(3)本发明采和50-500μm胶原颗粒和10％明胶调制成型所制取的复合剂型能有效地使BMP在体内得到缓释，充分发挥BMP的诱导成骨效应，加强新生骨的传导；另外，可使胶原的组织修复作用得到加强，特别是使骨愈合过程得到明显加快。实验表明，将BMP与胶原颗粒剂型放入对孔式种植体内，植入牙槽骨内一个月就有大量骨小梁在牙种植体的对孔内形成，并与牙槽骨融合一起，能有效地防止种植牙的松动。

实施例

根据本发明所述的制造方法制备3批骨形态发生蛋白与胶原颗粒复合剂型。

经备料后，首先将粒头胶原放入温度为50-60℃的醋酸缓冲液中，并浸泡一定时间，使之得到胶原醋酸缓冲液，胶原及醋酸缓冲液的加入量、浓度和酸碱度如表1所示。

另外，将骨形态发生蛋白加到盐酸胍与醋酸缓冲液的混合液中。盐酸胍与醋酸缓冲液两者的浓度、配比，以及骨形态发生蛋白的加入量如表2所示。

接着将上述分别制备胶原醋酸缓冲液与骨形态发生蛋白盐酸胍-醋酸缓冲液混合，在一定温度下搅拌，并静置一段时间。两者混合搅拌温度、静置时间，两者混合比例如表2所示。

随后在上述两者混合液中加入乙醇，经振荡混合均匀后在-50--80℃温度下保存一定时间，随即进行离心沉淀。乙醇加入量、混匀后保存温度和时间如表3所示。

最后用85％和100％的乙醇对沉淀物分别进行清洗，清洗凉干后，加入10％的明胶，在30℃温度下将粒状沉淀物调制成型。

将本发明实施例2所制取的骨形态发生蛋白与胶原复合剂型放入对孔式种植体内，植入牙槽骨内，一个月后就有大量骨小梁在牙种植体的对孔内形成，并与牙槽骨融合一起，能有效地防止种植牙的松动。

表1实施例胶原和醋酸缓冲液的加入量、浓度及酸碱度

表2实施例盐酸胍和醋酸缓冲液的浓度、配比以及骨形态发生蛋白的加入量

表3实施例乙醇加入量，混匀后保存温度及时间

Claims (2)

1、一种骨形态发生蛋白与胶原颗粒复合剂型的制造方法，其特征在于该方法包括如下工艺步骤：

(1)制备胶原醋酸缓冲液

将粒状的胶原溶于50-60℃醋酸缓冲液中，浸泡0.3-1.0小时，醋酸缓冲液中胶原的加入量为0.1-0.6mg/ml，

醋酸缓冲液的酸碱度PH为4.5-5.0，醋酸浓度15-25mM，由此得胶原醋酸缓冲液；

(2)制备骨形态发生蛋盐酸胍-醋酸缓冲液，将骨形态发生蛋白加入盐酸胍与醋酸缓冲液的混合液中，骨形态发生蛋白的加入量为盐酸胍-醋酸缓冲液混合液的0.3-0.7mg/ml，

盐酸胍的浓度为5-7M，

醋酸缓冲液的酸碱度PH为4.5-5.0，浓度为12-25mM，

盐酸胍与醋酸缓冲液的配比(ml/ml)为(0.5-1.5)∶(1.5-2.5)；

(3)将上述分别制备的胶原醋酸缓冲液与骨形态发生蛋白盐酸胍-醋酸缓冲液混合液混合，并在20-30℃温度下搅拌，之后静置0.5-2小时；两者的混合比例为1∶1；

(4)将乙醇加入上述混合液中，经振荡混匀后在-50--80℃温度下保存0.5-1.5小时，随即进行离心沉淀，

乙醇的加入量(ml)为混合液的1.5-2.5倍；

(5)用85％和100％的乙醇对沉淀物分别进行冲洗，用85％乙醇冲洗两次，用100％乙醇冲洗一次，冲洗后无毒下凉干，凉干后，加入10％的明胶，在30℃温度下将粒状沉淀物调制成型，经冷冻干燥后，保存待用。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于胶原的粒度为50-500μm。