ES2218381T3 - Procedimiento para solubilizar compuestos del peptido 1 de tipo glucagon. - Google Patents
Procedimiento para solubilizar compuestos del peptido 1 de tipo glucagon.Info
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Abstract
Un procedimiento para preparar un compuesto GLP-1 que es soluble en solución acuosa a pH 7, 4, siendo referido dicho compuesto GLP-1 como un ¿compuesto GLP-1 soluble¿, del correspondiente compuesto GLP-1 que es sustancialmente insoluble en solución acuosa a pH 7, 4, siendo referido dicho compuesto compuesto GLP-1 como uncompuesto ¿GLP-1 insoluble¿, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) disolver el compuesto GLP-1 insoluble en base acuosa con un pH de entre 10, 5 y 12, 5, para formar una solución de GLP-1; b) neutralizar la solución de GLP-1 a un pH de entre 6, 5, y 9, 0; y c) aislar el compuesto GLP-1 soluble de la solución neutralizada de la etapa b).
Description
Procedimiento para solubilizar compuestos del
péptido 1 de tipo glucagón.
El péptido 1 de tipo glucagón
(GLP-1) es un péptido de 37 aminoácidos secretado
por las células L del intestino en respuesta a la ingestión de
alimentos. Se ha descubierto que estimula la secreción de insulina
(acción insulinotrópica), por lo que causa la captación de insulina
por las células y la disminución de los niveles de glucosa en suero
(véase, por ejemplo, Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein
Research, 40: 333-343 (1992)). Sin embargo, el
GLP-1 (1-37) es muy poco activo. Una
escisión endógena posterior entre la 6ª y 7ª posición produce un
péptido OH GLP-1 (7-37)
biológicamente activo más potente. También se conocen numerosos
análogos y derivados del GLP-1 biológicamente
activos, denominados en lo sucesivo "compuestos
GLP-1". Por ejemplo, el GLP-1
(7-36)NH_{2} es un análogo de
GLP-1 natural en el que la glicina del extremo C se
ha reemplazado con -NH_{2}.
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH es un análogo de
GLP-1 (7-37)OH sintético en
el que la alanina en la posición 8 se ha reemplazado con valina; y
Thr^{16}-Lys^{18}-GLP-1
(7-37)OH es un análogo GLP-1
(7-37)OH sintético en el que la valina en la
posición número dieciséis y la serina de la posición dieciocho se
han reemplazado con treonina y lisina, respectivamente. Por su
capacidad para estimular la secreción de insulina, los compuestos
GLP son muy prometedores como agentes para el tratamiento de
diabetes, obesidad y afecciones relacionadas.
Los compuestos GLP-1 pueden
existir en al menos dos formas diferentes. La primera forma es
fisiológicamente activa y se disuelve fácilmente en solución acuosa
a pH fisiológico (7,4). Por el contrario, la segunda forma tiene muy
poca, o ninguna, actividad insulinotrópica y es sustancialmente
insoluble en agua a pH 7,4. Por desgracia, la forma inactiva se
produce con facilidad cuando se agitan las soluciones acuosas de
GLP-1, se exponen a superficies hidrófobas o tienen
interfases aire/agua grandes. Esto complica de forma considerable la
producción de cantidades comerciales de compuestos
GLP-1 activos; el mezclado de operaciones o el
movimiento continuo a través de una bomba son operaciones
habituales en los procedimientos de fabricación en masa, y estas
operaciones producen la agitación, las interfases aire/agua y/o el
contacto con las superficies hidrófobas que da como resultado la
forma insoluble.
El documento
EP-0619322-A enseña composiciones y
procedimientos para el tratamiento de diabetes mellitus. En
particular, se refiere a composiciones que prolongan la
administración de péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1)
y derivados del mismo. Estas composiciones son útiles en el
tratamiento de diabetes mellitus no insulinodependiente.
En J. Pharm. Sci: 1994, páginas
1175-1180, se enseñan estudios de la estructura
secundaria de la insulinotropina en estado sólido. Se encontró que
la solubilidad disminuye a medida que la
\alpha-hélice se convierte en una estructura de
lámina \beta antiparalela.
En J. Pharm. Sci: 1988, páginas
183-189 se enseña el efecto de transiciones
conformacionales y racemización durante el desarrollo de
procedimientos de péptido 1 de tipo glucagón recombinante.
La realización del potencial farmacéutico de los
compuestos GLP-1 depende de la producción de la
forma activa de los compuestos GLP-1 en cantidades
comercialmente viables sin contaminación con cantidades
significativas de subproductos de la forma inactiva. Por tanto, hay
una necesidad clave de procedimientos para convertir en
rendimientos elevados cantidades de forma insoluble inactiva de
compuestos GLP-1 en la forma activa soluble.
En la actualidad se ha encontrado que la forma
insoluble inactiva de compuestos GLP-1 se pueden
convertir en la forma soluble fisiológicamente activa mediante la
disolución de la forma inactiva en base acuosa (o en ácido acuoso).
Otro descubrimiento, comunicado en la presente memoria descriptiva,
es que se puede aislar la forma soluble fisiológicamente activa de
compuestos GLP-1 con un elevado rendimiento sin
racemización de aminoácidos u otra degradación, siempre que la
solución de base acuosa (o solución de ácido acuoso) se neutraliza a
un pH adecuado, menos básico (o menos ácido). Por ejemplo, el
Val8-GLP-1
(7-37)OH se convirtió en
Val8-GLP-1
(7-37)OH soluble con alto rendimiento y sin
que se produzca racemización detectable mediante disolución en
hidróxido sódico acuoso a pH 12,3, neutralizando hasta un pH de 7,0
y aislando el producto soluble por filtración y liofilización
(ejemplos 4 y 6). En función de estos descubrimientos, se describe
un procedimiento para preparar un compuesto GLP-1
soluble, fisiológicamente activo a partir de su correspondiente
forma insoluble, inactiva.
La presente invención es un procedimiento para
preparar un compuesto GLP-1 que es soluble en
solución acuosa a pH 7,4 a partir de un compuesto
GLP-1 que es sustancialmente insoluble en solución
acuosa a pH 7,4. El compuesto GLP-1 insoluble se
disuelve en base acuosa o en ácido acuoso para formar una solución
GLP-1. La solución GLP-1 se
neutraliza hasta un pH al que no se produce una racemización
sustancial de aminoácidos de los compuestos GLP-1.
Después, el compuesto GLP-1 soluble se aísla a
partir de la solución neutralizada.
Según un primer aspecto de la presente invención,
se proporciona un procedimiento para preparar un compuesto
GLP-1 que es soluble en solución acuosa a pH 7,4,
denominándose dicho compuesto GLP-1 "compuesto
GLP-1 soluble", a partir del correspondiente
compuesto GLP-1 que es sustancialmente insoluble en
solución acuosa a pH 7,4, denominándose dicho compuesto
GLP-1 "compuesto GLP-1
insoluble", comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a)
- disolver el compuesto GLP-1 insoluble en base acuosa, con un pH entre 10,5 y 12,5 para formar una solución GLP-1;
- b)
- neutralizar la solución GLP-1 hasta un pH de entre 6,5 y 9,0; y
- c)
- aislar el compuesto GLP-1 soluble de la solución neutralizada de la etapa b). El pH de la base acuosa está preferiblemente entre 12,1 y 12,5.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para preparar un
compuesto GLP-1 que es soluble en solución acuosa a
pH 7,4, denominándose dicho compuesto GLP-1
"compuesto GLP-1 soluble", a partir del
correspondiente compuesto GLP-1 que es
sustancialmente insoluble en solución acuosa a pH 7,4,
denominándose dicho compuesto GLP-1 compuesto
"GLP-1 insoluble", comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de:
- a)
- disolver el compuesto GLP-1 insoluble en base acuosa con un pH entre 10 y 10,5, para formar una solución GLP-1;
- b)
- neutralizar la solución GLP-1 hasta un pH de entre 6,5 y 9,0; y
- c)
- aislar el compuesto GLP-1 soluble de la solución neutralizada de la etapa b).
Según un tercer aspecto de la presente invención,
se proporciona un procedimiento para preparar un compuesto
GLP-1 que es soluble en solución acuosa a pH 7,4,
denominándose dicho compuesto GLP-1 "compuesto
GLP-1 soluble", a partir del correspondiente
compuesto GLP-1 que es sustancialmente insoluble en
solución acuosa a pH 7,4, denominándose dicho compuesto
GLP-1 compuesto "GLP-1
insoluble", comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a)
- disolver el compuesto GLP-1 insoluble en ácido acuoso con un pH entre 1,5 y 2,0, para formar una solución GLP-1;
- b)
- neutralizar la solución GLP-1 hasta un pH de entre 6,5 y 9,0; y
- c)
- aislar el compuesto GLP-1 soluble de la solución neutralizada de la etapa b). Preferiblemente, la solución GLP-1 se neutraliza hasta un pH de 7,0 y 8,5.
Según un cuarto aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para preparar
Val^{8}-GLP-1(7-37)OH
(SEC ID Nº 15) que es soluble en solución acuosa a pH fisiológico,
denominándose dicho
Val^{8}-GLP-1(7-37)OH
"Val^{8}-GLP-1(7-37)OH
soluble", a partir de
Val^{8}-GLP-1(7-37)OH
que es insoluble en solución acuosa a pH fisiológico, denominándose
dicho
Val^{8}-GLP-1(7-37)OH
"Val^{8}-GLP-1(7-37)OH
insoluble", comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a)
- disolver Val^{8}-GLP-1(7-37)OH insoluble en base acuosa con un pH entre 12,1 y 12,5, para formar una solución Val^{8}-GLP-1(7-37)OH;
- b)
- neutralizar la solución Val^{8}-GLP-1(7-37)OH dentro de los treinta minutos posteriores a la disolución de Val^{8}-GLP-1(7-37)OH hasta un pH de entre 7,0 a 8,5.
- c)
- Filtrar la solución neutralizada de la etapa b) a través de una membrana de filtro que tiene una porosidad de entre 0,20 \mum a 0,25 \mum; y
- d)
- aislar el Val^{8}-GLP-1(7-37)OH soluble a partir de la solución filtrada de la etapa c).
El procedimiento de la presente invención puede
usarse para convertir cantidades grandes de la forma inactiva de
compuestos GLP-1 en la forma activa sin que se
produzca racemización significativa de aminoácidos u otra
degradación. Por tanto, se puede usar en procedimientos comerciales
para preparar compuestos GLP-1 con un alto
rendimiento y de pureza elevada.
La Figura es un gráfico que muestra la conversión
en el tiempo de la forma soluble de tres lotes diferentes de
Val^{8}-GLP-1(7-37)OH
en la forma insoluble en solución (pH 7,4, sin sales, fosfato 20
mM, 1 mg/ml de proteínas) con agitación (marcada "a") y sin
agitación.
Un compuesto GLP-1 es un péptido
que tiene de aproximadamente veinticinco a aproximadamente
treintaicinco aminoácidos naturales o modificados y tiene
suficiente homología con el
GLP-1(7-37)OH de forma
que exhibe actividad insulinotrópica. Un "aminoácido
modificado" es el aminoácido obtenido tras una o más
modificaciones químicas de un aminoácido natural. Más adelante, en
la definición de "derivado de GLP-1" se
proporcionan ejemplos de aminoácidos modificados. "Actividad
insulinotrópica" se refiere a la estimulación de la secreción de
insulina en respuesta a la ingestión de alimentos, lo que produce,
por tanto, la captación de glucosa por las células y la disminución
de los niveles de glucosa en suero. En la técnica se conoce una
amplia variedad de compuestos GLP-1, incluyendo
análogos de GLP, derivados de GLP, GLP sintéticos y GLP protegidos
de dipeptidil peptidasa IV. Más adelante en la presente memoria
descriptiva se proporciona el significado de los términos "análogo
de GLP", "derivado de GLP", "GLP biosintético" y
"GLP protegido de dipeptidil peptidasa IV".
La solubilidad de un compuesto
GLP-1 puede variar, dependiendo de cómo se ha
aislado y la forma y duración de su almacenamiento. Por ejemplo, la
solubilidad de compuestos GLP-1 que se han aislado
de la solución mediante cristalización o liofilización generalmente
es muy alta. Por el contrario, la solubilidad de u compuesto
GLP-1 que precipita a partir de una solución que
contiene concentraciones elevadas de sales, se ha expuesto a
superficies hidrófobas (por ejemplo, purificada por filtración
tangencial de flujo) o tiene grandes interfases aire/agua como
resultado de, por ejemplo, agitación enérgica, a menudo es muy baja
(Ejemplo 2). Además, los cristales altamente solubles o los polvos
liofilizados de un compuesto GLP-1 típicamente
muestran una disminución de la solubilidad en el tiempo. El
almacenamiento del compuesto a temperaturas bajas (por ejemplo, a
0ºC) puede retrasar la conversión a formas menos solubles.
El grado hasta el cual el compuesto
GLP-1 es soluble en agua a pH fisiológico se puede
correlacionar con la actividad insulinotrópica del compuesto.
Específicamente, la actividad biológica de un compuesto
GLP-1 aumenta a medida que va siendo más soluble, y
disminuye a medida que va siendo menos soluble. La actividad
insulinotrópica puede valorarse mediante procedimientos conocidos en
la técnica, incluyendo el uso de experimentos in vivo como
los descritos en el Ejemplo 5 y ensayos in vitro que
emplean células de los islotes pancreáticos o células de
insulinoma, como se describe en el documento EP 619 322 concedida a
Gelfand y col., y en la patente de EE.UU. nº 5.120.712,
respectivamente.
El grado hasta el cual el compuesto
GLP-1 es soluble en agua a pH fisiológico también
puede correlacionarse con las absorbancias en el espectro
infrarrojo. Específicamente, el espectro infrarrojo de los
compuestos GLP-1 se caracteriza por absorbancias a
1624 cm^{-1}, 1657 cm^{-1} y 1696 cm^{-1}. La solubilidad del
compuesto GLP-1 aumenta con la intensidad de la
absorbancia a 1657 cm^{-1} y disminuye con la intensidad de las
absorbancias a 1624 cm^{-1} y 1696 cm^{-1}. Por tanto, la
intensidad de estas tres absorbancias variará en consecuencia a
medida que el compuesto GLP-1 se convierte en una
forma más soluble o menos soluble (véase el Ejemplo 3).
Un compuesto GLP-1 que tiene una
solubilidad en agua a pH fisiológico (7,4) de al menos
aproximadamente 1,0 miligramos por mililitro de agua a pH 7,4 se
dice que está en su "forma activa" o "forma soluble" del
compuesto. Un compuesto GLP-1 es su forma activa o
soluble se denomina, en la presente memoria descriptiva,
"compuesto GLP-1 soluble". Preferiblemente, un
compuesto GLP-1 soluble tiene una solubilidad en
agua a pH fisiológico de al menos 5,0 miligramos por mililitro.
Generalmente, la proporción A_{1657}/ (A_{1624} + A_{1657} +
A_{1696}) es de al menos aproximadamente 0,60 para los compuestos
GLP-1 en la forma soluble y preferiblemente de al
menos aproximadamente 0,70. A_{n} es la intensidad de la
absorbancia a una longitud de onda n en centímetros recíprocos.
Un compuesto GLP-1 que tiene una
solubilidad en agua a pH fisiológico menor de aproximadamente 0,5
miligramos por mililitro de agua se dice que está en su "forma
inactiva" o "forma insoluble" del compuesto. Un compuesto
GLP-1 es su forma inactiva o insoluble se denomina,
en la presente memoria descriptiva, "compuesto
GLP-1 insoluble". Preferiblemente, un compuesto
GLP-1 insoluble tiene una solubilidad en agua a pH
fisiológico inferior a aproximadamente 0,1 miligramos por
mililitro. Generalmente, la proporción (A_{1624 + A1696)}/
(A_{1624} + A_{1657} + A_{1696}) es de al menos
aproximadamente 0,60 para los compuestos GLP-1 en
la forma soluble y preferiblemente de al menos aproximadamente
0,70. A_{n} es la intensidad de la absorbancia a una longitud de
onda n en centímetros recíprocos.
Se ha comunicado que la forma insoluble de los
compuestos GLP-1 se caracteriza por la formación de
láminas beta intramoleculares e intermoleculares, que da como
resultado la agregación e insolubilidad del compuesto, mientras que
la estructura secundaria de la forma soluble se caracteriza por la
presencia de hélices alfa (véase Senderoff y col., J.
Pharm. Sci. 87: 183 (1998)). El espectro de infrarrojos de las
formas solubles e insolubles de los compuestos
GLP-1 es consistente con esta interpretación.
Específicamente, las bandas de absorbancia a 1624 y 1696
cm-^{1} generalmente son indicativas de la
presencia de láminas beta, mientras que una banda de absorbancia a
1657 cm^{-1} es consistente con la presencia de hélices alfa.
La disolución de los compuestos
GLP-1 insolubles en base acuosa (o ácido acuoso) es
consistente con la degradación de las interacciones intramoleculares
e intermoleculares responsables de la formación de láminas beta. Es
más, el aislamiento de la forma soluble de los compuestos
GLP-1 de estas soluciones es consistente con la
formación de nuevo de la estructura secundaria de compuestos
GLP-1 solubles. Por tanto, el procedimiento de la
presente invención puede usarse con proteínas (por ejemplo,
compuestos GLP-1) que tienen una forma activa
soluble caracterizada por un contenido elevado de alfa hélice y una
forma inactiva o insoluble caracterizada por un contenido elevado
de láminas beta, para convertir la forma insoluble en soluble.
El procedimiento de la presente invención puede
usarse para convertir los compuestos GLP-1
insolubles en compuestos GLP-1 solubles en
composiciones en las que el compuesto GLP-1
insoluble es el único componente o, por el contrario, en las que el
compuesto GLP-1 insoluble es uno de varios
componentes. Por tanto, el procedimiento puede "purificar"
mezclas que comprenden las formas soluble e insoluble de un
compuesto GLP-1 mediante la conversión de la forma
insoluble en la forma soluble. En consecuencia, el procedimiento es
adecuado de forma ideal para la eliminación de cantidades pequeñas,
o incluso solo rastros, de la forma insoluble, o para minimizar la
cantidad de la forma insoluble en la composición antes, por
ejemplo, de la administración como fármaco o formulación en una
forma de dosificación farmacológica.
Por costumbre en la técnica, al extremo amino del
GLP-1 (7-37)OH se le ha
asignado el número de residuo 7 y al extremo carboxi el número 37.
Esta nomenclatura se aplica a otros compuestos GLP. Cuando no se
especifica, el extremo C normalmente se considera que está en la
forma carboxilo tradicional. La secuencia de aminoácidos del
GLP-1(7-37)OH se
proporciona a continuación:
^{7}His-Ala-Glu-^{10}Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-^{15}Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-^{20}Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-^{25}Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-^{30}
Ala-Trp-Leu-Val-Lys-^{35}Gly-Arg-^{37}Gly-COOH (SEC ID Nº 1)
Ala-Trp-Leu-Val-Lys-^{35}Gly-Arg-^{37}Gly-COOH (SEC ID Nº 1)
Un "compuesto GLP-1" tiene
la suficiente homología con el GLP-1
(7-37)OH o un fragmento del
GLP-1 (7-37)OH como para que
el compuesto tenga actividad insulinotrópica. Preferiblemente, un
compuesto GLP-1 tiene la secuencia de aminoácidos
del GLP-1 (7-37)OH o un
fragmento del mismo, modificada de forma que cero, uno, dos, tres,
cuatro o cinco aminoácidos difieren del aminoácido de la posición
correspondiente del GLP-1
(7-37)OH o del fragmento del
GLP-1 (7-37)OH. Los
compuestos GLP preferidos están modificados en la posición 8, en la
posición 22 o en la posición 8 y la posición 22.
Preferiblemente, los aminoácidos del compuesto
GLP que difieren del aminoácido en la posición correspondiente del
GLP-1 (7-37)OH son
sustituciones conservadoras y, más preferiblemente, son
sustituciones altamente conservadoras.
Una "sustitución conservadora" es la
sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene la misma
carga electrónica neta y de aproximadamente el mismo tamaño y
forma. Los aminoácidos con cadenas laterales aminoacídicas
alifáticas o alifáticas sustituidas tienen aproximadamente el mismo
tamaño cuando el número total de átomos de carbono y de
heteroátomos en sus cadenas laterales difieren en no más de
alrededor de cuatro. Tienen aproximadamente la misma forma cuando
el número de ramificaciones en sus cadenas laterales difiere en no
más de una. Se considera que los aminoácidos con grupos fenilo o
grupos fenilo sustituidos en sus cadenas laterales tienen más o
menos el mismo tamaño y forma. A continuación se enumeran cinco
grupos de aminoácidos. La sustitución de un aminoácido en un
compuesto GLP-1 con otro aminoácido de los mismos
grupos da como resultado una sustitución conservadora:
Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina,
isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, y aminoácidos no
naturales con cadenas laterales C1-C4 alifáticas o
C1-C4 alifáticas sustituidas con hidroxilo (cadenas
lineales o con una ramificación).
Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y
aminoácidos no naturales con cadenas laterales
C1-C4 alifáticas sustituidas con ácido carboxílico
(sin ramificar o con un punto de ramificación).
Grupo III: lisina, ornitina, arginina y
aminoácidos no naturales con cadenas laterales
C1-C4 alifáticas sustituidas con amina o guanidino
(sin ramificar o con un punto de ramificación).
Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos no
naturales con cadenas laterales C1-C4 alifáticas
sustituidas con amida (sin ramificar o con un punto de
ramificación).
Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y
triptófano.
Una "sustitución altamente conservadora" es
la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene el
mismo grupo funcional en la cadena lateral y casi el mismo tamaño y
forma. Los aminoácidos con cadenas laterales aminoacídicas
alifáticas o alifáticas sustituidas tienen casi el mismo tamaño
cuando el número total de carbonos y de heteroátomos de sus cadenas
laterales difiere en no más de dos. Tienen casi la misma forma
cuando tienen el mismo número de ramificaciones en sus cadenas
laterales. Ejemplos de sustituciones altamente conservadoras
incluyen valina por leucina, treonina por serina, ácido aspártico
por ácido glutámico y fenilglicina por fenilalanina. Ejemplos de
sustituciones que no son altamente conservadoras incluyen alanina
por valina, alanina por serina y ácido aspártico por serina.
"Análogo de GLP-1" se define
como un compuesto GLP-1 que tiene una o más
sustituciones, deleciones, inversiones o adiciones de aminoácidos
respecto del GLP-1 (7-37)OH.
Entre las sustituciones de aminoácidos permisibles se incluye la
sustitución de un L aminoácido con su correspondiente forma D. En la
nomenclatura usada en la presente memoria descriptiva para designar
los análogos GLP-1, el aminoácido sustituyente y su
posición se indica antes que la estructura original. Por ejemplo,
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH designa un análogo de
GLP-1 en el que la alanina que normalmente se
encuentra en la posición ocho de GLP-1
(7-37)OH se ha sustituido con valina.
En la técnica se conocen numerosos análogos de
GLP-1 e incluyen, pero no se limita a ellos:
GLP-1 (7-34), GLP-1
(7-35), GLP-1
(7-36)-NH_{2}, Gln^{9}-
GLP-1 (7-37),
d-Gln^{9}- GLP-1
(7-37), Thr^{16}-Lys^{18}-
GLP-1 (7-37), Lys^{18}-
GLP-1 (7-37), Gly^{8}-
GLP-1 (7-36)NH_{2},
Gly^{8}- GLP-1 (7-37)OH,
Val^{8}- GLP-1
(7-36)NH_{2}, Val^{8}-
GLP-1 (7-37)OH,
Met^{8}-GLP-1
(7-36)NH_{2}, Met^{8}-
GLP-1 (7-37)OH, Ile^{8}-
GLP-1 (7-36) NH_{2}, Ile^{8}-
GLP-1 (7-37)OH, Thr^{8}-
GLP-1 (7-36)NH_{2},
Thr^{8}- GLP-1 (7-37)OH,
Ser^{8}- GLP-1
(7-36)NH_{2}, Ser^{8}-
GLP-1 (7-37)OH, Asp^{8}-
GLP-1 (7-36)NH_{2},
Asp^{8}- GLP-1 (7-37)OH,
Cys^{8}- GLP-1
(7-36)NH_{2},
Cys^{8}-GLP-1
(7-37)OH, Thr^{9}- GLP-1
(7-37), D-Thr^{9}-
GLP-1 (7-37), Asn^{9}-
GLP-1 (7-37),
D-Asn^{9}- GLP-1
(7-37),
Ser^{22}-Arg^{23}-Arg^{24}-Gln^{26}-
GLP-1 (7-37), Arg^{23}-
GLP-1 (7-37), Arg^{24}-
GLP-1 (7-37) y
Gly^{8}-Gln^{21}- GLP-1
(7-37)OH y similares.
Un "derivado de GLP-1" se
defina como una molécula que tiene la secuencia de aminoácidos de
GLP-1 (7-37) o un análogo de
GLP-1, pero que además tiene una modificación
química de uno o más de sus grupos aminoacídicos laterales, átomos
de \alpha-carbono, grupo amino terminal o grupo
ácido carboxílico terminal. Una modificación química incluye, pero
no se limita a, añadir fracciones restos químicos, crear enlaces
nuevos y eliminar restos químicos. Entre las modificaciones en los
grupos aminoacídicos laterales se incluyen, sin limitaciones,
acilación de grupos \varepsilon-amino lisina,
N-alquilación de arginina, histidina o lisina,
alquilación de grupos de ácido carboxílico glutámico o aspártico y
desamidación de glutamina o asparagina. Entre las modificaciones
del grupo amino terminal se incluyen, sin limitaciones, las
modificaciones desamino de N-alquilo inferior,
N-dialquilo inferior y N-acilo (por
ejemplo, alquilo-CO inferior). Entre las
modificaciones del grupo carboxi terminal se incluyen, sin
limitaciones, las modificaciones de amida, amida de alquilo
inferior, dialquilamida y éster de alquilo inferior. Los alquilos
inferiores incluyen alquilos C1-C4 de cadena lineal
o ramificada. Además, uno o más grupos laterales, o grupos
terminales, pueden estar protegidos por grupos protectores
conocidos para el químico experto habitual en proteínas. El carbono
\alpha de un aminoácido puede estar mono o dimetilado.
En la patente de EE.UU. nº 5.705.483 se describen
otros compuestos GLP-1 y tienen la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC ID nº 2. Todas las enseñanzas
de la patente de EE.UU. nº 5.705.483 se incorporan en la presente
memoria descriptiva como referencia.
R_{1}-X-Glu-^{10}Gly-Thr-Pe-Thr-Ser-^{15}Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-^{20}Leu-y-Gly-Gln-Ala-^{25}Ala-Lys-Z-Phe-Ile-^{30}Ala-Trp-
Leu-Val-Lys-^{35}Gly-Arg-R_{2} (SEC ID Nº2)
Leu-Val-Lys-^{35}Gly-Arg-R_{2} (SEC ID Nº2)
En la SEC ID Nº 2, R_{1} es
L-histidina, D-histidina, desamino-
histidina, 2-amino-histidina,
beta-hidroxi- histidina, homohistidina,
alfa-fluorometil -histidina o
alfa-metil- histidina.
X es Ala, Gly, Val, Thr, Met, Ile, Ser o
alfa-metil-Ala.
Y es Glu, Gln, Ala, Thr, Ser o Gly.
R_{2} es NH_{2} o Gly-OH.
Otros compuestos GLP-1 se
describen en el documento WO 91/11457, todas las enseñanzas del cual
se incorporan en la presente memoria descriptiva como referencia.
Estos compuestos GLP-1 incluyen
GLP-1 (7-34), GLP-1
(7-35), GLP-1
(7-36) o GLP-1
(7-37), o la forma amida de los mismos, y sales
farmacéuticamente aceptables de los mismos, con al menos una de
las siguientes modificaciones:
- (a)
- sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, arginina o D-lisina por lisina en la posición 26 y/o la posición 34; o sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, lisina o una D-arginina por la arginina en la posición 36;
- (b)
- sustitución de un aminoácido resistente a oxidación por el triptófano en la posición 31;
- (c)
- sustitución de al menos uno de: tirosina por valina en la posición 16; lisina por serina en la posición 18; ácido aspártico por ácido glutámico en la posición 21; serina por glicina en la posición 22; arginina por glutamina en la posición 23; arginina por alanina en la posición 24 y glutamina por lisina en la posición 26;
- (d)
- sustitución de al menos uno de: glicina, serina o cisteína por alanina en la posición 8; ácido aspártico, glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina o fenilalanina por ácido glutámico en la posición 9; serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valinaisoleucina, leucina, metionina o fenilalanina por glicina en la posición 10; y ácido glutámico por ácido aspártico en la posición 15; o
- (e)
- sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina o fenilalanina, o la forma D o N acilada o alquilada de histidina por histidina en la posición 7; donde, en las sustituciones en (a), (b), (d) y (e), los aminoácidos sustituidos pueden estar opcionalmente en la forma D y los aminoácidos sustituidos en la posición 7 puede opcionalmente estar en la forma N acilada o N alquilada.
Otros compuestos GLP-1 se
describen en la patente de EE.UU. nº 5.188.666. Entre los ejemplos
se incluye un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº 3:
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-
Leu-Val-X (SEC ID Nº 3)
Leu-Val-X (SEC ID Nº 3)
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
X en la SEC ID Nº 3 es Lys-COOH y
Lys-Gly-COOH
También están incluidos un éster de alquilo
inferior farmacéuticamente aceptable de dicho péptido y una amida
farmacéuticamente aceptable de dicho péptido, por ejemplo, amida de
alquilo inferior y amida de dialquilo inferior. Generalmente, el
grupo alquilo inferior es un grupo alifático de
C1-C20 con cadenas lineales o ramificada con cero,
una o más unidades de insaturación.
Otros compuestos GLP-1 más se
describen en la patente de EE.UU. nº 5.512.549. Estos compuestos
GLP-1 tienen la secuencia de aminoácidos de SEC ID
Nº 4:
R^{1} es 4-imidazopropionilo,
4-imidazoacetilo o
4-imidazo-\alpha,
\alpha-dimetilacetilo.
R^{2} es acilo C_{6}-C_{10}
sin ramificar o no hay.
R^{3} es GLy-OH o NH_{2}.
Xaa es Lys o Arg.
Otros compuestos GLP-1 más se
describen en el documento WO 98/08871. Estos compuestos
GLP-1 incluyen un sustituyente lipófilo unido al
residuo aminoacídico del extremo N o del extremo C en el que el
sustituyente es un grupo alquilo o un grupo que tiene un grupo
carboxílico omega.
Los "GLP-1 biosintéticos" se
definen como cualquier análogo de GLP-1 o secuencia
nativa que contienen solo residuos de aminoácidos naturales y, por
tanto, son capaces de expresarse en las células vivas, incluyendo
células recombinantes y organismos.
Los "GLP protegidos de la
DPP-IV" se refieren a los compuestos
GLP-1 que son resistentes a la acción de la
DPP-IV. Estos incluyen análogos que tienen un
residuo aminoacídico D o modificado en la posición 8. Estos también
incluyen GLP-1 biosintéticos que tienen Gly o los
residuos de aminoácidos L Val, Thr, Met, Ser, Cys, Ile o Asp en la
posición 8. Otros compuestos GLP-1 protegidos de la
DPP-IV incluyen desamino Hi^{7} y otros derivados
de His^{7}.
En el procedimiento de la presente invención, el
compuesto GLP-1 insoluble se añade a una solución
que es lo bastante básica (o ácida) como para disolver el
compuesto. A continuación, la solución se mezcla o, de otro modo, se
agita hasta que el compuesto se disuelve. Generalmente, los
compuestos GLP-1 se disuelven con más rapidez a
medida que incrementa la basicidad o la acidez de la solución. Sin
embargo, la tasa de racemización y otra degradación también aumenta
a medida que la solución se convierte en más básica (o ácida) y
cuanto más tiempo se disuelve el compuesto GLP-1 en
solución altamente ácida o básica. Por tanto, al practicar el
procedimiento de la presente invención es deseable usar soluciones
que son lo bastante básicas (o ácidas) como para disolver con
facilidad el compuesto, pero no tan básicas (o ácidas) que produzcan
racemización de aminoácidos o la formación de otros subproductos.
El experto en la técnica será capaz de identificar de forma
rutinaria los pH adecuados que alcanzaran este doble objetivo.
Típicamente se usan soluciones básicas con un pH de entre
aproximadamente 10,5 y aproximadamente 12,5 y soluciones ácidas con
un pH de entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 2,0 para
llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Sin
embargo, también se pueden usar soluciones menos básicas, siempre
que se deje el suficiente periodo de tiempo para la disolución. Se
han usado soluciones que tienen un pH de entre aproximadamente 10,0
y 10,5 con tiempos de disolución de al menos treinta minutos. Se
prefieren los pH de entre aproximadamente 12,1 y aproximadamente
12,5. En un aspecto, es deseable minimizar la cantidad de base
acuosa o de ácido acuoso que se usa para disolver el compuesto
GLP-1. Cuando se aísla por liofilización el
compuesto GLP-1 final se prefiere una cantidad
mínima de base acuosa o de ácido acuoso.
Tras la disolución del compuesto
GLP-1, la solución, denominada en la presente
memoria descriptiva "solución GLP-1" se
neutraliza hasta un pH al cual no se produce racemización
sustancial de aminoácidos, por ejemplo menos del 1% del compuesto
GLP-1 racemiza por hora y preferiblemente menos del
0,1%. La racemización de los aminoácidos en los compuestos
GLP-1 se puede detectar y cuantificar mediante
procedimientos conocidos en la técnica, tales como cromatografía
HPLC (véase, por ejemplo, Senderoff y col., J. Pharm.
Sci. 87: 183 (1998) y el ensayo descrito en el Ejemplo 6). Por
tanto, un experto habitual en la técnica puede determinar
fácilmente los pH adecuados para la solución neutralizada. Para la
mayoría de las aplicaciones, los valores de pH para la solución
neutralizada pueden variar de entre aproximadamente 6,5 a
aproximadamente 9,0. Los valores de pH preferidos se encuentran
entre aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,5.
Para minimizar la racemización de aminoácidos, es
deseable neutralizar la solución de GLP-1 ácida o
básica lo antes posible tras la disolución del compuesto
GLP-1 insoluble. Preferiblemente, la solución de
GLP-1 se neutraliza en un periodo de tiempo lo
bastante corto de forma que no haya racemización o degradación
sustancial de aminoácidos en el compuesto GLP-1, por
ejemplo menos del 1% de los compuestos GLP-1
contienen aminoácidos racemizados y, preferiblemente, menos del
0,1%. Como se ha mencionado anteriormente, la tasa de racemización
de aminoácidos y otras degradaciones aumenta al aumentar la
basicidad o acidez de la solución. Por tanto, la cantidad de tiempo
que puede haber entre la disolución y la neutralización sin que haya
una formación sustancial de subproductos de degradación o de
racemización varía según el pH de la solución de
GLP-1. Cuando el pH de la solución de
GLP-1 se encuentra entre aproximadamente 10,5 y
aproximadamente 12,5 o entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente
2,0 no se produce racemización o degradación de aminoácidos
sustancial cuando la solución de GLP-1 se neutraliza
dentro de aproximadamente los 30 minutos posteriores a la disolución
del compuesto GLP-1 insoluble. Preferiblemente, la
solución de GLP-1 se neutraliza en los cinco minutos
posteriores a la disolución. Opcionalmente, la solución de
GLP-1 se puede neutralizar antes de completar la
disolución del compuesto GLP-1 insoluble, siempre
que se elimine de la solución el material que no se ha disuelto
antes de aislar el compuesto GLP-1 soluble. El
material que no se ha disuelto se puede eliminar por cualquier medio
adecuado, incluida la filtración.
Para ajustar el pH de una solución en el
procedimiento de la presente invención se puede usar cualquier
ácido o base adecuado. Preferiblemente, el ácido o la base son
adecuados para usar en la preparación de un producto farmacéutico.
Entre los ejemplos de ácidos adecuados se incluyen ácido
clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido oxálico y
similares. Se prefieren el ácido clorhídrico. Entre los ejemplos de
bases adecuadas se incluyen base hidróxido y base carbonatos. Se
prefiere hidróxido sódico.
En la solución de GLP-1,
típicamente permanece sin disolver una pequeña cantidad de material
sólido, denominada en la presente memoria descriptiva "material
gelatinoso". Es preferible eliminar este material de la solución
de GLP-1 o de la solución de GLP-1
neutralizada antes de aislar el compuesto GLP-1
soluble. En un ejemplo, el pH de la solución de
GLP-1 se ajusta hasta aproximadamente 8,0 antes de
eliminar el material gelatinoso. La eliminación del material
gelatinoso se puede llevar a cabo por cualquier medio adecuado,
incluyendo por filtración.
El compuesto GLP-1 soluble
aislado preparado mediante el procedimiento de la presente
invención se puede usar como ingrediente activo en un producto
farmacéutico para el tratamiento de enfermedades tales como diabetes
tipo II u obesidad. En consecuencia, es deseable eliminar la
materia microbiana de la solución de GLP-1 y/o de
la solución neutralizada. Típicamente, la materia microbiana se
elimina de las soluciones con una membrana de filtro adecuada,
preferiblemente con una membrana de filtro que tenga una porosidad
inferior o igual a 0,22 \muM. Las etapas de filtración para
eliminar el material gelatinoso y la materia microbiana se pueden
combinar o, de forma alternativa, realizarse en etapas separadas.
Además, cuando el compuesto GLP-1 final se va a
usar como producto farmacéutico es deseable llevar a cabo el
procedimiento de la presente invención en un entorno estéril
consistente con las Buenas Prácticas de Fabricación.
El compuesto GLP-1 soluble se
puede aislar a partir de la solución neutralizada por cualquier
procedimiento adecuado, incluyendo por liofilización, secado por
pulverización o cristalización. En el documento EP 619.322 de
Gelfand y col. y en el documento WO 99/30731 de Hoffman y
col. se describen ejemplos de procedimientos adecuados de
cristalización.
Dados la información de la secuencia descrita en
la presente memoria descriptiva y el estado de la técnica en la
síntesis de proteínas en fase sólida, los GLP se pueden obtener
mediante síntesis química. Sin embargo también es posible obtener
algunos GLP mediante fragmentación enzimática del proglucagón
usando técnicas bien conocidas para el experto en la técnica. Es
más, se pueden usar, y se prefieren, técnicas de ADN recombinante
bien conocidas para expresar los GLP consistentes con la
invención.
Los principios de la síntesis química en fase
sólida de polipéptidos se conocen bien en la técnica y pueden
encontrarse en textos generales del área, tales como Dugas, H. Y
Penney, C., Bioorganic Chemistry (1981)
Springer-Verlag, Nueva York, páginas
54-92, Merrifield, J. M., Chem. Soc.,
85: 2149 (1962) y Stewart y Young, Solid Phase Peptide
Synthesis, pág. 24-66, Freeman (San Francisco,
1969).
En la patente de EE.UU. nº 5.705.483, la patente
de EE.UU. nº 5.188.666, la patente de EE.UU. nº 5.512.549, el
documento WO 91/11457 y el documento WO 98/08871 se proporcionan
descripciones específicas para la preparación de compuestos
GLP-1.
La invención se ilustra con los siguientes
ejemplos, con los que no se pretende limitarla de ningún modo.
El compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH con la secuencia de aminoácidos
H_{2}N-His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-COOH
(SEC ID Nº 5) se preparó usando procedimientos de síntesis de
péptidos en fase sólida y el producto final se purificó mediante
cromatografía preparativa de fase inversa en una resina de sílice C8
usando TFA al 0,1% y un gradiente de elución de acetonitrilo. La
corriente resultante se secó mediante liofilización. El compuesto
Val^{8}-GLP (7-37) también se
puede preparar de modo recombinante según los procedimientos
descritos en la patente de EE.UU. nº 5.705.483.
Polvo liofilizado de
Val^{8}-GLP (7-37)OH (1
gramo) se disolvió en bicarbonato amónico 25 mM, pH 8,0 (100 ml).
La solución se agitó con una barra de agitación TEFLON a
aproximadamente 200 rpm a 21ºC (temperatura ambiente) durante 16
horas. A tiempos variables, normalmente en 30 minutos, la solución
se volvió turbia. Al continuar la agitación, la turbidez de hizo
visiblemente más densa. La cinética de la turbidez se midió por la
velocidad de formación de turbidez, es decir la absorbancia a 340
nm. La proteína precipitada se recogió bien por filtración, por
ejemplo con un disco de filtro Whatman 1, o por centrifugación. El
sobrenadante se sometió a ensayos para determinar el contenido de
proteínas, bien mediante Ensayo Colorimétrico de Biuret obtenido de
Pierce (Rockford, IL) o absorbancia UV a 280 nm. Pro cualquiera de
los dos procedimientos, el precipitado proteico constituyó un
exceso del 90% del material de partida, es decir, menos del 10% de
la proteína restante estaba en la fracción del sobrenadante. El
precipitado recogido se secó al vacío, es decir, en un
liofilizador. El material precipitado resultante (0,96 gramos) era
soluble en fosfato 20 mM a pH 7,2 a menos de 0,01 mg/ml. La
solubilidad se determinó mediante suspensión del sólido en el
tampón, ajuste del pH si es necesario, y filtración a través de un
filtro de 0,2 micrómetros. El contenido proteico del filtrado se
analizó mediante Ensayo Colorimétrico de Biuret, absorbancia UV a
280 nm, o mediante análisis de cromatografía líquida de alta
presión (HPLC). El análisis HPLC se llevó a cabo usando una columna
C-18, de 5 micrómetros y 300 angstrom (columna
Jupiter C-18, obtenida de Phenomenex, Torrance,
Calif.) y un gradiente de elución con Tampón A (10% de acetonitrilo
en solución de ácido trifluoroacético al 0,1%) y Tampón B (90% de
acetonitrilo en solución de ácido trifluoroacético al 0,1%), 25 a
69% de tampón B en treinta minutos. La columna se corrió a 60ºC con
un caudal de 1,0 ml/min, la detección se realizó a 214 nanómetros
de longitud de onda y el volumen de inyección fue de 20
microlitros.
Los compuestos GLP (GLP-1
(7-37)OH, Val^{8}-GLP
(7-37)OH e
isopropilimidazol^{7}-arginina^{26}-GLP-1
(8-37)OH) preparados de este modo tenían una
solubilidad inferior a 0,1 mg/ml y normalmente menor a 0,05 mg/ml.
Las sales, especialmente el cloruro sódico, cuando están presentes a
concentración mayor de 25 mM, aceleraron considerablemente la
velocidad de formación del material insoluble.
Tres lotes diferentes de
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH (QIY 17, QIY 18 y 361EM7) se
solubilizaron a 1 mg/ml en fosfato 20 mM, a pH 7,4 y el pH final se
ajustó a 7,4 con hidróxido sódico 1N. Muestras de dos a diez
mililitros de cada solución se transfirieron a dos grupos
diferentes de viales de vidrio. Un grupo de muestras se agitó
mientras que el otro se dejó reposar sin agitación. La turbidez a
tiempos variables se midió determinando a absorbancia a 340 nm. Los
resultados se muestran en la Figura. Los cursos de tiempo de las
soluciones agitadas se designan con una "a".
Como se puede deducir de la Figura, la turbidez
de las soluciones agitadas aumenta mucho más rápido en las
soluciones agitadas que en las soluciones que se dejó reposar. Dado
que la turbidez es indicativa de precipitación de proteínas, este
resultado es consistente con la velocidad de formación de la forma
insoluble, acelerándose con el aumento de la exposición al aire
causado por la agitación.
El compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH se sometió a filtración por flujo
tangencial. Durante la filtración, la solución concentrada se espesó
y se hizo más viscosa y el compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH formó un material gelatinoso en las
membranas de filtro. La formación del material gelatinoso se produjo
en los 30 minutos posteriores al comienzo de la filtración; la
velocidad de formación aumentó en presencia de sales. La proteína
"insolubilizada" se recogió por filtración o centrifugación y
se secó en una estufa de vacío o en un liofilizador. La
precipitación en presencia o ausencia de sales produjo un producto
que era soluble a menos de 0,1 mg/ml en un tampón de pH neutro.
El compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH se incubó a una temperatura entre
2ºC a 6ºC en una matriz de ácido acético 35 mM con acetonitrilo al
25%, a un pH aparente de 3,3. Sin agitación, las preparaciones
desarrollaron oclusiones gelatinosas en aproximadamente 1 mes de
incubación. La agitación aumentó la velocidad de la formación del
gel. El gel se recogió mediante centrifugación y se secó al
vacío y exhibió una solubilidad inferior a 0,1 mg/ml a pH
neutro.
Se analizaron cuatro lotes diferentes de
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH purificado, liofilizado para
determinar las características de la estructura secundaria mediante
Espectroscopia de infrarrojos por Transformada de Fourier (FTIR)
para valorar el contenido en alfa hélices y láminas beta de las
preparaciones. En la región Amida I se realizó la desconvolución
(1750-1600 cm^{-1}) usando software Biorad
Win-IR Pro, versión 2,5. Los resultados se muestran
a continuación en la tabla 1:
| 1657 cm-1 | 1624 + 1696 cm-1 | |
| Número de lote | % de alfa hélice | % total de láminas beta |
| 1 | 62,7 | 31,4 |
| 2 | 62,8 | 29,3 |
| 3 | 63,6 | 30,6 |
| 4 | 63,6 | 28,9 |
| MEDIA | 30,1 | |
| Sigma | 1,2 |
Los datos de la tabla muestran que el polvo
liofilizado tiene un alto contenido en alfa hélice (por encima de
60%) y un contenido en láminas beta relativamente bajo (30% o
menos).
Se prepararon cinco muestras de
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH como se describe a
continuación:
Muestra
1
EL polvo liofilizado de
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH se disolvió en ácido acético 10 mM
(pH 3) a 1 mg/ml y se sometió a precipitación isoeléctrica mediante
ajuste del pH a 5,5 con hidróxido sódico 1N. El precipitado
resultante se recogió por centrifugación y se secó al
vacío.
Muestra
2
Se llevó a cabo un precipitado isoeléctrico
acercándose al pH 5,5 desde el lado alcalino mediante
solubilización de Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH en bicarbonato amónico 10 mM, pH
8,0, y después ajustando el pH hacia abajo con ácido clorhídrico
1N.
Muestra
3
Se recogió una muestra gelificada mediante
centrifugación a partir de una solución de
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH (2,7 mg/ml en ácido acético 25 mM,
pH 3,3 que contienen acetonitrilo al 25%) que se había incubado a
4ºC durante 3,1 meses.
Muestras 4 y
5
El compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH se disolvió a 1 mg/ml en fosfato 10
mM (pH 7,2) y se agitó hasta que se formó un precipitado. La
solución se fraccionó mediante centrifugación para producir una
fracción de GLP-1 soluble (muestra 4) y una
fracción precipitada (muestra 5). Ambas fracciones se secaron al
vacío.
Cada una de las muestras 1-5 se
midió para determinar las características de la estructura
secundaria mediante espectroscopia de infrarrojos por transformada
de Fourier (FTIR). Además, cada una de las muestras
1-5 se colocó en solución de fosfato 20 mM (pH 7,2)
y se elevó el pH a 12,3 mediante la adición de hidróxido sódico 1N
durante no más de 3 minutos. Después, todas las muestras se
disolvieron y las soluciones se aclararon. El pH de cada solución se
ajustó a continuación a 7,0 mediante la adición de ácido
clorhídrico 1N. Las muestras 1A-5A, obtenidas de
las muestras 1-5, respectivamente, se obtuvieron
mediante liofilización de las soluciones y se secaron al
vacío. Las características estructurales secundarias de las
muestras 1A-5A se valoraron por FTIR. Los
resultados de los análisis FTIR de las muestras 1-5
y 1A-5A se muestran a continuación, en la tabla
2:
| Porcentaje de alfa hélice | Porcentaje de característica lámina beta | |
| Muestra | 1657 cm^{-1} | 1624 + 1696 cm^{-1} |
| 1 | 24,9 | 69,8 |
| 1A | Pico ancho a 1583 cm-1 | Interfirió con el análisis |
| 2 | 51,9 | 40,5 |
| 2A | 85,9 | No se observó ninguna |
| 3 | 25,5 | 70,0 |
| 3A | 62,2 | 23,7 |
| 4 | 75,8 | 14,7 |
| 4A | 86,0 | No se observó ninguna |
| 5 | 12,9 | 57,3 |
| 5A | 90,6 | No se observó ninguna |
Todas las muestras se analizaron mediante
Cromatografía líquida de alto rendimiento, como se describe en el
Ejemplo 2, y se mostró que contenían un único pico que eluyó de
forma simultánea en relación con el compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH estándar. Esto sugiere que ninguna
muestra sufrió ningún cambio químico discernible por HPLC. En cada
caso, la excursión básica aumentó el contenido medido de alfa
hélices de la proteína y dio como resultado un producto que era
soluble a > 1mg/ml en tampón fosfato 20 mM, pH 7,2.
En otro ejemplo de los efectos de la excursión
básica sobre la estructura secundaria, una muestra purificada y
liofilizada de Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH purificada mediante cromatografía
inversa se liofilizó (0,1 gramos) o se precipitó mediante la
adición de suficiente dihidrógeno fosfato de sodio 3,0M (pH 3,80)
para dar como resultado una solución fosfato 0,6M. El precipitado
resultante se lavó con acetato de sodio 10 mM a pH 5,5 y el
precipitado lavado se secó al vacío. Una segunda porción del
precipitado lavado se solubilizó aumentando el pH del material a
10,5 durante 30 minutos a temperatura ambiente mediante la adición
de hidróxido sódico 1N. A continuación, el pH de esa solución se
redujo a 7,0 mediante la adición de ácido clorhídrico 1,0N y
después, la solución se liofilizó. La estructura secundaria de las
tres muestras se determinó mediante FTIR. Los resultados se
muestran en la Tabla 3:
| Porcentaje de alfa | Porcentaje de beta | ||
| Muestra | Contenido de hélices | Contenido de láminas | |
| Corriente liofilizada | 71 | 16 | |
| Precipitado de fosfato | 57 | 35 | |
| Excursión a pH 10,5 | 71 | 13 |
Los resultados muestran que la excursión a pH
básico reduce el contenido en láminas beta y aumenta el contenido en
alfa hélices de la muestra.
Se preparó
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH de alto contenido en láminas beta
mediante solubilización del polvo liofilizado en tampón fosfato 20
mM, pH 7,2 y sometiendo la solución a agitación durante toda la
noche a 21ºC. Se recogió el precipitado resultante, se lavó con agua
desionizada y se secó al vacío. El material de partida del
polvo liofilizado y el precipitado seco se sometieron a análisis
para determinar la biodisponibilidad mediante inyección en grupos de
tres ratas. Para preparar las muestras, el material de partida del
polvo liofilizado (soluble) se formuló en una solución a 2 mg/ml en
tampón fosfato 15 mM (pH 7,5). Después, el precipitado seco se
convirtió en una pasta en fosfato 10 mM (pH 7,2); el material
insoluble se convierte en una suspensión a 16,5 mg de sólido por ml
en tampón fosfato 15 mM (pH 7,5). Los materiales formulados se
inyectaron por vía subcutánea a 80 y 800 microgramos/kilogramo de
peso corporal, mientras se inyectaba la pasta de precipitado a 10
veces eso, es decir a 8000 microgramos/kilogramo. Mediante ELISA se
determinó que la concentración máxima en las muestras de suero
extraídas de las ratas era de 11-15 nanogramos/ml
para el material formulado y de 0,4 a 0,6 ng/ml para la pasta. El
área por debajo de la curva para la pasta fue de aproximadamente el
1% o menor en comparación con el material formulado.
El compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH solubilizado se expuso a pH 12,3
durante 10 minutos a temperatura ambiente. No se observó ningún
cambio discernible en el perfil de la HPLC. Sin embargo, un análisis
HPLC, realizado como se describe en el Ejemplo 2, de
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH solubilizada, expuesta a pH 12,3
durante varias horas mostró varios picos nuevos que eran más
polares, es decir, eluyeron antes. En este perfil se observaron tres
picos nuevos prominentes y crecieron a 0,36, 0,06 y 0,64% por hora.
Según estos datos, una exposición de cinco minutos daría como
resultado una degradación del 0,09%. El fraccionamiento de estos
picos y el análisis mediante espectroscopia de masas (ESI) y el
análisis por degradación de Edman mostraron que los tres picos
tenían masas (3384,4 \pm 0,5 amu) y secuencias idénticas en los
31 ciclos de los péptidos. Este resultado es consistente con la
isomerización de los residuos de aminoácidos de la conformación L a
la D (véase, por ejemplo, Senderoff, y col., J. Pharm.
Sci. 87: 183 (1998).
Este dato es consistente con la conclusión de que
los efectos conformacionales observados en la actualidad de la
excursión básica sobre el compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH, medidos mediante FTIR y
solubilidad, no se deben a la isomerización L a D, que es evidente
en los picos HPLC nuevos.
El compuesto
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH insoluble se suspendió en agua
desionizada a 2 mg sólido/ml. El pH de una alícuota se redujo a 1,74
mediante adición de 12 microlitros de ácido fosfórico al 85%/ml de
solución. El pH de una segunda alícuota se redujo a un pH de 1,92
mediante la adición de 5,5 microlitros de ácido clorhídrico al
10%/ml de solución. Cada muestra se agitó suavemente durante 15
minutos. Las muestras se ajustaron a un pH de 7,4 mediante la
adición de hidróxido sódico al 10% y, después, cada una se filtró a
través de una membrana de filtro de 0,2 micrómetros. La porción
soluble se liofilizó y se analizó para determinar la estructura
secundaria. El análisis con infrarrojos de los productos mostró que
la absorbancia mayor en la región amida era a 1657
cm-1, consistente con la formación de
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH soluble. El análisis HPLC, como se
describe en el Ejemplo 6, no mostró la existencia de racemización
detectable.
El rendimiento recuperado fue del 77,5% para la
muestra tratada con ácido clorhídrico y del 6,4% para la muestra
tratada con ácido fosfórico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Eli Lilly and Company
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para solubilizar
compuestos de péptido 1 de tipo glucagón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> x-11708
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/178,438
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-01-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/224,058
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-08-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 1 es
L-histidina, D-histidina,
desamino-histidina,
2-amino-histidina,
betahidroxi-histidina, homohistidina,
alfa-fluorometilhistidina o alfametilhistidina.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Ala, Gly, Val,
Thr, Met, Ile, Ser o alfametil-Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15) . . (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 15 es Glu, Gln, Ala,
Thr, Ser o Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21) . . (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 21 es Glu, Gln, Ala,
Thr, Ser o Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2 o
Gly-OH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Xaa Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28) . . (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 28 es
Lys-COOH y
Lys-Gly-COOH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 1 es
4-imidazopropionilo,
4-imidazoacetilo o 4-imida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20) . . (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 20 es Lys o
Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28) . . (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 28 es Lys o es
Lys- C6-C20 acilo sin ramificar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es
Gly-OH o NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Xaa Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La posición 2 es Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los últimos 3 aminoácidos de
GLP-1(7-37) están
delecionados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) . . (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los últimos 2 aminoácidos de
GLP-1 (7-37) están delecionados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) . . (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 3 es Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) . . (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 3 es
d-Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10) . . (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 10 es Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12) . . (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 12 es Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser
Xaa Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12) . . (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 12 es Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Xaa Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212>PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Tpr Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Asp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Asp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Cys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31) . . (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 31 es NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 2 es Cys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) . . (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 3 es Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) . . (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 3 es
D-Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) . . (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 3 es Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3) . . (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 3 es D- Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16) . . (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 16 es Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17) . . (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 17 es Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18) . . (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 18 es Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20) . . (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 20 es Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Xaa}
\sac{Xaa Xaa Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17) . . (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 17 es Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
Ser Tyr Leu Glu Gly}
\sac{Xaa Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
Lys Gly Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18) . . (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en la posición 18 es Arg
Claims (18)
1. Un procedimiento para preparar un compuesto
GLP-1 que es soluble en solución acuosa a pH 7,4,
siendo referido dicho compuesto GLP-1 como un
"compuesto GLP-1 soluble", del correspondiente
compuesto GLP-1 que es sustancialmente insoluble en
solución acuosa a pH 7,4, siendo referido dicho compuesto compuesto
GLP-1 como un compuesto "GLP-1
insoluble", comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a)
- disolver el compuesto GLP-1 insoluble en base acuosa con un pH de entre 10,5 y 12,5, para formar una solución de GLP-1;
- b)
- neutralizar la solución de GLP-1 a un pH de entre 6,5, y 9,0; y
- c)
- aislar el compuesto GLP-1 soluble de la solución neutralizada de la etapa b).
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que el pH de la base acuosa está entre 12,1 y 12,5.
3. Un procedimiento para preparar un compuesto
GLP-1 que es soluble en solución acuosa a pH 7,4,
siendo referido dicho compuesto GLP-1 como
"compuesto GLP-1 soluble", del correspondiente
compuesto GLP-1 que es sustancialmente insoluble en
solución acuosa a pH 7,4, siendo referido dicho compuesto
GLP-1 como un compuesto "compuesto
GLP-1 insoluble", comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de:
- a)
- disolver el compuesto GLP-1 insoluble en base acuosa con un pH de entre 10 y 10,5, para formar una solución de GLP-1;
- b)
- neutralizar la solución de GLP-1 a un pH de entre 6,5, y 9,0; y
- c)
- aislar el compuesto GLP-1 soluble de la solución neutralizada de la etapa b).
4. Un procedimiento para preparar un compuesto
GLP-1 que es soluble en solución acuosa a pH 7,4,
siendo referido dicho compuesto GLP-1 como
"compuesto GLP-1 soluble", del correspondiente
compuesto GLP-1 que es sustancialmente insoluble en
solución acuosa a pH 7,4, siendo referido dicho compuesto
GLP-1 como un compuesto "compuesto
GLP-1 insoluble", comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de:
- a)
- disolver el compuesto GLP-1 insoluble en ácido acuoso con un pH de entre 1,5 y 2,0, para formar una solución de GLP-1;
- b)
- neutralizar la solución de GLP-1 a un pH de entre 6,5, y 9,0; y
- c)
- aislar el compuesto GLP-1 soluble de la solución neutralizada de la etapa b).
5. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la solución de
GLP-1 se neutraliza a un pH de entre 7,0 y 8,5.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la solución de
GLP-1 se neutraliza dentro de un intervalo de tiempo
lo bastante corto tras la disolución del compuesto
GLP-1 insoluble de forma que no se produzca
racemización sustancial del compuesto GLP-1
disuelto.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el
que la solución de GLP-1 se neutraliza en
aproximadamente treinta minutos tras la disolución del compuesto
GLP-1 insoluble.
8. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la solución de
GLP-1 se filtra a través de una membrana de filtro
con una porosidad lo bastante fina como para retirar el material
gelatinoso de la solución.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el
que la membrana de filtro tiene una porosidad lo bastante fina como
para retirar la materia microbiana de la solución.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el compuesto
GLP-1 soluble se aísla por liofilización,
cristalización o secado por pulverización.
11. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el compuesto
GLP-1 comprende la secuencia de aminoácidos de
GLP-1 (7-37)OH o un
fragmento de la misma modificada, de forma que cero, uno, dos, tres,
cuatro o cinco aminoácidos difieren de la posición correspondiente
del GLP-1 (7-37)OH o del
fragmento de la misma.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que el compuesto GLP-1 se modifica en la posición
8 y en la posición 22.
13. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el compuesto
GLP-1 está protegido de DPP-IV.
14. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el compuesto
GLP-1 comprende GLP-1
(7-34), GLP-1
(7-35), GLP-1 (7-36)
o GLP-1 (7-37), o la forma amida de
los mismos, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, que
tienen al menos una de las siguientes modificaciones:
- a)
- sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, arginina o D-lisina, por la lisina en la posición 26 y/o en la posición 34; o sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, lisina o D-arginina por arginina de la posición 36;
- b)
- sustitución de un aminoácido resistente a oxidación por el triptófano en la posición 31;
- c)
- sustitución de al menos uno de: tirosina por valina en la posición 16; lisina por serina en la posición 18; ácido aspártico por ácido glutámico en la posición 21; serina por glicina en la posición 22; arginina por glutamina en la posición 23; arginina por alanina en la posición 24 y glutamina por lisina en la posición 26;
- d)
- sustitución de al menos uno de: glicina, serina o cisteína por alanina en la posición 8; ácido aspártico, glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina o fenilalanina por ácido glutámico en la posición 9; serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina o fenilalanina por glicina en la posición 10; y ácido glutámico por ácido aspártico en la posición 15; o
- e)
- sustitución de glicina, serina, cisteína, treonina, asparagina, glutamina, tirosina, alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina o fenilalanina, o la forma D o N acilada o alquilada de histidina por histidina en la posición 7; donde, en las sustituciones en (a), (b), (d) y (e), los aminoácidos sustituidos pueden estar opcionalmente en la forma D y los aminoácidos sustituidos en la posición 7 pueden opcionalmente estar en la forma N acilada o N alquilada.
15. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el compuesto
GLP-1 es GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 1], GLP-1
(7-34) [SEC ID Nº 6], GLP-1
(7-35) [SEC ID Nº 7], GLP-1
(7-36)NH_{2} [SEC ID Nº 36],
Gln^{9}GLP-1 (7-37) [SEC ID Nº8],
d-Gln^{9}GLP-1
(7-37) [SEC ID Nº9],
Thr^{16}-Lys^{18}-GLP-1
(7-37) [SEC ID Nº 10],
Lys^{18}GLP-1 (7-37) [SEC ID
Nº11], Gly^{8}GLP-1
(7-36)NH_{2} [SEC ID Nº 12],
Gly^{8}GLP-1 (7-37)OH [SEC
ID Nº 13], Val^{8}GLP-1
(7-36)NH_{2} [SEC ID Nº 14],
Val^{8}GLP-1 (7-37)OH [SEC
ID Nº 15], Met^{8}GLP-1
(7-36)NH_{2} [SEC ID Nº 16],
Met^{8}GLP-1 (7-37)OH [SEC
ID Nº 17], Ile^{8}GLP-1
(7-36)NH_{2} [SEC ID Nº 18],
Ile^{8}GLP-1
(7-37)OH[SEC ID Nº 19],
Thr^{8}GLP-1 (7-36)NH_{2}
[SEC ID Nº 20], Thr^{8}GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 21],
Ser^{8}GLP-1 (7-36)NH_{2}
[SEC ID Nº 22], Ser^{8}GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 23],
Asp^{8}GLP-1 (7-36)NH_{2}
[SEC ID Nº 24], Asp^{8}GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 25],
Cys^{8}GLP-1 (7-36)NH_{2}
[SEC ID Nº 26], Cys^{8}GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 27],
Thr^{9}GLP-1 (7-37) [SEC ID Nº
28],
D-Thr^{9}-GLP-1
(7-37) [SEC ID Nº 29],
Asn^{9}GLP-1 (7-37) [SEC ID Nº
30],D-Asn^{9}-GLP-1
(7-37) [SEC ID Nº 31],
Ser^{22}-Arg^{23}-Arg^{24}-Gln^{26}-GLP-1
(7-37) [SEC ID Nº 32],
Arg^{23}-GLP-1
(7-37) [SEC ID Nº 33],
Arg^{24}-GLP-1
(7-37) [SEC ID Nº 34] y Gly^{8}
-Gln^{21}-GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 35].
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que el compuesto GLP-1 es GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 1] o
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 15].
17. Un procedimiento para preparar
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH [SEC ID N1 15] que es soluble en
solución acuosa a pH fisiológico, siendo referido dicho
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH como
"Val^{8}-GLP-1
(7-37) soluble", a partir de
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH que es insoluble en solución acuosa
a pH fisiológico, siendo referido dicho
Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH como
"Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH insoluble", comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de:
- a)
- disolver Val^{8}-GLP-1 (7-37)OH insoluble en base acuosa con un pH de entre 12,1 y 12,5, para formar una solución de Val^{8}-GLP-1 (7-37)OH;
- b)
- neutralizar la solución de Val^{8}-GLP-1 (7-37)OH en aproximadamente treinta minutos tras la disolución del compuesto Val^{8}-GLP-1 (7-37)OH a un pH de entre 7,0 y 8,5;
- c)
- filtrar la solución neutralizada de la etapa b) a través de una membrana de filtro que tiene una porosidad de entre 0,20 \mum y 0,25 \mum; y
- d)
- aislar el compuesto Val^{8}-GLP-1 (7-37)OH soluble de la solución filtrada de la etapa c).
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que el compuesto Val^{8}-GLP-1
(7-37)OH [SEC ID Nº 15] soluble se aísla de
la solución filtrada de la etapa c) mediante secado por
pulverización, liofilización o cristalización.
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