ES2213221T3 - Factor de tipo egf de granulos de cromafina y factor neurotrofico derivado de celulas de glia con actividad promotora de la supervivencia sobre neuronas daergicas. - Google Patents
Factor de tipo egf de granulos de cromafina y factor neurotrofico derivado de celulas de glia con actividad promotora de la supervivencia sobre neuronas daergicas.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROTEINAS SIMILARES A EGF, DERIVADAS DE LOS GRANULOS DE CROMAFINA, QUE PRESENTAN UNA ACTIVIDAD PROMOTORA DE LA SUPERVIVENCIA DE NEURONAS DAERGICAS, A SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN PARA DICHAS PROTEINAS O PARA UN DERIVADO FUNCIONALMENTE ACTIVO O PARTE DEL MISMO, Y A PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION DE LAS MISMAS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A FACTORES NEUROTROFICOS DERIVADOS DE LAS CELULAS GLIALES, QUE SON CAPACES DE PROMOVER LA SUPERVIVENCIA DE NEURONAS DAERGICAS, A SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN PARA DICHOS FACTORES O PARA UN DERIVADO FUNCIONALMENTE ACTIVO O UNA PARTE DEL MISMO, Y A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE LOS MISMOS.
Description
Factor de tipo EGF de gránulos de cromafina y
factor neurotrófico derivado de células de glía con actividad
promotora de la supervivencia sobre neuronas DAérgicas.
La presente invención se refiere a proteínas de
tipo EGF derivadas de gránulos de cromafina que están implicadas en
promover la supervivencia de neuronas DAérgicas, y a procedimientos
para su preparación.
Los injertos de tejido medular adrenal y células
de cromafina en el estriatum de pacientes con Morbus Parkinson (PD)
y modelos animales de la enfermedad han presentado efectos
terapéuticos que conducen a la restauración de los transmisores y
las funciones motoras (para revisiones, véase Freed, 1993; Fisher y
Gage, 1993). Una explicación común para estos efectos ha sido que
las células de cromafina injertadas pueden compensar, secretando
dopamina (DA), la ausencia sustancial de este transmisor
nigrostriatal en PD (Ehringer y Homykiewicz, 1960). Sin embargo, las
cantidades de DA sintetizadas y liberadas por las células de
cromafina son pequeñas (aprox. 1% de las catecolaminas totales en
ratas adultas; Coulter y col., 1988), y los aumentos de DA estriatal
son incluso muy moderados inmediatamente adyacentes a un injerto de
célula de cromafina (Becker y Freed, 1988). Se ha argumentado por lo
tanto también que la liberación de mediadores químicos distintos a
DA puede ser una causa para los efectos beneficiosos de los injertos
de células de cromafina en el cerebro parkinsoniano. El brote
sustancial de los axones restantes dentro del estriatum lesionado
(Bohn y col., 1987; Kordower y col., 1991) ha planteado las
especulaciones de que las moléculas neurotróficas o citoquinas que
provocan la síntesis y liberación de moléculas neurotróficas pueden
subyacer los efectos curativos de los injertos de células de
cromafina. Esta idea recibe apoyo de la evidencia creciente de que
las células de cromafina sintetizan, almacenan, y liberan un gran
número de factores de crecimiento y neuropéptidos activos
neurotróficamente (Lachmund y col., 1994; Unsicker y Stögbauer,
1992; véase Unsicker, 1993, y Unsicker y Krieglstein, 1996, para
revisiones). Se demostró que la estimulación de la liberación de
gránulos desde células de cromafina con el agonista colinérgico
carbachol aumentaba el rendimiento de la actividad del factor
neurotrófico para varias poblaciones de neuronas de los sistemas
nerviosos periférico y central (Lachmund y col., 1994). La secreción
inducida por despolarización de la actividad neurotrófica se
paraleló por la liberación aumentada de
cromo-granina A y catecolaminas sugiriendo una
co-liberación desde los gránulos de cromafina.
Durante mucho tiempo, se ha sospechado que el
factor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF-2)
era el responsable de al menos algunas de las acciones curativas de
las células de cromafina injertadas en el sistema nigrostriatal
lesionado, dado que el FGF-2 imita los efectos
tróficos de los injertos (Otto y Unsicker, 1990, 1993a). Sin
embargo, el FGF-2 no está situado en los gránulos de
cromafina y no se libera a través de los caminos regulados o
constitutivos de secreción (Bieger y col., 1995; Stachowiak y col.,
1994).
En consecuencia, el problema técnico subyacente a
la presente invención es proporcionar nuevos compuestos capaces de
promover la supervivencia de neuronas DAérgicas (mesencefálicas),
que se puedan usar para el tratamiento de alteraciones del SN
periférico y/o central en el hombre.
Estos compuestos pueden ser la actividad de tipo
EGF de los gránulos de cromafina así como partes funcionales de los
mismos o compuestos químicos que hacen la misma función que son lo
suficientemente pequeños para cruzar la barrera
sangre-cerebro para realizar esa función.
La solución al problema técnico anterior se
consigue por las formas de realización caracterizadas en las
reivindicaciones.
En particular, la presente invención se refiere a
la proteína derivada de los gránulos de cromafina que media
selectivamente la actividad promotora de la supervivencia sobre las
neuronas DAérgicas. El término "proteína derivada de gránulos de
cromafina" se refiere a proteínas únicas definidas que, cuando se
aplican únicamente o en combinaciones ejercen efectos tróficos,
promotores de la supervivencia y diferenciación sobre las neuronas
DAérgicas. La expresión "actividad promotora de la supervivencia
selectiva sobre neuronas DAérgicas" se refiere a la actividad
proteínica que puede conferir, por sí mismo o en combinación con
otros factores presentes en los gránulos de cromafina, la
supervivencia y diferenciación en las neuronas DAérgicas dentro del
intervalo nanomolar o por debajo.
La proteína derivada de gránulos de cromafina de
la presente invención es un ligando del receptor del factor de
crecimiento epidérmico (EGFR); es decir, la proteína derivada de
gránulos de cromafina presenta efectos dentro de un intervalo
nanomolar de concentraciones.
La proteína derivada de gránulos de cromafina de
la presente invención es capaz de promover la maduración celular
astroglial. La expresión "capaz de la maduración celular
astroglial" quiere decir que dentro de un sistema de cultivo de
células mesencefálicas embriónicas, la proteína aumenta el número de
células astrogliales visualizadas por la expresión de proteínas que
son específicas para este tipo celular.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la proteína derivada de gránulos de cromafina es
capaz de inducir la proliferación de células no DAérgicas, que se
supone que son células progenitoras gliales. La expresión "capaz
de la proliferación de células no DAérgicas" quiere decir que el
incremento del número de células progenitoras astrogliales
supuestas es el efecto producido inicialmente por la "proteína
derivada de gránulos de cromafina". Se supone que este efecto
inicial es el prerrequisito para la promoción de la supervivencia
por un factor secretado por el número incrementado de células
astrogliales.
Un objeto adicional de la presente invención se
refiere a un procedimiento para la preparación de la proteína
derivada de gránulos de cromafina definida anteriormente, que
comprende las etapas de aislar gránulos de cromafina de células de
cromafina y extraer el contenido de proteína soluble en agua que
contiene la proteína derivada de gránulos de cromafina, de los
gránulos de cromafina en una solución tampón. La expresión "aislar
gránulos de cromafina de células de cromafina" comprende el
fraccionamiento subcelular de los organelos celulares de cromafina
por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa 1,7 M. La
expresión "extraer el contenido de proteína soluble en agua que
contiene la proteína derivada de gránulos de cromafina"
comprende la lisis de los organelos obtenidos como el sedimento de
la centrifugación de sacarosa 1,7 M en un tampón fosfato 10 mM a pH
7,0 siguiendo veinte minutos de congelación a -80ºC.
Un objeto adicional de la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína
derivada de gránulos de cromafina definida anteriormente,
opcionalmente en asociación con un vehículo y/o diluyente
farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica se puede
usar para el tratamiento de alteraciones del SN periférico y/o
central en el hombre como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad
de Alzheimer u otras demencias, otras alteraciones
neurodegenerativas del sistema nervioso central y neuropatías
periféricas que incluyen diabetes, neuropatía de cisplatino u otras
enfermedades nerviosas periféricas genéticas o adquiridas.
Un objeto adicional de la presente invención
comprende la aplicación del factor anterior derivado de gránulos de
cromafina conjuntamente con moléculas neurotróficas encontradas
previamente, como neurotrofinas, miembros del
TGF-\beta, el factor de crecimiento de
fibroblasto, y superfamilias de citoquinas neuropoyéticas.
Las figuras muestran:
Figura 1. Micrográficas electrónicas de
preparaciones representativas de gránulos de cromafina bovinos. Bar
= 1 \muM.
Figura 2. Fotomicrográficas de cultivos
disociados de células mesencefálicas ventrales de rata E14 después
de 8 días en cultivo teñido con anticuerpos monoclonales contra TH.
Los cultivos eran cultivos control y cultivos tratados con la
proteína derivada de gránulos de cromafina (VP) a una dilución de
1:20, FGF-2 (10 ng/ml), o
TGF-\alpha (20 ng/ml). Bar = 25 \muM.
Figura 3. El efecto promotor de la supervivencia
de la actividad derivada de gránulos de cromafina se debe a una
proteína. Los cultivos se trataron durante 7 días, comenzando 24
después del sembrado, con la proteína derivada de gránulos de
cromafina (VP) a una dilución de 1:20. Los cultivos gemelos se
trataron con cantidades idénticas de proteína derivada de gránulos
de cromafina inactivada por calor (VP calor), o proteína derivada de
gránulos de cromafina digerida con tripsina (VP tripsina). Cada
barra representa el número medio de células
TH-positivas contadas en +/-MEB de cultivos
triplicados de dos experimentos. Las diferencias entre grupos se
consideraron significativas a ***P<0,001.
Figura 4. Bajo estimulación colinérgica, las
células de cromafina bovinas liberan la actividad promotora de la
supervivencia para las neuronas DAérgicas en el medio. Los cultivos
establecidos de células mesencefálicas ventrales de rata E14 se
trataron durante 7 días, empezando 24 después del sembrado, con
medio condicionado de células de cromafina estimuladas con
carbachol, o medio condicionado de células de cromafina no
estimuladas sin carbachol (control), o medio de cultivo que contiene
carbachol (10^{-5} M). Cada barra representa el número medio de
células TH-positivas contadas en +/-MEB de cultivos
cuadriplicados de dos experimentos. *P<0,05.
Figura 5. Curva de respuesta a dosis de la
actividad derivada de gránulos de cromafina (VP) en la supervivencia
de neuronas TH-inmunoreactivas de cultivos
mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días.
Los cultivos se trataron con VP a diluciones de 1:10, 1:20, 1:50 y
1:200, o con FGF-2 (10 ng/ml). Los resultados son la
+/-MEB media de determinaciones triplicadas, de dos experimentos
reproducidos. *P<0,05, ***P<0,001.
Figura 6. El efecto promotor de la supervivencia
de la actividad derivada de gránulos de cromafina no se debe a la
encefalina o al neuropéptido Y. Los cultivos se trataron durante 7
días, empezando 24 después del sembrado, con
Leu-encefalina (Leu-ENK),
Met-encefalina (Met-ENK),
neuropéptido Y (NPY) a 100 ng/ml o con proteína derivada de gránulos
de cromafina (VP) a una dilución de 1:20. Cada barra representa el
número medio de células TH-positivas contadas en
+/-MEB de cultivos triplicados de dos experimentos.
Figura 7. Se muestran la captación de
^{3}H-DA, ^{3}H-GABA, y
^{3}H-serotonina (A) y la supervivencia de las
neuronas inmunoreactivas con serotonina (B) para cultivos
mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días.
Se documenta el efecto de la proteína derivada de gránulos de
cromafina (VP) a una dilución de 1:20. Los controles de estudios de
captación se fijaron al 100 por ciento. Los resultados son la +/-MEB
media de determinaciones triplicadas, de dos experimentos.
*P<0,05, **P<0,01.
Figura 8. Fotomicrográficas de cultivos
disociados de base de cerebro medio ventral de rata E14 después de 8
días en cultivo. Los paneles superiores muestran el teñido con
anticuerpo monoclonal contra GFAP; los paneles de en medio muestran
la visualización de la incorporación de BrdU usando anticuerpos
monoclonales contra BrdU. Los paneles inferiores muestran el teñido
nuclear usando yoduro de propidio (izquierda) y (derecha) doble
marcado para TH (rojo) y BrdU (verde). Los cultivos mostrados en la
parte a mano izquierda representan los cultivos control; los paneles
en la parte a mano derecha son cultivos tratados con VP a una
dilución de 1:10. Bar = 25 \mum.
Figura 9. Números de las neuronas
TH-inmunoreactivas supervivientes de cultivos
mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días.
Se usaron el agente antimitótico FOUR y la gliotoxina AA a una
concentración de 30 \mum cada uno en los cultivos control, o en
los cultivos tratados con VP a una dilución de 1:50. Los resultados
son la +/-MEB media de determinaciones triplicadas, de dos
experimentos.
Figura 10. Números de neuronas
TH-inmunoreactivas supervivientes de los cultivos
mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días.
Los cultivos se trataron o con proteína derivada de gránulos de
cromafina a una dilución de 1:20 de
DIV1-DIV8(VP), o de DIV1-DIV4
seguido por tratamiento con medio de cultivo solamente
(VP/DIV1-4), o tratamiento con medio condicionado
con VP (VP-CM). Los resultados son la +/-MEB media
de determinaciones triplicadas, de dos experimentos. **P<0,01,
***P<0,001.
Figura 11. El efecto de promoción de la
supervivencia de la proteína derivada de gránulos de cromafina (VP)
sobre neuronas DAérgicas se puede suprimir usando DAPH, un inhibidor
de la ruta de señalización del EGFR. Los cultivos derivados del
mesencéfalo ventral de rata E14 se trataron con VP a una dilución de
1:50 en ausencia o presencia, respectivamente, de 10 \muM de DAPH.
Los cultivos no tratados sirvieron como controles. A DIV 6 los
cultivos se fijaron y se procesaron para la reactividad GFAP o TH.
Los números de células TH positivas (barras abiertas) se dan como la
+/-MEB media de determinaciones triplicadas de dos experimentos
reproducidos, y los números de células GFAP positivas se dan como la
media de dos determinaciones de dos experimentos reproducidos.
Figura 12. La aparición de células astrogliales
GFAP positivas inducidas por la proteína derivada de gránulos de
cromafina, o TGF-\alpha, pero no
FGF-2 se puede inhibir por DAPH, un inhibidor de la
ruta de señalización del EGFR. Los cultivos derivados del
mesencéfalo ventral de rata E14 se trataron con VP a una dilución de
1:50, FGF-2 a 10 ng/ml o
TGF-\alpha a 20 ng/ml en ausencia (paneles de la
izquierda) o presencia, respectivamente, de 10 \muM de DAPH o
Tirfostina B56 (paneles de la derecha). A DIV 6 los cultivos se
fijaron y se procesaron para inmunoreactividad TH (panel superior) o
GFAP, seguido por visualización DAB. Bar = 25 \mum.
Figura 13. Expresión de GDNF en cultivos
celulares mesencefálicos (DIV 8) detectada por
RT-PCR. Los carriles - representan los controles, en
los que el ARN total no se transcribió, los carriles + representan
el ADNc. Se obtiene una señal positiva para GDNF (700 pb) de células
de glioma B49, pero no de cultivos celulares mesencefálicos tratados
con VP o no tratados.
Figura 14. La proteína derivada de gránulos de
cromafina protege contra la toxicidad de MPP+. Se muestran los
porcentajes de neuronas supervivientes TH + después del tratamiento
con MPP+ (1 \muM), o MPP+ en combinación con VP 1:20. Los
controles se fijaron como 100%. Los resultados son la +/-MEB media
de determinaciones triplicadas, de dos experimentos reproducidos.
*P<0,05.
Figura 15. Cromatograma de la purificación de la
proteína de los gránulos de cromafina en Heparin Sefarosa.
Figura 16. Números de neuronas
TH-inmunoreactivas supervivientes de cultivos
mesencefálicos (E14) al final del periodo de cultivo de ocho días,
usando las fracciones de proteína después de la cromatografía de
Heparin Sefarosa.
Figura 17. Cromatograma de la purificación de la
proteína de los gránulos de cromafina usando
RP-HPLC.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención:
Medio de cultivo, factores de crecimiento y
productos químicos. El medio libre de suero usado consistió en
medio Eagle modificado con Dulbecco y Ham F-12
(DMEM/F-12, BioWhittaker), incluyendo los
complementos N1 (Bottenstein y col., 1980) apotransferrina,
insulina, L-tiroxina, selenito sódico y progesterona
(Sigma, Deideshofen, Alemania), y glutamina 2,5 mM (GIBCO,
Eggenstein, Alemania), 2,5 mg/ml de albúmina de suero bovino
(sigma), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, y
fungizona 0,25 \mug/ml (BioWhittaker, Heidelberg, Alemania). La
solución de sal equilibrada de Hank libre de calcio y magnesio
(CMF), el suero de caballo, la tripsina, la
5-fluorodesoxiuridina (FDUR), y el ácido
\alpha-aminoadípico (AA) eran de Sigma, la ADNasa
era de Boehringer. La 4,5-dianilinoftalamida (DAPH)
y la Tirfostina B56 (Calbiochem, Bad Soden, Alemania) se
disolvieron en DMSO para dar una concentración final de 1 mM y se
almacenaron en alícuotas a -20ºC.
Se usó un tubo de diálisis Spectrapor (Roth,
Karlsruhe, Alemania) con un PM de corte de 3.500. Factores de
crecimiento: rh FGF-2, rh
TGF-\alpha, rh EGF (IC Chemikallen, Ismaningen,
Alemania). Los factores de crecimiento liofilizados se
resuspendieron en DMEM que contenía BSA 0,25% y penicilina,
estreptomicina, y fungizona en la concentración dada, para dar una
concentración final de 1 \mug/ml. Se conservaron alícuotas de 100
\mul a -70ºC hasta que se usaron.
Aislamiento del contenido soluble de los
gránulos de cromafina. Los procedimientos de aislamiento siguen
esencialmente el protocolo de Winkler y Smith (1975). Brevemente,
se diseccionaron aprox. 60 adrenales bovinas obtenidas de la casa
slughter, Manheim, Alemania, se juntaron de la médula en sacarosa
0,3 M, tampón fosfato 10 mM, pH 7,0, se homogeneizaron, se
centrifugaron durante 15 min a 380 g, seguido por centrifugación
del sobrenadante a 8.720 g durante 20 min. Se sabe que el sedimento
contiene todos los organelos, que pueden entonces fraccionarse
adicionalmente por gradientes de sacarosa. Para purificar grandes
vesículas de núcleo denso, los gránulos de cromafina, el sedimento
resuspendido (0,3 M sacarosa, fosfato 10 mM, pH 7,0) se cargó en un
colchón de sacarosa 1,7 M. Los gránulos de cromafina se obtuvieron
como un sedimento después de la centrifugación a 100.000 g durante
90 min. El sedimento se resuspendió en fosfato 10 mM pH 7,0, se
congeló en nitrógeno líquido y se descongeló posteriormente, para
lisar las vesículas y extraer el contenido de proteína soluble. Se
recogieron fragmentos de membrana por centrifugación a 100.000 g
durante 30 min. El sobrenadante que contenía la mezcla de proteína
soluble de los gránulos de cromafina se dializó (PM de corte 3.500)
durante la noche contra varios lotes de exceso de 100 veces de
tampón fosfato 10 mM pH 7,0 para separar las catecolaminas y otros
componentes de bajo peso molecular de las proteínas. Para
cuantificar la concentración de proteína se empleó el ensayo de
proteína de Bradford (Bio-Rad) usando
gammaglobulina bovina como patrón (Bio-Rad). La
solución de proteína se diluyó para dar una concentración de
proteína final de 20 mg/ml. Esta solución de proteína después se
filtró estéril (0,22 \muM) y se almacenó en alícuotas a -70ºC.
Para cromatografía en Heparin-Sefarosa
(Econo-Pac Cartucho de Heparina, 5 ml
Bio-Rad) los gránulos purificados se cargaron en
NaCl 100 mM, Tris 10 mM, Chaps 0,1% a pH 7,3. Después del lavado con
el mismo tampón, la proteína se eluyó usando un gradiente desde
NaCl 100 mM hasta NaCl 1 M en Tris 10 mM, Chaps 0,1% a pH 7,3. Las
fracciones recogidas se desalaron por cromatografía en fase inversa
(RP-HPLC) en columnas de Aquapore
RP-300, 7 micrómetros, Applied Biosystems, usando
tampón de separación A (TFA 0,1%) y tampón de separación B (TFA
0,1%/Acetonitrilo 90%). Para la determinación de la actividad
biológica, las muestras liofilizadas se resuspendieron en 20 \mul
de Acetonitrilo 50% y se añadieron al medio a 5 \mul por 2 ml de
Medio a cada cambio de medio. La inactivación por calor se consiguió
calentando una muestra de proteína tres veces a 90ºC durante 30
seg. Se digirió una alícuota con tripsina 0,1% a 37ºC durante 1
hora. La digestión se terminó añadiendo 100 \mug de inhibidor de
tripsina de soja disueltos en 50 \mul PBS.
Microscopía electrónica. Los gránulos de
cromafina aislados se sedimentaron y se fijaron con formaldehído
1,5% y glutaraldehido 1,5% en tampón fosfato (pH 7,4) seguido por
tetróxido de osmio 1% en hexacianoferrato-II de
potasio 1,5%. Después de la tinción de bloqueo en acetato de
uranilo acuoso 1% y deshidratación en etanol, los sedimentos se
fijaron en Epon, se seccionaron en un ultratomo LKB III y se vieron
en un microscopio electrónico Zeiss EM10.
Cultivo de tejido. Los cultivos celulares
mesencefálicos se establecieron esencialmente como describe
Kriegstein y Unsicker (1994). En resumen, la base del cerebro medio
ventral de fetos de rata Wistar del día embriónico (E) 14 de dos
camadas (20-25 embriones) se diseccionó y se recogió
en CMF. Las piezas de tejido se disociaron enzimáticamente usando
tripsina 0,25% (BioWhittaker) en CMF durante 15 min a 37ºC. Después
de la adición de un volumen igual de suero de caballo enfriado en
hielo y 1mg ADNasa, las células se trituraron con pipetas pasteur
pulidas al fuego y siliconizadas y posteriormente se lavaron con
DMEM/F12. La suspensión celular única (100 \mul) se sembró en
cubreobjetos de vidrio recubiertos de poliornitina (0,1 mg/ml en
tampón borato 15 mM, pH 8,4, Sigma)-laminina (5
\mug/ml; Sigma) a una densidad de 200.000 células/cm^{2}. Los
cubreobjetos se incubaron en una atmósfera humidificada de CO_{2}
5%/aire 95% para permitir que las células se pegaran. Después de dos
horas los cubreobjetos se transfirieron a placas de 24 pocillos
(Falcon) que contenían 750 \mul de medio. Al día siguiente, y
posteriormente cada tres días, se reemplazaron 500 \mul del medio
y al mismo tiempo se añadieron los factores neurotróficos a las
concentraciones dadas.
Las células de cromafina bovina se aislaron por
perfusión y digestión de colagenasa como se describe previamente y
se enriquecieron hasta >95% de pureza empleando centrifugación en
gradiente Percoll (Unsicker y col., 1980; Bieger y col., 1995). Las
células de cromafina se sembraron a 200.000 células/cm^{2} en
matraces de cultivo de plástico (Falcon; 5x10^{6} células por 25
cm^{2}) y se mantuvieron en 5 ml de DMEM con complementos de N1
durante 40 h. Después del lavado de las células con medio
precalentado, las células se expusieron a 2 ml DMEM/N1 que contenía
el agonista colinérgico carbachol (10^{-5} M) durante 15 min,
mientras que los cultivos control se trataron de forma idéntica,
pero sin secretagoga (véase. Lachmund y col., 1994). El medio
condicionado de células estimuladas y no estimuladas se almacenó en
alícuotas a -80ºC para evitar el congelado y descongelado repetidos
y se aplicó a dilución 1:4 a cultivos de neuronas DAérgicas
mesencefálicas.
Inmunocitoquímica. Para identificar las
neuronas DAérgicas o serotonérgicas, las células se visualizaron
usando anticuerpos contra tirosina hidroxilasa (TH), o serotonina,
respectivamente. Las células se fijaron con paraformaldehido 4%
tamponado en fosfato tamponado salino (PBS) durante 10 min a
temperatura ambiente, se permeabilizaron con acetona a -20ºC durante
10 min y se lavaron con (PBS). Después del bloqueo con
H_{2}O_{2} 1% en PBS, seguido por suero de caballo 1%, los
cubreobjetos se tiñeron con un anticuerpo monoclonal contra TH de
rata (1:200; Boehringer Mannheim, diluido en suero de caballo 1%) o
con un anticuerpo contra serotonina (1:50; DAKO) durante 1 h a 37ºC.
El teñido específico se visualizó usando el kit
anti-ratón Vectastain ABC en combinación con DAB
(Camon, Alemania).Para la inmunocitoquímica de la proteína acídica
fibrilar glial (GFAP), las células se fijaron y permeabilizaron
usando acetona a -20ºC durante 20 min, después se lavaron con PBS y
se incubaron con un anticuerpo monoclonal contra GFAP (1:100;
Sigma) durante 1 h a 37ºC. Se usó TRITC anti-Ig de
ratón como anticuerpo secundario. Para controlar la proliferación
celular se añadió bromodesoxiuridina (BrdU) al cultivo, 24 horas
antes de la fijación, a una concentración final de 10 \muM. Las
células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con etanol 70%
tamponado con glicina 50 mM, pH 2,0, durante 20 min a -20ºC. La
BrdU incorporada se identificó usando el kit de detección
anti-BrdU I (Boehringer, Mannheim). La detección
doble de BrdU/TH se consiguió aplicando primero el protocolo para
BrdU seguido después de otros cinco lavados con PBS y por el
procedimiento para teñido de TH usando TRICT anti- Ig de ratón como
anticuerpo secundario. Los núcleos se tiñeron con yoduro de
propidio (20 s, 0,1 \mug/ml). Los cubreobjetos se fijaron usando
Aquatex (Merck, Darmstadt).
Estudios de captación de transmisores. La
captación de alta afinidad de ^{3}H-DA,
^{3}H-GABA y ^{3}H-serotonina
(Amersham) se determinó según un procedimiento modificado descrito
por Alexi y Hefti (1993). Las células se lavaron tres veces con la
solución de incubación (glucosa 5 mM y ácido ascórbico 1 mM en PBS,
pH 7,4), se preincubaron durante 15 min a 37ºC con 0,5 ml de
solución de incubación, antes de añadir
^{3}H-GABA o ^{3}H-serotonina 50
nM durante un periodo adicional de 15 min. Se obtuvieron blancos
incubando las células a 4ºC. La captación se paró retirando la
mezcla de incubación, seguido por tres lavados rápidos con PBS
enfriado en hielo. Después se añadieron 300 \mul de agua
destilada, los cultivos se congelaron durante 2 h a -80ºC, se
descongelaron, y las células se rasparon dos veces con un volumen
adicional de 200 \mul de agua destilada. La radiactividad extraída
se midió por espectrometría de centelleo líquido después de la
adición de 10 ml de cóctel de centelleo a cada vial.
Tratamiento de cultivos con MPP+,
5-fluorodesoxiuridina, y ácido
\alpha-aminoadípico. El día 4 se añadió el ión
de
N-metil-4-fenilpiridinio
(MPP+; RBI) a los cultivos celulares mesencefálicos a una
concentración final de 1 \muM durante un periodo de 48 h. La
toxina se reemplazó después por medio de cultivo fresco durante un
periodo final de 48 h. El tratamiento con la proteína de los
gránulos de cromafina comenzó 24 h antes de la adición de la toxina
y duró hasta el final del experimento (día 8).
Se añadieron
5-fluorodesoxiuridina (FDUR, Sigma), o ácido
\alpha-aminoadípico (AA, Sigma) a los cultivos a
concentraciones finales de 30 \muM conjuntamente con cada cambio
de medio (O'Malley y col., 1994).
Evaluación de los números de células. La
supervivencia de células DAérgicas se evaluó contando todas las
neuronas TH-positivas en una franja diagonal del
cubreobjetos usando la ampliación de 100 veces. Esta área
correspondió al 12% del área total. La cuantificación se hizo por
triplicado y en al menos dos experimentos independientes. El número
de células GFAP-positivas se calculó de la misma
forma.
RT-PCR. A DIV 8 de la
proteína de los gránulos de cromafina tratada o no tratada, se aisló
el ARN total de los cultivos celulares mesencefálicos por
extracción con tiocianato de guanidinio ácido/fenol/cloroformo desde
10 pocillos y se juntó (correspondiente a 2x10^{6} células). El
ADNc se sintetizó en un volumen final de 20 \mul con los
siguientes componentes: 2,5 \mug del ARN total,
Tris-HCl 50 mM (8,3), KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM,
ditiotreitol 10 mM, dNTPs 5 mM, cebador oligo(dT) 25 mM
(Gibco), 20 unidades de inhibidor de ARNasa (Boehringer) y 200
unidades de transcriptasa inversa Superscript RNAasa
H^{-}(Gibco). La mezcla se incubó a 37ºC durante 60 min.
La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 25 \mul que
contenían ADNc (hecho de 625 ng de ARN total),
Tris-HCl 10 mM (pH 8,8), KCl 10 mM, MgCl_{2} 2,5
mM, Tween 20 0,002%, dNTPs 0,2 mM, cebadores 5' 1 \muM, cebadores
3' 1 \muM, 1,5 unidades de ADN polimerasa UITma (Perkin Elmer)
usando la técnica de inicio caliente según instrucciones de los
fabricantes, en un sistema de PCR Perkin Elmer GeneAmp 9600. Las
etapas de amplificación implicaron la desnaturalización a 94ºC
durante 1 min, alineamiento durante 2 min a 60ºC con cebadores de
GDNF, y extensión a 72ºC durante 3 min. Las muestras (5 \mul) de
las mezclas de PCR se analizaron por electroforesis en geles de
agarosa al 2% en presencia de bromuro de etidio. Los cebadores de
GDNF se usaron como describe Schaar y col. (1993), y el tamaño
esperado del producto de la PCR fue 700 pares de bases. El ARN
aislado de células B49, la línea celular glial de la que se aisló
originalmente el GDNF (Lin y col., 1993), se usó como control
positivo para la amplificación de GDNF.
Estadísticas. Los datos se analizaron por
un ANOVA de un sentido, y el significado de las diferencias
intergrupo se determinó aplicando un test Student. Las diferencias
se consideraron significativas a **P<0,05, **P<0,01,
***P<0,001.
Se prepararon gránulos de cromafina bovina
siguiendo esencialmente un protocolo de Winkler y Smith (1975). El
sedimento obtenido que representaba la fracción granular se analizó
por microscopía electrónica para detectar contaminaciones con otros
organelos. En la Fig. 1 se muestra una micrográfica representativa
de una preparación de gránulos de cromafina. El análisis de
microscopio electrónico reveló que estas preparaciones están
compuestas esencialmente por gránulos de núcleo de gran densidad,
identificados por su densidad y tamaño de aproximadamente 280 nm.
Los gránulos se rompieron usando un tampón salino bajo, para fluir
solo proteínas solubles, que no están unidas a la membrana. Se usó
diálisis extensiva para diluir catecolaminas y otros componentes
pequeños, lo que dio como resultado una mezcla de proteínas
analizada cuidadosamente por Winkler y col. (1986). Los
constituyentes de proteínas destacados de los gránulos de cromafina
son las cromograninas A y B, las encefalinas, el neuropéptido Y, y
la dopamina-\beta-hidroxilasa (no
mostrados).
Para evaluar los posibles efectos promotores de
la supervivencia sobre las neuronas DAérgicas de la proteína de los
gránulos de cromafina, los cultivos se trataron con esta mezcla a
una dilución de 1:20, empezando el tratamiento el día 1 in
vitro (DIV 1). La Fig. 2 muestra que la proteína de los gránulos
de cromafina mantiene claramente más neuronas
TH-positivas en comparación con los cultivos control
después de ocho días en cultivo. Este efecto era comparable al
visto tratando los cultivos con una concentración saturante de
FGF-2 (10 ng/ml) o TGF-\alpha (20
ng/ml).
Para verificar que este efecto promotor de la
supervivencia es de hecho debido a un componente proteínico, la
muestra de proteína se incubó con calor y tripsina. Cualquiera de
los dos procedimientos suprimió la actividad promotora de la
supervivencia (Fig. 3), indicando que la actividad neurotrófica
aislada de los gránulos de cromafina es una proteína.
Para proporcionar pruebas de que la actividad
DAérgica se almacenaba y se liberaba de los gránulos de cromafina,
se aplicó medio condicionado por células de cromafina bovina a
cultivos de neuronas DAérgicas mesencefálicas E14. El medio
condicionado de células estimuladas con el agonista colinérgico
carbachol (10^{-5} M) aumentó la supervivencia de las neuronas
TH-positivas hasta 141,9 +/- 13,5% (n = 4; Fig. 4)
de los valores control (medio condicionado de células no
estimuladas) a DIV 8. El medio de cultivo que contenía carbachol
fue ineficaz (Fig. 4). Así, los gránulos de cromafina almacenan y
liberan una actividad neurotrófica que mantiene las neuronas
DAérgicas del cerebro medio.
La cuantificación del efecto neurotrófico de la
proteína de los gránulos de cromafina mostró los mayores efectos
promotores de la supervivencia a una dilución 1:20, y no pudo
aumentarse adicionalmente usando una dilución 1:10. La CI_{50} se
alcanzó a una dilución de 1:50 (Fig. 5).
Para investigar si los componentes destacados de
los gránulos de cromafina que se sabe que tienen algunas actividades
tróficas (Unsicker y Stögbauer, 1992), pueden imitar los efectos
observados, se analizó la capacidad del neuropéptido Y, Leu- y
Met-encefalina para promover la supervivencia de las
neuronas DAérgicas del cerebro medio. Sin embargo, ninguno de estos
neuropéptidos tuvo ninguna actividad promotora de la supervivencia
usando concentraciones hasta 100 ng/ml (Fig. 6).
Las neuronas DAérgicas son el
5-10% de la población de neuronas en el sistema de
cultivo celular empleado así como en el mesencéfalo in vivo.
Las neuronas no DAérgicas son principalmente GABAérgicas, pero hay
también unas pocas neuronas serotonérgicas. Para analizar la
selectividad del efecto promotor de la supervivencia de la proteína
de los gránulos de cromafina, se investigó su efecto sobre la
captación de DA, GABA y serotonina, siguiendo un protocolo
establecido que se usó para probar la selectividad de GDNF para
neuronas DAérgicas (Lin y col., 1993). Como se muestra en la Fig.
7a, la captación de ^{3}H-DA y
^{3}H-serotonina, pero no la captación de
^{3}H-GABA se influenciaron por el tratamiento de
los cultivos con la proteína de los gránulos de cromafina. El
aumento en la captación de serotonina no era debido al efecto
promotor de la supervivencia de la proteína de los gránulos de
cromafina, dado que el número de neuronas
serotonina-positivas no se alteró significativamente
(Fig. 7b).
Las moléculas que se ha informado que mantienen
la supervivencia de las neuronas DAérgicas cultivadas parecen
clasificarse en dos grupos. Una categoría ejerce sus efectos
incrementando el número de células astrogliales, el otro grupo actúa
aparentemente de una forma más directa sobre las neuronas DAérgicas
(Unsicker y col., 1996). Para definir el mecanismo de la
supervivencia de las neuronas DAérgicas mediada por la proteína de
los gránulos de cromafina se estudiaron la proliferación celular y
la diferenciación celular glial. Primero, se analizó la presencia de
células astrogliales al final del periodo de cultivo usando un
anticuerpo monoclonal para GFAP. Muy pocas células astrogliales, si
es que alguna, eran detectables en los cultivos control no tratados
a DIV8 (Fig. 8). Los cultivos tratados con la proteína de los
gránulos de cromafina mostraron un aumento dramático en células
GFAP-positivas (Fig. 8). Para controlar la
proliferación celular, se administró BrdU a los cultivos, se dejó
que se incorporara durante la fase S del ciclo celular, y se detectó
usando un anticuerpo monoclonal contra BrdU. Los cultivos control
mostraron la incorporación de BrdU en los núcleos de muy pocas
células, mientras que los cultivos tratados con la proteína de los
gránulos de cromafina mostraron abundantes núcleos marcados (Fig.
8). El doble marcado con anticuerpos contra BrdU y TH mostró que
las células TH^{+} nunca incorporaban BrdU (Fig. 8). Estos datos
indican que la actividad de los gránulos de cromafina es mitogénica
para glioblastos (posiblemente también para otras células presentes
en los cultivos) e induce la maduración de los glioblastos para que
se conviertan en células astrogliales
GFAP-positivas.
Se ha demostrado previamente que el tratamiento
con el agente antimitótico 5-fluorodesoxiuridina
(FDUR), y el ácido aminoadípico de gliotoxina (AA) a concentraciones
de 30 \muM inhibe eficazmente la proliferación celular y la
maduración celular astroglial usando un sistema de cultivo celular
similar (O'Malley y col., 1994). El tratamiento antimitótico se usó
para bloquear la proliferación y posiblemente suprimir el efecto
promotor de la supervivencia de la actividad derivada de los
gránulos de cromafina. Se usaron concentraciones de la mitad del
máximo de la proteína de los gránulos de cromafina (1:50) en
combinación con FDUR, o AA 30 \muM, respectivamente. El
tratamiento comenzó el DIV1, y los cultivos se procesaron el DIV8
para inmunocitoquímicas TH y GFAP. Como se muestra en la Fig. 9,
ambos tratamientos suprimieron el efecto promotor de la
supervivencia de la proteína de los gránulos de cromafina sin
afectar la supervivencia basal, descartando efectos secundarios
tóxicos. Estos datos muestran claramente que el efecto promotor de
la supervivencia de la proteína de los gránulos de cromafina
requiere el incremento numérico de una población celular en este
cultivo, más probablemente glioblastos que maduran posteriormente a
células astrogliales GFAP-positivas.
Los cultivos de neuronas DAérgicas del cerebro
medio se establecieron como normalmente, y el tratamiento con la
proteína de los gránulos de cromafina (1:20) empezó 24 h después del
sembrado, durante un periodo de 72 h (DIV1-DIV4). En
este momento, el medio de cultivo completo se retiró y se reemplazó
por medio libre de suero, que se recogió y se renovó cada 48 h (DIV6
y DIV8). Estos medios (almacenados a 4ºC) se juntaron y se
designaron "medio condicionado con proteína de gránulos de
cromafina (VP-CM)". Los cultivos de neuronas
DAérgicas del cerebro medio establecidos nuevamente se trataron
entonces con VP-CM, empezando el DIV1, con dos
cambios más de medio de cultivo el DIV4 y DIV6, y se procesaron
finalmente para las inmunocitoquímicas de TH y GFAP el DIV8. Como se
muestra en la Fig. 10, tratar los cultivos con la proteína de los
gránulos de cromafina durante un periodo de tres, mejor que de siete
días todavía produjo un efecto promotor de la supervivencia
significativo a DIV8. Lo que es más importante, el medio
condicionado de cultivos tratados con medio condicionado con
gránulos de cromafina (VP-CM) produjo un efecto
promotor de la supervivencia sobre las neuronas DAérgicas
comparable. Este efecto no se acompañó por un aumento en células
astrogliales. Así, la proteína de los gránulos de cromafina, en una
primera etapa, provoca la maduración celular astroglial que conduce
a la producción y/o liberación de un factor neurotrófico, que, en
una segunda etapa, mantiene la supervivencia de las neuronas
DAérgicas.
La Fig. 15 muestra el cromatograma de la
purificación en Heparin Sefarosa. Las fracciones se procesaron para
inmunocitoquímica de TH y GFAP. Como se muestra en la Fig. 16,
después de la purificación en Heparin Sefarosa, las fracciones 4 y 7
produjeron un efecto promotor de la supervivencia significativo.
Además, la fracción 4 fue capaz de inducir la maduración de los
glioblastos para que se conviertan en células astrogliales
GFAP-positivas. Las proteínas contenidas en la
fracción 4 se purificaron adicionalmente usando
RP-HPLC. La Fig. 17 muestra el cromatograma de la
purificación. Las fracciones se procesaron para inmunocitoquímica
de GFAP. Como se muestra en la Tabla 2, las fracciones 7 a 9 fueron
capaces de inducir la maduración de los glioblastos para que se
conviertan en células astrogliales
GFAP-positivas.
\begin{minipage}[t]{150mm} En las Tablas 1 y 2, la indicación + quiere decir que la actividad GFAP es detectable y la indicación - quiere decir que la actividad GFAP no es detectable.\end{minipage}
Se ha demostrado que el FGF-2, el
EGF, y el TGF-\alpha tanto promueven la
supervivencia de las neuronas DAérgicas como aumentan la
proliferación celular en cultivos celulares mesencefálicos (Otto y
Unsicker, 1993b; Engele y Bohn, 1991; Knüsel y col., 1990). En una
serie inicial de experimentos la actividad derivada de los gránulos
de cromafina se analiza bloqueando específicamente su ruta receptora
putativa. Se aplica un inhibidor de proteína
tirosina-quinasa específico con selectividad por la
ruta de transducción de la señal del receptor de EGF (EGFR)
(Buchdunger y col. 1994). Habiendo demostrado por los experimentos
de AA y FDUR que el efecto neurotrófico de la proteína de los
gránulos de cromafina está mediado por astrocitos (véase Fig. 9) se
cribó para la supresión del número de células astrogliales. El
protocolo usado fue como sigue: 24 horas después del sembrado de
células mesencefálicas y después de tres días, la proteína de los
gránulos de cromafina a una concentración de 1:50 se mezcló con
diferentes concentraciones del bloqueador de señalización de EGFR,
DAPH y se administró junto con medio fresco. Después de un total de
seis días, los cultivos se fijaron y se procesaron para
inmunocitoquímica de GFAP. Como se muestra en las Fig. 11 y 12, el
DAPH, a una concentración de 10 \muM inhibió tanto la
supervivencia de las neuronas DAérgicas (Fig. 12, panel superior)
como la aparición de células astrogliales inducida por la actividad
de los gránulos de cromafina. Como se esperaba, la inducción
mediada por FGF-2 de las células astrogliales no
pudo afectarse por este inhibidor (Fig. 12). Cuando los cultivos se
trataron con TGF-\alpha, un ligando de EGFR
fisiológico en el SNC, o EGF (10 ng/ml), solo se pudieron detectar
unas pocas células astrogliales GFAP-positivas
(Fig. 12). Su aparición pudo bloquearse eficazmente por tratamiento
de DAPH (Fig. 12). Estos datos muestran claramente que la aparición
de células astrogliales inducida por la proteína de los gránulos de
cromafina se puede inhibir específicamente por DAPH, un inhibidor
selectivo de la ruta de señalización del EGFR, y que los ligandos
TGF-\alpha y EGF no explican completamente el
efecto mediado por la proteína de los gránulos de cromafina. Se
eligió el inhibidor DAPH, porque se ha demostrado que no afecta a
la transducción de señales de FGF-2 o a la
señalización inducida de PDGF. Sin embargo, el compuesto DAPH
inhibe no solo el EGFR sino también la autofosforilación
p185^{c-erb82} (Buchdunger y col., 1994). Para
probar cual de las dos proteínas quinasas está implicada en los
efectos inducidos de la proteína de los gránulos de cromafina, se
usó Tirfostina B56 que inhibe selectivamente la autofosforilación
de quinasa de EGFR (Gazit y col., 1989). A 10 \muM, la Tirfostina
B56 inhibió con éxito la aparición de células astrogliales inducida
por la proteína de los gránulos de cromafina (Fig. 12). Este
descubrimiento muestra más adelante que la proteína derivada de los
gránulos de cromafina es un ligando de EGFR.
Para definir más a fondo la actividad trófica
inducida por la proteína de los gránulos de cromafina en el cultivo
celular mesencefálico, se llevó a cabo RT-PCR
usando ARN de cultivos mesencefálicos a DIV8, que se habían tratado
con la proteína de los gránulos de cromafina. Como se muestra en la
Fig. 13, el ARNm de GDNF fue claramente detectable en muestras de
ARN de la línea celular gliomal B49, de la que se había aislado y
clonado la proteína (Lin y col., 1993). Por contraste, no se pudo
detectar señal en los cultivos tratados con la proteína de los
gránulos de cromafina lo que indica que es improbable que el GDNF
sea un factor dopaminotrófico inducido por la proteína de los
gránulos de cromafina.
La degeneración de las neuronas DAérgicas y sus
terminales en el sistema nigrostriatal inducida por MPTP- y MPP+ se
parece a la que se ve en la enfermedad de Parkinson (Kopin y
Markey, 1988). Para evaluar si la proteína de los gránulos de
cromafina tenía la capacidad para proteger las neuronas DAérgicas
mesencefálicas de la muerte inducida por MPP+, se añadió MPP+ (1
\muM) a cultivos celulares mesencefálicos a DIV4, 24 horas
posteriores a tratarlos con VP (1:20). El recuento de las neuronas
DAérgicas supervivientes a DIV8 indicó que el tratamiento con VP
protegía significativamente contra la toxicidad de MPP+ (Fig.
14).
La proteína aislada y liberable de los gránulos
de cromafina promueve la supervivencia de las neuronas DAérgicas
mesencefálicas in vitro y las protege de la toxicidad de
MPP+. El efecto neurotrófico se consigue en dos etapas. Primero, la
proteína de los gránulos de cromafina provoca la proliferación
celular y la maduración celular astroglial que implica un ligando
de EGFR. Segundo, un factor derivado de las células de glía
distinto de GDNF promueve la supervivencia de las neuronas
DAérgicas mesencefálicas.
En particular, los constituyentes de la proteína
del contenido soluble de los gránulos de cromafina bovina
desencadenan mecanismos que conducen a la supervivencia potenciada
de las neuronas DAérgicas cultivadas de la base del cerebro medio
de rata embriónica. Así, las células de cromafina injertadas en el
sistema nigrostriatal lesionado ejercen sus funciones beneficiosas a
través de secretar molécula(s) activa(s)
biológicamente distintas a las aminas biogénicas. Se sabe que las
células de cromafina sintetizan, almacenan y liberan
factor(es) neurotrófico(s) a través de la ruta
exocitótica (Lachmund y col., 1994; Unsicker, 1993). No se ha
establecido todavía ni su número ni su identidad molecular. El
FGF-2, la molécula del factor de crecimiento
probablemente más intensivamente estudiado en las células de
cromafina (Stachowiak y col., 1994; Bieger y col., 1995) y factor
trófico potente para neuronas DAérgicas en desarrollo y debilitadas
tóxicamente in vitro e in vivo (Ferrari y col., 1989;
Otto y Unsicker, 1990; 1993a, b), no se libera de los gránulos
(Stachowiak y col., 1994; Bieger y col., 1995). En consecuencia, el
FGF-2 no debe considerarse como un candidato para
factores de la presente invención. Los injertos de cromafina en el
cerebro reciben conexiones sinápticas funcionales de novo
(Jousselin-Hosaja y col., 1994; Ortega y col.,
1992). Además, se ha demostrado que las células de cromafina
injertadas liberan sus contenidos granulares por exocitosis (Ortega
y col., 1992). Se informó que la actividad exocítica era más
frecuente en injertos en el estriatum en comparación con otros
sitios de injertos en el cerebro. Es probable por lo tanto que las
catecolaminas incluyendo DA y la(s) molécula(s) que
produce(n) el efecto trófico fueran liberadas y pudieran
ejercer sus acciones cerca del sitio del injerto
simultáneamente.
Referente al mecanismo de acción del efecto
promotor de la supervivencia derivado de los gránulos de cromafina
sobre las neuronas DAérgicas embriónicas, podrían estar implicadas
dos etapas, (i) la inducción de la proliferación celular y la
maduración de una población creciente de células astrogliales
GFAP-positivas, y la (ii) estimulación de la
producción y/o liberación de un factor dopaminotrófico de las
células gliales. Por lo tanto, la proteína derivada de los gránulos
de cromafina según la presente invención es un factor de maduración
glial y mitogénico. Puede, sin embargo, actuar adicionalmente a
través de neuronas no DAérgicas. Varios factores de crecimiento
mitogénicos, como el FGF-2, el EGF, y el
TGF-\alpha (Knusel y col., 1990; Casper y col.,
1991; Engele y Bohn, 1991; Alexi y Hefti, 1993) tienen efectos
tróficos sobre neuronas DAérgicas mesencefálicas que están
acompañados por un aumento en los números celulares, que incluyen
las células astrogliales. Las células de cromafina pueden
sintetizar FGF-2.
La inhibición de la superfamilia de EGFR bloquea
tanto el aumento en las células astrogliales como el efecto promotor
de la supervivencia. Se ha demostrado que el DAPH, el inhibidor de
EGFR empleado, inhibe la proteína tirosina-quinasa
de EGFR in vitro con alta selectividad y también tiene
actividad antitumor potente in vivo (Buchdunger y col.,
1994). Por lo tanto, que el factor de los gránulos de cromafina es
un ligando para el EGFR. Dado que el EGF y el
TGF-\alpha no imitan el efecto del factor
granular sobre la maduración in vivo y la proliferación de
los progenitores astrogliales mesencefálicos, cabe la posibilidad
de que otro ligando de EGFR se almacene en las células de
cromafina. Hay una amplia lista de ligandos de EGFR que comprende,
además del EGF y el TGF-\alpha, la anfiregulina
(Shoyab y col., 1988, 1989), el EGF de unión a heparina
(Higashiyama y col., 1991), la betacelulina (Sasada y col., 1993;
Shing y col., 1993), y la más recientemente identificada epiregulina
(Toyoda y col., 1995). Otro miembro potencial es el factor de
crecimiento derivado de Schawnoma (Kimura y col., 1990), que es
homólogo a la anfiregulina (véase Lee DY y col., 1995, para
revisión). Además, hay varios ARNm's que codifican proteínas
relacionadas que pertenecen a la superfamilia de EGF, dlk, pG2, y
prel-1 (Lee YL y otros, 1995). Además, varios
productos génicos virales, por ejemplo, el VGF, producido por la
familia Pox, y proteínas codificadas por los virus del fibroma y
mixoma Sophe (véase Carpenter y Wahl, 1990, para revisión) son
ligandos para el EGFR. Los mecanismos de transducción de nuevos
EGFRs que interaccionan con ligandos todavía desconocidos también
pueden se pueden afectar por DAPH y Tirfostina B56. Sin embargo, los
ligandos del proto-oncogen
p185c-erbB2/HER2/neu, como por ejemplo, la
neuregulina, el factor de crecimiento glial/heregulinas (Marchionni
y col., 1993) se pueden excluir como candidatos a factor, dado que
la Tirfostina B56, que inhibe selectivamente la quinasa de EGFR
(CI50 5,0 \muM), pero no la autofosforilación por la
HER1-2-quinasa (CI50 > 500
\muM; Gazit y col., 1989), bloqueó completamente el efecto de la
proteína del gránulo sobre la glía mesencefálica.
Otro punto relevante para la presente invención
afecta a los mecanismos de clasificación y liberación de factores de
crecimiento, especialmente en neuronas. Generalmente se ha
supuesto, pero no probado previamente, que los factores de
crecimiento se liberan a través de la ruta constitutiva de
secreción. Ahora está apareciendo la prueba de que esto no es
exclusivamente cierto. En la línea celular del feocromocitoma PC12,
que se parece a células de cromafina en muchos sentidos, el BDNF y
el NT-4 transfectados parecen liberarse
principalmente a través de la ruta secretora regulada (Goodman y
Hefti, 1994). Por contraste, las neuronas del hipocampo, secretan
NGF transfectado por un mecanismo no convencional, que implica la
despolarización y el influjo de potasio, pero no calcio externo
(Btöchl y Thoenen, 1995). Así, la localización de un factor de
crecimiento en los gránulos de cromafina y su secreción regulada
puede no constituir un modo inusual de liberación para un factor de
crecimiento.
Con respecto a la identidad del factor
dopaminotrófico derivado glial inducido por la proteína de los
gránulos de cromafina según la presente invención, el GDNF, la
molécula dopaminotrófica más destacada, se excluye. Coherente con
los resultados de la presente invención de que el efecto
dopaminotrófico de la proteína de los gránulos de cromafina implica
un incremento numérico y maduración de células astrogliales es el
hecho de que los sitios de implantación de injertos de cromafina
presenten acumulaciones pronunciadas de astroglía fibrosa (Hansen y
col., 1988).
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Claims (4)
1. Uso de un factor receptor de la proteína
derivada de los gránulos de cromafina que es un ligando del
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), con una
actividad promotora de la supervivencia selectiva sobre neuronas
DAérgicas, para estimular la maduración celular astroglial.
2. El uso de una proteína derivada de gránulos de
cromafina según la reivindicación 1 para estimular la proliferación
de las células no DAérgicas.
3. Uso de una proteína derivada de gránulos de
cromafina según la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de una
composición farmacéutica para tratar alteraciones del SNC
periférico y/o central en el hombre.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que la
alteración del SNC se selecciona del grupo formado por la
enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, una alteración
neurodegenerativa, una neuropatía periférica incluyendo la diabetes
y la neuropatía de cisplatino, y una enfermedad nerviosa periférica
genética o adquirida.
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