ES2206458T3 - Secuencias geneticas que codifican enzimas glicosiltransferasas y usos para las mismas. - Google Patents

Abstract

EL PRESENTE INVENTO SE REFIERE GENERALMENTE A SECUENCIAS GENETICAS QUE CODIFICAN LAS ENZIMAS DEL METABOLISMO DE LA VIA FLAVONOIDE Y EN PARTICULAR ENZIMAS DE GLICOSILACION FLAVONOIDE Y SU EMPLEO TAL COMO EN MANIPULACION DE LA PRODUCCION DE MOLECULAS PIGMENTARIAS EN PLANTAS. MAS PARTICULARMENTE, EL PRESENTE INVENTO PROPORCIONA UNA SECUENCIA GENETICA CODIFICADORA DE RHAMNOSE UDP: RHAMNOSILTRASFERASA (3RT) GLUCOSIDO - 3 - ANTOCIANIDINA.

Description

Secuencias genéticas que codifican enzimas glicosiltransferasas y usos para las mismas.

El presente invento se refiere en general a secuencias genéticas que codifican enzimas metabolizantes de rutas de flavonoides y en particular enzimas de glicosilación de flavonoides y su uso en procedimientos tales como la producción por manipulación de moléculas pigmentarias en plantas.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que se hace referencia de aquí en adelante en la memoria descriptiva se encuentran recogidas al final de la descripción. Los SEQ ID Nos. a los que aquí se hace referencia en relación con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos se encuentran definidos detrás de la Bibliografía.

La industria de la floristería se esfuerza por producir variedades nuevas y diferentes de plantas florales. Un modo eficaz para crear esas variedades nuevas es a través de la manipulación del color de las flores y las técnicas clásicas de mejora vegetal se han utilizado con cierto éxito para producir una amplia gama de colores para la mayoría de variedades comerciales de flores. Esta estrategia está limitada, sin embargo, por las restricciones de un grupo de genes particulares de la especie y por esta razón es raro que una especie determinada presente un espectro completo de variedades coloreadas. Por ejemplo, la producción de variedades azules de la mayoría de las especies de flores cortadas tales como rosas, crisantemos, tulipanes, lirios, claveles y gerbera brindaría una importante oportunidad tanto en el mercado de las flores cortadas como en el mercado de plantas ornamentales.

El color de las flores se debe de manera predominante a tres tipos de pigmentos: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De estos tres tipos de pigmentos, los flavonoides son los más comunes y contribuyen a proporcionar una gama de colores que va del el amarillo al rojo y al azul. Las moléculas de flavonoides que realizan la contribución más importante al color de las flores son las antocianinas que son derivados glicosilados de la cianidina, delfinidina, petunidina, peonidina, malvidina y pelargonidina, y están localizadas en la vacuola.

Los pigmentos flavonoides son metabolitos secundarios de la ruta de los fenilpropanoides. La ruta biosintética de los pigmentos flavonoides ("ruta de los flavonoides") está totalmente establecida. (Ebel y Halbrock, 1988; Hahlbrock y Grisebach, 1979; Wiering y De Vlaming, 1984; Schram y col., 1984; Stafford, 1990) y se muestra en las Figuras 1A y 1B. Tres reacciones y tres enzimas están implicadas en la conversión de la fenilalanina en p-cumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos clave en la ruta de los flavonoides. Las enzimas son la fenilalanina-amonio-liasa (PAL) (del inglés, " Phenilalanine Ammonia-Lyasa"), cinamato-4-hidroxilasa (C4H) y 4-cumarato:CoA-ligasa (4CL). La primera etapa ejecutada en la ruta implica la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (proporcionada por acción de la acetil-CoA-carboxilasa (ACC) sobre el acetil-CoA y CO_{2}), con una molécula de p-cumaroil-CoA. Esta reacción está catalizada por la enzima chalcona-sintetasa (CHS). El producto de esta reacción, la 2',4,4',6'-tetrahidroxi-chalcona, normalmente se isomeriza con rapidez por acción de la enzima chalcona-flavanona-isomerasa (CHI) para producir naringenina. La naringenina posteriormente se hidroxila en la posición 3 del anillo central por acción de la flavonol-3-hidroxilasa (F3H) para producir dihidrocanferol (DHK) (del inglés, " DiHydroKaempferol").

El anillo B del dihidrocanferol puede ser hidroxilado o bien en la posición 3', o bien en ambas posiciones 3' y 5', para producir dihidroquercetina (DHQ) y dihidromiricetina (DHM) respectivamente. El patrón de hidroxilación del anillo B desempeña un papel clave en la determinación del color de los pétalos.

Los dihidroflavonoles (DHK, DHQ y DHM) también pueden ser sustrato de la acción de la flavonol-sintetasa para producir los flavonoles canferol, quercetina y miricetina. Los flavonoles son incoloros pero actúan como copigmentos junto con las antocianinas para aumentar el color de las flores.

La etapa siguiente en la ruta que conduce a la producción de las antocianinas coloreadas implica a la dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) con la producción de las leucoantocianidinas. Estas moléculas flavonoides son inestables en condiciones fisiológicas normales y la glicosilación en la posición 3, a través de la acción de glicosiltransferasas, estabiliza la molécula de antocianidina permitiendo así la acumulación de antocianinas. En general, las glicosiltransferasas transfieren los restos de azúcares desde los UDP-azúcares y muestran altas especificidades para la posición de glicosilación y relativamente bajas especificidades para los sustratos aceptores (Seitz y Hinderer, 1988).

Las glicosiltransferasas implicadas en la estabilización de la molécula de antocianidina incluyen la UDP-glucosa:flavonoide-3-glucosiltransferara (3GT), que transfiere un resto de glucosa desde la UDPG a la posición 3-O de la molécula de antocianidina para producir el antocianidín-3-glucósido. Estas antocianinas pueden luego ser glicosiladas por otra glicosiltransferasa, la UDP-ramnosa:antocianidín-3-glucósido-ramnosiltransferasa (3RT), que añade un grupo de ramnosa a la glucosa unida en la posición 3-O de la molécula de antocianina para producir los antocianidín-3-rutinósidos, y una vez acilados pueden ser posteriormente modificados por la UDP-glucosa:antocianidín-3-(p-cumaroil)-rutinósido-glucosiltransfe-rasa (5GT).

El documento WO90/12084 sugiere la producción de nuevos fenotipos de plantas por ingeniería genética, mediante la introducción de material genético que codifica genes de interés, que incluyen los genes implicados en la ruta biosintética de los flavonoides.

La UDP-ramnosa:antocianidín-3-glucósido-ramnosil-transferasa se ha purificado a partir de Silene dioica (Kamsteeg y col., 1979) y se ha demostrado que utiliza como sustratos tanto antocianidín-3-glucósidos como antocianidín-3,5-diglucósidos. La presencia de antocianidín-3-rutinósidos se ha descrito en Petunia (Stafford, 1990; Jonsson y col., 1982; Maizonnier y Moessner, 1980), Antirrhinum (Martin y col., 1991), ciclamen (Miyajima y col., 1990), Metrosideros (Andersen, 1988), Alstroemeria (Saito y col., 1988), Potentilla spp. (Harborne y Nash, 1984), Saintpaulia ionantha (violeta africana) (Khokhar y col., 1982), Bromeliaceae spp. (Saito y Harborne, 1983), geranio (Asen y Griesbach, 1983) y en varias otras plantas. No existen informes, sin embargo, de que los antocianidín-3-rutinósidos se hayan encontrado en rosas, aunque sí se han descrito antocianidín-3-glucósidos y antocianidín-3,5-diglucósidos (Asen, 1982). Tampoco existen informes hasta la fecha de que un cDNA de ramnosiltransferasa se haya aislado en plantas.

En petunias, la UDP-ramnosa:antocianidín-3-glucósido-ramnosiltransferasa está controlada por el locus Rt situado en el cromosoma VI. Cuando ambos alelos están presentes en el estado homocigoto recesivo, los antocianidín-3-glucósidos se acumulan y no tienen lugar posteriores modificaciones de la molécula de antocianina tales como una glicosilación, acilación y metilación (Stafford, 1990). La adición de ramnosa a los antocianidín-3-glucósidos tiene un ligero efecto de azular sobre el color (Wiering y de Vlaming, 1984) y un espectro mayor de colores se hace por lo tanto posible cuando los antocianidín-3-rutinósidos están modificados por medio de glicosilación, acilación y metilación posteriores.

Además de las modificaciones anteriormente mencionadas, el pH y la copigmentación con otros flavonoides tales como los flavonoles y flavonas pueden afectar al color de los pétalos. Los flavonoles y las flavonas pueden también ser glicosilados por glicosiltransferasas. Los 3-rutinósidos de distintos flavonoles se han encontrado en Crocus spp. (Harborne y Williams, 1984), Lilium cordatum (Nakano y col., 1989), Eustoma grandiflorum (Asen y col., 1986)), Curcubita pepo (Itokawa y col., 1981), Calendula officinalis (Vidal-Ollivier y col., 1989), Tulipa gesneriana (Budzianowski, 1991), Alstroemeria (Saito y col., 1988), Rosa spp. (Asen, 1982), Nicotiana spp. (Snook y col., 1992) y varias otras plantas. La capacidad para controlar la actividad de 3RT, o de otras glicosiltransferasas tales como la 5GT, proporcionaría un medio de manipulación del color de los pétalos permitiendo con ello a una especie determinada expresar un espectro más amplio de colores de las flores. Ese control puede realizarse modulando el nivel de producción de una enzima natural o introduciendo una enzima no natural.

Según aquí se utiliza, una enzima "natural" es una enzima nativa en relación con una célula particular o una enzima que se expresa de manera natural en una célula particular. Una enzima no "natural" es una enzima no nativa en relación con la célula pero que se expresa a través de la introducción de material genético en una célula vegetal; por ejemplo, por medio de un transgén. Una enzima "endógena" es una enzima producida por una célula pero que puede ser o no natural con respecto a esa célula.

De acuerdo con el presente invento, se han identificado y clonado secuencias genéticas que codifican la enzima flavonoide-glicosiltransferasa, UDP-ramnosa:antocia-nidín-3-glucósido-ramnosiltransferasa (en lo sucesivo denominada "3RT"), y se han utilizado para generar plantas transgénicas. Estas secuencias recombinantes permiten la posterior glicosilación de antocianidín-3-glucósidos tales como el delfinidín-3-glucósido y el cianidín-3-glucósido, proporcionando de este modo un medio para manipular el color de los pétalos.

Por consiguiente, uno de los aspectos del presente invento proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o que es complementaria a, una secuencia que codifica una enzima de glicosilación de flavonoides vegetales, que posee las características de una glicosiltransferasa, o una parte o un derivado funcional de dicha glicosiltransferasa.

Más en particular, el presente invento está dirigido a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o que es complementaria a, una secuencia que codifica una glicosiltransferasa vegetal, la antocianidín-3-glucósido-ramnosiltransferasa (3RT), o una parte o un derivado funcional de dicha glicosiltransferasa.

El presente invento se describe e ilustra en este documento con referencia a la identificación, clonación y manipulación de secuencias genéticas que codifican 3RT que, hasta el momento presente, es una enzima de glicosilación de flavonoides particularmente conveniente y útil para la práctica del invento que aquí se describe.

Por comodidad y sólo a modo de anotación taquigráfica, la referencia que aquí se hace a una "enzima de glicosilación de flavonoides" incluye a las ramnosiltransferasas que actúan sobre flavonoides tales como antocianinas, flavonoles y/o flavonas. Preferiblemente, la enzima de glicosilación de flavonoides es 3RT.

Un aspecto preferido del presente invento, por lo tanto, está dirigido a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican, o que son complementarios a, una secuencia que codifica 3RT o un mutante, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo funcional de 3RT.

Por la expresión "molécula de ácido nucleico aislada" se entiende una secuencia genética en un estado no presente en la naturaleza. En general, esto significa una molécula aislada no en su estado natural o formada por procedimientos que no se encuentran necesariamente en su entorno natural. De manera más específica, esta expresión incluye a moléculas de ácido nucleico formadas o mantenidas in vitro, incluyendo fragmentos de DNA genómico, moléculas recombinantes o sintéticas y ácidos nucleicos en combinación con ácidos nucleicos heterólogos tales como ácidos nucleicos heterólogos fusionados o unidos operativamente a las secuencias genéticas del presente invento. La expresión "molécula de ácido nucleico aislada" se extiende también al DNA genómico o al cDNA o a una parte de los mismos, que codifica una 3RT o un mutante, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo funcional de 3RT, en orientación inversa con respecto a su promotor o a otro promotor. También se extiende a secuencias presentes en la naturaleza después de al menos una purificación parcial con relación a otras secuencias de ácido nucleico. La expresión molécula de ácido nucleico aislada según aquí se utiliza se entiende que tiene el mismo significado que un material ácido nucleico aislado.

La expresión "secuencia genética" se utiliza aquí en su sentido más general y abarca toda serie contigua de bases nucleotídicas que especifican de manera directa, o a través de una serie complementaria de bases, una secuencia de aminoácidos que comprende una molécula de 3RT. Esa secuencia de aminoácidos puede constituir una 3RT de longitud completa tal como se expone en la SEQ ID No:2, o una de sus formas truncadas activas o uno de sus mutantes, derivados, partes, fragmentos, homólogos o análogos funcionales, o puede corresponder a una región particular tal como una región N-terminal, C-terminal o a una porción interna de la enzima.

En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos sustancialmente corresponde a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No:2 o a una de sus regiones o partes.

Según este aspecto preferido del presente invento, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que:

(i)

codifica una 3RT; y

(ii)

presenta una similitud en la secuencia de nucleótidos de al menos el 50% con respecto a la secuencia expuesta en la SEQ ID No:2.

Más en particular, el presente invento está dirigido a una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que:

(i)

codifica una 3RT; y

(ii)

presenta una similitud en la secuencia de nucleótidos de al menos el 65%-75% con respecto a la secuencia expuesta en la SEQ ID No:2.

Las similitudes preferidas en tanto por ciento incluyen el 80%, 85%, 90%, 92%-95%, 96%-98% y 99%-100%. Aunque las similitudes en tanto por ciento anteriormente mencionadas suponen una comparación total entre las secuencias expuestas en la SEQ ID No:2 y otra secuencia génica, está claro que pueden existir regiones específicas en las moléculas que están siendo comparadas, que presenten una similitud de menos que el 50%. En relación con esto, el presente invento se define también en forma de una molécula de ácido nucleico, y en particular una molécula de DNA, que comprende una secuencia de nucleótidos que:

(i)

codifica una 3RT; y

(ii)

presenta una similitud en la secuencia de nucleótidos de al menos el 50%-75% con respecto a una o más regiones de la secuencia expuesta en la SEQ ID No:2.

En una realización alternativa, la molécula de ácido nucleico, y más en particular la molécula de DNA, comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia expuesta en la SEQ ID No:2 y sustancialmente similar a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:3.

Las secuencias de ácido nucleico que aquí se contemplan también abarcan moléculas "antisentido" capaces de regular la expresión del gen correspondiente en una planta. Una "molécula antisentido" según aquí se utiliza puede también abarcar una construcción génica que comprende el gen genómico estructural o el gen de cDNA o parte de los mismos, en orientación inversa con respecto a su promotor o a otro promotor.

En una de las realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica una 3RT o uno de sus mutantes, derivados, partes, fragmentos, homólogos o análogos funcionales, se utiliza para disminuir la actividad de una 3RT natural, por ejemplo, utilizando una co-supresión (Patente de EE.UU. número 5.034.323). Como alternativa, la secuencia de ácido nucleico que codifica esta enzima o sus diferentes mutantes, derivados, partes, fragmentos, homólogos o análogos funcionales, se utiliza en la orientación antisentido para disminuir la actividad de la 3RT natural. Aunque sin desear limitar el presente invento a una sola de las teorías, es posible que un transcrito antisentido de 3RT, o uno de sus fragmentos o partes (por ejemplo, una molécula de oligonucleótido), forme un dúplex con la totalidad o con una parte del mRNA presente en la naturaleza y especificado por la enzima, previniéndose así la acumulación de ese mRNA, o la traducción de ese mRNA en la enzima activa.

En otra alternativa, podrían utilizarse ribozimas para inactivar secuencias de un ácido nucleico diana. Las ribozimas están perfectamente descritas por Haseloff y Gerlach (1988). Con respecto a esta realización, la ribozima estaría formada preferiblemente por una porción hibridadora y por una porción catalítica, comprendiendo la porción hibridadora uno y preferiblemente dos brazos nucleotídicos capaces de hibridarse con un transcrito de mRNA procedente de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos sustancialmente como la expuesta en la SEQ ID No:2.

La referencia que aquí se hace la alteración de la actividad de 3RT se refiere a una elevación o a un descenso de la actividad de hasta un 30%, o más preferiblemente del 30%-50%, o incluso más preferiblemente del 50%-75%, o aún más preferiblemente del 75% o más, por encima o por debajo de los niveles de actividad endógenos normales o de los niveles de actividad existentes. A dicha elevación o descenso puede hacerse referencia como "modulación" de la actividad de la enzima 3RT. Generalmente, la modulación se hace a un nivel de transcripción o traducción de las secuencias genéticas de 3RT. El nivel de actividad puede determinarse utilizando el método de Kamsteeg y col (1979).

Los ácidos nucleicos del presente invento pueden ser ácidos ribonucleicos o desoxirribonucleicos, monocatenarios o moléculas circulares cerradas covalentemente. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es cDNA. El presente invento también se extiende a otras moléculas de ácido nucleico que se hibridan a las secuencias genéticas aquí descritas.

Según este aspecto del presente invento, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que:

(i)

codifica una 3RT; y

(ii)

se hibrida con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No:2 y/o SEQ ID No. 3, o con una de sus formas complementarias, en condiciones de rigurosidad baja.

Con el propósito de definir el nivel de rigurosidad, puede hacerse convenientemente referencia a Maniatis y col., (1982), páginas 387-389, y especialmente al párrafo 11. Una rigurosidad baja aquí se define que está en unas condiciones de 4-6 x SSC / SDS al 1% (p/v), a 37ºC-45ºC, durante 2-3 horas. Dependiendo de la fuente y de la concentración del ácido nucleico implicado en la hibridación, pueden utilizarse condiciones de rigurosidad alternativas tales como unas condiciones de rigurosidad media que aquí se considera que son de 1-4 x SSC / SDS al 0,5%-1% (p/v), a una temperatura mayor o igual que 45ºC, durante 2-3 horas, o unas condiciones de rigurosidad alta que aquí se considera que son de 0,1-1 x SSC / SDS al 0,1%-1,0%, a una temperatura mayor o igual que 60ºC, durante 1-3 horas.

En su realización más preferida, el presente invento se extiende a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No:2, o a una molécula que presenta una similitud de al menos el 50%, más preferiblemente de al menos el 55%, aún más preferiblemente de al menos el 60% y todavía más preferiblemente de al menos el 65%-70%, e incluso aún más preferiblemente del 85%, a un nivel de secuencia de nucleótidos o de secuencia de aminoácidos, con al menos una o más regiones de la secuencia de nucleótidos o de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No:2, y en la que el ácido nucleico codifica, o es complementario a, una secuencia que codifica una enzima que tiene actividad de 3RT.

Las moléculas de ácido nucleico que aquí se contemplan pueden existir en una de las dos orientaciones, solas o en combinación con una molécula vector y preferiblemente con un vector de expresión. La expresión "molécula vector" se utiliza en su sentido más amplio para incluir cualquier vehículo intermediario de la molécula de ácido nucleico, capaz de facilitar la transferencia del ácido nucleico al interior de la célula vegetal y/o de facilitar su integración en el genoma de la planta. Un vehículo intermediario puede, por ejemplo, adaptarse para su uso en una electroporación, bombardeo con microproyectiles, transferencia mediada por Agrobacterium o inserción a través de virus con DNA o de virus con RNA. El vehículo intermediario y/o la molécula de ácido nucleico en él contenida pueden o no necesitar estar integrados de manera estable en el genoma de la planta. Esas moléculas vector pueden también replicarse y/o expresarse en células procariotas. Preferiblemente, las moléculas vector o sus partes son capaces de integrarse en el genoma de la planta. La molécula de ácido nucleico puede adicionalmente contener una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula vegetal. La molécula de ácido nucleico y el promotor pueden también introducirse en la célula mediante cualquiera de varios medios como los anteriormente descritos. La molécula vector puede contener también una secuencia genética que codifica una ribozima según se ha definido en lo que antecede, capaz de escindir un transcrito de mRNA de una 3RT.

El ácido nucleico o su forma complementaria puede codificar la enzima de longitud completa o uno de sus derivados. Por "derivado" se entiende todas las sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos, sencillas o múltiples, con respecto a la enzima presente en la naturaleza, y que conservan la actividad de 3RT. En relación con esto, el ácido nucleico incluye la secuencia de nucleótidos presente en la naturaleza, que codifica una 3RT, o puede contener sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos, simples o múltiples, con respecto a dicha secuencia presente en la naturaleza. Las secuencias de ácido nucleico del presente invento o su forma complementaria pueden también codificar una "parte" de una 3RT, ya sea activa o inactiva, y esa molécula de ácido nucleico puede ser útil como sonda oligonucleotídica, como cebador para las reacciones en cadena de la polimerasa o en diferentes técnicas mutagénicas, o para la generación de moléculas antisentido o de moléculas de ribozima capaces de regular la expresión del gen correspondiente presente en la planta.

Los derivados por inserción de aminoácidos de la 3RT del presente invento incluyen fusiones amino terminales y/o carboxilo terminales así como inserciones intra-secuencia de aminoácidos sencillos o múltiples. Las variantes de la secuencia por inserción de aminoácidos son aquellas en las que uno o más residuos de aminoácidos se introducen en un sitio predeterminado de la proteína, aunque una inserción al azar es también posible con un escrutinio adecuado del producto resultante. Las variantes por deleción se caracterizan por la retirada de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes por sustitución de aminoácidos son aquellas en las que se ha retirado al menos uno de los residuos de la secuencia y en su lugar se ha insertado un residuo diferente. Las sustituciones típicas son aquellas sustituciones hechas de acuerdo con la Tabla 1, a la vuelta de la página.

Cuando la 3RT deriva por sustitución de aminoácidos, los aminoácidos generalmente son reemplazados por otros aminoácidos que tienen propiedades similares, tales como carácter hidrófobo, carácter hidrófilo, electronegatividad, cadenas laterales voluminosas y propiedades similares. Las sustituciones de aminoácidos típicamente son de residuos únicos. Las inserciones de aminoácidos usualmente son del orden de aproximadamente 1-10 residuos de aminoácidos y las deleciones varían en aproximadamente 1-20 residuos. Preferiblemente las deleciones o inserciones se hacen por pares adyacentes, es decir, una deleción de dos residuos o una inserción de dos residuos.

Las variantes de aminoácidos anteriormente mencionadas pueden prepararse con facilidad usando técnicas de síntesis de péptidos muy conocidas en la técnica, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, 1964) y técnicas similares, o mediante manipulaciones con DNA recombinante. Las técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados de un DNA que tiene una secuencia conocida o parcialmente conocida, son muy conocidas e incluyen, por ejemplo, la mutagénesis con M13. La manipulación de una secuencia de DNA para producir proteínas variantes que se manifiestan como variantes por sustitución, inserción o deleción, se encuentran convenientemente descritas, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989).

Otros ejemplos de mutantes y derivados, recombinantes o sintéticos, de la enzima 3RT del presente invento incluyen sustituciones, deleciones y/o adiciones simples o múltiples de cualquier molécula asociada con la enzima tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o polipéptidos.

Los términos "análogos" y "derivados" se extienden también a cualquier equivalente químico funcional de una 3RT y también a cualquier derivado de aminoácido anteriormente descrito. Por comodidad, la referencia que aquí se hace a "3RT" incluye una referencia a cualquiera de sus mutantes, derivados, partes, fragmentos, homólogos o análogos funcionales.

TABLA 1 Residuos adecuados para las sustituciones de aminoácidos

Residuo original	Ejemplo de sustituciones
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn; Glu
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln; Glu
Met	Leu; Ile; Val
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu; Met

El presente invento se ilustra usando secuencias de ácido nucleico derivadas de petunia ya que ésta representa hasta la fecha la fuente de material más conveniente y preferida. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará de inmediato que pueden aislarse secuencias similares a partir de varias otras fuentes tales como otras plantas y algunos microorganismos. Todas esas secuencias de ácido nucleico que codifican directa o indirectamente una 3RT están incluidas en el presente invento con independencia de la fuente de la que procedan. Los ejemplos de otras fuentes adecuadas de genes que codifican ramnosiltransferasas incluyen, pero sin limitarse a ellas, Silene dioica, Antirrhinum, ciclamen, Alstroemeria, Metrosideros, Potentilla y Saintpaulia ionantha.

De acuerdo con el presente invento, una secuencia de ácido nucleico que codifica 3RT puede ser introducida y expresada en una planta transgénica en cualquiera de las dos orientaciones, proporcionando con ello un medio, o para convertir sustratos adecuados, si la célula vegetal los sintetiza, en antocianidín-3-rutinósidos en último término, o de manera alternativa, para inhibir esa conversión de metabolitos disminuyendo o eliminando la actividad de 3RT endógena o existente. La producción de estas antocianinas modificará el color de los pétalos y puede contribuir a la producción de un color más azul. La expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta, puede ser constitutiva, inducible o dependiente de las fases del desarrollo y también puede ser específica de tejido. El vocablo expresión se utiliza en su sentido más amplio para incluir la producción de RNA o de tanto RNA como proteína. También se extiende a la expresión parcial de una molécula de ácido nucleico.

De acuerdo con este aspecto del presente invento, se proporciona un método para producir una planta floral transgénica, capaz de sintetizar 3RT, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha 3RT en condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La planta transgénica puede de este modo producir una 3RT no natural en niveles elevados con respecto a la cantidad expresada en una planta no transgénica comparable.

Otro aspecto del presente invento contempla un método para producir una planta transgénica con una actividad de 3RT natural o existente disminuida, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o que es complementaria a, una secuencia que codifica una actividad de 3RT, regenerar una planta transgénica a partir de esa célula y, en caso necesario, cultivar dicha planta transgénica en unas condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia del ácido nucleico.

Otro aspecto más del presente invento contempla un método para producir una planta genéticamente modificada con una actividad de 3RT natural o existente disminuida, comprendiendo dicho método alterar el gen Rt a través de la modificación de las secuencias naturales por medio de la recombinación homóloga con un gen Rt apropiadamente alterado o con uno de sus derivados o una de sus partes, introducido en la célula vegetal, y regenerar la planta genéticamente modificada a partir de esa célula.

En una realización preferida, el presente invento contempla un método para producir una planta floral transgénica que exhibe propiedades de inflorescencia alteradas, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácido nucleico del presente invento, regenerar una planta transgénica a partir de esa célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una 3RT. Como alternativa, dicho método puede comprender, transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácido nucleico del presente invento o con su secuencia complementaria, regenerar una planta transgénica a partir de esa célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para alterar el nivel de actividad de la 3RT natural o existente. Preferiblemente el nivel alterado sería menor que el nivel natural o que el nivel existente de actividad de 3RT en una planta no transgénica comparable. Sin desear limitar el presente invento, una teoría sobre el modo de acción es que la disminución de la actividad de la 3RT natural requiere la expresión de la secuencia de ácido nucleico introducida o de su secuencia complementaria. Sin embargo, la expresión de la secuencia genética introducida o de su secuencia complementaria puede no requerirse para conseguir el efecto deseado: en concreto, conseguir una planta floral que exhibe propiedades de inflorescencia alteradas.

En una realización relacionada, el presente invento contempla un método para producir una planta floral que exhiba propiedades de inflorescencia alteradas, comprendiendo dicho método la alteración del gen Rt a través de la modificación de las secuencias naturales por medio de la recombinación homóloga con un gen Rt apropiadamente alterado o con uno de sus derivados o una de sus partes, introducido en la célula vegetal, y regenerar la planta genéticamente modificada a partir de esa célula.

Preferiblemente, la inflorescencia alterada incluye la producción de diferentes tonalidades de flores azules o rojas o de otros colores, dependiendo del genotipo y del estado fisiológico de la planta receptora.

Por consiguiente, el presente invento se extiende a un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un gen recombinante que codifica una 3RT o una de sus partes, o que porta una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente complementaria con la totalidad o con una parte de una molécula de mRNA opcionalmente transcribible cuando así se requiere para efectuar la regulación de una 3RT, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con la molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o que es complementaria a, una secuencia que codifica una 3RT, cuando así se necesita, en unas condiciones que permiten la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y regenerar una planta transgénica a partir de esa célula. Por "planta adecuada" se entiende una planta capaz de producir antocianidín-3-glucósidos y de poseer las propiedades fisiológicas apropiadas requeridas para el desarrollo del color deseado.

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El experto en la técnica reconocerá de manera inmediata las variaciones aplicables a los métodos del presente invento, tales como aumentar o disminuir la expresión de la enzima presente de manera natural en una planta diana, lo que produce diferentes tonalidades de colores tales como diferentes tonalidades de azul o rojo.

El presente invento, por lo tanto, se extiende a todas las plantas transgénicas que contienen la totalidad o parte de la secuencia de ácido nucleico del presente invento, o sus formas antisentido y/o cualquiera de sus homólogos o formas relacionadas, y en particular a aquellas plantas transgénicas que exhiben propiedades de inflorescencia alteradas. Las plantas transgénicas pueden contener una molécula de ácido nucleico introducida que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o que es complementaria a, una secuencia que codifica una 3RT. En general, el ácido nucleico se introduciría de manera estable en el genoma de la planta, aunque el presente invento también se extiende a la introducción de una secuencia de nucleótidos de 3RT contenida en una secuencia de ácido nucleico de replicación autónoma, tal como un virus con DNA o un virus con RNA capaz de replicarse en el interior de la célula vegetal. El invento también se extiende a las semillas de esas plantas transgénicas. Esas semillas, especialmente si están coloreadas, serán útiles como marcadores de propiedad de las plantas.

Un aspecto más del presente invento se dirige a las formas recombinantes de 3RT. Las formas recombinantes de la enzima proporcionarán una fuente de material de investigación, para producir, por ejemplo, enzimas más activas, y pueden ser útiles en el desarrollo de sistemas in vitro para la producción de compuestos coloreados.

Un aspecto adicional más del presente invento contempla el uso de las secuencias genéticas que aquí se describen, en la fabricación de una construcción genética capaz de expresar una 3RT o de regular por disminución una enzima 3RT natural en una planta.

Otro aspecto del presente invento está dirigido a un organismo procariota o eucariota que porta una secuencia genética que codifica una 3RT de manera extracromosómica en forma de un plásmido. En una de las realizaciones, el plásmido es pCGP806 en Escherichia coli. El microorganismo Escherichia coli, cepa XL1-Blue, que contiene el plásmido pCGP806, fue depositado en los Australian Government Analytical Laboratories, 1 Suakin Street, New South Wales, 2037, Australia, el 29 de julio de 1993, y recibió el Número de Registro N93/32139.

El presente invento se describe de manera más amplia con referencia a las Figuras y Ejemplos no limitativos que vienen a continuación.

En las figuras:

La Figura 1 es una representación esquemática de la ruta de biosíntesis de los pigmentos flavonoides. Las enzimas implicadas en la primera parte de la ruta están indicadas de la siguiente manera: PAL = Fenilalanina amonio-liasa; C4H = Cinamato 4-hidroxilasa; 4CL = 4-cumarato:Co-A-ligasa; CHS = Chalcona-sintetasa; CHI = Chalcona flavanona-isomerasa; F3H = Flavanona 3-hidroxilasa; DFR = Dihidroflavonol-4-reductasa (Beld y col., 1989); 3GT = UDP-glucosa:flavonoide-3-O-glucosil-transferasa; 3RT = UDP-ramnosa:antocianidín-3-glucósido ramnosiltransferasa y está controlada por el locus Rt. Los loci genéticos de la última parte de la ruta se han indicado de la siguiente manera: Gf = es el locus que controla la acilación; una 5-O-glucosilación sigue a la etapa de acilación pero no está correlacionada con el locus Gf (Jonsson y col., 1984c); Mt1 y Mt2 = son los loci responsables de la metilación en 3' (Jonsson y col., 1984b); Mf1 y Mf2 = son los loci responsables de la metilación en 3' y 5' (Jonsson y col., 1984b).

La Figura 2 es un diagrama del inserto de cDNA en el vector pCGN1703 usado en la preparación de la biblioteca de cDNA de pétalos n.º 1.

La Figura 3 es un diagrama del plásmido pCGP806. El inserto de cDNA de aE10,9 está indicado en forma de una recuadro no sombreado. En el inserto hay un sitio interno Pst1 situado aproximadamente a 100 pb del extremo 5'.

La Figura 4 es una autorradiografía representativa del análisis de RFLP de las plantas VR(V/R)F2. El DNA genómico digerido con EcoRI se hibridó con el clon de cDNA de aE10,9. La designación dada por RFLP y obtenida usando la sonda aE10,9, se emparejó de manera parcial con la designación dada RFLP y obtenida usando la sonda dfr-C. V: RFLP similar a V23; R: RFLP similar a R51; H: RFLP de (VR) heterozigótica.

La Figura 5 es un análisis de transferencia de RNA, del mRNA codificado por el cDNA de aE10,9 en limbos de pétalos de distintas líneas de P. hybrida. A. Hibridación con una sonda aE10,9 marcada con ^{32}P, con 20 \mug de RNA total procedente de líneas de P. hybrida. Los genotipos de las líneas de petunia se encuentran descritos en el Ejemplo 1. Se detectaron dos bandas en la línea R51 con una exposición más prolongada. B. Hibridación con una sonda aE10,9 marcada con ^{32}P, a 20 \mug de RNA total aislado procedente de limbos de pétalos de color rosa de Tr38, con un transposón en el locus Rt (rt*), y procedente de limbos de pétalos en su mayor parte de color carmesí de Tr38, de los que el transposón se había cortado en uno de los alelos Rt (Rt).

La Figura 6 es un diagrama del plásmido binario pCGP810. El inserto de cDNA procedente de pCGP806 se clonó en una orientación con sentido detrás del promotor Mac del vector de expresión pCGP293, según se ilustra.

La Figura 7 es un diagrama del plásmido binario pCGP811. El inserto de cDNA procedente de pCGP806 se clonó en una orientación antisentido detrás del promotor Mac del vector de expresión pCGP293, según se ilustra.

La Figura 8 es un análisis de transferencia de RNA que muestra los perfiles de expresión de los transcritos correspondientes a PAL, CHS, CHI, DFR y 3RT. Hibridación con sondas marcadas con ^{32}P a 20 \mug de RNA total aislado de pétalos procedentes de cinco fases de desarrollo de la P. hybrida cv OGB(1-5) descritas en el Ejemplo 1.

La Figura 9 es un análisis de transferencia de RNA que muestra los perfiles de expresión de los transcritos correspondientes a PAL, CHS, CHI, DFR y 3RT. Hibridación con sondas marcadas con ^{32}P a 20 \mug de RNA total aislado de tejido foliar de OGB, procedente de plantones de 6 semanas que se habían incubado con glucosa al 2% (p/v) y se habían expuesto a una luminosidad alta durante 0-7 días.

La Figura 10 es un análisis de transferencia de RNA de mRNA de 3RT en distintas partes de la planta OGB. Cada pista contenía una muestra de 20 \mug de RNA total. Todas las partes florales procedían de flores en aproximadamente la fase 3 de desarrollo. Los órganos vegetativos procedieron de plantones de 6-8 semanas. La muestra de tallo/raíz corresponde a la unión del tallo y la raíz, y la muestra de raíz (T.C.) se recogió procedente de plántulas en cultivo de tejidos.

La Figura 11 muestra la localización del RNA de 3RT en capullos de pétalos de petunia en fase 3 mediante hibridación in situ. El plásmido pCGP806 contenía el clon de cDNA de aE10,9 en un vector pBluescript (Stratagene). El plásmido pCGP806 se linearizó con EcoRI de manera que podía sintetizarse un transcrito de RNA antisentido usando el cebador T7 y se linearizó con XhoI para obtener el transcrito con sentido usando el cebador T3. La sonda de RNA con sentido se usó como control de la hibridación inespecífica. A muestra el portaobjetos de control hibridado con el transcrito de aE10,9 con sentido. Las abreviaturas son: u, capa superior de células epidérmicas; v, haz vascular; m, células mesófilas y l, capa inferior de células epidérmicas. B muestra la sección de los pétalos hibridada con el transcrito de aE10,9 antisentido. Las líneas de escala representan 50 \mum.

Las abreviaturas de los aminoácidos utilizados a lo largo de toda la memoria descriptiva se muestran en la siguiente tabla:

Aminoácido	3 letras	una sola letra
L-alanina	Ala	A
L-arginina	Arg	R
L-asparagina	Asn	N
L-ácido aspártico	Asp	D
L-cisteína	Cys	C
L-glutamina	Gln	Q
L-ácido glutámico	Glu	E
L-glicina	Gly	G
L-histidina	His	H
L-isoleucina	Ile	I
L-leucina	Leu	L
L-lisina	LYS	K
L-metionina	Met	M
L-fenilalanina	Phe	F
L-prolina	Pro	P
L-serina	Ser	S
L-treonina	Thr	T
L-triptófano	Trp	W
L-tirosina	Tyr	Y
L-valina	Val	V

Lo siguiente es un sumario de las SEQ ID Nos. asignados a las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos a las que aquí se hace referencia:

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Secuencia	ID SEQ No.
Oligo n.º 1	ID SEQ No:1
Oligo n.º 2	ID SEQ No:6
Oligo n.º 3	ID SEQ No:7
Oligo n.º 4	ID SEQ No:4
Oligo n.º 5	ID SEQ No:5
aE10,9	ID SEQ No:2
aE10,12	ID SEQ No:3

Ejemplo 1 Material vegetal

Las variedades de Petunia hybrida utilizadas se presentan en la Tabla 2.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

1

Las plantas se cultivaron en cámaras especializadas para cultivo con una duración del día de 14 h con una intensidad lumínica de 10.000 lux y una temperatura de 22ºC a 26ºC. Las flores de OGB se recogieron en las fases de desarrollo definidas de la siguiente manera:

Fase 1: Capullo cerrado, no pigmentado (<25 mm de longitud).

Fase 2: Capullo cerrado, pigmentado (25-35 mm de longitud).

Fase 3: Capullo púrpura oscuro con corola emergente (>35 mm de longitud).

Fase 4: Flor abierta de color púrpura oscuro, antes de la dehiscencia de las anteras (>50 mm de longitud).

Fase 5: Flor completamente abierta con todas las anteras dehiscentes.

Las flores de las otras variedades se recogieron antes de la dehiscencia de las anteras en la fase de máxima acumulación de pigmentos.

Ejemplo 2 Cepas bacterianas

Las cepas de Escherichia coli utilizadas fueron:

DH5\alpha:

3

XL1-Blue:

4

PLK-F:

5

La cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens utilizada fue AGLO (Lazo y col., 1991).

Los vectores de clonación pBluescript y pBluescribe se obtuvieron procedentes de Stratagene.

Transformación de E. coli

La transformación de las cepas de E. coli se realizó según el método de Inoue y col., (1990).

Ejemplo 3 Métodos generales Síntesis de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador PCR-Mate DNA de Applied Biosystems, usando métodos recomendados por el fabricante. Los oligonucleótidos sintetizados fueron, 5'-3':

6

Preparación de sondas de cDNA marcadas con ^{32}P

Se incubaron 20 \mug de RNA total a 100ºC durante 2 minutos y después se enfriaron en hielo durante dos minutos más. El RNA se añadió a una mezcla de reacción que contenía oligo-dT 20 \mug/ml, Tris-HCl 50 mM pH8,0, KCl 75 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 10 mM, actinomicina D 0,5 mg/ml, dATP 200 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, dCTP 2,5 \muM, 100 \muCi de [\alpha-^{32}P]-dCTP (Bresatec, 3.000 Ci/mmol), 40 unidades de RNasin (Promega) y 600 unidades de la transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (BRL), y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Se añadieron EDTA y NaOH hasta alcanzar una concentración final de 50 mM y 0,2 M respectivamente, y la mezcla se incubó durante 20 minutos a 70ºC. La mezcla se neutralizó después por adición de HCl a una concentración 0,2 M. El [\alpha-^{32}P]-dCTP no incorporado se separó por cromatografía en una columna de Sephadex G-50 (Fine).

Marcaje con ^{32}P de sondas de DNA

Se marcaron radiactivamente fragmentos de DNA (de 50 a 100 ng) con 50 \muCi de [\alpha-^{32}P]-dCTP utilizando un kit de oligomarcaje (Bresatec). El [\alpha-^{32}P]-dCTP no incorporado se separó por cromatografía en una columna de Sephadex G-50 (Fine).

Ejemplo 4 Construcción de la biblioteca de cDNA n.º 1

Se aisló el RNA total procedente de tejido de los pétalos de flores de P. hybrida cv OGB, fase de 3 a 4, usando el método de Turpen y Griffith (1986). Se seleccionó el RNA poli(A)^{+} a partir del RNA total mediante tres ciclos de cromatografía en celulosa con oligo dT (Aviv y Leder, 1972).

Se usaron 4 \mug de mRNA preparados a partir de las cinco fases de desarrollo de P. hybrida cv OGB para construir una biblioteca de cDNA usando el método del dímero-cebador (Alexander y col., 1984) en pCGN1703 (Figura 2). El plásmido pCGN1703 es un vector plasmídico basado en pBluescribe M13^{-} (Stratagen) y fue construido por Calgene Inc. (CA. EE.UU.). Los sitios del conector de policlonación se cambiaron de manera que el inserto de cDNA está flanqueado por los sitios PstI, XbaI y SmaI. Un fragmento HinDIII/PvuII que incluía el cebador T3 y el promotor lac se encontraba delecionado.

La biblioteca se sembró con una densidad alta sobre placas de LB (Sambrook y col., 1989) + ampicilina (100 \mug/ml) y se incubó a 37ºC durante 16 horas. Las colonias a continuación se extrajeron raspando y se suspendieron en caldo LB + glicerol al 15% (v/v) y se almacenaron a -70ºC. Veinte mil colonias de la biblioteca amplificada se sembraron sobre placas de LB + ampicilina (100 \mug/ml) con una densidad de 2.000 colonias por placa, y se incubaron a 32ºC durante 16 horas. Después de una incubación a 4ºC durante 1 hora, los alzados de las colonias por duplicado se llevaron sobre filtros Colony/Plaque Screen™ (DuPont) y se trataron según lo recomendado por el fabricante.

Escrutinio diferencial de la biblioteca de cDNA n.º 1

Una estrategia de escrutinio diferencial se utilizó para aislar clones de cDNA que codifican genes expresados en pétalos de OGB (fases 3-4) pero que tiene una expresión reducida o están ausentes en pétalos de R51 (fases 3-4). Se escrutaron veinte mil colonias, a 2.000 colonias por placa de 15 cm. Antes de la hibridación, los filtros se prelavaron en una disolución de Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, sarcosina al 0,1% (p/v) (disolución de prelavado), a 42ºC, durante 30 minutos. Los filtros se volvieron a lavar luego en 2 x SSC, SDS al 1% (p/v). Los alzados de las colonias por duplicado se prehibridaron (42ºC, 1 h) e hibridaron (42ºC, 16 h) en formamida desionizada al 50% (v/v), NaCl 1 M, SDS al 1% (p/v), sulfato de dextrano al 10% (p/v) (disolución de hibridación). Se añadieron DNA degradado de esperma de salmón (100 \mug/ml) y poli U (20 \mug/ml) junto con las sondas de cDNA marcadas con ^{32}P (3 x 10^{6} cpm/ml) antes de la etapa de hibridación. Los filtros se lavaron en 2 x SSC, SDS al 1% (p/v), a 65ºC durante 2 x 60 minutos, seguido de 0,2 x SSC, SDS al 1% (p/v), a 65ºC durante 30 minutos, y se expusieron a una película Kodak XAR con un filtro de intensificación, a -70ºC durante 16 horas.

Resultantes del anterior escrutinio diferencial, se aislaron 196 clones de cDNA y se dispusieron en agrupaciones ordenadas. Estas agrupaciones se hibridaron luego con sondas de cDNA preparadas a partir del RNA total extraído de pétalos de OGB (fases 3-4), de pétalos de OGB (fase 5) y de hojas de OGB. Setenta y ocho clones de un total de 196 clones de cDNA se habían expresado de manera preferente en los pétalos de OGB (fases 3-4) en comparación con los pétalos de OGB (fase 5) y con las hojas de OGB. Estos clones se seleccionaron para realizar análisis de clones hermanos, análisis de transferencia de RNA y análisis de secuencias.

Ejemplo 5 Análisis de clones hermanos Aislamiento y purificación de insertos de cDNA

Con el fin de determinar cuales de los 78 clones de cDNA eran hermanos, los insertos de cDNA marcados procedentes de una selección se hibridaron con las agrupaciones ordenadas. Los insertos de cDNA se aislaron procedentes del vector plasmídico sometiéndoles a restricción con las endonucleasas de restricción apropiadas y a electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de fusión y en un tampón de TAE para el desarrollo electroforético. El fragmento de DNA correcto se retiró del gel cortándolo y se purificó mediante tres extracciones con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1) seguidas de dos extracciones con éter y una precipitación con etanol. El sedimento de DNA por último se resuspendió en TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) y se hizo una estimación de la concentración sometiendo una parte alícuota a electroforesis en un gel de agarosa, paralela a una cantidad conocida de DNA de SPP-1 sometido a restricción con EcoRI (Bresatec).

Los clones de cDNA positivos se recogieron de las placas, se pasaron a caldo LB + ampicilina (100 \mug/ml) y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas. Partes alícuotas (200 \mul) de los cultivos de la noche se dispusieron luego en bandejas de microtitulación formando agrupaciones ordenadas. Con el fin de someter a escrutinio estos clones de cDNA, las agrupaciones se sembraron en placas replicadas sobre filtros Colony/Plaque Screen™ (DuPont) que se habían extendido sobre la superficie de placas de LB + ampicilina (100 \mug/ml). Las bacterias se cultivaron a 28ºC durante 16 horas, seguido de una incubación de 2 horas a 37ºC. Los filtros se retiraron y se trataron poniéndoles a flotar en una disolución de SDS al 10% (p/v) durante 2 minutos, seguido de secado al aire sobre una capa de papel secante. El DNA se calentó sobre los filtros utilizando el método del autoclave (Allday y Jones, 1987). Antes de la hibridación, los filtros se lavaron en una disolución de prelavado a 42ºC durante 30 minutos y se volvieron a lavar con 2 X SSC, SDS al 1% (p/v). Las etapas de prehibridación e hibridación se llevaron a cabo de la manera previamente descrita.

Trece clones de cDNA presentaron hibridación cruzada con un clon de cDNA (aE10) en condiciones de rigurosidad alta. El clon que llevaba el inserto de cDNA más largo (0,9 kb) se designó pCGP711 y un clon con un inserto de cDNA más corto (0,5 kb) se designó pCGP712.

Ejemplo 6 Aislamiento de un clon de cDNA más largo

El clon de cDNA aE10 aislado en la biblioteca de cDNA n.º 1 tenía una longitud de sólo 0,9 kb. Con el fin de aislar el cDNA de longitud completa, 16.000 pfu procedentes de la biblioteca de cDNA n.º 2 se sometieron a escrutinio con el inserto de cDNA procedente de pCGP711.

Construcción de la biblioteca de cDNA n.º 2

Dos microgramos de RNA poli(A)^{+} se transcribieron de manera inversa en un volumen de 20 \mul que contenía 1 x tampón de reacción de Superscript™, ditiotreitol 10 mM, dATP 500 \muM, dGTP 500 \muM, dTTP 500 \muM, 5-metil-dCTP 500 \muM, 0,75 \mug del oligonucleótido n.º 1 (SEQ ID No.1) y 2 \mul de la transcriptasa inversa Superscript™ (BRL). La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 50 minutos, a 44ºC durante 10 minutos y luego se colocó sobre hielo.

La mezcla de reacción de la segunda cadena (140 \mul) se añadió a la mezcla de reacción de la primera cadena. La mezcla de reacción de la segunda cadena estaba constituida por Tris-HCl 21 mM, KCl 104 mM, MgCl_{2} 5,3 mM, \beta-NAD 171 \muM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 11,4 mM, dATP 214 \muM, dCTP 642 \muM, dGTP 214 \muM, dTTP 214 \muM, DTT 4 mM, 10 \muCi de ^{32}P-dCTP (3.000 Ci/mmol), 15 unidades de la DNA-ligasa de E. coli, 40 unidades de la DNA-polimerasa I de E. coli (Boehringer) y 0,8 unidades de RNasa H. La mezcla final se incubó durante 150 minutos a 16ºC. Para hacer el cDNA bicatenario de extremos romos, se añadieron 10 unidades de la DNA-polimerasa de T4, y la reacción se continuó durante otros 15 minutos a 16ºC. La reacción se detuvo y el cDNA se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo, seguido de extracción con cloroformo y precipitación con etanol.

Adaptadores que portaban el sitio EcoRI se ligaron con el cDNA y a continuación se sometieron a tratamiento con quinasa utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante. Las enzimas se desnaturalizaron con calor (70ºC, 20 minutos) y el DNA se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. El cDNA se digirió con 50 unidades de XhoI (Boehringer) en un volumen de reacción de 100 \mul, usando las condiciones recomendadas por el fabricante. La enzima se desactivó por acción de calor (70ºC, 20 minutos) y la mezcla se pasó a través de una columna giratoria (Pharmacia) que se había equilibrado en tampón de STE (Sambrook y col., 1989). El eluído se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Después de una microcentrifugación a 4ºC durante 30 minutos, el sedimento de cDNA se lavó con etanol al 70% (v/v), se secó al aire y se resuspendió en 10 \mul de tampón de TE (Tris-HCl 1 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM).

Una parte alícuota de 2,5 \mul de la mezcla de cDNA se ligó con 1 \mug del vector \lambdaZAPII tratado con EcoRI/XhoI/CIAP (Stratagene) en 5 \mul de tampón de reacción constituido por Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM y 2 unidades de la DNA-ligasa de T4. La reacción se llevó a cabo a 4ºC durante 4 días.

Después de incubar a temperatura ambiente durante dos horas, la mezcla de la reacción de ligación se empaquetó utilizando el sistema Packagen (Promega). El número total de recombinantes fue de 1 x 10^{6} pfu.

Después de transfectar células PLK-F', el cDNA empaquetado se sembró en una proporción de 50.000 pfu por placa de 15 cm de diámetro. Las placas se incubaron a 37ºC durante 8 horas, y el fago eluyó en NaCl 100 mM, MgSO_{4} 8 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, gelatina al 0,01% (Phage Storage Buffer (PSB)). Se añadió cloroformo y el fago se almacenó a 4ºC considerado como una biblioteca amplificada.

Aislamiento del plásmido

El fago auxiliar R408 (Stratagene) se utilizó para cortar los fagómidos pBluescript que contenían los insertos de cDNA de petunia procedentes de la biblioteca n.º 2 de cDNA amplificado en \lambdaZAP, utilizando los métodos descritos por el fabricante. E. coli XL1-Blue se transfectó con la mezcla de fegómidos y las colonias se sembraron en placas con LB (Sambrook y col., 1989) que contenían ampicilina, 100 \mug/ml. Las colonias individuales se analizaron con respecto a la presencia de los insertos de cDNA haciéndolas crecer en caldo LB (Sambrook y col., 1989) + ampicilina (100 \mug/ml) y aislando el plásmido usando el procedimiento de lisis con álcali (Sambrook y col., 1989). Una vez que se hubo determinado la presencia del inserto de cDNA, se prepararon mayores cantidades de DNA plasmídico a partir de cultivos de toda la noche de 50 ml usando el procedimiento de lisis con álcali. El DNA plasmídico se purificó después mediante separación en bandas en un gradiente de CsCl (Sambrook y col., 1989).

Escrutinio de la biblioteca de cDNA nº. 2

Antes de la hibridación, los alzados de las placas por duplicado se lavaron en la disolución de prelavado a 42ºC durante 30 minutos; se trataron con hidróxido sódico 0,4 M a 42ºC durante 30 minutos; a continuación se lavaron en una disolución de Tris-HCl 0,2 M pH 8,0, 0,1 x SSC, SDS al 0,1% (p/v), a 42ºC durante 30 minutos, y por último se volvieron a lavar en 2 x SSC, SDS al 1% (p/v). La prehibridación se llevó a cabo a 42ºC durante 1 h; a continuación se añadió una sonda marcada con ^{32}P (1 x 10^{5} cpm/ml) a la disolución de hibridación y la hibridación se continuó a 42ºC durante otras 16 h. Los filtros se lavaron luego en 2 x SSC, SDS al 1% (p/v), a 65ºC durante 2 x 30 minutos, seguido de 0,2 x SSC, SDS al 1% (p/v), a 65ºC durante 30 minutos, y se expusieron a una película Kodak XAR con un filtro de intensificación, a -70ºC durante 16 horas.

Uno de los 13 clones que hibridaron, designado pCGP806, contenía un inserto de cDNA (aE10,9) de 1,7 kb, y se eligió para su análisis posterior (Figura 3). Otro de los 13 clones que hibridaron, designado pCGP820, posteriormente se demostró que contenía un inserto de cDNA ligeramente más largo (aE10,12).

Ejemplo 7 Análisis de las secuencias de DNA

La secuenciación de DNA se llevó a cabo esencialmente por el método de Sanger y col., (1977), usando la enzima Sequenase (USB, versión 2.1). La secuencia completa de aE10,9 se determinó usando el kit Erase-a-base (Promega) (SEQ ID No:2). La secuencia parcial del clon de cDNA de pCGP820 (aE10,2) se muestra en la SEQ ID No:3.

Las búsquedas de homologías en comparación con las bases de datos Genbank, SWISS-PROT y EMBL se realizaron usando los programas FASTA y TFASTA (Pearson y Lipman, 1988).

La secuencia completa de aE10,9 se muestra en la SEQ ID No:2. Esta secuencia contenía un marco de lectura abierto de 1.407 bases a partir de la primera metionina, que codifica un polipéptido de 469 aminoácidos. El marco de lectura abierto continúa en dirección aguas arriba desde la primera metionina, según se observa en la secuencia parcial del extremo 5' del inserto de cDNA de pCGP820 (SEQ ID No:3) que muestra que está presente otra metionina en fase, situada 4 aminoácidos en dirección aguas arriba de la primera metionina de aE10,9. La secuencia de aminoácidos codificada por aE10,9 mostró similitud con la Bzl UDP-glucosa:flavonol-3-O-glucosiltransferasa de maíz (Furtek y col., 1988; Ralston y col., 1988) y con la 3GT de Hordeum vulgare (Wise y col., 1990) (Tablas 3A y 3B). La región de más similitud (36%) abarcaba 130 aminoácidos desde el aminoácido 262 hasta el 396 de la secuencia de cDNA de aE10,9. La mitad última de esta región, desde el aminoácido 335 hasta el 387 (que abarcaba 52 aminoácidos) mostró también homología (alrededor del 32%) con otras glicosiltransferasas procedentes de fuentes no vegetales: en concreto, con glucuronosiltransferasas procedentes de seres humanos (Ritter y col., 1991), ratón (Kimura y Owens, 1987) y rata (Mackenzie, 1986) y con una glucosiltransferasa ecdisteroidea procedente del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (O'Reilly y Miller, 1989, 1990). Una comparación de la secuencia de aminoácidos de las glicosiltransferasas de fuentes vegetales, humanas y víricas a lo largo de la extensión de 52 aminoácidos, se muestra en la Tabla 4. Los alineamientos de las secuencias se realizaron usando el programa Clustal (Higgins y Sharp, 1988).

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Ejemplo 8 Análisis de RFLP Aislamiento de DNA genómico

El DNA se aisló de tejido foliar esencialmente de la manera descrita por Dellaporta y col., (1983). Las preparaciones de DNA se purificaron de nuevo mediante una centrifugación en gradiente de densidad de flotación en CsCl (Sambrook y col., 1989).

Transferencias Southern

El DNA genómico (10 \mug) se digirió durante 16 horas con 60 unidades de EcoRI y se sometió a electroforesis a lo largo de un gel de agarosa al 0,7% (p/v) en un tampón de desarrollo de TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 50 mM). El DNA a continuación se desnaturalizó en una disolución de desnaturalización (NaCl 1,5 M/NaOH 0,5 M) durante de 1 a 1,5 horas, se neutralizó en Tris-HCl 0,5 M (pH 7,5)/NaCl 1,5 M durante de 2 a 3 horas y después se transfirió a un filtro Hybond N (Amersham) en 20 x SSC.

Aislamiento de una sonda de DFR-C

Un fragmento del gen dfr-C se amplificó por PCR usando como molde DNA genómico de V23 y dos cebadores oligonucleotídicos, el n.º 4 (SEQ ID No:4) y el n.º 5 (SEQ ID No:5), obtenidos de la secuencia publicada de dfr-C (Gerats y col., 1990). El producto resultante de la PCR, de 170 pb, se purificó en gel y se aisló sobre una membrana NA-45 (Schleicher y Schuell). Después de la elución, el producto de la PCR se ligó en el vector pBluescrpt M13^{-} que contenía una cola de ddT (Stratagene), descrito por Holton y Graham (1991), y se secuenció para confirmar que el fragmento clonado correspondía a la secuencia publicada.

Análisis de RFLP

Las transferencias Southern del DNA genómico de V23 y R51, hibridadas con aE10,9, revelaron una banda de hibridación en ambas líneas, en condiciones de rigurosidad alta. El análisis de RFLP se utilizó para investigar el ligamiento del gen correspondiente al cDNA de aE10,9 a loci genéticos conocidos. El análisis del DNA genómico digerido con EcoRI, aislado de una población de V23 x R51 F2, reveló un RFLP con respecto a la sonda de aE9,10, que estaba ligado a dfc-C. Dfr-C es un marcador molecular del cromosoma VI y está ligado a Rt (Beld y col., 1989). Había una cosegregación de los RFLP de aE10,9 y dfr-C en 26 de cada 34 plantas V23 x R51 F2. Esto representa una frecuencia de recombinación de 8,1% que es similar a la frecuencia de recombinación del 13% descrita entre Rt y dfr-C (Cornu y col., 1990).

Ejemplo 9 Análisis Northern

Se aisló RNA total procedente de tejido que se había congelado en N_{2} líquido y se había molido hasta obtener un polvo fino utilizando maza y mortero. Un tampón de extracción de isotiocianato de guanidina 4 M, Tris HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 20 mM, Sarkosyl al 0,1% (v/v), se añadió al tejido y la mezcla se homogeneizó durante 1 minuto utilizando un Polytron a velocidad máxima. La suspensión se filtró a través de Miracloth (Calbiochem) y se centrifugó en un rotor JA20 durante 10 minutos a 10.000 rpm. El sobrenadante se recogió y se preparó en CsCl,0,2 g/ml (p/v). Las muestras se extendieron luego sobre una capa de 10 ml de CsCl 5,7 M, EDTA 50 mM (pH 7,0), en tubos de centrífuga Quick-seal de 38,5 ml (Beckman) y se centrifugaron a 42.000 rpm durante 12-16 horas, a 23ºC, en un rotor Ti-70. Los sedimentos se resuspendieron en TE/SDS (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, SDS al 0,1% (p/v)) y se extrajeron con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), saturado en EDTA 10 mM (pH 7,5). Después de la precipitación en etanol, los sedimentos de RNA se resuspendieron en TE/SDS.

Las muestras de RNA se sometieron a electroforesis a través de geles de agarosa al 1,2% (p/v) en formaldehído 2,2 M, utilizando un tampón de desarrollo que contenía ácido morfolinopropanosulfónico 40 mM (pH 7,0), acetato sódico 5 mM, EDTA 0,1 mM (pH 8,0). El RNA se transfirió a filtros Hybond-N (Amersham) de la manera descrita por el fabricante y se hibridó con un fragmento de cDNA marcado con ^{32}P (10^{8} cpm/\mug, 2 x 10^{6} cpm/ml). Se llevaron a cabo una prehibridación (1 h a 42ºC) y una hibridación (16 h a 42ºC) en formamida al 50% (v/v), NaCl 1M, SDS al 1% (p/v), sulfato de dextrano al 10% (p/v). Para la etapa de hibridación, se añadió DNA de esperma de salmón degradado (100 \mug/ml) junto con la sonda marcada con ^{32}P.

Los filtros se lavaron en 2 x SSC, SDS al 1% (p/v) a 65ºC durante de 1 a 2 horas, y luego en 0,2 x SSC, SDS al 1% (p/v) a 65ºC durante de 0,5 a 1 hora. Los filtros se expusieron a una película Kodak XAR con un filtro de intensificación a -70ºC durante 16 horas.

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Expresión en mutantes

Se estudió la influencia de tres loci genéticos (Rt, An1 y An2) sobre la acumulación del mRNA que se hibrida con la sonda aE10,9 (Figura 5A). Según descripciones previas, Rt controla la ramnosilación de antocianidín-3-glucósidos mientras que An1 y An2 son genes reguladores que controlan la actividad de varios genes estructurales implicados en la biosíntesis de antocianina (Gerats y col., 1984). En el tejido de los pétalos de las líneas Rt/Rt, An1/An1, An2/An2 (Da, Sd5, Skr4, R18 y R51), se detectaron dos mRNA de aproximadamente 2,4 kb y 1,5 kb con la sonda aE10,9, en comparación con sólo un mRNA de aproximadamente 1,7 kb detectado en OGB y en otras líneas Rt/Rt, An1/An1, An2/An2 (Tbl-3 y V23). Las líneas R51, V23 y OGB también se hibridaron con los clones hermanos de cDNA de aE10,9 más cortos (datos no mostrados). El inserto de cDNA de 0,5 kb de pCGP712, que comenzaba en el nucleótido 736 de la secuencia de aE10,9 (SEQ ID No:2) solamente detectó el transcrito de 2,4 kb de la línea R51. El inserto de cDNA de 0,9 kb de pCGP711, que comenzaba en el nucleótido 1.217 de la secuencia de aE10,9 (SEQ ID No:2), detectó los dos transcritos de 2,4 kb y 1,5 kb en la línea R51. Ambos clones de cDNA, el de 0,5 kb y el 0,9 kb, detectaron el transcrito de tipo salvaje en las líneas V23 y OGB. No hubo expresión detectable del mRNA que se hibridó con la sonda aE10,9 en las líneas An1/An1 o An2/An2 (Ba20, Dla51, Pla3 y Tlh1).

El locus Rt en la línea Tr38 de petunia es inestable debido a la presencia de un transposón (Cornu, 1977). Se desarrollan pétalos revertantes carmesí cuando ese transposón se ha escindido en una etapa temprana del desarrollo floral. El RNA total aislado a partir de pétalos de color rosa de Tr38 (rt*) y de pétalos revertidos carmesí de Tr38 (Rt) se estudió con respecto a la expresión de un mRNA que se hibridara con la sonda aE10,9 (Figura 5B). La sonda aE10,9 detectó una especie de RNA de 2,0 kb en el tejido de pétalos rt* y un transcrito de 1,7 kb en el tejido revertante.

Ejemplo 10 Preparación de construcciones Construcción de pCGP293

El vector de expresión binario pCGP293 derivó del vector binario Ti, pCGN1559 (McBride y Summerfelt, 1990). El plásmido pCGN1559 se digirió con KpnI y los extremos 3' protuberantes se suprimieron con la DNA-polimerasa de T4 conforme a protocolos estándar (Sambrook y col., 1989). El vector después se digirió de nuevo con XbaI y el extremo protuberante 5' resultante se reparó utilizando el fragmento de Klenow de la DNA polimerasa I. El vector a continuación se religó para obtener el pCGP67. Un fragmento PstI de 1,97 kb que contenía el promotor Mac, el terminador del gen mas y diferentes sitios de clonación (Comai y col., 1990) se aisló a partir de pCGP40 y se insertó en el sitio PstI de pCGP67 para obtener pCGP293.

El plásmido pCGP40 se construyó retirando el gen GUS (Jefferson y col., 1987) en forma de un fragmento BamHI-SacI procedente de pCGN7334 y reemplazándolo con el fragmento BamHI-SacI procedente de pBluescribe M13^{-} que incluye el sitio de multiclonación. El plásmido pCGN7334, obtenido procedente de Calgene Inc. (CA, USA), se construyó insertando el fragmento que contenía la fusión de los genes Mac-GUS-mas en el sitio XhoI de pCGN7329 (Comai y col., 1990).

Construcción de pCGP810

El plásmido pCGP810 se construyó clonando el inserto de cDNA procedente de pCGP806 en una orientación con sentido detrás del promotor Mac (Comai y col., 1990) de pCGP293. El plásmido pCGP806 se sometió a restricción con BamHI y KpnI para liberar el inserto de cDNA. El fragmento de cDNA se aisló en un gel de agarosa de bajo punto de fusión y se ligó con los extremos BamHI/KpnI del vector binario pCGP293. La ligación se llevó a cabo utilizando el kit de ligación de Amersham con 400 ng del vector binario pCGP293 y 85 ng del fragmento de cDNA de aE10,9 de 1,7 kb. La inserción correcta del inserto en pCGP810 se estableció mediante análisis de restricción con PstI de DNA aislado de transformantes resistentes a gentamicina.

Construcción de pCGP811

El plásmido pCGP811 (Figura 7) se construyó clonando el inserto de cDNA procedente de pCGP806 en una orientación antisentido detrás del promotor Mac (Comai y col., 1990) de pCGP293. El plásmido pCGP806 se sometió primero a restricción con ApaI. Los extremos protuberantes en 3' se "cortaron hacia atrás" con DNA-polimerasa (fragmento de Klenow) según se describe en Sambrook y col., 1989. El plásmido se sometió después a restricción con XbaI para aislar el fragmento que contenía el inserto de cDNA. Los extremos protuberantes XbaI en 5' se rellenaron utilizando DNA-polimerasa (fragmento de Klenow) (Sambrook y col., 1989). El fragmento de cDNA se aisló en un gel de agarosa de bajo punto de fusión y se ligó con los extremos romos XbaI/BamHI del vector binario pCGP293. La ligación se llevó a cabo utilizando el kit de ligación de Amersham con 400 ng del vector binario pCGP293 y 85 ng del fragmento de cDNA de aE10,9 de 1,7 kb. La inserción correcta del inserto en pCGP811 se estableció mediante análisis de restricción con PstI del DNA aislado de transformantes resistentes a gentamicina.

Ejemplo 11 Transformaciones de A. Tumefaciens

Los plásmidos pCGP811 y pCGP810 (Figuras 6 y 7) se introdujeron en la cepa AGL0 de Agrobacterium tumefaciens añadiendo 5 \mug de cada uno de los DNA plasmídicos a 100 \mul de células AGL0 competentes, preparadas inoculando un cultivo de MG/L de 50 ml (Garfinkel y Nester, 1980) y cultivándolo durante 16 h con agitación, a 28ºC. Las células después se sedimentaron y se resuspendieron en 0,5 ml de CaCl_{2} 100 mM/glicerol (85%/15% (v/v)). La mezcla de DNA-Agrobacterium se congeló mediante incubación en N_{2} líquido durante 2 minutos y a continuación se dejó descongelar mediante incubación a 37ºC durante 5 minutos. La mezcla DNA-bacterias se puso luego sobre hielo durante 10 minutos más. Las células después se mezclaron con 1 ml de medio MG/L y se incubaron con agitación durante 16 horas a 28ºC. Las células de A. tumefaciens que portan pCGP811 o pCGP810 se seleccionaron en placas de agar MG/L que contenían gentamicina, 100 \mug/ml. La presencia de pCGP811 o pCGP810 se confirmó mediante análisis Southern de DNA aislado de transformantes resistentes a gentamicina.

Ejemplo 12 Transformaciones en petunia Material vegetal

Tejido foliar de plantas maduras de P. hybrida cv VR se esterilizó en hipoclorito sódico al 1,25% (p/v) durante 2 minutos y después se lavó tres veces en agua estéril. El tejido foliar se cortó luego en cuadrados de 25 mm^{2} y se precultivó en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) complementado con quinetina, 0,05 mg/litro, y ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1,0 mg/litro, durante 24 horas.

Co-cultivo de tejido de Agrobacterium y Petunia

La cepa AGL0 de A. tumefaciens (Lazo y col., 1991) que contenía el vector binario pCGP811 o pCGP810 (Figuras 6 y 10) se mantuvo a 4ºC en placas de agar MG/L (Garfinkel y Nester, 1980) con gentamicina, 100 mg/litro. Una colonia única se cultivó toda la noche en un medio líquido que contenía Bacto-peptona al 1% (p/v), Bacto-extracto de levadura al 0,5% (p/v) y NaCl al 1% (p/v). Una concentración final de 5 x 10^{8} células/ml se preparó al día siguiente por dilución en medio líquido MS que contenía vitaminas B5 (Gamborg y col., 1968) y sacarosa al 3% (p/v) (BPM). Los discos foliares se sumergieron durante 2 minutos en BPM que contenía AGL0/pCGP811 o AGL0/pCGP810 según se ha descrito anteriormente. Los discos foliares se secaron luego en papel secante y se pusieron en el medio de co-cultivo durante 4 días. El medio de co-cultivo estaba formado por medio SH (Schenk y Hildebrant, 1972) complementado con quinetina, 0,05 mg/litro, y 2,4-D, 1,0 mg/litro), e incluía una capa de células de alimentación, de una suspensión de células de tabaco extendida sobre el medio de co-cultivo, con un papel de filtro colocado sobre la superficie de la suspensión de células de tabaco.

Recuperación de plantas de petunia transgénicas

Después del co-cultivo, los discos foliares se transfirieron a medio MS complementado con sacarosa al 3% (p/v), \alpha-bencilaminopurina (BAP) (1 mg/litro para los discos foliares de VR o 4,0 mg/litro para los discos foliares de SD), ácido \alpha-naftalenoacético (NAA) 0,1 mg/litro, kanamicina (300 mg/litro para los discos foliares de VR o 100 mg/litro para los discos foliares de SD), cefotaxima 350 mg/litro y Gelrite Gellan Gum (Schweizerhall) al 0,3% (p/v) (medio de selección). Los explantes en regeneración se transfirieron a medio de selección de nueva aportación pasadas 4 semanas. Los brotes adventicios que sobrevivieron a la selección con kanamicina se aislaron y se transfirieron a BPM que contenía kanamicina 100 mg/litro y cefotaxima 200 mg/litro, para la inducción de las raíces. Todos los cultivos se mantuvieron en condiciones de un fotoperíodo de 16 h (luz fluorescente blanca fría 60 \mumoles, m-2, s-1) a 23ºC \pm 2ºC. Cuando las raíces alcanzaron 2-3 cm de longitud, las plántulas de petunia transgénicas se transfirieron a una mezcla de tierra para macetas Debco 51410/2, esterilizada en autoclave, contenida en tubos de 8 cm. Pasadas 4 semanas, las plantas se replantaron en macetas de 15 cm utilizando la misma mezcla de tierra para macetas, y se mantuvieron a 23ºC en condiciones de un fotoperíodo de 14 horas (luz de halogenuro de mercurio 300 \mumoles, m-2, s-1).

Ejemplo 13 Análisis fenotípicos de las plantas transgénicas pCGP810 en SD

La Tabla 5 muestra los diferentes fenotipos de color de pétalos y de polen, obtenidos con plantas SD transformadas con el plásmido pCGP810. Las dos plantas transgénicas n.º 2129 y n.º 2128 produjeron flores con un color de pétalos y polen alterado, así como flores que se asemejaban a las de las plantas SD de control. Estos cambios en el color del polen se observaron tras la introducción el plásmido pCGP810 en las plantas de petunia SD y fueron un acontecimiento inesperado. Los códigos se han tomado de la Royal Horticultural Society's Colour Chart. Estos códigos proporcionan un medio alternativo mediante el que describir los fenotipos de color observados. Los números asignados, sin embargo, deben considerarse únicamente como una guía en relación a los colores percibidos y no deben considerarse limitativos de los colores posibles que pueden obtenerse.

TABLA 5

Número de registro	Código de la RHSCC	Color de los pétalos	Color del polen
VR	80ª	púrpura	azul
Control de SD	63B/C	rosa oscuro	blanco/verde
2128	63B/C	igual que SD	blanco/verde
2129	64C	rosa/púrpura variegado	azul
2130	71B/C	púrpura	azul
RHSCC = Royal Horticultural Society Colour Chart

pCGP811 en VR

La Tabla 6 muestra los diferentes fenotipos de color obtenidos con plantas VR transformadas con el plásmido pCGP811. Los códigos también esta vez se han tomado de la Royal Horticultural Society's Colour Chart, y al igual que se ha manifestado anteriormente, estos códigos deben considerarse únicamente como una guía en relación a los colores percibidos y no deben considerarse limitativos de los colores posibles que pueden obtenerse.

TABLA 6

Número de registro	Código de la RHSCC	Color de los pétalos
Control de VR	80ª	púrpura
2127	80ª	igual que VR
2123	64B, 67A, 71C	rosa oscuro
2125	71D	rosa oscuro
2126	67C+78ª	rosa/púrpura variegado
2122	71C	rosa oscuro
2132	80ª	igual que VR
2129	64B	rojo/rosa
2124	80ª	igual que VR
2130	80ª	igual que VR
2128	74B	rosa oscuro
2144	80ª	igual que VR
2131	67C+78ª	rosa/púrpura variegado
RHSCC = Royal Horticultural Society Colour Chart

Ejemplo 14 Extracción de los pigmentos Antocianidinas

Antes de los análisis de HPLC o TLC, las moléculas de antocianina presentes en los extractos de los pétalos se hidrolizaron con ácido para separar los restos glicosílicos de la molécula principal de las antocianidinas. El patrón de hidroxilación en el anillo B de los pigmentos antocianidinas se determinó por análisis de HPLC o TLC de la molécula principal de las antocianidinas.

Los pigmentos florales se extrajeron e hidrolizaron incubando un limbo de pétalo con 1 ml de ácido clorhídrico 2 M, a 100ºC, durante 30 minutos. Las antocianinas hidrolizadas se extrajeron con 200 \mul de alcohol isoamílico. Esta mezcla se secó luego al vacío y se resuspendió en un volumen más pequeño de 20 \mul de alcohol isoamílico. Una parte alícuota de 5 \mul de los extractos procedentes del pCGP810 en pétalos, anteras y estilos de SD, se aplicó en forma de mancha en una placa de TLC. Una parte alícuota (5 \mul) de los extractos procedentes del pCGP811 en pétalos de VR se separó, se secó al vacío y se resuspendió en 200 \mul de acetonitrilo al 50% (v/v) y TFA al 0,5% (v/v).

Antocianinas

Se prepararon extractos de pigmentos no hidrolizados de las flores de petunia transgénicas, añadiendo los limbos de pétalos, estilos o anteras a 1 ml de HCl al 1% (v/v) en metanol, y se incubaron en oscuridad a 4ºC durante 16 horas. Los extractos se separaron luego y se secaron al vacío. Los pigmentos se resuspendieron en 100 \mul de HCl al 1% (v/v) en metanol. Una parte alícuota de los extractos procedentes del pCGP811 en pétalos de VR y del pCGP810 en pétalos de SD se aplicó en forma de mancha en una placa de TLC.

Análisis de antocianidinas por HPLC

Una parte alícuota de 5 \mul de las antocianidinas procedentes del pCGP811 presente en pétalos de VR, en 200 \mul de acetonitrilo al 50% (v/v) y TFA al 0,5% (v/v), se analizó por HPLC por medio de una elución en gradiente, utilizando condiciones de gradiente desde el 50% de B al 60% de B durante 10 minutos, seguidamente 60% de B durante 10 minutos, y por último desde 60% de B hasta 100% de B durante 5 minutos, estando el disolvente A constituido por TFA:H_{2}O (5:995) y el disolvente B constituido por acetonitrilo:TFA:H_{2}O (500:5:495). Una columna de cartucho Asahi Pac ODP-50 (250 mm x 4,6 mm de D.I.) se utilizó para las separaciones cromatográficas en fase inversa. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min y la temperatura fue de 40ºC. La detección de los compuestos antocianidinas se llevó a cabo utilizando un detector tridimensional Shimazu SDP-M6A a 400-650 nm.

Los picos de las antocianidinas se identificaron con referencia a estándar conocidos, a saber: delfinidina, cianidina y malvidina.

Análisis de antocianidinas por TLC

Los extractos de pigmentos hidrolizados con ácido se cromatografiaron en el sistema de disolventes de Forestal (HOAc:agua:HCl; 30:10:3) (Markham, 1982).

Análisis de antocianinas por HPLC

Los picos correspondientes al delfinidín-3-glucósido procedente de los extractos de pétalos no hidrolizados de la petunia SD y a un transformante antisentido de aE10,9 en VR, se identificaron por HPLC con referencia a un estándar de delfinidín-3-glucósido. Las fracciones de delfinidín-3-glucósido se purificaron luego dos veces por HPLC usando condiciones de elución en gradiente, en primer lugar desde el 10% de D hasta el 60% de D durante 40 minutos y después del 60% de D durante 40 minutos. La recogida de las fracciones se llevó a cabo en el período de 39 a 46 minutos. Las condiciones de repurificación fueron desde el 20% de D hasta el 40% de D durante 40 minutos y después del 40% de D durante 30 minutos. La recogida de fracciones se hizo en el período de 38 a 45 minutos. (El disolvente C fue H_{2}O y el disolvente D fue acetonitrilo al 50% (v/v), TFA al 0,5% (v/v). Las fracciones purificadas se sometieron luego a espectrometría de masas para confirmar la identificación del compuesto como delfinidín-3-glucósido.

Análisis de antocianinas por TLC

Partes alícuotas de extractos de pigmentos no hidrolizados se aplicaron en forma de mancha en placas de TLC de celulosa sobre plástico (MERCK) y se cromatografiaron en dos sistemas de disolventes distintos, HOAc al 15% y BAW (Butan-1-ol:HOAc:agua; 4:2:5).

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Ejemplo 15 Complementación de un mutante rt (pGCP810 en SD)

La línea SD de la petunia híbrida es homocigota recesiva con respecto al gen Rt. Produce flores de color rosa que acumulan pigmentos con delfinidín-3-glucósido. Una versión con sentido del cDNA de aE10,9 se clonó detrás del promotor Mac constitutivo y se introdujo en SD. Tres de cada cuatro transformantes independientes produjeron flores de color más intenso. Los análisis de cromatografía en capa fina (TLC) (del inglés, " Thin Layer Chromatography") de extractos de estas flores hidrolizados con ácido revelaron que la malvidina era el pigmento principal producido en los pétalos. Debido a que la línea SD es dominante con respecto a Gf, Mt y Mf, la mutación en Rt es la única lesión que evita que esta línea produzca malvidina (véase la Figura 1B). Por lo tanto, las producción de este pigmento en las flores transgénicas proporcionó una evidencia obligada de que el cDNA de aE10,9 es capaz de complementar la mutación de Rt y que por lo tanta codifica la 3RT.

Ejemplo 16 Supresión antisentido de la actividad de 3Rt (pCGP811 en VR)

El cDNA de aE10,9 se clonó detrás del promotor constitutivo Mac en una orientación antisentido y se introdujo en la línea VR de petunia híbrida de flores púrpura. Siete de cada 12 transformantes independientes mostraron un color de flores alterado. La mayoría de los casos las flores tenían un tono uniforme de color rosa, pero en dos casos las flores fueron variegadas y contenían sectores púrpura y sectores rojos. Los análisis de HPLC y TLC de extractos no hidrolizados de los pétalos revelaron que el delfinidín-3-glucósido era el pigmento principal en las flores transgénicas de colores más claros. La producción de malvidina estaba significativamente disminuida pero no totalmente suprimida en la totalidad de las plantas transgénicas examinadas y en ellas había una producción aumentada de petunidina (Tabla 7). La Tabla 7, a la vuelta de la página, muestra los análisis por HPLC de las antocianidinas presentes en algunas de las flores de las plantas transgénicas de petunia VR transformadas con pCGP811.

TABLA 7

Número de	Genotipo	Proporción de	Proporción de	Proporción
registro		delfinidina	petunidina	de malvidina
		(%)	(%)	(%)
		RT=7,5 min	RT=9,8 min	RT=13,5 min
VR	Rt	-	11,8%	88,1%
2125	Rt A/S	59,9%	33,6%	6,4%
2129	Rt A/S	66,8%	29,2%	4,0%
2131	Rt A/S	22,7%	19,4%	57,8%
Da	rt/rt	94,9%	3,8%	1,3%
A/S = antisentido
RT = tiempo de retención
Proporción % = % de antocianinas detectadas

La expresión antisentido del cDNA de aE10,9 en plantas VR interfirió con la producción de malvidina y produjo una acumulación de delfinidín-3-glucósidos. Este resultado apoya la postura de que el locus Rt codifica 3RT ya que la ramnosilación de los antocianidín-3-glucósidos precede a la 5-O-glucosilación, acilación y metilación (Figura 1). Curiosamente, ninguna de las plantas transgénicas presentó un perfil de pigmentos que se correspondiera exactamente con el de cualquier mutante en Rt caracterizado con anterioridad, ya que en todos los casos hubo alguna producción tanto de petunidina como de malvidina. Presumiblemente se produjo un bloqueo incompleto de la actividad del gen Rt. Sí que hubo, sin embargo, una correlación entre el color de las flores y el porcentaje de los pigmentos malvidina presentes en los extractos de pétalos. Las flores de colores más claros contenían menores cantidades de malvidina que las flores de colores más oscuros. Las flores transgénicas también contenían niveles más altos de pigmentos petunidina en comparación con el control de VR. Estudios mutacionales realizados con anterioridad predecirían que todos los pigmentos de petunia formados deberían haberse convertido en el pigmento malvidina por acción de las metiltransferasas controladas por los loci Mf1 y Mf2 (Wiering y de Vlaming, 1984). Sin embargo, Jonsson y col., (1984a y b) han informado que la cantidad de malvidina formada, en relación con la de petunidina, varía con la concentración del sustrato (delfinidín(3-p-cumaroil)rutinósido-5-glucósido) y que una concentración alta del sustrato inhibe la formación de malvidina. Una posible explicación de estos resultados es que los niveles altos de los delfinidín-3-glucósidos pueden tener efecto sobre las reacciones de metilación controladas por los loci Mf1 y Mf2. Como alternativa, puede requerirse una concentración mínima del sustrato petunidina para una metilación eficiente en 5'.

Ejemplo 17 Expresión temporal y espacial de Rt

El perfil de expresión del gen Rt se estudió mediante análisis de transferencia de RNA e hibridación in situ.

Aislamiento de genes de la biosíntesis de flavonoides, caracterizados con anterioridad (a) CHI

Un clon de cDNA de chi-A (van Tunen y col., 1988) se sintetizó por PCR usando 10 ng procedentes de la biblioteca de cDNA n.º 1 y dos oligonucleótidos, el n.º 2 (SEQ ID No:6), que abarca los nucleótidos 6-20, y el n.º 3 (SEQ ID No:7) que era complementario a los nucleótidos 711-725 de la secuencia de cDNA de chi-A publicada (van Tunen y col., 1988). El producto resultante de la PCR se trató con quinasa y después se ligó en el sitio SmaI de pBluescribe M13^{-} (Stratagene) y se secuenció para confirmar que el fragmento clonado correspondía a la secuencia publicada.

(b) DFR-A

El clon de cDNA que correspondía a dfr-A se aisló a partir del escrutinio diferencial de la biblioteca de cDNA n.º 1 y se identificó por análisis de la secuencia y comparación con la secuencia publicada (Beld y col., 1989).

(c) PAL (i) Construcción la biblioteca de cDNA n.º 3

El RNA total se aisló a partir de plantas en fase de 1 a 3 de P. hybrida cv OGB. El RNA poli(A)^{+} se purificó mediante cromatografía en celulosa con oligo-dT. Se sintetizó un cDNA bicatenario a partir de 2,5 \mug de RNA poli(A)^{+} utilizando una modificación del método de Lapeyre y Amalric (1985). No se realizó el tratamiento del cDNA bicatenario con la nucleasa S1 antes de la ligación del conector. Se ligaron adaptadores EcoRI (Promega) al cDNA bicatenario, la ligasa se desactivó por acción de calor (70ºC durante 20 minutos) y los adaptadores se trataron con quinasa para permitir la posterior ligación del DNA vector desfosforilado. Los adaptadores y las moléculas pequeñas de cDNA no ligados se separaron mediante una cromatografía en una columna giratoria de Sephadex S200 (Pharmacia). Una cuarta parte de cDNA se ligó con 1 \mug de IZAP (Stratagene) cortado con EcoRI y desfosforilado. Una vez empaquetada, la biblioteca se tituló transfectando E. coli BB4 y sembrando en placa sobre un medio NZY que contenía X-gal. La biblioteca contenía 23.000 recombinantes.

(ii) Escrutinio de la biblioteca de cDNA n.º 3

La biblioteca de cDNA n.º 3 se escrutó con un fragmento de cDNA que portaba PAL, procedente de patata (una donación del Dr. Imre E., Somssich, Max Planck Institute, Köln, Alemania). La prehibridación (42ºC, 1 hora) y la hibridación (42ºC, 16 horas) se llevaron a cabo en formamida al 20% (v/v), 6 x SSC y SDS al 1% (p/v). Las condiciones de baja rigurosidad de los lavados incluyeron 2 x 5 minutos en 2 x SSC/SDS al 0,1% (p/v) a temperatura ambiente, seguido de 2 x 30 minutos en 2 x SSC /SDS al 0,1% (p/v) a 42ºC. La identificación del clon de cDNA de petunia que portaba PAL se confirmó por análisis de la secuencia y comparación con la secuencia publicada perteneciente a Phaseolis vulgaris (Edwards y col., 1985).

(d) Clon de cDNA que porta CHS

Un fragmento genómico que porta chs-A de petunia, de 8 kb, procedente de PgP32 (Reif y col., 1985) se utilizó para escrutar la biblioteca de cDNA n.º 1. Un clon de cDNA de longitud completa que porta chs-A de petunia se aisló utilizando las condiciones de hibridación estándar previamente descritas. La identificación se confirmó por análisis de la secuencia y comparación con la secuencia publicada (Koce y col., 1986).

Inducción de la síntesis de delfinidina en hojas, por acción de glucosa y alta luminosidad

Se recogieron hojas procedentes de P. hybrida cv OGB y se cortaron en secciones de 1 cm^{2} en agua estéril. Las secciones de las hojas se pusieron luego a flotar sobre una disolución de glucosa al 2% (p/v) y se expusieron a una intensidad lumínica de 24.000 lux durante 96 horas.

Expresión temporal (a) Regulación por las fases de desarrollo

El RNA total procedente de pétalos de P. hybrida cv OGB, se recogió de flores en las diferentes fases del desarrollo definidas en el anterior Ejemplo 1, se estudió con respecto a la expresión de distintos genes implicados en la ruta biosintética de los flavonoides.

El gen correspondiente al clon de cDNA de aE10,9 se encontró que estaba regulado por las fases del desarrollo durante la maduración de la corola, en general tenía su expresión máxima aproximadamente en las fases 1-2 del desarrollo de las flores (Figura 8). Este perfil según la fase de desarrollo fue similar al de la expresión de otros genes implicados en la biosíntesis de flavonoides, aunque la expresión de CHS, CHI, DFR y PAL generalmente tenía su máximo en las fases 2-3 del desarrollo de las flores (Figura 8).

(b) Inducción de la ruta de la antocianina en tejido foliar

Los genes de la ruta biosintética de los pigmentos flavonoides normalmente no se expresan en tejido foliar. Sin embargo, la síntesis de los pigmentos de delfinidina se indujo en hojas de OGB por incubación en una disolución de glucosa al 2% (p/v) en condiciones de alta luminosidad. En estas condiciones, el gen correspondiente al clon de cDNA de aE10,9 se detectó en el tejido foliar de OGB. La inducción máxima del RNA mensajero se demostró que tuvo lugar pasadas 96 horas. También se indujo la expresión de varios otros genes de la biosíntesis de pigmentos (Figura 9).

(c) Expresión en diferentes órganos

El RNA total procedente de diferentes órganos de P. hybrida cv OGB se estudió con respecto a la expresión del gen correspondiente al clon aE10,9 (Figura 10). El mensaje se detectó en el pétalo y el estigma, aunque en este último el mensaje se detectó a un nivel enormemente reducido. Por lo tanto, la expresión del mRNA de 3RT parece estar regulada por las fases del desarrollo en concreto en pétalos y flores.

Expresión espacial - Hibridaciones in situ (a) Preparación de tejidos vegetales

Los pétalos se cortaron en trozos de 2-3 mm y junto con las anteras y los estigmas se fijaron en paraformaldehído al 4% (v/v) en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (del inglés, " Phosphate Buffered Saline") y MgCl_{2} 5 mM, pH 7,4, durante aproximadamente 16-24 horas (Lawrence y Singer, 1985; Singer y col., 1986). Los tejidos se deshidrataron luego a través de una serie de etanoles de grado y se incluyeron en Paraplast (Berlyn y Miksche, 1976). Se cortaron secciones transversales de 10 \mum de grosor y se montaron en portaobjetos excavados. (Portaobjetos que se habían tratado con 3-aminopropiltrietoxisilano al 2% en acetona durante 5 minutos y después se habían lavado en agua destilada y secado al aire).

(b) Preparación de sondas de RNA

Se prepararon sondas de DNA específicas de cadena usando el kit de reacción Riboprobe (Stratagene).

(c) Hibridación

Los portaobjetos con las secciones montadas se desparafinaron en xileno y después de hidrataron haciéndolos pasar a través de una serie de etanoles de grado según la manera descrita por Martineau y Taylor (1986). Las secciones se trataron luego en PBS y en MgCl_{2} 5 mM durante aproximadamente 30 minutos, seguido de 10 minutos en glicina 0,1 M, Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5.

En cada uno de los portaobjetos, se liofilizaron 1,2 x 10^{6} cpm de la sonda de RNA, 50 \mug de tRNA de E. coli (Boehringer Mannheim) y 25 \mug de DNA de esperma de arenque degradado (Sigma), y a continuación se resuspendieron en 25 \mul de formamida desionizada (BDH) que se habían calentado a 90ºC. Una parte alícuota de 25 \mul de la mezcla de hibridación 2X se calentó luego para obtener una concentración final de 2 x SSC, BSA al 0,2% (p/v), sulfato de dextrano al 10%, DTT 75 mM, 1 unidad/\mul de inhibidor de RNasin-ribonucleasa (Promega) y formamida al 50% (v/v). Una gotita de 40 \mul se colocó sobre la sección y se cubrió con un cubreobjetos. Las hibridaciones se llevaron a cabo en una cámara humidificada a 37ºC durante 16 horas.

El lavado se llevó a cabo en formamida al 50% (v/v), 2 x SSC, DTT 20 mM, durante 5 minutos a temperatura ambiente para retirar los cubreobjetos, seguido de 30 minutos a 42ºC en RNasa A 10 \mug/ml, NaCl 500 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,0, DTT 20 mM y luego de 2 x SSC, DTT 20 mM y 1 x SSC, DTT 20 mM. El lavado final se hizo en 1 x SSC, DTT 20 mM a temperatura ambiente durante otros 30 minutos. Los portaobjetos a continuación se deshidrataron en una serie de etanoles de grado de la manera descrita por Martineau y Taylor (1986). Los portaobjetos se secaron al aire y a continuación se expusieron a una película Fuji RX a -70ºC durante 16 horas para medir la duración de la exposición a la emulsión nuclear líquida para el registro de trazas (Coghlan y col., 1985). Los portaobjetos a continuación se revistieron con la emulsión nuclear líquida para el registro de trazas Kodak NTB-2 (diluida en proporción 1:1 con agua destilada) a 45ºC, se dejaron secar en posición vertical y después se colocaron en una caja protegida herméticamente frente a la luz, junto con cristales de gel de sílice (6-18 mesh) (BDH) y se almacenaron a 4ºC durante 5 días. Los portaobjetos se revelaron según se describe en Martineau y Taylor (1986). Los portaobjetos se lavaron con agua corriente durante 15 minutos y seguidamente se deshidrataron a través de una serie de etanoles de grado, haciéndoles pasar después a través de xileno:etanol al 95% (1:1) y xileno. Los portaobjetos se montaron luego de modo permanente con Euckitt (O. Kindler).

Los portaobjetos se examinaron con un fotomicroscopio de Nikon. El portaobjetos de control fue un portaobjetos hibridado con el transcrito con sentido, considerado como una indicación del fondo. Se tomaron fotografías con una película Kodak Ektachrome 160T.

La expresión espacial del transcrito de Rt se estudió mediante una hibridación in situ. En secciones de pétalos, el cDNA de aE10,9 se unió predominantemente a las células epidérmicas, aunque se detectó una hibridación limitada a las células mesófilas (Figura 11). Esto corresponde a una acumulación del pigmento antocianina que se localiza esencialmente en las capas epidérmicas de los pétalos. Experimentos preliminares de hibridación in situ, realizados en secciones de estilos y anteras, han detectado también un transcrito de Rt en estos órganos.

Como parte de un programa para aislar clones de cDNA implicados en la ruta de la antocianina, se utilizó una estrategia de escrutinio diferencial para escrutar una biblioteca de cDNA de pétalos de OGB con sondas de cDNA preparadas a partir de pétalos de OGB (limbo y parte tubular) de flores en fases 3-4 y en pétalos (parte tubular) de R51. La línea R51 de petunia es mutante en varios loci que se sabe que están implicados en la biosíntesis de antocianina, y porta también una mutación ciega que conduce a la formación de flores constituidas mayoritariamente por parte tubular con limbos reducidos. Se detectarían dos clases de clones de cDNA con este escrutinio diferencial, los clones que se expresarían preferencialmente en tejido del limbo en comparación con el tejido de la parte tubular, y los clones que presentarían una regulación por disminución debido a las mutaciones específicas. El clon de cDNA aE10,9 mostró similitudes de la secuencia en comparación con glicosiltransferasas previamente secuenciadas. Los análisis de RFLP y de transferencia de RNA proporcionaron una fuerte evidencia de que este cDNA corresponde al locus Rt que es homocigoto recesivo en R51. Esto se verificó mediante complementación entre una mutación de Rt y el cDNA de aE10,9. Además, la expresión antisentido del clon de cDNA aE10,9 inhibió la ramnosilación de los antocianidín-3-glucósidos.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: (En otros países diferentes de EE.UU):

\hskip2cm

INTERNATIONAL FLOWER DEVELOPMENTS, PTY. LTD.

\hskip3cm

(Solamente en EE.UU.):

\hskip2cm

BRUGLIERA, Filippa; HOLTON, Timothy Albert

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(ii)

TÍTULO DEL INVENTO: SECUENCIAS GENÉTICAS QUE CODIFICAN ENZIMAS GLICOSILTRANSFERASAS Y SUS USOS

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: DAVIES COLLISON CAVE

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 1 LITTLE COLLINS STREET

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(C)

CIUDAD: MELBOURNE

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(D)

ESTADO: VICTORIA

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: AUSTRALIA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 3000

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release n.º 1.0,

\hskip5.3cm

Versión n.º 1.25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: AU INTERNACIONAL

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de julio de 1993

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS PREVIOS DE LA SOLICITUD:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: AU PL 3846

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de julio de 1992

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: SLATTERY, JOHN M.

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: EJH/JMS/LM

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 61 3 254 2777

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 61 3 254 2770

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TELEX: AA 31787

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA TCTCGAGTTT TTTTTTTTTT TTTTT

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.738 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERIZACIÓN:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1...1.413

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

10

11

110

\vskip1.000000\baselineskip

12

120

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 89 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERIZACIÓN:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 30...89

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCCACTGTAA TGTAGCAGTA TT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCAATCCGTC AGATTGGTAT CA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGTCTCCTC CAAGTG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTAGACTCCA ATCAC

\hfill

15

Claims (27)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la glicosiltransferasa vegetal, antocianidín-3-glucósido ramnosiltransferasa (3RT) o una parte o un derivado funcional de dicha glicosiltransferasa, o la secuencia complementaria a la misma, secuencia que comprende la secuencia sustancialmente como se expone en SEQ ID No:2, o una de sus partes o uno de sus derivados funcionales, o una secuencia que tiene con respecto a ella una similitud de la secuencia de nucleótidos de al menos el 50%.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, siendo la planta una petunia.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 2, siendo la planta Petunia hybrida.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID No:2, o la secuencia complementaria a ella.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar a la secuencia expuesta en la SEQ ID No:3.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, teniendo dicha secuencia una similitud de secuencia de nucleótidos de al menos el 85% con respecto a ella.

7. Una vector que comprende la molécula de ácido nucleico reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6.

8. Un vector según la reivindicación 7, en el que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor.

9. Un vector según la reivindicación 8, capaz de replicarse y expresarse en una célula eucariota.

10. Un vector según la reivindicación 8, capaz de replicarse y expresarse en una célula procariota.

11. Una planta transgénica capaz de expresar una enzima glicosiltransferasa 3RT no natural o una de sus partes o uno de sus derivados funcionales, habiéndose introducido en dicha planta transgénica una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha enzima 3RT o una de sus partes o uno de sus derivados funcionales.

12. Una planta transgénica según la reivindicación 11, en la que la glicosiltransferasa 3RT es de origen vegetal.

13. Una planta transgénica según la reivindicación 12, en la que la glicosiltransferasa 3RT es originaria de Petunia hybrida, Silene dioica, Antirrhinum, ciclamen, Alstroemeria, Metrosideros, Potentilla o Saintpaulia.

14. Una planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 13, siendo dicha secuencia de nucleótidos como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6.

15. Una planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 14, en la que la expresión es regulable.

16. Una planta transgénica según la reivindicación 15, en la que la expresión está regulada las fases del desarrollo.

17. Una planta transgénica según la reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 16, seleccionándose dicha planta entre el grupo constituido por petunia, rosa, clavel, crisantemo, gerbera, tabaco, lisianthus, lirio, iris y pelargonio.

18. Un método para producir una planta floral transgénica, capaz de exhibir propiedades de inflorescencia alteradas, comprendiendo dicho método introducir en una célula de una planta adecuada, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o que es complementaria a, una secuencia que codifica la glicosiltransferasa vegetal 3RT o una parte o un derivado funcional de dicha glicosiltransferasa, regenerar una planta transgénica a partir de esa célula, y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico en forma de una glicosiltransferasa.

19. Un método según la reivindicación 18, en el que dicha molécula de ácido nucleico es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6.

20. Un método según la reivindicación 18 ó 19, en el que la planta transgénica se selecciona entre la lista constituida por petunia, rosa, clavel, crisantemo, gerbera, tabaco, lisianthus, lirio, iris y pelargonio.

21. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 18 a 20, en el que dicha planta adecuada porta una enzima natural de glicosilación de flavonoides que tiene las características de una glicosiltransferasa y el ácido nucleico se introduce en unas condiciones que producen una regulación por disminución de la expresión de dicha enzima natural de glicosilación de flavonoides.

22. El uso de una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o que es complementaria a, una secuencia que codifica la glicosiltransferasa vegetal 3RT o una parte o un derivado funcional de dicha glicosiltransferasa, para alterar las propiedades de inflorescencia de una planta.

23. Un uso según la reivindicación 22, en el que dicha molécula de ácido nucleico aislada es según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6.

24. Una planta transgénica obtenible con el método o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones de 18 a 23.

25. Partes de una planta transgénica, preferiblemente las flores o semillas, derivadas de la planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 17 ó 24.

26. Partes de una planta transgénica según la reivindicación 25, siendo una de dichas partes una flor.

27. Una célula de una planta transgénica transformada con la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6.