JP4917201B2 - 臍帯血移植後の腫瘍および各種感染症の予防・治療用製剤、臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤、臍帯血移植後の腫瘍および各種感染症の予防・治療用製剤ならびに臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤の製造方法。 - Google Patents
臍帯血移植後の腫瘍および各種感染症の予防・治療用製剤、臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤、臍帯血移植後の腫瘍および各種感染症の予防・治療用製剤ならびに臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤の製造方法。 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、臍帯血由来活性化リンパ球及び該リンパ球を主成分とする製剤ならびに該製剤の製造方法、該製剤調整用キットに関し、腫瘍や各種感染症の再発予防および治療、ならびに各種臓器等の幹細胞の生着促進等に供することを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
リンパ球は、生体防御のための免疫系を担う重要な手段として近時大いに注目されている。 特にＴリンパ球は、細胞性免疫を担う重要な細胞の一つであり、これらはモノクローナル抗体の反応性により次のように分類される。 例えば、抗ＣＤ３抗体（ＣＤは cluster of differentiation の略）との反応性を有するＴリンパ球は、ＣＤ３陽性細胞と分類され、これらについては発現される抗原とその機能の関係に関する多くの研究が行われている。
【０００３】
またＣＤ３陽性細胞のうちＣＤ４５ＲＡ抗原を発現するものはナイーブＴリンパ球であり、一般的には抗腫瘍活性などを示さないものと考えられている。 これに対して、上記ＣＤ３陽性細胞のうちＣＤ４５ＲＯ抗原を発現するものはメモリーＴリンパ球であり、抗腫瘍活性等の作用を有することが知られる。 また本発明者である関根は、これまでにリンパ球を固相化抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖できること及び、これによって増殖させた自己由来リンパ球は、抗腫瘍効果を有することを既に報告している（特開平３−８００７６号公報）。
【０００４】
またこれ以外にも抗ＣＤ３抗体あるいはインターロイキン２を用いて末梢血等に由来するリンパ球の増殖が可能であること、及びこれによって得られた自己由来リンパ球が抗腫瘍活性を有することについても数多く報告されている。 さらに伊藤等は、抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖させた自己由来リンパ球が先天性免疫不全患者のウイルス感染症に有効であることを既に報告している〔伊藤仁也、関根暉彬；医学のあゆみ、１８１巻、６号、４２６−４２７頁（１９９７年）〕。
【０００５】
さらに骨髄移植の分野においては、患者とドナーの白血球血液型（以下、ＨＬＡと略す）が一致した場合にのみ行われるが、本ＨＬＡには数多くの種類が存在し、患者とドナーとの間でのＨＬＡ完全一致は極めてまれであるところから、実際にはＨＬＡの主要なものが一致していれば骨髄移植がおこなわれている。 しかし、ＨＬＡが完全に一致しないため、骨髄移植にともなって Graft vs. Host Diseases（以下、単に「ＧＶＨＤ」と略す）が引き起こされるおそれがある。
【０００６】
このＧＶＨＤによる疾患は重篤な症状が示されることから、本疾患の治療目的でも免疫抑制剤が使用される。 この免疫抑制剤を投与された患者は、ＧＶＨＤ自体からは一応回復できるものの、免疫抑制状態となりサイトメガロウイルスやエプスタイン・バー・ウイルス感染症を発症し、多くの場合死に至る危険性が高い。 そこでElizabeth らは、このような免疫抑制状態で起こるウイルス感染症を予防・治療するために、骨髄の供与者のリンパ球からサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８陽性細胞を誘導し、骨髄移植患者のサイトメガロウイルス感染症を治療できることを報告している（Elizabeth a.Walter,M.D. et al.，N .Engl. J .of Med .，Vol.333，p.1038-1044，（1995））。
【０００７】
さらに臨床においても、アロジェニックなリンパ球をフェレーシスなどにより調製し、これを白血病患者の治療〔 Donor Leukocyte Transfusion（以下、ＤＬＴと略す）〕に用いることもおこなわれている。 しかしＤＬＴは、治療効果が高いものの、急性のＧＶＨＤが５０％から８０％の患者に認められ、致死的なＧＶＨＤが２０％前後にも達することが認められる〔 Kolb,H.J.et al.，Blood.， Vol.86，p.2041-2050,（1995）、Slavin,S.et al.，Exp.Hematol.，Vol.23，p. 1553-1562，（1995）〕。 また、フェレーシスには数時間もの時間がかかり、ドナーへの負担が非常に大きいという難点がある。
【０００８】
さらにＧｉｒａｌｔらは、ＣＤ８陽性細胞を除去した白血球を用いたＤＬＴについて報告している〔Giralt,S.et al.，Blood.，Vol.86，p.4337-4343，（1995）〕。 またＲｉｔｚらは、フェレーシスにより調製したＣＤ４陽性細胞を使用したＤＬＴについて報告している〔Claret EJ.et al ，J.Clin.invest，Vol.100，No.4， p.588-866，（1997）〕。 上記いずれの場合もＧＶＨＤを起こさずにＧＶＬ（ Graft versus leukemia ： 軽度のＧＶＨ反応が患者にとって有利に働く反応）効果が誘導されたことを報告しているが、そのＧＶＬ効果は弱い。
【０００９】
更に近年、末梢血や骨髄から調製される細胞の代わりに臍帯血に含まれる細胞を骨髄移植の代わりに使用（臍帯血移植と呼ぶことがある）する試みについても研究されている。 しかし一般的に臍帯血中に含まれるリンパ球は、抗原刺激を受けていないナイーブなリンパ球であり、一般的には抗腫瘍活性及び抗ウイルス効果は無いと考えられている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
臍帯血は臍の緒に含まれる血液であり、骨髄や末梢血から細胞を調製するよりもドナーの負担が小さく、またＨＬＡの拘束性も小さい。 しかしながら、臍帯血移植は、腫瘍の再発率が高く、しかもウイルス感染症や移植した細胞の生着において依然として問題点を有している。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような臍帯血移植が有する腫瘍の再発率の高さや、ウイルス感染症の発症の危険性を無くし、しかも移植した細胞の生着性を改善するための薬剤や方法を開発することを目標にして鋭意研究を行い、本発明を完成するに至った。 すなわち具体的には、本発明は臍帯血中に含まれる細胞をインターロイキン２と抗ＣＤ３抗体により刺激・増殖させることによりメモリーＴ細胞の臍帯血由来の活性化リンパ球を調製することに成功した。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明の臍帯血由来の活性化リンパ球および該リンパ球を主成分とした予防用および治療用製剤の製造方法について説明する。
【００１３】
〔リンパ球の採取〕
本発明の臍帯血由来の活性化リンパ球は、臍の緒から採取した臍帯血より採取したものを増殖・活性化させて得ることができる。 採血方法としては、臍の緒の血管からの採血が好ましく、この場合血液の凝固が起こらないように、採血した血液にヘパリンやクエン酸を加えることができる。 また、臍帯血は臍帯血バンクに保管される移植用の臍帯血の一部を使用することができる。 本発明の臍帯血由来の活性化リンパ球は、０．００１ｍｌから１００ｍｌの臍帯血を材料として調製することができる。
【００１４】
〔臍帯血由来活性化リンパ球〕
臍帯血由来の活性化リンパ球の増殖については、周知のリンパ球細胞の培養法によって実施することができ、またその培養法は、増殖効率の観点からインターロイキン２及び抗ＣＤ３抗体両方の存在下において培養することが好ましい。
【００１５】
この場合に使用するインターロイキン２は、市販されているものを用いることができ、培養用培地液１〜２０００Ｕ／ｍｌの濃度となるように用いるのが好ましい。 インターロイキン２は、水、生理食塩液、ダルベッコりん酸緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＡＩＭ−Ｖ等の一般に広く用いられる細胞培養用培地液等に溶解して使用することができる。 一度溶解したものは、活性の低下を防ぐため、冷蔵保存することが好ましい。
【００１６】
なおこの場合に使用される培養用培地液としては、リンパ球細胞の培養に適したものであれば特に制限されず、例えば血清等の生物由来の培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地などが使用でき、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が好ましいものとして挙げられ、とりわけてＲＰＭＩ−１６４０が特に好ましい。 培養用培地は、正常ヒト血清を添加したものが増殖効果に優れ好ましく、またこれらの培地は市販品を用いることもできる。
【００１７】
培養は、一般的な細胞培養の方法、例えば、ＣＯ２インキュベータ内で行うことができる。 ＣＯ２濃度は１〜１０％、特に５％が好ましく、温度は、３０〜４０℃、特に３７℃が好ましい。 この培養には、日数に特に制限はないが、抗ＣＤ３抗体の刺激情報が細胞に伝達されることが前提となるため、２〜２０日間程度行うことが好ましく、特に３〜１４日間おこなうことが、より一層好ましい。 この培養の期間内には、顕微鏡下で細胞の状態を観察し、適宜細胞数を計測しながら、培養液を適宜添加するのが好ましい。
【００１８】
この培養では、通常、培養開始１〜２日目には目立った細胞の増殖はないが、３日目頃から細胞増殖が観察され、順調に増殖し出すと培養液がオレンジ色から黄色に変化するようになる。 培養液の添加量は、添加前の培養中の液量に対して０．１〜５倍程度が好ましい。 その添加割合は、培養液の劣化及びインターロイキン２活性の低下を防ぐために、１〜７日に１回行うことが好ましい。
【００１９】
抗ＣＤ３抗体存在下の培養後、さらに抗ＣＤ３抗体の刺激無しに培養を継続することもできる。 すなわち、抗ＣＤ３抗体を固相化していない器具、例えば培養用フラスコ、ローラーボトル、培養用ガスパーミアブルバッグ等で投与まで培養を継続することができる。 これら条件下でのリンパ球細胞の培養は、抗ＣＤ３抗体の刺激がないこと以外は、抗ＣＤ３抗体存在下の培養の条件と同じであることが好ましく、ヒト血清の濃度、無血清培地を適時使用することが、作業性、コスト性、安全性等において、より一層好ましい。
【００２０】
培養に際しては、例えばインターロイキン２を含む培養用培地液に臍帯血あるいは単核球細胞を浮遊させ、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器に入れ培養を開始することができる。 さらに、必要により各種サイトカインや増殖・活性化因子、マイトージェン等を使用して臍帯血由来の活性化リンパ球の増殖・活性化を行うこともできる。
【００２１】
なお、リンパ球細胞の刺激に用いる抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を用いて動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、コスト等に優れた市販のＯＫＴ−３抗体（製造元：オーソファーマスーティカル）が使用できる。 しかし、これ以外にもリンパ球細胞の増殖・活性化を促進できる抗体であれば、特に限定されるものではない。
【００２２】
抗ＣＤ３抗体は、リンパ球細胞の増殖効率、操作の容易性の観点から、固相化して用いるのが好ましい。 抗体を固相化する器具としては、ガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質の培養容器が挙げられる。 この場合、入手が容易であることから市販のプラスチック製の滅菌済み細胞培養フラスコ等を使用することもでき、その大きさは適宜選択できる。
【００２３】
固相化は、抗ＣＤ３抗体の希釈液を上記した固相化する器具に添加し、例えば、４〜３７℃で２〜２４時間静置することによって行うことができる。 また本抗ＣＤ３抗体の固相化には、抗ＣＤ３抗体を滅菌したダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に０．１〜３０μｇ／ｍｌの濃度に希釈して用いることが好ましい。 また固相化後、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することができ、使用時には液を除去して、必要あれば、常温のダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄して使用することができる。
【００２４】
上記により得られた臍帯血由来活性化リンパ球は、これを加工し、あるいは後記するように製剤化し、これを例えば腫瘍や各種感染症の予防あるいは治療薬等、生体防御手段として広範囲に使用が可能である。
【００２５】
〔臍帯血由来活性化リンパ球を主成分とする製剤〕
さらに増殖させた臍帯血細胞を主成分とする臍帯血由来の活性化リンパ球を、例えばヒトアルブミンを含む輸液用生理食塩液中に懸濁した形態で製剤化することにより、腫瘍あるいは各種感染症の予防および治療用製剤として用いることができる。
【００２６】
なおここでいう「製剤」とは、臍帯血由来の活性化リンパ球を主成分として含有した生体防御機能を有するすべての材料を意味し、臍帯血由来の活性化リンパ球を含んでいればどのような形態でも良い。 例えば、適当な溶液に臍帯血由来の活性化リンパ球を懸濁させた形態のものでもよく、特に上記したヒトアルブミンを含む輸液用生理食塩液に臍帯血由来の活性化リンパ球を懸濁した形態の製剤が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２７】
この場合臍帯血を直接、試験管内で増殖させ、この中から臍帯血由来の活性化リンパ球を主成分として含む製剤を調製するか、または、臍帯血より単核球細胞を分離し、これを試験管内で増殖させることにより臍帯血由来の活性化リンパ球を主成分として含む製剤を調製し、製造することができる。
【００２８】
また本発明の製剤に含まれる臍帯血由来の活性化リンパ球は、種々の遺伝子を導入したり、本来持っているような遺伝子を欠落あるいは変異させたものであってもよい。 また、ヒト免疫不全ウイルス感染に必要なコファクターを欠如した臍帯血由来の活性化リンパ球使用により、ヒト免疫不全ウイルスの予防あるいは治療、さらには、ヒト免疫不全ウイルスにより引き起こされる免疫不全状態での各種感染症の予防あるいは治療にも使用できる。 さらに本発明の製剤は、骨髄移植の分野において、患者とドナーのＨＬＡが一致している場合だけでなく、ＨＬＡの一致していない場合にも使用できる。
【００２９】
上記の臍帯血由来活性化リンパ球を主成分とする製剤は、癌患者、免疫不全症患者、自己免疫性疾患、アレルギー患者等の臍帯血移植の対象疾患患者や、各種感染症患者に対する予防・治療に広く用いることができる。 また本発明の製剤は、腫瘍の再発を予防するだけでなく、腫瘍の治療用にも使用でき、また白血病その他、各種固形腫瘍に対しての治療にも使用できる。
【００３０】
すなわち、癌としては、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、前立腺癌、白血病、肉腫、脳腫瘍等が挙げられる。 また免疫不全症に関しては、先天性の免疫不全症と後天的な免疫不全症等が挙げられる。 先天性の免疫不全症としては、重症複合免疫不全症、Wiscott Aldrich 症候群、アデノシン・デアミネース欠損症、プリンヌクレオチド・ホスホリラーゼ欠損症等が例示されるが、これらの免疫不全症のみに限定されるものでない。
【００３１】
さらに後天的な免疫不全症としては、抗がん剤、免疫抑制剤、ステロイド剤等の使用による続発性免疫不全や、ヒト免疫不全ウイルスの感染によるエイズ等が例示されるが、これらの免疫不全症のみに限定されるものでない。 また自己免疫性疾患としては、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シューグレン症候群、重症筋無力症、悪性貧血、橋本病等が例示されるが、これらの自己免疫性疾患のみに限定されるものでない。
【００３２】
また本発明の製剤は、免疫能が低下した患者だけでなく、特定のウイルス等に対しての免疫能が欠如あるいは低下した患者に対しても予防的あるいは治療的に使用することができる。 アレルギー性疾患としては、気管支喘息、スギ花粉症、じんま疹等が例示されるが、これらのアレルギー性疾患のみに限定されるものではなく、また各種アレルギーの治療あるいは症状の軽減を目的として使用することもできる。
【００３３】
さらに感染症としては、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、クラミジア感染症、マイコプラズマ感染症等が例示される。 上記のウイルス感染症としては、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス感染症等が例示されるが、これらのウイルス感染症のみに限定されるものでなく、これ以外の各種ウイルス感染症、例えばヘルペスシンプレックスウイルス、バリセロゾスターウイルス等のヘルペス属ウイルス、あるいはヒト白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等の各種レトロウイルスによる感染症の予防及び治療用にも広く使用が可能である。
【００３４】
また上記の細菌感染症としては、緑膿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌等を原因とするものに使用することができるが、これらのほかにも人に病原性を示す細菌による感染症であればいずれの感染症に対しても使用できる。 特に原因となる病原体が未知の場合や同定が困難な病原体による感染症、あるいはそれに付随するような疾患の治療や予防に対しても使用できる。
【００３５】
〔臍帯血由来活性化リンパ球を主成分とする製剤の調製用キット〕
本発明の臍帯血由来活性化リンパ球は、製剤としてその構成成分を単独の試薬として使用できるほかに、例えばインターロイキン２を含む培養液と抗ＣＤ３抗体固相化フラスコを構成成分として組合わせたキットとして作成し、これを使用することにより、より容易に本発明の製剤の調製を行うことができる。
【００３６】
なおこの場合に使用する培養液は、抗ＣＤ３抗体固相化フラスコに予め分注しておくことができ、さらにこれを凍結保存しておくこともできる。 このように、少なくとも２個以上の構成成分を複数の試薬として組合わせたキットとして作成し、これを使用することにより、より容易に本発明の製剤の調製を行うこともができる。
【００３７】
上記した本発明のすべてに用いることの可能な臍帯血由来の活性化リンパ球あるいはそれを含む製剤は、これを冷凍保存し、必要に応じて各種疾患の予防あるいは治療に使用することができる。
【００３８】
〔投与量〕
さらに臍帯血由来活性化リンパ球を主成分とする製剤の投与量については、患者の状態や治療対象等により、適宜選択できるが、通常、体重１Ｋｇあたり１×１０２個から１×１０９個である。 またこの場合、製剤の効力の観点から、より好ましくは、１×１０３個から１×１０８個の範囲が最良である。
【００３９】
〔投与形態・方法〕
製剤の投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく、前記した細胞をヒト血清アルブミンが０．０１〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤がより好ましい。 投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。 投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、１〜５００ｍｌとするのが好ましく、この液量に前記の量の細胞が含まれるようにするのがより好ましい。 さらに投与頻度は１回／日〜１回／月が良く、また投与回数は少なくとも１回以上は必要である。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する
〔実施例１〕
１．細胞培養用フラスコの調製
ダルベッコりん酸緩衝液（発売元：株式会社ニプロ：１０００ml、以下ＰＢ Ｓ（−）と略すこともある）で５μｇ／ｍｌに希釈調製しておいたＯＫＴ３（輸入発売元：ヤンセン協和株式会社、製造元：オーソファーマスーティカル：ＯＫＴ３注）溶液を、培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製：MS-200 5R）に３ｍｌ入れ、底面に溶液を均一に浸した。
【００４１】
一晩冷蔵庫で保存後、フラスコのＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取った。 生理食塩水（光製薬）１０ｍｌをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。 再度、クリーンベンチ内で生理食塩水（光製薬）１０ｍｌをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後に蓋を開けて液を捨てるとともに、フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。
【００４２】
そのフラスコに培養用培地［培地(RPMI1640+7)〔株式会社日研生物研究所製〕４３．５ｍｌ、３５，０００Ｕ／ｍｌ ＩＬー２（シータス社製）１ｍｌ、ファンギゾン〔輸入総発売元：ライフテックオリエンタル株式会社１５２９５−０１７〕０．５ｍｌ、ヒト血清０．５ｍｌ、を混合して培養用培地とした（以下、単に「培養用培地」と略すこともある）］を５ｍｌ加えた。 フラスコは冷凍庫で使用直前まで保存した。
【００４３】
２．採血
３名分の臍の緒から臍帯血５〜２０ｍｌをそれぞれヘパリン加採血した。
【００４４】
３．臍帯血の培養
上記１で調製した培養用フラスコを冷凍庫から出し、室温で１０分間放置した。 培養用培地が完全に溶けたことを確認して、上記２で採血した臍帯血の内１００μｌを３個のフラスコにそれぞれ入れ臍帯血が均一に混ざるように軽く攪拌した後、３７℃インキュベーター（三洋電機株式会社製：ステリカルトインキュベータＭＩＰ−３０３３、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）で培養を開始した（培養０日目）。
【００４５】
４．チュルク液による細胞数の測定
前記２．において、採血した臍帯血１０μｌを４０μｌのチュルク液（武藤化学薬品社製）と混合し、血球計算版（エルマー社製：９７３１）に１０μｌアプライし、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製：２１１３２０）下で細胞数を測定した。 その結果、フラスコ内総細胞数はそれぞれ１．３×１０５個、１．５×１０５個、１．４×１０５個であった。
【００４６】
５．細胞表面抗原解析のための臍帯血単核球の分離
クリーンベンチ（昭和科学株式会社製：Ｓ−１１００）内で無菌的に（以下単に「無菌的に」と略す）、採血した注射筒の注射針を、接合部近くを触らないようにはずし、19G×1 1/2”注射針（発売元：株式会社ニプロ）につけ替えた。 １５ｍｌ遠沈管（岩城硝子株式会社製：２３２７−０１５）に、洗浄用培地（RPMI1640＋6 ）（５００ｍｌ、株式会社日研生物医学研究所製：GM1106）を５ｍｌ注ぎ込み、さらにその遠沈管内に、採血した血液全てをゆっくりと注いだ。 遠沈管の蓋を完全に閉めた後、２〜３回転倒混和させた。
【００４７】
１０ｍｌピペット（輸入発売元：コーニングコースタージャパン：４１０５）でリンホセパールＩ（１００ｍｌ株式会社免疫生物研究所製：23010） を１５ｍｌ遠沈管に３ｍｌ入れ、次に、洗浄用培地で希釈した臍帯血１０ｍｌを遠沈管に、液面を乱さないようにゆっくり重層した回転数１，８００ｒｐｍ、遠心分離温度２０℃、ブレーキをＯＦＦの状態で１５分間遠心した（遠心機は株式会社コクサン製：Ｈ−７００Ｒを使用）。
【００４８】
さらに遠心後、無菌的に遠沈管のリンパ球層の約１ｃｍ上までリンパ球細胞を吸い取らないように注意深く遠心上清を吸引機でゆっくり吸い取った。 ５ｍｌピペットマンで血餅の層を吸い取らないようにリンパ球細胞の層を採り、あらかじめ、洗浄用培地(RPMI1640+6)を１０ｍｌ入れておいた１５ｍｌ遠沈管内に回収した。 遠沈管の蓋を閉め２〜３回転倒混和した後、回転数１，８００ｒｐｍ、遠心分離温度２０℃の状態で１０分間遠心した。
【００４９】
さらに遠心後、上清を捨て、細胞沈渣をボルテックスミキサーにかけて、良く分散させた。 最後に洗浄用培地を１０ｍｌ入れ、良く転倒混和した後、細胞数測定用に１０μｌ、ＣＤ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４、ＣＤ８含有率測定用及び細胞の表面抗原の解析用に１．５ｍｌマイクロチューブ（輸入発売元：アシスト株式会社：７２．６９０）３本に５００μｌずつサンプリングした。
【００５０】
６．細胞の表面抗原の解析
上記５．において調製した３本の細胞懸濁液を６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた（遠心機は株式会社佐久間製作所製：Ｍ−１５０を使用した）。 上清をきれいに吸い取った後、チューブ１にはＰＢＳ（−）８μｌ、ＣＤ３／ＨＬＡ―ＤＲ抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４００４８）８μｌ、チューブ２にはＰＢＳ（−）８μｌ、ＣＤ４／ＣＤ８抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４００３９）８μｌをそれぞれのチューブに入れ３０分間反応させた。
【００５１】
なお、チューブ３は非特異的反応用コントロールとして、ＰＢＳ（−）８μｌのみを加えた。 反応後、シース液（コールター株式会社製：アイソトンＩＩ）８００μｌをそれぞれのチューブにいれボルテックスで攪拌した後、６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。 上清みをきれいに吸い取った後、シース液を８００μｌ加え、ピペッティングし、細胞をほぐした後、ＦＡＣＳ測定用チューブ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：２０５２）内に入れた。
【００５２】
ＦＡＣＳはＦＡＣＳｃａｎ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を使用し、またＦＡＣＳによる測定についてはマニュアルに従っておこなった。 その結果、ＣＤ３、ＨＬＡ―ＤＲ、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞 の含有率は、それぞれ２８、３、３９及び７、１８、１、１７及び３、１５、４、１６及び８（単位は、いずれも％）であった。
【００５３】
７．培養７日目のチュルク液による細胞数の測定
前記３．より培養開始した細胞７日目の細胞１０μｌを４０μｌのチュルク液（武藤化学薬品社製）と混合し、血球計算版（エルマー社製：９７３１）に１０μｌアプライし、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製：２１１３２０）下で細胞数を測定した。 その結果、フラスコ内総細胞数はそれぞれ１．７×１０７個、１．９×１０７個、１．７×１０７個であった。
【００５４】
８．培養７日目の細胞表面抗原の解析
前記４．と同様にして前記３．より培養開始した細胞７日目の細胞のＦＡＣＳによる細胞表面抗原の解析を行った。 その結果、ＣＤ３、ＨＬＡ―ＤＲ、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の占める比率はそれぞれ９８、１０、７９及び２０、９８、１７、２２、７８及び２０、９７、５６、７２及び２７（単位はいずれも％）であった。
【００５５】
さらに前記４．と同様にして、前記３．より培養開始した細胞７日目の細胞のＣＤ４５ＲＡ抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４７７２３）、ＣＤ４５ＲＯ抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４７９６７）の陽性率をＦＡＣＳで解析した。 その結果、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の占める比率は７％及び７３％であった。 臍帯血由来の活性化リンパ球は、殆どＣＤ４５ＲＯが陽性であることから、十分な抗腫瘍効果や抗感染防御作用を有すると考えられる。
【００５６】
〔実施例２〕
臍帯血単核球の培養
前記５．で単離した臍帯血単核球をそれぞれ前記１．で調製した細胞培養用フラスコで培養したところ、細胞の増殖が確認された。
【００５７】
〔実施例３〕
造血幹細胞生着促進検討
臍帯血移植患者に、実施例１と同様にして移植した臍帯血の一部から調製した活性化リンパ球を臍帯血移植後に投与したところ、移植患者において速やかに抗体産生が開始されたことから、臍帯血由来の活性化リンパ球は造血幹細胞生着促進作用を有することが明らかとなった。
【００５８】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明は臍帯血由来の増殖活性化リンパ球、もしくは増殖させた臍帯血細胞を主成分とする臍帯血由来の活性化リンパ球を含有させたことを特徴とする腫瘍および各種感染症の予防および治療用製剤であるために、移植時に腫瘍再発の予防・治療、各種感染症の予防・治療、幹細胞の生着促進等に幅広く使用することができるだけでなく、移植時以外にも腫瘍再発の予防・治療、各種感染症の予防・治療に使用することができる。 また、幹細胞の生着促進に使用できるほか、各種臓器などの生着促進用としても使用できる。
【産業上の利用分野】
本発明は、臍帯血由来活性化リンパ球及び該リンパ球を主成分とする製剤ならびに該製剤の製造方法、該製剤調整用キットに関し、腫瘍や各種感染症の再発予防および治療、ならびに各種臓器等の幹細胞の生着促進等に供することを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
リンパ球は、生体防御のための免疫系を担う重要な手段として近時大いに注目されている。 特にＴリンパ球は、細胞性免疫を担う重要な細胞の一つであり、これらはモノクローナル抗体の反応性により次のように分類される。 例えば、抗ＣＤ３抗体（ＣＤは cluster of differentiation の略）との反応性を有するＴリンパ球は、ＣＤ３陽性細胞と分類され、これらについては発現される抗原とその機能の関係に関する多くの研究が行われている。
【０００３】
またＣＤ３陽性細胞のうちＣＤ４５ＲＡ抗原を発現するものはナイーブＴリンパ球であり、一般的には抗腫瘍活性などを示さないものと考えられている。 これに対して、上記ＣＤ３陽性細胞のうちＣＤ４５ＲＯ抗原を発現するものはメモリーＴリンパ球であり、抗腫瘍活性等の作用を有することが知られる。 また本発明者である関根は、これまでにリンパ球を固相化抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖できること及び、これによって増殖させた自己由来リンパ球は、抗腫瘍効果を有することを既に報告している（特開平３−８００７６号公報）。
【０００４】
またこれ以外にも抗ＣＤ３抗体あるいはインターロイキン２を用いて末梢血等に由来するリンパ球の増殖が可能であること、及びこれによって得られた自己由来リンパ球が抗腫瘍活性を有することについても数多く報告されている。 さらに伊藤等は、抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖させた自己由来リンパ球が先天性免疫不全患者のウイルス感染症に有効であることを既に報告している〔伊藤仁也、関根暉彬；医学のあゆみ、１８１巻、６号、４２６−４２７頁（１９９７年）〕。
【０００５】
さらに骨髄移植の分野においては、患者とドナーの白血球血液型（以下、ＨＬＡと略す）が一致した場合にのみ行われるが、本ＨＬＡには数多くの種類が存在し、患者とドナーとの間でのＨＬＡ完全一致は極めてまれであるところから、実際にはＨＬＡの主要なものが一致していれば骨髄移植がおこなわれている。 しかし、ＨＬＡが完全に一致しないため、骨髄移植にともなって Graft vs. Host Diseases（以下、単に「ＧＶＨＤ」と略す）が引き起こされるおそれがある。
【０００６】
このＧＶＨＤによる疾患は重篤な症状が示されることから、本疾患の治療目的でも免疫抑制剤が使用される。 この免疫抑制剤を投与された患者は、ＧＶＨＤ自体からは一応回復できるものの、免疫抑制状態となりサイトメガロウイルスやエプスタイン・バー・ウイルス感染症を発症し、多くの場合死に至る危険性が高い。 そこでElizabeth らは、このような免疫抑制状態で起こるウイルス感染症を予防・治療するために、骨髄の供与者のリンパ球からサイトメガロウイルスに特異的なＣＤ８陽性細胞を誘導し、骨髄移植患者のサイトメガロウイルス感染症を治療できることを報告している（Elizabeth a.Walter,M.D. et al.，N .Engl. J .of Med .，Vol.333，p.1038-1044，（1995））。
【０００７】
さらに臨床においても、アロジェニックなリンパ球をフェレーシスなどにより調製し、これを白血病患者の治療〔 Donor Leukocyte Transfusion（以下、ＤＬＴと略す）〕に用いることもおこなわれている。 しかしＤＬＴは、治療効果が高いものの、急性のＧＶＨＤが５０％から８０％の患者に認められ、致死的なＧＶＨＤが２０％前後にも達することが認められる〔 Kolb,H.J.et al.，Blood.， Vol.86，p.2041-2050,（1995）、Slavin,S.et al.，Exp.Hematol.，Vol.23，p. 1553-1562，（1995）〕。 また、フェレーシスには数時間もの時間がかかり、ドナーへの負担が非常に大きいという難点がある。
【０００８】
さらにＧｉｒａｌｔらは、ＣＤ８陽性細胞を除去した白血球を用いたＤＬＴについて報告している〔Giralt,S.et al.，Blood.，Vol.86，p.4337-4343，（1995）〕。 またＲｉｔｚらは、フェレーシスにより調製したＣＤ４陽性細胞を使用したＤＬＴについて報告している〔Claret EJ.et al ，J.Clin.invest，Vol.100，No.4， p.588-866，（1997）〕。 上記いずれの場合もＧＶＨＤを起こさずにＧＶＬ（ Graft versus leukemia ： 軽度のＧＶＨ反応が患者にとって有利に働く反応）効果が誘導されたことを報告しているが、そのＧＶＬ効果は弱い。
【０００９】
更に近年、末梢血や骨髄から調製される細胞の代わりに臍帯血に含まれる細胞を骨髄移植の代わりに使用（臍帯血移植と呼ぶことがある）する試みについても研究されている。 しかし一般的に臍帯血中に含まれるリンパ球は、抗原刺激を受けていないナイーブなリンパ球であり、一般的には抗腫瘍活性及び抗ウイルス効果は無いと考えられている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
臍帯血は臍の緒に含まれる血液であり、骨髄や末梢血から細胞を調製するよりもドナーの負担が小さく、またＨＬＡの拘束性も小さい。 しかしながら、臍帯血移植は、腫瘍の再発率が高く、しかもウイルス感染症や移植した細胞の生着において依然として問題点を有している。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような臍帯血移植が有する腫瘍の再発率の高さや、ウイルス感染症の発症の危険性を無くし、しかも移植した細胞の生着性を改善するための薬剤や方法を開発することを目標にして鋭意研究を行い、本発明を完成するに至った。 すなわち具体的には、本発明は臍帯血中に含まれる細胞をインターロイキン２と抗ＣＤ３抗体により刺激・増殖させることによりメモリーＴ細胞の臍帯血由来の活性化リンパ球を調製することに成功した。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明の臍帯血由来の活性化リンパ球および該リンパ球を主成分とした予防用および治療用製剤の製造方法について説明する。
【００１３】
〔リンパ球の採取〕
本発明の臍帯血由来の活性化リンパ球は、臍の緒から採取した臍帯血より採取したものを増殖・活性化させて得ることができる。 採血方法としては、臍の緒の血管からの採血が好ましく、この場合血液の凝固が起こらないように、採血した血液にヘパリンやクエン酸を加えることができる。 また、臍帯血は臍帯血バンクに保管される移植用の臍帯血の一部を使用することができる。 本発明の臍帯血由来の活性化リンパ球は、０．００１ｍｌから１００ｍｌの臍帯血を材料として調製することができる。
【００１４】
〔臍帯血由来活性化リンパ球〕
臍帯血由来の活性化リンパ球の増殖については、周知のリンパ球細胞の培養法によって実施することができ、またその培養法は、増殖効率の観点からインターロイキン２及び抗ＣＤ３抗体両方の存在下において培養することが好ましい。
【００１５】
この場合に使用するインターロイキン２は、市販されているものを用いることができ、培養用培地液１〜２０００Ｕ／ｍｌの濃度となるように用いるのが好ましい。 インターロイキン２は、水、生理食塩液、ダルベッコりん酸緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＡＩＭ−Ｖ等の一般に広く用いられる細胞培養用培地液等に溶解して使用することができる。 一度溶解したものは、活性の低下を防ぐため、冷蔵保存することが好ましい。
【００１６】
なおこの場合に使用される培養用培地液としては、リンパ球細胞の培養に適したものであれば特に制限されず、例えば血清等の生物由来の培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地などが使用でき、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が好ましいものとして挙げられ、とりわけてＲＰＭＩ−１６４０が特に好ましい。 培養用培地は、正常ヒト血清を添加したものが増殖効果に優れ好ましく、またこれらの培地は市販品を用いることもできる。
【００１７】
培養は、一般的な細胞培養の方法、例えば、ＣＯ２インキュベータ内で行うことができる。 ＣＯ２濃度は１〜１０％、特に５％が好ましく、温度は、３０〜４０℃、特に３７℃が好ましい。 この培養には、日数に特に制限はないが、抗ＣＤ３抗体の刺激情報が細胞に伝達されることが前提となるため、２〜２０日間程度行うことが好ましく、特に３〜１４日間おこなうことが、より一層好ましい。 この培養の期間内には、顕微鏡下で細胞の状態を観察し、適宜細胞数を計測しながら、培養液を適宜添加するのが好ましい。
【００１８】
この培養では、通常、培養開始１〜２日目には目立った細胞の増殖はないが、３日目頃から細胞増殖が観察され、順調に増殖し出すと培養液がオレンジ色から黄色に変化するようになる。 培養液の添加量は、添加前の培養中の液量に対して０．１〜５倍程度が好ましい。 その添加割合は、培養液の劣化及びインターロイキン２活性の低下を防ぐために、１〜７日に１回行うことが好ましい。
【００１９】
抗ＣＤ３抗体存在下の培養後、さらに抗ＣＤ３抗体の刺激無しに培養を継続することもできる。 すなわち、抗ＣＤ３抗体を固相化していない器具、例えば培養用フラスコ、ローラーボトル、培養用ガスパーミアブルバッグ等で投与まで培養を継続することができる。 これら条件下でのリンパ球細胞の培養は、抗ＣＤ３抗体の刺激がないこと以外は、抗ＣＤ３抗体存在下の培養の条件と同じであることが好ましく、ヒト血清の濃度、無血清培地を適時使用することが、作業性、コスト性、安全性等において、より一層好ましい。
【００２０】
培養に際しては、例えばインターロイキン２を含む培養用培地液に臍帯血あるいは単核球細胞を浮遊させ、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器に入れ培養を開始することができる。 さらに、必要により各種サイトカインや増殖・活性化因子、マイトージェン等を使用して臍帯血由来の活性化リンパ球の増殖・活性化を行うこともできる。
【００２１】
なお、リンパ球細胞の刺激に用いる抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を用いて動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、コスト等に優れた市販のＯＫＴ−３抗体（製造元：オーソファーマスーティカル）が使用できる。 しかし、これ以外にもリンパ球細胞の増殖・活性化を促進できる抗体であれば、特に限定されるものではない。
【００２２】
抗ＣＤ３抗体は、リンパ球細胞の増殖効率、操作の容易性の観点から、固相化して用いるのが好ましい。 抗体を固相化する器具としては、ガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質の培養容器が挙げられる。 この場合、入手が容易であることから市販のプラスチック製の滅菌済み細胞培養フラスコ等を使用することもでき、その大きさは適宜選択できる。
【００２３】
固相化は、抗ＣＤ３抗体の希釈液を上記した固相化する器具に添加し、例えば、４〜３７℃で２〜２４時間静置することによって行うことができる。 また本抗ＣＤ３抗体の固相化には、抗ＣＤ３抗体を滅菌したダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に０．１〜３０μｇ／ｍｌの濃度に希釈して用いることが好ましい。 また固相化後、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することができ、使用時には液を除去して、必要あれば、常温のダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄して使用することができる。
【００２４】
上記により得られた臍帯血由来活性化リンパ球は、これを加工し、あるいは後記するように製剤化し、これを例えば腫瘍や各種感染症の予防あるいは治療薬等、生体防御手段として広範囲に使用が可能である。
【００２５】
〔臍帯血由来活性化リンパ球を主成分とする製剤〕
さらに増殖させた臍帯血細胞を主成分とする臍帯血由来の活性化リンパ球を、例えばヒトアルブミンを含む輸液用生理食塩液中に懸濁した形態で製剤化することにより、腫瘍あるいは各種感染症の予防および治療用製剤として用いることができる。
【００２６】
なおここでいう「製剤」とは、臍帯血由来の活性化リンパ球を主成分として含有した生体防御機能を有するすべての材料を意味し、臍帯血由来の活性化リンパ球を含んでいればどのような形態でも良い。 例えば、適当な溶液に臍帯血由来の活性化リンパ球を懸濁させた形態のものでもよく、特に上記したヒトアルブミンを含む輸液用生理食塩液に臍帯血由来の活性化リンパ球を懸濁した形態の製剤が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２７】
この場合臍帯血を直接、試験管内で増殖させ、この中から臍帯血由来の活性化リンパ球を主成分として含む製剤を調製するか、または、臍帯血より単核球細胞を分離し、これを試験管内で増殖させることにより臍帯血由来の活性化リンパ球を主成分として含む製剤を調製し、製造することができる。
【００２８】
また本発明の製剤に含まれる臍帯血由来の活性化リンパ球は、種々の遺伝子を導入したり、本来持っているような遺伝子を欠落あるいは変異させたものであってもよい。 また、ヒト免疫不全ウイルス感染に必要なコファクターを欠如した臍帯血由来の活性化リンパ球使用により、ヒト免疫不全ウイルスの予防あるいは治療、さらには、ヒト免疫不全ウイルスにより引き起こされる免疫不全状態での各種感染症の予防あるいは治療にも使用できる。 さらに本発明の製剤は、骨髄移植の分野において、患者とドナーのＨＬＡが一致している場合だけでなく、ＨＬＡの一致していない場合にも使用できる。
【００２９】
上記の臍帯血由来活性化リンパ球を主成分とする製剤は、癌患者、免疫不全症患者、自己免疫性疾患、アレルギー患者等の臍帯血移植の対象疾患患者や、各種感染症患者に対する予防・治療に広く用いることができる。 また本発明の製剤は、腫瘍の再発を予防するだけでなく、腫瘍の治療用にも使用でき、また白血病その他、各種固形腫瘍に対しての治療にも使用できる。
【００３０】
すなわち、癌としては、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、前立腺癌、白血病、肉腫、脳腫瘍等が挙げられる。 また免疫不全症に関しては、先天性の免疫不全症と後天的な免疫不全症等が挙げられる。 先天性の免疫不全症としては、重症複合免疫不全症、Wiscott Aldrich 症候群、アデノシン・デアミネース欠損症、プリンヌクレオチド・ホスホリラーゼ欠損症等が例示されるが、これらの免疫不全症のみに限定されるものでない。
【００３１】
さらに後天的な免疫不全症としては、抗がん剤、免疫抑制剤、ステロイド剤等の使用による続発性免疫不全や、ヒト免疫不全ウイルスの感染によるエイズ等が例示されるが、これらの免疫不全症のみに限定されるものでない。 また自己免疫性疾患としては、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シューグレン症候群、重症筋無力症、悪性貧血、橋本病等が例示されるが、これらの自己免疫性疾患のみに限定されるものでない。
【００３２】
また本発明の製剤は、免疫能が低下した患者だけでなく、特定のウイルス等に対しての免疫能が欠如あるいは低下した患者に対しても予防的あるいは治療的に使用することができる。 アレルギー性疾患としては、気管支喘息、スギ花粉症、じんま疹等が例示されるが、これらのアレルギー性疾患のみに限定されるものではなく、また各種アレルギーの治療あるいは症状の軽減を目的として使用することもできる。
【００３３】
さらに感染症としては、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、クラミジア感染症、マイコプラズマ感染症等が例示される。 上記のウイルス感染症としては、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス感染症等が例示されるが、これらのウイルス感染症のみに限定されるものでなく、これ以外の各種ウイルス感染症、例えばヘルペスシンプレックスウイルス、バリセロゾスターウイルス等のヘルペス属ウイルス、あるいはヒト白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等の各種レトロウイルスによる感染症の予防及び治療用にも広く使用が可能である。
【００３４】
また上記の細菌感染症としては、緑膿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌等を原因とするものに使用することができるが、これらのほかにも人に病原性を示す細菌による感染症であればいずれの感染症に対しても使用できる。 特に原因となる病原体が未知の場合や同定が困難な病原体による感染症、あるいはそれに付随するような疾患の治療や予防に対しても使用できる。
【００３５】
〔臍帯血由来活性化リンパ球を主成分とする製剤の調製用キット〕
本発明の臍帯血由来活性化リンパ球は、製剤としてその構成成分を単独の試薬として使用できるほかに、例えばインターロイキン２を含む培養液と抗ＣＤ３抗体固相化フラスコを構成成分として組合わせたキットとして作成し、これを使用することにより、より容易に本発明の製剤の調製を行うことができる。
【００３６】
なおこの場合に使用する培養液は、抗ＣＤ３抗体固相化フラスコに予め分注しておくことができ、さらにこれを凍結保存しておくこともできる。 このように、少なくとも２個以上の構成成分を複数の試薬として組合わせたキットとして作成し、これを使用することにより、より容易に本発明の製剤の調製を行うこともができる。
【００３７】
上記した本発明のすべてに用いることの可能な臍帯血由来の活性化リンパ球あるいはそれを含む製剤は、これを冷凍保存し、必要に応じて各種疾患の予防あるいは治療に使用することができる。
【００３８】
〔投与量〕
さらに臍帯血由来活性化リンパ球を主成分とする製剤の投与量については、患者の状態や治療対象等により、適宜選択できるが、通常、体重１Ｋｇあたり１×１０２個から１×１０９個である。 またこの場合、製剤の効力の観点から、より好ましくは、１×１０３個から１×１０８個の範囲が最良である。
【００３９】
〔投与形態・方法〕
製剤の投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく、前記した細胞をヒト血清アルブミンが０．０１〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤がより好ましい。 投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。 投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、１〜５００ｍｌとするのが好ましく、この液量に前記の量の細胞が含まれるようにするのがより好ましい。 さらに投与頻度は１回／日〜１回／月が良く、また投与回数は少なくとも１回以上は必要である。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する
〔実施例１〕
１．細胞培養用フラスコの調製
ダルベッコりん酸緩衝液（発売元：株式会社ニプロ：１０００ml、以下ＰＢ Ｓ（−）と略すこともある）で５μｇ／ｍｌに希釈調製しておいたＯＫＴ３（輸入発売元：ヤンセン協和株式会社、製造元：オーソファーマスーティカル：ＯＫＴ３注）溶液を、培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製：MS-200 5R）に３ｍｌ入れ、底面に溶液を均一に浸した。
【００４１】
一晩冷蔵庫で保存後、フラスコのＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取った。 生理食塩水（光製薬）１０ｍｌをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。 再度、クリーンベンチ内で生理食塩水（光製薬）１０ｍｌをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後に蓋を開けて液を捨てるとともに、フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。
【００４２】
そのフラスコに培養用培地［培地(RPMI1640+7)〔株式会社日研生物研究所製〕４３．５ｍｌ、３５，０００Ｕ／ｍｌ ＩＬー２（シータス社製）１ｍｌ、ファンギゾン〔輸入総発売元：ライフテックオリエンタル株式会社１５２９５−０１７〕０．５ｍｌ、ヒト血清０．５ｍｌ、を混合して培養用培地とした（以下、単に「培養用培地」と略すこともある）］を５ｍｌ加えた。 フラスコは冷凍庫で使用直前まで保存した。
【００４３】
２．採血
３名分の臍の緒から臍帯血５〜２０ｍｌをそれぞれヘパリン加採血した。
【００４４】
３．臍帯血の培養
上記１で調製した培養用フラスコを冷凍庫から出し、室温で１０分間放置した。 培養用培地が完全に溶けたことを確認して、上記２で採血した臍帯血の内１００μｌを３個のフラスコにそれぞれ入れ臍帯血が均一に混ざるように軽く攪拌した後、３７℃インキュベーター（三洋電機株式会社製：ステリカルトインキュベータＭＩＰ−３０３３、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％）で培養を開始した（培養０日目）。
【００４５】
４．チュルク液による細胞数の測定
前記２．において、採血した臍帯血１０μｌを４０μｌのチュルク液（武藤化学薬品社製）と混合し、血球計算版（エルマー社製：９７３１）に１０μｌアプライし、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製：２１１３２０）下で細胞数を測定した。 その結果、フラスコ内総細胞数はそれぞれ１．３×１０５個、１．５×１０５個、１．４×１０５個であった。
【００４６】
５．細胞表面抗原解析のための臍帯血単核球の分離
クリーンベンチ（昭和科学株式会社製：Ｓ−１１００）内で無菌的に（以下単に「無菌的に」と略す）、採血した注射筒の注射針を、接合部近くを触らないようにはずし、19G×1 1/2”注射針（発売元：株式会社ニプロ）につけ替えた。 １５ｍｌ遠沈管（岩城硝子株式会社製：２３２７−０１５）に、洗浄用培地（RPMI1640＋6 ）（５００ｍｌ、株式会社日研生物医学研究所製：GM1106）を５ｍｌ注ぎ込み、さらにその遠沈管内に、採血した血液全てをゆっくりと注いだ。 遠沈管の蓋を完全に閉めた後、２〜３回転倒混和させた。
【００４７】
１０ｍｌピペット（輸入発売元：コーニングコースタージャパン：４１０５）でリンホセパールＩ（１００ｍｌ株式会社免疫生物研究所製：23010） を１５ｍｌ遠沈管に３ｍｌ入れ、次に、洗浄用培地で希釈した臍帯血１０ｍｌを遠沈管に、液面を乱さないようにゆっくり重層した回転数１，８００ｒｐｍ、遠心分離温度２０℃、ブレーキをＯＦＦの状態で１５分間遠心した（遠心機は株式会社コクサン製：Ｈ−７００Ｒを使用）。
【００４８】
さらに遠心後、無菌的に遠沈管のリンパ球層の約１ｃｍ上までリンパ球細胞を吸い取らないように注意深く遠心上清を吸引機でゆっくり吸い取った。 ５ｍｌピペットマンで血餅の層を吸い取らないようにリンパ球細胞の層を採り、あらかじめ、洗浄用培地(RPMI1640+6)を１０ｍｌ入れておいた１５ｍｌ遠沈管内に回収した。 遠沈管の蓋を閉め２〜３回転倒混和した後、回転数１，８００ｒｐｍ、遠心分離温度２０℃の状態で１０分間遠心した。
【００４９】
さらに遠心後、上清を捨て、細胞沈渣をボルテックスミキサーにかけて、良く分散させた。 最後に洗浄用培地を１０ｍｌ入れ、良く転倒混和した後、細胞数測定用に１０μｌ、ＣＤ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４、ＣＤ８含有率測定用及び細胞の表面抗原の解析用に１．５ｍｌマイクロチューブ（輸入発売元：アシスト株式会社：７２．６９０）３本に５００μｌずつサンプリングした。
【００５０】
６．細胞の表面抗原の解析
上記５．において調製した３本の細胞懸濁液を６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた（遠心機は株式会社佐久間製作所製：Ｍ−１５０を使用した）。 上清をきれいに吸い取った後、チューブ１にはＰＢＳ（−）８μｌ、ＣＤ３／ＨＬＡ―ＤＲ抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４００４８）８μｌ、チューブ２にはＰＢＳ（−）８μｌ、ＣＤ４／ＣＤ８抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４００３９）８μｌをそれぞれのチューブに入れ３０分間反応させた。
【００５１】
なお、チューブ３は非特異的反応用コントロールとして、ＰＢＳ（−）８μｌのみを加えた。 反応後、シース液（コールター株式会社製：アイソトンＩＩ）８００μｌをそれぞれのチューブにいれボルテックスで攪拌した後、６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。 上清みをきれいに吸い取った後、シース液を８００μｌ加え、ピペッティングし、細胞をほぐした後、ＦＡＣＳ測定用チューブ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：２０５２）内に入れた。
【００５２】
ＦＡＣＳはＦＡＣＳｃａｎ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を使用し、またＦＡＣＳによる測定についてはマニュアルに従っておこなった。 その結果、ＣＤ３、ＨＬＡ―ＤＲ、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞 の含有率は、それぞれ２８、３、３９及び７、１８、１、１７及び３、１５、４、１６及び８（単位は、いずれも％）であった。
【００５３】
７．培養７日目のチュルク液による細胞数の測定
前記３．より培養開始した細胞７日目の細胞１０μｌを４０μｌのチュルク液（武藤化学薬品社製）と混合し、血球計算版（エルマー社製：９７３１）に１０μｌアプライし、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製：２１１３２０）下で細胞数を測定した。 その結果、フラスコ内総細胞数はそれぞれ１．７×１０７個、１．９×１０７個、１．７×１０７個であった。
【００５４】
８．培養７日目の細胞表面抗原の解析
前記４．と同様にして前記３．より培養開始した細胞７日目の細胞のＦＡＣＳによる細胞表面抗原の解析を行った。 その結果、ＣＤ３、ＨＬＡ―ＤＲ、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の占める比率はそれぞれ９８、１０、７９及び２０、９８、１７、２２、７８及び２０、９７、５６、７２及び２７（単位はいずれも％）であった。
【００５５】
さらに前記４．と同様にして、前記３．より培養開始した細胞７日目の細胞のＣＤ４５ＲＡ抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４７７２３）、ＣＤ４５ＲＯ抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４７９６７）の陽性率をＦＡＣＳで解析した。 その結果、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の占める比率は７％及び７３％であった。 臍帯血由来の活性化リンパ球は、殆どＣＤ４５ＲＯが陽性であることから、十分な抗腫瘍効果や抗感染防御作用を有すると考えられる。
【００５６】
〔実施例２〕
臍帯血単核球の培養
前記５．で単離した臍帯血単核球をそれぞれ前記１．で調製した細胞培養用フラスコで培養したところ、細胞の増殖が確認された。
【００５７】
〔実施例３〕
造血幹細胞生着促進検討
臍帯血移植患者に、実施例１と同様にして移植した臍帯血の一部から調製した活性化リンパ球を臍帯血移植後に投与したところ、移植患者において速やかに抗体産生が開始されたことから、臍帯血由来の活性化リンパ球は造血幹細胞生着促進作用を有することが明らかとなった。
【００５８】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明は臍帯血由来の増殖活性化リンパ球、もしくは増殖させた臍帯血細胞を主成分とする臍帯血由来の活性化リンパ球を含有させたことを特徴とする腫瘍および各種感染症の予防および治療用製剤であるために、移植時に腫瘍再発の予防・治療、各種感染症の予防・治療、幹細胞の生着促進等に幅広く使用することができるだけでなく、移植時以外にも腫瘍再発の予防・治療、各種感染症の予防・治療に使用することができる。 また、幹細胞の生着促進に使用できるほか、各種臓器などの生着促進用としても使用できる。
Claims (5)
- 臍帯血由来増殖活性化CD45RO陽性細胞（メモリーT細胞）を含有させたことを特徴とする、臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤。
- 移植臍帯血由来増殖活性化CD45RO陽性細胞（メモリーTリンパ球）を含有させたことを特徴とする、臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤。
- 増殖活性化が抗CD3抗体およびインターロイキン2によることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤。
- 増殖活性化CD45RO陽性細胞（メモリーTリンパ球）の由来する臍帯血が、臍帯血移植に使用した臍帯血由来であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤。
- 移植臍帯血より単核球細胞を分離する工程と、分離した単核球細胞を抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２により増殖させる工程と、増殖させた単核球細胞のCD45RO抗体陽性率を解析する工程と、解析後に増殖活性化CD45RO陽性細胞（メモリーTリンパ球）を含有する製剤を調製する工程とを含む、臍帯血移植後の移植臍帯血幹細胞の生着促進用製剤の製造方法。
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