ES2211644T3 - Derivados de oligo bencimidazoles y su utilizacion como agentes de transfeccion del adn. - Google Patents
Derivados de oligo bencimidazoles y su utilizacion como agentes de transfeccion del adn.Info
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Abstract
Derivados de oligobencimidazol de **fórmula** en la que: - R representa un átomo de hidrógeno, un radical carboxilo, alquiloxicarbonilo, carbamoílo, alquilcarbamoílo, un grupo piperazinilo eventualmente sustituído en posición 4 con un alquilo que contiene 1 a 4 átomos de carbono, lineal o ramificado, o bien R representa un grupo imidazolilo; - n es un número entero igual a 2, 3, 4 ó 5, y - R'' representa un grupo -O-R3, -S-R3, NHR3, o bien -O-CO- NH-R3 y R3 representa un grupo alquilo; - o bien R'' representa un grupo -NR4R5 o bien -O-CO-NR4R5 y R4 y R5, idénticos o diferentes, representan cada uno un grupo alquilo; siendo los radicales alquilos mencionados anteriormente, salvo especificación en contra, lineales o ramificados, eventualmente saturados, y conteniendo 12 a 22 átomos de carbono; entendiendo que R'' es diferente de OR3 con R3 representando un sustituyente dodecilo cuando R representa 4-metil- piperazinilo y n es igual a 2; así como sus sales metálicas, sus sales de adición con bases nitrogenadas y sus sales de adición con ácidos.
Description
Derivados de oligo bencimidazoles y su
utilización como agentes de tansfección del ADN.
La presente invención se refiere a derivados de
oligobencimidazoles capaces de asociarse con ácidos nucleicos de
fórmula general (I):
sus sales, las composiciones que las contienen, y
a sus utilizaciones, por ejemplo para la transferencia in
vitro, in vivo o ex vivo de ácidos nucleicos
administrados por
fluorescencia.
En la patente FR-1.519.964 se han
descrito los compuestos bisbencimidazólicos y sus sales de
fórmula:
en la que Ar designa un resto arileno, R_{1}
designa un átomo de hidrógeno o de halógeno, un grupo hidroxi, un
grupo alquilo o alcoxi inferior, un grupo mercapto o
alquilmercapto, un grupo alquilendioxi o nitro, un resto fenilo o un
grupo amína eventualmente portador de sustituyentes alquílicos,
R_{2} designa hidrógeno, un resto alquilo eventualmente
sustituido, un resto alcoxicarbonilo, carbamido, arilo o
arilalquilo y R_{3} designa un átomo de halógeno o un resto
alquilo
inferior.
Estos compuestos se describen como poseyendo una
fuerte actividad antihelmíntica y bacteriostática contra gérmenes
gram-positivos, y pueden igualmente caracterizarse
fácilmente gracias a su fluorescencia verde típica (véase página 5,
párrafo 5 de FR-1.519.964).
Además, se ha mostrado en particular que uno de
estos derivados bisbencimidazólicos denominado "Hoechst 33258"
para el que Ar-R_{1} es p-fenol,
R_{2} es un grupo metilo y R_{3} es H, es igualmente un buen
ligando del pequeño surco del ADN, además de ser un fluoróforo. El
"Hoechst 33258" se ha descrito, pues, como útil para la
visualización de ADN nuevamente sintetizado y para determinar el
número de pares de bases A-T presentes en una
muestra de ADN (véase F.G. Loontiens et al., Biochemistry,
1990, 29, pp. 9029-9039.
EP-0.653.491 A1 describe la
utilización del compuesto "Hoechst 33258" o de su éter etílico
"Hoechst 33342" para la introducción de ADN extraño en células
in vitro.
A continuación, se han sintetizado numerosos
compuestos similares al "Hoechst 33258". Por ejemplo, se ha
preparado un compuesto análogo para el que el grupo hidroxi del
fenol terminal está situado en posición meta en lugar de estar en
para, con objeto de introducir potencialmente un enlace de hidrógeno
con ciertos grupos funcionales del ADN (S.E. S. Ebrahimi et al.,
Anti-Cancer Drug Design,1995 10, pp.
463-479). Se ha mostrado que esta ligera diferencia
estructural con relación al "Hoechst 33258", no introduce
modificación importante de las propiedades, aunque incluso una muy
ligera modificación de estructura es susceptible de alterar las
propiedades de enlace en el ADN (véase página 464 del mismo
documento). Tales derivados se describen como siendo útiles como
dispositivo biológico y como medicamentos dirigidos directamente
hacia el genoma en casos de enfermedades virales o de
cánceres.
cánceres.
El compuesto "Hoechst 33258" se ha
modificado igualmente por introducción, al nivel del sustituyente
fenol terminal, de diferentes tipos de moléculas de enlace
(comunmente denominadas "linker"), como por ejemplo el
hexa-(etilenglicol), a fin de poder unir este fluoróforo de forma
covalente a oligo(desoxinucleótidos), lo que permite
aumentar la estabilidad del complejo de hibridación formado y
seguir el éxito de esta hibridación por medida de la fluorescencia
(K. Wiederholt et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118,
pp. 7055-7062; Sharanabasava, B. Rajur et al.,
J.Org. Chem. 1997, 62, pp. 523-529).
Se han formado igualmente conjugados entre
"Hoechst 33258" y polietilenglicol ("PEG"), a fin de
permitir la separación de fragmentos de ADN amplificados por
reacción de polimerización en cadena ("PCR"), idénticos en
longitud pero diferentes en lo que se refiere a su composición
basica, gracias a las propiedades de enlace del compuesto
"Hoechst 33258" con el ADN (M. Müller et al., Nucleic Acid
Research, 1997, Vol. 25, Nº 24, pp.
5125-5126).
Por último, se han sintetizado igualmente
compuestos análogos del "Hoechst 33258" que llevan una cadena
alquilo que contiene 5, 8 ó 12 átomos de carbono sobre el oxígeno
del fenol terminal. Se ha mostrado que estos compuestos análogos
enlazan el pequeño surco del ADN y que resulta así una inhibición de
la transcripción de ciertos genes específicos de células
cancerosas. Se ha mostrado también que estos compuestos análogos
inducen una toxicidad selectiva frente a células del melanoma
humano. (S.S.C. Wong et al., Biochemical Pharmacology,
1994 , Vol. 47, Nº 5, pp. 827-837).
Por otra parte, se sabe que los lípidos
catiónicos son agentes de transfección del ADN en las células. En
efecto, debido a su carga global positiva, interaccionan
espontáneamente con el ADN de forma global negativa, originando así,
por interacciones iónicas, complejos nucleolipídicos compactados
capaces de fijarse sobre las membranas celulares, y permitiendo la
liberación intracelular del ADN. Sin embargo, el empleo de estos
lípidos catiónicos como agentes de transferencia plantea también
numerosos problemas, y su eficacia permanece mejorable. De modo
especial, se ha observado que para obtener complejos
nucleolipídicos eficaces y estables, es en general necesario que
estos complejos sean fuertemente catiónicos. Sin embargo, sería
deseable poder disponer de vectores no catiónicos o menos
catiónicos, de manera que se formasen con el ácido nucleico
partículas globalmente neutras o negativas por diferentes
razones:
- los complejos formados entre el ácido nucleico
y los vectores de transferencia, debido a su carga global positiva,
tienen tendencia a ser captados por el sistema retículoendotelial,
lo que induce su eliminación;
- debido a la carga global positiva de los
complejos formados, las proteínas del plasma tienen tendencia a
adsorberse en su superficie, y resulta una pérdida del poder de
transferencia;
- en un contexto de inyección local, la presencia
de una carga global positiva importante impide la difusión de los
complejos de ácidos nucleicos fuera del lugar de administración,
pues los complejos se absorben en las matrices extracelulares; los
complejos no pueden, por tanto, alcanzar las células que actúan
como blancos o dianas, lo que, como consecuencia, implica una
disminución de la eficacia de transferencia con relación a la
cantidad de complejos inyectada;
- por último, los lípidos o polímeros catiónicos
tienen un efecto inflamatorio, que se ha constatado en numerosas
muestras.
Una alternativa a los lípidos catiónicos para la
transferencia de ácidos nucleicos se ha propuesto así en la tesis
de J.S. Rémy(Synthèse et Utilisation in vitro de nouveaux
vecteurs de transfert de gènes, Jean-Serge REMY,
Université Louis Pasteur de Strasbourg,defensa de la tesis
del 13 de abril de 1994), en el marco de la cual se habían
sintetizado oligopirroles acoplados a cadenas grasas
hidrocarbonadas, a fin de formar complejos con el ADN, gracias
especialmente a las propiedades de ligandos del pequeño surco del
ADN de los oligopirroles peptídicos. Sin embargo, los derivados
lipídicos de oligopirrol sintetizados se habían vuelto ligeramente
tóxicos y no habían mostradoninguna eficacia en la transferencia.
Tales vectores no parecían, pues, ser ventajosas con relación a los
lípidos catiónicos.
Mientras tanto se ha mostrado que los derivados
de oligobencimidazol de fórmula general (I):
en la
que
- R representa un átomo de hidrógeno, un radical
carboxilo, alquiloxicarbonilo, carbamoílo, alquilcarbamoílo, un
grupo piperazinilo eventualmente sustituido en posición 4 con un
alquilo que contiene 1 a 4 átomos de carbono lineal o ramificado, o
bien R representa un grupo imidazolilo;
- n es un número entero igual a 2, 3, 4 ó 5,
y
- R' representa un grupo
-O-R_{3}, -S-R_{3}, NHR_{3}, o
bien
-O-CO-NH-R_{3} y
R_{3} representa un grupo alquilo;
- o bien R' representa un grupo -NR_{4}R_{5}
o bien -O-CO-NR_{4}R_{5} y
R_{4} y R_{5}, idénticos o diferentes, representan cada uno un
grupo alquilo;
siendo los radicales alquilos mencionados
anteriormente lineales o ramificados, salvo especificación en
contra, eventualmente saturados, y conteniendo 12 a 22 átomos de
carbono,
así como sus sales, manifiestan propiedades de
enlace con el ADN y propiedades de fluorescencia particularmente
interesantes en el marco de una administración de ADN in vitro,
in vivo o ex vivo y su visualización.
En efecto, los compuestos de fórmula general (I)
según la presente invención constituyen derivados de "Hoechst
33258" acoplados a una o varias cadenas grasas hidrocarbonadas,
y se ha mostrado que estos compuestos son ligandos de ADN, y en
particular del pequeño surco del ADN, pero que, contrariamente a
los lípidos catiónicos, no compactan dicho ADN. De modo más
preciso, los derivados de oligobencimidazol de fórmula general (I)
según la invención forman enlaces de hidrógeno no iónicos con el
ADN y permiten así estabilizar el ADN en un contexto de producción
y/o purificación de dicho ADN. Además, se ha mostrado igualmente
que los derivados de oligobencimidazol según la invención conservan
las mismas propiedades de fluorescencia que el "Hoechst 33258"
cuando están asociados al ADN, lo que permite la visualización de
este último. Finalmente, se ha puesto de manifiesto que,
contrariamente a los oligopirroles lipídicos, los derivados de
oligobencimidazol según la presente invención permiten la
transferencia del ADN a las células, protegiendo totalmente de las
degradaciones causadas por las endonucleasas.
Según una variante de la invención, los derivados
de oligobencimidazol tienen por fórmula general (II):
en la
que
- R representa un átomo de hidrógeno o un grupo
piperazinilo eventualmente sustituido en posición 4 con un alquilo
que contiene 1 a 4 átomos de carbono lineal o ramificado;
- n es un número entero igual a 2 ó 3, y
- R' representa un grupo -OR_{3}, NHR_{3} u
-O-CO-NH-R_{3} y
R_{3} representa un grupo alquilo;
- o bien R' representa un grupo NR_{4}R_{5} u
-O-CO-NR_{4}R_{5} y R_{4} y
R_{5}, idénticos o diferentes, representan cada uno un grupo
alquilo;
siendo los radicales alquilos mencionados
anteriormente lineales o ramificados, salvo especificación en
contra, eventualmente saturados, y conteniendo 12 a 22 átomos de
carbono,
entendiéndose que R' es diferente de OR_{3} con
R_{3} que representa un sustituyente dodecilo cuando R representa
4-metilpiperazinilo y n es igual a 2,
así como sus sales.
En el sentido de la invención, los sustituyentes
alquilo, lineales o ramificados, eventualmente saturados, y
conteniendo 12 a 22 átomos de carbono, se denominan igualmente
"cadenas grasas". La o las cadenas grasas pueden contener en
particular 12, 14, 16 ó 18 átomos de carbono. Puede especialmente
tratarse de cadenas grasas
\hbox{(CH _{2} ) _{11} }CH_{3},
(CH_{2})_{13}CH_{3}, (CH_{2})_{15}CH_{3},
o (CH_{2})_{17}CH_{3}.
Los derivados de oligobencimidazol de fórmula
general (I) pueden obtenerse según métodos análogos a los descritos
en la patente FR-1.519.964. Este es más
particularmente el caso cuando se desea obtener derivados para los
que R representa un sustituyente piperazinilo eventualmente
sustituido. En efecto, en este caso se puede partir del producto
comercial "Hoechst 33258" e injertar en el grupo hidroxi del
fenol terminal el sustituyente R' tal como se define en la fórmula
general (I) según métodos clásicos conocidos por el especialista o
según métodos análogos. Por otra parte, los derivados de
oligobencimidazol de fórmula general (I) pueden obtenerse
igualmente, bien por síntesis en fase sólida, o ya por síntesis en
fase líquida.
1) Se condensa sobre el
1,2-diaminobenceno comercial
3,4-dinitrobenzaldehído de forma que se obtenga,
después de la formación espontánea del ciclo, un derivado nitrado
de fórmula general (III):
La condensación se efectúa en dioxano en
presencia de diyodo. Se opera con preferencia a temperatura
comprendida entre 10ºC y 40ºC durante aproximadamente 24 horas.
El 3,4-dinitrobenzaldehído puede
obtenerse de la forma siguiente:
a) El ácido 3,4-dinitrobenzoico
comercial se transforma en halogenuro de acilo que corresponde,
según los métodos clásicos conocidos por el especialista para
obtener un halogenuro de acilo a partir de un ácido o según métodos
análogos. Por ejemplo, se opera en presencia de un reactivo tal
como cloruro de tionilo, tricloruro o tribromuro de fósforo,
pentacloruro o pentabromuro de fósforo a temperatura comprendida
entre aproximadamente 70ºC y 90ºC. Según otro método, se opera en
presencia de trifenilfosfina en tetraclorometano.
b) El halogenuro de
3,4-dinitrobencilcarbonilo se reduce luego en el
alcohol correspondiente, según los métodos clásicos conocidos por
el especialista para obtener un alcohol a partir de un halogenuro
de acilo o según métodos análogos. Como ejemplo, se puede operar en
presencia de borohidruro de litio en un disolvente conveniente (por
ejemplo tetrahidrofurano) a temperatura muy baja, por ejemplo a
-78ºC.
c) El alcohol obtenido en la etapa precedente se
oxida finalmente a 3,4-dinitrobenzaldehído, según
los métodos clásicos conocidos por el especialista, para obtener un
aldehído a partir de un alcohol o según métodos análogos. Por
ejemplo, se puede utilizar como agente oxidante óxido de cromo y
operar en presencia de cloruro de trimetilsililo. Se sitúa en este
caso a temperatura comprendida entre aproximadamente 10ºC y 40ºC,
en un disolvente orgánico apropiado como, por ejemplo,
dimetilformamida, disolventes clorados, etc...
2) El derivado nitrado de fórmula general (III)
se reduce entonces de forma que se obtiene un derivado diamínico de
fórmula general (IV):
La reducción se efectúa según los métodos
clásicos, por ejemplo, mediante hidrogenación catalítica en medio
ácido, en presencia de níquel de Raney o de paladio sobre carbón,
en alcohol y a una temperatura comprendida entre 20ºC y 60ºC. Como
alcohol se puede utilizar metanol o etanol. Otra alternativa
consiste en operar por acción de cloruro estannoso en medio acuoso
ácido a temperatura comprendida entre 20 y 100ºC, o también por
reducción mediante hierro en medio acuoso ácido y alcohólico a una
temperatura comprendida entre 20 y 100ºC. La disolución acuosa
ácida puede ser, por ejemplo, una disolución acuosa de ácido
clorhídrico. La disolución alcohólica puede ser, por ejemplo,
metanol o etanol.
3) Las etapas de condensación y de reducción
tales como las descritas en 1) y 2) se repiten sucesivamente
n-2 veces de tal forma que se obtiene un derivado
diamínico de fórmula general (V):
en la que n representa un número entero elegido
entre 2, 3, 4 ó
5.
4) Se condensa luego sobre el derivado diamínico
de fórmula general (V), obtenido precedentemente, un derivado de
nitrobenzaldehído de fórmula general (VI):
en la que R' es tal como se define en la fórmula
general
(I),
de forma que se obtiene un derivado de fórmula
general (VII):
en la que R' es tal como la definida
precedentemente.
Con preferencia, la condensación se efectúa en
dioxano en presencia de diyodo. Se opera preferentemente a
temperatura comprendida entre 10ºC y 40ºC durante aproximadamente
24 horas. Según otro método, se opera en presencia de dicloruro de
dicianoquinona (DDQ) en un disolvente conveniente, por ejemplo
N,N-dimetilformamida,
N-metilpirrolidona, dimetilacetamida, acetonitrilo,
diclorometano, tolueno, benceno, etc...
El derivado benzaldehído de fórmula general (VI)
es, bien comercial, o ya se obtiene:
a) por alquilación del
4-hidroxibenzaldehído comercial, según los métodos
clásicos conocidos por el especialista o según métodos análogos,
cuando R' representa un grupo OR_{3},
b) por reducción seguida de una alquilación del
4-nitrobenzaldehído comercial, según los métodos
clásicos conocidos por el especialista o según métodos análogos,
cuando R' representa un grupo NHR_{3}, o bien
c) por adición nucleófila del derivado ácido
COOH-NHR_{3} o
COOH-NR_{4}R_{5} sobre
4-hidroxibenzaldehído comercial, según los métodos
clásicos conocidos por el especialista o según métodos análogos,
cuando R' representa un grupo
-O-CO-NHR_{3} o bien
-O-CO-NR_{4}R_{5}.
5) En el caso en que se desee que los derivados
de fórmula general (I) según la presente invención lleven un
sustituyente R que represente un grupo piperazinilo eventualmente
sustituido o un grupo imidazolilo, entonces se efectúa la primera
etapa del procedimiento descrito anteriormente a partir de
1,2-diaminobenceno sustituido en posición 4 con el
grupo R.
Se puede igualmente preparar los derivados de
oligobencimidazol de fórmula general (I), según la presente
invención en fase sólida. Este es más particularmente el caso
cuando se desea que los derivados de fórmula general (I) según la
presente invención lleven un sustituyente R que representa un grupo
carboxilo, alquiloxicarbonilo, carbamoílo o alquilcarbamoílo. En
este caso, se puede operar como sigue:
1) Sobre una resina clásica de tipo resina de
Wang sustituida con un átomo de bromo o de yodo o con un grupo
hidroxi, o cualquier otra resina análoga conveniente, se injerta
ácido 3,4-diaminobenzoico comercial, de forma que se
obtiene la resina sustituida de fórmula general (VIII):
Cuando la resina de partida está sustituida con
un átomo de halógeno, el acoplamiento se efectúa en presencia de
una sal de cesio y de una base no nucleófila en
N-etildiisopropilamina, en un disolvente aprótico
conveniente. Como ejemplos de base no nucleófila, se pueden
utilizar, aminas terciarias, carbonato de calcio o también
hidrógeno-carbonato de sodio. Aún más
preferentemente, las bases utilizadas son aminas terciarias, por
ejemplo trietilamina (TEA) o N-etildiisopropilamina
(DIEA). Los disolventes convenientes pueden elegirse entre
N-metilpirrolidona o dimetilformamida
2) Sobre la resina sustituida de fórmula general
(VIII), obtenida en la etapa precedente, se condensa
3,4-dinitrobenzaldehído, de forma que se obtiene,
después de la formación espontánea del ciclo, un derivado nitrado de
fórmula general (IX):
La condensación se efectúa en dioxano en
presencia de diyodo. Se opera con preferencia a temperatura
comprendida entre 10ºC y 40ºC, durante aproximadamente 24
horas.
El 3,4-dinitrobenzaldehído se
obtiene de la misma forma que se describe precedentemente para la
preparación en fase líquida.
3) El derivado nitrado de fórmula general (IX)
obtenido se reduce entonces de forma que se obtiene un derivado
diamínico de fórmula general (X):
La reducción se efectúa con preferencia en
presencia de un ácido de Lewis en un disolvente conveniente. Como
ejemplo de ácido de Lewis, se utiliza cloruro de estaño o cloruro
de cromo. Como ejemplo de disolvente conveniente, se utiliza
N,N-dimetilformamida o
N-metilpirrolidona.
4) Las etapas de condensación y de reducción
tales como las descritas anteriormente en 2) y 3) se repiten
sucesivamente aún n-2 veces, de tal forma que se
obtiene un derivado diamínico de fórmula general (XI):
en la que n representa un número entero elegido
entre 2, 3, 4 ó
5.
5) Se condesa después sobre el derivado diamínico
de fórmula general (XI), obtenido precedentemente, un derivado de
nitrobenzaldehído de fórmula general (VI):
en la que R' es tal como se define en la fórmula
general
(I),
de forma que se obtiene un derivado de fórmula
general (XII):
en la que R' es tal como se define
precedentemente.
Con preferencia, la condensación se efectúa en
dioxano en presencia de diyodo. Se opera preferentemente a
temperatura comprendida entre 10ºC y 40ºC, durante aproximadamente
24 horas. Según otro método, se opera en presencia de dicloruro de
dicianoquinona (DDQ) en un disolvente conveniente elegido entre
N,N-dimetilformamida o
N-metilpirrolidona.
El derivado benzaldehído de fórmula general (VI)
es, bien comercial, o ya se obtiene como se indica precedentemente
para la preparación en fase líquida.
6) El derivado obtenido en la etapa precedente se
escinde luego de la resina, y se obtiene así el ácido de fórmula
general (XIII):
en la que R' y n son tales como se definen
precedentemente.
La escisión de la resina se efectúa según los
métodos clásicos conocidos por el especialista o según cualquier
otro método análogo. Por ejemplo, se opera en presencia de ácido
trifluoroacético a temperatura comprendida entre 10ºC y 50ºC.
7) Para obtener los derivados de
oligobencimidazol de fórmula general (I), se opera según el
significado de R, de la forma siguiente:
a) cuando R representa un radical
alquiloxicarbonilo, se opera según los métodos clásicos de
esterificación conocidos por el especialista, que no alteran el
resto de la molécula, especialmente por aplicación o adaptación de
los métodos descritos en Tetrahedron 33, 683 (1977),
Tetrahedron Letters, 4475 (1978) o Bull. Soc. Chim. Japan,
40, 2380 (1967);
b) cuando R representa un radical carbamoílo o
alquilcarbamoílo, se opera según los métodos clásicos de
transformación de ácidos en amidas conocidos por el especialista y
que no alteran el resto de la molécula, por ejemplo mediante
tratamiento con amoníaco o con una amina primaria conveniente
(representando R un radical alquilcarbamoílo).
Según otra variante, la síntesis en fase sólida
puede efectuarse como sigue:
1) Sobre una resina clásica de tipo resina de
Wang sustituida con un átomo de bromo o de yodo o con un grupo
hidroxi, o cualquier otra resina análoga conveniente, se injerta
ácido
3-nitro-4-aminobenzoico
comercial, de forma que se obtiene la resina sustituida de fórmula
general (XIV):
Cuando la resina de partida está sustituido con
un átomo de halógeno, el acoplamiento se efectúa en presencia de
una sal de cesio y de una base no nucleófíla en
N-etildiisopro-pilamina, en un
disolvente aprótico conveniente. Como ejemplos de base no
nucleófila, se pueden utilizar, aminas terciarias, carbonato de
calcio, o también hidrógeno-carbonato de sodio. Aún
más preferentemente, las bases utilizadas son aminas terciarias,
por ejemplo trietilamina (TEA) o
N-etildiisopropilamina (DIEA). Los disolventes
convenientes pueden elegirse entre
N-metilpirrolidona o dimetilformamida.
2) A la resina sustituida de fórmula general
(XIV) obtenida en la etapa precedente, se añade cloruro de
4-fluoro-3-nitro-bencilcarbonilo
y se obtiene así la resina sustituida de fórmula general (XV)
siguiente:
El acoplamiento se efectúa según los métodos de
acoplamiento peptídico clásicos (Bodanski M., Principles and
Practices of Peptide Synthesis, Ed.
Springer-Verlag) o por cualquier otro método
análogo conocido por el especialista. De modo especial, la reacción
se efectúa en presencia de una base no nucleófila en disolventes
apróticos convenientes, a temperatura comprendida entre 0 y 100ºC,
ajustándose el pH entre 9 y 11.
Como ejemplos, pueden utilizarse como disolventes
cloroformo, dimetilformamida, metilpirrolidona, acetonitrilo,
diclorometano, tolueno o benceno.
Las bases no nucleófilas empleadas son
preferentemente aminas terciarias, carbonato de calcio o
hidrógeno-carbonato de sodio. Aún más
preferentemente, las bases utilizadas son aminas terciarias como,
por ejemplo, trietilamina (TEA) o
N-etildiisopropilamina.
Ventajosamente, el acoplamiento peptídico se
efectúa entre 0 y 50ºC, y con preferencia entre 10 y 30ºC.
El cloruro de
4-fluoro-3-nitro-bencilcarbonilo
se obtiene a partir del ácido comercial correspondiente, según
cualquier método conocido por el especialista, para obtener un
halogenuro de acilo, a partir de un ácido. Por ejemplo, se puede
operar por acción de cloruro de tionilo, a temperatura comprendida
entre aproximadamente 70ºC y 90ºC.
3) A continuación, el átomo de flúor de la resina
sustituida de fórmula general (XV), obtenida en la etapa
precedente, se transforma en función amina, de forma que se obtiene
una resina sustituida de fórmula general (XVI):
La aminación se opera según los métodos clásicos
conocidos por el especialista para transformar un átomo de halógeno
en función amina, por ejemplo mediante sustitución nucleófila,
operando en presencia de amoníaco en un disolvente conveniente, por
ejemplo N,N-dimetilformamida.
4) Las etapas 2) y 3) tales como las descritas
anteriormente, se repiten sucesivamente aún n-2
veces, de tal forma que se obtiene una resina sustituida de fórmula
general (XVII):
5) Se condensa luego sobre la resina sustituida
de fórmula general (XVII), obtenida precedentemente, un derivado de
halogenuro de acilo de fórmula general (XVIII):
en la que Hal representa un átomo de halógeno
elegido entre cloro, bromo, yodo o flúor, y R' es tal como se
define
precedentemente,
a fin de obtener una resina sustituida de
fórmula general (XIX):
El acoplamiento se efectúa según los métodos de
acoplamiento peptídico clásicos (Bodanski M., Principles and
Practices of Peptide Synthesis, Ed.
Springe-Verlag) o por cualquier método análogo
conocido por el especialista. Especialmente, la reacción se efectúa
de forma general en presencia de una base no nucleófila en
disolventes apróticos convenientes, a temperatura comprendida entre
0 y 100ºC, ajustándose el pH entre 9 y 11.
Como ejemplos, pueden utilizarse como
disolventes, cloroformo, dimetilformamida, metilpirrolidona,
acetonitrilo, diclorometano, tolueno o benceno.
Las bases no nucleófilas empleadas son
preferentemente aminas terciarias, carbonato de calcio o
hidrógeno-carbonato de sodio. Aún más
preferentemente, las bases utilizadas son aminas terciarias como,
por ejemplo, trietilamina (TEA) o
N-etildiisopropilamina.
Ventajosamente, el acoplamiento peptídico se
efectúa entre 0 y 50ºC, y con preferencia entre 10 y 30ºC.
El derivado de halogenuro de acilo, de fórmula
general (XVIII) es, bien comercial, o ya se obtiene a partir del
ácido correspondiente, según cualquier método conocido del
especialista, para obtener un halogenuro de acilo a partir de un
ácido. Por ejemplo, se puede operar por acción del cloruro de
tionilo a temperatura comprendida entre aproximadamente 70ºC y
90ºC.
El derivado de ácido correspondiente es, bien
comercial o ya obtenido:
a) por alquilación del ácido
4-hidroxibenzoico comercial, según los métodos
clásicos conocidos por el especialista o según métodos análogos,
cuando R' representa un grupo OR_{3};
b) por reducción seguida de una alquilación del
ácido 4-nitrobenzoico comercial, según los métodos
clásicos conocidos por el especialista o según métodos análogos,
cuando R' representa un grupo NHR_{3}, o bien
\newpage
c) por adición nucleófila del derivado ácido
COOH-NHR_{3} o
COOH-NR_{4}R_{5} sobre ácido
4-hidroxibenzoico comercial, según los métodos
clásicos conocidos por el especialista o según métodos análogos,
cuando R' representa un grupo
-O-CO-NHR_{3} o bien
-O-CO-NR_{4}R_{5}.
6) la resina sustituida, de fórmula general (XIX)
obtenida en la etapa precedente se reduce entonces de forma que se
obtiene una resina sustituida con un producto policiclado de
fórmula general (XX):
La reducción se efectúa con preferencia en
presencia de un ácido de Lewis en un disolvente conveniente. Como
ejemplo de ácido de Lewis, se utiliza cloruro de estaño o cloruro
de cromo. Como ejemplo de disolvente conveniente, se utiliza
N,N-dimetilformamida o
N-metilpirrolidona.
7) El producto policiclado obtenido en la etapa
precedente se escinde de la resina y se obtiene así un derivado de
fórmula general (XXI):
La escisión de la resina se efectúa según los
métodos clásicos conocidos por el especialista o según cualquier
otro método análogo. Por ejemplo, se opera en presencia de ácido
trifluoroacético a temperatura comprendida entre 10ºC y 50ºC.
8) Por último, se obtienen los derivados de
oligobencimidazol de fórmula general (I) según la invención, a
partir del derivado de fórmula general (XXI) obtenido en la etapa
precedente, por sustitución de la función ácido con el grupo R,
estando R definido como precedentemente, de forma análoga a los
métodos descritos con anterioridad en 7) para la primera variante
de preparación en fase sólida.
Los nuevos derivados de oligobencimidazol según
la presente invención, así como sus productos intermedios de
síntesis, pueden purificarse eventualmente mediante métodos físicos
tales como cristalización o cromatografía.
Por otra parte, los derivados lipídicos de
oligobencimidazol según la invención, así como sus productos
intermedios, pueden transformarse en sales metálicas o en sales de
adición con las bases nitrogenadas, según los métodos conocidos por
sí mismos. Estas sales pueden obtenerse según los métodos
habituales que no alteran el resto de la molécula, especialmente por
acción de una base metálica (por ejemplo alcalina o
alcalino-térrea), de amoníaco o de una amina, sobre
un producto citado anteriormente, en un disolvente apropiado tal
como un alcohol, un éter o agua, o por reacción de intercambio con
una sal de un ácido orgánico. La sal formada precipita después de
la concentración eventual de su disolución y se separa por
filtración, decantación y/o liofilización.
Los derivados lipídicos de oligobencimidazol
según la invención pueden transformarse igualmente en sales de
adición con los ácidos. Los compuestos de fórmula general (I)
obtenidos en forma de estas sales, pueden liberarse y transformarse
en sales de otros ácidos, según los métodos habituales.
Como ejemplos de sales farmacéuticamente
aceptables, pueden citarse las sales con metales alcalinos (sodio,
potasio, litio) o con metales alcalino-térreos
(magnesio, calcio), sal de amonio, sales de trietilamina,
metilamina, propilamina, diisopropilamina,
N,N-dimetiletanolamina, bencilamina,
diciclohexilamina, N-bencil fenetilamina,
N,N'-dibenciletilendiamina, difenilendiamina
benzhidrilamina, quinina, colina, arginina, lisina, leucina y
dibencilamina), así como las sales de adición con ácidos minerales
(hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos, nitratos, fosfatos) u
orgánicos (succinatos, fumaratos, maleatos, metanosulfonatos,
p-toluensulfonatos e isetionatos).
Otro objeto de la invención se refiere a
composiciones que contienen un derivado de oligobencimidazol tal
como el definido anteriormente y un ácido nucleico.
Otro objeto de la invención se refiere a
composiciones tales como las definidas precedentemente y que
contienen además uno o varios adyuvantes.
Como ejemplos de adyuvantes, se pueden citar
co-lípidos neutros que son capaces de asociarse a
los complejos formados entre ADN y los derivados de
oligobencimidazol según la invención y de mejorar el poder de
transferencia. En particular, se pueden utilizar lípidos naturales o
sintéticos, de iones dipolares o desprovistos de cargas iónicas en
condiciones fisiológicas. Ejemplos representativos de
co-lípidos neutros incluyen colesterol,
dioleil-fosfati-dil-etanolamina
(DOPE),
oleil-palmitoil-fosfatidil-etanol-amina
(POPE), diestearoil-, dipalmitoil-,
dimiristoil-fos-fatidil-etanolaminas
así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces,
fosfatidil-gliceroles,
diacil-gliceroles,
glicosil-diacil-gliceroles,
cerebrósidos (tales como especialmente galactocerebrósidos),
esfingolípidos (tales como especialmente esfingomielinas) o también
asialogangliósidos (tales como especialmente los asialoGM1 y
GM2).
Estos diferentes co-lípidos
neutros pueden obtenerse, bien por síntesis, o ya por extracción a
partir de órganos (como, por ejemplo, el cerebro) o de huevos,
mediante técnicas clásicas conocidas por el especialista. Por
ejemplo, la extracción de lípidos naturales puede realizarse
mediante disolventes orgánicos (véase igualmente Biochemistry,
Lehninger).
Las composiciones según la invención contienen en
general 0,01 a 20 de un co-lípido neutro para un
equivalente de ácido nucleico (en moles/mol), y con preferencia
0,05 a 5 equivalentes de un co-lípido neutro.
Se pueden igualmente utilizar como adyuvantes
compuestos que permiten mejorar la biodisponibilidad, por ejemplo
polietilenglicol.
Según otro modo de realización, las composiciones
de la presente invención pueden además contener un elemento que
actúa de diana que permita orientar la transferencia de ácido
nucleico. Este elemento de diana puede ser un elemento de diana
extracelular que permita orientar la transferencia de ADN hacia
ciertos tipos celulares o ciertos tejidos deseados (células
tumorales, células hepáticas, células hematopoyéticas...). Puede
igualmente tratarse de un elemento de diana intracelular que permita
orientar la transferencia del ácido nucleico hacia ciertos
compartimentos celulares privilegiados (mitocondrias, núcleo,
etc...).
Entre los elementos utilizables como dianas en el
marco de la invención, se pueden citar azúcares, péptidos,
proteínas, oligonucleótidos, lípidos, neuromediadores, hormonas,
vitaminas o sus derivados. Preferentemente, se trata de azúcares,
péptidos o proteínas tales como anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos, ligandos de receptores celulares o fragmentos de estos,
receptores o fragmentos de receptores, etc... En particular, puede
tratarse de ligandos de receptores de factores de crecimiento, de
receptores de citokinas, de receptores de tipo lecitinas celulares,
o de ligandos de secuencia RGD con una afinidad para los receptores
de proteínas de adhesión como las integrinas. Se pueden igualmente
citar los receptores de transferrina, los HDL y de los LDL, o el
transportador del folato. El elemento de diana puede igualmente ser
un azúcar que permita apuntar a las lecitinas tales como los
receptores para axialo-glicoproteínas o para los
receptores de salivación exagerada y continua (syalidés) tal
como el syalil Lewis X, ó también un fragmento Fab de anticuerpo, o
un anticuerpo de cadena sencilla (ScFv).
Las cantidades respectivas de cada componente
pueden ajustarse fácilmente por el especialista, en función del
derivado de oligobencimidazol utilizado, del ácido nucleico, del o
de los adyuvantes y de las aplicaciones buscadas (especialmente del
tipo de células para transfectar).
En el sentido de la invención, se entiende por
"ácidos nucleicos" los ácidos desoxiribonucleicos de hebra que
forman una doble hélice que contiene un pequeño surco y un gran
surco. Puede tratarse de secuencias naturales o artificiales, y
especialmente de ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc),
secuencias híbridas o secuencias sintéticas o semisintéticas. Estos
ácidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal,
bacteriano, viral, etc... Pueden obtenerse mediante cualquier
técnica conocida por el especialista, y especialmente por cribado de
bancos, por síntesis química, o también por métodos mixtos que
incluyen la modificación química o enzimática de secuencias
obtenidas por cribado de bancos. Pueden modificarse
químicamente.
Según un modo de realización particular, los
ácidos nucleicos están constituidos por vectores, en particular
vectores de expresión, vectores recombinantes, plásmidos, episomas,
etc... Dichos vectores contienen una secuencia que codifica y todos
los elementos necesarios para la expresión de dicha secuencia que
codifica, especialmente elementos de regulación de la expresión del
ácido nucleico a insertar, tales como promotores y secuencias
activadoras ("enhancers") o secuencias apropiadas de
iniciación y de detención de la transcripción, pero también otros
elementos como, por ejemplo, secuencias que codifican para un
origen de replicación funcional o no, genes marcadores, regiones de
enlace con otros componentes celulares, secuencias de señal,
secuencias de poliadenilación, etc...
Se entiende por secuencia que codifica un gen de
interés terapéutico situado en fase con secuencias de regulación,
por ejemplo, uno o varios promotores y un terminador
transcripcional activo en las células que actúan como diana.
En el sentido de la invención, se entiende por
gen de interés terapéutico especialmente cualquier gen que codifica
para un producto proteico que tiene un efecto terapéutico. El
producto proteico así codificado puede ser especialmente una
proteína o un péptido. Este producto proteico puede ser exógeno
homólogo o endógeno, frente a la célula diana, es decir un producto
que está normalmente expresado en la célula diana cuando ésta no
presenta ninguna patología. En este caso, la expresión de una
proteína permite, por ejemplo, paliar una expresión insuficiente en
la célula o la expresión de una proteína inactiva o débilmente
activa, debido a una modificación, o también sobreexpresar dicha
proteína. El gen de interés terapéutico puede también codificar
para un mutante de una proteína celular, que tenga una estabilidad
aumentada, una actividad modificada, etc... El producto proteico
puede igualmente ser heterólogo frente a la célula diana. En este
caso, una proteína expresada puede, por ejemplo, completar o
aportar una actividad deficiente a la célula, permitiéndole luchar
contra una patología, o estimular una respuesta inmunitaria.
Entre los productos terapéuticos en el sentido de
la presente invención, se pueden citar, más particularmente,
enzimas, derivados de sangre, hormonas, linfokinas: interleukinas,
interferones, TNF, etc... (FR-2.684.514), factores
de crecimiento, neurotransmisores o sus precursores o enzimas de
síntesis, factores tróficos (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF,
NT3, NT5, HARP/pleyotrofina, etc...), las apolipoproteínas (ApoAI,
ApoAIV, ApoE, etc...,FR-2.704.556, distrofina o una
minidistrofina (FR-2.681.786), proteína CFTR
asociada a la mucoviscidosis, genes supresores de tumores (p53, Rb,
Rap1A, DCC,k-rev, etc...,
FR-2.704.234), genes que codifican para factores
implicados en la coagulación (Factores VII, VIII, IX), genes que
intervienen en la reparación del ADN, genes suicidas (timidina
kinasa, citosina desaminasa), genes de hemoglobina o de otros
transportadores proteicos, enzimas del metabolismo, catabolismo,
etc...
El ácido nucleico de interés terapéutico puede
ser igualmente un gen o una secuencia antisentido, cuya expresión
en la célula diana permite controlar la expresión de genes o la
transcripción de ARNm celulares. Tales secuencias pueden, por
ejemplo, transcribirse a las célula diana en ARN complementarios de
ARNm celulares y bloquear así su traducción en proteína, según la
técnica descrita en la patente EP-140308. Los genes
terapéuticos contienen igualmente secuencias que codifican para
ribozimas, que son capaces de destruir selectivamente ARN dianas
(EP-321201).
Como se indica anteriormente, el ácido nucleico
puede igualmente contener uno o varios genes que codifican para un
péptido antigénico capaz de generar en el hombre o el animal una
respuesta inmunitaria. En este modo particular de realización, la
invención permite preparar, bien vacunas o ya tratamientos
inmunoterapéuticos aplicados al hombre o al animal, especialmente
contra microorganismos, virus o cánceres. Puede tratarse, de modo
especial, de péptidos antigénicos específicos del virus de Epstein
Barr, del virus HIV, del virus de la hepatitis B
(EP-185573), del virus de la
pseudo-rabia, del "syncitia forming
virus", de otros virus o también de péptidos antigénicos
específicos de tumores (EP-259212).
Preferentemente, el ácido nucleico contiene
igualmente secuencias que permiten la expresión del gen de interés
terapéutico y/o del gen que codifica para el péptido antigénico en
la célula o el órgano deseado. Puede tratarse de secuencias que son
naturalmente responsables de la expresión del gen considerado,
cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula
infectada. Puede igualmente tratarse de secuencias de origen
diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o
incluso sintéticas). De modo especial, puede tratarse de secuencias
promotoras de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede
tratarse de secuencias promotoras procedentes del genoma de la
célula que se desea infectar. De igual forma, puede tratarse de
secuencias promotoras procedentes del genoma de un virus. A este
respecto, se pueden citar, por ejemplo, promotores de genes E1A,
MLP, CMV, RSV, etc... Además, estas secuencias de expresión pueden
modificarse por adición de secuencias de activación, de regulación,
etc...
Puede también tratarse de promotor inductible o
reprimible.
Por otra parte, el ácido nucleico puede
igualmente contener, en particular más arriba del gen de interés
terapéutico, una secuencia señal que dirija el producto terapéutico
sintetizado a las vías de secreción de la célula diana. Esta
secuencia señal puede ser la secuencia señal natural del producto
terapéutico, pero puede igualmente tratarse de cualquier otra
secuencia señal funcional, o de una secuencia señal artificial. El
ácido nucleico puede igualmente contener una secuencia señal que
dirija el producto terapéutico sintetizado hacia un compartimento
particular de la célula.
Las composiciones según la invención pueden
formularse para administraciones por vía tópica, cutánea, oral,
rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica,
intratraqueal, intra peritoneal, etc... Con preferencia, las
composiciones de la invención contienen un vehículo
farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable,
especialmente para una inyección directa a nivel del órgano deseado,
para una administración por vía tópica (sobre piel y/o mucosa) o
para una administración por formación de aerosol. Puede tratarse en
particular de disoluciones estériles, isotónicas, o de
composiciones secas, especialmente liofilizadas, que, por adición
según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten
la formación de disoluciones inyectables. Las dosis de ácidos
nucleicos utilizadas para la inyección, así como el número de
administraciones, pueden adaptarse en función de diferentes
parámetros, y especialmente en función del modo de administración
utilizado, de la patología implicada, del gen a expresar, o también
de la duración del tratamiento estudiado. En lo referente más
particularmente al modo de administración, puede tratarse, bien de
una inyección directa en los tejidos, por ejemplo a nivel de los
tumores, o en las vías circulatorias, o ya de un tratamiento de
células en cultivo seguido de su reimplantación in vivo, por
inyección o injerto. Los tejidos implicados en el marco de la
presente invención, son, por ejemplo, músculos, piel, cerebro,
pulmones, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre,
huesos, cartílagos, páncreas, riñones, vejiga, estómago, intestinos,
testículos, ovarios, recto, sistema nervioso, ojos, glándulas,
tejidos conjuntivos,
etc.
etc.
La invención tiene igualmente por objeto la
utilización de derivados de oligobencimidazol tales como los
definidos anteriormente para la transferencia de ácidos nucleicos
en las células in vitro, in vivo o ex vivo. De modo
más preciso, la presente invención tiene por objeto la utilización
de compuestos tales como los definidos anteriormente para la
preparación de un medicamento destinado a la transferencia de ácido
nucleico a las células. El ácido nucleico contenido en dicho
medicamento codifica un producto proteico o nucleico, o constituye
dicho producto nucleico, apto para corregir enfermedades in vivo
o ex vivo en las que interviene dicho producto proteico o
nucleico.
La invención se refiere, además, a un método de
transferencia de ácidos nucleicos a las células, que consiste, en
una primera etapa, en el curso de la cual el ácido nucleico se pone
en contacto con al menos un derivado de oligobencimidazol según la
invención y eventualmente con uno o varios adyuvantes y/o uno o
varios vehículos fisiológicamente compatibles para formar un
complejo, y en una segunda etapa que consiste en poner el complejo
así formado en contacto con las células.
La puesta en contacto de las células con el
complejo puede realizarse por incubación de las células con dicho
complejo (para utilizaciones in vivo o ex vivo), o
por inyección o formación de aerosol del complejo en un organismo
(para utilizaciones in vivo). La incubación se realiza con
preferencia en presencia de, por ejemplo, 0,01 a 1000 \mug de
ácido nucleico por 10^{6} células. Para una administración in
vivo, pueden utilizarse, por ejemplo, dosis de ácido nucleico
que varían de 10^{-4} a 10 mg.
Los derivados de oligobencimidazol según la
invención son utilizables para la transferencia de ácidos nucleicos
a células primarias o a razas establecidas. Puede tratarse de
células fibroblásticas, musculares, nerviosas (neuronas,
astrocitos, células gliales), hepáticas, hematopoyéticaa
(linfocitos, CD34, dendríticas, etc.), epiteliales, etc..., en
forma diferenciada o pluripotente (precursores).
Por último, las utilizaciones de las
composiciones según la invención pueden concernir tanto al hombre
como a cualquier animal tal como ovinos, bovinos, animales
domésticos (perro, gato, etc...), caballos, peces, etc...
Además de las disposiciones precedentes, la
presente invención se refiere igualmente a otras características y
ventajas que se deducirán de los ejemplos y figuras que siguen, y
que deben considerarse como ilustrativas de la invención sin
limitar su alcance. Especialmente, la firma solicitante propone,
como ejemplo no limitativo, diversos protocolos operatorios así
como productos intermedios de reacción susceptibles de emplearse
para preparar los agentes de transferencia de fórmula general (I).
Por supuesto, corresponde al especialista inspirarse en estos
protocolos o productos intermedios para poner a punto
procedimientos análogos dedicados a conducir a estos mismos
compuestos.
Figura 1: Estructura de los derivados de
oligobencimidazol (1) y (2) cuya preparación se expone en los
ejemplos 1 y 2.
Figura 2: Señal de emisión de fluorescencia a 450
nm de complejos ADN/derivado (1) (curva continua) y del derivado
(1) solo (curva punteada) en función de cantidades crecientes de
derivado (1) en nmol/\mug de ADN. La concentración de ADN es 50
\mug/ml.
Figura 3: Señal de emisión de fluorescencia a 450
nm de complejos ADN/derivado (2) (curva continua) y del derivado
(2) solo (curva punteada) en función de cantidades crecientes de
derivado (2) en nmol/\mug de ADN. La concentración de ADN es 50
\mug/ml.
Figura 4: Gel de agarosa de un plásmido de ADN
complejado con los derivados (1) y (2) a diferentes concentraciones
de derivado expresado en nmol de producto por \mug de ADN.
"*": banda amarilla característica del
derivado no complejado con ADN, y que permanece por tanto al nivel
del punto de inyección.
"**": banda azul característica del producto
complejado con ADN.
Figura 5: Gel de agarosa de un plásmido de ADN
complejado con los derivados (1) y (2), a diferentes
concentraciones de derivado expresadas en nmol de producto por
\mug de ADN. El gel se ha revelado bajo la misma lámpara U.V. que
para la figura 4, pero con bromuro de etidio.
Figura 6: Gel de agarosa (0,8%) de 1 \mug de un
plásmido de ADN asociado a cantidades crecientes de un lípido
catiónico de fórmula:
tal como se describe en la solicitud de patente
WO 97/18185, estando expresadas las cantidades en nmol de lípido
catiónico por \mug de ADN. Las bandas están reveladas con bromuro
de etidio y por absorción bajo una lámpara
U.V.
Figura 7: Representación esquemática del plásmido
pXL3031 utilizado en las experiencias de transferencia de ADN en
las células.
Nota preliminar: el isocianato de
dodecilo, el isocianato de octadecilo, la
N-etil-diisopropilamina, el
"Hoechst 33258", la resina de
Wang-bromopoliestireno, el yodo, el yoduro de cesio,
el ácido 3,4-diaminobenzoico, la
1,2-dianilina, el ácido
3,4-dinitrobenzoico, el cloruro de tionilo, la
piridina, el óxido de cromo, el cloruro de trimetilsililo, el
borohidruro de litio y el cloruro estannoso fueron todos productos
disponibles en el comercio.
Los espectros de RMN (Resonancia Magnética
Nuclear) de protón se registraron con espectrómetros Brucker 250 y
400 MHz.
Los análisis CLHP (Cromatografía líquida de altas
Prestaciones) se realizaron con un aparato HITACHI equipado con un
dispositivo de toma de muestras automático
AS-2000A, una bomba L-6200A, un
detector UV L 4000 a 220 nm, y un integrador calculador D 2500. La
columna utilizada para analizar los productos con cadenas
lipídicas, comercializada por APPLIED BIOSYSTEMS, fue de
acero inoxidable de 3 cm de longitud y 4,6 mm de diámetro. Las fases
móviles fueron agua y acetonitrilo adicionadas de ácido
trifluoroacético, y la fase estacionaria fue Aquapore butil
de 7 micras. El caudal varió entre 1 y 4 ml/minuto. La otra
columna utilizada para analizar productos sin cadenas lipídicas,
comercializada por MERCK, fue de acero inoxidable de 25 cm de
longitud y 4,6 mm de diámetro. Las fases móviles fueron agua y
acetonitrilo adicionados de ácido trifluoroacético, y la fase
estacionaria fue Lichrospher RP-18 de 5
micras. El caudal fue 1 ml/minuto.
Las cromatografías sobre capa fina (CCM) se
efectuaron sobre placa de aluminio de 20x20 recubiertas de gel de
sílice.
En lo referente a las purificaciones CLHP
preparativas, el aparato utilizado fue un conjunto para la
cromatografía en fase líquida en modo gradiente, que permitió una
detección U.V. Esta cadena preparativa estuvo compuesta por los
elementos siguientes:
Bomba A: GILSON modelo 305 equipada con un
cabezal 50 SC
Bomba B: GILSON modelo 303 equipada con un
cabezal 50 SC.
Bomba de inyección: GILSON modelo 303
equipada con un cabezal 25 SC
Módulo de presión: GILSON modelo 806.
Mezclador: GILSON modelo 811 C equipado
con un cabezal de 23 ml
Detector UV: GILSON modelo 119 equipado
con una célula preparativa, y regulado a 220 nm.
Colector de fracción: GILSON modelo 202
equipado con portadores nº 21.
Integrador: SHIMADZU modelo
C-R6A.
Columnas: Columna C4 (10 \mu) de acero
inoxidable de 25 cm de longitud y 2,2 cm de diámetro,
comercializada por VYDAC modelo 214 TP 1022. Columna C18 (10 \mu)
de acero inoxidable de 25 cm de longitud y 2,2 cm de diámetro,
comercializada por VYDAC modelo 218 TP 1022.
\newpage
La disolución del producto que se iba a purificar
se cargó en la columna por la bomba de inyección con un caudal de
15 ó 12 ml/minuto. Las fases móviles fueron agua y
acetonitrilo.
Se disolvieron 0,32 mmol de "Hoechts 33258"
en 10 cm^{3} de dimetilformamida. A esta disolución se añadieron
2 mmol de N-etil-diisopropilamina y
luego 1 mmol de isocianato de octadecilo. La mezcla se agitó
durante 24 horas a 50ºC y la reacción se siguió por CLHP. Se filtró
en frío la urea obtenida en forma de precipitado, debido al exceso
de isocianato introducido. Se añadió luego ácido acético hasta pH
4, y se evaporó el disolvente.
El producto bruto obtenido se purificó por CLHP
preparativo. Las fracciones interesantes se reagruparon y se
liofilizaron.
Se obtuvieron 0,125 mmol de producto salificado,
con un rendimiento de 39,2%.
CLHP: Rt = 9,81 min.
Espectro de RMN ^{1}H(400 MHz
(CD_{3})_{2}SO d6,\delta en ppm):
0,86(t,J=7Hz:3H); de 1,15 a 1,40 (mt:30H);
1,51(mt:2H); 2,92(s:3H); de 3,00 a 3,15(mt:2H);
3,10(mt:2H); 3,26(mt:2H); 3,61(d
ancha,J=10Hz:2H); 3,91(d ancha, J=10Hz:2H); 7,20(s
ancha:1H); 7,25(d ancha, J=9Hz:1H); 7,36(d,J=9Hz:2H);
7,68(d,J=9Hz:1H) de 7,80 a 7,90 (mt:2H); 8,06(dd,J=9 y
1,5Hz:1H); 8,25(d,J=9 Hz:2H); 8,45(s ancha:1H); de
9,70 a 9,90(mf:1H).
Se disolvieron 0,32 mmol de "Hoechst 33258"
en 10 cm^{3} de dimetilformamida. A esta disolución se añadieron
2 mmol de N-etil-diisopropilamina y
luego 1 mmol de isocianato de dodecilo. La mezcla se agitó durante
24 horas a 50ºC y la reacción se siguió por CLHP. Se filtró en frío
la urea obtenida en forma de precipitado, debido al exceso de
isocianato introducido. Se añadió luego ácido acético hasta pH 4, y
se evaporó el disolvente.
El producto bruto obtenido se purificó por CLHP
preparativo. Las fracciones interesantes se reagruparon y se
liofilizaron.
Se obtuvieron 0,134 mmol de producto salificado,
con un rendimiento de 41,9%.
CLHP: Rt = 11,34 min.
Espectro de RMN ^{1}H (400 MHz,
(CD_{3})_{2}SO d6, \delta en ppm): 0,89(t,
J=7Hz:3H); de 1,25 a 1,45(mt:18H); 1,56(mt:2H);
2,93(s:3H); 3,15(mt:2H); de 3,30 a 4,20(mt:8H);
7,17(dd,J=9 y 2Hz:1H);
7,22(d,J=2Hz:1H);7,34(d,J=8,5Hz:2H); de 7,45 a
7,60(mf:1H); 7,63(d,J=9Hz:1H);
7,81(d,J=8Hz:1H); 8,06(d ancha, J=8Hz:1H);
8,24(d,J=8,5Hz:2H); 8,43(s ancha:1H).
Este ejemplo ilustró la propiedad de los
derivados de oligobencimidazol según la invención, para formar
complejos con ADN.
Para ello, se midió la fluorescencia de mezcla de
ADN con cantidades crecientes de derivado (1) ó (2) por excitación
a 350 nm y detección a 450 nm.
Los resultados se representaron en la Figura 2
para la formación de complejos con el derivado (1) y en la Figura 3
para la formación de complejos con el derivado (2).
En todos los casos, se constató que cuando no
había derivado de oligobencimidazol (1) ó (2) y el ADN estaba solo
en disolución, no se detectó fluorescencia alguna. Después, la
fluorescencia aumentó con las cantidades crecientes de derivado (1)
ó (2) hasta alcanzar un palier. Esta fluorescencia no fue idéntica
a la fluorescencia emitida por el derivado (1) ó (2) solos, pero,
en compensación, las curvas obtenidas para los complejos
ADN/derivado presentaron un espectro de emisión y de excitación
similares a los obtenidos para el "Hoechst 33258" (resultado
no indicado).
Así, estos resultados mostraron que los derivados
(1) y (2) formaban complejos con el ADN y que la saturación del
surco del ADN (concentración en derivado con relación a la cantidad
de ADN más allá de la cual no se formaba ningún complejo), se situó
en una relación derivado de oligobencimidazol/ADN aproximadamente
igual a 1,5-2 nmol/\mug.
Este ejemplo completó el ejemplo 3, ya que puso
de manifiesto la formación de complejos de ADN y de derivados de
oligobencimidazol según la invención. Además, este ejemplo ilustró
las propiedades específicas de estos complejos de ADN/derivados de
oligobencimidazol con relación a los complejos de ADN/lípido
catiónico de la técnica anterior.
Por esta razón, se preparó un gel de agarosa de
un plásmido de ADN mezclado con cantidades crecientes de derivado
(1) ó (2) según la invención (véase Figura 4). Este gel se observó
directamente bajo la luz de una lámpara UV, sin ser revelado.
Entonces se pudieron observar dos bandas gracias a las propiedades
de absorción espectrales específicas de los derivados según la
presente invención:
- una banda amarilla característica del derivado
solo, es decir no complejado con ADN (banda marcada con un
asterísco ("*"); se constató que el derivado permaneció en el
punto de inyección;
- una banda azul característica del derivado
complejo con ADN (banda marcada con dos asteriscos ("**").
El mismo gel de agarosa se reveló luego con
bromuro de etidio (véase la Figura 5). Se constató que el ADN
emigró de forma idéntica al ADN solo, cualquiera que fuese la
concentración de derivado según la invención. Este ejemplo ilustró,
por tanto, el hecho de que los derivados (1) y (2) dieron complejos
con ADN que tuvieron las mismas propiedades de movilidad bajo
electroforesis que el ADN solo, mientras que este no fue el caso
cuando el ADN estaba complejado con lípidos catiónicos clásicos. En
efecto, la Figura 6 mostró un gel de agarosa efectuado con
complejos que contenían cantidades crecientes de un lípido
catiónico: se observó una migración de los complejos formados que
varió con la cantidad de lípido catiónico presente con el ADN. Este
resultado indicó que, cuanto más aumentó la cantidad de lípido
catiónico, más se compactó el ADN, y menos emigró éste sobre el
gel.
Así, los derivados de oligobenzimidazol según la
presente invención fueron complejantes del ADN que, al contrario de
los lípidos catiónicos clásicamente utilizados en la transfección
no viral de genes, no compactaron el ADN. Las propiedades de
movilidad del ADN se conservaron, por tanto, incluso cuando se
añadieron al ADN cantidades importantes de derivados según la
presente invención, para formar complejos. Esta propiedad fue
particularmente interesante en una óptica de transfección no viral
de genes, ya que sería así posible gracias a los derivados de
oligobenzimidazol según la presente invención formar complejos con
el ADN, permitiendo la protección de dicho ADN frente a las
endonucleasas sin modificar, por otra parte, sus propiedades de
movilidad.
Además, fue así igualmente posible formar
complejos que fueron detectables por métodos directos,
especialmente sin revelado por bromuro de etidio, gracias a las
propiedades de fluorescencia específicas de los derivados según la
presente invención.
Plásmido utilizado. El ADN utilizado fue el
plásmido pXL3031 (véase la Figura 7) en disolución en una mezcla de
dextrosa al 5% y de cloruro de sodio 10 mM a una concentración de
0,5 mg/ml o de 1,0 mg/ml. Este plásmido contenía el gen luc
que codifica para la luciferasa bajo control del promotor P/E CMV
del citomegalovirus. Su tamaño fue 3671 bp. El plásmido pXL3031 se
purificó según los métodos descritos en la solicitud de patente WO
97/35002.
Las disoluciones de ácido nucleico se diluyeron a
20 \mug/ml en suero fisiológico (cloruro de sodio 0,15 M).
El derivado (2) de oligobenzimidazol según la
invención se puso en disolución en agua a concentración variante de
40 a 160 \mumol y se mezcló volumen a volumen con la disolución
de ADN. La concentración salina final fue 75 mmol.
Las células HeLa se cultivaron en condiciones
apropiadas en microplacas de 24 pocillos (2 cm^{2}/pocillo) y se
transfectaron cuando estaban en fase exponencial de crecimiento y a
50-70% de la confluencia.
Las células se lavaron 2 veces con 0,5 cm^{3}
de medio desprovisto de proteínas séricas y repuestas en
crecimiento, bien en medio sin suero (transfección en ausencia de
suero), o bien en medio completo (transfección en presencia de
suero). Se añadieron a las células 0,05 cm^{3} de mezcla
citofectante (0,5 \mug de ADN/pocillo) (3 pocillos/condición
vector-ADN. Cuando las células se transfectaron en
ausencia de suero, el medio de crecimiento se suplementó, 2 horas
después de la transfección, con la cantidad apropiada de suero.
La eficacia de la transfección se evaluó a las 48
horas después de la transfección, por una medida de la expresión de
luciferasa, según las recomendaciones dadas para la utilización del
kit Promega ("Luciferase Assay System"). La
toxicidad de las mezclas citofectantes se estimó mediante una
medida de las concentraciones proteicas en los lisados
celulares.
Los resultados de actividad luciferasa in
vivo referidos a las proteínas expresadas en
RLU/5\mul/10s/\mug de proteína (escrito más simplemente
RLU/\mug de poteína, significando "RLU" "Unidad de Luz
Relativa"), se indican en la Tabla siguiente:
- "nd" significa "expresión no detectable".
Los resultados obtenidos indicaron que era
posible obtener una expresión después de la transferencia de
material genético complejado con derivados según la presente
invención en células in vitro, sea en un medio con o sin
suero.
El plásmido utilizado fue el mismo que el
descrito precedentemente para el ejemplo 5 (pXL3031). Igualmente,
las disoluciones citofectantes se prepararon de la misma forma que
en el ejemplo 5.
Se inyectaron 25 \mul de disoluciones de
complejos de derivado (1)/ADN por vía intramuscular en ratones
C57B16, a razón de 4 \mug de ADN/músculo de ratón. La eficacia de
transfección se evaluó a los 7 días después de la transfección por
una medida de la expresión de luciferasa según las recomendaciones
dadas para la utilización del kit Promega (Luciferase Assay
System). Los músculos se molieron en 1,5 ml de tampón de lisis
(con inhibidores de proteasas). Después de la dosificación de la
actividad luciferasa sobre 10 \mul, los resultados se expresaron
en RLU/10 \mul/10 segundos.
Los resultados de actividad luciferasa in
vivo en los músculos de ratón, expresados en RLU/10 \mul/10
segundos, se indicaron en la Tabla siguiente:
Los resultados obtenidos indicaron que era
posible obtener una expresión in vivo en el músculo después
de la transferencia de material genético complejado a los derivados
según la presente invención, bien sea utilizando o no la técnica de
electrotransferencia tal como se describió en las solicitudes de
patente WO 99/01157 y WO 99/01158.
Claims (10)
1. Derivados de oligobencimidazol de fórmula
general (I):
en la
que
- R representa un átomo de hidrógeno, un radical
carboxilo, alquiloxicarbonilo, carbamoílo, alquilcarbamoílo, un
grupo piperazinilo eventualmente sustituido en posición 4 con un
alquilo que contiene 1 a 4 átomos de carbono, lineal o ramificado, o
bien R representa un grupo imidazolilo;
- n es un número entero igual a 2, 3, 4 ó 5,
y
- R' representa un grupo
-O-R_{3}, -S-R_{3}, NHR_{3}, o
bien
-O-CO-NH-R_{3} y
R_{3} representa un grupo alquilo;
- o bien R' representa un grupo -NR_{4}R_{5}
o bien -O-CO-NR_{4}R_{5} y
R_{4} y R_{5}, idénticos o diferentes, representan cada uno un
grupo alquilo;
siendo los radicales alquilos mencionados
anteriormente, salvo especificación en contra, lineales o
ramificados, eventualmente saturados, y conteniendo 12 a 22 átomos
de carbono;
entendiendo que R' es diferente de OR_{3} con
R_{3} representando un sustituyente dodecilo cuando R representa
4-metil-piperazinilo y n es igual a
2;
así como sus sales metálicas, sus sales de
adición con bases nitrogenadas y sus sales de adición con
ácidos.
2. Derivados de oligobencimidazol según la
reivindicación 1 de fórmula general (II):
en la
que
- R representa un átomo de hidrógeno o un grupo
piperazinilo eventualmente sustituido en posición 4 con un alquilo
que contiene 1 a 4 átomos de carbono, lineal o ramificado;
- n es un número entero igual a 2 ó 3, y
- R' representa un grupo -OR_{3}, NHR_{3} u
-O-CO-NH-R_{3} y
R_{3} representa un grupo alquilo;
- o bien R' representa un grupo NR_{4}R_{5} u
-O-CO-NR_{4}R_{5} y R_{4} y
R_{5},idénticos o diferentes, representan cada uno un grupo
alquilo;
siendo los radicales alquilo mencionados
anteriormente, salvo especificación en contra, lineales o
ramificados, eventualmente saturados, y conteniendo 12 a 22 átomos
de carbono;
entendiéndose que R' es diferente de OR_{3},
representando R_{3} un sustituyente dodecilo cuando R representa
4-metil-piperazinilo y n es igual a
2;
así como sus sales metálicas, sus sales de
adición con bases nitrogenadas y sus sales de adición con
ácidos.
3. Derivados de oligobencimidazol según la
reivindicación 1, caracterizados porque se trata del
4-[6-(4-metil-piperazín-1-il)-1H,3'H-[2,5']bisbencimidazol-2'-il]-1-oc-tadecilcarbamoiloxi
fenilo (derivado (1)) o del
4-[6-(4-metilpiperazín-1-il)-1H,3'H-[2,5']bisbencimidazol-2'-il)-dodecil-carbamoiloxi-fenilo
(derivado (2)).
4. Composición caracterizada porque
contiene un derivado de oligobencimidazol tal como el definido en
las reivindicaciones 1, 2 ó 3 en que el derivado para el que R'
representa un grupo OR_{3}, representando R_{3} un sustituyente
dodecilo, R representa
4-metil-piperazinilo y n es igual a
2, y un ácido nucleico.
5. Composición según la reivindicación 4,
caracterizada porque contiene, además, uno o varios
adyuvantes.
6. Composición según la reivindicación 4 ó 5,
caracterizada porque contiene, además, un vehículo
farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, tópica
o en forma de aerosol.
7. Utilización de un derivado de
oligobencimidazol tal como el definido en la reivindicación 1, 2 ó
3, o del derivado para el que R' representa un grupo OR_{3},
representando R_{3} un sustituyente dodecilo, R representa
4-metil-piperazinilo y n es igual a
2, para la transferencia de ácidos nucleicos a células in
vitro.
8. Utilización de un derivado de
oligobencimidazol tal como el definido en la reivindicación 1, 2 ó
3, o del derivado para el que R' representa un grupo OR_{3},
representando R_{3} un sustituyente dodecilo, R representa
4-metil-piperazinilo y n es igual a
2, para la preparación de un medicamento destinado a la
transferencia de ácido nucleico a células.
9. Método de transferencia de ácidos nucleicos a
células in vitro, caracterizado porque consta de una
primera etapa en el curso de la cual el ácido nucleico se pone en
contacto con al menos un derivado de oligobencimidazol tal como se
define en la reivindicación 1, 2 ó 3 o con el derivado para en el
que R' representa un grupo OR_{3}, representando R_{3} un
sustituyente dodecilo, R representa
4-metil-piperazinilo y n es igual a
2, y eventualmente con uno o varios adyuvantes y/o uno o varios
vehículos fisiológicamente compatibles para formar un complejo, y
una segunda etapa que consiste en poner en contacto con las células
el complejo así formado.
10. Composición según la reivindicación 4, 5 ó 6
para su utilización como medicamento.
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