ES2221924T3 - Procedimiento para el analisis de una muestra medica mediando evitacion de contribuciones perturbadoras a causa de una hemolisis. - Google Patents
Procedimiento para el analisis de una muestra medica mediando evitacion de contribuciones perturbadoras a causa de una hemolisis.Info
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Abstract
PARA EL ANALISIS DE UNA MUESTRA MEDICA BAJO PREVENCION DE SOPORTES DE PERTURBACION SOBRE BASE DE HEMOLISIS SE GENERA Y SE MIDE UNA REACCION PREVIA ANTES DE LA REACCION PRINCIPAL PARA UN COMPONENTE CONTENIDO EN LA MUESTRA, QUE SE DETERMINA POR MEDIO DEL GRADO DE HEMOLISIS DE LA MUESTRA. EL RESULTADO OBTENIDO A CONTINUACION EN LA MUESTRA A SER DETERMINADA, SE CORRIGE DE LAS SITUACIONES PERTURBADORAS MEDIANTE UTILIZACION DE LOS PROCESOS CONJUNTOS LOCALIZADOS (CORRELACION) ENTRE EL GRADO DE HEMOLISIS Y EL IMPORTE DE PERTURBACION.
Description
Procedimiento para el análisis de una muestra
médica mediando evitación de contribuciones perturbadoras a causa
de una hemólisis.
El presente invento se refiere a un procedimiento
para el análisis de una muestra médica mediando evitación de
errores de medición a causa de una hemólisis.
El material de investigación más frecuente para
análisis bioquímicos es un suero sanguíneo o un plasma. Es sabido,
que al realizar la determinación de diversos analitos a partir de
un suero sanguíneo o de un plasma sanguíneo pueden aparecer
errores, que influyen sobre el resultado de la medición y que son
causados por las propiedades de la muestra. Se presentan errores de
medición en este sentido en particular por causa de un material de
muestra hemolítico. La hemólisis puede falsear los resultados
analíticos de medición en un grado especial.
Cuando, en el caso de una muestra de sangre,
aparece una hemólisis, entonces ha sido destruida una parte de los
glóbulos sanguíneos rojos, y las sustancias constituyentes, que se
liberan en este caso, contaminan al material de la muestra. Esto
tiene como consecuencia el hecho que los valores analíticos de un
suero o un plasma son falseados por las sustancias constituyentes de
los glóbulos sanguíneos, tales como p.ej. la hemoglobina.
Para solventar esta desventaja, en el documento
de patente de los EE.UU.
US-A-4.263.512 se propone la
determinación de un cromógeno interferente en una muestra de sangre
en común con el analito, y se recomienda la corrección del error de
medición de acuerdo con el grado de hemólisis (correlacionado con la
concentración del cromógeno). No obstante, en el caso de este
método convencional de corrección se utiliza solamente el colorante
sanguíneo rojo, que se pone en libertad por los eritrocitos, para
la determinación del error de medición en el caso de un material de
muestra hemolítico. En el documento de patente europea
EP-0.268.025 B1 se hace mención a la posibilidad de
que exista una relación cuantitativa entre el grado de la
perturbación por hemólisis, la concentración del analito y el error
de medición producido por la perturbación. Esta relación se puede
representar con ayuda de la regresión múltiple. Los factores de
corrección deducibles de esta adaptación permiten entonces la
corrección del resultado del análisis, sobre la base de una
perturbación por hemólisis, determinada de manera independiente,
p.ej. a través de una medición del índice de Hb (hemoglobina)
(despreciando las eventuales dependencias adicionales con respecto
de la concentración del analito).
El analizador químico clínico "Synchron CX
5" de la entidad Beckman utiliza un conjunto de 2 a 5 longitudes
de onda para la medición de unos cursos de reacción y para la
compensación de un fondo perturbador. Por medio de una elección
apropiada de longitudes de onda adicionales, que no son relevantes
para la reacción, es posible corregir automáticamente las
interferencias espectrales endógenas. A intervalos de 16 segundos
se efectúa una "medición fotométrica de ocho ráfagas" (en
inglés "eight flash photometric measurement", es decir que en
el caso de como máximo 5 longitudes de onda se generan 8 x 5 = 40
datos de medición. Para la corrección de las señales se utiliza
entonces la siguiente ecuación policromática:
Diferencia de absorción = diferencia (A - B - C -
D - E + k)
siendo
| A | = | la modificación de la absorción de la reacción de un analito medida bicromáticamente |
| B – E | = | las longitudes de onda de corrección bicromáticas ponderadas, y |
| k | = | una constante, con la que se toma en cuenta la influencia espectral de sueros en ausencia de |
| una lipemia, hemólisis o ictericia. |
Dependiendo del aparato automático de análisis,
la corrección policromática, cuando ésta sea parte constituyente de
una aplicación de ensayo, se puede efectuar o bien categóricamente
(con un analizador Beckman), o bien tan sólo por encima de un valor
límite específico para el ensayo, a partir del cual el error por
interferencia influye visiblemente sobre el hallazgo (valor
recuperado) de la muestra.
Fue misión del presente invento, no obstante,
poner a disposición un método de análisis, que haga posible
determinar los errores de medición, causados por componentes
contaminantes en una muestra de suero sanguíneo o en una muestra de
plasma sanguíneo de sangre hemolítica, con una exactitud mejorada y
con un esfuerzo de trabajo manifiestamente reducido, en comparación
con los procedimientos habituales de corrección.
El problema planteado por esta misión se resuelve
por medio de un procedimiento para el análisis de una muestra
médica mediando evitación de errores de medición causados por una
hemólisis, en el que, antes de la determinación fotométrica
propiamente dicha de un componente contenido en la muestra, se
somete la muestra a una reacción previa, mediante la que se
determina el grado de hidrólisis de la muestra, y el valor de
medición del componente que se ha de determinar, obtenido a
continuación, es corregido por un valor, que se había determinado
mediante correlación del grado de hemólisis con la contribución al
error de medición de componentes perturbadores.
En comparación con el estado de la técnica, el
procedimiento de acuerdo con el invento se distingue por la ventaja
de que, para la corrección del valor de medición de una muestra
hemolítica, no es necesaria ninguna determinación independiente del
grado de hemólisis, p.ej. mediante determinación del índice de
hemoglobina en una muestra. Más bien, se pudo comprobar una relación
entre el grado de hemólisis de una muestra y la reacción previa
comprobada en los casos de los sueros o plasmas hemolíticos. La
reacción previa se desarrolla en este caso en presencia de una
muestra y de un reactivo, pero antes de la adición del reactivo
iniciador de la reacción de determinación propiamente dicha del
valor de medición.
Con ayuda del modelo biométrico descrito en el
presente invento, es posible estimar el grado de hemólisis de una
muestra directamente a partir de la reacción previa causada por él,
y llevar a cabo una correspondiente corrección del resultado del
análisis. Como una contribución adicional al error del análisis se
ha de considerar el hecho de que, al efectuar la determinación de
ciertas sustancias, se puede obtener asimismo un resultado falso
para las muestras hemolíticas, cuando esta sustancia está presente
también en glóbulos sanguíneos rojos, y de esta manera, después de
una hemólisis, está presente asimismo adicionalmente en la muestra
que se ha de analizar. También esta contribución al error de la
medición es tomada en cuenta por el procedimiento de acuerdo con el
invento, puesto que en la reacción previa, junto al grado de
hemólisis, toma parte también el contenido de analito de la
muestra.
El procedimiento de acuerdo con el invento
permite una corrección de los errores de medición causados por una
hemólisis y produce en el intervalo de referencia (31 U/l en el
caso de mujeres, 37 U/l en el caso de varones) una corrección
especialmente eficaz (< 10% de aumento del valor recuperado o
hallazgo (véase la Figura 1)).
Adicionalmente, fuera del intervalo de
referencia, las perturbaciones hasta de un orden de magnitud de
80%, que se obtenían con procedimientos de acuerdo con el estado de
la técnica, se pudieron reducir, con la correspondiente corrección,
a menos que o igual a 30%.
El procedimiento de acuerdo con el invento toma
en cuenta solamente a través de la reacción previa las propiedades
individuales de la muestra, de tal manera que, basándose en los
datos experimentales actuales, se puede prescindir de otros
procedimientos específicos de corrección para el material de la
muestra. En particular, no son necesarias mediciones adicionales de
ningún tipo. Este hecho constituye una ventaja importante frente a
los procedimientos de corrección descritos hasta ahora para sueros
o plasmas hemolíticos.
En una forma de realización preferida del
invento, se determina asimismo fotométricamente la reacción previa.
En este caso, se prefiere especialmente que la determinación
fotométrica se efectúe bicromáticamente, y en particular a 340 y
405 nm, y que el valor de medición propiamente dicho resulte
mediante cálculo de la diferencia de los resultados a las dos
longitudes de onda.
La iniciación de la reacción previa se efectúa de
manera preferida por adición de un reactivo, que contiene NADH y
LDH. En una forma de realización especialmente preferida, el
reactivo contiene adicionalmente MDH.
En otra forma de realización especialmente
preferida del presente invento, se asegura la relación entre el
grado de hemólisis, determinado por medio de la reacción previa, y
la contribución al error de medición por los componentes
perturbadores, tales como en particular la hemoglobina, o también el
componente que se ha de determinar, que, no obstante, está presente
en la muestra por causa de la hemólisis, sobre una amplia base para
un gran grupo de voluntarios, que tienen estados de salud, edades y
sexos de carácter heterogéneo.
En un procedimiento especialmente preferido, la
relación entre la reacción previa y la reacción principal, en lo
que se refiere al componente que se ha de determinar, se define con
ayuda de la fórmula
velocidad_{sustancia/muestra} =
velocidad_{total} - velocidad_{reacción\ previa} -
velocidad_{sustancia/eritrocitos},
significando "sustancia" el
componente que se ha de determinar en la
muestra.
Una posibilidad de eliminar las interferencias se
pudo comprobar, en efecto, con ayuda de una relación matemática
entre la reacción previa y la reacción principal. Un curso
esquemático de reacción se representa en la Figura 2 y la relación
matemática para la reacción total es la siguiente
velocidad_{total} =
velocidad_{sustancia/muestra} -
velocidad_{sustancia/eritrocitos} - velocidad_{reacción\
previa},
entendiéndose por "sustancia"
en este contexto el componente que se ha de determinar, que está
contenido o bien en un suero o en eritrocitos. Esto significa que
la modificación del valor de medición por unidad de tiempo
(cinética total) se compone de la señal del suero exento de
hemólisis, así como de la de los eritrocitos y de la reacción
previa, que persiste a lo largo de la adición del reactivo de
determinación propiamente dicho. Para poder calcular a partir de
esto el valor en un suero exento de perturbaciones, se tiene que
resolver la fórmula de la siguiente
manera:
velocidad_{sustancia/muestra} =
velocidad_{total} - velocidad_{sustancia/eritrocitos} -
velocidad_{reacción\
previa}
y conduce a la fórmula antes
mencionada para la determinación de la
velocidad_{sustancia/muestra}.
Con el conjunto de datos establecido, y con ayuda
de una regresión lineal múltiple se puede utilizar el siguiente
modelo para el cálculo de la
velocidad_{sustancia/eritrocitos}:
velocidad_{sustancia/eritrocitos}
= \alpha x velocidad_{reacción\ previa} + \beta x
(velocidad_{reacción\
previa)}^{2}
(véase la Figura
4)
En el marco del presente invento se prefiere
especialmente que la fórmula necesaria para el cálculo del valor
corregido sea almacenada en un soporte de datos y que éste sea
utilizado para una corrección automática de los resultados del
análisis con ayuda del tratamiento electrónico de datos.
Se prefiere especialmente que el valor del error
de medición ya se pueda calcular por medio de las informaciones
almacenadas en el soporte de datos. Para esto, en el soporte de
datos se almacenan los datos, que se habían determinado para la
relación entre el grado de hemólisis determinado por la reacción
previa y la contribución al error de medición para un gran grupo de
voluntarios.
De manera especialmente preferida, el
procedimiento se aplica de tal manera que el valor corregido del
componente perturbado sea indicado en la impresión y/o en la
pantalla de un aparato de tratamiento electrónico de datos, que se
emplea para la medición. En este caso, se prefiere, de nuevo, que el
valor corregido se indique con un intervalo de tolerancia. No
obstante, puede ser conveniente llevar a cabo automáticamente la
corrección del valor de medición sólo dentro de determinados límites
de tolerancia, y, fuera de estos límites de tolerancia, llevar a
cabo las correcciones manualmente, después de haber considerado
correspondientemente las circunstancias.
El procedimiento de acuerdo con el invento se
aplica de manera especialmente preferida en el caso de unos
componentes que se han de determinar, y que se seleccionan entre el
grupo que se compone de (a) el grupo de analitos, que se detecta de
manera correspondiente al tipo de reacción bioquímica de GOT / GPT
y/o b) que pertenece a un grupo de analitos, que se compone de las
proteínas totales, albúmina, LDH, potasio, colesterol total,
colesterol libre, ácido úrico, triglicéridos, sodio, cloruro,
\beta-lipoproteínas, ensayos de enturbiamiento con
timol, ensayos de enturbiamiento con sulfato de zinc, fosfolípidos
y ácidos grasos libres. En este caso, también es posible, y esto
constituye una forma preferida de realización del invento,
determinar un componente, cuya concentración en los glóbulos
sanguíneos rojos es mayor que en el suero sanguíneo o en el plasma
sanguíneo.
El procedimiento de acuerdo con el invento
constituye, por lo tanto, una posibilidad fácilmente automatizable,
y realizable con rapidez, de determinar unos componentes que están
contenidos en unas muestras que contienen sangre, suero sanguíneo o
plasma, y en este caso, evitar los errores de medición causados por
una hemólisis, llevándose a cabo, adicionalmente a la reacción de
determinación propiamente dicha, sólo una reacción previa, que
permite la determinación del grado de hemólisis.
El presente invento es ilustrado aún más por
medio de las Figuras adjuntas y los Ejemplos.
La actividad de la GOT es perturbada en gran
manera por el material hemolítico de una muestra y conduce a unos
resultados falsamente positivos. Se presenta una manifiesta
dependencia entre el grado de hemólisis y el aumento de la actividad
de la GOT. En el caso de unos valores en suero de aproximadamente
20 U/l, la GOT, con un índice de Hb de 500 mg/dl, se mide con un
valor demasiado alto, de un 80%, con procedimientos de acuerdo con
el estado de la técnica. Esta perturbación se basa sobre todo en el
hecho de que la GOT está contenida en los eritrocitos y que existe,
por tanto, una relación directa entre el grado de hemólisis y el
aumento de la actividad.
\alpha-cetoglutarato +
L-aspartato ^{GOT} L-glutamato +
oxalacetato
oxalacetato + NADH + H^{+\ MDH}
L-malato + NAD^{+}
La medición se efectúa a 340 nm (longitud de onda
principal) y 405 nm (longitud de onda secundaria). Se detecta la
descomposición de NADH.
Se realizan las operaciones de extraer sangre
(plasma con heparina) / centrifugar / desechar el material
sobrenadante / lavar la torta de sangre 3 veces con NaCl al 0,9% y
hacer estallar los eritrocitos con agua y filtrar a través de lana
de vidrio / determinar el contenido de eritrocitos.
Para aumentar la concentración se desecha el
suero del mismo donante.
Se realizan las operaciones de extraer sangre
(suero) / centrifugar / conservar el suero / mezclar la torta de
sangre con perlas de vidrio y agitar enérgicamente durante 2 - 3
horas / centrifugar (las perlas de vidrio sirven como capa de
separación entre los residuos de células y el material hemolizado)
/ extraer por pipeteo el material sobrenadante y determinar el
contenido de Hb.
Los siguientes resultados se obtuvieron mediando
aplicación de la preparación del material hemolizado 2 con 20
sueros diferentes en diversos intervalos de concentraciones. El
aumento de la concentración de los sueros antes citados se efectuó
en 8 etapas: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 mg/dl de Hb
(Figura 3).
Las mediciones se llevaron a cabo en un aparato
automático de análisis clínicos - químicos Hitachi 717 con los
puntos de medición 10 - 20 (reacción previa) y 30 - 50 (reacción
principal).
Con el fin de validar el procedimiento de
corrección antes descrito, se midió primeramente un panel de sueros
humanos no hemolíticos en el aparato automático de análisis Hitachi
717 y se definieron las actividades de GOT encontradas como los
valores nominales de BM.
Después de esto, se midieron 25 sueros
procedentes de este panel con hasta 8 aumentos diferentes de
concentración del material hemolizado (en total 217 muestras).
Las comparaciones de los métodos entre los
valores de medición que se corresponden de un material de muestra
no hemolítico (valor nominal) y de un material de muestra
hemolítico (valor real) sin y con procedimiento de corrección se
muestran en la Figura 4 (correlación entre los valores nominales y
reales = 0,923) y en la Figura 5 (correlación entre los valores
nominales y reales = 0,981). Este resultado, reproducido varias
veces, muestra claramente que la interferencia hemolítica se puede
corregir eficientemente por medio del procedimiento aquí
indicado.
| Composición del reactivo 1: | |
| 1. Monohidrógeno-fosfato de sodio | |
| 2. Dihidrógeno-fosfato de sodio | tampón A |
| 3. L(+)-monoaspartato de sodio | |
| 4. LDH | |
| 5. NADH | tabletas de enzimas + materiales de relleno |
| 6. MDH |
Agente conservante: aziduro de Na
En ensayos de intercambio se pudo poner en claro
lo que causa el aumento de la reacción previa a 340 y 405 nm, y
cómo se comporta en este caso la reacción principal.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En el caso de la adición del reactivo R1 a una
muestra hemolítica, con un grado creciente de hemólisis se presenta
una reacción previa con un aumento de la señal. La medición se
efectúa bicromáticamente a 340 y 405 nm.
Cuando se lleva a cabo la misma medición a 340
nm, no se puede comprobar ninguna reacción previa. A 405 nm, por el
contrario, tiene lugar una reacción con una señal decreciente
(Figuras 6 y 7). La reacción previa creciente tiene lugar, conforme
a ello, por causa del cálculo de la diferencia entre las dos
longitudes de onda.
Claims (14)
1. Procedimiento para el análisis de una muestra
médica mediando evitación de contribuciones perturbadoras a causa
de una hemólisis, en el que, antes de la reacción principal, para
un componente que está contenido en la muestra, se realiza y se
mide una reacción previa, mediante la cual se determina el grado de
hemólisis de la muestra, y el resultado de la muestra que se ha de
determinar obtenido seguidamente se corrige en cuanto a esta
contribución perturbadora mediando aprovechamiento de la relación
(correlación) encontrada entre el grado de hemólisis y la
contribución perturbadora.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1,
caracterizado porque
la reacción previa se determina asimismo por vía
fotométrica.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2,
caracterizado porque
la determinación fotométrica se efectúa
bicromáticamente a 340 y 405 nm, y el valor de medición propiamente
dicho se obtiene mediante un cálculo de la diferencia de los
resultados a las dos longitudes de onda.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque
la iniciación de la reacción previa se efectúa
mediante adición de un reactivo que contiene NADH y LDH.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
4,
caracterizado porque
el reactivo contiene adicionalmente MDH.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque
la relación entre el grado de hemólisis
determinado por medio de la reacción previa y la contribución al
error de medición por los componentes perturbadores se asegura
sobre una amplia base para un gran grupo de voluntarios que tienen
estados de salud, edades y sexos de carácter heterogéneo.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque
la correlación de la reacción previa con la
reacción de determinación en lo que se refiere al componente que se
ha de determinar se efectúa a través de la fórmula
velocidad_{sustancia/muestra} =
velocidad_{total} - velocidad_{reacción\ previa} -
velocidad_{sustancia/eritrocitos}
significando "sustancia" el
componente que se ha determinar en la
muestra.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque
la fórmula necesaria para el cálculo del valor
corregido se almacena en un soporte de datos, y ésta se utiliza
para una corrección automática de los resultados de los análisis
con ayuda del tratamiento electrónico de datos.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
8,
caracterizado porque
el valor del error de medición se puede calcular
por medio de las informaciones almacenadas en el soporte de
datos.
10. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 8 ó 9,
caracterizado porque
el valor corregido del componente perturbado
aparece en la impresión y/o en la pantalla del aparato de
tratamiento electrónico de datos.
11. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 8 hasta 10,
caracterizado porque
el valor corregido se indica con un intervalo de
tolerancia.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 10 ó 11,
caracterizado porque
la corrección del valor de medición se efectúa
automáticamente sólo dentro de determinados límites de
tolerancia.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores, seleccionándose el componente que se ha
de determinar entre el grupo que se compone de (a) el grupo de
analitos, que es detectado correspondientemente al tipo de la
reacción bioquímica de GOT / GPT, y/o (b) que pertenece a un grupo
de analitos, que se compone de las proteínas totales, albúmina,
LDH, potasio, colesterol total, colesterol libre, ácido úrico,
trigliceroles, sodio, cloruro,
\beta-lipoproteínas, ensayos de enturbiamiento con
timol, ensayos de enturbiamiento con sulfato de zinc, fosfolípidos y
ácidos grasos libres.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores, determinándose un componente, cuya
concentración en las glóbulos sanguíneos rojos es más alta que en
el suero sanguíneo o en el plasma sanguíneo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4427492 | 1994-08-03 | ||
| DE4427492A DE4427492A1 (de) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | Verfahren zur Analyse einer medizinischen Probe unter Vermeidung von Störbeiträgen aufgrund von Hämolyse |
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