ES2224122T3 - Inmunoterapia de cancer con linfocitos alogenicos. - Google Patents
Inmunoterapia de cancer con linfocitos alogenicos.Info
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Abstract
SE HAN DESCUBIERTO METODOS PARA TRATAR LA PATOLOGIA RESIDUAL TRAS LA ELIMINACION DE LA MAYOR PARTE O DE UNA PARTE IMPORTANTE DE LAS CELULAS MALIGNAS DE UN PACIENTE CON CANCER. EL PACIENTE SE SOMETE A UN TRASPLANTE DE CELULAS GERMINALES AUTOLOGAS. TRAS LA RECUPERACION HEMATOPOYETICA PARCIAL, SE INFUNDE AL PACIENTE CON LINFOCITOS SANGUINEOS PERIFERICOS ALOGENICOS, YA SEA SOLOS O EN COMBINACION CON LA ACTIVACION IN VIVO O IN VITRO DE LAS CELULAS T. LOS LINFOCITOS ALOGENICOS INFUNDIDOS DESENCADENAN UNA RESPUESTA CELULAR ANTITUMORAL.
Description
Inmunoterapia de cáncer con linfocitos
alogénicos.
Esta invención describe la metodología para la
erradicación de células tumorales residuales tras una intervención
quirúrgica, quimioterapia y/o radioterapia. Esto implica la
administración de linfocitos alogénicos tras el transplante
autólogo de células madre. Más concretamente, esta invención está
relacionada con el uso de linfocitos alogénicos de
HLA-compatible o HLA-incompatible
para inducir una respuesta
injerto-contra-célula maligna tras
un transplante autólogo de células madre.
Los pacientes con enfermedades malignas
hematológicas resistentes a dosis convencionales de quimioterapia
y/o radiación pueden ser tratados mediante un transplante autólogo
o alogénico de médula ósea. El transplante de médula ósea (TMO) hace
posible administrar a pacientes con una enfermedad resistente dosis
elevadas supraletales combinadas de quimioterapia y radiación,
ignorando el efecto tóxico irreversible de esas combinaciones
terapéuticas en el compartimento de la médula ósea normal. No
obstante, esta eliminación de masa(s) tumoral(es) en
un paciente puede dejar una fracción de células malignas residuales
que pueden dar lugar a una recidiva de la enfermedad. Varias líneas
de evidencia sugieren que una proporción significativa del efecto
beneficioso del TMO alogénico (es decir un TMO de un individuo
genéticamente no idéntico al paciente huésped) resulta de
interacciones mediadas por células de las células inmunes del
donante contra las células tumorales residuales en el huésped que
han escapado al tratamiento reductor de quimioradioterapia.
Tras un TMO alogénico, la incidencia de recidiva
es significativamente menor en los pacientes de leucemia con
manifestaciones clínicas de enfermedad
injerto-contra-huésped (EICH) aguda
o crónica, en comparación pacientes que no presentan EICH, lo que
indica que las interacciones alogénicas mediadas por inmunidad o
las células inmunocompetentes del donante contra el huésped también
se acompañan de efectos del injerto contra la leucemia (ICL). Weiden
et al., N. Engl. J. Med. 300: 1068 (1979); Weiden et
al., N. Engl. J. Med. 304: 1529-33 (1981);
Weiden et al., Transplantation 13: 248-51
(1981); Barrett et al., Blood 74: 862 (1989); Sullivan et
al., Blood 73:1720 (1989); Horowitz et al., Blood 75:
555 (1990); Slavin et al., Bone Marrow Transplant. 6:
155-61 (1990).
En pacientes sometidos a un TMO alogénico con
depleción de linfocitos T para la prevención de la EICH aparecen
niveles mayores de recidiva comparado con receptores de injertos de
médula en los que no se han eliminado las células T,
independientemente de la severidad de la EICH. Horowitz et
al., Blood 75:555 (1990); Slavin et al., Bone Marrow
Transplant. 6:155-61 (1990); Goldman et al.,
Ann. Inter. Med. 108: 806-14 (1988); Ringden and
Horowitz, Transplant. Proc. 21: 2989-92 (1989);
Goldman et al., Ann. Int. Med. 108: 806 (1988). Asimismo,
los niveles de recidiva en los pacientes con leucemia aguda o
leucemia mieloide crónica reconstituidos con injertos de médula
ósea obtenidos de un gemelo idéntico (injertos singénicos) son
significativamente mayores que en aquellos reconstituidos con
células de médula ósea obtenidas de un hermano de
HLA-idéntico pero no singénico. Ringden and
Horowitz, Transplant. Proc. 21: 2989-92 (1989). De
forma similar, los niveles de recidiva tras el transplante de la
médula del propio paciente (autólogo), aun tras una adecuado purgado
in vitro para la eliminación de células leucémicas
residuales, son significativamente mayores que tras un TMO
alogénico. Armitage, Curr. Opinion in Hematol. 1993:
240-45 (1993). Así, los resultados por debajo del
óptimo obtenidos con un TMO autólogo (TMOA) son similares a los
resultados observados en un transplante de médula singénico. Todos
los datos anteriores sugieren que en término prácticos la EICH o el
potencial de desarrollar EICH se correlaciona con una menor
incidencia de recidiva.
Las células de un donante alogénico pueden
también jugar un papel contra los linfomas, como se demuestra en
modelos animales experimentales, Slavin et al., Cancer
Immunol. Immunother. 11: 155-58 (1981), y en
humanos. Phillips et al., J. Clin. Oncol. 4:
480-88 (1986); Ernst et al., Proc. of the
4th International Conference on Lymphoma, Lugano 1990, sumario #P35;
Chopra et al., J. Clin. Oncol. 10: 1690-95
(1992). Como se demuestra en modelos animales experimentales, los
efectos injerto-contra-tumor (ICT),
de manera similar a los efectos
injerto-contra-leucemia (ICL),
pueden ocurrir tras un TMO, independientemente de la EICH.
Moscovitch and Slavin, J. Immunol. 132: 997-1000
(1984). Como se usa aquí, el ICL es una forma de ICT.
Aunque los mecanismos efectores
anti-leucemia asociados a la EICH pueden ser
beneficiosos en el TMO, la EICH representa uno de los mayores
obstáculos en el TMO alogénico, aun entre hermanos perfectamente
HLA-idénticos. En la mayoría de receptores de TMO
alogénico se desarrolla una EICH aguda, con manifestaciones
clínicas significativas en el 26-64% de los
receptores a pesar de una óptima profilaxis
post-transplante con inmunosupresores. Storb et
al., Blood 73: 1729 (1989). Hasta un 45% de los supervivientes
a largo plazo pueden desarrollar una EICH crónica. Storb et
al., Blood 73: 1729 (1989). No existe una terapia satisfactoria
para los pacientes con una EICH establecida y por lo tanto los
pacientes con manifestaciones severas de las formas aguda o crónica
de la enfermedad tienen tendencia a desarrollar complicaciones
multisistémicas que pueden requerir hospitalizaciones frecuentes,
conduciendo a una calidad de vida pobre y ocasionalmente, a
complicaciones serias o incluso fatales.
La EICH tras un TMO alogénico puede prevenirse
mediante una adecuada eliminación pre-transplante
de linfocitos T, no utilizando profilaxis
post-transplante anti-EICH. Reisner
et al., In: Slavin, S(ed.), Tolerance in Bone Marrow
and Organ Transplantation. Elsevier, Amsterdam (1984), p. 293;
Waldmann et al., Lancet 2: 483-85 (1984);
Slavin et al., Transplant. Proc. 17: 465-67
(1985). TMO sin EICH representa un procedimiento mejor tolerado que
puede necesitar hospitalizaciones más cortas con una evolución
inmediata personal superior tras un TMO alogénico. Además, la
calidad de vida de los supervivientes a largo plazo sin la EICH es
claramente mejor que para aquellos pacientes con EICH severa aguda
o crónica.
Desafortunadamente, las ventajas del TMO
alogénico libre de EICH se contrarrestan con otras complicaciones
serias debidas a efectos adversos de la eliminación de linfocitos
T, como una elevada incidencia de rechazo del injerto, que ocurre
en el 10-30% de los receptores, así como niveles
elevados de recidiva del tumor. Martin et al., Bone Marrow
Transplant. 3: 445 (1988); Kernan et al., Transplantation
43: 842 (1987); Waldmann et al., Lancet 2:
483-85 (1984); Slavin et al., Transplant.
Proc. 17: 465-67 (1985). En consecuencia, no parece
haber una clara evidencia hasta la fecha de un beneficio global
significativo de la prevención de la EICH mediante eliminación de
los linfocitos T.
Claramente, podría ser un avance significativo en
la materia el poder combinar los beneficios de un riesgo mínimo o
controlable de EICH tras un ATMO o un transplante autólogo de
células madre (TACM) con una inducción de la respuesta
injerto-contra-célula maligna que
puede estar asociada con la EICH tras un TMO alogénico.
La presente invención describe la manufactura de
medicamentos adecuados para el tratamiento de pacientes humanos de
cáncer que se han sometido a un procedimiento de reducción de
células malignas en el que se ha realizado un transplante autólogo
de células madre como parte del procedimiento de eliminación. En
otras palabras, los medicamentos de la invención son adecuados para
el tratamiento de aquellos pacientes a los que se les han
reintroducido sus propias células madre para reconstituir su médula
ósea tras una reducción del tumor. En general, estos pacientes se
consideran de riesgo para la recidiva de la enfermedad debido a la
población de células malignas residuales que pueden permanecer en el
paciente tras el proceso de reducción de masa tumoral. Típicamente,
estos pacientes se monitorizan hasta que han recuperado la
hematopoyesis parcialmente pero aun no tienen la inmunidad
completamente reconstituida. En este momento, se puede administrar a
los pacientes un medicamento de la invención. El medicamento de la
invención se utiliza para administrar linfocitos alogénicos de forma
que causa una respuesta
injerto-contra-célula maligna
clínicamente significativa. Más específicamente, la presente
invención está relacionada con la manufactura de un medicamento para
el tratamiento de pacientes humanos de cáncer, de forma que cause
una respuesta ligera o clínicamente significativa
injerto-contra-huésped y carente de
la EICH, siendo habido sometido este paciente a un procedimiento de
reducción de células malignas y posteriormente a un transplante
autólogo de células madre relacionado con este procedimiento de
reducción, estando este paciente en riesgo de recidiva de la
enfermedad debido a una población residual de células malignas que
pueden permanecer viables en dicho paciente tras el mencionado
proceso de reducción, en el que dicho paciente se detecte
parcialmente recuperada la hematopoyesis pero no se encuentre
totalmente reconstituida su inmunidad.
Los linfocitos alogénicos en esta situación son
linfocitos obtenidos de un individuo genéticamente no idéntico al
paciente al que se le infusionan los linfocitos. Los niveles de
células malignas del paciente derivadas de ciertas células malignas
residuales que puedan estar presentes tras el proceso de reducción
original deben monitorizarse. Esta monitorización puede estar
constituida por uno o varios ensayos celulares o moleculares para
detectar o cuantificar células malignas, puede estar constituida por
un programa de monitorización para detectar los signos clínicos de
la recidiva, o una combinación de estos métodos de
monitorización.
Tal como se usa aquí, una respuesta clínicamente
significativa permite, por ejemplo, que se evite una recidiva del
paciente, se prolongue sustancialmente el tiempo de recidiva y por
otro lado genera un estado beneficioso que prolonga
significativamente la vida. Así, la evidencia de una clínicamente
significativa puede incluir, por ejemplo, ausencia o retraso de
recidiva, inducción de una remisión temporal o permanente, evidencia
de una eliminación de enfermedad mínima residual, es decir,
eliminación de marcadores específicos de la enfermedad y, en los
casos en los que corresponda, eliminación de marcadores dirigidos
contra las células específicas del huésped.
En las situaciones en las que los linfocitos
alogénicos no se seleccionan (ver a continuación) para reducir o
eliminar el potencial de EICH de las células, es preferible que se
utilicen linfocitos alogénicos HLA-compatibles. La
presente invención, en un aspecto, proporciona un medicamento que
contiene linfocitos alogénicos HLA-compatibles. Un
tratamiento que utilice linfocitos alogénicos
HLA-compatibles debe comprender la siguiente
secuencia de pasos:
a) el tratamiento del paciente mediante
administración (es decir, infusión) de aproximadamente 10^{7}
células/kg y hasta 10^{9} células/kg de linfocitos
HLA-compatibles;
b) la monitorización de las indicaciones de una
respuesta injerto-contra-células
malignas en el paciente; y
c) en caso de no desarrollarse una respuesta
injerto-contra-células malignas en
el paciente o ser insuficiente, debe aumentarse el tratamiento
realizando al menos uno de los siguientes procedimientos: (1)
administración de un número de linfocitos alogénicos de
HLA-compatible mayor que el número de linfocitos
administrados en el paso (a); (2) administración de un número de
linfocitos alogénicos de HLA-compatible, al menos
tan elevado como el número de linfocitos administrados en el paso
(a), acompañados de la administración in vivo de al menos un
activador de células T al paciente; (3) administración de linfocitos
alogénicos de HLA-compatible activados de un donante
(LAD) al paciente; y (4) administración de LAD alogénicos de
HLA-compatible, acompañado de administración in
vivo de al menos un activador de células T al paciente. Se puede
realizar más de uno de estos procedimientos si no se desarrolla una
respuesta injerto-contra-células
malignas en el paciente o ésta es insuficiente tras el primer o
subsiguientes procedimientos.
El paso (a) anterior puede de forma alternativa
aumentarse mediante la administración concomitante con los
linfocitos alogénicos de al menos un activador de células T al
paciente. Al administrarse el activador de células T directamente al
paciente los linfocitos alogénicos infusionados están expuestos al
activador in vivo.
Los pacientes de cáncer humano pueden tratarse
también utilizando la EICH como marcador clínico. Tras una reducción
de células malignas y un transplante autólogo de células madre, un
paciente puede monitorizarse hasta que éste ha recuperado
parcialmente la hematopoyesis aunque no esté totalmente
reconstituida su inmunidad. Entonces, se le pueden administrar al
paciente linfocitos alogénicos de HLA-compatible, en
un tratamiento que cause una ligera respuesta
injerto-contra-huésped. Entonces se
pueden monitorizar los niveles de células malignas en el paciente
derivadas de alguna célula maligna residual que pueda haber
permanecido tras el proceso de reducción original.
Tal como se utiliza aquí, el término "respuesta
injerto-contra-huésped" incluye,
pero no se limita a los síntomas clásicos de la enfermedad
injerto-contra-huésped (EICH), como
es sabido para aquellos que poseen un conocimiento mínimo de la
materia. Los pacientes con una ligera respuesta
injerto-contra-huésped incluyen
aquellos con, por ejemplo, EICH cutánea de grado I o grado I/II o
otras formas de EICH que cesan antes de la aparición de
manifestaciones severas que conduzcan a complicaciones
multisistémicas serias o fatales. Una respuesta
injerto-contra-huésped ligera puede
incluir también respuestas moleculares o celulares que se
correlacionen con los síntomas clínicos de la EICH o con la
aparición inminente de los síntomas clínicos de la EICH.
Para el método alternativo descrito anteriormente
que involucra una EICH ligera, un tratamiento con administración de
linfocitos de HLA-compatible puede comprender la
siguiente secuencia de pasos:
a) el tratamiento del paciente mediante la
administración de aproximadamente 10^{7} células/kg y hasta
10^{9} células/kg de linfocitos alogénicos de
HLA-compatible;
b) la monitorización de indicaciones de una
respuesta injerto-contra-huésped
ligera en el paciente; y
c) en caso de no desarrollarse una respuesta
injerto-contra-huésped en el
paciente o ser insuficiente, debe aumentarse el tratamiento
realizando al menos uno de los siguientes procedimientos: (1)
administración de un número de linfocitos alogénicos de
HLA-compatible mayor que el número de linfocitos
administrados en el paso (a); (2) administración de un número de
linfocitos alogénicos de HLA-compatible, al menos
tan elevado como el número de linfocitos administrados en el paso
(a), acompañados de la administración in vivo de al menos un
activador de células T al paciente; (3) administración de LAD
alogénicos de HLA-compatible, acompañado de
administración in vivo de al menos un activador de células T
al paciente. Se puede realizar más de uno de estos procedimientos si
no se desarrolla una respuesta
injerto-contra-huésped en el
paciente o ésta es insuficiente tras el primer o subsiguientes
procedimientos.
El paso (a) anterior puede aumentarse mediante la
administración concomitante con los linfocitos alogénicos de al
menos un activador de células T al paciente. Al administrarse el
activador de células T directamente al paciente los linfocitos
alogénicos infusionados están expuestos al activador in
vivo.
Una forma de administración de linfocitos de
HLA-compatible y que involucre una EICH ligera,
puede comprender la siguiente secuencia de pasos:
a) el tratamiento del paciente mediante la
administración de aproximadamente 10^{7} células/kg y hasta
10^{9} células/kg de linfocitos alogénicos de
HLA-compatible, y al menos un activador de células T
al paciente;
b) la monitorización de los signos de una
respuesta injerto-contra-huésped
ligera en el paciente;
c) en caso de no desarrollarse una respuesta
injerto-contra-huésped en el
paciente o ser insuficiente, la administración de aproximadamente
10^{7} células/kg y hasta 10^{9} células/kg de LAD alogénicos de
HLA-compatible, y al menos un activador de células T
al paciente;
d) la monitorización de los signos de una
respuesta injerto-contra-huésped
ligera en el paciente;
Alternativamente, los LAD pueden administrarse en
la infusión inicial. En este caso la forma de administración de
linfocitos de HLA-compatible pueden estar formados
por la siguiente secuencia de pasos:
a) la administración al paciente de
aproximadamente 10^{5} células/kg y hasta 10^{9} células/kg de
linfocitos alogénicos de HLA-compatible, en los que
al menos algunos de los linfocitos alogénicos de
HLA-compatible son LAD, junto con un activador de
células T al paciente;
b) la monitorización de los signos de una
respuesta injerto-contra-huésped
ligera en el paciente;
c) en caso de no desarrollarse una respuesta
injerto-contra-huésped en el
paciente o ser insuficiente, la administración de aproximadamente
10^{5} células/kg y hasta 10^{9} células/kg de LAD alogénicos de
HLA-compatible, y al menos un activador de células T
al paciente;
d) la monitorización de los signos de una
respuesta injerto-contra-huésped
ligera en el paciente;
El activador de células T puede ser cualquier
agente adecuado que active la vía de transducción de señales de las
células T dando lugar a la activación de los linfocitos. La
activación de los linfocitos implica toda una serie de sucesos
interrelacionados descritos, por ejemplo, en Abbas et al.,
Cellular and Molecular Immunology. Segunda Edición, W.B. Saunders
Co. (1994), páginas 153-65. Un activador de células
T puede comprender, sin limitaciones, alguno o más de los
siguientes: interleuquina 1 (IL1), interleuquina 2 (IL2),
interleuquina 4 (IL4), interleuquina 5 (IL5), interleuquina 6 (IL6),
interleuquina 7 (IL7), interleuquina 12 (IL12), interleuquina 13
(1L13), interferón alfa (IFN\alpha), interferón gamma
(IFN\gamma), factor necrosis tumoral (TNF\alpha), un anticuerpo
anti-CD3 o con fragmentos de unión a antígeno del
mismo (anti-CD3), un anticuerpo
anti-CD28 o fragmentos de unión a antígeno del mismo
(anti-CD28), fitohemaglutinina,
concanavalina-A y ésteres de forbol. Cualquiera de
estos activadores puede ser un factor nativo obtenido de fuentes
naturales, un factor producido mediante metodología de DNA
recombinante, un polipéptido sintetizado químicamente u otra
molécula, o cualquier derivado que tenga la actividad funcional de
un factor nativo.
Las células madre utilizadas para un transplante
autólogo de células madre pueden obtenerse de la médula ósea, de la
circulación periférica, o, cuando sea apropiado, de procedencia
fetal como el tejido fetal, la circulación fetal y la sangre de
cordón umbilical. Los pacientes de cáncer que se pueden tratar con
el medicamento de la presente invención son cualquier paciente que
tenga una condición patológica causada por células malignas,
incluyendo leucemia, linfomas, y cáncer de mama sin
limitaciones.
En una presentación alternativa, los linfocitos
alogénicos que se usan en la presente invención se seleccionan para
obtener una actividad
injerto-contra-huésped
sustancialmente reducida comparado con la de los linfocitos sin
seleccionar. Preferiblemente los linfocitos seleccionados son
linfocitos CD8+. En los casos en los que se usan linfocitos
seleccionados que tienen una actividad
injerto-contra-huésped
sustancialmente reducida, los linfocitos pueden ser tanto de HLA
compatible como de HLA-incompatible con el paciente.
En una infusión inicial de linfocitos de
HLA-incompatible, por ejemplo linfocitos CD8+ de
HLA-incompatible, pueden administrarse tan pocas
células como 10^{5} y hasta tantas como 10^{9} células.
La presente invención también incluye el uso de
un activador de células T en la manufactura del medicamento, siendo
el medicamento para la administración de forma concomitante con un
medicamento que contiene linfocitos alogénicos, para el tratamiento
de pacientes de cáncer humano, en los que el paciente ha sido
sometido a un procedimiento de reducción de células malignas y con
posterioridad se ha sometido a un transplante autólogo de células
madre relacionado con el procedimiento de reducción. Como
anteriormente, el paciente tiene riesgo de recidiva de la enfermedad
debido a la población de células malignas residuales que pueden
permanecer viables en el paciente tras el procedimiento de
reducción. El tratamiento de este paciente implica uno o más de los
métodos de alo-CMI y/o alo-CCI como
se ha descrito anteriormente.
En consecuencia, puede generarse un artículo
manufacturado que comprenda material empaquetado y un contenedor con
el material empaquetado, en el que una etiqueta o inserto en el
paquete indique que el contenido del material empaquetado puede
usarse en cualquiera de los métodos descritos anteriormente para el
tratamiento de un paciente de cáncer humano. Preferiblemente, el
contenedor que se incluya en el material empaquetado debe ser un
contenedor colapsable (pej., una bolsa de plástico) que contenga
paredes opuestas de un material flexible y un tubo flexible (pej.,
un tubo de plástico) que sobresalga del contenedor. El contenedor
puede contener un activador de células T. Preferiblemente el tubo
debe estar adaptado para recibir linfocitos alogénicos (es decir,
alogénico para un paciente a tratar) en el contenedor. Si un
activador de células T está presente en el contenedor, los
linfocitos entrantes se activan. Estos LDA pueden entonces
utilizarse para tratar a un paciente de cáncer de acuerdo con los
métodos descritos con anterioridad.
La Figura 1 representa los resultados de la
transferencia de células de bazo obtenidas de ratones F1 tras una
irradiación letal y transplantados con 10^{7} células singénicas
de médula ósea y 10^{5} células BCL1 además de
20-30 x 10^{6} LSP de ratones alogénicos con (A,
n=40) o sin (B, n=40) un tratamiento concomitante in vivo con
IL2rh (12 x 10^{4} UI x 2/día durante 5 días IP). Un grupo similar
recibió LSP singénicos (F1) administrados con (C, n=20) o sin (D,
n=20) IL2rh. Un grupo control recibió la transferencia de células de
bazo obtenidas de 10 receptores F1 no tratados (E, n=20).
La Figura 2 representa los resultados de la
transferencia de células de bazo obtenidas de ratones F1 tras una
irradiación letal reconstituidos con 10^{7} células singénicas de
médula ósea mezcladas con 10^{5} células BCL1. La inmunoterapia
mediada por células consistió en la administración intravenosa de
números crecientes de células de bazo C57BL/6: 1 x 10^{6} (A,
n=10); 3 x 10^{6} (B, n=10); 10 x 10^{6} (C, n=10) y 30 x
10^{6} (D, n=10). Se muestra uno de tres experimentos.
La Figura 3 representa los resultados de la
transferencia de células de bazo obtenidas de ratones BALB/c
tratados con ciclofosfamida (300 mg/kg IP), inoculadas 24 horas
después con 10^{3} células BCL1, y recibiendo un día después 4 x
10^{6} células singénicas de médula ósea tratados con ASTAZ. La
inmunoterapia consistió en una mezcla de 20 x 10^{6} células
C57BL/6 alogénicas de bazo y nódulo linfático tanto con (A, n=6)
como sin (B, n=6) tratamiento de IL2rh in vivo (12 x 10^{4}
UI x 3 /día durante 3 días IP). Los receptores de una mezcla de 20 x
10^{6} células singénicas BALB/c de bazo y nódulo linfático
tratados con IL2rh (C, n=7) y los receptores de 10^{3} células
BCL1 solamente (D, n=10) sirvieron como controles.
La Figura 4 representa los resultados de la
transferencia de células de bazo obtenidas de ratones F1 tras una
irradiación letal inoculados con 10^{5} células BCL1 y 30 x
10^{6} células de médula ósea pre-activadas in
vitro durante 4 días con IL2rh; ratones sin un tratamiento
adicional (A, n=33), ratones con tratamiento de IL2rh in vivo
(12 x 10^{4} UI x 2/día durante 5 días IP) (B, n=25); controles:
receptores de 10^{5} células de bazo obtenidas de ratones control
no tratados inoculados con 10^{5} células BCL1 (C, n=30).
La Figura 5 muestra fotografías de escaneos de
tomografía computerizada (TC) de un paciente de cáncer de mama. El
Panel A muestra la presencia de metástasis del cáncer de mama
(flechas) en el hígado antes de Alo-CMI/CCI. La
imagen de TC en el Panel B no revela las metástasis en el hígado en
el mismo paciente después de haberse administrado un régimen de
Alo-CMI/CCI.
La Figura 6 representa los resultados de la
transferencia de células de bazo obtenidas de ratones F1 tras una
irradiación letal inoculados 10^{5} células BCL1. Los ratones
irradiados recibieron células T alogénicas no seleccionadas o
poblaciones de células T seleccionadas de células CD4+ o CD8+; los
ratones control recibieron linfocitos T singénicos (Fl). A = células
C57 de bazo no seleccionadas; B = células CD8+, es decir, células de
bazo tratadas con un anticuerpo que elimina la población celular de
células CD4+; C = células CD4+, es decir, células de bazo tratadas
con un anticuerpo que elimina la población celular de células CD8+;
D = células de bazo control (Fl).no seleccionadas
La Figura 7 representa los resultados de la
transferencia de células del bazo obtenidas de ratones F1 irradiados
inoculados 10^{5} células BCL1. Los ratones irradiados recibieron
células T alogénicas no seleccionadas o poblaciones de células T
seleccionadas de células CD4+ o CD8+; los ratones control recibieron
linfocitos T singénicos (Fl). Las células se administraron como LAD
en conjunto con la administración in vivo de IL2r. A = LDA
C57 no seleccionados administrados sin IL2r in vivo
concomitante; B = LDA C57 no seleccionados con IL2r in vivo;
C = LAD CD8+, es decir, LAD tratados con un anticuerpo que elimina
la población celular de células CD4+, más IL2r in vivo; D =
LAD CD4+, es decir, LAD tratados con un anticuerpo que elimina la
población celular de células CD8+, más IL2r in vivo.
El presente inventor ha empleado linfocitos
alogénicos de sangre periférica, solos o en combinación con
tratamiento un activador de células T in vivo, o in
vitro, para la correcta eliminación de enfermedad residual
mínima tras la quimioterapia y/o radioterapia. El sistema de
tratamiento apropiado se ha definido mediante estudios en
laboratorios animales, y los protocolos de tratamiento se han
extendido posteriormente a pacientes humanos con alto riesgo de
recidiva de la enfermedad.
Una línea de células B murinas espontáneas y
transplantables con origen en una leucemia/linfoma BALB (BCL1) se
utilizó para investigar la eliminación de enfermedad mínima residual
(EMR) tras un transplante de médula ósea. Como se utiliza aquí, la
EMR se refiere a una condición en la que células residuales malignas
permanecen viables en un paciente tras un proceso de reducción de un
tumor primario y/o metastático. El procedimiento de reducción puede
comprender cualquier protocolo que elimine o destruya células
tumorales, incluyendo sin limitación la eliminación quirúrgica, la
quimioterapia o radioterapia, o cualquier combinación de estas
aproximaciones. Este tratamiento elimina un porción significativa de
células malignas del paciente, pero puede dejar un número
clínicamente significativo de células residuales malignas que ponen
al paciente en riesgo de recidiva. El término "tumor" como se
usa aquí incluye todas las situaciones patológicas que involucren
células malignas; esto puede incluir tumores "sólidos" que se
generan en tejidos sólidos así como tumores "líquidos" como las
leucemias y los linfomas que derivan de la transformación maligna de
células hematopoyéticas.
En los transplantes autólogos de médula ósea
(TAMO) con pacientes humanos, un individuo recibe sus propias
células de médula ósea mediante infusión tras un procedimiento de
reducción del tumor. Generalmente, las células de médula ósea se
toman del paciente y se conservan, por ejemplo por criopreservación,
previamente al procedimiento de reducción. El TAMO permite el uso de
un tratamiento que de otro modo sería letal, p.ej. la quimioteapia o
radioterapia que dañan seriamente o destruye la médula ósea del
paciente. Tras el procedimiento de reducción, la médula ósea del
paciente es reconstituida mediante las células madre presentes en la
muestra de médula ósea preservada.
Las células madre capaces de reconstituir el
sistema inmune de un paciente pueden obtenerse no solo por
extracción directa de la médula ósea, sino también de la circulación
periférica del paciente tras la movilización de estas células desde
la médula ósea. Esto puede conseguirse mediante el tratamiento del
paciente con factor estimulador de colonias de granulocitos
(FSC-G) u otros factores apropiados que induzcan el
movimiento de células madre de la médula ósea hasta la circulación
periférica. Tras la movilización, las células madre pueden recogerse
desde la sangre periférica mediante cualquier técnica de aféresis
apropiada, por ejemplo a través del uso de cualquier aparato de
recolección de células sanguíneas disponible comercialmente como por
ejemplo el CS 3000® Plus comercializado por la división Fenwal de
Baxter Healthcare Corporation. Los métodos para realizar aféresis
con el aparato CS 3000® Plus se describen en Williams et al.,
Bone Marrow Transplantation 5: 129-33 (1990) y
Hillyer et al., Transfusion 33: 316-21
(1993), ambas publicaciones incorporadas aquí como referencia. Las
células madre recogidas desde la sangre periférica se denominan aquí
"células madre de sangre periférica" (CMSP). El término
"transplante autólogo de células madre" (TACM) se usa aquí para
referirse a cualquier infusión a un paciente de sus propias células
madre, derivadas de cualquier fuente apropiada (es decir, médula
ósea o circulación periférica). Como esto, el TAMO, en el que las
células autólogas infusionadas se extraen directamente de la médula
ósea de los pacientes, pueden considerarse simplemente como una
forma de TACM.
Es posible generar un sistema experimental en
ratones que simula el TACM en humanos. Esto se consigue mediante el
uso de donantes y receptores de células madre derivados de una
estirpe singénica de ratones. En estas estirpes, la endogamia crea
una situación en la que, desde el punto de vista practico, los
ratones de la estirpe son genéticamente idénticos entre ellos. Estos
ratones aceptan tejidos y órganos transplantados entre individuos
sin evidencias de rechazo inmune, de una manera análoga a la
aceptación de las células propias de un paciente tras un TACM. El
transplante de células madre derivadas de médula ósea entre estos
ratones se denomina aquí "transplante singénico de médula ósea"
(TSMO) y puede considerarse análogo al TAMO y al TACM en
humanos.
En los presentes experimentos, los ratones
recibieron una dosis letal de irradiación corporal total (ICT) o,
alternativamente, una dosis letal de ciclofosfamida administrada
intraperitonealmente. Las células de médula ósea (CMO) se extrajeron
directamente de la médula ósea de ratones singénicos. En algunos
casos, estas preparaciones de CMO se trataron con mafosfamida
(ASTA-Z) para simular un proceso de purgado en el
que las células madre del paciente, previamente al TACM, son
tratadas para eliminar o destruir al menos una parte de cualquier
células maligna contaminante. Un día después de la irradiación o del
tratamiento con ciclofosfamida, los ratones recibieron 10^{7}
células de médula ósea singénica mediante infusión en la vena
después al de la cola. Para simular EMR, se añadieron 10^{5}
células tumorales BCL1 a las CMO singénicas antes de TSMO.
Tras TSMO, los ratones receptores recibieron
inmunoterapia alogénica mediada por células
(alo-CMI) o inmunoterapia alogénica activada
citoquinas mediada por células (alo-CCI). La
alo-CMI involucra la transferencia de linfocitos
alogénicos inmunocompetentes (es decir, linfocitos de una estirpe de
ratones diferente de la de los ratones receptores) en varios tiempos
y en varias dosis, administradas post-TSMO.
Generalmente estos linfocitos representan linfocitos de sangre
periférica (LSP) o mezclas de donantes de células de bazo y células
de nódulos linfáticos. El alo-CCI involucra la
transferencia de linfocitos alogénicos pre-activados
in vitro con interleuquina 2 recombinante humana (IL2rh).
Tal como se usa aquí, el término "LAD" se refiere a tales
"linfocitos activados de donante", es decir, linfocitos
(humanos o de ratón) activados in vitro con un activador de
células T tales como la IL2rh. En algunos protocolos experimentales,
el régimen de Alo-CMI o el Alo-CCI
se acompañó de administración simultánea in vivo, de IL2rh a
los ratones receptores, para poder facilitar la activación adicional
de los linfocitos infusionados in vivo.
El hecho de que los receptores primarios no
desarrollaran leucemia no prueba la eliminación de todas las células
BCL1, ya que la supresión activa de las células tumorales existentes
puede prevenir el desarrollo de enfermedad aparente en estos
animales. Esto ha sido documentado tras TMO alogénico y terapia con
IL2rh. Slavin et al., Cancer Immunol. Immunother. 11:155
(1981); Slavin et al., Nat. Immun. Cell Growth Regul. 7:180
(1988). Para establecer evidencias concluyentes de la erradicación
de las células malignas residuales, las células de bazo de los
ratones tratados, o receptores, se transfirieron adoptivamente a
receptores singénicos secundarios. Si estos receptores secundarios
no desarrollan leucemia, se juzgará que los ratones originales
tratados con Alo-CMI o Alo-CCI
estaban libres de células malignas viables, ya que se ha demostrado
que tan solo 1-10 células son capaces de causar la
enfermedad. Slavin et al., Cancer Res. 41:4162 (1981); Cohen
et al., J. Immunol. 151: 4803-10 (1993).
Los resultados de los experimentos de TSMO con
ratones sugirieron que la inmunoterapia efectiva de la EMR puede
alcanzarse in vivo mediante una terapia celular con
linfocitos aloreactivos a través de un efecto que puede ser
potenciado in vivo con una pequeña serie de dosis intermedias
de IL2rh. Los efectos similares al ICL también se indujeron mediante
infusión de LAD sin causar ningún deterioro general de la capacidad
hematopoyética de las CMO en los receptores irradiados letalmente.
Además, los efectos ICL inducidos por los linfocitos alogénicos así
como los LAD también pueden potenciarse mediante terapia
concomitante de IL2rh in vivo, más probablemente debido a la
activación continua in vivo de las células alogénicas
efectoras contra células malignas residuales en el huésped.
Los datos además indicaron que la erradicación de
BCL1 puede llevarse a cabo antes de que las manifestaciones clínicas
de la EICH en los receptores primarios sean evidentes, ya que los
experimentos mostraron que los efectos similares a un ICL contra las
células BCL1 se alcanzaron en 1-2 semanas tras la
administración de los linfocitos alogénicos. Esto implica que el
injerto temporal de las células alogénicas efectoras puede ser
suficiente para inducir los efectos beneficiosos de ICL contra EMR,
sin la necesidad de la residencia permanente de células alogénicas
efectoras, que pueden poner al paciente en riesgo de EICH grave a
través de las barreras de la histocompatibilidad mayor. Además, como
el intervalo de tiempo entre TACM y el tratamiento de
alo-CMI/CCI aumenta, gran número de donantes de LSP
pueden ser administrados con menor probabilidad de una EICH grave.
Slavin et al., J. Exp. Med. 147:963 (1978); Slavin et
al., Blood 80:535a (1992).
Así, es preferible que un régimen
alo-CMI o alo-CCI comience solo
después de que el paciente esté parcialmente recuperado
hematopoyéticamente siguiendo el procedimiento original de reducción
de tumor/TACM. Esto aumenta la probabilidad de que el inóculo
alogénico sea rechazado mediante la reconstitución de las células
inmunitarias del huésped en el tiempo debido, tras haberse logrado
los efectos de ICT (pej., ICL). Por otro lado, también se prefiere
que el régimen de alo-CMI/alo-CCI se
emprenda antes de la completa reconstitución inmune del paciente, ya
que la probabilidad de rechazo prematuro del inóculo alogénico,
antes de los efectos beneficiosos de ICL/ICT, son reducidos por esta
razón. Ya que la completa reconstitución inmune tras un TACM en
humanos frecuentemente requiere hasta un año, el paciente puede ser
monitorizado hasta alcanzar una condición clínica estable (pej., una
situación de contajes sanguíneos estabilizados), tal como se indica
para niveles aceptables de, por ejemplo, glóbulos blancos (GB),
hemoglobina (Hb) y plaquetas. Este estado de recuperación parcial de
la hematopoyesis puede alcanzarse comenzando en cuestión de semanas
tras el TACM en humanos, bastante antes de que la completa
reconstitución inmune disminuya la probabilidad de éxito del
alo-CMI y/o alo-CCI.
Las estrategias de alo-CMI y
alo-CCI desarrolladas en ratones se han adaptado a
pacientes humanos en una variedad de protocolos llevados a cabo por
el presente inventor en el tratamiento de pacientes de cáncer con
alto riesgo de recidiva de la enfermedad. Los pacientes de cáncer
con leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas
no-Hodgkin y cáncer metastático de mama se han
tratado con los métodos de la presente invención.
A dos de los pacientes de leucemia mieloide aguda
tratados tempranamente se les administraron números relativamente
bajos (pej., alrededor de 10^{4} células/kg) de linfocitos
alogénicos de sangre periférica como primer dosis, en un esfuerzo
por minimizar el riesgo de EICH seria. Posteriormente, se administró
a los pacientes números crecientes de linfocitos alogénicos de
sangre periférica en varios intervalos de tiempo para aumentar las
posibilidades de respuesta clínicamente significativa
injerto-contra células malignas. Ambos pacientes
(pacientes 1 y 2 en el Ejemplo 2, detallado a continuación)
sufrieron una recidiva y murieron. Tras este resultado, se hizo
aparente que la administración de LSP con incrementos graduales,
empezando por dosis relativamente bajas, podían no ser
efectivas.
En retrospectiva, se puede hipotetizar que una
dosis baja inicial de LSP alogénicos produjo solo inmunización sin
una EICH significativa o una respuesta
injerto-contra célula maligna. Así, después, dosis
mayores de LSP alogénicos, que de otro modo deberían ser efectivos,
podrían ser rápidamente rechazados por paciente y rendir una
actividad inefectiva de
injerto-contra-células malignas. Por
consiguiente, en los casos subsiguientes, se administraron más
células (pej., al menos aproximadamente 10^{7} células/kg) en la
dosis inicial. Con esta mayor dosis inicial de células alogénicas
tras el TCMA, se obtuvieron resultados satisfactorios en muchos
pacientes con la población tratada hasta la fecha.
Si se usan linfocitos alogénicos de antígeno
leucocitario humano (HLA)-compatible en los
presentes procedimientos, preferiblemente estas células serán
totalmente idénticas con el HLA del paciente. Alternativamente, las
células alogénicas de HLA-compatible deben ser al
menos haploidénticas con el paciente. Así, si las células alogénicas
son derivadas de un hermano del paciente, puede tolerarse una cierta
desigualdad. Por ejemplo, las células alogénicas de
HLA-compatible pueden, en algunos casos, ser de un
solo locus de HLA desemparejado como se demuestra con el paciente
No. 12 descrito el Ejemplo 2 a continuación. Si las células
alogénicas eran derivadas de un individuo no relacionado,
preferiblemente las células serán de HLA totalmente idéntico con el
paciente.
Preferiblemente, una dosis inicial de al menos
aproximadamente 10^{7} linfocitos alogénicos de
HLA-compatible/kg se administran una vez que el
paciente ha alcanzado un situación clínicamente estable (pej.,
contajes sanguíneos estabilizados), es decir, una vez el paciente
haya recuperado parcialmente la hematopoyesis. Preferiblemente,
también se le administrará al paciente un activador de células T
in vivo, concomitante con la administración de los linfocitos
de HLA-compatible. Preferiblemente el activador de
células T es interleuquina 2 humana producida mediante tecnología de
DNA recombinante (IL2rh) a una dosis de aproximadamente 6 x 10^{6}
UI de IL2rh/m^{2}/día, por inyección subcutánea, empezando el
mismo día que la infusión de linfocitos alogénicos. Otros
activadores apropiados de la transducción de señales de las células
T como se detallan con anterioridad pueden usarse, tanto con como
sin IL2rh, tanto tiempo como sea necesario para obtener la
activación deseada.
Si no se consigue desarrollar una EICH en un
paciente al que se ha administrado los anteriormente descritos
números de linfocitos alogénicos de HLA-compatible
con un activador de células T in vivo concomitante, entonces
el sistema de tratamiento se escala. Preferiblemente esto se realiza
con la administración de una segunda dosis de linfocitos alogénicos
de HLA compatible preactivados in vitro con un activador de
células T. Preferiblemente el activador de células T es una
citoquina como la IL2rh, aunque, de nuevo, otros activadores de la
transducción de señales de las células T pueden usarse tanto con o
sin IL2rh.
Previamente a la administración de la segunda
dosis de células que comprenden LAD, y dependiendo del estado
particular de cada paciente, puede administrársele al paciente
ciclofosfamida (Cytoxan) u otros inmunosupresores apropiados para
evitar el rechazo de la segunda dosis de células. Esto es, el
inmunosupresor se da en una dosis efectiva para matar o inactivar
las T células del huésped que podrían de otro modo operar para
rechazar el segundo inoculo alogénico; el inmunosupresor puede ser
el beneficio adicional de eliminar las potenciales funciones de las
células supresoras del huésped que pueden interferir con los a
efectos ICT de los LDA infusionados. Preferiblemente, el activador
de células T in vivo se administra al paciente
concomitantemente con la segunda dosis de células alogénicas.
Debe entenderse que cualquier combinación de
linfocitos alogénicos, activador de células T in vivo y/o LDA
queda cubierta por la presente invención, cuando la dosis inicial de
células corresponde a un número de linfocitos alogénicos de
HLA-compatible que provoque una respuesta del
huésped más allá de la mera inmunización a una segunda dosis de
células del mismo donante o uno similar. Generalmente, esta dosis
inicial es al menos aproximadamente 10^{7} linfocitos alogénicos
de sangre periférica/kg. De todos modos, es posible que una dosis
menor de células, pej., aproximadamente 10^{5} células/kg, pueda
usarse si, por ejemplo, se usaran LAD en una infusión inicial.
Entre tratamientos alo-CMI/CCI o
al finalizar el régimen alo-CMI/CCI, deben
monitorizarse los niveles de malignas células del paciente, es
decir, la evidencia de enfermedad mínima residual. Esta
monitorización debe comprender un seguimiento de los signos de
recidiva en el paciente. La monitorización puede incluir también,
cuando sea apropiado, varios ensayos moleculares o celulares para
detectar o cuantificar cualquier célula maligna residual. Por
ejemplo, en los casos de donantes y receptores de sexo no idéntico,
las células residuales derivadas del huésped pueden detectarse
mediante el uso de marcadores sexuales apropiados como ácidos
nucleicos cebadores o sondas específicos del cromosoma Y. En casos
de incompatibilidad de un único locus de HLA entre donantes y
receptores, las células residuales del huésped pueden documentarse
mediante el análisis de los loci de clase I o clase II que difieren
entre donante y recipiente con una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Alternativamente, pueden utilizarse marcadores
moleculares apropiados específicos de las células tumorales. Por
ejemplo, ácidos nucleicos cebadores y/o sondas específicas para la
translocación bcr/abl en la leucemia mieloide crónica, para otros
oncogenes activos en varios tumores, para genes supresores de
tumores inactivados, otros genes específicos de tumores, o cualquier
otro reactivo de ensayo que se sabe específico de las células
tumorales, pueden utilizarse. Cualquiera de estos procedimientos u
otros funcionalmente comparables pueden usarse para monitorizar la
evidencia de células residuales malignas en el paciente.
En circunstancias normales, los receptores de
transplantes de médula ósea autólogos o alogénicos reciben solo
productos sanguíneos irradiados cuando el paciente los requiere.
Estos productos son irradiados para evitar la posibilidad de injerto
de linfocitos T inmunocompetentes derivados del producto sanguíneo
del donante (pej., plaquetas o glóbulos rojos). En la mayoría de
instituciones, los productos sanguíneos irradiados se usan también
en pacientes que reciben dosis elevadas de quimioterapia
convencional sin transplante, pej., los productos sanguíneos
suministrados tras la inducción de remisión en los pacientes de
leucemia y linfoma. Obviamente, las posibilidades de injerto de
linfocitos T inmunocompetentes de productos sanguíneos no idénticos
es relativamente baja en circunstancias normales. De todos modos, si
la inmunosupresión es suficiente para permitir un injerto, la EICH
puede ser "violenta" y letal.
Los linfocitos no irradiados de tipo como el
donante pueden usarse intencionadamente para inducir efectos
injerto-contra-células malignas. El
método se estructura para producir un injerto transitorio, como para
inducir los efectos
injerto-contra-células malignas que
pueden venir acompañados por una EICH ligera. Como las células del
donante que se usan son de HLA-compatible con el
recipiente, las posibilidades de injerto son mayores que si las
células del donante no fueran funcionalmente idénticas con el
complejo mayor de histocompatibilidad del paciente. Más aun, las
posibilidades de rechazo inmediato por un lado y de EICH letal por
el otro son relativamente bajas a causa de la compatibilidad del
HLA. Así, los protocolos de Alo-CMI/CCI proporcionan
la posibilidad de un transitorio injerto de los LSP del donante con
una ICT efectiva y con una posibilidad mínima de inducción de EICH
severa.
Alternativamente, pueden seleccionarse subgrupos
de células T que retienen una actividad ICT pero que tienen una
capacidad reducida o nula de inducir EICH. El uso de linfocitos
alogénicos de HLA-compatible no se requiere. Así,
aunque puede ser deseable en algunas circunstancias utilizar
linfocitos de HLA-compatible, en otros casos es
permisible que exista una incompatibilidad en uno o más loci
(linfocitos de HLA-no idéntico). Esto es a causa de
que el uso de subgrupos de células T con potencial de EICH limitado
permite que la EICH se minimice incluso si los linfocitos
infusionados no son de HLA compatible con el paciente. De hecho, el
potencial ICT se potencia mediante el uso de linfocitos alogénicos
de HLA no idéntico.
Para la selección de un subgrupo apropiado de
células T, el presente inventor ha establecido que los linfocitos T
CD8+ representan las células efectoras de la respuesta de ICT. Los
experimentos que establecen este hallazgo se detallan en el Ejemplo
4 a continuación. La capacidad de las células CD8+ para inducir la
EICH es reducida en comparación con las de células T no
seleccionadas. Así, las células CD8+ representan un subgrupo útil de
células T para su uso en el ámbito clínico, ya que el riesgo de EICH
es reducido aunque se mantiene una actividad ICT significativa. El
término "seleccionado" tal como aquí se usa significa el uso de
cualquier procedimiento que proporcione una población de células T
relativamente enriquecida para el subgrupo de células T deseado.
Esto puede incluir, por ejemplo, la selección positiva para células
CD8+, o la eliminación o reducción de las células CD4+ dejando una
población correspondientemente enriquecida para las células CD8+
comparado con una población no seleccionada.
La invención se entenderá mejor en referencia a
los siguientes usos ilustrativos, que son puramente ejemplares, y no
deben tomarse como limitantes del alcance real de la presente
invención como se describe en las reivindicaciones.
A. Ratones: Ratones BALB/c (BALB), C57BL/6
(C57), y (BALB/c x C57BL/6)F1 (Fl), de 2-6
meses de edad, se adquirieron de la colonia reproductiva de la
Hebrew University-Hadassah Medical School,
Jerusalem. Los ratones se mantuvieron bajo condiciones estándar, con
agua acídica (PH 2,7) y sin medidas protectoras especiales. A los
ratones se les administró sulfato de neomicina 0,5% en su agua de
beber durante 2 semanas post-transplante.
B. Células B de leucemia murina (BCL1):
BLC1, una línea de células B de leucemia/linfomas, espontánea,
transplantable, de origen BALB se caracteriza por una marcada
(aumento de 50 veces) esplenomegalia, acompañada de linfocitosis
extrema en sangre periférica (>200,00/mm^{3}) y resulta en la
muerte de todos los ratones inoculados con
>10-100 células tumorales. Slavin et al.,
Nature 272:624 (1978); Slavin et al., Cancer Res. 41:4162
(1981). BCL1 se mantuvo in vivo en ratones BALB mediante pase
IV de 10^{6}-10^{7} linfocitos de sangre
periférica (LSP) obtenidos de ratones que tienen el tumor. Los
ratones con linfocitosis marcada en la sangre se usaron
subsiguientemente como donantes de células BCL1 para los ratones
experimentales. Los contajes de LSP para todos los grupos
experimentales se llevaron a cabo semanalmente. La leucemia se
definió como contajes de LSP superiores a 20.000/mm^{3}. En el
pico de enfermedad, los contajes de LSP normalmente alcanzaban
>100.000/mm^{3}.
C. Mafosfamida (ASTA-Z).
ASTA-Z fue amablemente proporcionado por los Dr. M.
Peukert y H. Sindermann (Astawerke, Bielefeld, Alemania) como polvo
liofilizado y se disolvió en salina fresca antes de su uso.
ASTA-Z se ha utilizado in vitro para reducir
o eliminar poblaciones celulares malignas de preparaciones de médula
ósea. Douay et al., CR Acad. Sci. Paris t. 301, Ser III, no.
6:303 (1985).
Los ratones se expusieron a una única dosis de
750 cGy de irradiación total corporal (ITC) desde una unidad de
rayos X Philips (250 kV 20 mA) con un foco con una distancia a la
piel de 70 cm a una proporción de dosis de 60 cGy/min.
Alternativamente, los ratones se condicionaron con ciclofosfamida
recién disuelta (CY) (300 mg/kg) (Taro, Israel) administrada
intraperitonealmente (IP). Veinticuatro horas después, los ratones
recibieron 10^{7} células singénicas de médula vía la vena lateral
de la cola.
E. Preparación de células de médula ósea
(CMO). Las CMO se obtuvieron de fémures, tibias y húmeros de
ratones singénicos. Células mononucleares que contenían 10^{7} CMO
en 0,25 ml de medio de Hank se inyectaron en la vena después al de
la cola de los recetores 24 horas
post-radiación.
F. Procedimiento de purgado. Las células
se resuspendieron a una concentración de 20x10^{6} células/ml en
medio de Hank que contiene un 4% de albúmina sérica humana. Entonces
se añadió ASTA-Z hasta una concentración final de
100 \mug/ml. Tanto las células control no tratadas como las CMO
tratadas con ASTA-Z se incubaron a 37ºC durante 30
minutos, se lavaron dos veces en medio de Hank y se contaron. Las
CMO purgadas o no purgadas (4x10^{6}) se inyectaron en ratones
BALB acondicionados con CY.
G. Interleuquina-2
Recombinante Humana (IL2rh). La IL2rh se proporcionó como 1 mg
de Proleuquina (3x10^{6} Unidades Cetus, equivalente a 18 x
10^{6} unidades internacionales) y fue amablemente cedida por el
Dr. S.L. Aukerman, Cetus/Chiron, CA, USA. La IL2rh se diluyó
inicialmente con agua para inyección y subsecuentemente rediluida
con dextrosa al 5%. Las unidades internacionales (UI) se utilizan a
lo largo del resto de la presente solicitud.
H. Activación de las CMO mediante IL2rh.
Las CMO se cultivaron en frascos de 225 cm^{3} (Corning
25160-225, Corning Glass, Corning NY) en medio RPMI
1640 (Beit Haemek, Israel) que contenía L-glutamina,
aminoácidos no esenciales, piruvato, suero de cría bovina al 10%
(SCB) y IL2rh (6.000 UI/ml) durante 4 días en un incubador
humidificado con 5% de CO_{2} a 37ºC. Tras el crecimiento, se
determinó la viabilidad con el método de exclusión de azul
tripano.
I. Simulación de enfermedad mínima residual
tras un transplante singénico de médula ósea. Para simular una
enfermedad mínima residual (EMR) cuantitativamente, 10^{5} células
BCL1 se añadieron al inóculo de médula durante el transplante
singénico de médula ósea (TSMO), antes de la inmunoterapia.
J. Inmunoterapia mediante linfocitos
alogénicos inmunocompetentes. La inmunoterapia mediada por
células alogénicas (Alo-CMI) consistió en una
transferencia adoptiva de linfocitos alogénicos inmunocompetentes
(LSP o una mezcla de células de bazo y nódulo linfático del donante)
como se detalla para cada experimento en el apartado de resultados,
a continuación. La inmunoterapia mediadas por células alogénicas
activada por citoquinas (Alo-CCI) consistió en la
transferencia adoptiva de linfocitos alogénicos
pre-activados in vitro con un activador de
células T (linfocitos activados de donante, o "LAD"). En este
Ejemplo, un activador de células T comprende la IL2rh. En algunos
experimentos la infusión de linfocitos alogénicos se continuó con la
subsiguiente activación in vivo con IL2rh, mediante
Alo-CMI adicional con IL2rh in vivo, o
mediante una Alo-CCI adicional con IL2rh in
vivo, respectivamente.
K. Detección de BCL1 clonogénicas residuales
con experimentos de transferencia adoptiva. Para determinar si
las células BCL1 residuales estaban presentes tras varios
tratamientos, 10^{5} células de bazo obtenidas de ratones tratados
se transfirieron adoptivamente a receptores secundarios singénicos
no tratados (BALB). La ausencia de leucemia (2100 días) en los
receptores secundarios indicó la eliminación de BCL1 ya que se había
demostrado que tan solo 1-10 células eran capaces de
causar enfermedad.
L. Análisis estadístico. La significación
de las diferencias entre los ratones tratados y no tratados se
calculó con el test estadístico independiente t.
A. Inducción de los efectos de
alo-CMI y alo-CCI. Los ratones
F1 se irradiaron letalmente (750 cGy) y se transplantaron con
10^{7} CMO singénicas. Tras la inoculación de 10^{5} células
BCL1 para simular EMR, diferentes números de LSP C57 se
administraron intravenosas para inducir efectos parecidos al ICL a
través de alo-CMI. Para detectar la eficacia de la
alo-CMI en la erradicación de células BCL1
residuales, alícuotas de 10^{5} células del bazo recogidas de
2-3 ratones experimentales se transfirieron
adoptivamente a receptores secundarios BALB normales, una o dos
semanas post-TSMO.
La Figura 1 resume los resultados obtenidos de
tres experimentos diferentes en un total de 120 ratones. La
inyección de 20-30x10^{6} LSP, obtenidas de
ratones C57 para inducir alo-CMI tras un TSMO en
receptores F1, eliminaron efectivamente las células residuales BCL1,
ya que ninguno de los 40 receptores BALB secundarios adoptivos
desarrolló leucemia (>180 días). Por lo contrario, se desarrolló
leucemia en los 20 receptores secundarios BALB inoculados con
10^{5} células del bazo obtenidas de receptores F1 que habían
recibido 20-30x10^{6} LSP de donantes singénicos
post-TSMO. La adición de IL2rh (12x10^{4} UI
x2/día durante 5 días IP) post-transplante no
mejoró la supervivencia libre de enfermedad de los receptores
secundarios de 10^{5} células del bazo (obtenidas de ratones F1
tratados de forma similar) ya que los 20 ratones BALB recipientes
secundarios desarrollaron leucemia (Figura 1). La adición de IL2rh
in vivo en la misma dosis a los receptores de 20x10^{6}LSP
alogénicos para su posterior activación in vivo de las
células efectoras no indujo efectos ICL adicionales medibles ya que
los 40 receptores BALB secundarios se mantuvieron libres de
enfermedad (>180 días) (Figura 1).
B. Efecto cuantitativo del número de células
efectoras en la eficacia de la alo-CMI. Los
efectos anti-leucémicos mediados por la
alo-CMI fueron dependientes de la dosis celular.
Como se muestra en la Figura 2, todos los receptores de TSMO
inyectados con 30x10^{6} células C57 del bazo resistieron
completamente al desarrollo de leucemia tras la inoculación de
10^{5} células BCL1. La inyección de 10x10^{6} células del bazo
alogénicas junto con 10^{5} células BCL1 indujo una
alo-CMI efectiva en el 70% de los receptores
secundarios adoptivos. A pesar de ello, la reducción de las células
de bazo C57 inductoras de alo-CMI a 3x10^{6} o
1x10^{6} no consiguió eliminar las células BCL1 residuales y todos
los receptores secundarios adoptivos desarrollaron leucemia (Figura
2).
C. Inducción de los efectos
Alo-CMI y
Alo-CMI/Il-2 tras un transplante con
CMO purgadas con ASTA-Z. La viabilidad de
inducción de alo-CMI se investigó mediante el
acondicionamiento con CY a elevadas dosis seguido de un rescate de
los receptores con CMO singénicas purgadas con
ASTA-Z. Los receptores BALB recibieron CY en
elevadas dosis (300 mg/kg IP) y se les inyectaron 24 horas después
10^{3} células BCL1 para simular MM. Un día después, todos los
ratones recibieron 4x10^{6} CMO singénicas tratadas con
ASTA-Z intravenosas. Los ratones se dividieron en 3
grupos experimentales: el primero (6 ratones) recibió una mezcla de
células alogénicas C57 de bazo y nódulo linfático intravenosas
(20x10^{6} células) para la inducción de alo-CMI;
el segundo grupo (6 ratones) recibió una terapia celular idéntica
con potenciación adicional in vivo de ICL mediante
tratamiento con IL2rh (12x10^{4} UI x3/día durante 3 días, IP); el
tercer grupo (7 ratones) recibió una mezcla de células singénicas
del bazo y nódulo linfático, con el mismo tratamiento de IL2rh in
vivo. Una semana después, se transfirieron adoptivamente a
ratones BALB secundarios alícuotas de 10^{5} células de un
conjunto de 2-3 bazos obtenidas de cada grupo
experimental.
Como se muestra en la Figura 3, todos los ratones
inoculados con células de bazo de los ratones control as los que se
les dieron 10^{3} células BCL1, o los ratones a los que se les
administraron linfocitos singénicos BALB con IL2rh in vivo,
desarrollaron leucemia y murieron en 40 y 60 días, respectivamente.
Asimismo, los receptores secundarios de 10^{5} células del bazo
obtenidas de ratones que habían sido tratados con
alo-CMI, usando células C57 alogénicas solamente,
mostraron efectos ICL no medibles ya que todos los receptores
desarrollaron leucemia. Por lo contrario, la adición de IL2rh in
vivo tras la administración de mezclas celulares de células C57
del bazo y nódulo linfático indujo efectos
anti-leucémicos sustanciales y el 50% de los ratones
receptores secundarios adoptivos se mantuvieron libres de leucemia
durante >125 días (Figura 3).
D. El aumento de los efectos
inmunoterapéuticos por activación in vitro de linfocitos
alogénicos con IL2rh. El siguiente experimento se diseñó para
probar la potencial mejora en la eficacia del tratamiento mediante
pre-activación in vitro con IL2rh de las
células alogénicas efectoras. Se infusionaron 30x10^{6} CMO C57
pre-activadas in vitro durante 4 días con
IL2rh a ratones F1 letalmente irradiados (750 cGy TBI).Las CMO se
mezclaron con 10^{5} células BCL1 para simular EMR. Los resultados
de los 3 grupos separados de experimentos dieron resultados
similares y por tanto los datos de agruparon (Figura 4).
Todos los receptores F1 se dividieron en dos
grupos. El primer grupo de 33 ratones no recibió ningún tratamiento
adicional. A los ratones del segundo grupo (25 ratones) se les
inyectó IL2rh (12x10^{4} UI x2/día durante 5 días, IP) en un
intento de aumentar más aun la eficacia de la terapia celular
mediante la activación continua de las células efectoras
IL2rh-dependientes in vivo. Alícuotas de
10^{5} células obtenidas de un conjunto de células del bazo
preparadas de ratones de ambos grupos experimentales se
transfirieron adoptivamente a receptores BALB secundarios. Como se
muestra en la Figura 4, 10 de los 33 receptores secundarios de
células del bazo obtenidas del primer grupo experimental
permanecieron libres de enfermedad durante >150 días. La terapia
de IL2rh in vivo adicional en el segundo grupo experimental
mejoró aún más los efectos Alo-CCI, ya que 19 de los
25 receptores secundarios permanecieron libres de enfermedad durante
un periodo de observación >150 días (p=0,05) (Figura 4).
Paciente No.1. Este paciente varón se
diagnosticó de leucemia mieloide crónica (LMC) en fase crónica. El
cariotipo original de la LMC fue positivo para el cromosoma
Philadelphia (Ph+). El paciente estaba en fase crónica (FC) y era
Ph- en el momento del TACM. El paciente tenía 57 años en el momento
del TACM. Anteriormente al TACM, recibió un régimen acondicionador
de irradiación corporal total (ICT) 200 cGy/día, días -5 a -3, y
cytoxan 60 mg/kg., días -2 a -1. El TACM consistió en 0,5 x 10^{8}
células nucleadas de médula ósea no purgadas/kg; infusionadas IV en
el día 0.
En el día +71, tan pronto como los contajes
sanguíneos se estabilizaron (WBC: 4,200/mm^{3}; Hb: 11,5 g %;
plaquetas: 133.000/mm^{3}), el paciente recibió 3 x 10^{7}
células T /kg de LSP de un hermano HLA-compatible.
No se observó EICH; Así pues, el régimen de alo-CMI
se escaló. En el día +107, el paciente recibió 4,6 x 10^{7}
células T/kq de LSP del mismo donante. Empezando en el día +107,
también recibió 6 x 10^{6} UI de IL2rh/m^{2}/día durante 3 días,
por inyección subcutánea. No se observó EICH. En el día +240,
después de que reapareciera el cariotipo Ph+, el paciente recibió
4,95 x 10^{7} células/kg de linfocitos activados de donante
("LAD") del mismo donante. Empezando en el día +240, también
recibió 6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día
durante 3 días, mediante inyección subcutánea. Los LAD se produjeron
exponiendo los LSP del donante a 60000 UI/ml de IL2rh durante cuatro
días en cultivo.
Paciente No.2. Este paciente mujer se
diagnosticó de LMA, FAB M2, y estaba en la primera remisión completa
en el momento del TACM. El paciente tenía 50 años en el momento del
TACM. Previamente al TACM, ella recibió un régimen acondicionador de
Busulfan 4 mg/kg, días -9 a -6, Cytoxan 60 mg/kq, días -3 a -2,
Tiotepa 5 mg/kg/día, días -5 a -4, Cotrimoxazol, 10 mg/kg, días -10
a -2, Alopurinol, 300 mg/kg/días -10 a -1 y Ara-C,
25 mg intratecalmente. El TACM consistió en 0,64 x 10^{8} células
nucleadas de médula ósea no purgadas/kq infusionadas IV el día 0. En
el día +58, tan pronto como los contajes sanguíneos se estabilizaron
(WBC:4,400/mm^{3}; Hb:9,5 g %; plaquetas: 66.000/mm^{3}), el
paciente recibió 5 x 10^{7} células T/kq de LSP de una hermana de
HLA-compatible. En el día +86 el paciente recibió
una segunda dosis de 6,1 x 10^{7} células/kg de LSP de la hermana
de HLA-compatible. Empezando en el día +86, también
recibió 6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día
durante 3 días, mediante inyección subcutánea, No se observó
EICH.
Paciente No.3. Este paciente varón se
diagnosticó de LMC. El cariotipo original de la LMC era Ph+. El
paciente estaba en fase crónica (FC) y el 50% de sus células de la
médula eran Ph+ (es decir, el paciente era Ph+) en el momento del
TACM. El paciente tenía 47 años en el momento del TACM. Previamente
al TACM, recibió un régimen acondicionador de TBI 200 cGY/día, días
-5 a -3, y Cytoxan 60 mg/kq, días -2 a -1. El TACM consistió en 0,98
x 10^{8} células nucleadas de la médula ósea no purgadas/kg,
infusionadas IV en el día 0. En el día +55, tan pronto como los
contajes celulares se estabilizaron (WBC: 6900/mm^{3}; Hb: 12,0 g
%; plaquetas :248.000/mm^{3}), el paciente recibió 4 x 10^{7}
células T/kg de LSP de una hermana de
HLA-compatible. No desarrolló EICH. En el día +77,
el paciente recibió 2,8 x 10^{7} células/kg de LSP de la hermana
de HLA-compatible. Empezando en el día +77, también
recibió 6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día
durante 3 días, mediante inyección subcutánea. No se observó
EICH.
Paciente No. 4. Este paciente varón se
diagnosticó de linfoma no-Hodgkin (LNH), tipo
Burkitt, y estaba en una segunda remisión parcial en el momento del
TACM. Tal como se usa aquí, el término "remisión parcial"
indica al menos un 50% de respuesta (es decir, al menos un 50% de
reducción de la masa celular del linfoma) pero manteniendo evidencia
de enfermedad. El paciente tenía 36 años en el momento del TACM.
Previamente al TACM, recibió un régimen acondicionador de etoposido,
200 mg/m^{2}/día, días -6 a -3, tiotepa, 40 mg/m^{2}/día, días
-5 a -2, Ara-C, 200 mg/m^{2}/día, días -4 a -1,
Cytoxan, 60 mg/kg/día, día -3, y melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días
-2 a -1.
El TACM consistió en 0,74 x 10^{8} células
nucleadas viables de médula ósea/kg más 2,36 x 10^{8}/kg células
madres viables de sangre periférica. Se administró
GM-CSF subcutánea, 5 ug/kg/día, del día +1 al día
+18. Previamente al TACM, las células autólogas se purgaron con
cuentas magnéticas Dynal recubiertas con anti-CD19
para la eliminación de células residuales de linfoma.
En el día +90, el paciente recibió 5 x 10^{7}
células/kg de LSP de un hermano de HLA-compatible.
El paciente no mostró signos de EICH tras esta primera infusión
celular. Un análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando dos loci VNTR (VNTR = Número variable de repeticiones en
tándem) no mostró evidencia de células específicas del donante
circulantes. En el día +124, el paciente recibió 5 x 10^{7}
células/kq de PSL del mismo donante. Esto se continuó con tres días
de tratamiento con el paciente no hospitalizado con 6 x 10^{6} UI
de IL-2rh/m^{2}/día, mediante inyección
subcutánea, empezando en el día +124.
Cincuenta días después (día +174) el paciente
desarrolló pancitopenia, y la biopsia de médula ósea reveló una
médula severamente hipocelular con números elevados de linfocitos
grandes granulares y células plasmáticas. Linfocitos con una
morfología similar se encontraron en la sangre. La repetición de la
PCR usando dos loci VNTR diferentes mostró un injerto parcial de
células del donante en el día +191 y un 100% de injerto de las
células del donante en el día +211. Un TMO alogénico se realizó
entonces infusionándole al paciente 4,2 x 10^{8} células de la
médula del donante/kq; no se administró profilaxis
post-transplante anti-EICH. El
paciente tuvo un rápido injerto de tres linajes con contajes
normales de plaquetas tras 14 días y hemoglobina normal tras 26
días. WBC normalizados tras 10 días con un 70% de neutrófilos, 5% de
monocitos y 25% de linfocitos. Los linfocitos grandes granulares
desaparecieron de la sangre. En el día 14 tras el TMO alogénico, el
paciente mostró signos mínimos de EICH aguda con afectación de la
piel y la cavidad oral. No hubo afectación intestinal o hepática.
Desde entonces el paciente ha continuado experimentando EICH
mucocutánea de grado I/II, parcialmente controlada con esteroides y
ciclosporina A.
Paciente No. 5. Este paciente varón se
diagnosticó de LNH, folicular mixto IV A, y estaba en una segunda
remisión parcial en el momento del TACM. El paciente tenía 39 años
en el momento del TACM. Previamente al TACM, recibió un régimen
acondicionador de etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días -6 a -3;
tiotepa, 40 mg/m^{2}/día, días -5 a -2; Ara-C, 200
mg/m^{2}/día, -días -4 a -1; Cytoxan, 60 mg/kq/día, día -3; y
melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días -2 a -1.
El TACM consistió en 0,5 X 10^{8} células
nucleadas de la médula ósea/kg, infusionadas IV en el día 0.
Previamente al TACM, las células autólogas se purgaron con cuentas
magnéticas Dynal recubiertas con anti-CD19 para la
eliminación de células tumorales contaminantes.
En la semana 8 post-TACM, el
paciente recibió 5 X 10^{7} células T /kq de LSP de una hermana de
HLA compatible. En la semana 12 post-TACM, el
paciente recibió 5 x 10^{7} células T /kq de LSP del mismo
donante. Empezando en la semana 12; el mismo día de la
administración del segundo tratamiento de alo-CMI,
el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de
IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, por inyección
subcutánea. No se observó EICH. En la semana 16
post-TACM, el paciente recibió 0,5 x 10^{7} LAD/kg
de una hermana de HLA compatible. Los LAD se produjeron por
exposición de los LSP del donante a 6000 UI/ml de
IL-2rh durante cuatro días en in cultivo. No se
observó EICH.
Paciente No. 6. Este paciente mujer se
diagnosticó de LNH, de celularidad mixta II A, y estaba en una
segunda remisión completa en el momento del TACM. El paciente tenía
36 años en el momento del TACM. Previamente al TACM, recibió un
régimen acondicionador de etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días -6 a
-3, tiotepa, 40 mg/m^{2}/día, días -5 a -2, Ara-C,
200 mg/m^{2}/día, días -4 a -1, Cytoxan, 60 mg/kg/día, día -3, y
melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días -2 a -1.
El TACM consistió en 0,94 x 10^{8} células
nucleadas de la médula ósea no purgadas/kg más 3,9 x 10^{7} de
células madre de sangre periférica movilizadas con
G-CSF previamente a su recolección con el separador
de células sanguíneas CS 3000® Plus (Baxter Healthcare Corporation,
Fenwal System. No. Catálogo 4R453B). Las células se infusionaron IV
en el día 0.
En la semana 10 post-TACM, tan
pronto como los contajes sanguíneos se estabilizaron (WBC:
4,300/mm^{3}; Hb: 11,2 g %; plaquetas : 116.000/mm^{3}), el
paciente recibió 3 x 10^{7} células T/kg de LSP de un hermano de
HLA compatible. En la semana 15 post-TACM, el
paciente recibió 4,1 x 10^{7} células T/kg de LSP del mismo
donante. Empezando en la semana 15, en el mismo día que la
administración del segundo tratamiento de alo-CMI,
el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de
IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, por inyección
subcutánea. En la semana 23 post-TACM, el paciente
recibió 5 x 10^{7} LAD/kg de un hermano de HLA compatible. Los LAD
se produjeron por exposición de los LSP del donante a 6.000 UI/ml
IL-2rh durante cuatro días en cultivo. Empezando en
la semana 23, en el mismo día que la administración del tratamiento
de alo-CCI, el paciente también recibió 6 x 10^{6}
UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, por
inyección subcutánea. No se observó EICH.
Paciente No. 7. Este paciente mujer se
diagnosticó de LNH, inmunoblástico, y estaba en una segunda remisión
completa en el momento del TACM. El paciente tenía 21 años en el
momento del TACM. Previamente al TACM, ella recibió un régimen
acondicionador de etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días -6 a -3;
tiotepa, 40 mg/m^{2}/día, días -5 a -2; Ara-C, 200
mg/m^{2}/día, días -4 a -1; Cytoxan, 60 mg/kg/día, día -3; y
melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días -2 a -1.
El TACM consistió en 3,82 x 10^{8} células de
médula ósea no purgadas/kg más 1,29 x 10^{8} células madre de
sangre periférica movilizadas con G-CSF previamente
a la recogida con el separador de células sanguíneas CS 3000® Plus.
Las células se infusionaron IV en el día 0.
En la semana 10 post-TACM, el
paciente recibió 5 x 10^{7} células T/kg de LSP de una hermana de
HLA compatible. En la semana 15 post-TACM, el
paciente recibió una segunda infusión de 5 x 10^{7} células T/kg
de LSP de la hermana de HLA compatible. En la semana 19
post-TACM, el paciente recibió una tercera infusión
de 5 x 10^{7} Células T/kg de LSP del mismo donante. No se observó
EICH, pero el paciente no aceptó la sugerencia de recibir IL2rh
in vivo. En la semana 30 post-TACM, el
paciente recibió una cuarta infusión de 5 x 10^{7} células T/kg
de LSP de la hermana de HLA compatible. Empezando en la semana 23,
en el mismo día que la administración del cuarto tratamiento de
alo-CMI, el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI
de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. No se ha observado EICH hasta la fecha.
Paciente No. 8. Este paciente mujer se
diagnosticó de LNH, difuso de células grandes, y estaba en
condiciones de recidiva en el momento del TACM. El paciente tenía 21
años en el momento del TACM. Previamente al TACM, ella recibió un
régimen acondicionador de etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días -6 a
-3; tiotepa, 40 mg/m^{2}/día, días -5 a -2; Ara-C,
200 mg/m^{2}/día, días -4 a -1; Cytoxan, 60 mg/kg/día, día -3; y
melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días -2 a -1.
El TACM consistió en 1,8 x 10^{8} células
mononucleares de la médula ósea no purgadas/kg, infusionadas IV en
el día 0.
En la semana 6 post TACM, tan pronto como los
contajes sanguíneos se estabilizaron (WBC: 4.400/mm^{3}; Hb: 11,7
g %; plaquetas: 150.000/mm^{3}), el paciente recibió 5 x 10^{7}
células T/kg de LSP de una hermana con una incompatibilidad de un
solo locus. En la semana 10 post-TACM, el paciente
recibió una segunda infusión de 5 x 10^{7} células T/kg de LSP del
mismo donante. Empezando en la semana 10, en el mismo día que la
administración del segundo tratamiento de alo-CMI,
el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de
lL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. No se observó EICH.
Paciente No. 9. Este paciente varón se
diagnosticó de LMA, FAB M5, y estaba en la primera remisión completa
en el momento del TACM. El paciente tenía 46 años en el momento del
TACM. Previamente al TACM, recibió un régimen acondicionador de
Busulfan 4/mg/kg, días -9 a -6; Cytoxan 60 mg/kg, días -3 a -2;
Tiotepa 5 mg/kg/día, días -5 a -4; Cotrimoxazol, 10 kg/mg, días -10
a -2, Alopurinol, 300 mg/kg, días -10 a -1 y Ara-C,
25 mg intratecalmente. El TACM consistió en 1,39 x 10^{8} células
de médula ósea no purgadas infusionadas IV en el día 0. En la semana
11, el paciente recibió 3,86 x 10^{7} células T/kg de LSP de un
hermano de HLA compatible. No desarrolló EICH.
Paciente No. 10. Este paciente mujer se
diagnosticó de LMA, FAB M3, y estaba en una segunda remisión parcial
en el momento del TACM. El paciente tenía 12 años en el momento del
TACM. Previamente al TACM, ella recibió un régimen acondicionador de
Busulfan 4 mg/kg, días -9 a -6; Cytoxan 60 mg/kg, días -3 a -2;
Mitoxantrona 6 mg/m^{2}/día, días -5 a -4; Cotrimoxazol, 10 mg/kg,
días -10 a -2, Alopurinol, 300 mg/kg, días -10 a -1 y
Ara-C, 25 mg intratecalmente. El ASCT consistió en
1,14 x 10^{8} células de médula no purgadas infusionadas IV en el
día 0. En el día +113, el paciente recibió 2 x 10^{7} células T/kg
de LSP de su madre con un solo locus incompatible. En el día +142,
el paciente recibió 1000 mg/m^{2} de Cytoxan para mejorar la
eficacia y el injerto temporal de una segunda infusión de LSP del
donante. Veinticuatro horas después, el paciente recibió 1,7 x
10^{7} células T/kg del mismo donante. Empezando en el mismo día
que la administración del segundo tratamiento de
alo-CMI, el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI
de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea; En el día +188, el paciente recibió 1,5 x
10^{7} LAD/kg del mismo donante. Los LAD se produjeron exponiendo
los LSP del donante a 6000 UI/ml IL-2rh durante
cuatro días en cultivo. Durante el mismo día de la administración
del tratamiento de alo-CCI, el paciente también
recibió 6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día
durante 3 días, mediante inyección subcutánea.
Paciente No. 11. Este paciente varón fue
diagnosticado de LMA, FAB M5, y estuvo en remisión completa en el
momento del TACM. El paciente tenía 6 años y medio de edad en el
momento del TACM. Antes del TACM, había recibido un régimen
acondicionador de Busulfan de 4 mg/kg, los días -9 a -6; Cytoxan 60
mg/kg, los días -3 a -2; Tiotepa 5 mg/kg/día, los días -5 a -4;
Cotrimoxazol, 10 mg/kg, los días -10 a -2, Alopurinol, 300 mg/kg,
los días -10 a -1 y Ara-C, 25 mg intratecalmente. El
TACM consistió en 2,7 X 10^{8} células de médula ósea no purgadas
infusionadas IV en el día 0. En la semana 14, el paciente recibió 5
x 10^{7} células T/kg de LSP de su padre con un solo locus
incompatible.
Este último paciente (3 de Mayo de 1994) recibió
2,5 x 10^{7} células T/kg de LSP con un solo locus incompatible
del mismo donante. En el mismo día de la administración del segundo
tratamiento de alo-CMI, el paciente también recibió
6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3
días, mediante inyección subcutánea. Antes del segundo tratamiento
de Alo-CMI, el paciente recibió cytoxan a
500-1000 mg/m^{2} con hidratación adecuada. Un mes
después el paciente recibió 7,8 x 10^{7} LAD/kg del mismo donante.
Los LAD se produjeron por exposición de los LSP del donante a 6.000
UI/ml de IL-2rh durante cuatro días en cultivo.
Empezando el mismo día de la administración del tratamiento de
alo-CCI, el paciente también recibió 6 x 10^{6}UI
de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. Antes del tratamiento de
alo-CCI, el paciente recibió cytoxan a
500-1000 mg/m^{2} con hidratación adecuada.
Paciente No. 12. Este paciente varón fue
diagnosticado de LNH, de células pequeñas y grandes mezcladas, en
los nódulos linfáticos, en febrero de 1993. Presentaba también gran
afectación de la médula ósea. Recibió quimioterapia (12 rondas de
MACOP-B), pero sufrió recidiva en los nódulos
linfáticos y en la médula ósea en octubre de 1993. Recibió
quimioterapia adicional y estuvo en una segunda remisión parcial
durante el periodo de TACM, con recurrencia en la médula. El
paciente tenía 45 años de edad durante el TACM. Antes del TACM,
recibió un régimen acondicionador consistente de etoposido, 200
mg/m^{2}/día, los días -6 a -3; tiotepa, 40 mg/m^{2}/día, los
días -5 a -2; Ara-C, 200 mg/m^{2}/día, los días -4
a -1; Cytoxan, 60 mg/kg/día, día -3; y melfalan, 60 mg/m^{2}/día,
los días -2 a -1.
El TACM consistió en 2,15 x 10^{8} células
madres de sangre periférica no purgadas movilizadas por
G-CSF, infusionadas IV el día 0.
En la semana 7 post-TACM, el
paciente recibió 3 x 10^{7} células T/kg de LSP de una hermana de
HLA-compatible. En la semana 11
post-TACM, el paciente recibió una segunda infusión
de 3 x 10^{7} células T/kg de LSP del mismo donante. Empezando en
la semana 11, en el mismo día de la administración del segundo
tratamiento de alo-CMI, el paciente también recibió
6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3
días, mediante inyección subcutánea. Antes del segundo tratamiento
de alo-CMI, el paciente recibió ciclofosfamida
(cytoxan) a 500-1000 mg/m^{2} con hidratación
adecuada. No se observó EICH. Para escalar el tratamiento, el
paciente recibió 3 x 10^{7} LAD/kg del paciente de
HLA-compatible. Los LAD se produjeron exponiendo los
LSP del donante a 6000 IU/ml IL-2rh durante cuatro
días en cultivo. En el mismo día de la administración del
tratamiento de alo-CCI, el paciente también recibió
6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3
días, mediante inyección subcutánea. Antes del tratamiento de
alo-CCI, el paciente recibió melfalan a 30
mg/m^{2}.
Notas sobre los Pacientes Nos.
13-19: Los pacientes 13-19
representan pacientes con linfomas adicionales tratados de forma
similar a los pacientes 8-12 y 16, excepto que la
infusión inicial de linfocitos alogénicos fue acompañada por la
administración in vivo de IL2rh. A continuación se resumen
los aspectos relevantes de los protocolos del tratamiento:
Paciente No. 13. Este paciente varón se
diagnosticó de enfermedad de Hodgkin, con esclerosis nodular, y
presentó una tercera remisión parcial durante el TACM. Tenía 16 años
de edad durante el TACM. Antes del TACM, recibió un régimen
acondicionador como el presentado para el paciente No. 12 anterior.
El TACM consistió en células de médula ósea solamente. Tras la
recuperación parcial hematopoyética, el paciente recibió 3 x
10^{7} células T/kg de LSP de un hermano de
HLA-compatible. En el mismo día de la administración
del primer tratamiento de alo-CMI, el paciente
también recibió 6 x 10^{6} UI de
IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. Antes del tratamiento de
alo-CMI, el paciente recibió cytoxan a
500-1000 mg/m^{2} con hidratación adecuada. No se
observó EICH. Para escalar el tratamiento, el paciente recibió 2,0 x
10^{7} LAD/kg del donante de HLA-compatible. Los
LAD se produjeron exponiendo los LSP del donante a 6000 UI/ml de
IL-2rh durante cuatro días en cultivo. En el mismo
día de la administración del tratamiento de alo-CCI,
el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de
IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. Antes del tratamiento de
alo-CCI, el paciente recibió cytoxan a
500-1000 mg/m^{2} con hidratación adecuada.
Paciente No. 14. Este paciente mujer se
diagnosticó de LNH, de bajo grado, y estuvo en segunda remisión
completa durante el TACM. Tenía 24 años de edad durante el TACM.
Antes del TACM, recibió un régimen acondicionador como el presentado
antes para el paciente No. 12. El TACM consistió en células de
médula ósea (1,95 x 10^{8}/kg) más células madre de sangre
periférica (3,88 x 10^{8}/kg). En el día +169, el paciente recibió
3,6 x 10^{7} células T/kg de LSP de una hermana de
HLA-compatible. En el mismo día de la
administración del primer tratamiento de alo-CMI, el
paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de IL2rh/m^{2}/día
durante 3 días, mediante inyección subcutánea. Antes del tratamiento
de alo-CMI, el paciente recibió cytoxan a 750
mg/m^{2} con hidratación adecuada. No se observó EICH. Para
escalar el tratamiento, el paciente recibió (día +171) 3,0 x
10^{7} LAD/kg del donante de HLA compatible. Los LAD se produjeron
exponiendo los LSP del donante a 6000 UI/ml de
IL-2rh durante cuatro días en cultivo. En el mismo
día de la administración del tratamiento de alo-CCI,
el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de
IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. Antes del tratamiento de
alo-CCI, el paciente recibió melfalan a 30
mg/m^{2}.
mg/m^{2}.
Doce (12) días tras la administración de los LAD,
el paciente desarrolló una aplasia de médula ósea. Se realizó un
transplante alogénico de médula ósea con las células de médula ósea
del donante con LSP compatibles (2,9 x 10^{8}/kg), con reducción
de células T inmunocompetentes usando Campath-1G, un
anticuerpo monoclonal de rata anti-CDW52 humano
(IgG2b), proporcionado por los Drs. G. Hale y H. Waldmann (Oxford
University, UK). Véase, pej., Hale et al.,
Campath-1 monoclonal antibodies in bone marrow
transplantation. J. Hematotherapy 3: 15-31 (1994).
El anticuerpo Campath-1G se utilizó a una
concentración de 0,3 \mug/10^{6} células nucleadas. La
reconstitución de granulocitos se potenció mediante la
administración diaria subcutánea de G-CSF (5
ug/kg/día). Después del TMO alogénico, el paciente se recuperó
totalmente con un injerto total de 3 linajes de células
hematopoyéticas del tipo del donante al 100% y sin DNA huésped
residual, como se confirmó por VNTR-PCR. No presentó
EICH agudo, y no se utilizó profilaxis
anti-EICH.
Paciente No. 15. Este paciente mujer se
diagnosticó de LNH, de alto grado, con enfermedad refractaria. Ella
tenía 48 años de edad durante el TACM. Antes del TACM, recibió un
régimen acondicionador como el proporcionado antes para el paciente
No. 12. El TACM consistió en células de médula ósea y células madre
de sangre periférica combinadas. Tras la recuperación parcial
hematopoyética, el paciente recibió 5,8 x 10^{7} células T/kg de
LSP a partir de un hermano de HLA-compatible. En el
mismo día que la administración del primer tratamiento de
alo-CMI, el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI
de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. No se observó EICH. Para escalar el
tratamiento, el paciente recibió 5,8 x 10^{7} LAD/kg a partir de
donante de HLA compatible. Los LAD se produjeron exponiendo los LSP
del donante a 6000 UI/ml de IL-2rh durante cuatro
días en cultivo. En el mismo día de la administración del
tratamiento de alo-CCI el paciente también recibió
6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3
días, mediante inyección subcutánea. Antes del tratamiento de
alo-CCI, el paciente recibió melfalan a 30
mg/m^{2}.
Paciente No. 16. Este paciente varón se
diagnosticó de Enfermedad de Hodgkin, con esclerosis nodular, y
estuvo en segunda remisión completa durante el TACM. Tenía 49 años
de edad durante el TACM. Antes del TACM, recibió un régimen
acondicionador como el proporcionado antes para el paciente No. 12.
El TACM consistió en células de médula ósea solamente (0,9 x
10^{8}/kg). En el día +183, el paciente recibió 8,3 x 10^{6}
Células T/kg de LSP de una hermana de
HLA-compatible. En el mismo día de la administración
del tratamiento de alo-CMI, el paciente también
recibió 6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día
durante 3 días, mediante inyección subcutánea. Antes del tratamiento
de alo-CMI, el paciente recibió cytoxan a 1500
mg/m^{2} con hidratación adecuada.
Veintiún (21) días tras el tratamiento de
alo-CMI, el paciente desarrolló una aplasia de
médula ósea. Se realizó un trasplante alogénico de médula ósea con
las células de médula ósea del donante de LSP (3,3 x 10^{8}/kg),
obtenidas por reducción de células T inmunocompetentes usando
Campath-1G (0,3 \mug/10^{6} células
nucleadas).
Paciente No 17. Este paciente mujer se
diagnosticó de LNH, de alto grado, y estaba una segunda remisión
parcial durante el TACM. Ella tenía 39 años de edad durante el TACM.
Antes del TACM, recibió un régimen acondicionador como el
proporcionado antes para el paciente No. 12. El TACM consistió en
células médula ósea y células madre de sangre periférica combinadas.
Antes del TACM, las células autólogas se purgaron con cuentas
magnéticas Dynal recubiertas de anti-CD19 para la
eliminación de células tumorales contaminantes. Tras la recuperación
hematopoyética parcial, el paciente recibió 2,7 x 10^{7} células
T/kg de LSP de un hermano de HLA-compatible. En el
mismo día de la administración del primer tratamiento de
alo-CMI, el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI
de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. Antes del tratamiento de
alo-CMI, el paciente recibió cytoxan a
500-1000 mg/m^{2} con hidratación adecuada.
Paciente No. 18. Este paciente varón se
diagnosticó con enfermedad de Hodgkin, con esclerosis nodular, y
estaba en la tercera remisión completa durante el TACM. Tenía 29
años de edad durante el TACM. Antes del TACM, recibió un régimen
acondicionador como el proporcionado antes para el paciente No. 12.
El TACM consistió en células de médula ósea solamente (0,64 x
10^{8}/kg). En el día +110, el paciente recibió 4 x 10^{7}
células T/kg de LSP de una hermana de
HLA-compatible. En el mismo día de la administración
del tratamiento de alo-CMI, el paciente también
recibió 6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día
durante 3 días, mediante inyección subcutánea. Antes del tratamiento
de alo-CMI, el paciente recibió melfalan a 15
mg/m^{2} con hidratación adecuada. En el día +150, el paciente
recibió 3,3 x 10^{7} LAD/kg del donante de HLA compatible. Los LAD
se produjeron exponiendo los LSP del donante a 6000 UI/ml de
IL-2rh durante cuatro días en cultivo. En el mismo
día de la administración del tratamiento de alo-CCI,
el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de
IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. Antes del tratamiento de
alo-CCI, el paciente recibió melfalan a 30
mg/m^{2}.
Seis (6) días tras el tratamiento de
alo-CCI, el paciente desarrolló aplasia de médula
ósea. Se realizó un trasplante alogénico de médula ósea con las
células de médula ósea del donante de LSP compatibles (3,52 x
10^{8}/kg), obtenidas por reducción de células T inmunocompetentes
usando Campath-1G (0,1 \mug/10^{6} células
nucleadas).
Paciente No. 19. Este paciente varón se
diagnosticó de LNH, de grado intermedio, y estaba en la primera
remisión parcial durante el TACM. Tenía 38 años de edad durante el
TACM. Antes del TACM, recibió un régimen acondicionador como el
proporcionado antes para el paciente No. 12. El TACM consistió en
células de médula ósea y células madre de sangre periférica
combinadas. Tras la recuperación parcial hematopoyética, el paciente
recibió 2,8 x 10^{7} células T/kg de LSP de un hermano de HLA
compatible. En el mismo día de la administración del primer
tratamiento de alo-CMI, el paciente también recibió
6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3
días, mediante inyección
subcutánea.
subcutánea.
Notas de los Pacientes Nos.
20-25: Los pacientes 20-25 son
pacientes de cáncer de mama que fueron tratados con un régimen de
reducción que incluía un TACM. Se continuó con una
alo-CMI y, en algunos cosos,
alo-CCI. A seis pacientes con enfermedad
metastática, con pronósticos muy graves, se les ofreció
inmunoterapia de la presente invención. La naturaleza avanzada de
sus dolencias no daba grandes esperanzas de erradicación completa de
la enfermedad, pero en ausencia de alternativas terapéuticas
viables, se decidió proceder. De los seis pacientes, cuatro tenían
evidencias de una gran enfermedad metastática en el momento en que
la inmunoterapia se inició. Ninguno de estos pacientes mostró
evidencias de injerto. Así pues, las células alogénicas infusionadas
no debieron tener tiempo suficiente para provocar respuesta total de
ICT. Incluso en ratones, para obtener la eliminación del tumor se
requería un tiempo de residencia de 2-3 semanas de
las células alogénicas infusionadas. Weiss et al., Effective
Graft vs. Leukemia Effects Independently of Graft vs. Host Disease
Following T-Cell depleted allogeneic bone marrow
transplantation in a murine model of B-Cell
Leukemia/Linphoma (BCL1): Role of Cell Therapy and
RhIL-2. J. Immunology 153(6):
2562-7 (Sept. 1994). De todos modos, como se
describe a continuación, uno de estos pacientes mostró una respuesta
a la terapia celular pronunciada, aunque transitoria.
Dos de los pacientes de cáncer de mama
metastático empezó el estudio en remisión, tras la reducción de masa
tumoral mediante quimioterapia previamente a la terapia celular.
Como se describe a continuación, estos pacientes no mostraron
evidencia de enfermedad tras 11 y tras 9 meses respectivamente
después del TACM, están libres de cualquier síntoma, y tienen
puntuaciones de Karnofsky del 100%. Esto a pesar del hecho de que,
de nuevo, no había evidencia de injerto. Con futuros pacientes, se
posibilitará el injerto con aplicación más agresiva de
terapia
celular.
celular.
Paciente No. 20. Este paciente mujer se
diagnosticó de cáncer de mama metastático, con metástasis en el
hígado y la columna vertebral. Se sometió a una mastectomía parcial
derecha con disección de nódulos linfáticos axilares ya que mostraba
afectación de 18/35 nódulos linfáticos. El paciente tenía 43 años en
el momento del TACM. Previamente al TACM, ella recibió un régimen
acondicionador de carboplatino, 200 mg/m^{2}/día, días -7 a -4;
tiotepa, -60 mg/m^{2}/día, días -6 a -4; etoposido, 200
mg/m^{2}/día, días -5 a -3; y melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días -4
a -3.
En el momento del TACM, el paciente mostraba
elevación del marcador celular de cáncer de mama
CA-15.3. El TACM consistió en 3,74 x 10^{8}
células madre de sangre periférica/kg, infusionadas IV en el día 0.
Las células madre se recogieron tras su movilización con
G-CSF (7,5 mg/kg/día durante 5 días) utilizando tres
recolecciones con el separador de células sanguíneas CS 30000 Plus.
Tras el TACM, el paciente se recuperó sin complicaciones y se le
dejó marchar el día 20 post-TACM.
Un hermano de HLA totalmente compatible (A, B, DR
y reacción a mezcla de linfocitos (RML) -negativo) se escogió como
donante de LSP para la alo-CMI. En el día +77,
cuando el paciente había alcanzado un estado clínico estable (WBC:
2.700/mm^{3}; Hb: 9,1 g %; .plaquetas: 56.000/mm^{3}), el
paciente recibió 3,2 x 10^{7} células T/kg de LSP de un hermano de
HLA compatible. Empezando en el mismo día que la administración del
primer tratamiento alo-CMI, el paciente también
recibió 6 x 10^{6} UI de IL2rh/m^{2}/día durante 3 días,
mediante inyección subcutánea. En el día +117, el paciente recibió
5,4 x 10^{7} células T/kg de LAD, junto con IL-2rh
in vivo como se ha descrito anteriormente. Los LAD se
produjeron como se ha descrito anteriormente. En el día +162, el
paciente recibió 1,11 x 10^{8} células T/kg de LSP (no LAD), junto
con IL-2rh in vivo como se ha descrito
anteriormente. En el día +165, el paciente recibió 8,6 x 10^{7}
células T/kg de LAD, junto con IL-2rh in
vivo como se ha descrito anteriormente. Los LAD se produjeron
como se ha descrito anteriormente. En el día +343, el paciente
recibió 1,72 x 10^{8} células T/kg de LAD (cultivados in
vitro con fitohemaglutinina); junto con IL-2rh
in vivo como se ha descrito anteriormente.
Paciente No. 21. Este paciente varón se
diagnosticó de cáncer de mama metastático, con metástasis en la
médula ósea, esternón y vértebras T4 a T7. Se sometió a una
lumpectomía con disección del nódulo linfático axilar que mostraba
afectación de 16/18 nódulos linfáticos. El paciente tenía 36 años en
el momento del TACM. Previamente al TACM, recibió un régimen
acondicionador de carboplatino, 200 mq/m^{2}/día, días -7 a -4;
tiotepa, 60 mg/m^{2}/día, días -6 a -4; etoposido, 200
mg/m^{2}/día, días -5 a -3; y melfalan, 60 mg/m^{2}/día,
días-4 a -3.
El TACM consistió en 1,64 x 10^{8} células
madre de sangre periférica/kg, infusionadas IV en el día 0; Las
células madre se recogieron tras la movilización con
G-CSF (7,5 mg/kg/día durante 5 días) utilizando tres
recogidas del separador de células sanguíneas CS 3000 Plus. Tras el
TACM, el paciente se recuperó sin complicaciones y se dejó marchar
en el día 20 post-TACM.
Se eligió un hermano de HLA totalmente compatible
(A, B, DR y reacción a mezcla de linfocitos
(RML)-negativo) como donante de LSP durante la
alo-CMI. En el día +33, tan pronto como el paciente
hubo alcanzado un estado clínico estable (WBC: 11.000/mm^{3}; Hb:
11,5 g %; plaquetas: 201.000/mm^{3}), el paciente recibió 2,3 x
10^{7} células T/kg de LSP de un hermano de HLA compatible.
Empezando en el mismo día que la administración del primer
tratamiento de alo-CMI, el paciente también recibió
6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3
días, mediante inyección subcutánea. En el día +90, el paciente
recibió 9,4 x 10^{6} LAD/kg del mismo donante. Los LAD se
produjeron mediante exposición de los LSP del donante a 6.000 UI/ml
de IL-2rh durante cuatro días en cultivo. En el
mismo día que la administración del tratamiento de
alo-CCI, el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI
de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. En el día +170, el paciente recibió 6,7 x
10^{7} células T/kg de LSP del mismo donante. En el mismo día que
la administración del tratamiento de alo-CCI, el
paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de IL2rh/m^{2}/día
durante 3 días, mediante inyección subcutánea.
Paciente No. 22. Este paciente mujer se
diagnosticó de cáncer de mama metastático, con afectación de 18/30
nódulos linfáticos. El paciente tenía 36 años en el momento del
TACM, sin evidencia de enfermedad. Previamente al TACM, ella recibió
un régimen acondicionador de carboplatino, 200 mg/m^{2}/día, días
-7 a -4; tiotepa, 60 mg/m^{2}/día, días -6 a -4; etoposido, 200
mg/m^{2}/día, días -5 a -3; y melfalan, 160 mg/m^{2}/día, días
-4 a -3. El TACM consistió en 1,86 x 10^{8} células madre de
sangre periférica/kg, infusionadas IV en el día 0. El paciente
sufrió una recidiva cinco (5) meses después del TACM, con metástasis
en los huesos.
En el día +180, el paciente recibió 4 x 10^{7}
células T/kg de LSP de un donante de HLA compatible. Empezando en el
mismo día que la administración del primer tratamiento de
alo-CMI, el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI
de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. En el día +210, el paciente recibió 1,11 x
10^{8} células T/kg de LSP del mismo donante. En el mismo día de
la administración del segundo tratamiento de
alo-CMI, el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI
de IL2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante inyección subcutánea.
En el día +216, el paciente recibió 3,3 x 10^{7} células T/kg de
LAD del mismo donante, junto con IL-2rh in
vivo como se ha descrito anteriormente. Los LAD se produjeron
mediante exposición de los LSP del donante a 6.000 UI/ml de IL2rh
durante cuatro días en cultivo.
Paciente No. 23. Este paciente mujer se
diagnosticó de cáncer de mama metastático, con afectación de 11/31
nódulos linfáticos y metástasis en las vértebras. El paciente tenía
44 años en el momento del TACM, con elevación del marcador celular
de cáncer de mama CA-15.3. Previamente al TACM, ella
recibió un régimen acondicionador de carboplatino, 200
mg/m^{2}/día, días -7 a -4; tiotepa, 60 mg/m^{2}/día, días -6 a
-4; etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días -5 a -3; y melfalan, 60
mg/m^{2}/día, días -4 a -3. El TACM consistió en 2,79 x 10^{8}
células madre de sangre periférica/kg, infusionadas IV en el día
0.
En el día +210, el paciente recibió 2,98 x
10^{7} células T/kg de LSP de un donante de HLA compatible.
Empezando en el mismo día de la administración del primer
tratamiento de alo-CMI, el paciente también recibió
6 x 10^{6}UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días,
mediante inyección subcutánea. En el día +270, el paciente recibió
6,54 x 107 LAD/kg del mismo donante. Los LAD se produjeron mediante
exposición de los LSP del donante a 6.000 UI/ml de
IL-2rh durante cuatro días en cultivo. En el mismo
día de la administración del tratamiento de alo-CCI,
el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de
IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea.
Paciente No. 24. Este paciente mujer se
diagnosticó de cáncer de mama metastático, con metástasis en las
costillas y vértebras. El paciente tenía 54 años en el momento del
TACM. Previamente al TACM, ella recibió un régimen acondicionador de
carboplatino, 200 mg/m^{2}/día, días -7 a -4; tiotepa, 60
mg/m^{2}/día, días -6 a -4; etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días
-5 a -3; y melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días -4 a -3. El TACM
consistió en 2,69 x 10^{8} células madre de sangre periférica/kg,
infusionadas IV en el día 0. El paciente no mostró evidencia de
enfermedad en el momento del inicio del tratamiento de
alo-CMI.
En el día +125, el paciente recibió 3,3 x
10^{7} células T/kg de LSP de un donante de HLA compatible.
Empezando en el mismo día que la administración del primer
tratamiento de alo-CMI, el paciente también recibió
6 x 10^{6} UI de IL-2rh/m^{2}/día durante 3
días, mediante inyección subcutánea.
Paciente No. 25. Este paciente mujer se
diagnosticó de cáncer de mama metastático, con metástasis óseas así
como metástasis en los nódulos linfáticos cervicales y
supraclaviculares.
El paciente tenía 51 años en el momento del TACM.
Previamente al TACM, ella recibió un régimen acondicionador de
carboplatino, 200 mg/m^{2}/día, días -7 a -4; tiotepa, 60
mg/m^{2}/día, días -6 a -4; etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días -5
a -3; y melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días -4 a -3. El TACM consistió
en 1,71 x 10^{8} de células madre de sangre periférica/kg,
infusionadas IV en el día 0. El paciente no mostró evidencia de
enfermedad en el momento del inicio del tratamiento de
alo-CMI.
En el día +160, el paciente recibió 3,45 x
10^{7} células T/kg de LSP de un donante de HLA compatible.
Empezando en el mismo día de la administración del primer
tratamiento de alo-CMI, el paciente también recibió
6 x 10^{6} UI de IL2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea. En el día +211, el paciente recibió 5 x
10^{7} LAD/kg del mismo donante. Los LAD se produjeron mediante
exposición de los LSP del donante a 6.000 UI/ml de
IL-2rh durante cuatro días en cultivo. En el mismo
día de la administración del tratamiento de alo-CCI,
el paciente también recibió 6 x 10^{6} UI de
IL-2rh/m^{2}/día durante 3 días, mediante
inyección subcutánea.
Porciones de los protocolos de tratamiento de
pacientes anteriormente descritos se resumen en la Tabla 1, a
continuación. Los pacientes están agrupados de acuerdo con su
enfermedad (LMA, LMC, LNH y cáncer de mama).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
^{a}Los términos usados en la
Tabla se definen a
continuación:
1RC,2RC: Primera o segunda
remisión completa,
respectivamente.
1RP,2RP,3RP: Primera,
segunda o tercera remisión parcial,
respectivamente.
FC(Ph-): Fase
crónica, sin evidencia citogenética de cromosoma
Philadelphia.
FC(Ph+): Fase
crónica, evidencia citogenética de la presencia del cromosoma
Philadelphia.
BU/CY: Régimen
acondicionador de Busulfan, 4 mg/kg, días 6 hasta 9
pre-TACM (días -9 a -6), así como Cytoxan
(ciclofosfamida), 50 mg/kg, días -5 a 2, Cotrimoxazol, 10 mg/kg,
días - 10 a -2, Alopurinol, 300 mg/kg, días -10 a -1 y arabinósido
de citosina (Ara-C), 25 mg
intratecalmente.
BU/CY + TT: Régimen
acondicionador de Busulfan 4 mg/kg días -9 a -6, Cytoxan 60 mg/kg,
días -3 a 2, Tiotepa 5 mg/kg/día, días -5 a -4; Cotrimoxazol, 10
mg/kg, días -10 a -2, Alopurinol, 300 mg/kg, días -10 a -1 y
Ara-C, 25 mg
intratecalmente.
BU/GY + MX: Régimen
acondicionador de Busulfan 4 mg/kg, días -9 a -6; Cytoxan 60 mg/kg,
días -3 a -2; Mitoxantrona 6 mg/m^{2}/día, días -5 a -4;
Cotrimoxazol 10 mg/kg, días -10 a -2, Alopurinol 300 mg/kg, días -10
a -1 y Ara-C, 25 mg
intratecalmente.
CY/ICT: Régimen
acondicionador de irradiación corporal total (ICT) 200 cGY/día, días
-5 a -3, y Cytoxan 60 mg/kg, días -2 a
-1.
ETACM: Régimen
acondicionador de etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días -6 a -3;
tiotepa, 40 mg/m^{2}/día, días -5 a -2; Ara-C 200
mg/m^{2}/día, días -4 a -1; Cytoxan, 60 mg/kg/día -3; y melfalan
60 mg/m^{2}/día, días -2 a
-1.
CTEM: Régimen acondicionador
de carboplatino, 200 mg/m^{2}/día, días -7 a -4; tiotepa, 60
mg/m^{2}/día, días -6 a -4; etoposido, 200 mg/m^{2}/día, días -5
a -3; y melfalan, 60 mg/m^{2}/día, días -4 a
-3.
ATMO: Infusión de células
madre extraídas directamente de la médula
ósea.
CMSP: Infusión de células
madre obtenidas de la sangre periférica tras movilización desde la
médula
ósea.
LSP, ADL: Si no se señala
otra numeración, LSP (linfocitos de sangre periférica) y LAD
(linfocitos activados de donante) se refiere a una infusión de
\neq 10^{7} células/kg de peso corporal del paciente. En los
pacientes No. 5-18, la primera infusión de células
alogénicas se realizó solo después de la consecución de una
reconstitución hematopoyética
parcial.
Citoxan/LSP o LAD:
Ciclofosfamida (Cytoxan) administrado previamente a la infusión de
\geq 10^{7} células/kg de LSP o
LAD.
Melfalan/LSP o LAD: Melfalan
administrado previamente a la infusión de \geq 10^{7} células/kg
de LSP o
LAD.
Los pacientes descritos anteriormente se han
seguido durante distintos periodos de tiempo. El estado de
enfermedad de los pacientes se resume a continuación:
Paciente No.1, está vivo y
hematológicamente en remisión completa sin necesidad de
quimioterapia y con una puntuación de Karnofsky del 100%, después de
34 meses del TACM. La PCR de la translocación característica del
cromosoma Philadelphia bcr/abl fluctúa entre negativo y positivo,
aunque la enfermedad del paciente aparece como totalmente
controlada. El paciente está recibiendo 9 x 10^{6} unidades de
IFN\alpha (Roferon A, S.C.) diarias.
Paciente No.2, está vivo y bien tras 35
meses del TACM sin evidencias de enfermedad y con puntuación de
Karnofsky del 100%.
Paciente No.3, está vivo y
hematológicamente en remisión completa sin necesidad de
quimioterapia y con puntuación de Karnofsky del 100%, tras 33 meses
post-TACM. Actualmente, el paciente está en
tratamiento con IFN\alpha. La PCR de la translocación
característica del cromosoma Philadelphia bcr/abl fluctúa entre
negativo y positivo, aunque la enfermedad del paciente aparece como
totalmente controlada.
Paciente No. 4, está vivo y bien tras 36
meses del TACM inicial y tras dos años tras el TMO alogénico, sin
evidencia de linfoma. El paciente tiene EICH ligera cutánea crónica
con puntuación de Karnofsky del 100%.
Paciente No. 5, tuvo una recidiva tras 18
meses post-TACM. El paciente se está tratando con
alo-CMI/CCI de otro donante de HLA compatible.
Paciente No. 6, está vivo y bien tras 29
meses del TACM y sin evidencias de enfermedad.
Paciente No. 7,.está vivo y bien tras 28
meses del TACM y sin evidencias de enfermedad.
Paciente No. 8, sufrió una recidiva a los
3 meses post-TACM y murió a los 5 meses
post-TACM.
Paciente No. 9, sufrió una recidiva a los
4 meses post-TACM. No tuvo oportunidad de recibir
alo-CMI con IL2rh debido a complicaciones pulmonares
severas no relacionadas. El paciente murió 5 meses después de la
recidiva.
Paciente No. 10, está vivo y bien, sin
evidencias de enfermedad tras 13 meses post-TACM,
con puntuación de Karnofsky del 100%. El análisis por PCR de la
sangre no muestra evidencia de RAR-alfa, el marcador
molecular típico de la LMA.
\newpage
Paciente No. 11, está vivo y bien, sin
evidencias de enfermedad tras 15 meses post-TACM,
puntuación de Karnofsky del 100%.
Paciente No. 12, sufrió una recidiva tras
7 meses post-ASCT. El paciente está vivo y
clínicamente bien con evidencia de enfermedad a los 14 meses
post-TACM. No se le ha enviado para su posterior
tratamiento y ésta siendo tratado por el médico que lo envió.
Paciente No. 13, está vivo y bien, sin
evidencias de enfermedad tras 15 meses
post-ASCT.
Paciente No. 14, está vivo y bien, sin
evidencias de enfermedad tras 14 meses
post-ASCT.
Paciente No. 15, está vivo y bien, sin
evidencias de enfermedad tras 13 meses
post-ASCT.
Paciente No. 16, murió de fallo
multiorgánico 13 días después del TMO alogénico por aplasia
medular.
Paciente No. 17, está vivo y bien, sin
evidencias de enfermedad tras 9 meses post-ASCT.
Paciente No. 18, murió de neumonía y
sepsis por Candida 9 días después del TMO alogénico por aplasia
medular.
Paciente No. 19, sufrió una recidiva a los
5 meses post-TACM. Está siendo tratado con en las
áreas afectadas y se tratará con inmunoterapia tan pronto como el
tratamientos de radioterapia haya finalizado.
Paciente No. 20, mostró una pronunciada
remisión parcial de 3 meses de duración, durante la cual hubo una
desaparición típica de metástasis hepáticas de las imágenes de
escáner TC (ver Figura 5), y hubo una clara disminución del nivel
del marcador de cáncer de mama 15.3 (bajó de 118 a menos de 4). El
paciente ha sufrido una recidiva y ahora está es estadio de
progresión de la enfermedad.
Paciente No. 21, tiene enfermedad
progresada.
Paciente No. 22, tiene enfermedad
progresada.
Paciente No. 23, tiene enfermedad
progresada.
Paciente No. 24, está vivo y bien, sin
evidencias de enfermedad tras 11 meses
post-ASCT.
Paciente No. 25, está vivo y bien, sin
evidencias de enfermedad tras 9 meses post-ASCT.
Los resultados presentados
anteriormente indican que la alo-CMI y la
alo-CCI pueden ser la alternativa más racional y
práctica en la erradicación de células malignas residuales. Los
efectos ICT inducidos mediante la administración de linfocitos
alogénicos puede potenciarse mediante la administración de IL2rh
in
vivo.
Las citoquinas utilizadas en los siguientes
experimentos se obtuvieron como se indica a continuación: (1) La
IL2rh fue proporcionada por el Dr. C. R. Franks (EuroCetus BY,
Amsterdam, Holanda) como un polvo liofilizado en viales de 1 mg que
contenían 18 x 10^{6} unidades internacionales (UI). (2) El
interferón-gamma recombinante (IFN\gammar) fue
proporcionado por Roussel Uclaf (Romainville, Francia) como un polvo
liofilizado que contenía 2 x 107 U/mg. (3) La IL-6
recombinante humana (IL-6r) fue amablemente
proporcionada por el Dr. M. Revel y Dr. 0. Laub (InterPharm
Laboratories, Rehovot, Israel) a una concentración de 1,13 mg/ml de
proteína que contenía 43 x 10^{6} UI/ml. (4) La
IL-7 recombinante humana (IL-7rh)
fue proporcionada por Pepro Tech (New Jersey, USA) como un polvo
liofilizado y se reconstituyó hasta 100 mg/ml.
Los linfocitos se preactivaron in vitro
con IL2rh o con combinaciones de IL2rh y otras citoquinas durante
cuatro días a 37ºC. Las concentraciones de citoquinas usadas durante
la incubación in vitro de los linfocitos fue como sigue: (a)
IL2rh: 6000 UI/ml; (b) IL6r: 100-1000 U/ml; (c)
IL7r: 10 ng/ml; y (d) IFN\gamma: 1000 U/ml. Los efectos
anti-tumorales de los LAD recogidos
post-cultivo se probaron contra células tumorales
K562 sensibles a células natural killer (NK) y células tumorales
Daudi resistentes a NK. La toxicidad in vitro se evaluó
mediante liberación de cromo específica tras la incubación de
células efectoras con células tumorales marcadas con cromo. Los
resultados se presentan a continuación como unidades líticas por
10^{6} células efectoras, determinadas por un 30% de lisis en 5 x
10^{3} células diana:
Citotoxicidad (unidades líticas
/10^{6}
células)
| Anti-Daudi | Anti-K562 | |
| IL2 sóla | 48 | 53 |
| IL2 + IL6 + IL7 + IFN | 210 | 129 |
Los ratones se adquirieron y mantuvieron como se
describe en el Ejemplo 1. El uso y mantenimiento de las células de
leucemia BCL1 fue como se describe en el Ejemplo 1. La
IL-2rh se obtuvo de EuroCetus (Amsterdam, Holanda).
Las concentraciones de IL-2rh están expresadas en
unidades internacionales (UI), donde 6.000 UI equivalen a 1.000
unidades Cetus.
En un primer juego de experimentos, receptores F1
BALB/c x C57BL/6 (F1) se inocularon con 10^{5} células de
leucemia BCL1. Las células BCL1 son de origen BALB/c. Los ratones
recipiente se acondicionaron con irradiación corporal total (ICT) a
750 cGY; 24 horas después los ratones acondicionados recibieron
tratamiento de alo-CMI usando 15 x 10^{6} células
del bazo obtenidas de donantes C57BL/6 (experimento) o F1 (control).
Las células del bazo usadas durante la alo-CMI
fueron tanto tratadas como no tratadas con anticuerpos monoclonales
específicos para eliminar subgrupos de células T bien definidos (CD4
o CD8). Las células CD4+ se eliminaron con el anticuerpo YTS 191, y
las células CD8+ se eliminaron con el anticuerpo YTS 169. Ambos
anticuerpos son IgG2b y, así pues, se unen efectivamente al sistema
reticuloendotelial Fc-positivo del recipiente
huésped, resultando en lisis celular a través de citotoxicidad
mediada por células anticuerpo dependiente (CCAD). Los anticuerpos
fueron proporcionados por los Drs. Steve Cobbold y Herman Waldman,
Cambridge University, Reino Unido.
Para evaluar los efectos de la
alo-CMI en la eliminación de las células tumorales
en el recipiente huésped, 10^{5} células del bazo de receptores
tratados a los 49 días de la alo-CMI se
transfirieron adoptivamente a receptores BALB/c secundarios. Se hizo
un seguimiento de la leucemia en los receptores secundarios para
evaluar si las células del bazo obtenidas de los animales tratados
contenían células tumorales clonogénicas.
Los resultados se muestran en la Figura 6. La
gráfica es un mezcla de los dos experimentos en los que 9/10 y 8/10,
respectivamente de los receptores tratados con células del bazo con
eliminación de CD4 permanecieron libres de enfermedad, mientras 0/7
y 0/10 de los receptores tratados con células del bazo con
eliminación de CD8 permanecieron libres de enfermedad. Los datos
indican que las células CD8+, pero no las células CD4+, fueron
capaces de provocar una respuesta ICT en los ratones recipiente.
En un segundo grupo de experimentos, se evaluaron
de nuevo subgrupos de células T, esta vez como LAD administrados
junto con IL2rh in vivo. Los receptores F1 se inocularon con
10^{5} células de leucemia BCL1. Los receptores se acondicionaron
con ICT a 750 cGY. Al día siguiente cada recipiente recibió 10 X
10^{6} linfocitos activados de donante(LAD). Los LAD
(células del bazo activadas in vitro con IL2rh a 6000 UI/ml
durante 4 días) se administraron no tratados o
pre-tratados con los anticuerpos
anti-CD4 y anti-CD8 descritos
anteriormente para eliminar las poblaciones celulares de subgrupos
de células T bien definidos. Para amplificar los efectos potenciales
anti-tumorales in vivo y para investigar si
la falta de subgrupos de células T bien definidos puede compensarse
con un tratamiento in vivo con IL-2rh, se les
administraron a los receptores 120.000 UI de IL-2rh
intraperitonealmente dos veces al día durante cinco días.
Para evaluar los efectos de la
alo-CMI en la eliminación de las células tumorales
en el receptor huésped, se transfirieron adoptivamente 10^{5}
células del bazo de receptores tratados a los 12 días de la
alo-CMI a receptores BALB/c secundarios. Se hizo un
seguimiento de la leucemia en los receptores secundarios para
evaluar si las células del bazo obtenidas de los animales tratados
contenían células tumorales clonogénicas.
Los resultados se muestran en la Figura 7, que
resume tres experimentos separados. Los datos demuestran que la
IL-2rh puede aumentar y restaurar una actividad
completa ICT a los LAD incluso si las células CD4 se eliminan. Así
pues, la IL-2rh puede sustituir a las células CD4
bajo esas condiciones. Por lo contrario, los LAD con eliminación de
CD8+ no recuperan una actividad completa ICT mediante el tratamiento
adicional in vivo con IL-2rh. Estos datos
confirman que los efectos anti-leucemia son mediados
por células T CD8+ y además, indican que estos efectos pueden
potenciarse mediante un tratamiento in vivo con
IL-2rh.
Claims (12)
1. El uso de linfocitos alogénicos en la
manufactura de un medicamento para el tratamiento de un paciente de
cáncer humano, en un régimen que causa una respuesta celular
injerto-contra-célula maligna ligera
o clínicamente significativa y carente de enfermedad
injerto-contra-huésped, habiendo
sido este paciente sometido a un procedimiento de reducción de
células malignas y habiéndose sometido posteriormente a un
transplante autólogo de células madre relacionado con el mencionado
procedimiento de reducción, estando dicho paciente en riesgo de
recidiva de la enfermedad debido a una población de células
malignas residuales que pudiera permanecer viable en dicho paciente
tras el mencionado procedimiento de reducción, y con su uso durante
la fase en la que dicho paciente tiene una hematopoyesis
parcialmente recuperada pero no se encuentra completamente
inmunoreconstituido.
2. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 en
el que el medicamento incluye al menos un activador de células
T.
3. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2
en el que dichos linfocitos alogénicos se seleccionan para dar
lugar a una actividad
injerto-contra-huésped
sustancialmente disminuida comparado con los linfocitos no
seleccionados.
4. El uso de acuerdo con la Reivindicación 3, en
el que dichos linfocitos seleccionados son linfocitos CD8+.
5. El uso de acuerdo con la Reivindicación 3, en
el que dichos linfocitos seleccionados son de HLA compatible con
dicho paciente.
6. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2
en el que dichos linfocitos de HLA compatible con dicho
paciente.
7. El uso de un activador de células T en la
manufactura de un medicamento, en el que el medicamento es para su
administración concomitante con un medicamento que incluye
linfocitos alogénicos para el tratamiento de un paciente de cáncer
humano, en un régimen que cause una respuesta celular ligera
injerto-contra-célula maligna, o
clínicamente significativa y carente de enfermedad
injerto-contra-huésped, habiendo
sido sometido dicho paciente a un procedimiento de reducción de
células malignas y habiéndose sometido posteriormente a un
transplante autólogo de células madre relacionado con dicho
procedimiento de reducción, teniendo dicho paciente riesgo de
recidiva de la enfermedad debido a una población de células
malignas residuales que pudiera permanecer viable en dicho paciente
tras el mencionado procedimiento de reducción, con su uso durante
la fase en la que dicho paciente tiene una hematopoyesis
parcialmente recuperada pero no se encuentra completamente
inmunoreconstituido.
8. El uso como en la Reivindicación 6 ó 7, en el
que dicho activador de células T incluya al menos un activador de
la vía de transducción de señales de las células T.
9. El uso como en la Reivindicación 8, en el que
dicho activador de la vía de transducción de señales de las células
T se seleccione de entre IL1, 1L2, IL4, IL5, IL6, IL7, IL12, IL13,
IFN\alpha, IFN\gamma, TNF\alpha, anti-CD3,
anti-CD28, fitohemaglutinina,
concanavalina-A, y ésteres de forbol.
10. El uso como en cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes, en el que dichas células malignas
sean células de leucemia.
11. El uso como en cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 9, en el que dichas células malignas sean
células de linfoma.
12. El uso como en cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 9, en el que dichas células malignas sean
células de cáncer de mama.
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