FR2879747A1 - Procede d'evaluation in vitro du potentiel protecteur contre la photoimmunosuppression ou du caractere photosensibilisant de produits ou de compositions. - Google Patents
Procede d'evaluation in vitro du potentiel protecteur contre la photoimmunosuppression ou du caractere photosensibilisant de produits ou de compositions. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne notamment un procédé d'évaluation in vitro de la capacité d'au moins un produit à moduler les défenses immunitaires cutanées en condition photoinduite, caractérisé en ce que l'on évalue, sur un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans exposé à une irradiation UV, la capacité dudit produit à moduler (a) le nombre et/ou la morphologie des cellules de Langerhans et/ou (b) la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction d'hypersensibilité de contact HSC.Ce procédé permet notamment de cribler et/ou évaluer soit l'activité protectrice et/ou réparatrice de produits vis-à-vis de la photoimmunosuppression (ex : filtres UV) soit le caractère photosensibilisant (photoallergisant ou phototoxique) de produits destinés à des compositions cosmétiques ou dermatologiques.
Description
L'invention concerne notamment un procédé d'évaluation in vitro de la
capacité d'au moins un produit à moduler les défenses immunitaires cutanées en condition photoinduite, caractérisé en ce que l'on évalue, sur un équivalent d'épiderme comprenant
au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans exposé à une irradiation UV, la capacité dudit produit à moduler (a) le nombre et/ou la morphologie des cellules de Langerhans et/ou (b) la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction d'hypersensibilité de contact (HSC).
On pourra également évaluer selon l'invention l'activité d'une association de produits ou même l'activité globale d'une composition.
Ce procédé permet notamment de cribler et/ou évaluer soit l'activité protectrice et/ou réparatrice de produits vis-à-vis de la photoirnmunosuppression (ex: filtres UV) soit le caractère photosensibilisant (photoallergisant ou phototoxique) de produits destinés à des compositions cosmétiques ou dermatologiques.
L'invention concerne également l'utilisation d'un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans soumis à une irradiation UV, en tant que modèle in vitro pour évaluer le potentiel protecteur et/ou réparateur de produits vis-à-vis de la photoimmunosuppression ou le caractère photosensibilisant de produits.
La peau est reconnue comme l'un des principaux éléments actifs du système de défense immunitaire. Trois types de cellules épidermiques participent à ce système: les kératinocytes, les mélanocytes et les cellules de Langerhans, qui jouent un rôle primordial dans la réponse immunitaire cutanée à des agressions extérieures (produits chimiques, allergènes, micro-organismes, radiations UV).
Les cellules de Langerhans sont des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse qui peuvent être caractérisées par la présence de granules de Birbeck et l'expression du marqueur antigénique CD1 a (cellules CD1 a positives). Elles jouent un rôle décisif dans l'initiation des réponses immunitaires dirigées contre les antigènes introduits dans la peau ou nouvellement générés par celle-ci. Mises en contact avec un allergène, les cellules de Langerhans migrent vers des ganglions où elles déclenchent les réactions spécifiques des cellules T; à ce titre, elles sont assimilées à des cellules de présentation des antigènes, essentielles au bon fonctionnement des lymphocytes T. Mais les cellules de Langerhans sont aussi la cible privilégiée des rayonnements UV, qui peuvent altérer leur structure et/ou leur fonction et par là-même affecter le système de défense immunitaire cutané (photoimmunosuppresssion), conduisant à une baisse des résistances aux agressions et notamment, une augmentation de l'incidence de certains cancers.
Les rayonnements UV sont également responsables de la photosensibilisation, qui est un processus chimique associé à une molécule ou produit, appelé photosensibilisateur, dont la présence dans un système le rend sensible à la lumière.
Ces réactions photosensibilisées cutanées correspondent généralement à des effets secondaires indésirables du produit et se manifestent: - à court terme, par des réactions de phototoxicité ou de photoallergie; - à long terme, par des réponses mutagènes ou carcinogènes.
Ces réactions photosensibilisées cutanées peuvent induire la formation de photoadduits au sein des cellules épidermiques, la génération d'espèces réactives de l'oxygène, une phototoxicité en terme d'apoptose et de nécrose et des conséquences sur le phénotype et la fonctionnalité des cellules dont les cellules de Langerhans.
Une réaction de phototoxicité est une irritation photochimique résultant de l'action conjuguée d'un produit et de la lumière, qui survient lors d'une première exposition, à condition que l'agent phototoxique soit en quantité suffisante et que la peau soit exposée aux longueurs d'onde appropriées. Les lésions cliniques sont limitées aux surfaces exposées à la lumière.
Une réaction de photoallergie nécessite également l'action conjuguée d'un produit et de la lumière: c'est un phénomène immunologique qui comporte une phase d'induction et une phase de révélation, c'est-à- dire que la réaction se déclenche généralement lors d'une exposition ultérieure aux UV et à l'agent photoallergisant.
Ces molécules photosensibilisantes peuvent être contenues dans différents produits (médicaments, essences de plantes, colorants, produits ménagers ou produits cosmétiques) et la réaction peut survenir suite à une ingestion ou un contact.
On comprend donc de ce qui précède l'importance des cellules de Langerhans dans le système immunitaire cutané et la nécessité de disposer d'un modèle in vitro prédictif des effets UV in vivo, utilisable comme modèle pour évaluer des produits capables de moduler la structure et/ou la fonction des cellules de Langerhans en condition photoinduite, autrement dit moduler les défenses immunitaires cutanées en condition photoinduite.
Or la Demanderesse vient justement de montrer que le modèle in vitro d'équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans décrit dans la demande EP 0 789 074 répondait aux UV (UVA et UVB ou UVA seuls) de la même façon qu'un modèle in vivo de peau hurnaine. En effet, elle a pu montrer que des conditions d'exposition à une radiation UV altérait de façon semblable dans les 2 modèles le nombre et/ou la morphologie des cellules de Langerhans, qui sont une des manifestations d'une réaction de photoimmunosuppression (au niveau de la structure des cellules de Langerhans).
Par altération du nombre des cellules de Langerhans', on entend une modification du nombre des cellules de Langerhans, en particulier une diminution de leur nombre.
Par 'altération de la morphologie des cellules de Langerhans', on entend une modification de la taille des cellules de Langerhans et/ou de leur dendricité, c'est-à-dire du nombre et de la longueur des dendrites; on entend en particulier une diminution de la taille desdites cellules et/ou de leur dendricité.
Par ailleurs, elle a pu montrer que ce même modèle, mis en contact avec un allergène et soumis à une radiation UV, permettait de mettre en évidence une altération de la réponse à une réaction d'hypersensibilité de contact induite par un allergène, autre manifestation de la réaction de photoimmunosuppression (au niveau cette fois de la fonction des cellules de Langerhans). Cette altération de la réaction d'hypersensibilité de contact (HSC) était visualisée par une diminution de la variation du taux d'expression du gène IL-113 connu pour être normalement surexprimé spécifiquement dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction d'hypersensibilité de contact HSC.
Par altération de la réaction d'hypersensibilité de contact (HSC)', on entend une diminution de la réponse à une réaction d'hypersensibilité de contact, qui se manifeste par une diminution de la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction d'HSC. Cette diminution de la variation du taux d'expression peut correspondre à une diminution ou plus rarement, une augmentation du taux d'expression des gènes, selon respectivement que les gènes sont normalement sur-exprimés ou au contraire sous-exprimés lors d'une réaction d'HSC. On sait en effet que les gènes HLA-DR, CD80, CD86, CD83, CD 54 (ICAM-1), CD40, CD44, CD45, CD58 (LFA-3), CD32/16 (FcïRlUlll), CD23 (FcERII), CD24, CD11c, CCR7, CXCR4, IL-1(3, IL-1[3 Converting Enzyme (ICE), Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9), 5- Lipoxygènase (5-LO), F4/80 sont normalement susceptibles d'être sur- exprimés spécifiquement au niveau des cellules de Langerhans lors d'une réaction d'hypersensibilité de contact; alors que les gènes CD1 a et CCR6 sont au contraire susceptibles d'être sous-exprimés spécifiquement au niveau des cellules de Langerhans lors d'une réaction d'hypersensibilité de contact.
L'utilisation de cet équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans paraît donc avantageuse en tant que modèle in vitro pour évaluer des produits protecteurs et/ou réparateurs vis-à-vis de la photoimmunosuppression ou le caractère photosensibilisant (photoallergisant ou phototoxique) de produits.
L'invention concerne donc un procédé d'évaluation in vitro de la capacité d'au moins un produit à moduler les défenses immunitaires cutanées en condition photoinduite, caractérisé en ce que l'on évalue, sur un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans exposé à une irradiation UV, la capacité dudit produit à moduler (a) le nombre et/ou la morphologie des cellules de Langerhans et/ou (b) la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction d'hypersensibilité de contact HSC.
L'homme du métier déterminera aisément, par habitude, la nature du témoin nécessaire à la mise en oeuvre du procédé.
En particulier, le témoin pourra être un équivalent d'épiderme comprenant des kératinocytes et des cellules de Langerhans mis dans les mêmes conditions que la condition à tester mais en absence du produit à tester.
Des contrôles adaptés sont également utilisés pour assurer la pertinence des résultats observés sur notre modèle. Il s'agira d'équivalents d'épidermes comprenant des kératinocytes et des cellules de Langerhans mis dans les conditions suivantes: - non irradié ; - non irradié + produit à tester; - non irradié + allergène; - irradié.
Selon un premier mode de réalisation, le procédé selon l'invention est un procédé d'évaluation de l'activité protectrice et/ou réparatrice d'au moins un produit vis-à-vis de la photoimmunosuppression, comprenant les étapes suivantes: - on met en contact un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans avec un produit à tester, ledit produit étant appliqué avant et/ou pendant et/ou après une irradiation UV; - on analyse le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans; - on compare ce résultat par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on sélectionne les produits pour lesquels le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans n'est pas ou peu diminué par rapport au témoin.
Pour évaluer la capacité d'un produit à maintenir (potentiel protecteur) les défenses immunitaires cutanées en condition photoinduite, le produit doit être appliqué avant l'irradiation UV.
Pour évaluer la capacité d'un produit à rétablir (potentiel réparateur) les défenses immunitaires cutanées en condition photoinduite, le produit doit être appliqué pendant et/ou après l'irradiation UV.
L'analyse du nombre et/ou de la taille des cellules de Langerhans pourra être réalisée selon les techniques classiques d'immunomarquage et d'analyse d'image. Le nombre des cellules de Langerhans exprimé en cellules /cm2 d'épiderme ou en cellules/mm de longueur d'épiderme peut par exemple correspondre au comptage du nombre de cellules HLA-DR, Langérine ou CD1 a+ après mise en oeuvre de techniques classiques d'immunomarquage.
Le principe général de la technique d'immunomarquage consiste par exemple à incuber les feuillets épidermiques, préalablement séparés du derme, avec un anticorps monoclonal de rat dirigé contre les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe Il: HLA-DR humain (clone: YE2/36HL Harlan Seralab) présents au niveau des membranes cellulaires des cellules de Langerhans, ou avec un anticorps dirigé contre la Langérine (Immunotech). La présence de ces anticorps est ensuite révélée grâce à un second anticorps biotinylé dirigé contre les immunoglobulines de rat puis fixation d'un complexe streptavidine couplé à la peroxydase et révélation par de l'AEC (3-amino-ethyl carbazole) ou un second anticorps dirigé contre les immunoglobulines de rat couplé à la fluorescéine (FITC).
L'analyse de la dendricité des cellules de Langerhans peut être réalisée selon les techniques classiques d'analyse d'image et de mesure du nombre et de la longueur des dendrites.
Selon une alternative, ce procédé peut intégrer la présence d'un allergène et comprendre les étapes suivantes: - on met en contact un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans avec un produit à tester, ledit produit étant appliqué avant et/ou pendant et/ou après une irradiation UV; - on applique un allergène; - on mesure la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse audit allergène; - on compare cette mesure par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on sélectionne les produits pour lesquels la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse audit allergène n'est pas ou peu diminuée par rapport au témoin.
La mesure de la variation du taux d'expression des gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse à un allergène peut être réalisée par une mesure de la quantité d'ARNm dudit gène (ex: IL-1(3) selon les techniques classiques d'analyse transcriptomique, telles que RNA-arrays ou RT-PCR. De préférence on utilisera la technique de RT-PCR.
Par exemple, la technique RT-PCR peut comprendre les étapes suivantes: isoler les ARN totaux à partir des équivalents d'épiderme; - synthétiser les ADNc correspondants par réverse-transcription; amplifier par polymérisation en chaîne PCR les fragments correspondant à IL-113, à l'aide d'amorces spécifiques d'IL-1 R et d'HPRT (contrôle) ; - analyser les produits PCR par électrophorèse en gel d'agarose et quantification par détection fluorométrique, par rapport au témoin non traité.
Il sera ainsi avantageux de tester l'activité protectrice et/ou réparatrice de filtres UV vis-à-vis de la photoimmunosuppression. On sait en effet que l'efficacité des filtres UV vis-à-vis de l'érythème définie par le FPS (Facteur de Protection Solaire), ne prédit pas leur efficacité vis-à-vis de la photoimmunosuppression (Kelly DA et al., 2000, J. Exp. Med., vol 191, num 3, pp.561-566).
On pourra également évaluer et comparer selon le procédé de l'invention l'activité protectrice et/ou réparatrice de composés vis-à- vis de la photoimmunosuppression, connus pour prévenir l'altération photoinduite du nombre et/ou de la morphologie des cellules de Langerhans (ex: polyphénols extraits de thé vert) et/ou la diminution photo-induite des réactions HSC (ex: isoflavonoïdes végétaux, vitamines).
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention est un procédé d'évaluation du caractère phototoxique d'au moins un produit, comprenant les étapes suivantes: - on met en contact un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans avec un produit à tester, ledit produit étant appliqué avant et/ou pendant une irradiation UV; - on analyse le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans; - on compare ce résultat par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on attribue un caractère phototoxique' aux produits pour lesquels le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans est diminué par rapport au témoin.
Selon une alternative, ledit procédé peut intégrer la présence d'un allergène et comrpendre les étapes suivantes: - on met en contact un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans avec un produit à tester, ledit produit étant appliqué avant et/ou pendant une irradiation UV; - on applique un allergène; - on mesure la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse audit allergène; - on compare cette mesure par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on attribue un caractère 'phototoxique' aux produits pour lesquels la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse à un allergène est diminuée par rapport au témoin.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention est un procédé d'évaluation du caractère photoallergisant d'au moins un produit, comprenant les étapes suivantes: on met en contact un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans avec un produit à tester, ledit produit 25 étant appliqué avant une irradiation UV; - on analyse (i) le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans, ainsi que (ii) la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction HSC; - on compare ces résultats par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on attribue un caractère photoallergisant' aux produits pour lesquels (i) le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans est diminué par rapport au témoin et/ou (ii) la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les celllules de Langerhans est augmentée par rapport au témoin.
2879747 9 Selon une alternative, le procédé peut intégrer la présence d'un allergène et comprendre les étapes suivantes: - on met en contact un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans avec un produit à tester, ledit produit 5 étant appliqué avant une irradiation UV; - on applique un allergène; - on mesure la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction HSC; - on compare cette mesure par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact 10 avec ledit produit et l'allergène; - on attribue un caractère 'photoallergisant amplifiable par un allergène' aux produits pour lesquels la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction HSC est amplifiée par rapport au témoin.
Par 'photoallergisant amplifiable par un allergène', on entend un composé dont le caractère photoallergisant est amplifié en présence d'un allergène.
Cette alternative peut présenter un intérêt notamment pour visualiser des effets additifs 20 ou synergiques de composés à caractère (photo)allergisants, lesdits composés pouvant être présents dans une même composition ou dans des compositions différentes.
Dans les procédés décrits ci-dessus comprenant une étape de mesure de la variation du taux d'expression d'un gène spécifiquement régulé dans les cellules de Langerhans en réponse à un allergène, ledit gène peut être choisi parmi les gènes HLA-DR, CD80, CD86, CD83, CD 54 (ICAM-1), CD40, CD44, CD45, CD58 (LFA-3), CD32/16 (FcyRll/III), CD23 (FcERII), CD24, CD11c, CCR7, CXCR4, IL-1 R, IL-1p Converting Enzyme (ICE), Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9), 5-Lipoxygènase (5-LO), F4/80, CD1a et CCR6.
La mesure de la variation du taux d'expression des gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse à un allergène peut être réalisée par une mesure de la quantité d'ARNm dudit gène (ex: IL-1p) selon les techniques classiques d'analyse transcriptomique, telles que RNA-arrays ou RT-PCR.
De préférence on utilisera la technique de RT-PCR, qui peut comprendre par exemple les étapes suivantes: - isoler les ARN totaux à partir des équivalents d'épiderme; - synthétiser les ADNc correspondants par réverse-transcription; amplifier par polymérisation en chaîne PCR les fragments correspondant à IL-113, à l'aide d'amorces spécifiques d'IL-1 [3 et d'HPRT (contrôle) ; - analyser les produits PCR par électrophorèse en gel d'agarose et quantification par détection fluorométrique, par rapport au témoin non traité.
L'allergène' utilisé dans le procédé selon l'invention est un agent capable d'induire sur l'équivalent d'épiderme une réaction d'hypersensibilité de contact (HSC), caractérisée notamment par une variation du taux d'expression de certains gènes, spécifiquement au niveau des cellules de Langerhans.
L'allergène pourra par exemple être choisi parmi l'oxazolone, le 2, 4 dinitrofluorobenzène, le paraphénylènediamine, l'eugénol, la benzocaïne et le sulfate de nickel.
Avantageusement, on utilisera l'oxazolone.
L'allergène est généralement appliqué à une concentration sub- toxique inférieure ou égale à 1/3 de sa concentration cytotoxique. Cette concentration cytotoxique est variable selon les allergènes et est déterminée par exemple par l'observation au microscope d'altérations cellulaires au niveau des kératinocytes (ex: modification de la forme, perte d'adhérence).
En particulier l'allergène sera appliqué à une dose et pendant une durée suffisante pour déclencher une réaction d'hypersensibilité de contact, mesurable par la variation du taux d'expression de certains gènes connus pour être spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en présence d'un allergène. Pour IL-1[3 par exemple, on pourra appliquer l'allergène, en particulier l'oxazolone, pendant 24 heures.
L'équivalent d'épiderme utilisé dans les procédés de l'invention décrits ci-dessus, est décrit dans la demande EP 0 789 074. II cornprend au moins des kératinocytes et au moins des précurseurs de cellules de Langerhans induits ou non. Il peut également comprendre d'autres types cellulaires de la peau, en particulier des mélanocytes.
Cet équivalent d'épiderme est généralement préparé sur un support; à titre d'exemple, on peut citer comme support les lattices rnixtes collagène/fibroblastes, le derme préalablement désépidermisé, les membranes artificielles comme par exemple les filtres de marque Millipores, les substituts sous-cutanés à base de collagène, en particulier le biomatériau EPISKIN, le plastique ou tout autre support compatible avec la viabilité cellulaire.
Préférentiellement, le support est constitué par un derme préalablement désépidermisé et l'on met en oeuvre le protocole décrit dans Prunieras et collaborateurs, Ann. Chir. Plast., 1979, 24, n 4, 357- 362.
Les kératinocytes utilisés dans l'équivalent d'épiderme peuvent être préparés selon toute méthode connue de l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple la culture à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique ou la culture de kératinocytes issus de la gaine de follicules pileux normaux ou pathologiques.
Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau humaine normale ou pathologique, en particulier selon la méthode décrite dans Régnier et collaborateurs, Frontier of Matrix Biology, Vol.9, 4-35 (Karger, Basel 1981) ou à partir de la gaine de follicules pileux humains normaux ou pathologiques.
Les précurseurs de cellules de Langerhans peuvent être toute cellule souche apte à se différencier sous l'effet d'une induction en cellules de Langerhans, c'est à dire apte à se différencier en cellules CD1a positives.
Avantageusement, ces précurseurs peuvent être des cellules hématopoïétiques CD34+ (Caux et collaborateurs, Nature, Vol. 360, Nov. 1992, 258).
Les précurseurs de cellules de Langerhans peuvent être purifiés à partir des tissus dans lesquels ils se trouvent naturellement, parmi lesquels on peut citer la moelle osseuse, le sang périphérique, le sang de cordon ombilical. Préférentiellement on utilisera les cellules CD34+ issues de sang de cordon ombilical commercialisées par Praxcell.
D'autres sources de précurseurs de cellules de Langerhans peuvent également être utilisées dans l'équivalent d'épiderme utilisé dans le procédé selon l'invention: - des monocytes CD14+ issus du sang commercialisés par Poïetics/Cambrex; - des lignées myéloïdes humaines, telles que les lignées HL60 KG1, U937 et THP1 commercialisées par ATCC ou la lignée MUTZ-3; - les cellules dendritiques dérivées de CD34+ de sang de cordon (CD34-D) commercialisées par MatTek.
En particulier, on utilisera des cellules de Langerhans provenant de précurseurs des cellules de Langerhans choisis parmi des cellules dérivées des cellules hématopoïétiques CD34+ d'origine humaine, des cellules CD34-D ou des cellules de lignées myéloïdes HL60 KG1 ou MUTZ-3.
L'induction de la différenciation des précurseurs de cellules de Langerhans peut être réalisée avant ou après leur mise en co-culture.
Cette différencitaion peut être induite par les cytokines telles que le facteur de stimulation de colonies (Granulocyte/Macrophage -Colony Stimulating Factor ou GMCSF), le facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor ou TNF-a), le facteur de cellules souches (Stem Cell Factor ou SCF), l'interleukine 3 ou encore l'interleukine 4 ou un mélange de celles-ci.
Mais elle peut également être spontanément induite par la présence de kératinocytes ou encore par une culture de ces précurseurs dans un milieu dans lequel ont été préalablement cultivés des kératinocytes.
Les précurseurs des cellules de Langerhans induits ou non sont mis en co-culture à 20 tout stade de l'élaboration de l'équivalent d'épiderme.
Le rapport entre le nombre de kératinocytes et les précurseurs de cellules de Langerhans induits ou non, co-cultivés sur le support, est généralement compris entre les rapport 95/5 et 25/75 en pourcentage du nombre de cellules total dans la co-culture et préférentiellement entre 75/25 et 35/65 et encore plus préférentiellement ce rapport est de 50/50.
Le milieu nutritif utilisé peut être tout milieu nutritif connu pour sa capacité à permettre la prolifération et la différenciation des kératinocytes. On peut citer à titre d'exemple le milieu Dulbecco modifié Eagle, ou un milieu défini à teneur en calcium variable, tel le milieu décrit par Boyce S.T. et Ham R.G., (J. Tissue Cult. Meth., 1985, 9, 83-93) . Avantageusement, il est possible d'utiliser un mélange de plusieurs milieux nutritifs comme par exemple le mélange milieu Dulbecco modifié Eagle/milieu HAM F12 ou milieu de Rheinwald et Green, (Cell, 1975, 6, 331334).
Selon un mode particulier de l'invention, l'équivalent d'épiderme utilisé dans l'un des procédés décrits ci-dessus est préparé comme suit: on constitue un mélange de kératinocytes humains normaux préalablement isolés selon la méthode décrite dans Régnier et coll, (Front Matrix Biol, Vol.9, 4-35, 1981) avec ou sans mélanocytes humains préalablement isolés selon la méthode décrite dans Olsson et coll., (Acta Derm. Venereol., 1994, 74, 226-268), dans une proportion de 10 pour 1.
Ces cellules sont déposées sur un derme désépidermisé (Regnier et coll, Front Matrix Biol, Vol.9, 4-35, 1981; Regnier et coll., Exp Cell Res, 165:63-72, 1986) ou sur un support collagénique type Episkin (1.3 cm). . Sur le derme désépidermisé, 5x105 cellules par cm2 sont déposées selon la méthode décrite dans Prunieras et coll., (Ann. Chir. Plast., 1979, 24, n 4, 357-362) et la culture s'effectue dans un milieu constitué d'un mélange de milieu Dulbecco modifié Eagle et de milieu HAM F12 en une proportion de 3 pour 1, contenant 10 % de sérum de veau foetal, 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 400 ng/ml d'hydrocortisone, 10-6 M Isoprotérénol, 5 11g/ml de transferrine, 2 x 10-9 M detriiodothyronine, 1,8 x 10-4 M d'adénine et 5 g/ml d'insuline (Rheinwald et Green, Cell, 1975, 6, 331-334).
La culture est ainsi maintenue immergée pendant 6 jours. La culture est alors placée à l'interface air/liquide, ledit liquide étant alors constitué du même milieu que précédemment duquel l'isoprotérénol, la transferrine, la triiodothyronine et l'adénine ont été retirés.
Parallèlement, des cellules CD34+ sont isolés à partir de sang de cordon ombilical et cultivées selon la méthode décrite dans Caux et Coll., (Nature, Vol. 360, 19 novembre 1992, pp. 258-260), pendant 6 jours en présence de facteur de stimulation de colonies (Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor ou GM-CSF) à la concentration de 200 ng/ml et de facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor ou TNF-a) à la concentration de 2,5 ng/ml.
2 jours après passage du mélange kératinocytes/mélanocytes à l'interface air/liquide, 30 on dépose sur l'épiderme en reconstruction 5x105 cellules CD34+, telles que préalablement préparées.
La culture est ensuite entretenue jusqu'à obtention d'un équivalent d'épiderme histologiquement satisfaisant c'est-à-dire un équivalent d'épiderme présentant les couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée.
Sur un support collaqénique type Episkin (1.3 cm), 4x105 kératinocytes sont inoculés simultanément avec les cellules dendritiques dérivées des CD34+ (5x104 CD1a+).
Les cellules CD34+ ont été préalablement cultivées et différenciées en une sous-population dendritique CD1a+ pendant 7 jours dans le milieu StemBio A (C.N.R.S.
Villejuif, France) en présence de 1000 U/ml GM-CSF, 50 U/ml TNF-a, 20 ng/mL de Stem Oeil Factor (SCF) remplacé au 3 ou 4ème jour par 0.5 ng/ml de Tumor Growth Factor (TGF-(3).
Le mélange cellulaire est maintenu immergé pendant 3 jours en milieu Dulbecco modifié Eagle et milieu HAM F12 en une proportion de 3 pour 1, contenant 10 % de sérum de veau foetal, 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 400 ng/ml d'hydrocortisone, 10"6 M Isoprotérénol, 5 g/ml de transferrine, 2 x 10-9 M de triiodothyronine, 1, 8 x 10-4 M d'adénine et 5 g/ml d'insuline (Rheinwald et Green, Cell, 1975, 6, 331-334). Les cellules sont alors placées pendant 10 jours à l'interface air/liquide dans le même milieu que précédemment dans lequel l'isoprotérénol, la transferrine, la triiodothyronine et l'adénine ont été retirés.
L'irradiation UV' utilisée dans le procédé de l'invention, est une irradiation comprenant des UVA et des UVB (RSS ou radiation solaire simulée) ou des UVA seuls.
La condition d'irradiation RSS peut être reproduite avec une lampe au Xénon Oriel (1000W,) équipée au moins d'un miroir dichroïque et d'un filtre Schott WG-320 (RSS). La condition d'irradiation aux UVA seuls peut être reproduite à l'aide d'une lampe au Xénon Oriel équipée au moins d'un miroir dichroïque et d'un filtre Schott WG-335.
L'irradiation UV est appliquée à une dose biologique efficace (DBE ou BED) et pendant une durée suffisante pour induire la formation de cellules coups de soleil (sun burn cells) dans l'équivalent d'épiderme, caractérisées notamment par une position suprabasale, un noyau picnotique (chromatine condensée) et un cytoplasme eosinophile (coloré en orange).
Par exemple, la dose BED utilisée dans le procédé de l'invention est une dose comprise entre 8,4J/ cm2 et 9,6 J/cm2; et l'irradiation UV peut par exemple être appliquée pendant une durée de 10-15 min. L'invention porte encore sur l'utilisation de la variation du taux d'expression de l'IL-1(3 35 comme marqueur de l'activité des cellules de Langerhans en condition photoinduite, dans un procédé d'évaluation in vitro du potentiel protecteur et/ou réparateur d'au moins un produit vis- à-vis de la photoimmunosuppression ou du potentiel photosensibilisant d'au moins un produit, ledit procédé étant réalisé sur un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans soumis à une irradiation UV (UVA et UVB ou UVA seuls) et à un allergène.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans soumis à une irradiation UV (UVA et UVB ou UVA seuls), en tant que modèle in vitro pour évaluer le potentiel protecteur et/ou réparateur de produits vis-à-vis de la photoimmunosuppression ou le potentiel photosensibilisant de produits.
L'invention sera maintenant illustrée par les exemples non limitatifs suivants.
EXEMPLES
Exemple 1: Comparaison du modèle in vivo de peau et du modèle in vitro 20 d'épiderme reconstruit contenant des cellules de Langerhans vis- à-vis des effets UV (SSR ou UVA seuls) - Modèle in vivo Des biopsies en forme de fuseau de 1 cm de long ont été prélevées sur des sujets à peau claire (phototype II et III) sous anesthésie locale (xylocaïne 2% adrénalysée) 24 heures (étude UVA) ou 72 heures (étude SSR== UVA/UVB) après l'exposition.
Les expositions UVA ont été réalisées à l'aide d'une lampe au xénon Oriel 10 cm x 10 cm équipée d'un miroir dichroïque et d'un filtre Schott WG-335 / 3 mm.
Les expositions RSS- 2MED ont été réalisées à l'aide d'une lampe au xénon Oriel équipée d'un miroir dichroïque et d'un filtre Schott WG- 320 / 1,5 mm.
L'analyse des cellules de Langerhans est faite par une technique d'immunomarquage selon le protocole suivant: les feuillets épidermiques, préalablement séparés du derme, ont été incubés soit 40 heures à 37 C avec un anticorps monoclonal de rat dirigé contre les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II: HLA-DR humain (clone: YE2/36HL - Harlan Seralab) présents au niveau des membranes cellulaires des cellules de Langerhans soit la nuit à température ambiante avec un anticorps dirigé contre la Langérine dilué au 1/200 (Immunotech). La présence de ces anticorps est ensuite révélée grâce à un second anticorps biotinylé dirigé contre les immunoglobulines de rat puis fixation d'un complexe streptavidine couplé à la peroxydase et révélation par de l'AEC (3-amino-ethyl carbazole) ou un second anticorps dirigé contre les immunoglobulines de rat couplé à la fluorescéine (FITC).
- Modèle in vitro 000 cellules dendritiques CD1a+, dérivées de cellules CD34+ de sang de cordon ombilical, et 400 000 kératinocytes normaux humains sont inoculés sur support Episkin (1,3cm2). Les cellules sont cultivées pendant 3 jours dans un milieu DMEM/Ham F12 (3:1) contenant 10% de sérum de veau foetal, 10 ng/ml d'EGF, 400 ng/ml d'hydrocortisone, 10-6 M d'isoprotérénol, 5 pg/ml de transferrine, 2x10-9 M de triiodothyronine, 1,8x10-4 M d'adénine et 5 pg/ml d'insuline. Les cellules sont alors placées à l'interface air-liquide pendant 10 jours pour induire la différenciation épidermique dans un milieu de culture sans isoprotérénol, transferrine, triiodothyronine et adénine.
Les échantillons ont été exposés sous une lampe au Xénon Oriel 15 cm x 15 cm équipée d'un miroir dichroïque et d'un filtre Schott WG-335 / 3 mm (UVA) ou d'un filtre Schott WG-320 / 1,5 mm (SSR). Vingt-quatre heures après irradiation, les épidermes reconstruits ont été détachés avec du bromure de sodium 2M et fixés à l'acétone.
Les immunomarquages des feuillets épidermiques ont été réalisés avec le kit LSAB 2 System HRP (DAKO, Glostrup, Danemark). L'anticorps monoclonal anti-Langérine (clone DCGM4, Beckmann Coulter/Immunotech, Marseille, France) a été utilisé au 1/300ème et l'anticorps anti-HLA- DR(/DP/DQ) (clone CR3/43, M0775, DAKO) au 1/50ème - Analyses de la densité et de la morphologie La densité (nombre) de cellules positives est évaluée par analyseur d'image et les résultats sont exprimés en nombre de cellules par mm2 d'épiderme.
Les altérations morphologiques des cellules de Langerhans, au niveau de leur taille et/ou de leur dendricité (nombre et longueur des dendrites) sont évaluées par analyse d'image.
Résultats UVA L'analyse de la densité des cellules HLA-DR positives et Langérine positives, identifiées comme étant des cellules de Langerhans, a permis la mise en évidence d'un effet dose global linéaire significatif (p<0.01) pour les 2 modes de détection mis en oeuvre (anticorps anti-HLA-DR ou anti-Langérine) et pour les 2 modèles testés (vitro/ vivo) : le nombre de cellules de Langerhans diminue linéairement en fonction de la dose d'UVA délivrée.
On observe également des altérations morphologiques des cellules de Langerhans (HLA-DR positives) après exposition UVA: dans le modèle in vivo, on observe ainsi une diminution de la taille des cellules de Langerhans après exposition UVA et la disparition des dendrites (diminution de leur nombre et de leur longueur) ; cet effet est linéaire en fonction de la dose d'UVA. Une tendance identique est observée in vitro après exposition à 30 J.cm 2 d'UVA.
Résultats RSS In vivo, on observe une diminution du nombre de cellules de Langerhans (densité) après exposition SSR. La dose seuil pour observer cet effet est supérieure à 1 DEM. Une tendance identique est observée in vitro après exposition à 8.4 J-cm-2 SSR.
Dans les 2 modèles évalués, on observe une variabilité des résultats concernant les modifications de la morphologie des cellules de Langerhans après exposition SSR, mais une tendance vers une diminution de la taille et/ou de la dendricité des cellules de Langerhans.
L'ensemble de ces résultats montre que l'effet des UV (UVA et SSR) sur le nombre et la morphologie des cellules de Langerhans est globalement similaire dans les 2 modèles évalués: in vitro (épiderme reconstruit contenant des cellules de Langerhans) et in vivo (peau humaine).
Ce qui fait de notre modèle in vitro un bon modèle d'évaluation de l'effet des UVA et UVB ou UVA seuls sur le système immunitaire cutané impliquant les cellules de Langerhans, et par là même, un bon modèle pour évaluer des actifs protecteurs et/ou réparateurs vis-à-vis de la photoimmunosuppression ou des actifs photosensibilisants (phototoxiques ou photoallergiques).
Un tel procédé d'évaluation de l'activité protectrice et/ou réparatrice vis-à-vis de la photo- immunosuppression ou de l'activité photosensibilisante de produits pourra ainsi être basé sur une analyse du nombre des cellules de Langerhans et/ou de leur dendricité , comparativement à un témoin.
Exemple 2: Evaluation du potentiel protecteur du Mexoryle SX vis-à- vis de l'inhibition photoinduite de la sur-expression de l'IL-15 causée par l'oxazolone (photoimm unosuppressionl Préparation de l'équivalent d'épiderme L'équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans est préparé selon la méthode décrite dans la demande EP 0 789 074 (L'OREAL) ou dans Regnier et coll. (1997, the journal of investigative dermatology, 109, n 4, pp.510-512) ou une méthode dérivée, comme décrit ci-après.
On constitue un mélange de kératinocytes humains normaux préalablement isolés selon la méthode décrite dans Régnier et colli, (Front Matrix Biol, Vol.9, 4-35, 1981) avec ou sans mélanocytes humains préalablement isolés selon la méthode décrite dans Olsson et coll., (Acta Derm. Venereol., 1994, 74, 226-268), dans une proportion de 10 pour 1.
4x105 kératinocytes sont inoculés simultanément avec les cellules dendritiques dérivées des CD34+ (5x104 CD1 a+) sur un support collagénique type Episkin (1.3 cm2).
Les cellules CD34+ ont été préalablement cultivées et différenciées en une sous-population dendritique CD1a+ pendant 7 jours dans le milieu StemBio A (C.N.R.S. Villejuif, France) en présence de 1000 U/ml GM-CSF, 50 U/ml TNF-a, 20 ng/mL de Stem Cell Factor (SCF) remplacé au 3 ou 4eme jour par 0.5 ng/ml de Tumor Growth Factor (TGF-(3).
Le mélange cellulaire est maintenu immergé pendant 3 jours en milieu Dulbecco modifié Eagle et milieu HAM F12 en une proportion de 3 pour 1, contenant 10 % de sérum de veau foetal, 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 400 ng/ml d'hydrocortisone, 10-6 M Isoprotérénol, 5 pg/ml de transferrine, 2 x 10-9 M de triiodothyronine, 1, 8 x 10-4 M d'adénine et 5 gg/ml d'insuline (Rheinwald et Green, Cell, 1975, 6, 331-334). Les cellules sont alors placées pendant 10 jours à l'interface air/liquide dans le même milieu que précédemment dans lequel l'isoprotérénol, la transferrine, la triiodothyronine et l'adénine ont été retirés.
Traitement des équivalents d'épiderme Des équivalents d'épiderme ainsi préparés seront traités séparément selon les conditions suivantes: contrôle 1: non irradié ; - contrôle 2: application de l'oxazolone 1% (allergène) pendant 24h; - contrôle 3: irradiation RSS; - témoin: irradiation RSS (Radiation Solaire Simulée) puis application, par exemple 1 h après, de l'oxazolone 1% pendant 24h; - test: application du produit à tester, en l'occurrence le Mexoryl SX 4% (filtre UV) 15 minutes avant irradiation RSS puis application, par exemple 1 h après, de l'oxazolone 1% 10 pendant 24h.
La condition d'irradiation RSS ou Radiation Solaire Simulée, est reproduite avec une lampe au Xénon Oriel (1000W, 15cm x 15cm) équipée d'un miroir dichroïque et d'un filtre Schott WG-320/1,5mm (RSS 9.6J/cm2).
Selon une alternative, la condition d'irradiation RSS peut être remplacée par une condition d'irradiation aux UVA seuls, à l'aide d'une lampe au Xénon Oriel 15 cm x 15 cm équipée d'un miroir dichroïque et d'un filtre Schott WG-335 / 3 mm.
Mesure de la variation du taux d'expression des ARNms de l'IL-113 par RT-PCR.
Les feuillets épidermiques reconstruits comme décrit précédemment sont détachés du support et les ARNs totaux sont extraits avec du Trizol (Life Technologies/GibcoBRL) selon le protocole préconisé par le fournisseur, puis reverse-transcrits en ADNc. Un premier brin d'ADNc est synthétisé à partir de 1 pg d'ARN en utilisant (un primer) une amorce oligo(dT)18 (First-strand synthesis kit, Amersham Pharmacia Biotech). L'ADNc est ensuite amplifié dans un volume total de 100pI contenant 50mM de KCI, 10mM Tris-HCI (pH 8.3), 1.5mM MgCl2, 200pM dNTPs, des amorces spécifiques PCR (200pmol IL-1(3 ou 5pmol d'hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase HPRT), et 2.5 unités d'ADN polymerase AmpliTaq (Perkin Elmer).
cycles de réaction de polymérisation en chaîne PCR (Gene Amp PCR system 2400, Perkin Elmer) sont réalisés dans les conditions suivantes: dénaturation à 94 C pendant 45 secondes, liaison des amorces à 60 C (IL1(3/ HPRT) pendant 1 mn et polymérisation à 72 C pendant 2 mn.
Les amorces spécifiques d'IL-1(3 et d'HPRT (contrôle) utilisées sont les suivantes: IL-1-p (produit PCR de 250 pb; Reutter et al., Toxicol. in vitro (1997) 11, 619-626) 5'-(6-Fam)GAC ACA TGG GAT AAC GAG GC 5'-ACG CAG GAC AGG TAC AGA TT HPRT (gène de ménage; produit PCR de 470 pb) : 5'-(6-Fam)GGC GTC GTG ATT AGT GAT GAT GAT GAA CC 5'-CTT GCG ACC TTG ACC ATC TTT GGA Les produits PCR sont analysés par électrophorèse en gel d'agarose 2% en tampon Trisacetate EDTA contenant du bromure d'éthidium. Ils sont quantifiés par détection fluorométrique après séparation par électrophorèse capillaire, en utilisant un analyseur ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems).
Les intensités fluorométriques IL-113/ HPRT dans les échantillons traités sont comparées 15 au témoin non traité.
On obtient les résultats suivants: Conditions expérimentales Ratio ARNms IL-1(3/HPRT non irradié (contrôlel) 1.0 Oxazolone 1 % (contrôle 2) 1.7 RSS + Oxazolone 1 % (témoin) 0.8 Mexoryl SX 4% + RSS + Oxazolone 1 % 1.8 RSS (contrôle 3) 1.1 Ces résultats montrent que le modèle d'équivalent d'épiderme comprenant des cellules de Langerhans soumis à un allergène (contrôle 2) répond par une variation (augmentation) de l'expression de l'IL-1(3, correspondant à l'activité des cellules de Langerhans lors de la réaction d'hypersensibilité de contact en présence d'un allergène.
La diminution de la variation du taux d'expression de l'IL-1(3 dans la condition RSS + oxazolone' (témoin), correspond à une inhibition photoinduite de la sur-expression de l'IL-1(3 normalement induite par l'allergène; cette inhibition correspond à une réaction de photoimmunosuppression affectant la fonctionnalité des cellules de Langerhans (capacité à produire de l'IL 1-R).
En présence du Mexoryl SX 4% (test filtre UV), appliqué avant la radiation RSS et l'application de l'allergène, on observe un niveau de taux d'expression d'IL-1(3 équivalent à la condition allergène seul', ce qui montre un effet protecteur du filtre UV vis-à-vis de la réaction de photoimmunosuppression observée en absence de filtre UV. Le filtre UV est ainsi capable de protéger la fonction immunitaire des cellules de Langerhans contre les effets des UV.
La condition irradiation RSS (contrôle 3) seule montre qu'il n'y a pas d'influence sur le taux d'expression constitutif de l'IL-113.
Donc l'équivalent d'épiderme reconstruit contenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans est un bon modèle pour évaluer le potentiel protecteur de produits (ex: filtres UV) vis-à-vis de la photoimmunosuppression.
Exemple 3: Evaluation du potentiel réparateur d'un produit vis-à- vis de l'inhibition photoinduite de la sur-expression de l'IL-1f causée par l'oxazolone L'évaluation du potentiel réparateur d'un produit ou d'une composition contenant au moins ce produit peut être réalisée selon un protocole similaire à celui décrit à l'exemple 20 2 mais avec l'application du produit après et/ou pendant l'irradiation UV.
Le test peut consister en: - une préparation d'un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans, comme décrit à l'exemple 2; - une irradiation RSS dudit équivalent d'épiderme; l'application, par exemple 1h après (ou en même temps que l'irradiation), sur cet équivalent d'épiderme, du produit ou de la composition à tester pendant 24 à 72h - l'application de l'allergène pendant 24 h; - la mesure du taux d'expression des ARNms de l'IL-113 par RT-PCR, selon le 30 protocole décrit à l'exemple 2.
Si le produit est photoréparateur, on mesure une augmentation du taux d'expression des ARNms de l'IL-1(3 induite par l'allergène par rapport au témoin; alors qu'un produit non photoréparateur ne permet pas d'empêcher l'inhibition par les UV de la sur-expression d'IL-113 induite par l'allergène.
Exemple 4: Evaluation du potentiel photosensibilisant (phototoxique ou photoallergisant) d'un produit L'évaluation du potentiel photosensibilisant d'un produit ou d'une composition contenant au moins ce produit peut être réalisée selon un protocole similaire à celui décrit à l'exemple 2.
Le test peut consister en: - une préparation d'un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans, comme décrit à l'exemple 2; - une irradiation UV dudit équivalent d'épiderme en présence du produit ou de la composition à tester, ledit produit étant appliqué avant l'irradiation UV; - l'application, par exemple 1h après l'irradiation, de l'allergène pendant 24 h 15 - la mesure du taux d'expression des ARNms de l'IL-1(3 par RT-PCR, selon le protocole décrit à l'exemple 2.
Pour un produit photoxique, on obtiendra une inhibition plus importante de la sur- expression d'IL-1(3 qu'avec les UV seuls: le produit phototoxique amplifie l'effet UV. Si la différence d'inhibition entre "UV" et "UV+phototoxique" est faible, on peut montrer que l'on a la même inhibition mais à une dose UV inférieure avec le produit photoxique (à partir d'une gamme de doses RSS).
Pour un produit photoallergisant, qui se comporte comme un allergène photoinductible (nécessité de le mettre avant l'irradiation), on obtiendra une augmentation de l'expression IL-1[3 par rapport à une absence de traitement ou à un allergène seul. Si la différence entre sur- expression avec "1 allergène" et "allergène + photoallergique" est faible, on peut montrer que l'on a la même sur-expression mais à une concentration de l'allergène inférieure avec le produit photoallergique (à partir d'une gamme de concentrations pour l'allergène).
Claims (16)
1. Procédé d'évaluation in vitro de la capacité d'au moins un produit à moduler les défenses immunitaires cutanées en condition photoinduite, caractérisé en ce que l'on évalue, sur un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans exposé à une irradiationUV, la capacité dudit produit à moduler (a) le nombre et/ou la morphologie des cellules de Langerhans et/ou (b) la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction d'hypersensibilité de contact HSC.
2. Procédé d'évaluation in vitro selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé d'évaluation de l'activité protectrice et/ou réparatrice d'au moins un produit vis-à-vis de la photoimmuriosuppression, comprenant les étapes suivantes: - on met en contact un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans avec un produit à tester, ledit produit étant appliqué avant et/ou pendant et/ou après une irradiation UV; - on analyse le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans; - on compare ce résultat par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on sélectionne les produits pour lesquels le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans n'est pas diminué par rapport au témoin. 25
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'application d'un allergène sur ledit équivalent après l'étape de mise en contact avec le produit à tester, et dans lequel: - on mesure la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse audit allergène; - on compare cette mesure par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on sélectionne les produits pour lesquels la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse audit allergène n'est pas diminuée par rapport au témoin.
4. Procédé d'évaluation in vitro selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé d'évaluation du caractère phototoxique d'au moins un produit, comprenant les étapes suivantes: - on met en contact un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans avec un produit à tester, ledit produit étant appliqué avant et/ou pendant une irradiation UV; - on analyse le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans; - on compare ce résultat par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on attribue un caractère 'phototoxique' aux produits pour lesquels le nombre et/ou la taille et/ou la dendricité des cellules de Langerhans est diminué par rapport au témoin.
5. Procédé d'évaluation in vitro selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'application d'un allergène sur ledit équivalent après l'étape de mise en contact avec le produit à tester, et dans lequel: - on mesure la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse audit allergène; - on compare cette mesure par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on attribue un caractère phototoxique' aux produits pour lesquels la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans en réponse à un allergène est diminuée par rapport au témoin.
6. Procédé d'évaluation in vitro selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé d'évaluation du caractère photoallergisant d'au moins un produit, dans lequel ledit produit est appliqué avant une irradiation UV, et qui comprend en outre les étapes suivantes: - on mesure la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction HSC; - on compare cette mesure par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit; - on attribue un caractère photoallergisant' aux produits pour lesquels la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans est augmentée par rapport au témoin.
7. Procédé d'évaluation in vitro selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'application d'un allergène après la mise en contact dudit équivalent avec le produit à tester, et dans lequel: - on mesure la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction HSC; - on compare cette mesure par rapport à un témoin n'ayant pas été mis en contact avec ledit produit et l'allergène; - on attribue un caractère 'photoallergisant amplifiable par un allergène' aux produits pour lesquels la variation du taux d'expression de gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans lors d'une réaction HSC est amplifiée par rapport au témoin.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 3, 5, 6 et 7, caractérisé en ce que les gènes dont la variation du taux d'expression est mesurée sont choisis parmi HLA-DR, CD80, CD86, CD83, CC) 54 (ICAM-1), CD40, CD44, CD45, CD58 (LFA-3), CD32/16 (FcyRll/III), CD23 (FcsRll), CD24, CD11c, CCR7, CXCR4, IL-1(3, IL-1(3 Converting Enzyme (ICE) , Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9), 5-Lipoxygènase (5-LO), F4/80, CD1 a et CCR6.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 3, 5, 6 et 7, caractérisé en ce que le taux d'expression des gènes spécifiquement régulés dans les cellules de Langerhans de la réaction d'HSC est évalué par la quantité d'ARNm dudit gène mesurée par une technique de RT-PCR.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3, 5, 6 et 7, caractérisé en ce que l'allergène est choisi parmi l'oxazolone, le 2,4 dinitrofluorobenzène, le paraphénylènediamine (pPD), l'eugénol, la benzocaïne et le sulfate de nickel.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'allergène est appliqué sur ledit épiderme reconstruit en une quantité inférieure ou égale à 1/3 de la concentration cytotoxique dudit allergène.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'équivalent d'épiderme comprend des kératinocytes obtenus à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau humaine normale ou pathologique ou à partir de la gaine de follicules pileux humains normaux ou pathologiques.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que les cellules de Langerhans proviennent de précurseurs des cellules de Langerhans choisies parmi des cellules dérivées des cellules hématopoïétiques CD34+ d'origine humaine, des cellules CD34-D, ou des cellules de lignées myéloïdes HL60 KG1 ou MUTZ- 3.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'irradiation UV comprend des UVA et des UVB ou des UVA seuls.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'irradiation UV est appliquée à une dose biologique efficace comprise entre 8,4J/cm2 et 9,6J/cm2.
16. Utilisation d'un équivalent d'épiderme comprenant au moins des kératinocytes et des cellules de Langerhans soumis à une irradiation UV, en tant que modèle in vitro pour évaluer le potentiel protecteur et/ou réparateur de produits vis-à-vis de la photoimmunosuppression ou le caractère photosensibilisant de produits.
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FR0453024A FR2879747A1 (fr) | 2004-12-16 | 2004-12-16 | Procede d'evaluation in vitro du potentiel protecteur contre la photoimmunosuppression ou du caractere photosensibilisant de produits ou de compositions. |
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FR0453024A FR2879747A1 (fr) | 2004-12-16 | 2004-12-16 | Procede d'evaluation in vitro du potentiel protecteur contre la photoimmunosuppression ou du caractere photosensibilisant de produits ou de compositions. |
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2004
- 2004-12-16 FR FR0453024A patent/FR2879747A1/fr active Pending
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