ES2213808T3 - Equivalente de piel que comprende celulas de langerhans. - Google Patents

Equivalente de piel que comprende celulas de langerhans.

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ES2213808T3 ES97400037T ES97400037T ES2213808T3 ES 2213808 T3 ES2213808 T3 ES 2213808T3 ES 97400037 T ES97400037 T ES 97400037T ES 97400037 T ES97400037 T ES 97400037T ES 2213808 T3 ES2213808 T3 ES 2213808T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN MODELO DE PIEL RECONSTRUIDA, CARACTERIZADO POR EL HECHO DE QUE COMPRENDE UN EQUIVALENTE DE EPIDERMIS SOBRE UN SOPORTE, COMPRENDIENDO DICHO EQUIVALENTE DE EPIDERMIS AL MENOS QUERATINOCITOS Y AL MENOS PRECURSORES DE CELULAS DE LANGERHANS INDUCIDOS O NO, ASI COMO EL PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE DICHO EQUIVALENTE DE PIEL. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN EQUIVALENTE DE EPIDERMIS, CARACTERIZADO POR EL HECHO DE QUE COMPRENDE AL MENOS QUERATINOCITOS Y AL MENOS PRECURSORES DE CELULAS DE LANGERHANS INDUCIDOS O NO Y SU PROCEDIMIENTO DE PREPARACION.

Description

Equivalente de piel que comprende células de Langerhans.
La presente invención se refiere a un nuevo equivalente de piel, a su procedimiento de obtención, al equivalente de epidermis comprendido en este equivalente de piel y a su procedimiento de preparación.
Se busca poner a punto, desde hace varios años, modelos de piel reconstruida que permitan efectuar los estudios necesarios para la mejor comprensión del papel de la piel tanto en el ámbito mecánico como en el ámbito fisiológico.
Así, modelos más o menos parecidos de piel humana han podido ser puestos a punto. Se pueden citar por ejemplo los modelos descritos en las patentes o en las solicitudes de patente EP 285471, EP 285474, EP 418035, WO-A-90 02796, WO-A-9116010, EP 197090, EP 20753, FR 2665175, FR 2689904.
De forma muy general, los modelos de piel reconstruida descritos en estos documentos están constituidos por queratinocitos humanos depositados sobre un soporte, a menudo un equivalente de dermis, y cultivados en condiciones tales que entran en un programa de diferenciación que conduce a la formación de un equivalente de epidermis.
Sin embargo, la epidermis humana natural está compuesta principalmente de tres tipos de células que son los queratinocitos, muy mayoritarios, los melanocitos y las células de Langerhans. Cada uno de estos tipos celulares contribuye por sus funciones propias al papel esencial jugado en el organismo por la piel.
Las células de Langerhans están implicadas en las defensas inmunitarias de la piel. Se sabe desde hace mucho tiempo estas ocupan un sitio esencial en las defensas inmunitarias del huésped, en particular como primera barrera a las agresiones exteriores.
Las células de Langerhans son células derivadas de la médula ósea que pueden caracterizarse por la presencia de gránulos de Birbeck y la expresión del marcador antigénico CD1a (células CD1a positivas) (Rowden et coll., Nature 268 : 247-248, 1977).
Las mismas juegan un papel decisivo en la iniciación de las respuestas inmunitarias dirigidas contra los antigenos introducidos en la piel o nuevamente generados por ésta.
Puestas en contacto con un alérgeno, las células de Langerhans migran a los ganglios donde desencadenan reacciones específicas de las células-T. A este respecto, son por consiguiente asimiladas en las células de presentación de los antigenos, esenciales para el buen funcionamiento de los linfocitos T.
Así, la principal función de las células de Langerhans es proporcionar una señal sensitiva en la respuesta inmunitaria de la piel inducida contra una gran variedad de antígenos incluyendo los alergenos de contacto, los antígenos tumorales y los microorganismos.
Se puede por consiguiente concluir que estas células intervienen probablemente en un gran número de patologías de la piel.
El documento WO-A-90 02796 sugiere añadir, en un sistema tridimensional de cultivo de piel, en cultivos de queratinocitos y melanocitos, células de Langerhans separadas a partir de extracciones de piel fresca. Este mismo documento precisa que el crecimiento en cultivo de tales células es difícil. Se averiguó de hecho que las células de Langerhans purificadas a partir de la extracción de la piel son células procedentes de precursores que han progresado en su ciclo de diferenciación hasta llegar a ser células CD1a positivas y que estas células separadas no progresan más en su ciclo de diferenciación.
El cultivo in vitro de tales células se resume en un mantenimiento de supervivencia debido a la incapacidad para estas células de multiplicarse. De hecho estas células se paran y mueren sin haber cumplido su papel. Sucede lo mismo cuando estas células se introducen en un modelo de piel reconstruida. Así, incluso si se sugiere introducir células de Langerhans en este documento, la piel reconstruida obtenida no podría ser satisfactoria, en la medida en que las células de Langerhans no sobreviven.
Los melanocitos están localizados en la capa basal de la epidermis. Son la sede de la melanogenesis y debido a su contacto estrecho con los queratinocitos transfieren a estos la melanina neosintetizada en forma de melanosomas, dando así a la piel su coloración. El tipo y la cantidad de melanina contenida en los melanosomas determina la coloración de la piel. Además, la melanina constituye principalmente una pantalla eficaz para la protección contra las radiaciones solares en particular las radiaciones ultravioletas. Un modelo de piel reconstruida que ha incorporado melanocitos se describe en la solicitud de patente WO-A-9351165.
Por consiguiente, se comprende que los modelos de piel reconstruida descritos en la técnica anterior solo permiten estudios incompletos del papel y/o de las reacciones de la piel. En efecto, la ausencia de células Langerhans, células esenciales para las defensas inmunitarias de la piel, en estos modelos hace estos inutilizables para estudios inmunológicos in vitro. Por otra parte, se puede suponer que los estudios farmacológicos y/o toxicológicos realizados con estos modelos solo han podido reflejar una parte de la realidad de las interacciones debido a la ausencia de este componente esencial de la piel que constituyen las células de Langerhans.
Independientemente de los fenómenos naturales que conducen a los síntomas relacionados con las pieles llamadas sensibles y/o alérgicas, fenómenos que un modelo de este tipo podrá permitir mejor delimitar, la industria en general, y la de los cosméticos en particular, introduce cada vez más a menudo compuestos nuevos en sus composiciones. Uno de los problemas principales a los cuales se enfrenta es entonces la evaluación de los efectos nefastos que estos compuestos podrían inducir en contacto con la piel en particular en términos de sensibilización de contacto.
Por razones de ética, es evidente que esta evaluación no puede ser practicada ni en el hombre, ni con los animales.
Se comprende entonces el interés de un modelo in vitro que pueda permitir, por la comprensión de los mecanismos de defensa de la piel, una mejor comprensión de los síntomas relacionados con las pieles llamadas sensibles y/o alérgicas y una evaluación de los efectos nefastos de los compuestos potencialmente utilizables en la industria.
La firma solicitante, que desde hace muchos años se interesa por el ámbito de las pieles reconstruidas, ha descubierto ahora que es posible incorporar al menos precursores de células Langerhans, previamente inducidos o no, en un modelo de piel reconstruida.
La presente invención tiene pues por objeto un modelo de piel reconstruida, caracterizado por el hecho de que comprende un equivalente de epidermis sobre un soporte, comprendiendo el indicado equivalente de epidermis al menos queratinocitos y al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no.
La expresión "precursores de células de Langerhans inducidos" cubre en este texto toda célula, normal o patológica, que ha experimentado, previamente a su puesta en co-cultivo, a menos un tratamiento destinado a conferirla los caracteres de una célula de Langerhans, es decir una célula CD1a positiva, sin implicar la adquisición o no por esta célula el carácter CD1a positivo.
En la piel normal, las células de Langerhans están localizadas en la parte suprabasal de la epidermis.
Preferentemente, el modelo de piel reconstruido según la invención presenta al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no localizados en la parte suprabasal del equivalente de epidermis.
Se entiende que el equivalente de piel de la invención puede comprender cualquier otro tipo celular que pudiera ser incorporado a la misma.
La firma solicitante ha conseguido a establecer un procedimiento de preparación de un equivalente de piel que comprende un equivalente de epidermis sobre un soporte, comprendiendo el indicado equivalente de epidermis al menos queratinocitos y al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no.
La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento para la preparación de un equivalente de piel tal como se ha descrito anteriormente, caracterizado por el hecho de que se co-cultivan sobre el soporte, queratinocitos y al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no.
Para facilitar la comprensión, el empleo del término "co-cultivo" (o términos similares) debe entenderse como referentes a los cultivos celulares efectuados sobre el soporte que permiten la elaboración de la piel reconstruida, sin que con ello se subentienda obligatoriamente la presencia de más de una especie celular. Los términos "culture" y "cultive" se entienden entonces como referentes a los cultivos celulares efectuados de forma clásica por ejemplo en cajas de cultivos celulares tradicionales.
El soporte utilizado según la invención puede ser uno cualquiera de los descritos en la técnica anterior. A título de ejemplo, se pueden citar como soporte los rejillas mixtas colágeno/fibroblastos, la dermis previamente desepidermizada, las membranas artificiales como por ejemplo los filtros de marca Millipores, los sustitutos subcutáneos a base de colágeno, el plástico o cualquier otro soporte compatible con la viabilidad celular.
Preferentemente, el soporte está constituido por una dermis previamente desepidermizada.
Sea cual fuere el soporte seleccionado, el protocolo utilizado para su realización según la invención puede ser uno cualquiera de los protocolos descritos en la técnica anterior.
Preferentemente, según la invención cuando el soporte está constituido por una dermis previamente desepidermizada se utiliza el protocolo descrito por Prunieras et Coll, Ann. Chir. Plast., 1979, 24, nº 4, 357-362.
Según la invención, para obtener el equivalente de epidermis que comprende al menos queratinocitos y al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no, se co-cultivan juntos en el soporte al menos queratinocitos y al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no.
Los queratinocitos utilizados según la invención pueden ser preparados según cualquier método conocido de la técnica anterior. Se pueden citar a título de ejemplo el cultivo a partir de epidermis disociada que proviene de la extracción de piel normal o patológica o el cultivo de queratinocitos procedentes de la envoltura de folículos pilosos normales o patológicos.
Preferentemente, según la invención los queratinocitos utilizados se preparan a partir de epidermis disociada que proviene de la extracción de piel normal o patológica, según el método descrito por Régnier et Coll, Frontier of Matrix Biology, Vol. 9, 4-35 (Karger, Basel 1981).
Los precursores de células de Langerhans pueden ser cualquier célula cepa apta para diferenciarse bajo el efecto de una inducción de células de Langerhans, es decir apta para diferenciarse de células CD1a positivas. Ventajosamente, estos precursores pueden ser células hematopoyéticas CD34^{+} (Caux et Coll, Nature, Vol. 360, Nov. 1992, 258).
Los precursores de células de Langerhans pueden ser purificados a partir de tejidos en los cuales se encuentran de forma natural, entre los cuales se pueden citar la medula ósea, la sangre periférica, la sangre de cordón umbilical.
Preferentemente, se utiliza según el procedimiento de la invención precursores de células de Langerhans preparados a partir de sangre periférica o de sangre de cordón umbilical y aún más preferentemente precursores preparados a partir de sangre de cordón umbilical.
Cualquier método de purificación puede ser utilizado a este fin. Se puede citar, por ejemplo, el descrito por Caux et Coll, Nature, Vol. 360, Nov. 1992, 258.
Según la invención, la inducción de la diferenciación de los precursores de células de Langerhans puede realizarse antes o después de su puesta en co-cultivo.
Esta inducción puede desde luego ser realizada por cualquier método conocido. Entre estos métodos se puede citar, por ejemplo, la diferenciación inducida por las citoquinas tales como el factor de estimulación de colonias (Granulocyte/Macrophage - Colony Stimulating Factor ou GM-CSF), el factor de necrosis tumoral (Tumor Necrosis Factor ou TNF-\alpha), el factor de células cepas (Stem Cell Factor ou SCF), la interleuquina 3 o también la interleuquina 4 o una mezcla de estas.
Pero la firma solicitante ha descubierto de forma completamente sorprendente que la diferenciación de los precursores de células Langerhans puede ser espontáneamente inducida por la presencia de queratinocitos o también por un cultivo de estos precursores en un medio en el cual ha sido previamente cultivados queratinocitos.
La inducción en presencia de queratinocitos puede por consiguiente ser realizada bien sea por un cultivo simultáneo de precursores de células Langerhans y de queratinocitos, interviniendo la inducción que en el cultivo, bien sea por co-cultivo de los precursores de células de Langerhans y de los queratinocitos sobre un soporte, por ejemplo una dermis desepidermizada, interviniendo la inducción en el seno del co-cultivo.
Preferentemente según la invención, la inducción de la diferenciación de los precursores de células de Langerhans se realiza por la presencia de queratinocitos y aún más preferentemente por co-cultivo de los precursores de células de Langerhans y de los queratinocitos sobre un soporte.
Ventajosamente, la inducción de la diferenciación de los precursores de células de Langerhans puede efectuarse por la combinación de al menos dos de estos métodos como por ejemplo el cultivo en presencia de queratinocitos y en presencia de al menos una citoquina o también el cultivo en presencia de una mezcla de citoquinas, como por ejemplo la combinación del GM-CSF y del TNF-\alpha.
La concentración en citoquinas utilizadas para la inducción es desde luego función de la naturaleza de la citoquina utilizada.
Las citoquinas están en general presentes en concentraciones comprendidas entre 1 ng/ml y 400 ng/ml de preferencia entre 2,5 ng/ml y 300 ng/ml.
Así, por ejemplo para la GM-CSF la concentración puede estar comprendida entre 100 ng/ml y 400 ng/ml y de preferencia entre 200 ng/ml y 300 ng/ml. Para el TNF-\alpha la concentración puede estar comprendida entre 1 ng/ml y 7,5 ng/ml y de preferencia entre 2,5 ng/ml y 5 ng/ml.
En la medida en que se utilice una mezcla de citoquinas, la proporción de una citoquina con relación a la otra variada en función de la naturaleza de las citoquinas utilizadas. Por ejemplo en el caso de la mezcla GM-CSF/TNF-\alpha, esta está comprendida entre las relaciones ponderales 400/1 y 13/1 y de preferencia entre 120/1 y 40/1.
Es posible para la puesta en co-cultivo de enriquecer la preparación de precursores inducidos de células CD1a positivas. Para ello se separan en los cultivos de precursores inducidos las células CD1a positivas.
Según la invención, la relación entre el número de queratinocitos y los precursores de células de Langerhans inducidos o no, co-cultivados sobre el soporte, está comprendida entre las relaciones 95/5 y 25/75 en porcentaje en número de células total en el co-cultivo y preferentemente entre 75/25 y 35/65 y aún más preferentemente esta relación es de 50/50.
Según el procedimiento de la invención, los precursores de células de Langerhans inducidos o no son puestos en co-cultivo en cualquier fase de la elaboración del equivalente de epidermis.
Ventajosamente, el procedimiento según la invención comprende una etapa en la cual los precursores de células de Langerhans inducidos o no son puestos en co-cultivo con los queratinocitos en un tiempo que permite su localización suprabasal en el equivalente de epidermis.
Preferentemente, los precursores de células de Langerhans inducidos o no son puestos en co-cultivo en un tiempo seleccionado entre el momento en que la capa suprabasal del equivalente de epidermis comienza a formarse y el momento en que los queratinocitos diferenciados comienzan a formar la primera capa de stratum corneum.
Aún más preferentemente, los precursores de células de Langerhans inducidos o no son puestos en co-cultivo en un tiempo seleccionado entre el momento en que la capa suprabasal del equivalente de epidermis comienza a formarse y el segundo día de incubación después de la exposición a la superficie intermedia aire / líquido (ver a continuación).
El medio nutritivo utilizado para el procedimiento según la invención puede ser cualquier medio nutritivo conocido por su capacidad para permitir la proliferación y la diferenciación de queratinocitos. Se puede citar a título de ejemplo el medio Dulbecco modificado Eagle, o un medio definido con contenido en calcio variable, tal como el medio descrito por Boyce S.T. et Ham R.G., (J. Tissue Cult. Meth., 1985, 9, 83-93).
Ventajosamente, según la invención es posible utilizar una mezcla de varios medios nutritivos como por ejemplo la mezcla medio Dulbecco modificado Eagle/medio HAM F12 o medio de Rheinwald et Green, (Cell, 1975, 6, 331-334).
Según el protocolo de preparación del equivalente de piel, el co-cultivo se mantiene primeramente sumergido en un medio nutritivo durante un tiempo de incubación de 3 a 8 días. Este medio nutritivo puede ser por ejemplo el medio descrito por Rheinwald et Green, medio que permite la proliferación de los queratinocitos.
Al cabo de este tiempo de incubación, el co-cultivo es llevado a la superficie intermedia de aire / líquido, por ejemplo por depósito sobre una rejilla metálica. El líquido está entonces preferentemente constituido por el mismo medio nutritivo que el precedente, a diferencia de que solo 3 de los factores de crecimiento inicialmente contenidos en el medio de Rheinwald et Green son conservados a las mismas concentraciones, a saber el factor de crecimiento epidérmico (EGF), la insulina y la hidrocortisona.
La incubación se continua seguidamente hasta la obtención de un equivalente de piel que presenta las características de una piel, a saber un equivalente de dermis que soporta un equivalente de epidermis que presenta las capas celulares clásicas a saber las capas basal, suprabasal, granulosa y córnea.
Así, la incubación se continua durante un tiempo comprendido entre 5 y 30 días.
El modelo de piel reconstruida así realizado está constituido por dos entidades, el soporte y el equivalente de epidermis, que es posible separar físicamente el uno del otro.
El equivalente de epidermis puede entonces ser utilizado por separado del soporte.
La invención se refiere pues igualmente a un equivalente de epidermis, caracterizado por el hecho de que comprende al menos queratinocitos y al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no y su procedimiento de preparación, tal como se ha descrito anteriormente.
Preferentemente, el equivalente de epidermis según la invención presenta al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no localizados en su parte suprabasal.
Bien entendido, el equivalente de piel que presenta la mejor similitud con la piel normal es el equivalente de piel que contiene los tres tipos celulares esenciales presentes en la piel normal.
Así, ventajosamente, el modelo de piel reconstruida según la invención comprende además melanocitos.
La invención se refiere ventajosamente a un equivalente de epidermis que contiene queratinocitos, al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no y de melanocitos.
Los melanocitos utilizados según la invención pueden ser purificados a partir de cualquier órgano que contenga como por ejemplo la piel normal o el folículo de cabello.
Preferentemente, se utilizan melanocitos purificados a partir de piel normal.
Cualquier método de purificación conocido de la técnica anterior puede ser utilizado para preparar estos melanocitos. Se puede citar por ejemplo el método descrito por Olsson et Coll, Acta Derm. Venereol., 1994, 74, 226-268.
Para obtener un equivalente de piel que contiene los tres tipos celulares presentes en la piel normal, es necesario co-cultivar queratinocitos, precursores de células de Langerhans inducidos o no y melanocitos sobre un soporte.
Así, según otro modo particular de procedimiento de la invención, este se caracteriza por el hecho de que se co-cultivan sobre un soporte, queratinocitos al menos de los precursores de células de Langerhans inducidos o no y melanocitos.
En los casos de un equivalente de piel que comprende los tres tipos celulares, el procedimiento utilizado para su realización no difiere en nada del expuesto anteriormente para la realización de un equivalente de piel que comprende dos tipos celulares.
Por ejemplo la relación entre la mezcla (queratinocitos + melanocitos) y las células de Langerhans y/o los precursores co-cultivados sobre el soporte está comprendida entre las relaciones 95/5 y 25/75 en porcentaje del número total de células en el co-cultivo y preferentemente entre 75/25 y 35/65 y aún más preferentemente esta relación es de 50/50.
La relación particular entre queratinocitos y melanocitos puede ser la descrita en la técnica anterior (WO-A-9351165).
Los ejemplos indicados a continuación ilustran la invención sin limitarla en modo alguno.
Ejemplo de preparación de un equivalente de epidermis que contiene queratinocitos, células de Langerhans y melanocitos
Se constituyó una mezcla de queratinocitos humanos normales previamente separados según el método descrito en Réigner et collaborateurs, (Frontier of Matrix Biology, Vol. 9, 4-35, Karger, Basel 1981) y de melanocitos humanos previamente separados según el método descrito en Olsson et coll., (Acta Derm. Venereol., 1994, 74, 226-268), en una proporción de 10 por 1. Esta mezcla fue depositada sobre una dermis desepidermizada a razón de 5x10^{5} células por cm^{2}, según el método descrito por Prunieras et Coll, Ann. Chir. Plast., 1979, 24, nº 4, 357-362. El cultivo se efectuó en un medio constituido por una mezcla de medio Dulbecco modificado Eagle y del medio HAM F12 en una proporción de 3 por 1, conteniendo un 10% de suero de ternera fetal, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 400 ng/ml de hidrocortisona, 10^{-6} M Isoproterenol 5 \mug/ml de transferrina, 2 x 10^{-9}M de triyodotironina, 1,8 x 10^{-4} M de adenina y 5 \mug/ml de insulina (Rheinwald et Green, Cell, 1975, 6, 331-334). El cultivo se mantuvo así sumergido durante 6 días. El cultivo fue entonces colocado en la superficie intermedia de aire/líquido, estando el indicando líquido entonces constituido por el mismo medio que el indicado anteriormente del cual el isoproterenol, la transferrina, la triyodotironina y la adenina fueron retirados.
Paralelamente, células CD34^{+} fueron aisladas a partir de sangre de cordón umbilical y cultivadas según el método descrito en Caux et Coll., (Nature, Vol. 360, 19 novembre 1992, páginas 258-260), durante 6 días en presencia de un factor de estimulación de colonias (Granulocyte/Macrophage - Colony Stimulating Factor ou GM-CSF) a la concentración de 200 ng/ml y de factor de necrosis tumoral (Tumor Necrosis Factor ou TNF-\alpha) a la concentración de 2,5 ng/ml. 2 días después del paso de la mezcla queratinocitos / melanocitos por la superficie intermedia de aire / líquido, se depositó sobre la epidermis en reconstrucción 5x10^{5} células CD34^{+}, tales como las previamente preparadas. El cultivo se mantuvo a continuación hasta la obtención de un equivalente de epidermis histológicamente satisfactorio es decir un equivalente de epidermis que presenta las capas celulares clásicas, a saber las capas basal, suprabasal, granulosa y córnea.
Preparación de un equivalente de epidermis que contiene queratinocitos y células de Langerhans, sin preinducción de precursores de células de Langerhans
Se constituyó una mezcla de queratinocitos humanos normales previamente separados según el método descrito por Réigner et coll., (Frontier of Matrix Biology, Vol. 9, 4-35, Karger, Basel 1981) y de células CD34^{+} separados a partir de sangre de cordón umbilical según el método descrito por Caux et Coll., (Nature, Vol. 360, 19 novembre 1992, páginas 258-260), en una proporción de 1 por 1. Esta mezcla fue depositada sobre una dermis desepidermizada a razón de 5x10^{5} células de cada tipo por cm^{2} según el método descrito por Prunieras et coll., (Ann. Chir. Plast., 1979, 24, nº 4, 357-362). El co-cultivo se efectúo en un medio constituido por una mezcla del medio Dulbecco modificado Eagle y del medio HAM F12 en una relación volúmica de 3 por 1, conteniendo un 10% de suero de ternera fetal, 10 ng/ml de factor de desarrollo epidérmico (EGF), 400 ng/ml de hidrocortisona, 10^{-6} M Isoproterenol 5 \mug/ml de trasferrina, 2 x 10^{-9} M de triyodotironina, 1,8 x 10^{-4} M de adenina y 5 \mug/ml de insulina (Rheinwald et Green, Cell, 1975, 6, 331-334). El cultivo se mantuvo así sumergido durante 6 horas. El cultivo se colocó entonces en la superficie intermedia de aire / líquido, estando entonces el indicando líquido constituido por el mismo medio que el anteriormente del cual el isoproterenol, la transferrina, la triyodotironina y la adenina fueron retirados.
El co-cultivo se mantuvo a continuación hasta la obtención de un equivalente de epidermis histológicamente satisfactorio, es decir un equivalente de epidermis que presenta las capas celulares clásicas, a saber las capas basal, suprabasal, granulosa y córnea.

Claims (28)

1. Equivalente de piel, caracterizado por el hecho de que comprende un equivalente de epidermis sobre un soporte, comprendiendo el indicado equivalente de epidermis al menos queratinocitos y al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no, siendo los precursores de células de Langerhans células hematopoyéticas CD34^{+}.
2. Equivalente de piel según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el soporte es seleccionado entre las rejillas mixtas colágeno / fibroblastos, la dermis previamente desepidermizada, las membranas artificiales como por ejemplo los filtros de marca Millipores, los sustitutos sub-cutáneos a base de colágeno, el plástico o cualquier otro soporte compatible con la viabilidad celular.
3. Equivalente de piel según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el soporte esta constituido por dermis previamente desepidermizada.
4. Equivalente de piel, según una cualquier de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que comprende además melanocitos.
5. Equivalente de piel según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que los precursores de células de Langerhans inducidos o no tienen una localización suprabasal en el equivalente de epidermis.
6. Procedimiento de preparación de un equivalente de piel, caracterizado por el hecho de que el co-cultivo sobre un soporte de queratinocitos y al menos precursores de células de Langerhans inducidos o no, siendo los precursores de células de Langerhans células hematopoyéticas CD34^{+}.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que la relación entre el número de queratinocitos y los precursores de células de Langerhans inducidas o no, co-cultivados sobre el soporte está comprendido entre las relaciones 95/5 y 25/75 en porcentaje en número total de células en el co-cultivo y preferentemente entre 75/25 y 35/65 y aún más preferentemente esta relación es de 50/50.
8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado por el hecho de que los queratinocitos son obtenidos por el cultivo a partir de epidermis disociada proveniente de extracción de piel normal o patológica o por el cultivo de queratinocitos procedentes de la envoltura de folículo piloso normal o patológico.
9. Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado por el hecho de que los queratinocitos son obtenidos a partir de extracción de piel normal o patológica.
10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por el hecho de que los precursores de células de Langerhans son purificados a partir de medula ósea, de sangre periférica o de sangre de cordón umbilical.
11. Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado por el hecho de que los precursores de células de Langerhans son purificadas a partir de sangre de cordón umbilical.
12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, caracterizado por el hecho de que la diferenciación de los precursores de células de Langerhans es inducido antes o después de su puesta en co-cultivo.
13. Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado por el hecho de que la diferenciación de los precursores de células de Langerhans es inducido después de su puesta en co-cultivo.
14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado por el hecho de que la diferenciación de los precursores de células de Langerhans es inducida según un método seleccionado entre el cultivo en presencia de queratinocitos, el cultivo en un medio en el han sido previamente cultivados queratinocitos, el cultivo en presencia de una citoquina seleccionada entre el factor de simulación de colonias, el factor de necrosis tumoral, el factor de células cepa la interleuquina 3 o la interleuquina 4.
15. Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado por el hecho de que la diferenciación es inducida por la combinación de al menos dos métodos seleccionados entre el cultivo en presencia de queratinocitos, el cultivo en un medio en el cual han sido previamente cultivados queratinocitos, el cultivo en presencia de una citoquina seleccionada entre el factor de estimulación de colonias, el factor de necrosis tumoral, el factor de células cepa la interleuquina 3 o la interleuquina 4.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que la diferenciación es inducida por el cultivo en presencia de queratinocitos y en presencia de al menos una citoquina o por el cultivo en presencia de una mezcla de citoquinas, como por ejemplo la combinación del GM-CSF y del TNF-\alpha.
17. Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado por el hecho de que la diferenciación es inducida por una mezcla de GM-CSF y de TNF-\alpha.
18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17, caracterizado por el hecho de que las citoquinas están presentes en concentraciones comprendidas entre 1 ng/ml y 400 ng/ml de preferencia entre 2,5 ng/ml y 300 ng/ml.
19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 18, caracterizado por el hecho de que la concentración en GM-CSF está comprendida entre 100 ng/ml y 400 ng/ml y de preferencia entre 200 ng/ml y 300 ng/ml.
20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 19, caracterizado por el hecho de que la concentración en TNF-\alpha está comprendida entre 1 ng/ml y 7,5 ng/ml y de preferencia entre 2,5 ng/ml y 5 ng/ml.
21. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado por el hecho de que la proporción entre citoquinas en el caso de mezcla GM-CSF/TNF- \alpha está comprendida entre las relaciones ponderales 400/1 y 13/1 y de preferencia entre 120/1 y 40/1.
22. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 21, caracterizado por el hecho de que los precursores de las células de Langerhans inducidos o no son puestos en co-cultivo con los queratinocitos en un tiempo que permite su localización en la parte suprabasal del equivalente de epidermis.
23. Procedimiento según la reivindicación anterior, caracterizado por el hecho de que los precursores de células de Langerhans inducidos o no son puestos en cultivo en un tiempo seleccionado entre el momento en que la capa suprabasal del equivalente de epidermis comienza a formarse y el momento en que los queratinocitos diferenciados comienzan a formar la primera capa del estrato córneo.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado por el hecho de que los precursores de células de Langerhans inducidos o no son puestos en co-cultivo con un tiempo seleccionado entre el momento en que la capa suprabasal del equivalente de epidermis comienza a formarse y el segundo día de cultivo después del paso por la superficie intermedia de aire / líquido.
25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 24, caracterizado por el hecho de que se co-cultivan además melanocitos.
26. Equivalente de epidermis, caracterizado por el hecho de que comprende al menos queratinocitos y precursores de células de Langerhans inducidos o no, siendo los precursores de células de Langerhans células hematopoyéticas CD34^{+}.
27. Equivalente de epidermis según la reivindicación 26, caracterizado por el hecho de que comprende además melanocitos.
28. Equivalente de epidermis según una cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27 caracterizado por el hecho de que los precursores de células de Langerhans inducidos o no tienen una localización suprabasal.
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