ES2206466T3 - Adn codificante de quitina desacetilasa. - Google Patents
Adn codificante de quitina desacetilasa.Info
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Abstract
SE HA DESCUBIERTO UNA SECUENCIA DE DNA DE UNA ENZIMA PRESENTE EN MUCOR ROUXII QUE CATALIZA LA CONVERSION DE CITINA EN CITOSAN (ES DECIR, TENIENDO UNA ACTIVIDAD DE ACETILASA DE CITINA). DICHA SECUENCIA DE DNA PUEDE CODIFICAR UNA PROTEINA RIZOBIAL NODB, QUE MUESTRA ALGUNA HOMOLOGIA CON LA DEACETILASA DE CITINA DEL INVENTO.
Description
ADN codificante de quitina desacetilasa.
Después de la celulosa, la quitina es el material
biológico renovable, más fácilmente obtenible y más abundante en el
mundo. Es un producto natural sintetizado por una amplia variedad de
organismos. Se producen varios miles de millones de toneladas de
este material al año. La quitina es un polímero de hidratos de
carbono, el polímero N-acetilado de la
N-acetilglucosamina con enlaces
\beta(1\rightarrow4), o la
poli-N-acetil glucosamina. En las
plantas, la quitina es un constituyente de la pared celular que
reemplaza a la celulosa o que se presenta a veces junto con la
celulosa. En los animales, la quitina se organiza normalmente en
forma de cutícula en una de las capas de tejido epitelial. Aunque es
estructuralmente similar a la celulosa, la quitina tiene propiedades
químicas claramente diferentes. Es un material extremadamente
insoluble, con una aplicación industrial limitada.
El derivado desacetilado de la quitina, el
quitosano, es un material mucho más tratable con un amplio e
impresionante conjunto de aplicaciones prácticas. El quitosano está
cargado positivamente, pudiendo así ser empleado como agente
precipitante de proteínas y como agente quelante de metales. Puede
ser formulado en forma de solución, gel, membrana, película o fibra.
Tales formulaciones son útiles, por ejemplo, en las áreas de
recuperación de materiales preciosos, protección de cultivos,
cromatografía e inmovilización enzimática. El quitosano es un
material biológicamente benigno, no inmunogénico, lo que lo
convierte en ideal para su uso en las industrias agrícola,
alimentaria, farmacéutica y cosmética. Puede formar complejos con
otros polímeros naturales, como el colágeno y la queratina, para
formar materiales con propiedades biomédicas únicas. Estos
materiales se pueden emplear, por ejemplo, como aceleradores de la
curación de heridas, como componentes de piel y vasos sanguíneos
artificiales, como anticoagulantes, y como vehículos para el control
de la liberación de medicamentos.
Actualmente, la mayoría del quitosano producido
en todo el mundo se prepara a partir de material proveniente del
caparazón de los crustáceos. La quitina compone aproximadamente el
20-50% del peso seco de la cutícula de los de
crustáceos, siendo el resto principalmente carbonato cálcico,
fosfato cálcico y otras proteínas. La quitina se aísla primero
tratando el caparazón molido de los crustáceos con un ácido y un
álcali diluidos para eliminar las proteínas y los minerales. A
continuación, la quitina sin refinar se desacetila exponiéndola a
un álcali concentrado, a una temperatura elevada para generar
quitosano. Aunque el quitosano producido de esta forma tiene muchas
características útiles, es imposible controlar de forma eficaz el
proceso de producción, lo que lleva a la producción de un material
con un amplio rango de peso molecular y un grado de desacetilación
heterogéneo. Este producto no es de gran valor, ya que muchas de
las importantes y potenciales aplicaciones, sobre todo en el área
biomédica, requieren un material uniforme, con unas propiedades
físicas y químicas muy específicas.
El objeto de la invención se refiere a una
secuencia de ADN aislada que codifica para una enzima que cataliza
la conversión de quitina en quitosano. Unas formas de realización
específicas incluyen secuencias de ADN que se caracterizan por su
capacidad para hibridar con la secuencia de ADN representada en SEC
ID Nº: 1, en condiciones de hibridación restrictivas y que codifican
una enzima con actividad quitina desacetilasa. La invención también
trata de una construcción de ADN para su expresión que codifica una
enzima con la especificidad descrita anteriormente, o porciones
biológicamente activas de la misma.
La invención también trata de un procedimiento
para convertir quitina en quitosano poniendo en contacto la quitina
con la enzima mencionada anteriormente con actividad quitina
desacetilasa. En este procedimiento, la enzima se genera por
técnicas de ADN recombinante en las que una secuencia aislada de ADN
que codifica para la enzima, o uno de los fragmentos biológicamente
activos de la misma, se expresa a partir de una construcción de
ADN.
La Figura 1 es un diagrama que representa el
perfil de elución de una columna de Fenil Sefarosa®
CL-4B.
La Figura 2 es un diagrama que representa el
perfil de elución de una columna de Sefarosa® Q de Flujo Rápido.
La Figura 3 es un diagrama que representa el
perfil de elución de una columna de Sefarosa® S de Flujo Rápido.
La Figura 4 es un diagrama que representa la
dependencia de la temperatura de la actividad quitina
desacetilasa.
La Figura 5 es un diagrama que representa la
dependencia del pH de la actividad quitina desacetilasa.
La Figura 6 es un diagrama que representa la
secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos que se deduce de ella
de la quitina desacetilasa de Mucor rouxii. La secuencia de
ADN también se muestra en la SEC ID Nº: 1. La secuencia de
aminoácidos que se deduce se denominará en lo sucesivo SEC ID Nº:
2.
La presente invención fue posible gracias al
descubrimiento de un procedimiento para la purificación de quitina
desacetilasa a partir de un extracto celular de un organismo
productor de quitina desacetilasa. La enzima quitina desacetilasa es
producida por una variedad de géneros que incluyen, por ejemplo,
Mucor, Phycomyces, Absidia y
Choanephora. Otros géneros potencialmente útiles incluyen
Zygorhynchus, Actinomucor, Circinella,
Rhizopus, Colletotrichum y Rhizomucor.
Una fuente preferida de quitina desacetilasa es
la pared celular de los micelios fúngicos. Estos micelios se
producen en grandes cantidades como producto secundario en la
industria de la fermentación. El crecimiento de Mucor
rouxii en fermentadores estándar ha sido descrito en la
literatura. El uso de un hongo como Mucor rouxii
ofrece una serie de ventajas. El organismo se puede hacer crecer
empleando nutrientes económicos. Se puede hacer crecer hasta una
elevada densidad celular (gramos de peso seco celular por litro de
medio de cultivo) en un sistema de fermentación a gran escala. El
tiempo de cultivo requerido para conseguir una elevada densidad
celular es tan reducido como 12 horas/ lote.
Inicialmente, se prepara un extracto celular a
partir de un organismo que produce quitina desacetilasa. Por
ejemplo, si el organismo es un hongo (por ejemplo, Mucor
rouxii) las células de los micelios se rompen en presencia de
un tampón de lisis. El tampón de lisis puede contener inhibidores
de proteasas, otros inhibidores de enzimas de degradación y
estabilizadores para mantener la actividad enzimática y facilitar
su extracción. El material insoluble se elimina de la fase líquida
del lisado, por ejemplo, por filtración o centrifugación.
El extracto celular se somete a una etapa de
oscilación térmica lo que da como resultado el precipitado de las
proteínas no deseadas (es decir, todas las proteínas que no son la
quitina desacetilasa). Por ejemplo, tal como se describe en los
Ejemplos a continuación, se puede incubar el extracto a,
aproximadamente, 50ºC durante un periodo de tiempo de
aproximadamente 15-30 minutos. A continuación, las
proteínas precipitadas se eliminan, por ejemplo, por filtración o
centrifugación.
Es bien sabido que las propiedades de solubilidad
de las proteínas en soluciones con elevadas concentraciones de sales
poseen un amplio rango de variación. Esta diferencia de solubilidad
se puede aprovechar para conseguir la separación de proteínas en
solución precipitando con una elevada fuerza iónica. Para este
propósito, se pueden emplear muchas sales, pero se prefiere el
sulfato amónico debido a que no altera de forma apreciable el pH,
es altamente soluble, y no desestabiliza las proteínas.
Los solicitantes han determinado que una
concentración de sulfato amónico de aproximadamente 2,1 M precipita
de forma eficaz una gran variedad de proteínas a partir de la fase
líquida descrita anteriormente, sin precipitar la quitina
desacetilasa. Las proteínas que precipitan en una concentración de
sulfato amónico de aproximadamente 2,1 M se eliminan de la solución
mediante técnicas estándar (por ejemplo, filtración o
centrifugación).
La fase líquida que se recupera tras la
precipitación con sulfato amónico se somete a una cromatografía de
interacción hidrófoba. La cromatografía de interacción hidrófoba se
emplea de forma generalizada para la purificación de macromoléculas
basándose en la variabilidad de la fuerza de la interacción
hidrófoba con grupos hidrófobos unidos a la matriz de un gel sin
carga. Esta técnica se lleva generalmente a cabo en presencia de
concentraciones moderadamente elevadas de sales
anti-caotrópicas (cromatografía de adsorción con
sales como adyuvantes). Varios factores influyen sobre el
comportamiento cromatográfico de proteínas y péptidos sobre
adsorbentes hidrófobos. Estos factores incluyen la estructura del
ligando, la densidad del ligando, las características de la
muestra, la tasa de flujo, la precipitación con sales, la fuerza
iónica, la temperatura y el pH. Un ejemplo de columna hidrófoba de
resina es la Fenil Sefarosa® 6 de Flujo Rápido. El material retenido
por un adsorbente hidrófobo se elimina de la columna pasando, por
ejemplo, agua a través de la columna.
Tras la cromatografía de interacción hidrófoba,
la solución que contiene la quitina desacetilasa se purifica además
por cromatografía de intercambio iónico. Un intercambiador de iones
es un soporte sólido que tiene grupos cargados unidos químicamente a
los que los iones se unen electrostáticamente. Un grupo cargado
negativamente intercambiará iones positivos y es un intercambiador
de cationes. Un grupo cargado positivamente intercambiará iones
negativos y es un intercambiador de aniones. Los intercambiadores
de iones se pueden caracterizar como intercambiadores de iones
fuertes o débiles. Los intercambiadores fuertes de iones funcionan a
lo largo de un amplio rango de pH, siendo así útiles para aislar
una sustancia débilmente ionizada que requiere un pH muy bajo o muy
alto para su ionización.
El pH del material que se recupera de la columna
hidrófoba se ajusta a aproximadamente 8 y se pasa a través de una
columna de intercambio de aniones fuerte (por ejemplo, Sefarosa® Q
de Flujo Rápido). Las fracciones se recogen y se ensayan para la
actividad desacetilasa tal como se describe a continuación en la
sección de Ejemplificación. Las fracciones que poseen actividad
desacetilasa se juntan y el pH de las fracciones juntadas se ajusta
a aproximadamente 3,5. La solución se pasa entonces a través de una
columna que contiene una resina de intercambio de iones fuerte (por
ejemplo, Sefarosa® S de Flujo Rápido) y se recoge lo que ha fluido a
su través. Cuando se analiza por electroforesis en gel de
poliacrilamida, la fracción que ha atravesado la columna contiene
una especie de proteínas electroforéticamente homogénea. El término
esencialmente pura, tal como se emplea en la presente invención,
hace referencia a una preparación de quitina desacetilasa que se
presenta esencialmente como una banda única cuando se analiza por
electroforesis en gel.
En un segundo procedimiento de purificación, los
solicitantes han empleado una inmunoglobulina purificada que
reacciona específicamente frente a la quitina desacetilasa. Esta
inmunoglobulina, con las propiedades deseadas, se puede sintetizar
inmunizando un animal con quitina desacetilasa esencialmente pura.
La inmunoglobulina con las propiedades deseadas se puede unir a un
soporte sólido para constituir un inmunoadsorbente. Se puede usar
entonces el inmunoadsorbente para purificar la enzima a partir de un
extracto sin refinar mediante procedimientos convencionales.
La quitina desacetilasa, preparada tal como se
describe en la presente invención, se puede emplear en un
procedimiento para convertir la quitina en quitosano. Los parámetros
de la reacción que afectan a la actividad de la enzima se tratan en
los Ejemplos. Previo al descubrimiento que constituye la base del
contenido de la invención, en la profesión era sabido que una
variedad de organismos producen una enzima que es capaz de
desacetilar la quitina convirtiendo de este modo la quitina en
quitosano. Esta enzima, generalmente denominada quitina
desacetilasa, es producida por una variedad de géneros incluyendo,
por ejemplo, Mucor, Phycomyces, Absidia, y
Choanephora. Otros géneros potencialmente útiles incluyen
Zygorhynchus, Actinomucor, Circinella,
Rhizopus, Colletotrichum y Rhizomucor.
Una fuente preferida de quitina desacetilasa es
la pared celular de los micelios fúngicos. Estos micelios son
producen en grandes cantidades como producto secundario en la
industria de la fermentación. El crecimiento de Mucor
rouxii en fermentadores estándar ha sido descrito en la
literatura.
La producción de una enzima con actividad quitina
desacetilasa mediante técnicas de ADN recombinante ofrece una
variedad de ventajas sobre la purificación de la enzima a partir de
un organismo en el que se produce de forma natural. Por ejemplo,
empleando técnicas recombinantes, es posible producir la enzima en
un sistema bien caracterizado como E. coli. El uso de estas
células bacterianas ofrece ventajas de producción cuando se compara
con productores conocidos de quitina desacetilasa como Mucor
rouxii.
Con objeto de producir quitina desacetilasa
mediante técnicas de ADN recombinante, primero es necesario aislar
el gen que codifica para la desacetilasa. El Ejemplo 4, presentado a
continuación, describe los experimentos que se llevaron a cabo con
objeto de efectuar el aislamiento de este gen. La secuencia
aminoterminal de aminoácidos se determinó empleando técnicas
bioquímicas convencionales y analizando una preparación
esencialmente pura de la enzima, preparada tal como se ha descrito
anteriormente. Se determinó la secuencia de ADN y se presenta en la
SEC ID Nº: 1. La secuencia de ADN descrita en la SEC ID Nº: 1 se
puede aislar por los procedimientos que se describen a continuación,
o bien empleando el procedimiento de amplificación por la reacción
en cadena de la polimerasa. Las secuencias de los cebadores que se
han de emplear en esta reacción de amplificación se pueden
determinar haciendo referencia al Listado de Secuencias de ADN que
se encuentra a continuación.
El alcance de la invención abarca una secuencia
aislada de ADN que codifica para una enzima con actividad quitina
desacetilasa, o para un fragmento biológicamente activo de la
misma, que se caracteriza por su capacidad de hibridar con la
secuencia de ADN representada en SEC ID Nº: 1 bajo condiciones de
hibridación restrictivas. Las secuencias de ADN que hibridan con
las secuencias mencionadas bajo condiciones de hibridación
restrictivas, son perfectamente complementarias, o presentan una
elevada homología con la secuencia mencionada. Homología, tal como
se emplea en la presente invención, hace referencia a secuencias de
ADN que difieren de la secuencia mencionada, pero la diferencia no
tiene un efecto sustancial sobre la actividad biológica (es decir,
la actividad desacetilasa) de la proteína codificada. Un posible
conjunto de condiciones de hibridación restrictivas es el siguiente:
formamida al 50%, SSPE 5 X (SSPE 1 X es NaCl 0,15 M,
Na-EDTA 1 mM, Na-fosfato 10 mM, pH
7,0), solución de Denhardt 5 X (polivinilpirrolidona 0,1%, Ficoll
0,1%), a 45º.
La identificación de fragmentos biológicamente
activos de la enzima se puede determinar mediante técnicas
convencionales. Por ejemplo, se pueden generar deleciones en la
construcción que codifica para la enzima. La construcción con la
deleción se expresa entonces y se ensaya para la actividad quitina
desacetilasa.
Las secuencias aisladas de ADN que caen dentro
del alcance de esta invención se pueden emplear para expresar la
desacetilasa codificada, en grandes cantidades, en células huésped
procariotas o eucariotas. Con este propósito, el ADN se inserta en
un vector de expresión procariota o eucariota, con las señales
reguladoras adecuadas, y se emplea para transformar células. Se han
desarrollado anteriormente con este propósito una variedad de
vectores y señales reguladoras adecuados y son bien conocidos por
los expertos en la materia.
Mediante el empleo de técnicas convencionales, la
desacetilasa de esta invención se puede sobreexpresar, por ejemplo,
en E. coli, hasta tal punto que represente una proporción
considerable del total de las proteínas de la célula. La
purificación de una proteína que se expresa en estos considerables
niveles, y para la que está establecido un sistema de ensayo simple,
es una cuestión sencilla para un experto en la materia.
Por otro lado, la invención trata del empleo de
un fragmento de la enzima con actividad quitina desacetilasa en un
procedimiento para convertir quitina en quitosano. En el
procedimiento reivindicado, la quitina se pone en contacto con un
fragmento de la enzima con actividad quitina desacetilasa, siendo
generado el fragmento de enzima por técnicas de ADN recombinante en
las que una secuencia aislada de ADN que codifica para la enzima, un
fragmento con actividad desacetilasa, se expresa a partir de una
construcción de ADN. El alcance de este aspecto de la invención
incluye el empleo de ADN caracterizado por su capacidad para
hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1 en
condiciones de hibridación restrictivas.
La invención se ilustra además mediante los
siguientes Ejemplos.
Mucor rouxii se obtuvo de la
American Type Culture Collection (ATCC 24905). El hongo se hizo
crecer en medio mínimo como describieron
Bartnicki-Garcia y Nickerson (Bacteriol,
84: 841-858 (1962)) en lotes de 16 litros. El
medio se inoculó con 2 x 10^{8} esporas por litro y se agitó y
aireó con aire estéril durante 24 horas a 28ºC. Los micelios se
recogieron en la mitad de la fase logarítmica por filtración. Los
cultivos produjeron aproximadamente 20 gramos de micelios (peso
húmedo) por litro.
Se extrajeron 400 gramos de micelios mezclándolos
con 600 gramos de cuentas de vidrio y 700 ml de tampón de lisis que
contenía Tris HCl 50 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM y PMSF 0,2 mM durante
una hora en hielo. Tras completar la lisis las cuentas de vidrio se
depositaron y se eliminaron, y el extracto se centrifugó durante 30
min a 8000 g a 4ºC. Nos referimos al sobrenadante (750 ml) como el
extracto sin refinar.
A continuación, el extracto sin refinar se incubó
en un baño de agua ajustado a 50ºC durante 30 minutos y el material
precipitado se eliminó por centrifugación a 8000 g durante 30
minutos a 4ºC. El sobrenadante de la incubación a 50º se llevó a 2,1
M en sulfato amónico y las proteínas precipitadas se eliminaron por
centrifugación a 10,000 g durante 45 minutos. El sobrenadante (850
ml) se pasó a través de una columna (44 x 230 mm)
CL-4B de Fenil Sefarosa® equilibrada con Tris HCL 20
mM (pH 7,5) con sulfato amónico 2,1 M. Tras lavar la columna con el
tampón mencionado anteriormente, las proteínas retenidas se eluyeron
con 2100 ml de una concentración de sulfato amónico decreciente en
un gradiente lineal. La tasa de flujo fue de 250 ml/h y se
recogieron fracciones de 14 ml. El perfil de elución se muestra en
la Figura 1. La actividad quitina desacetilasa se detectó en las
fracciones 195-295 que se juntaron para su posterior
purificación. El contenido proteico se evaluó con un monitor UV a
280 nm.
La actividad quitina desacetilasa se estimó
empleando como sustrato quitina parcialmente
O-hidroxietilada (quitina glicol) radiomarcada en
los grupos N-acetilo. La preparación del sustrato
así como las condiciones del ensayo fueron tal como las describieron
Araki e Ito (Eur. J. Biochem. 55:
71-78 (1975)) con las siguientes modificaciones. La
mezcla del ensayo contenía 0,1 mg/ml de BSA tamponada con glutamato
sódico 25 mM a pH 4,5 (50ºC). El tiempo de incubación fue de 30
minutos a 50ºC.
La muestra de quitina desacetilasa parcialmente
purificada de la etapa anterior se dializó frente a Tris HCl 20 mM
(pH 8), y se pasó a través de una columna de Sefarosa® Q de Flujo
Rápido (26 x 340 mm) equilibrada con el mismo tampón. Tras lavar la
columna, se estableció un gradiente lineal de NaCl (2000 ml,
0-0,75 M) tamponado con Tris HCl 20 mM (pH 8). La
tasa de flujo fue de 300 ml/h y se recogieron fracciones de 11,5 ml.
El perfil de elución se muestra en la Figura 2. La actividad quitina
desacetilasa se detectó en las fracciones 105-150
correspondiendo a NaCl \sim0,13 M. Estas fracciones se juntaron
para su posterior procesamiento.
Las fracciones juntadas se dializaron frente a un
tampón de formato sódico 25 mM (pH 3,5), y la muestra se cargó en
una columna de Sefarosa® S de Flujo Rápido (26 x 280 mm) equilibrada
con el mismo tampón. La columna se eluyó con una tasa de flujo de
250 ml/h con un gradiente lineal de NaCl (2000 ml,
0-1,2 M) en el tampón mencionado arriba. Se
recogieron fracciones de 12 ml. El perfil de elución se muestra en
la Figura 3. La mayoría de la actividad quitina desacetilasa no fue
retenida por la columna y se detectó en las fracciones que habían
fluido a través de la columna en una forma homogénea
electroforéticamente.
Los resultados del protocolo de purificación se
resumen en la Tabla 1. La enzima purificada según este procedimiento
se consideró homogénea electroforéticamente, tal como se comprobó
tanto por electroforesis nativa como por SDS-PAGE.
En un gel de SDS poliacrilamida de gradiente (5-20%)
la banda de la enzima migró hasta una distancia que correspondía a
75kDa de peso molecular. Cuando la quitina desacetilasa purificada
se sometió a filtración en gel en Sephacryl® S-200
HR, se eluyó como un único pico con un tamaño aparente de 80 kDa, lo
que indica que la enzima nativa está presente en forma de
monómero.
^{a}Se definió una unidad de actividad de la
enzima como la cantidad de enzima requerida para producir 1 \mumol
de ácido acético por minuto cuando se incubaba con 48 \mug de
quitina glicol en condiciones óptimas de pH (4,5) y temperatura
(50ºC).
Varias pruebas sugieren que la quitina
desacetilasa es una glicoproteína. Tras la electroforesis, la banda
de la enzima se tiñó positivamente con el reactivo periodato de
Schiff en los geles de poliacrilamida. La enzima fue retenida en una
columna de concanavalina A-Sefarosa® 4B y se
recuperó como un pico único por elución con un gradiente de
\alpha-metil manósido en un punto que corresponde
aproximadamente con 25 mM. Tal como se muestra en la Tabla 2, el
análisis directo de hidratos de carbono de la enzima reveló que la
proteína contiene 6 residuos de fucosa, 85 residuos de manosa y 22
residuos de N-acetilglucosamina por molécula,
contribuyendo aproximadamente en un 30% a su peso molecular. No se
encontraron ácido siálico ni otros azúcares en cantidades
significativas.
El análisis de monosacáridos se llevó a cabo por
cromatografía gas-líquido y cromatografía
gas-líquido-espectrometría de masas.
La mezcla se hidrolizó con ácido trifluoroacético 4M a 100ºC
durante 4 horas. La relación molar de hidratos de carbono por
molécula se estimó mediante el análisis directo de la composición de
hidratos de carbono y aminoácidos.
Hidrato de carbono | Mol/mol de proteína | Entero más próximo |
Fucosa | 5,81 | 6 |
Manosa | 81,92 | 82 |
N-Acetilglucosamina | 20,73 | 21 |
Ácido siálico | 0 |
Con objeto de determinar el tamaño de la cadena
de polipéptidos de la quitina desacetilasa de una forma alternativa,
se tradujo el ARNm que codifica la enzima in vitro seguido de
inmunoprecipitación. El ARNm se extrajo de los micelios (15 g de
peso húmedo) recogidos al inicio de la fase logarítmica mediante
pulverización con nitrógeno líquido. El ARNm se purificó por el
procedimiento de tiocianato de guanidinio de Chirwin y col.
(Biochem. 18: 5294-5299 (1979)) y se
pelleteó a continuación con cloruro de cesio por
ultracentrifugación. El Poly (A)^{+} ARN (\sim 120
\mug) se aisló mediante 3 pases a través de una columna de
oligo(dT)-celulosa tal como describieron Aviv
y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69:
1408-1412 (1972)). La traducción in vitro del
ARNm total se realizó empleando lisado de eritrocitos de conejo
tratado con nucleasas de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. El producto de la traducción in vitro se marcó
con ^{35}S-metionina.
El antisuero policlonal se preparó emulsificando
quitina desacetilasa pura (500 \mug, 1mg/ml en PBS) con un volumen
igual del adyuvante completo de Freund. La mezcla se inyectó por vía
intradérmica en un conejo tras extraer suero previamente a la
inmunización. El animal fue reinmunizado, y se le extrajo sangre, a
las cuatro y a las seis semanas con 200 \mug de enzima en
adyuvante incompleto de Freund, también inyectado por vía
intradérmica. Los antisueros obtenidos se monitorizaron para la
presencia de anticuerpos anti-quitina desacetilasa
por ELISA y por ensayos de inhibición de la actividad de la
enzima.
Tras completar la reacción de traducción in
vitro, se añadieron 10 \mul del suero extraído antes de la
inmunización y la reacción se incubó durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Los complejos
antígeno-anticuerpo se eliminaron por centrifugación
tras adsorción a 10 \mul de Proteína A-Sefarosa®
añadidos a la reacción. El antisuero policlonal específico
(10\mul) se añadió entonces al sobrenadante que se incubó a
continuación tal como se ha descrito anteriormente. Los nuevos
complejos antígeno-anticuerpo se recogieron
empleado Proteína A-Sefarosa® por centrifugación y
se lavaron tres veces con 20 volúmenes de Tris HCl 25 mM (pH 7,5),
NaCl 150 mM resuspendiendo y pelleteando. Los inmunoprecipitados se
hirvieron durante 5 minutos en tampón de carga
SDS-PAGE y se analizaron por electroforesis en gel.
El gel se fijó durante 30 minutos en ácido acético al 10%, metanol
30%, se incubó durante 30 minutos en EN^{3}HANCE® (New England
Nuclear) y se secó y expuso.
Los productos de la traducción in vitro se
analizaron en un gel de poliacrilamida SDS al 12% seguido de
autoradiografía. El material inmunoprecipitado por el antisuero
específico mostró una banda que correspondía a un peso molecular de
\sim49000 kDa, lo que representa el tamaño de la cadena
polipeptídica antes de cualquier modificación
post-traduccional.
La temperatura óptima de la actividad de la
enzima se estimó en \sim50ºC empleando quitina glicol marcada,
como sustrato tal como se ha descrito arriba. La dependencia de la
temperatura de la actividad quitina desacetilasa se muestra en el
gráfico de la Figura 1. El pH óptimo se estimó en \sim4,5, probado
con una combinación de tampones superpuestos, tal como se muestra en
el gráfico de la Figura 2. Cuando la quitina desacetilasa (5 mU) se
incubó con 1 mg de quitosano parcial y químicamente desacetilado
(81%) durante una hora, generó 0,22 \mumoles de ácido acético, lo
que corresponde a un incremento de \sim5,3% en el grado de
desacetilación. La enzima también fue activa sobre quitina
microcristalina (quitina coloidal) y carboximetil quitina (derivado
soluble).
La composición de aminoácidos de la quitina
desacetilasa se muestra en la Tabla 3. Los aminoácidos básicos sólo
suponen un \sim8% del total de aminoácidos, un valor un \sim40%
menor que la media.
La composición de aminoácidos de la quitina
desacetilasa purificada se determinó tras 24 horas de hidrólisis con
HCl 6M a 100ºC. Los valores son la media de dos determinaciones
distintas de la muestra. El número de residuos por molécula de
proteína se basa en el peso molecular estimado de 49000 Da de l
SDS-PAGE del producto inmunoprecipitado procedente
de la traducción in vitro del ARNm.
Se inmunizó un conejo macho adulto de Nueva
Zelanda blanco con 500 \mug (1 mg/ml en PBS) de quitina
desacetilasa purificada, preparada tal como se describe en el
Ejemplo 1, a partir de Mucor rouxii. La enzima se
emulsificó con un volumen igual de adyuvante completo de Freund en
un volumen total de 1 ml, y se administró al animal por vía
intradérmica. Se administraron tres dosis más de refuerzo, de 150
\mug de quitina desacetilasa emulsificada en adyuvante incompleto
de Freund, a intervalos de 4 semanas. Extracciones de sangre de la
vena marginal de la oreja se emplearon para monitorizar el título de
anticuerpos en suero por ELISA. Previo a la inmunización, se extrajo
suero control.
La especificidad del antisuero producido se
analizó en un ensayo de inhibición de quitina desacetilasa. La
actividad quitina desacetilasa se ensayó midiendo la radioactividad
de [^{3}H]-ácido acético liberado a partir de un derivado de la
quitina soluble en agua, quitina glicol
[acetil-^{3}H]. La mezcla de la reacción contenía
48 \mug de quitina glicol [acetil-^{3}H],
cloruro de magnesio 1 mM, 0,1 mg/ml de BSA y se tamponó con
glutamato sódico 25 mM (pH 4,5) en un volumen total de 50 \mul.
Tras incubar a 50ºC durante 15 minutos, la reacción se detuvo
añadiendo 16 \mul de HCl, 4 \mul de ácido acético y 80 \mul de
agua. Se añadió acetato de etilo (0,5 ml) a la muestra, y la mezcla
se agitó con fuerza en un vórtex durante 5 minutos y se centrifugó a
14000 rpm. Se añadieron 4,5 ml de una mezcla de líquido de centelleo
basado en el tolueno a 200 \mul de la solución de la fase orgánica
y se agitó todo. La solución se transfirió a un vial y se midió su
radioactividad en un contador de centelleo líquido. Una unidad de
enzima libera 1,0 \mumol de ácido acético a partir de quitina
glicol por minuto en las condiciones descritas anteriormente. La
actividad específica se definió como las unidades de enzima por
miligramo de proteína. La proteína se ensayó por el llamado
procedimiento de Lowry empleado albúmina sérica bovina como
patrón.
El título de anticuerpos se monitorizó por ELISA
no competitivo. Se revistieron placas de microvaloración con quitina
desacetilasa (Maxi Sorp, Nunc, Dinamarca) a 2 \mug/ml de tampón
"revestimiento" (pH 9,6), con carbonato sódico 0,05 M y
bicarbonato sódico, incubando toda la noche a 4ºC. Los pocillos se
lavaron con una solución acuosa de Tween 80 al 0,05% seguido de dos
lavados con agua destilada. Después de esto, se incubaron 200 \mul
de agente bloqueante por pocillo durante 1 hora a temperatura
ambiente. El agente bloqueante era 1 g de albúmina sérica bovina
disuelta en 100 ml de PBS 0,010 M (pH 7,4). Los pocillos se lavaron
al igual que la vez anterior. Se empleó un anticuerpo IgG
anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano
picante para detectar, de forma indirecta, las IgG específicas
unidas a la quitina desacetilasa pegada a los pocillos. El conjugado
se diluyó 10,000 veces en PBS 0,010 M (pH 7,4) y se incubó a 100
\mul por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Los
pocillos se lavaron con una solución de H_{2}O/Tween 80 como
anteriormente, seguido de dos lavados con agua destilada. Los
pocillos se aspiraron y se incubaron con 100 \mul de la solución
sustrato/cromógeno preparada justo antes de su uso como sigue: La
reacción se detuvo tras 15 minutos, añadiendo 50 \mul de ácido
sulfúrico 4M por pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm empleando
un lector de ELISA. La actividad enzimática de una cantidad
determinada de quitina desacetilasa purificada se midió tras la
incubación con varias cantidades de antisuero. Estos experimentos
confirmaron que un componente del antisuero era reactivo de forma
específica frente a la quitina desacetilasa.
La IgG se purificó por afinidad a partir de suero
de conejo empleando quitina desacetilasa unida a Sefarosa 4B
activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia Ltd.) de acuerdo con
las instrucciones de fabricante. Una solución que contenía diez
miligramos de quitina desacetilasa purificada se dializó frente a 2
l de "tampón de acoplamiento" (pH 8,3), que contenía
bicarbonato sódico 0,1M y cloruro sódico 0,5 M. Se mezcló Sefarosa
4B previamente expandida, activada con bromuro de cianógeno y
equilibrada con tampón de acoplamiento con quitina desacetilasa (1,4
mg de proteína/ml de gel) durante toda la noche a 4ºC manteniendo la
mezcla en rotación. Esta mezcla se transfirió a un embudo de vidrio
y se aspiró por vacío. El fluido se recuperó y se ensayó para la
proteína para evaluar la eficiencia del acoplamiento. El gel se lavó
a conciencia con tampón de acoplamiento y se mezcló como
anteriormente durante 2 horas con tampón Tris HCl (0,1 M, pH 8,0) a
temperatura ambiente. El gel se aspiró y se lavó con tampón de
acoplamiento. La proteína adsorbida no covalentemente al gel se
eliminó lavando el gel alternando tampones de pH bajo (acetato de
sodio 0,1 M, cloruro sódico 0,5 M, pH 4,0) y alto (Tris 0,1 M,
cloruro sódico 0,5 M, pH 8,3). La Sefarosa 4B unida a quitina
desacetilasa se transfirió a una mini-columna y se
lavó con Tris-HCl 0,025 M (pH 7,4) que contenía
azida sódica 0,02% para su almacenamiento a 4ºC. La concentración de
anticuerpo en solución se puede estimar midiendo la A_{280}
empleando un coeficiente de extinción medio del anticuerpo de 1,4
para 1 mg.ml^{-1} de proteína empleando una célula con una
longitud de recorrido de 1 cm.
El antisuero de conejo frente a la quitina
desacetilasa obtenido en distintas extracciones de sangre se
precipitó por separado con sulfato amónico al 40% de saturación. La
inmunoglobulina que contenía precipitados se disolvió y dializó
ampliamente frente a Tris 0,025 M (pH 7,4), cloruro sódico 0,2 M y
se pasó subsecuentemente a través de la columna de Sefarosa 4B unida
a quitina desacetilasa (incluyendo inhibidores de proteasas). El gel
se lavó con diez volúmenes de la columna de Tris 0,025 M, cloruro
sódico 0,1 M (pH 7,4), hasta que las fracciones recogidas daban
lecturas insignificantes a 280 nm. Las proteínas unidas
inespecíficamente se eluyeron con Tris 0,025 M, cloruro sódico 1 M,
pH 7,4. Un lote de IgG se eluyó con dos volúmenes de la columna de
tampón glicina-ácido clorhídrico 0,1 M (pH 2,8). Otro lote más de
IgG de mayor afinidad se eluyó con dos volúmenes de la columna de
glicina-ácido clorhídrico 0,2 M, pH 2,2. El término afinidad, tal
como se emplea en la presente invención, hace referencia a la
afinidad funcional (avidez) con la que se emplearon los anticuerpos
policlonales. Todas las fracciones se ajustaron inmediatamente a pH
7,0 con Tris-HCl 1 M (pH 9,0). Las dos poblaciones
de fracciones de IgG se reunieron por separado y se concentraron por
ultrafiltración previo a la diálisis frente a Tris 0,025 m (pH 7,4).
La IgG específica purificada muestra el patrón característico de la
IgG de conejo en SDS-PAGE. La IgG específica pura se
almacena a -20ºC a una concentración > 1 mg/ml en Tris 0,010 M,
cloruro sódico 0,1 M (pH 7,4).
El acoplamiento de la quitina desacetilasa a
Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno tuvo una eficacia del
90%, produciendo Sefarosa 4B unida a quitina desacetilasa a 1,4 mg
de quitina desacetilasa/ml de gel. Por el procedimiento presentado
aquí, aproximadamente 2,0-6,5 mg de IgG específica
pura fueron aislados por cada 10 ml de antisuero con la elución de
pH 2,8 (2,0% a 5,0% de proteína total tras la precipitación con
sulfato amónico). La IgG específica aislada total representa 4,5% a
8,0% de la proteína total tras la precipitación con sulfato amónico.
La capacidad de unión de la Sefarosa 4B unida a quitina desacetilasa
al anticuerpo anti-quitina desacetilasa se determinó
en 1,4 mg de IgG/ml de gel.
Micelios congelados (2 gramos), preparados tal
como se describe en el Ejemplo 1, se descongelaron, disgregaron y
homogeneizaron en 10 ml de tampón Tris-HCl 0,05 M
(pH 7,4) que contenía PMSF 0,5 mM, NEM 0,1 mM y NaCl 150 mM,
empleando una improvisada fresadora de cuentas de vidrio (2 gramos
de cuentas de vidrio por gramo de micelios en peso húmedo). Todas
las etapas se realizaron a 4ºC. Esto dio lugar a un producto
homogéneo que se centrifugó a 10,000 rpm durante 30 minutos a 4ºC.
El sobrenadante (12,2 ml; 4,6 mg/ml; 56,0 mg) se denomina extracto
sin refinar. El extracto se incubó entonces en un baño de agua
ajustado a 50ºC durante 15 minutos y se enfrió rápidamente en hielo.
Las proteínas precipitadas se eliminaron por centrifugación a 35,000
rpm durante 45 minutos a 4ºC.
Cinco miligramos de la IgG de conejo pura de
menor afinidad, descrita en el Ejemplo 2, se dializaron frente al
tampón de acoplamiento (pH 8,3) y se mezclaron con 5 ml de Sefarosa
4B expandida y activada con CNBr para preparar un inmunoadsorbente.
La IgG se acopló mediante el procedimiento descrito para el
acoplamiento de quitina desacetilasa. El acoplamiento de IgG a
Sefarosa 4B activada fue eficaz en un 85%, produciendo Sefarosa
unida a IgG a 1 mg de IgG/ml de gel. Este inmunoadsorbente se empleó
para la purificación de quitina desacetilasa.
El sobrenadante descrito arriba (11,5 ml; 0,54
mg/ml; 6,2 mg) se cargó sobre el inmunoadsorbente (compactado en una
columna de dimensiones 2 x 1,6 cm; 5 ml) previamente equilibrada con
tampón Tris-HCl 25 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 150
mM (tampón A). La columna se lavó con tampón A hasta que ya no se
evidenció absorción a 280 nm en los efluyentes (las proteínas unidas
inespecíficamente se eluyeron con Tris-HCl 25 mM pH
7,4, NaCl 1M). La quitina desacetilasa unida específicamente se
eluyó empleando tampón glicina-HCl 0,2 M (pH 2,8) a
una tasa de flujo de 35 ml/h. La fracción eluida se ajustó
inmediatamente a pH 7,0 con Tris-HCl 1M pH 9,0, se
dializó frente a tampón A y se concentró por ultrafiltración (300
\mul, 40 \mug/ml; 12 \mug; 180 mU).
La purificación de quitina desacetilasa por
inmunoadsorción (tabla 4) produjo una actividad específica de 1500 m
unidades/mg para la enzima adsorbida y un rendimiento de
aproximadamente 30%. La evaluación de la pureza de la quitina
desacetilasa por SDS-PAGE muestra una única banda.
La purificación de quitina desacetilasa mediante procedimientos
convencionales (tabla 1) produjo una enzima pura con una actividad
específica de 3,23 unidades/mg y un rendimiento de 11,8%. La
capacidad máxima de unión del inmunoadsorbente de determinó en 42
\mug de quitina desacetilasa/ml de gel (4% de los sitios de unión
del antígeno permanecen disponibles para unir antígeno tras la unión
covalente a la matriz).
Una preparación purificada de quitina
desacetilasa se sometió al análisis de la secuencia aminoterminal de
aminoácidos mediante técnicas convencionales. Basándose en la
información sobre la secuencia de aminoácidos, se sintetizaron
oligonucleótidos degenerados y un clon de ADNc correspondiente al
ARNm de la quitina desacetilasa se aisló de una librería de ADNc de
Mucor rouxii. La secuencia de ADNc se determinó y esta
secuencia se muestra en SEC ID Nº: 1.
Una búsqueda en la base de datos EMBL empleando
la secuencia de aminoácidos deducida de la quitina desacetilasa
reveló semejanzas significativas en la secuencia con proteínas nodB
de varias especies rhizobiales. Múltiples alineamientos de
secuencias empleando todas las secuencias conocidas de la proteína
nodB y la secuencia de la quitina desacetilasa hicieron resaltar las
semejanzas más significativas.
La secuencia de la proteína nodB (\sim215
aminoácidos de longitud) está bien conservada entre todas la
especies rhizobiales estudiadas, siendo idéntica entre
37-67% y con semejanzas globales de
55-78%. La quitina desacetilasa es un polipéptido
mucho más largo (400 aminoácidos) y la región que muestra homología
con los productos del gen nodB (hasta un 31% idéntica, 50% de
semejanza) se localiza en la parte central de la molécula. El
extremo aminoterminal (aminoácidos 1-121) y el
carboxiterminal están conservados en un (\approx50%) en la quitina
desacetilasa. Por el contrario, seis de los nueve sitos de
N-glicosilación pronosticados se encuentran en los
dominios no conservados de la quitina desacetilasa sugiriendo que
estos dominios glicosilados pueden ser importantes para la función
específica de la enzima en la biosíntesis de la pared celular.
Los expertos en la materia sabrán, o podrán
determinar, empleando experimentos de rutina sin más, muchos
equivalentes de las formas de realización específicas de la
invención descritas aquí. Se entiende que se abarcan éstos y todos
los demás equivalentes en las siguientes reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Thireos, George
Kafetzopoulos, Dimitris
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN QUE CODIFICA PARA LA
QUITINA DESACETILASA
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Two Militia Drive
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lexington
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02173
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- SOPORTE LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquette
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patente In Release #1,0, versión #1,25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA ACTUAL SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Brook, David E.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 22,592
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/ NÚMERO DE EXPEDIENTE: BTT91-01A
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 617 861-6240
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FAX: 617 861-9540
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1203 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
Claims (11)
1.Una secuencia aislada de ADN que codifica para
una enzima con actividad quitina desacetilasa presente en
Mucor rouxii, que cataliza la conversión de quitina en
quitosano, caracterizándose la secuencia de ADN por la
secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1.
2. Una secuencia aislada de ADN que codifica para
una enzima con actividad quitina desacetilasa o una porción que
codifica para un fragmento de la enzima con actividad quitina
desacetilasa, caracterizándose la secuencia de ADN por la
capacidad de hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC
ID Nº: 1 en condiciones de hibridación restrictivas.
3. Un construcción para la expresión de ADN que
codifica para una enzima presente en Mucor rouxii que
cataliza la conversión de quitina en quitosano o para un fragmento
de la misma, con actividad quitina desacetilasa, teniendo la enzima
la secuencia de ADN de la reivindicación 1.
4. Un construcción para la expresión de ADN que
comprende una secuencia de ADN que codifica para una enzima con
actividad quitina desacetilasa, caracterizándose la secuencia
de ADN por la capacidad de hibridar con la secuencia de ADN
representada en la SEC ID Nº: 1 en condiciones de hibridación
restrictivas.
5. Uso del fragmento de una enzima con actividad
quitina desacetilasa en un procedimiento para la conversión de
quitina en quitosano, que comprende el contacto de la quitina con el
fragmento de la enzima, siendo generado el fragmento de la enzima
por técnicas de ADN recombinante en las que una secuencia aislada de
ADN que codifica para el fragmento de una enzima con actividad
desacetilasa de acuerdo con la reivindicación 2 se expresa a partir
de una construcción para la expresión de ADN.
6. El uso de la reivindicación 5, en el que la
secuencia aislada de ADN que codifica para el fragmento de enzima
con actividad quitina desacetilasa, se caracteriza por la
capacidad de hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC
ID Nº: 1 en condiciones de hibridación restrictivas.
7. Una célula transformada con una construcción
de expresión de ADN recombinante de la reivindicación 3 o la
reivindicación 4.
8. Una célula de la reivindicación 7, en la que
la secuencia de ADN que codifica para la enzima con actividad
quitina desacetilasa se caracteriza por la capacidad de
hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1 en
condiciones restrictivas de hibridación.
9. Una célula de la reivindicación 7, que es
procariota.
10. Una célula de la reivindicación 9, que es
E. coli.
11. Una célula de la reivindicación 7, que es
eucariota.
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JP3030431B2 (ja) * | 1997-12-02 | 2000-04-10 | 農林水産省食品総合研究所長 | キチン脱アセチル化酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 |
DE10111083B4 (de) * | 2001-03-08 | 2006-06-22 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Chitindeacetylase und Verfahren zu seiner Herstellung |
EP2140009A2 (en) | 2007-03-29 | 2010-01-06 | CBD Technologies Ltd. | Transgenic plants containing soluble cell wall polysaccharides |
DE102007024085A1 (de) * | 2007-05-22 | 2008-11-27 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Nukleinsäuremoleküle codierend für ein Protein mit Deacetylase-Aktivität, besagtes Protein, sowie Verfahren zur Herstellung von Chitosan |
KR100914475B1 (ko) * | 2007-05-23 | 2009-08-28 | 전남대학교산학협력단 | 신규한 모티에렐라 sp. DY-52 균주, 그로부터 생산되는키틴 탈아세틸화효소, 및 그들의 용도 |
KR101831918B1 (ko) * | 2010-06-11 | 2018-02-27 | 한국원자력의학원 | 히알루론산의 탈아세틸화 가수분해효소, 및 이에 의해 탈아세틸화된 히알루론산 및 이의 유도체 |
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