ES2206466T3

ES2206466T3 - Adn codificante de quitina desacetilasa.

Info

Publication number: ES2206466T3
Application number: ES94902736T
Authority: ES
Inventors: George Thireos; Dimitri Kafetzopoulos
Original assignee: Institute for Molecular Biology and Biotechnology/FORTH
Current assignee: Institute for Molecular Biology and Biotechnology/FORTH
Priority date: 1992-12-07
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2013-12-07
Also published as: WO1994013815A1; US5525502A; EP0673425A1; DK0673425T3; DE69333185T2; DE69333185D1; AU5698494A; JPH09501301A; EP0673425B1; KR100351345B1; KR950704498A; ATE248919T1; CA2151257A1; AU663991B2

Abstract

SE HA DESCUBIERTO UNA SECUENCIA DE DNA DE UNA ENZIMA PRESENTE EN MUCOR ROUXII QUE CATALIZA LA CONVERSION DE CITINA EN CITOSAN (ES DECIR, TENIENDO UNA ACTIVIDAD DE ACETILASA DE CITINA). DICHA SECUENCIA DE DNA PUEDE CODIFICAR UNA PROTEINA RIZOBIAL NODB, QUE MUESTRA ALGUNA HOMOLOGIA CON LA DEACETILASA DE CITINA DEL INVENTO.

Description

ADN codificante de quitina desacetilasa.

Antecedentes de la invención

Después de la celulosa, la quitina es el material biológico renovable, más fácilmente obtenible y más abundante en el mundo. Es un producto natural sintetizado por una amplia variedad de organismos. Se producen varios miles de millones de toneladas de este material al año. La quitina es un polímero de hidratos de carbono, el polímero N-acetilado de la N-acetilglucosamina con enlaces \beta(1\rightarrow4), o la poli-N-acetil glucosamina. En las plantas, la quitina es un constituyente de la pared celular que reemplaza a la celulosa o que se presenta a veces junto con la celulosa. En los animales, la quitina se organiza normalmente en forma de cutícula en una de las capas de tejido epitelial. Aunque es estructuralmente similar a la celulosa, la quitina tiene propiedades químicas claramente diferentes. Es un material extremadamente insoluble, con una aplicación industrial limitada.

El derivado desacetilado de la quitina, el quitosano, es un material mucho más tratable con un amplio e impresionante conjunto de aplicaciones prácticas. El quitosano está cargado positivamente, pudiendo así ser empleado como agente precipitante de proteínas y como agente quelante de metales. Puede ser formulado en forma de solución, gel, membrana, película o fibra. Tales formulaciones son útiles, por ejemplo, en las áreas de recuperación de materiales preciosos, protección de cultivos, cromatografía e inmovilización enzimática. El quitosano es un material biológicamente benigno, no inmunogénico, lo que lo convierte en ideal para su uso en las industrias agrícola, alimentaria, farmacéutica y cosmética. Puede formar complejos con otros polímeros naturales, como el colágeno y la queratina, para formar materiales con propiedades biomédicas únicas. Estos materiales se pueden emplear, por ejemplo, como aceleradores de la curación de heridas, como componentes de piel y vasos sanguíneos artificiales, como anticoagulantes, y como vehículos para el control de la liberación de medicamentos.

Actualmente, la mayoría del quitosano producido en todo el mundo se prepara a partir de material proveniente del caparazón de los crustáceos. La quitina compone aproximadamente el 20-50% del peso seco de la cutícula de los de crustáceos, siendo el resto principalmente carbonato cálcico, fosfato cálcico y otras proteínas. La quitina se aísla primero tratando el caparazón molido de los crustáceos con un ácido y un álcali diluidos para eliminar las proteínas y los minerales. A continuación, la quitina sin refinar se desacetila exponiéndola a un álcali concentrado, a una temperatura elevada para generar quitosano. Aunque el quitosano producido de esta forma tiene muchas características útiles, es imposible controlar de forma eficaz el proceso de producción, lo que lleva a la producción de un material con un amplio rango de peso molecular y un grado de desacetilación heterogéneo. Este producto no es de gran valor, ya que muchas de las importantes y potenciales aplicaciones, sobre todo en el área biomédica, requieren un material uniforme, con unas propiedades físicas y químicas muy específicas.

Resumen de la invención

El objeto de la invención se refiere a una secuencia de ADN aislada que codifica para una enzima que cataliza la conversión de quitina en quitosano. Unas formas de realización específicas incluyen secuencias de ADN que se caracterizan por su capacidad para hibridar con la secuencia de ADN representada en SEC ID Nº: 1, en condiciones de hibridación restrictivas y que codifican una enzima con actividad quitina desacetilasa. La invención también trata de una construcción de ADN para su expresión que codifica una enzima con la especificidad descrita anteriormente, o porciones biológicamente activas de la misma.

La invención también trata de un procedimiento para convertir quitina en quitosano poniendo en contacto la quitina con la enzima mencionada anteriormente con actividad quitina desacetilasa. En este procedimiento, la enzima se genera por técnicas de ADN recombinante en las que una secuencia aislada de ADN que codifica para la enzima, o uno de los fragmentos biológicamente activos de la misma, se expresa a partir de una construcción de ADN.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama que representa el perfil de elución de una columna de Fenil Sefarosa® CL-4B.

La Figura 2 es un diagrama que representa el perfil de elución de una columna de Sefarosa® Q de Flujo Rápido.

La Figura 3 es un diagrama que representa el perfil de elución de una columna de Sefarosa® S de Flujo Rápido.

La Figura 4 es un diagrama que representa la dependencia de la temperatura de la actividad quitina desacetilasa.

La Figura 5 es un diagrama que representa la dependencia del pH de la actividad quitina desacetilasa.

La Figura 6 es un diagrama que representa la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos que se deduce de ella de la quitina desacetilasa de Mucor rouxii. La secuencia de ADN también se muestra en la SEC ID Nº: 1. La secuencia de aminoácidos que se deduce se denominará en lo sucesivo SEC ID Nº: 2.

Descripción detallada de la invención i) Purificación de la quitina desacetilasa

La presente invención fue posible gracias al descubrimiento de un procedimiento para la purificación de quitina desacetilasa a partir de un extracto celular de un organismo productor de quitina desacetilasa. La enzima quitina desacetilasa es producida por una variedad de géneros que incluyen, por ejemplo, Mucor, Phycomyces, Absidia y Choanephora. Otros géneros potencialmente útiles incluyen Zygorhynchus, Actinomucor, Circinella, Rhizopus, Colletotrichum y Rhizomucor.

Una fuente preferida de quitina desacetilasa es la pared celular de los micelios fúngicos. Estos micelios se producen en grandes cantidades como producto secundario en la industria de la fermentación. El crecimiento de Mucor rouxii en fermentadores estándar ha sido descrito en la literatura. El uso de un hongo como Mucor rouxii ofrece una serie de ventajas. El organismo se puede hacer crecer empleando nutrientes económicos. Se puede hacer crecer hasta una elevada densidad celular (gramos de peso seco celular por litro de medio de cultivo) en un sistema de fermentación a gran escala. El tiempo de cultivo requerido para conseguir una elevada densidad celular es tan reducido como 12 horas/ lote.

Inicialmente, se prepara un extracto celular a partir de un organismo que produce quitina desacetilasa. Por ejemplo, si el organismo es un hongo (por ejemplo, Mucor rouxii) las células de los micelios se rompen en presencia de un tampón de lisis. El tampón de lisis puede contener inhibidores de proteasas, otros inhibidores de enzimas de degradación y estabilizadores para mantener la actividad enzimática y facilitar su extracción. El material insoluble se elimina de la fase líquida del lisado, por ejemplo, por filtración o centrifugación.

El extracto celular se somete a una etapa de oscilación térmica lo que da como resultado el precipitado de las proteínas no deseadas (es decir, todas las proteínas que no son la quitina desacetilasa). Por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos a continuación, se puede incubar el extracto a, aproximadamente, 50ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 15-30 minutos. A continuación, las proteínas precipitadas se eliminan, por ejemplo, por filtración o centrifugación.

Es bien sabido que las propiedades de solubilidad de las proteínas en soluciones con elevadas concentraciones de sales poseen un amplio rango de variación. Esta diferencia de solubilidad se puede aprovechar para conseguir la separación de proteínas en solución precipitando con una elevada fuerza iónica. Para este propósito, se pueden emplear muchas sales, pero se prefiere el sulfato amónico debido a que no altera de forma apreciable el pH, es altamente soluble, y no desestabiliza las proteínas.

Los solicitantes han determinado que una concentración de sulfato amónico de aproximadamente 2,1 M precipita de forma eficaz una gran variedad de proteínas a partir de la fase líquida descrita anteriormente, sin precipitar la quitina desacetilasa. Las proteínas que precipitan en una concentración de sulfato amónico de aproximadamente 2,1 M se eliminan de la solución mediante técnicas estándar (por ejemplo, filtración o centrifugación).

La fase líquida que se recupera tras la precipitación con sulfato amónico se somete a una cromatografía de interacción hidrófoba. La cromatografía de interacción hidrófoba se emplea de forma generalizada para la purificación de macromoléculas basándose en la variabilidad de la fuerza de la interacción hidrófoba con grupos hidrófobos unidos a la matriz de un gel sin carga. Esta técnica se lleva generalmente a cabo en presencia de concentraciones moderadamente elevadas de sales anti-caotrópicas (cromatografía de adsorción con sales como adyuvantes). Varios factores influyen sobre el comportamiento cromatográfico de proteínas y péptidos sobre adsorbentes hidrófobos. Estos factores incluyen la estructura del ligando, la densidad del ligando, las características de la muestra, la tasa de flujo, la precipitación con sales, la fuerza iónica, la temperatura y el pH. Un ejemplo de columna hidrófoba de resina es la Fenil Sefarosa® 6 de Flujo Rápido. El material retenido por un adsorbente hidrófobo se elimina de la columna pasando, por ejemplo, agua a través de la columna.

Tras la cromatografía de interacción hidrófoba, la solución que contiene la quitina desacetilasa se purifica además por cromatografía de intercambio iónico. Un intercambiador de iones es un soporte sólido que tiene grupos cargados unidos químicamente a los que los iones se unen electrostáticamente. Un grupo cargado negativamente intercambiará iones positivos y es un intercambiador de cationes. Un grupo cargado positivamente intercambiará iones negativos y es un intercambiador de aniones. Los intercambiadores de iones se pueden caracterizar como intercambiadores de iones fuertes o débiles. Los intercambiadores fuertes de iones funcionan a lo largo de un amplio rango de pH, siendo así útiles para aislar una sustancia débilmente ionizada que requiere un pH muy bajo o muy alto para su ionización.

El pH del material que se recupera de la columna hidrófoba se ajusta a aproximadamente 8 y se pasa a través de una columna de intercambio de aniones fuerte (por ejemplo, Sefarosa® Q de Flujo Rápido). Las fracciones se recogen y se ensayan para la actividad desacetilasa tal como se describe a continuación en la sección de Ejemplificación. Las fracciones que poseen actividad desacetilasa se juntan y el pH de las fracciones juntadas se ajusta a aproximadamente 3,5. La solución se pasa entonces a través de una columna que contiene una resina de intercambio de iones fuerte (por ejemplo, Sefarosa® S de Flujo Rápido) y se recoge lo que ha fluido a su través. Cuando se analiza por electroforesis en gel de poliacrilamida, la fracción que ha atravesado la columna contiene una especie de proteínas electroforéticamente homogénea. El término esencialmente pura, tal como se emplea en la presente invención, hace referencia a una preparación de quitina desacetilasa que se presenta esencialmente como una banda única cuando se analiza por electroforesis en gel.

En un segundo procedimiento de purificación, los solicitantes han empleado una inmunoglobulina purificada que reacciona específicamente frente a la quitina desacetilasa. Esta inmunoglobulina, con las propiedades deseadas, se puede sintetizar inmunizando un animal con quitina desacetilasa esencialmente pura. La inmunoglobulina con las propiedades deseadas se puede unir a un soporte sólido para constituir un inmunoadsorbente. Se puede usar entonces el inmunoadsorbente para purificar la enzima a partir de un extracto sin refinar mediante procedimientos convencionales.

La quitina desacetilasa, preparada tal como se describe en la presente invención, se puede emplear en un procedimiento para convertir la quitina en quitosano. Los parámetros de la reacción que afectan a la actividad de la enzima se tratan en los Ejemplos. Previo al descubrimiento que constituye la base del contenido de la invención, en la profesión era sabido que una variedad de organismos producen una enzima que es capaz de desacetilar la quitina convirtiendo de este modo la quitina en quitosano. Esta enzima, generalmente denominada quitina desacetilasa, es producida por una variedad de géneros incluyendo, por ejemplo, Mucor, Phycomyces, Absidia, y Choanephora. Otros géneros potencialmente útiles incluyen Zygorhynchus, Actinomucor, Circinella, Rhizopus, Colletotrichum y Rhizomucor.

Una fuente preferida de quitina desacetilasa es la pared celular de los micelios fúngicos. Estos micelios son producen en grandes cantidades como producto secundario en la industria de la fermentación. El crecimiento de Mucor rouxii en fermentadores estándar ha sido descrito en la literatura.

ii) Producción de quitina desacetilasa por técnicas de ADN recombinante

La producción de una enzima con actividad quitina desacetilasa mediante técnicas de ADN recombinante ofrece una variedad de ventajas sobre la purificación de la enzima a partir de un organismo en el que se produce de forma natural. Por ejemplo, empleando técnicas recombinantes, es posible producir la enzima en un sistema bien caracterizado como E. coli. El uso de estas células bacterianas ofrece ventajas de producción cuando se compara con productores conocidos de quitina desacetilasa como Mucor rouxii.

Con objeto de producir quitina desacetilasa mediante técnicas de ADN recombinante, primero es necesario aislar el gen que codifica para la desacetilasa. El Ejemplo 4, presentado a continuación, describe los experimentos que se llevaron a cabo con objeto de efectuar el aislamiento de este gen. La secuencia aminoterminal de aminoácidos se determinó empleando técnicas bioquímicas convencionales y analizando una preparación esencialmente pura de la enzima, preparada tal como se ha descrito anteriormente. Se determinó la secuencia de ADN y se presenta en la SEC ID Nº: 1. La secuencia de ADN descrita en la SEC ID Nº: 1 se puede aislar por los procedimientos que se describen a continuación, o bien empleando el procedimiento de amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa. Las secuencias de los cebadores que se han de emplear en esta reacción de amplificación se pueden determinar haciendo referencia al Listado de Secuencias de ADN que se encuentra a continuación.

El alcance de la invención abarca una secuencia aislada de ADN que codifica para una enzima con actividad quitina desacetilasa, o para un fragmento biológicamente activo de la misma, que se caracteriza por su capacidad de hibridar con la secuencia de ADN representada en SEC ID Nº: 1 bajo condiciones de hibridación restrictivas. Las secuencias de ADN que hibridan con las secuencias mencionadas bajo condiciones de hibridación restrictivas, son perfectamente complementarias, o presentan una elevada homología con la secuencia mencionada. Homología, tal como se emplea en la presente invención, hace referencia a secuencias de ADN que difieren de la secuencia mencionada, pero la diferencia no tiene un efecto sustancial sobre la actividad biológica (es decir, la actividad desacetilasa) de la proteína codificada. Un posible conjunto de condiciones de hibridación restrictivas es el siguiente: formamida al 50%, SSPE 5 X (SSPE 1 X es NaCl 0,15 M, Na-EDTA 1 mM, Na-fosfato 10 mM, pH 7,0), solución de Denhardt 5 X (polivinilpirrolidona 0,1%, Ficoll 0,1%), a 45º.

La identificación de fragmentos biológicamente activos de la enzima se puede determinar mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden generar deleciones en la construcción que codifica para la enzima. La construcción con la deleción se expresa entonces y se ensaya para la actividad quitina desacetilasa.

Las secuencias aisladas de ADN que caen dentro del alcance de esta invención se pueden emplear para expresar la desacetilasa codificada, en grandes cantidades, en células huésped procariotas o eucariotas. Con este propósito, el ADN se inserta en un vector de expresión procariota o eucariota, con las señales reguladoras adecuadas, y se emplea para transformar células. Se han desarrollado anteriormente con este propósito una variedad de vectores y señales reguladoras adecuados y son bien conocidos por los expertos en la materia.

Mediante el empleo de técnicas convencionales, la desacetilasa de esta invención se puede sobreexpresar, por ejemplo, en E. coli, hasta tal punto que represente una proporción considerable del total de las proteínas de la célula. La purificación de una proteína que se expresa en estos considerables niveles, y para la que está establecido un sistema de ensayo simple, es una cuestión sencilla para un experto en la materia.

Por otro lado, la invención trata del empleo de un fragmento de la enzima con actividad quitina desacetilasa en un procedimiento para convertir quitina en quitosano. En el procedimiento reivindicado, la quitina se pone en contacto con un fragmento de la enzima con actividad quitina desacetilasa, siendo generado el fragmento de enzima por técnicas de ADN recombinante en las que una secuencia aislada de ADN que codifica para la enzima, un fragmento con actividad desacetilasa, se expresa a partir de una construcción de ADN. El alcance de este aspecto de la invención incluye el empleo de ADN caracterizado por su capacidad para hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1 en condiciones de hibridación restrictivas.

La invención se ilustra además mediante los siguientes Ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Primer procedimiento para la purificación quitina desacetilasa Fermentación de Mucor rouxii

Mucor rouxii se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC 24905). El hongo se hizo crecer en medio mínimo como describieron Bartnicki-Garcia y Nickerson (Bacteriol, 84: 841-858 (1962)) en lotes de 16 litros. El medio se inoculó con 2 x 10^{8} esporas por litro y se agitó y aireó con aire estéril durante 24 horas a 28ºC. Los micelios se recogieron en la mitad de la fase logarítmica por filtración. Los cultivos produjeron aproximadamente 20 gramos de micelios (peso húmedo) por litro.

Extracción y purificación de quitina desacetilasa

Se extrajeron 400 gramos de micelios mezclándolos con 600 gramos de cuentas de vidrio y 700 ml de tampón de lisis que contenía Tris HCl 50 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM y PMSF 0,2 mM durante una hora en hielo. Tras completar la lisis las cuentas de vidrio se depositaron y se eliminaron, y el extracto se centrifugó durante 30 min a 8000 g a 4ºC. Nos referimos al sobrenadante (750 ml) como el extracto sin refinar.

A continuación, el extracto sin refinar se incubó en un baño de agua ajustado a 50ºC durante 30 minutos y el material precipitado se eliminó por centrifugación a 8000 g durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante de la incubación a 50º se llevó a 2,1 M en sulfato amónico y las proteínas precipitadas se eliminaron por centrifugación a 10,000 g durante 45 minutos. El sobrenadante (850 ml) se pasó a través de una columna (44 x 230 mm) CL-4B de Fenil Sefarosa® equilibrada con Tris HCL 20 mM (pH 7,5) con sulfato amónico 2,1 M. Tras lavar la columna con el tampón mencionado anteriormente, las proteínas retenidas se eluyeron con 2100 ml de una concentración de sulfato amónico decreciente en un gradiente lineal. La tasa de flujo fue de 250 ml/h y se recogieron fracciones de 14 ml. El perfil de elución se muestra en la Figura 1. La actividad quitina desacetilasa se detectó en las fracciones 195-295 que se juntaron para su posterior purificación. El contenido proteico se evaluó con un monitor UV a 280 nm.

La actividad quitina desacetilasa se estimó empleando como sustrato quitina parcialmente O-hidroxietilada (quitina glicol) radiomarcada en los grupos N-acetilo. La preparación del sustrato así como las condiciones del ensayo fueron tal como las describieron Araki e Ito (Eur. J. Biochem. 55: 71-78 (1975)) con las siguientes modificaciones. La mezcla del ensayo contenía 0,1 mg/ml de BSA tamponada con glutamato sódico 25 mM a pH 4,5 (50ºC). El tiempo de incubación fue de 30 minutos a 50ºC.

La muestra de quitina desacetilasa parcialmente purificada de la etapa anterior se dializó frente a Tris HCl 20 mM (pH 8), y se pasó a través de una columna de Sefarosa® Q de Flujo Rápido (26 x 340 mm) equilibrada con el mismo tampón. Tras lavar la columna, se estableció un gradiente lineal de NaCl (2000 ml, 0-0,75 M) tamponado con Tris HCl 20 mM (pH 8). La tasa de flujo fue de 300 ml/h y se recogieron fracciones de 11,5 ml. El perfil de elución se muestra en la Figura 2. La actividad quitina desacetilasa se detectó en las fracciones 105-150 correspondiendo a NaCl \sim0,13 M. Estas fracciones se juntaron para su posterior procesamiento.

Las fracciones juntadas se dializaron frente a un tampón de formato sódico 25 mM (pH 3,5), y la muestra se cargó en una columna de Sefarosa® S de Flujo Rápido (26 x 280 mm) equilibrada con el mismo tampón. La columna se eluyó con una tasa de flujo de 250 ml/h con un gradiente lineal de NaCl (2000 ml, 0-1,2 M) en el tampón mencionado arriba. Se recogieron fracciones de 12 ml. El perfil de elución se muestra en la Figura 3. La mayoría de la actividad quitina desacetilasa no fue retenida por la columna y se detectó en las fracciones que habían fluido a través de la columna en una forma homogénea electroforéticamente.

Caracterización de la enzima purificada a) Peso molecular

Los resultados del protocolo de purificación se resumen en la Tabla 1. La enzima purificada según este procedimiento se consideró homogénea electroforéticamente, tal como se comprobó tanto por electroforesis nativa como por SDS-PAGE. En un gel de SDS poliacrilamida de gradiente (5-20%) la banda de la enzima migró hasta una distancia que correspondía a 75kDa de peso molecular. Cuando la quitina desacetilasa purificada se sometió a filtración en gel en Sephacryl® S-200 HR, se eluyó como un único pico con un tamaño aparente de 80 kDa, lo que indica que la enzima nativa está presente en forma de monómero.

TABLA 1

1

^{a}Se definió una unidad de actividad de la enzima como la cantidad de enzima requerida para producir 1 \mumol de ácido acético por minuto cuando se incubaba con 48 \mug de quitina glicol en condiciones óptimas de pH (4,5) y temperatura (50ºC).

b) Contenido en hidratos de carbono

Varias pruebas sugieren que la quitina desacetilasa es una glicoproteína. Tras la electroforesis, la banda de la enzima se tiñó positivamente con el reactivo periodato de Schiff en los geles de poliacrilamida. La enzima fue retenida en una columna de concanavalina A-Sefarosa® 4B y se recuperó como un pico único por elución con un gradiente de \alpha-metil manósido en un punto que corresponde aproximadamente con 25 mM. Tal como se muestra en la Tabla 2, el análisis directo de hidratos de carbono de la enzima reveló que la proteína contiene 6 residuos de fucosa, 85 residuos de manosa y 22 residuos de N-acetilglucosamina por molécula, contribuyendo aproximadamente en un 30% a su peso molecular. No se encontraron ácido siálico ni otros azúcares en cantidades significativas.

El análisis de monosacáridos se llevó a cabo por cromatografía gas-líquido y cromatografía gas-líquido-espectrometría de masas. La mezcla se hidrolizó con ácido trifluoroacético 4M a 100ºC durante 4 horas. La relación molar de hidratos de carbono por molécula se estimó mediante el análisis directo de la composición de hidratos de carbono y aminoácidos.

TABLA 2

Hidrato de carbono	Mol/mol de proteína	Entero más próximo
Fucosa	5,81	6
Manosa	81,92	82
N-Acetilglucosamina	20,73	21
Ácido siálico	0

c) Inmunoprecipitación del producto de la traducción in vitro

Con objeto de determinar el tamaño de la cadena de polipéptidos de la quitina desacetilasa de una forma alternativa, se tradujo el ARNm que codifica la enzima in vitro seguido de inmunoprecipitación. El ARNm se extrajo de los micelios (15 g de peso húmedo) recogidos al inicio de la fase logarítmica mediante pulverización con nitrógeno líquido. El ARNm se purificó por el procedimiento de tiocianato de guanidinio de Chirwin y col. (Biochem. 18: 5294-5299 (1979)) y se pelleteó a continuación con cloruro de cesio por ultracentrifugación. El Poly (A)^{+} ARN (\sim 120 \mug) se aisló mediante 3 pases a través de una columna de oligo(dT)-celulosa tal como describieron Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69: 1408-1412 (1972)). La traducción in vitro del ARNm total se realizó empleando lisado de eritrocitos de conejo tratado con nucleasas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto de la traducción in vitro se marcó con ^{35}S-metionina.

El antisuero policlonal se preparó emulsificando quitina desacetilasa pura (500 \mug, 1mg/ml en PBS) con un volumen igual del adyuvante completo de Freund. La mezcla se inyectó por vía intradérmica en un conejo tras extraer suero previamente a la inmunización. El animal fue reinmunizado, y se le extrajo sangre, a las cuatro y a las seis semanas con 200 \mug de enzima en adyuvante incompleto de Freund, también inyectado por vía intradérmica. Los antisueros obtenidos se monitorizaron para la presencia de anticuerpos anti-quitina desacetilasa por ELISA y por ensayos de inhibición de la actividad de la enzima.

Tras completar la reacción de traducción in vitro, se añadieron 10 \mul del suero extraído antes de la inmunización y la reacción se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los complejos antígeno-anticuerpo se eliminaron por centrifugación tras adsorción a 10 \mul de Proteína A-Sefarosa® añadidos a la reacción. El antisuero policlonal específico (10\mul) se añadió entonces al sobrenadante que se incubó a continuación tal como se ha descrito anteriormente. Los nuevos complejos antígeno-anticuerpo se recogieron empleado Proteína A-Sefarosa® por centrifugación y se lavaron tres veces con 20 volúmenes de Tris HCl 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM resuspendiendo y pelleteando. Los inmunoprecipitados se hirvieron durante 5 minutos en tampón de carga SDS-PAGE y se analizaron por electroforesis en gel. El gel se fijó durante 30 minutos en ácido acético al 10%, metanol 30%, se incubó durante 30 minutos en EN^{3}HANCE® (New England Nuclear) y se secó y expuso.

Los productos de la traducción in vitro se analizaron en un gel de poliacrilamida SDS al 12% seguido de autoradiografía. El material inmunoprecipitado por el antisuero específico mostró una banda que correspondía a un peso molecular de \sim49000 kDa, lo que representa el tamaño de la cadena polipeptídica antes de cualquier modificación post-traduccional.

d) Caracterización de la actividad de la enzima

La temperatura óptima de la actividad de la enzima se estimó en \sim50ºC empleando quitina glicol marcada, como sustrato tal como se ha descrito arriba. La dependencia de la temperatura de la actividad quitina desacetilasa se muestra en el gráfico de la Figura 1. El pH óptimo se estimó en \sim4,5, probado con una combinación de tampones superpuestos, tal como se muestra en el gráfico de la Figura 2. Cuando la quitina desacetilasa (5 mU) se incubó con 1 mg de quitosano parcial y químicamente desacetilado (81%) durante una hora, generó 0,22 \mumoles de ácido acético, lo que corresponde a un incremento de \sim5,3% en el grado de desacetilación. La enzima también fue activa sobre quitina microcristalina (quitina coloidal) y carboximetil quitina (derivado soluble).

e) Composición de aminoácidos

La composición de aminoácidos de la quitina desacetilasa se muestra en la Tabla 3. Los aminoácidos básicos sólo suponen un \sim8% del total de aminoácidos, un valor un \sim40% menor que la media.

La composición de aminoácidos de la quitina desacetilasa purificada se determinó tras 24 horas de hidrólisis con HCl 6M a 100ºC. Los valores son la media de dos determinaciones distintas de la muestra. El número de residuos por molécula de proteína se basa en el peso molecular estimado de 49000 Da de l SDS-PAGE del producto inmunoprecipitado procedente de la traducción in vitro del ARNm.

TABLA 3

2

Ejemplo 2 Producción y purificación de anticuerpos reactivos frente a la quitina desacetilasa

Se inmunizó un conejo macho adulto de Nueva Zelanda blanco con 500 \mug (1 mg/ml en PBS) de quitina desacetilasa purificada, preparada tal como se describe en el Ejemplo 1, a partir de Mucor rouxii. La enzima se emulsificó con un volumen igual de adyuvante completo de Freund en un volumen total de 1 ml, y se administró al animal por vía intradérmica. Se administraron tres dosis más de refuerzo, de 150 \mug de quitina desacetilasa emulsificada en adyuvante incompleto de Freund, a intervalos de 4 semanas. Extracciones de sangre de la vena marginal de la oreja se emplearon para monitorizar el título de anticuerpos en suero por ELISA. Previo a la inmunización, se extrajo suero control.

La especificidad del antisuero producido se analizó en un ensayo de inhibición de quitina desacetilasa. La actividad quitina desacetilasa se ensayó midiendo la radioactividad de [^{3}H]-ácido acético liberado a partir de un derivado de la quitina soluble en agua, quitina glicol [acetil-^{3}H]. La mezcla de la reacción contenía 48 \mug de quitina glicol [acetil-^{3}H], cloruro de magnesio 1 mM, 0,1 mg/ml de BSA y se tamponó con glutamato sódico 25 mM (pH 4,5) en un volumen total de 50 \mul. Tras incubar a 50ºC durante 15 minutos, la reacción se detuvo añadiendo 16 \mul de HCl, 4 \mul de ácido acético y 80 \mul de agua. Se añadió acetato de etilo (0,5 ml) a la muestra, y la mezcla se agitó con fuerza en un vórtex durante 5 minutos y se centrifugó a 14000 rpm. Se añadieron 4,5 ml de una mezcla de líquido de centelleo basado en el tolueno a 200 \mul de la solución de la fase orgánica y se agitó todo. La solución se transfirió a un vial y se midió su radioactividad en un contador de centelleo líquido. Una unidad de enzima libera 1,0 \mumol de ácido acético a partir de quitina glicol por minuto en las condiciones descritas anteriormente. La actividad específica se definió como las unidades de enzima por miligramo de proteína. La proteína se ensayó por el llamado procedimiento de Lowry empleado albúmina sérica bovina como patrón.

El título de anticuerpos se monitorizó por ELISA no competitivo. Se revistieron placas de microvaloración con quitina desacetilasa (Maxi Sorp, Nunc, Dinamarca) a 2 \mug/ml de tampón "revestimiento" (pH 9,6), con carbonato sódico 0,05 M y bicarbonato sódico, incubando toda la noche a 4ºC. Los pocillos se lavaron con una solución acuosa de Tween 80 al 0,05% seguido de dos lavados con agua destilada. Después de esto, se incubaron 200 \mul de agente bloqueante por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. El agente bloqueante era 1 g de albúmina sérica bovina disuelta en 100 ml de PBS 0,010 M (pH 7,4). Los pocillos se lavaron al igual que la vez anterior. Se empleó un anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante para detectar, de forma indirecta, las IgG específicas unidas a la quitina desacetilasa pegada a los pocillos. El conjugado se diluyó 10,000 veces en PBS 0,010 M (pH 7,4) y se incubó a 100 \mul por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con una solución de H_{2}O/Tween 80 como anteriormente, seguido de dos lavados con agua destilada. Los pocillos se aspiraron y se incubaron con 100 \mul de la solución sustrato/cromógeno preparada justo antes de su uso como sigue: La reacción se detuvo tras 15 minutos, añadiendo 50 \mul de ácido sulfúrico 4M por pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm empleando un lector de ELISA. La actividad enzimática de una cantidad determinada de quitina desacetilasa purificada se midió tras la incubación con varias cantidades de antisuero. Estos experimentos confirmaron que un componente del antisuero era reactivo de forma específica frente a la quitina desacetilasa.

La IgG se purificó por afinidad a partir de suero de conejo empleando quitina desacetilasa unida a Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia Ltd.) de acuerdo con las instrucciones de fabricante. Una solución que contenía diez miligramos de quitina desacetilasa purificada se dializó frente a 2 l de "tampón de acoplamiento" (pH 8,3), que contenía bicarbonato sódico 0,1M y cloruro sódico 0,5 M. Se mezcló Sefarosa 4B previamente expandida, activada con bromuro de cianógeno y equilibrada con tampón de acoplamiento con quitina desacetilasa (1,4 mg de proteína/ml de gel) durante toda la noche a 4ºC manteniendo la mezcla en rotación. Esta mezcla se transfirió a un embudo de vidrio y se aspiró por vacío. El fluido se recuperó y se ensayó para la proteína para evaluar la eficiencia del acoplamiento. El gel se lavó a conciencia con tampón de acoplamiento y se mezcló como anteriormente durante 2 horas con tampón Tris HCl (0,1 M, pH 8,0) a temperatura ambiente. El gel se aspiró y se lavó con tampón de acoplamiento. La proteína adsorbida no covalentemente al gel se eliminó lavando el gel alternando tampones de pH bajo (acetato de sodio 0,1 M, cloruro sódico 0,5 M, pH 4,0) y alto (Tris 0,1 M, cloruro sódico 0,5 M, pH 8,3). La Sefarosa 4B unida a quitina desacetilasa se transfirió a una mini-columna y se lavó con Tris-HCl 0,025 M (pH 7,4) que contenía azida sódica 0,02% para su almacenamiento a 4ºC. La concentración de anticuerpo en solución se puede estimar midiendo la A_{280} empleando un coeficiente de extinción medio del anticuerpo de 1,4 para 1 mg.ml^{-1} de proteína empleando una célula con una longitud de recorrido de 1 cm.

El antisuero de conejo frente a la quitina desacetilasa obtenido en distintas extracciones de sangre se precipitó por separado con sulfato amónico al 40% de saturación. La inmunoglobulina que contenía precipitados se disolvió y dializó ampliamente frente a Tris 0,025 M (pH 7,4), cloruro sódico 0,2 M y se pasó subsecuentemente a través de la columna de Sefarosa 4B unida a quitina desacetilasa (incluyendo inhibidores de proteasas). El gel se lavó con diez volúmenes de la columna de Tris 0,025 M, cloruro sódico 0,1 M (pH 7,4), hasta que las fracciones recogidas daban lecturas insignificantes a 280 nm. Las proteínas unidas inespecíficamente se eluyeron con Tris 0,025 M, cloruro sódico 1 M, pH 7,4. Un lote de IgG se eluyó con dos volúmenes de la columna de tampón glicina-ácido clorhídrico 0,1 M (pH 2,8). Otro lote más de IgG de mayor afinidad se eluyó con dos volúmenes de la columna de glicina-ácido clorhídrico 0,2 M, pH 2,2. El término afinidad, tal como se emplea en la presente invención, hace referencia a la afinidad funcional (avidez) con la que se emplearon los anticuerpos policlonales. Todas las fracciones se ajustaron inmediatamente a pH 7,0 con Tris-HCl 1 M (pH 9,0). Las dos poblaciones de fracciones de IgG se reunieron por separado y se concentraron por ultrafiltración previo a la diálisis frente a Tris 0,025 m (pH 7,4). La IgG específica purificada muestra el patrón característico de la IgG de conejo en SDS-PAGE. La IgG específica pura se almacena a -20ºC a una concentración > 1 mg/ml en Tris 0,010 M, cloruro sódico 0,1 M (pH 7,4).

El acoplamiento de la quitina desacetilasa a Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno tuvo una eficacia del 90%, produciendo Sefarosa 4B unida a quitina desacetilasa a 1,4 mg de quitina desacetilasa/ml de gel. Por el procedimiento presentado aquí, aproximadamente 2,0-6,5 mg de IgG específica pura fueron aislados por cada 10 ml de antisuero con la elución de pH 2,8 (2,0% a 5,0% de proteína total tras la precipitación con sulfato amónico). La IgG específica aislada total representa 4,5% a 8,0% de la proteína total tras la precipitación con sulfato amónico. La capacidad de unión de la Sefarosa 4B unida a quitina desacetilasa al anticuerpo anti-quitina desacetilasa se determinó en 1,4 mg de IgG/ml de gel.

Ejemplo 3 Segundo procedimiento para la purificación de quitina desacetilasa

Micelios congelados (2 gramos), preparados tal como se describe en el Ejemplo 1, se descongelaron, disgregaron y homogeneizaron en 10 ml de tampón Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4) que contenía PMSF 0,5 mM, NEM 0,1 mM y NaCl 150 mM, empleando una improvisada fresadora de cuentas de vidrio (2 gramos de cuentas de vidrio por gramo de micelios en peso húmedo). Todas las etapas se realizaron a 4ºC. Esto dio lugar a un producto homogéneo que se centrifugó a 10,000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante (12,2 ml; 4,6 mg/ml; 56,0 mg) se denomina extracto sin refinar. El extracto se incubó entonces en un baño de agua ajustado a 50ºC durante 15 minutos y se enfrió rápidamente en hielo. Las proteínas precipitadas se eliminaron por centrifugación a 35,000 rpm durante 45 minutos a 4ºC.

Cinco miligramos de la IgG de conejo pura de menor afinidad, descrita en el Ejemplo 2, se dializaron frente al tampón de acoplamiento (pH 8,3) y se mezclaron con 5 ml de Sefarosa 4B expandida y activada con CNBr para preparar un inmunoadsorbente. La IgG se acopló mediante el procedimiento descrito para el acoplamiento de quitina desacetilasa. El acoplamiento de IgG a Sefarosa 4B activada fue eficaz en un 85%, produciendo Sefarosa unida a IgG a 1 mg de IgG/ml de gel. Este inmunoadsorbente se empleó para la purificación de quitina desacetilasa.

El sobrenadante descrito arriba (11,5 ml; 0,54 mg/ml; 6,2 mg) se cargó sobre el inmunoadsorbente (compactado en una columna de dimensiones 2 x 1,6 cm; 5 ml) previamente equilibrada con tampón Tris-HCl 25 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 150 mM (tampón A). La columna se lavó con tampón A hasta que ya no se evidenció absorción a 280 nm en los efluyentes (las proteínas unidas inespecíficamente se eluyeron con Tris-HCl 25 mM pH 7,4, NaCl 1M). La quitina desacetilasa unida específicamente se eluyó empleando tampón glicina-HCl 0,2 M (pH 2,8) a una tasa de flujo de 35 ml/h. La fracción eluida se ajustó inmediatamente a pH 7,0 con Tris-HCl 1M pH 9,0, se dializó frente a tampón A y se concentró por ultrafiltración (300 \mul, 40 \mug/ml; 12 \mug; 180 mU).

La purificación de quitina desacetilasa por inmunoadsorción (tabla 4) produjo una actividad específica de 1500 m unidades/mg para la enzima adsorbida y un rendimiento de aproximadamente 30%. La evaluación de la pureza de la quitina desacetilasa por SDS-PAGE muestra una única banda. La purificación de quitina desacetilasa mediante procedimientos convencionales (tabla 1) produjo una enzima pura con una actividad específica de 3,23 unidades/mg y un rendimiento de 11,8%. La capacidad máxima de unión del inmunoadsorbente de determinó en 42 \mug de quitina desacetilasa/ml de gel (4% de los sitios de unión del antígeno permanecen disponibles para unir antígeno tras la unión covalente a la matriz).

TABLA 4

3

Ejemplo 4

Una preparación purificada de quitina desacetilasa se sometió al análisis de la secuencia aminoterminal de aminoácidos mediante técnicas convencionales. Basándose en la información sobre la secuencia de aminoácidos, se sintetizaron oligonucleótidos degenerados y un clon de ADNc correspondiente al ARNm de la quitina desacetilasa se aisló de una librería de ADNc de Mucor rouxii. La secuencia de ADNc se determinó y esta secuencia se muestra en SEC ID Nº: 1.

Una búsqueda en la base de datos EMBL empleando la secuencia de aminoácidos deducida de la quitina desacetilasa reveló semejanzas significativas en la secuencia con proteínas nodB de varias especies rhizobiales. Múltiples alineamientos de secuencias empleando todas las secuencias conocidas de la proteína nodB y la secuencia de la quitina desacetilasa hicieron resaltar las semejanzas más significativas.

La secuencia de la proteína nodB (\sim215 aminoácidos de longitud) está bien conservada entre todas la especies rhizobiales estudiadas, siendo idéntica entre 37-67% y con semejanzas globales de 55-78%. La quitina desacetilasa es un polipéptido mucho más largo (400 aminoácidos) y la región que muestra homología con los productos del gen nodB (hasta un 31% idéntica, 50% de semejanza) se localiza en la parte central de la molécula. El extremo aminoterminal (aminoácidos 1-121) y el carboxiterminal están conservados en un (\approx50%) en la quitina desacetilasa. Por el contrario, seis de los nueve sitos de N-glicosilación pronosticados se encuentran en los dominios no conservados de la quitina desacetilasa sugiriendo que estos dominios glicosilados pueden ser importantes para la función específica de la enzima en la biosíntesis de la pared celular.

Equivalentes

Los expertos en la materia sabrán, o podrán determinar, empleando experimentos de rutina sin más, muchos equivalentes de las formas de realización específicas de la invención descritas aquí. Se entiende que se abarcan éstos y todos los demás equivalentes en las siguientes reivindicaciones.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Thireos, George

Kafetzopoulos, Dimitris

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN QUE CODIFICA PARA LA

QUITINA DESACETILASA

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 1

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(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.

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(B): CALLE: Two Militia Drive

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(C): CIUDAD: Lexington

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(D): ESTADO: MA

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(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): CÓDIGO POSTAL: 02173

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(v): SOPORTE LEGIBLE POR ORDENADOR

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(A): TIPO DE SOPORTE: Disquette

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: Patente In Release #1,0, versión #1,25

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(vi): DATOS DE LA ACTUAL SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA:

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(C): CLASIFICACIÓN

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(viii): INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE

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(A): NOMBRE: Brook, David E.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 22,592

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(C): REFERENCIA/ NÚMERO DE EXPEDIENTE: BTT91-01A

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(ix): INFORMACIÓN DE CONTACTO:

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(A): TELÉFONO: 617 861-6240

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(B): FAX: 617 861-9540

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1203 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

4

Claims

1.Una secuencia aislada de ADN que codifica para una enzima con actividad quitina desacetilasa presente en Mucor rouxii, que cataliza la conversión de quitina en quitosano, caracterizándose la secuencia de ADN por la secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1.

2. Una secuencia aislada de ADN que codifica para una enzima con actividad quitina desacetilasa o una porción que codifica para un fragmento de la enzima con actividad quitina desacetilasa, caracterizándose la secuencia de ADN por la capacidad de hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1 en condiciones de hibridación restrictivas.

3. Un construcción para la expresión de ADN que codifica para una enzima presente en Mucor rouxii que cataliza la conversión de quitina en quitosano o para un fragmento de la misma, con actividad quitina desacetilasa, teniendo la enzima la secuencia de ADN de la reivindicación 1.

4. Un construcción para la expresión de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para una enzima con actividad quitina desacetilasa, caracterizándose la secuencia de ADN por la capacidad de hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1 en condiciones de hibridación restrictivas.

5. Uso del fragmento de una enzima con actividad quitina desacetilasa en un procedimiento para la conversión de quitina en quitosano, que comprende el contacto de la quitina con el fragmento de la enzima, siendo generado el fragmento de la enzima por técnicas de ADN recombinante en las que una secuencia aislada de ADN que codifica para el fragmento de una enzima con actividad desacetilasa de acuerdo con la reivindicación 2 se expresa a partir de una construcción para la expresión de ADN.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que la secuencia aislada de ADN que codifica para el fragmento de enzima con actividad quitina desacetilasa, se caracteriza por la capacidad de hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1 en condiciones de hibridación restrictivas.

7. Una célula transformada con una construcción de expresión de ADN recombinante de la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

8. Una célula de la reivindicación 7, en la que la secuencia de ADN que codifica para la enzima con actividad quitina desacetilasa se caracteriza por la capacidad de hibridar con la secuencia de ADN representada en la SEC ID Nº: 1 en condiciones restrictivas de hibridación.

9. Una célula de la reivindicación 7, que es procariota.

10. Una célula de la reivindicación 9, que es E. coli.

11. Una célula de la reivindicación 7, que es eucariota.