ES2201977T3 - Quimerismo mixto y tolerancia. - Google Patents
Quimerismo mixto y tolerancia.Info
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Abstract
Uso de células troncales hematopoyéticas en la preparación de un medicamento destinado a ser usado en un método para suscitar tolerancia en un mamífero receptor de una primera especie a un injerto obtenido de un mamífero donante de una segunda especie; comprendiendo el método los pasos de: introducir en dicho mamífero receptor células troncales hematopoyéticas de dicha segunda especie; crear espacio tímico en dicho receptor en ausencia de irradiación de todo el cuerpo; e introducir dicho injerto en dicho receptor; siendo el número de células troncales del donante administradas suficiente como para que pueda ser formado quimerismo mixto sin irradiación creadora de espacio hematopoyético; y no siendo dichas células troncales hematopoyéticas obtenidas de un embrión humano.
Description
Quimerismo mixto y tolerancia.
La invención se refiere al trasplante de tejidos
y órganos.
Kawai et al. informan en Transplantation,
vol. 59, 256-262, 1995, de que han desarrollado un
régimen preparativo no mieloablativo que permite producir quimerismo
mixto y tolerancia a los aloinjertos renales entre primates no
humanos no concordantes en cuanto al MHC (MHC = complejo mayor de
histocompatibilidad). El régimen básico incluye ATG (ATG =
globulina anti-timocitos), irradiación total del
cuerpo (TBI, 300 rad) no mieloablativa, irradiación tímica (TI, 770
rad) e infusión de médula ósea del donante, habiendo sido
trasplantados aloinjertos de riñón de donantes no concordantes en
cuanto al MHC con varias manipulaciones del régimen preparativo.
Los monos tratados con el régimen básico solamente (n = 2)
rechazaron los aloinjertos el día 15. Con la adición de
ciclosporina (CsA) por espacio de un mes (n = 3), un mono
desarrolló quimerismo mixto multilinaje y tolerancia al aloinjerto
renal a continuación (> 430 días). Para reducir la toxicidad del
régimen preparativo, la irradiación total del cuerpo fue
fraccionada pasando a ser de 150 rad en dos días sucesivos en los
estudios subsiguientes. Todos los monos que recibieron este régimen
modificado (n = 4) desarrollaron quimerismo multilinaje con menos
efectos secundarios y aceptaron los aloinjertos renales a largo
plazo sin adicional inmunosupresión (196 días, 198 días, > 150
días y > 40 días). En los supervivientes a largo plazo la no
reactividad específica del donante fue confirmada mediante
reacciones de los linfocitos mixtos y trasplante de piel. Tres
monos tratados con el régimen básico más CsA pero con solamente 150
rad de irradiación total del cuerpo (n = 1) o sin irradiación total
del cuerpo (n = 2) no desarrollaron quimerismo multilinaje y los
injertos fueron rechazados (el día 40-50) poco
después de haber cesado la administración de CsA. Los monos tratados
con el mismo régimen pero sin médula ósea del donante (n = 2)
rechazaron los aloinjertos de riñón el día 52. Los autores llegan a
la conclusión de que al menos un injerto transitorio de médula ósea
del donante parece ser esencial para la inducción de la tolerancia
específica del donante en este modelo con monos.
Stewart et al. informan en Blood, vol. 81,
2566-2571, 1993, sobre el exitoso injerto a largo
plazo de médula ósea (BM) de donante macho normal transfundida en
ratones hembra no sometidos a citoablación, lo cual contradice la
suposición de que tienen que ser creados "nichos" para que se
injerte la médula ósea. Estos autores usaron bandeo cromosómico y
análisis Southern blot para identificar las células de médula de
macho trasplantadas, y demostraron la estabilidad a largo plazo de
las médulas quiméricas. Huéspedes hembra Balb/C, BDF1 o
CBA-J (no sometidos a irradiación) recibieron por
espacio de 5 días consecutivos 4 x 10^{8} células de macho (por
día), y los mismos estudios fueron llevados a cabo usando
equivalentes de la tibia/del fémur de médula normal o médula de
ratones Balb/C que habían sido pretratados 6 días previamente con
150 mg/kg de 5-fluorouracil (5-FU).
Las técnicas de bandeo cromosómico pusieron de manifiesto que las
de un 5% a un 46% de las células de médula eran de macho a los 3 a 9
meses tras el trasplante con análisis Southern Blot de la médula de
donante normal, y el uso de la sonda pY2 puso de manifiesto un
continuado injerto a los 21 a 25 meses tras el trasplante, que iba
de un 15% a un 42% de células trasplantadas de macho en la médula.
La médula de macho donante normal se injertó considerablemente
mejor que la médula de macho pretratado con 5-FU
según queda de manifiesto de 1 a 12 meses tras el trasplante en los
receptores hembra no sometidos a citoablación. Los porcentajes de
células injertadas de macho en la médula ósea iban de un 23% a un
78% para los receptores de médula de donante normal y de un 0,1% a
un 39% para los receptores de médula tratada con
5-FU. El injerto medio para 6 ratones que recibieron
médula normal era de un 38%, mientras que el injerto medio para 6
ratones que recibieron médula
post-5-FU era de un 8% según
análisis efectuados de 1 a 3 meses tras el trasplante. A los 10 a 12
meses, el injerto medio del grupo de donantes normales era de un
46% en comparación con un 16% para el grupo pretratado con
5-FU. Los patrones de injerto con médula normal y
médula pretratada con 5-FU eran similares para el
bazo y el timo. Los autores llegan a la conclusión de que estos
resultados ponen de manifiesto que puede ser establecido quimerismo
a largo plazo tras el trasplante de médula de donante normal a
ratón huésped no irradiado normal e indican que para un injerto
exitoso no tienen que ser creados espacios medulares. Los autores
sugieren que la médula trasplantada compite en igualdad de
condiciones con la médula del huésped por el espacio medular. Los
autores indican finalmente que estos datos demuestran que la médula
de macho Balb/C post-5-FU es
marcadamente interior en la repoblación de médula, bazo y timo de
los huéspedes hembra Balb/C, y sugieren que esta población de
células puede no ser la población ideal para los estudios de
transferencia genética.
La WO 9313785 describe la tolerancia inducida a
los xenoinjertos con previo trasplante de células troncales
hematopoyéticas, irradiando al mamífero receptor con irradiación de
todo el cuerpo.
La invención aporta medicamentos destinados a ser
usados en métodos para inducir tolerancia a antígenos foráneos. Los
métodos comprenden regímenes preparativos que eliminan la necesidad
de irradiación creadora de espacio hematopoyético, y en especial de
irradiación preparativa de todo el cuerpo. Se ha descubierto en
particular que la administración de un número relativamente grande
de células troncales, combinada con la creación de espacio tímico,
puede permitir la inducción de tolerancia sin necesidad de
irradiación de todo el cuerpo (WBI).
En consecuencia, la invención supone el uso de
células troncales hematopoyéticas en la preparación de un
medicamento destinado a ser usado en un método para inducir
tolerancia en un mamífero receptor de una primera especie a un
injerto de un mamífero donante de una segunda especie. El método
incluye los pasos de introducir p. ej. mediante inyección
intravenosa en el mamífero receptor células troncales
hematopoyéticas; crear espacio tímico en dicho receptor en ausencia
de irradiación de todo el cuerpo; e implantar el injerto en el
receptor. Se cree que las células hematopoyéticas preparan al
receptor para el injerto que es efectuado a continuación a base de
inducir tolerancia a los niveles tanto de las células B como de las
células T.
El mamífero receptor puede ser a título de
ejemplo un humano. El mamífero donante puede ser a título de
ejemplo un cerdo, como p. ej. un cerdo miniatura. El injerto es
preferiblemente de una especie discordante. El injerto expresa
preferiblemente un antígeno del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC), y preferiblemente un antígeno de la clase
II. En realizaciones particularmente preferidas el receptor es un
primate, como p. ej. un humano, y el donante es un cerdo, como p.
ej. un cerdo miniatura.
Como se expone en otra parte en la presente, los
inventores han descubierto que este medicamento puede ser usado en
un método que puede ser puesto en práctica sin la administración de
irradiación creadora de espacio hematopoyético, como es p. ej. la
irradiación de todo el cuerpo. La irradiación de todo el cuerpo es
a menudo usada en la técnica para crear espacio hematopoyético y
suscitar así el injerto, el quimerismo y la tolerancia. La
necesidad de irradiación creadora de espacio hematopoyético puede
ser eliminada por entero mediante la inclusión de uno o varios de
los pasos siguientes en el método:
(1) Administrar un número lo suficientemente
grande de células hematopoyéticas de donante al receptor de forma
tal que las células troncales del donante se injerten, den lugar a
quimerismo mixto e induzcan tolerancia, siendo las células troncales
administradas preferiblemente en combinación con uno o varios de
los tratamientos aquí descritos, como son p. ej. los tratamientos
(2), (3) o (4) que se describen inmediatamente a continuación;
(2) administrar al receptor drogas o anticuerpos
creadores de espacio hematopoyético. Administrar p. ej. un
inhibidor de la proliferación celular, como p. ej. DSG (DSG =
desoxispergualina), o un antimetabolito, como p. ej. brequinar, o un
anticuerpo contra las células T, como p. ej. uno o ambos de un
anticuerpo anti-CD4 o anti-CD8;
(3) aportar tratamientos (que no sean la
irradiación de todo el cuerpo) que susciten el injerto y la
formación de quimerismo mixto aumentado la capacidad de las células
del donante para competir con las células de médula ósea del
huésped, y p. ej. administrar células estromales o administrar
citoquinas o factores de crecimiento específicos del donante, y p.
ej. cuando el donante es un cerdo miniatura administrar al receptor
uno o varios de los miembros del grupo que consta de SCF (SCF =
factor de células troncales) de cerdo, IL-3 de cerdo
o GM-SCF (GM-SCF = factor de
estimulación de colonias de macrófagos granulocíticos) de cerdo;
(4) crear espacio tímico en el receptor p. ej. a
base de irradiar el timo del receptor p. ej. a base de administrar
entre 1 y 10 Gy (entre 100 y 1.000 rad), más preferiblemente entre
3 y 7 Gy (entre 300 y 700 rad), y p. ej. 7 Gy (700 rad) de
irradiación tímica, o bien a base de administrar anticuerpos contra
las células T en una dosis suficiente para inactivar los timocitos.
Otros métodos para la creación de espacio tímico incluyen la
administración de esteroides, corticosteroides, brequinar o una
sustancia química o droga inmunosupresora, como p. ej. rapamicina,
ciclosporina o FK506. El tratamiento para crear espacio tímico
deberá ser administrado o al menos iniciado antes de la
administración de células troncales hematopoyéticas. Un tratamiento
efectivo deberá agotar los timocitos unipositivos hasta un punto tal
que se vean optimizados el injerto y la formación de quimerismo
mixto en ausencia de la creación de espacio hematopoyético, como p.
ej. de espacio hematopoyético creado mediante irradiación de todo el
cuerpo. En realizaciones preferidas, los timocitos unipositivos del
sujeto son agotados en al menos un 20, un 40, un 60 o un 80%. Se
prefieren los tratamientos que redundan en un agotamiento de entre
un 10 y un 90%. La duración del tratamiento variará con la
dosificación y con la eficacia del agente, pero será en general de
menos de 60, 30 ó 15 días. El tratamiento deberá tener una duración
de al menos 7 días, y más preferiblemente de 10 ó 14 días. En los
programas de tratamiento preferidos, p. ej., la administración de
una sustancia química o droga inmunosupresora, como p. ej. la
ciclosporina, deberá tener una duración de entre 7 y 30 días. El
tratamiento, como p. ej. la administración de ciclosporina, deberá
ser iniciado con una antelación tal que el mismo haya sido
concluido antes de la administración de células troncales. La
administración del agente deberá ser efectuada sobre una base
diaria o según sea necesario para mantener un nivel del agente que
permita lograr el deseado nivel de agotamiento. Un tratamiento
particularmente preferido es la administración de una sustancia
química inmunosupresora, como p. ej. ciclosporina, por espacio de
más de 7 y menos de 30 días. Un régimen útil en roedores es el de
la administración de 20 mg/kg/día de ciclosporina por espacio de 14
días terminando el tercer día antes de la administración de células
troncales.
Por consiguiente, es administrada al receptor una
cantidad de células troncales hematopoyéticas suficiente para
inducir tolerancia sin necesidad de irradiación creadora de espacio
hematopoyético. En realizaciones preferidas, el número de células
hematopoyéticas del donante es al menos el doble del, es al menos
igual al, o es al menos de un 75, un 50 o un 25% del número de
células de médula ósea que se encuentra en un adulto de la especie
receptora. En realizaciones preferidas, el número de células
troncales hematopoyéticas del donante es al menos el doble del, es
al menos igual al, o es al menos de un 75, un 50 o un 25% del número
de células troncales hematopoyéticas de médula ósea que se
encuentra en un adulto de la especie receptora. En caso de existir
una población consanguínea de la especie donante, como p. ej. cuando
la especie donante es la del cerdo miniatura, el número de células
de donante disponibles no queda limitado al número de células que
puedan ser obtenidas de un solo animal. Así, en tales casos las
células de donante administradas al receptor pueden proceder de más
de un animal, y p. ej. de dos, tres, cuatro o más animales. Como se
expone más adelante, las células troncales de donante pueden ser
aportadas en dos o más administraciones por separado.
El quimerismo mixto es inducido en el receptor y
el estado de quimerismo mixto es formado en ausencia de la
inducción de espacio hematopoyético, y p. ej. en ausencia de
espacio hematopoyético creado mediante irradiación creadora de
espacio, como p. ej. irradiación de todo el cuerpo.
El número de células de donante administradas al
receptor puede ser incrementado ya sea a base de incrementar el
número de células troncales aportadas en una administración
determinada o bien a base de efectuar repetidas administraciones de
células troncales de donante.
La repetida administración de células troncales
puede suscitar injerto, quimerismo mixto y tolerancia delecional a
largo plazo en los receptores de los injertos. Así, la invención
incluye también medicamentos destinados a ser usados en métodos en
los cuales le son efectuadas a un receptor múltiples
administraciones de células troncales hematopoyéticas. La
administración múltiple puede eliminar la necesidad de irradiación
creadora de espacio hematopoyético. Las administraciones pueden ser
efectuadas antes de la implantación del injerto, al ser efectuada
la implantación del injerto o bien después de la implantación del
injerto. En realizaciones preferidas son efectuadas antes de la
implantación de un injerto múltiples administraciones de células
troncales. Pueden ser efectuadas dos, tres, cuatro, cinco o más
administraciones. El período de tiempo entre las administraciones de
células troncales hematopoyéticas puede ser variado. En
realizaciones preferidas es efectuada una subsiguiente
administración de células troncales hematopoyéticas: al menos dos
días, una semana, un mes o seis meses después de la anterior
administración de células troncales; cuando el receptor comience a
presentar signos de respuesta de los linfocitos del huésped al
antígeno del donante; cuando disminuya el nivel de quimerismo;
cuando el nivel de quimerismo haya descendido hasta llegar a ser
inferior a un valor predeterminado; cuando el nivel de quimerismo
haya llegado a un nivel o haya descendido hasta ser inferior a un
nivel en el que la coloración con un anticuerpo monoclonal
específico de un antígeno de las células mononucleares de la sangre
periférica del donante sea igual a o haya descendido hasta llegar a
ser inferior a la coloración con un control isotípico que no se
fije a las células mononucleares de la sangre periférica, como p.
ej. cuando el monoclonal específico del donante coloree menos de un
1-2% de las células; o bien en general según sea
necesario para mantener un nivel de quimerismo mixto suficiente para
mantener la tolerancia al antígeno del donante.
Pueden también efectuarse para minimizar o
eliminar la necesidad de irradiación una o varias administraciones
de células troncales de donante posteriores a la implantación del
injerto. La administración de células troncales hematopoyéticas tras
el injerto puede ser efectuada: al menos dos días, una semana, un
mes o seis meses después de la previa administración de células
troncales; al menos dos días, una semana, un mes, seis meses o en
cualquier momento en el tiempo de vida del receptor después de la
implantación del injerto; cuando el receptor comience a presentar
signos de rechazo, según sea puesto p. ej. de manifiesto por una
disminución de la función del órgano injertado, por una variación de
la respuesta del huésped a los anticuerpos específicos del donante,
o por una variación de la respuesta de los linfocitos del huésped
al antígeno del donante; cuando disminuya el nivel de quimerismo;
cuando el nivel de quimerismo haya descendido hasta llegar a ser
inferior a un valor predeterminado; cuando el nivel de quimerismo
llegue a un nivel o haya descendido hasta llegar a ser inferior a un
nivel en el que la coloración con un anticuerpo monoclonal
específico de un antígeno de las células mononucleares de la sangre
periférica del donante sea igual a o haya descendido hasta llegar a
ser inferior a la coloración con un control isotípico que no se fije
a las células mononucleares de la sangre periférica, como p. ej.
cuando el monoclonal específico del donante coloree menos de un
1-2% de las células; o bien en general según sea
necesario para mantener la tolerancia o prolongar de otro modo la
aceptación de un injerto.
Cuando se efectúen múltiples administraciones de
células troncales, una o varias de las administraciones pueden
incluir un número de células hematopoyéticas del donante que sea al
menos el doble del, que sea igual al, o que sea al menos de un 75,
un 50 o un 25% del número de células de médula ósea que se
encuentra en un adulto de la especie receptora; y pueden incluir un
número de células troncales hematopoyéticas del donante que sea al
menos el doble del, que sea igual al, o que sea al menos de un 75,
un 50 o un 25% del número de células troncales hematopoyéticas de
médula ósea que se encuentra en un adulto de la especie
receptora.
En realizaciones preferidas, el medicamento está
destinado a ser usado en un método que incluye el paso de inactivar
las células killer naturales, y preferiblemente las células killer
naturales reactivas al injerto o xenorreactivas, y p. ej.
porcino-reactivas del mamífero receptor. Esto puede
lograrse p. ej. a base de introducir en el mamífero receptor un
anticuerpo que sea capaz de fijarse a las células killer naturales
del mamífero receptor. La administración de anticuerpos o de otro
tratamiento para inactivar las células killer naturales puede ser
efectuada antes de introducir las células troncales hematopoyéticas
en el mamífero receptor o antes de implantar el injerto en el
receptor. Este anticuerpo puede ser igual a un anticuerpo usado para
inactivar las células T o distinto del mismo.
En realizaciones preferidas, el medicamento está
destinado a ser usado en un método que incluye el paso de inactivar
las células T, y preferiblemente las células T
injerto-reactivas o xenorreactivas, y p. ej.
porcino-reactivas, del mamífero receptor. Esto puede
lograrse p. ej. a base de introducir en el mamífero receptor un
anticuerpo que sea capaz de fijarse a las células T del mamífero
receptor. La administración de anticuerpos o de otro tratamiento
para inactivar las células T puede ser efectuada antes de
introducir las células troncales hematopoyéticas en el mamífero
receptor o antes de implantar el injerto en el receptor. Este
anticuerpo puede ser igual a un anticuerpo usado para inactivar las
células killer naturales o distinto del mismo.
Una fuente de anticuerpo contra las células
killer naturales es el antisuero policlonal
anti-timocitos humanos. Preferiblemente puede ser
asimismo administrado un segundo anticuerpo contra las células T
maduras que lise las células T así como las células killer
naturales. El lisar las células T es ventajoso para la supervivencia
tanto de la médula ósea como del injerto. En el antisuero
anti-timocitos están presentes anticuerpos contra
las células T junto con anticuerpos contra las células killer
naturales. Pueden ser preferibles dosis repetidas de anticuerpos,
como p. ej. anticuerpos contra las células killer naturales o contra
las células T. Junto con los medicamentos de la invención pueden
ser usadas preparaciones monoclonales.
En realizaciones preferidas el receptor no recibe
tratamientos que estimulen la liberación de una citoquina por parte
de las células T maduras. P. ej., el receptor no deberá recibir una
sustancia, como p. ej. una droga esteroide, como p. ej. Prednisone
(17,
21-dihidroxipregna-1,4-dieno-3,11,20-triona),
a nivel de una dosificación o concentración que estimule la
liberación de una citoquina por parte de las células T maduras en el
receptor. Preferiblemente, el receptor está exento de tal
tratamiento desde el momento en el que son primeramente
administradas las células troncales hasta haber sido implantado el
injerto o hasta haber sido establecidos el quimerismo mixto y la
tolerancia.
En realizaciones preferidas, el medicamento es
para un método que incluye la administración de un corto programa
de tratamiento reductor de la colaboración, como p. ej. una droga u
otro agente químico que induzca tolerancia a los antígenos dispares
de la clase I y/o menores del injerto que es introducido en el
receptor. El corto programa de tratamiento reductor de la
colaboración, como p. ej. un programa corto de administración de
ciclosporina a dosis altas, es en general administrado al ser
introducido el injerto en el receptor. La duración del corto
programa de tratamiento reductor de la colaboración es
aproximadamente igual al o menor que el período de tiempo que es
necesario para que las células T maduras de la especie receptora
inicien el rechazo de un antígeno tras haber sido primeramente
estimuladas por el antígeno; y en realizaciones más preferidas la
duración es aproximadamente igual a o de menos de dos, tres,
cuatro, cinco o diez veces el período de tiempo que es necesario
para que una célula T madura de la especie receptora inicie el
rechazo de un antígeno tras haber sido estimulada inicialmente por
el antígeno. Estos métodos están descritos más detalladamente en la
solicitud Nº 08/458.720 que fue presentada el 1 de junio de 1995,
de la que somos copropietarios. Los métodos de la solicitud
08/458.720 pueden ser combinados con los métodos que aquí se
describen.
Otras realizaciones preferidas incluyen el paso
de introducir en el mamífero receptor tejido estromal específico de
la especie donante, y preferiblemente tejido estromal
hematopoyético, como p. ej. timo o hígado fetal. En realizaciones
preferidas, el tejido estromal es introducido simultáneamente a o
antes de las células troncales hematopoyéticas; y las células
troncales hematopoyéticas son introducidas simultáneamente al o
antes del anticuerpo.
Otras realizaciones preferidas incluyen
tratamientos para inactivar adicionalmente células T del receptor,
y particularmente timocitos o células T de los nódulos tímicos o
linfáticos. Los timocitos o células T de los nódulos tímicos o
linfáticos podrían de otro modo inhibir el injerto o la
supervivencia de las células administradas. Tal inactivación puede
lograrse mediante uno o varios de los pasos siguientes: irradiar el
timo del mamífero receptor con una dosis de radiación suficiente
para inactivar los timocitos, y p. ej. con 1-10 Gy
(100-1.000 rad), más preferiblemente con una dosis
de entre 3 y 7 Gy (300 y 700 rad), y p. ej. con aproximadamente 3,5
ó 7 Gy (350 ó 700 rad) de irradiación tímica; administrar una dosis
o dosis repetidas de un anticuerpo contra las células T o
anti-timocitos; o administrar al receptor un corto
programa de administración de una sustancia química o droga
inmunosupresora como las aquí descritas. La inactivación de los
timocitos o células T puede ser llevada a cabo antes del trasplante
de las células troncales hematopoyéticas o del injerto. En
realizaciones preferidas, el medicamento es para un método que
incluye el paso de disminuir o inhibir la actividad de los timocitos
o células T, y preferiblemente la actividad de las células T de los
nódulos tímicos o linfáticos, a base de administrar al receptor un
corto programa de administración de un agente inmunosupresor, como
p. ej. una sustancia química o droga, como p. ej. ciclosporina, que
sea suficiente para inactivar los timocitos o las células T, y
preferiblemente las células T de los nódulos tímicos o linfáticos.
La duración del corto programa de administración de agente
inmunosupresor es: aproximadamente igual a 30 días; aproximadamente
igual a o de menos de 8-12 días, y con preferencia
de aproximadamente 10 días; aproximadamente igual o inferior a dos,
tres, cuatro, cinco o diez veces el período de 8-12
ó 10 días. El programa corto puede comenzar: antes de o
aproximadamente al ser iniciado el tratamiento para inducir
tolerancia, y p. ej. aproximadamente al ser las células troncales
introducidas en el receptor; el día en el que se inicie el
tratamiento para inducir tolerancia, y p. ej. el día en el que sean
introducidas las células troncales en el receptor; dentro de un
período de 1, 2, 4, 6, 8, 10 ó 30 días antes o después de ser
iniciado el tratamiento para inducir tolerancia, y p. ej. dentro de
un período de 1, 2, 4, 6, 8, 10 ó 30 días antes o después de ser
introducidas las células troncales en el receptor. El corto
programa de administración de un inmunosupresor puede ser
administrado en conjunción con un anticuerpo contra las células T.
El corto programa de administración de un inmunosupresor debería
ser de una concentración y duración suficientes para inactivar las
células T, como p. ej. las células T de los nódulos tímicos o
linfáticos, que no serían inactivadas por la inactivación basada en
anticuerpos de las células T, como p. ej. la inactivación mediante
administraciones intravenosas de anticuerpo
anti-timocitos humanos o de preparaciones
similares.
Otras realizaciones preferidas incluyen el paso
de, preferiblemente antes del trasplante de células troncales
hematopoyéticas, agotar los anticuerpos naturales de la sangre del
mamífero receptor. A título de ejemplo, el agotamiento puede
lograrse a base de poner la sangre del receptor en contacto con un
epítope que absorba el anticuerpo anti-donante
preformado. El epítope puede ser acoplado a un sustrato insoluble y
puede ser aportado, p. ej. como una columna de afinidad. P. ej.,
puede usarse para agotar los anticuerpos naturales una matriz de
afinidad por el epítope por unión a \alpha1-3
galactosa, como p. ej. carbohidrato VI tipo B lineal en matriz. El
agotamiento puede lograrse también efectuando la hemoperfusión de un
órgano, como p. ej. un hígado o un riñón, obtenido de un mamífero
de la especie donante. (En la hemoperfusión del órgano los
anticuerpos de la sangre se fijan a los antígenos de las superficies
de las células del órgano y son por consiguiente retirados de la
sangre).
Otras realizaciones preferidas incluyen aquéllas
en las cuales: el mismo mamífero de la segunda especie es el
donante del injerto o de las células hematopoyéticas o de ambos; y
el anticuerpo es un antisuero policlonal
anti-timocitos humanos obtenido, p. ej., de un
caballo o de un cerdo.
En realizaciones preferidas, el método incluye el
paso de introducir en el receptor un injerto obtenido del donante y
que es obtenido de un órgano distinto del de las células troncales
hematopoyéticas, como p. ej. un corazón, un páncreas, un hígado o un
riñón.
Pueden usarse al implantar las células troncales
alogénicas métodos para los cuales los medicamentos de la invención
están indicados y que reducen considerablemente o eliminan la
necesidad de irradiación creadora de espacio hematopoyético. En
consecuencia, en otro aspecto la invención incluye el uso de
células troncales hematopoyéticas en la preparación de un
medicamento para un método para inducir tolerancia en un mamífero
receptor de una primera especie a un injerto de un mamífero donante
de la misma especie. El mamífero receptor puede ser a título de
ejemplo un primate, y p. ej. un humano. El injerto expresa
preferiblemente un antígeno del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC), y preferiblemente un antígeno de la
clase II.
El método incluye los pasos de introducir, p. ej.
mediante inyección intravenosa, en el mamífero receptor células
troncales hematopoyéticas; crear espacio tímico en dicho receptor
en ausencia de irradiación de todo el cuerpo; e implantar el injerto
en el receptor. Se cree que las células hematopoyéticas preparan al
receptor para el injerto que se efectúa a continuación, a base de
inducir tolerancia a los niveles tanto de las células B como de las
células T.
Este método puede ser puesto en práctica sin la
administración de irradiación creadora de espacio hematopoyético,
como p. ej. irradiación de todo el cuerpo. En la técnica se usa a
menudo irradiación de todo el cuerpo para crear espacio
hematopoyético y para así suscitar el injerto, el quimerismo y la
tolerancia. La necesidad de irradiación creadora de espacio
hematopoyético puede ser eliminada por completo mediante la
inclusión de uno o varios de los pasos siguientes en el método:
(1) Administrar al receptor un número lo
suficientemente grande de células hematopoyéticas del donante de
forma tal que las células troncales del donante se injerten, den
lugar a quimerismo mixto e induzcan tolerancia, siendo las células
troncales preferiblemente administradas en combinación con uno o
varios de los tratamientos que aquí se describen, como p. ej. los
tratamientos (2), o (3) que se indican inmediatamente a
continuación;
(2) administrar al receptor drogas o anticuerpos
creadores de espacio hematopoyético. Administrar p. ej. un
inhibidor de la proliferación celular, como p. ej.
desoxispergualina, o un antimetabolito, como p. ej. brequinar, o un
anticuerpo contra las células T, como p. ej. un anticuerpo
anti-CD4 o un anticuerpo anti-CD8 o
ambos;
(3) crear espacio tímico en el receptor, p. ej. a
base de irradiar el timo del receptor, p. ej. a base de administrar
entre 1 y 10 Gy (entre 100 y 1.000 rad), más preferiblemente entre
3 y 7 Gy (entre 300 y 700 rad), y p. ej. 7 Gy (700 rad) de
irradiación tímica, o bien a base de administrar anticuerpos contra
las células T a nivel de una dosis suficiente para inactivar los
timocitos. Otros métodos para la creación de espacio tímico incluyen
la administración de esteroides, corticosteroides, brequinar o una
sustancia química o droga inmunosupresora, como p. ej. rapamicina,
ciclosporina o FK506. El tratamiento para crear espacio tímico
deberá ser administrado o al menos iniciado antes de la
administración de las células troncales hematopoyéticas. Un
tratamiento eficaz deberá agotar los timocitos unipositivos hasta el
punto de que el injerto y la formación de quimerismo mixto sean
optimizados en ausencia de la creación de espacio hematopoyético, y
p. ej. de espacio hematopoyético creado mediante irradiación de
todo el cuerpo. En realizaciones preferidas, los timocitos
unipositivos del sujeto son agotados en al menos un 20, un 40, un
60 o un 80%. Se prefieren los tratamientos que redundan en un
agotamiento de entre un 10 y un 90%. La duración del tratamiento
variará con la dosificación y la eficacia del agente, pero será en
general de menos de 60, 30 ó 15 días. El tratamiento deberá tener
una duración de al menos 7 días, y más preferiblemente de 10 ó 14
días. En los programas de tratamiento preferidos, p. ej., la
administración de una sustancia química o droga inmunosupresora,
como p. ej. ciclosporina, deberá tener una duración de entre 7 y 30
días. El tratamiento, como p. ej. la administración de
ciclosporina, deberá ser iniciado con una antelación suficiente como
para que el mismo haya quedado concluido antes de la administración
de las células troncales. La administración del agente deberá ser
efectuada sobre una base diaria o según sea necesario para mantener
un nivel del agente que permita obtener el deseado nivel de
agotamiento. Un tratamiento particularmente preferido es la
administración de una sustancia química inmunosupresora, como p. ej.
ciclosporina, por espacio de más de 7 días y de menos de 30 días.
Un régimen útil en los roedores es el de 20 mg/kg/día de
ciclosporina por espacio de 14 días terminando el tercer día antes
de la administración de las células troncales.
Así, es administrada al receptor una cantidad de
células troncales hematopoyéticas suficiente para inducir
tolerancia sin necesidad de irradiación creadora de espacio
hematopoyético. En realizaciones preferidas, el número de células
hematopoyéticas del donante es al menos el doble del, es al menos
igual al, o es al menos de un 75, un 50 o un 25% del número de
células de médula ósea que se encuentra en un adulto de la especie
receptora. En realizaciones preferidas, el número de células
troncales hematopoyéticas es al menos el doble del, es al menos
igual al, o es al menos de un 75, un 50 o un 25% del número de
células troncales hematopoyéticas de médula ósea que se encuentra
en un adulto de la especie receptora.
Es inducido en el receptor quimerismo mixto, y el
estado de quimerismo mixto es formado en ausencia de la inducción
de espacio hematopoyético, y p. ej. en ausencia de espacio
hematopoyético creado mediante irradiación creadora de espacio, como
p. ej. irradiación de todo el cuerpo.
El número de células del donante administradas al
receptor puede ser incrementado a base de incrementar el número de
células troncales aportadas en una administración determinada o
bien a base de efectuar repetidas administraciones de células
troncales del donante, o bien a base de ambas cosas.
La repetida administración de células troncales
puede suscitar el injerto, el quimerismo mixto y la tolerancia
delecional a largo plazo en los receptores de los injertos. Así, la
invención incluye también medicamentos destinados a ser usados en
métodos en los cuales le son efectuadas a un receptor múltiples
administraciones de células troncales hematopoyéticas. La
administración múltiple puede eliminar la necesidad de irradiación
creadora de espacio hematopoyético. Las administraciones pueden ser
efectuadas antes de la implantación del injerto, al ser efectuada
la implantación del injerto o después de la implantación del
injerto. En realizaciones preferidas son efectuadas antes de la
implantación de un injerto múltiples administraciones de células
troncales. Pueden efectuarse dos, tres, cuatro, cinco o más
administraciones. El período de tiempo entre las administraciones
de células troncales hematopoyéticas puede ser variado. En
realizaciones preferidas se efectúa una subsiguiente administración
de células troncales hematopoyéticas: al menos dos días, una
semana, un mes o seis meses después de la previa administración de
células troncales; cuando el receptor comience a presentar signos de
respuesta de los linfocitos del huésped al antígeno del donante;
cuando disminuya el nivel de quimerismo; cuando el nivel de
quimerismo haya descendido hasta haber llegado a ser inferior a un
valor predeterminado; cuando el nivel de quimerismo haya alcanzado
un nivel o haya descendido hasta llegar a ser inferior a un nivel
en el que la coloración con un anticuerpo monoclonal específico de
un antígeno de las células mononucleares de la sangre periférica
del donante sea igual a o haya descendido hasta haber llegado a ser
inferior a la coloración con un control isotípico que no se fije a
las células mononucleares de la sangre periférica, como p. ej.
cuando el monoclonal específico del donante coloree menos de un
1-2% de las células; o en general según sea
necesario para mantener un nivel de quimerismo mixto que sea
suficiente para mantener la tolerancia al antígeno del donante.
Para eliminar la necesidad de irradiación pueden
ser también efectuadas una o varias administraciones de células
troncales del donante tras la implantación del injerto. La
administración de células troncales hematopoyéticas tras el injerto
puede ser efectuada: al menos dos días, una semana, un mes o seis
meses después de la previa administración de células troncales; al
menos dos días, una semana, un mes, seis meses o en cualquier
momento dentro del tiempo de vida del receptor después de la
implantación del injerto; cuando el receptor empiece a presentar
signos de rechazo, según sea p. ej. puesto de manifiesto por una
disminución de la función del órgano injertado, por una variación
de la respuesta del huésped al anticuerpo específico del donante, o
por una variación de la respuesta de los linfocitos del huésped al
antígeno del donante; cuando disminuya el nivel de quimerismo;
cuando el nivel de quimerismo haya descendido hasta haber llegado a
ser inferior a un valor predeterminado; cuando el nivel de
quimerismo haya llegado a un nivel o haya descendido hasta haber
llegado a ser inferior a un nivel en el que la coloración con un
anticuerpo monoclonal específico de un antígeno de las células
mononucleares de la sangre periférica del donante sea igual a o haya
descendido hasta haber llegado a ser inferior a la coloración con
un control isotípico que no se fije a las células mononucleares de
la sangre periférica, como p. ej. cuando el monoclonal específico
del donante coloree menos de un 1-2% de las
células; o bien en general según sea necesario para mantener la
tolerancia o para prolongar de otro modo la aceptación de un
injerto.
Cuando sean efectuadas múltiples administraciones
de células troncales, una o varias de las administraciones pueden:
incluir un número de células hematopoyéticas del donante que sea al
menos el doble del, que sea igual al, o que sea al menos de un 75,
un 50 o un 25% del número de células de médula ósea que se
encuentra en un adulto de la especie receptora; incluir un número
de células troncales hematopoyéticas del donante que sea al menos el
doble del, que sea igual al, o que sea al menos de un 75, un 50 o
un 25% del número de células troncales hematopoyéticas de médula
ósea que se encuentra en un adulto de la especie receptora.
En realizaciones preferidas, el medicamento está
destinado a ser usado en un método que incluye el paso de inactivar
las células killer naturales, y preferiblemente las células killer
naturales reactivas al injerto o reactivas al donante, del mamífero
receptor. Esto puede lograrse p. ej. a base de introducir en el
mamífero receptor un anticuerpo que sea capaz de fijarse a las
células killer naturales del mamífero receptor. La administración de
anticuerpos o de otro tratamiento para inactivar las células killer
naturales puede ser efectuada antes de introducir las células
troncales hematopoyéticas en el mamífero receptor o antes de
implantar el injerto en el receptor. Este anticuerpo puede ser
igual a un anticuerpo usado para inactivar las células T, o bien
puede ser distinto del mismo.
En realizaciones preferidas, el medicamento está
destinado a ser usado en un método que incluye el paso de inactivar
las células T, y preferiblemente las células T reactivas al injerto
o reactivas al donante, del mamífero receptor. Esto puede lograrse,
p. ej., a base de introducir en el mamífero receptor un anticuerpo
que sea capaz de fijarse a las células T del mamífero receptor. La
administración de anticuerpos o de otro tratamiento para inactivar
las células T puede ser efectuada antes de introducir las células
troncales hematopoyéticas en el mamífero receptor o antes de
implantar el injerto en el receptor. Este anticuerpo puede ser igual
a un anticuerpo usado para inactivar las células killer naturales,
o bien puede ser distinto del mismo.
Una fuente de anticuerpo contra las células
killer naturales es un antisuero policlonal
anti-timocitos humanos. Preferiblemente puede ser
administrado asimismo un segundo anticuerpo contra las células T
maduras que lise las células T así como las células killer
naturales. El lisar las células T es ventajoso para la supervivencia
tanto de la médula ósea como del injerto. En el antisuero
anti-timocitos están presentes anticuerpos contra
las células T junto con anticuerpos contra las células killer
naturales. Pueden ser preferibles dosis repetidas de anticuerpos,
como p. ej. anticuerpos contra las células killer naturales o contra
las células T. Junto con los medicamentos de la invención pueden
ser usadas preparaciones monoclonales.
En realizaciones preferidas, el receptor no
recibe tratamientos que estimulen la liberación de una citoquina
por parte de las células T maduras. P. ej., el receptor no deberá
recibir una sustancia, como p. ej. una droga esteroide, como p. ej.
Prednisone (17,
21-dihidroxipregna-1,4-dieno-3,11,20-triona),
a nivel de una dosificación o concentración que estimule la
liberación de una citoquina por parte de las células T maduras en el
receptor. Preferiblemente, el receptor está exento de tal
tratamiento desde el momento en el que son inicialmente
administradas las células troncales hasta que es implantado el
injerto o hasta haber sido establecidos el quimerismo mixto y la
tolerancia.
En realizaciones preferidas, el medicamento está
destinado a ser usado en un método que incluye la administración de
un corto programa de tratamiento reductor de la colaboración, como
p. ej. una droga u otra sustancia química, que induzca tolerancia a
antígenos dispares de la clase I y/o menores del injerto que es
introducido en el receptor. El corto programa de tratamiento
reductor de la colaboración, como p. ej. un programa corto de
administración de ciclosporina a dosis alta, es en general
administrado al ser el injerto introducido en el receptor. La
duración del corto programa de tratamiento reductor de la
colaboración es aproximadamente igual o inferior al período de
tiempo que es necesario para que las células T maduras de la especie
receptora inicien el rechazo de un antígeno tras haber sido
inicialmente estimuladas por el antígeno; y en realizaciones más
preferidas la duración es aproximadamente igual o inferior a dos,
tres, cuatro, cinco o diez veces el período de tiempo que es
necesario para que una célula T madura de la especie receptora
inicie el rechazo de un antígeno tras haber sido inicialmente
estimulada por el antígeno. Estos métodos están descritos más
detalladamente en la solicitud Nº 08/458.720 que fue presentada el
1 de junio de 1995 y de la que somos copropietarios. Los métodos de
la solicitud 08/458.720 pueden ser combinados con los métodos que
aquí se describen.
Otras realizaciones preferidas incluyen
medicamentos que están destinados a ser usados en tratamientos para
inactivar adicionalmente las células T del receptor, y
particularmente los timocitos o células T de los nódulos tímicos o
linfáticos. Los timocitos o células T de los nódulos tímicos o
linfáticos podrían de otro modo inhibir el injerto o la
supervivencia de las células administradas. Tal inactivación puede
lograrse mediante uno o varios de los pasos siguientes: irradiar el
timo del mamífero receptor con una dosis de radiación suficiente
para inactivar los timocitos, y p. ej. con 1-10 Gy
(100-1.000 rad), más preferiblemente con entre 3 y
7 Gy (300 y 700 rad), y p. ej. con aproximadamente 3,5 ó 7 Gy (350 ó
700 rad) de irradiación tímica; administrar una dosis o dosis
repetidas de un anticuerpo contra las células T o
anti-timocitos; o administrar al receptor un corto
programa de administración de una sustancia química o droga
inmunosupresora como las aquí descritas. La inactivación de los
timocitos o células T puede ser llevada a cabo antes del trasplante
de las células troncales hematopoyéticas o del injerto. En
realizaciones preferidas, el medicamento es para un método que
incluye el paso de disminuir o inhibir la actividad de los
timocitos o células T, y preferiblemente la actividad de las células
T de los nódulos tímicos o linfáticos, a base de administrar al
receptor un corto programa de administración de un agente
inmunosupresor, como p. ej. ciclosporina, que sea suficiente para
inactivar los timocitos o células T, y preferiblemente las células
T de los nódulos tímicos o linfáticos. La duración del corto
programa de administración de agente inmunosupresor es:
aproximadamente igual a 30 días; aproximadamente igual o inferior a
8-12 días, y con preferencia de aproximadamente 10
días; aproximadamente igual o inferior a dos, tres, cuatro, cinco o
diez veces el período de tiempo de 8-12 ó 10 días.
El corto programa de administración puede comenzar: antes de ser
iniciado el tratamiento para inducir tolerancia o aproximadamente al
ser iniciado el tratamiento para inducir tolerancia, y p. ej.
aproximadamente al ser introducidas en el receptor las células
troncales; el día en el que sea iniciado el tratamiento para inducir
tolerancia, y p. ej. el día en el que sean introducidas en el
receptor las células troncales; dentro de un período de tiempo de
1, 2, 4, 6, 8, 10 ó 30 días antes o después de ser iniciado el
tratamiento para inducir tolerancia, y p. ej. dentro de un período
de tiempo de 1, 2, 4, 6, 8, 10 ó 30 días antes o después de ser
introducidas las células troncales en el receptor. El corto programa
de administración de un inmunosupresor puede ser administrado en
conjunción con un anticuerpo contra las células T. El corto
programa de administración de un inmunosupresor deberá ser de una
concentración y una duración suficientes como para inactivar las
células T, como p. ej. las células T de los nódulos tímicos o
linfáticos, que no serían inactivadas por una inactivación de las
células T basada en anticuerpos, como p. ej. la inactivación
mediante administraciones intravenosas de anticuerpo
anti-timocitos humanos o de preparaciones
similares.
En otro aspecto, la invención incluye un
medicamento que está destinado a ser usado en un método para
inducir tolerancia a o prolongar la aceptación de un injerto de un
mamífero donante. El método incluye el paso de disminuir o inhibir
la actividad de los timocitos o células T, y preferiblemente la
actividad de las células T de los nódulos tímicos o linfáticos, a
base de administrar al receptor un corto programa de administración
de un agente inmunosupresor, como p. ej. una droga u otra sustancia
química, como p. ej. ciclosporina, que sea suficiente para
inactivar los timocitos o células T, y preferiblemente las células T
de los nódulos tímicos o linfáticos. La duración del corto programa
de administración de agente inmunosupresor es: aproximadamente
igual a 30 días; aproximadamente igual o inferior a
8-12 días, y con preferencia de aproximadamente 10
días; aproximadamente igual o inferior a dos, tres, cuatro, cinco o
diez veces el período de tiempo de 8-12 ó 10 días.
El corto programa de administración puede comenzar antes de la
introducción del tejido del donante en el receptor, preferiblemente,
y terminará 1, 2, 4, 6, 8, 10 ó 30 días antes de la introducción
del tejido del donante.
En realizaciones preferidas: el receptor es un
primate, como p. ej. un humano, y el injerto es un aloinjerto; el
receptor es un primate, como p. ej. un humano, y el donante es de
una segunda especie, y p. ej. de una segunda especie de primates, o
un cerdo.
Este método puede ser combinado con cualquiera de
los otros métodos que aquí se describen.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "combinación de especies discordantes"
se refiere a dos especies en las cuales tiene lugar rechazo
hiperagudo cuando un injerto es injertado de una a otra. En general,
las especies discordantes son de órdenes distintos, mientras que
las especies no discordantes son del mismo orden. Por ejemplo, las
ratas y los ratones son especies concordantes no discordantes. Las
combinaciones de especies concordantes no presentan rechazo
hiperagudo.
En el sentido en el que se le utiliza en la
presente, el vocablo "injerto" se refiere a una parte del
cuerpo, a un órgano, a un tejido o a células. Órganos tales como el
hígado, el riñón, el corazón o el pulmón u otras partes del cuerpo
tales como hueso o matriz esquelética, tejido tal como piel,
intestinos, glándulas endocrinas o células troncales progenitoras de
varios tipos, son todos ellos ejemplos de injertos.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "agente reductor de la colaboración"
significa un agente, como p. ej. una droga inmunosupresora, que
redunda en la reducción de la liberación de citoquina. Son ejemplos
de agentes reductores de la colaboración la ciclosporina, el
FK-506 y la rapamicina. Debido al hecho de que
pueden eliminar las células T, los anticuerpos contra las células T
no son preferidos para ser usados como agentes reductores de la
colaboración. Un agente reductor de la colaboración debe ser
administrado a nivel de una dosis suficiente para proporcionar el
nivel de inhibición de la liberación de citoquina que redundará en
tolerancia. El agente reductor de la colaboración deberá ser
administrado en ausencia de tratamientos que susciten la liberación
de citoquina, como p. ej. IL-2. Los putativos
agentes reductores de la colaboración pueden ser preseleccionados
mediante ensayos in vitro o in vivo, p. ej. a base de
poner al agente putativo en contacto con las células T y de
determinar la capacidad de las células T tratadas para liberar una
citoquina, como p. ej. IL-2. La inhibición de la
liberación de citoquina es indicativa de la eficacia del agente
putativo como agente reductor de la colaboración. Tales agentes
putativos preseleccionados pueden ser entonces probados
adicionalmente en un ensayo de trasplante de riñón. En un ensayo de
trasplante de riñón es sometida a ensayo la eficacia de un putativo
agente reductor de la colaboración a base de administrar el agente
putativo a un mono receptor y de implantar entonces en el receptor
un riñón de un mono donante concordante en cuanto a los antígenos
menores de la clase II y no concordante en cuanto a los antígenos
menores de la clase I. La tolerancia para con el riñón del donante
(indicada por la prolongada aceptación del injerto) es indicativa de
que al nivel de la dosificación con la que se ha efectuado el
ensayo el agente putativo es un agente reductor de la
colaboración.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "reducción de la colaboración"
significa la reducción de la colaboración de las células T mediante
la inhibición de la liberación de al menos una citoquina, como p.
ej. cualquiera de los miembros del grupo que consta de
IL-2, IL-4, IL-6,
interferón gamma o factor de necrosis tumoral, desde las células T
del receptor al tener lugar la primera exposición a un antígeno para
con el cual se desea tolerancia. La inhibición inducida en la
secreción de una citoquina por parte de las células T de un
receptor debe ser suficiente como para que el receptor presente
tolerancia a un antígeno que sea administrado durante la reducción
de la colaboración. Sin pretender que ésta constituya la única
teoría válida, se cree que el nivel de reducción es un nivel que
elimina considerablemente el inicial aumento brusco del nivel de
IL-2 que acompaña al primer reconocimiento de un
antígeno foráneo, pero que no elimina todas las células T maduras,
cuyas células pueden ser importantes para educar y producir
tolerancia.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "espacio hematopoyético" se refiere a
un estado creado en la médula ósea que suscita el injerto de las
células troncales administradas. La manera más común de crear
espacio hematopoyético es la consistente en la irradiación de la
médula ósea con irradiación de todo el cuerpo.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "célula troncal hematopoyética" se
refiere a una célula, como p. ej. una célula de médula ósea o una
célula de hígado o bazo fetal, que es capaz de desarrollarse
convirtiéndose en todos los linajes mieloides y linfoides, y que en
virtud de ser capaz de autorrenovarse puede proporcionar
reconstitución hematopoyética a largo plazo. En el sentido en el que
se la utiliza en la presente, la expresión "células troncales
hematopoyéticas" se refiere a células que no han sido retiradas
de un embrión humano. Pueden ser usadas en medicamentos de la
invención preparaciones purificadas de células hematopoyéticas o
preparaciones tales como médula ósea que incluyan otros tipos de
células. Sin pretender que ésta constituya la única teoría válida,
se cree que las células troncales hematopoyéticas se dirigen a un
sitio en el mamífero receptor. La preparación deberá incluir
células inmaduras, es decir células troncales hematopoyéticas
indiferenciadas; y estas células deseadas pueden ser separadas de
una preparación, o bien puede ser administrada una preparación
compleja. P. ej., en el caso de las células troncales de médula ósea
las células primitivas deseadas pueden ser separadas de una
preparación, o bien puede ser usada una muestra de médula ósea
compleja que incluya tales células. Las células troncales
hematopoyéticas pueden ser de animales fetales, neonatales,
inmaduros o maduros. Pueden ser usadas en los métodos de la
invención células troncales sacadas de la sangre del cordón del
receptor o del donante. Véase la Patente U.S. 5.192.553 y la
Patente U.S. 5.004.681.
En el sentido en el que la expresión es utilizada
en la presente, un "agente inmunosupresor capaz de inactivar las
células T de los nódulos tímicos o linfáticos" es un agente, y
p. ej. un agente químico, y p. ej. una droga, que, al ser
administrado a nivel de una dosificación apropiada, redunda en la
inactivación de las células T de los nódulos tímicos o linfáticos.
Son ejemplos de tales agentes la ciclosporina, el
FK-506 y la rapamicina. Pueden usarse también
anticuerpos contra las células T. Un agente deberá ser administrado
a razón de una dosis suficiente para redundar en una significativa
inactivación de las células T de los nódulos tímicos o linfáticos
que no sean inactivadas mediante la administración de un anticuerpo
contra las células T, como p. ej. una preparación
anti-ATG. Los agentes putativos y las
concentraciones útiles de los mismos pueden ser preseleccionados
mediante ensayos in vitro o in vivo, p. ej., a base
de administrar el agente putativo a un animal de ensayo, retirar una
muestra de tejido de los nódulos tímicos o linfáticos, y analizar
la presencia de células T activas en un análisis in vitro o
in vivo. Tales agentes putativos preseleccionados pueden ser
entonces sometidos adicionalmente a ensayo en ensayos de
trasplante.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "timocitos o células T de los nódulos
tímicos o linfáticos" se refiere a timocitos o células T que son
resistentes a la inactivación por los métodos tradicionales de
inactivación de las células T, como es p. ej. la inactivación
mediante una sola administración intravenosa de anticuerpos contra
las células T, y p. ej. de anticuerpos, y p. ej. de una preparación
de ATG (ATG = globulina anti-timocitos
humanos).
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "irradiación tímica" se refiere a un
tratamiento en el cual al menos la mitad, y preferiblemente al
menos un 75, un 90 o un 95% de la irradiación administrada está
dirigida al timo. La irradiación de todo el cuerpo, incluso si el
timo es irradiado al ser administrada la irradiación de todo el
cuerpo, no es considerada irradiación tímica.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "antígeno del complejo mayor de
histocompatibilidad" se refiere a un producto proteínico de uno o
varios genes del complejo mayor de histocompatibilidad; y la
expresión incluye fragmentos o análogos de productos de genes del
complejo mayor de histocompatibilidad que puedan evocar una
respuesta inmune en un organismo receptor. Los ejemplos de antígenos
del complejo mayor de histocompatibilidad incluyen los productos (y
los fragmentos o análogos de los mismos) de los gentes del complejo
mayor de histocompatibilidad humano, es decir los genes de los
antígenos linfocíticos humanos. Los antígenos del complejo mayor de
histocompatibilidad en el cerdo, y p. ej. en el cerdo miniatura,
incluyen los productos (y los fragmentos y análogos de los mismos)
de los genes de los antígenos leucocíticos porcinos, como p. ej. el
gen DRB.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "cerdo miniatura" se refiere a un cerdo
total o parcialmente consanguíneo.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "irradiación creadora de espacio
hematopoyético" se refiere a irradiación dirigida al tejido
hematopoyético, es decir a tejido en el cual se encuentran células
troncales, como p. ej. la médula ósea. La irradiación es de
intensidad suficiente para matar o inactivar un número considerable
de células hematopoyéticas. Esta irradiación es a menudo
administrada como irradiación de todo el cuerpo.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "espacio tímico" designa un estado
creado por un tratamiento que facilita la migración a y/o el
desarrollo en el timo de células hematopoyéticas del donante de un
tipo que puede eliminar o inactivar los timocitos del huésped que
reconocen los antígenos del donante. Se cree que el efecto es
mediado por la eliminación de células del huésped en el timo.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "corto programa de administración de un
agente reductor de la colaboración" significa un programa de
tratamiento transitorio no crónico. El tratamiento deberá comenzar
antes del trasplante del injerto o aproximadamente al ser efectuado
el trasplante del injerto. Como alternativa, el tratamiento puede
comenzar antes de la primera exposición del receptor a los antígenos
del donante o aproximadamente al tener lugar la primera exposición
del receptor a los antígenos del donante. Óptimamente, el
tratamiento tiene una duración que es aproximadamente igual o
inferior al período de tiempo que es necesario para que las células
T maduras de la especie receptora inicien el rechazo de un antígeno
tras haber sido inicialmente estimuladas por el antígeno. La
duración del tratamiento puede ser prolongada hasta llegar a ser
igual a un período de tiempo aproximadamente igual o inferior a
dos, tres, cuatro, cinco o diez veces el período de tiempo que es
necesario para que una célula T madura de la especie receptora
inicie el rechazo de un antígeno tras haber sido inicialmente
estimulada por el antígeno. La duración será habitualmente al menos
igual al período de tiempo que es necesario para que las células T
maduras de la especie receptora inicien el rechazo de un antígeno
tras haber sido inicialmente estimuladas por el antígeno. En los
cerdos y en los monos, son suficientes unos 12 días de tratamiento.
Los experimentos efectuados con ciclosporina A (10 mg/kg) en cerdos
demuestran que no son suficientes 6 días. Otros experimentos
efectuados con monos demuestran que la IL-2
administrada el día 8, 9 ó 10 del tratamiento con ciclosporina A
redundará en rechazo del tejido trasplantado. Por consiguiente, 8,
9 ó 10 días no son probablemente suficientes en los cerdos. En los
monos, una dosis de 20 mg/kg de ciclosporina con un nivel en sangre
de aproximadamente 500-1.000 ng/ml es suficiente
para inducir tolerancia a riñones concordantes en cuanto a los
antígenos de la clase II y no concordantes en cuanto a los
antígenos de la clase I y a los antígenos menores. El mismo nivel en
sangre, es decir el nivel de 500-1.000 ng/ml, es
suficiente para inducir tolerancia en los cerdos. La administración
a largo plazo de 5 mg/kg impide el rechazo (mediante supresión
inmune a largo plazo) pero no redunda en tolerancia.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "corto programa de administración de un
agente inmunosupresor" significa un programa de tratamiento
transitorio no crónico. El tratamiento deberá comenzar antes de ser
iniciado el tratamiento para inducir tolerancia o aproximadamente
al ser iniciado el tratamiento para inducir tolerancia, y p. ej.
aproximadamente al ser introducidas en el receptor las células
troncales xenogeneicas, alogénicas, singeneicas manipuladas
genéticamente o autólogas manipuladas genéticamente, y p. ej. el
corto programa de tratamiento puede comenzar el día en el que sea
iniciado el tratamiento para inducir tolerancia, y p. ej. el día en
el que sean introducidas en el receptor las células troncales
xenogeneicas, alogénicas, singeneicas manipuladas genéticamente o
autólogas manipuladas genéticamente; o bien el corto programa de
tratamiento puede comenzar dentro de un período de tiempo de 1, 2,
4, 6, 8 o 10 días antes de ser iniciado el tratamiento para inducir
tolerancia, y p. ej. dentro de un período de tiempo de 1, 2, 4, 6,
8 ó 10 días antes de ser introducidas en el receptor las células
troncales xenogeneicas, alogénicas, singeneicas manipuladas
genéticamente o autólogas manipuladas genéticamente. El corto
programa de tratamiento puede tener una duración correspondiente a
un período de tiempo igual o inferior a aproximadamente
8-12 días, y con preferencia de aproximadamente 10
días, o correspondiente a un período de tiempo que sea
aproximadamente igual o inferior a dos, tres, cuatro, cinco o diez
veces el período de tiempo de 8-12 ó 10 días.
Optimamente, el corto programa de tratamiento dura unos 30 días. La
dosificación deberá ser suficiente para mantener un nivel en sangre
suficiente para inactivar las células T de los nódulos tímicos o
linfáticos. Se ha comprobado que es eficaz en los primates una
dosificación de aproximadamente 15 mg/kg/día.
En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "tejido estromal" se refiere al tejido
de soporte o matriz de un órgano, a diferencia de sus elementos
funcionales o parenquima.
En el sentido en el que se le utiliza en la
presente, el vocablo "tolerancia" se refiere a una inhibición
de la respuesta inmune del receptor de un injerto que de otro modo
se produciría p. ej. en respuesta a la introducción de un antígeno
del complejo mayor de histocompatibilidad no propio en el receptor.
La tolerancia puede implicar las respuestas humorales o celulares o
a las respuestas tanto humorales como celulares. En el sentido en el
que se le utiliza en la presente, el vocablo "tolerancia" se
refiere no tan sólo a la completa tolerancia inmunológica a un
antígeno, sino a una tolerancia inmunológica parcial, es decir a un
grado de tolerancia a un antígeno que es mayor que el que se
observaría si no fuese empleado un medicamento de la invención. En
el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo
"tolerancia" se refiere a una inhibición del sistema
inmunológico específica del antígeno del donante, en oposición a la
inhibición de amplio espectro de sistema inmunológico que se
observa con los inmunosupresores.
Los medicamentos de la invención eliminan la
necesidad de tratamiento creador de espacio hematopoyético, y p.
ej. de irradiación, en muchos métodos de inducción de
tolerancia.
Mediante los medicamentos de la invención, la
creación de espacio tímico, p. ej. mediante irradiación tímica, la
inactivación de los timocitos y células T periféricos del receptor
y la administración de un número lo suficientemente grande de
células troncales xenogeneicas o alogénicas del donante permite la
inducción de tolerancia sin someter al receptor a irradiación de
todo el cuerpo. La inducción de espacio tímico puede reducir el
nivel de timocitos reactivos al donante, pero pueden añadirse pasos
adicionales (que se describen en la presente) para disminuir
adicionalmente la reactividad a los timocitos del donante.
A la luz de la siguiente descripción detallada y
de las reivindicaciones quedarán de manifiesto otras
características y ventajas de la invención.
Se describen brevemente en primer lugar los
dibujos.
La Fig. 1 es una ilustración de análisis
multilinaje de la repoblación de células del donante en animales a
los que les fueron administradas una inyección (- - - -) o cinco
inyecciones (____) de células de médula ósea.
La Fig. 2 (cuadro de la izquierda) es un gráfico
de la repoblación de monocitos del donante (\bigcirc),
granulocitos del donante (\blacksquare) y células B del donante
(triángulo negro) en las células blancas de la sangre de quimeras
estables entre ratones B6 que recibieron anticuerpos monoclonales
anti-CD4 y anti-CD8 los días -5, -1
y 7, y 6 Gy de irradiación tímica el día 0, con 174 x 10^{6}
células de médula ósea B10.A a lo largo de cinco días, desde el día
0 hasta el día 4 (n = 7). Están ilustradas en cada punto de datos
las desviaciones estándar. El panel de la derecha ilustra los
porcentajes de \pm desviación estándar de la media de las células
CD4 (\Delta) y CD8 (\blacksquare) totales originarias del
donante en las células blancas de la sangre de los mismos ratones
ilustrados en el panel de la izquierda.
La Fig. 3 es una ilustración de las respuestas en
la linfólisis mediada por células de las células del bazo de
quimeras mixtas estables. Fueron analizados a las 25 a 29 semanas
después del trasplante de médula ósea ratones B6 tratados con
anticuerpos monoclonales anti-CD4 y
anti-CD8 los días -5, -1 y 7, con irradiación tímica
el día 0 y con una dosis alta de células de médula ósea B10.A (174
x 10^{6} células a lo largo de los días 0 a 4). La reactividad en
materia de linfólisis mediada por células a las células
estimuladoras y a los blancos del tipo del huésped (cuadro superior
de la izquierda), del tipo del donante (cuadro superior de la
derecha) y de un tercero (cuadro inferior) está ilustrada para:
(\Box) una quimera mixta; (*) un control sin trasplante de
médula ósea/(\bigcirc) un ratón B6 normal; y (\blacklozenge) un
ratón B10.A normal. La lisis específica porcentual fue calculada
utilizando la fórmula siguiente: 100% x (liberación de ^{51}Cr
experimental -liberación de ^{51}Cr espontánea)/(liberación de
^{51}Cr máxima- liberación de ^{51}Cr espontánea). El cuadro de
la parte inferior de la figura ilustra la lisis específica
porcentual máxima obtenida para tres quimeras adicionales.
La Fig. 4 es un gráfico que ilustra la aceptación
específica de injertos cutáneos específicos del donante en
receptores B6 de trasplante de médula ósea B10.A alogénica (174 x
10^{6} los días 0 a 4) tras tratamiento con anticuerpos
monoclonales anti-CD4 y anti-CD8 los
días -5, -1 y 7, con 7 Gy de irradiación tímica el día 0. Cuadro de
la izquierda: supervivencia de la piel del tipo del donante en
ratones de control tratados de manera similar y que no recibieron
trasplante de médula ósea (____) y en receptores de trasplante de
médula ósea (- - - -). Cuadro de la derecha: supervivencia de la
piel de un tercero (SJL/J) en los mismos grupos de ratones. Los
injertos fueron llevados a cabo siete semanas después del trasplante
de médula ósea.
La Fig. 5 es una ilustración de la eliminación
específica de células V\beta5+ y V\beta11+ entre las células de
bazo CD4+ y entre los timocitos maduros (clase I^{alta}) del tipo
del huésped (K^{balta}) de quimeras que fueron sacrificadas a las
24 a 29 semanas del trasplante de médula ósea. Para los ratones de
control b10.A fueron analizados en lugar de ello timocitos
H-2D^{balta} seleccionados. Los ratones B6
recibieron 174 x 10^{6} células de médula ósea B10.A a lo largo de
los días 0-4 tras su acondicionamiento con
anticuerpos monoclonales anti-CD4 y
anti-CD8 y con 7 Gy de irradiación tímica. El
análisis por citometría de flujo fue llevado a cabo en 10^{4}
células seleccionadas para cada población de interés. Fue también
determinado el número total de células TCRa\beta^{alta} en la
misma selección, y los resultados obtenidos para cada V\beta
individual fueron corregidos dividiendo por la fracción de células
TCRa\beta^{alta}. Los resultados están presentados para
quimeras estables (n =6). * denota P<0,05; ***, P<0,005; ****,
P<0,0005; \text{*****}, P<0,00005 en comparación con los
simultáneos controles que fueron tratados de manera similar y no
recibieron trasplante de médula ósea (n = 4).
La invención aporta varios medicamentos para
inducir tolerancia a antígenos foráneos, y p. ej. a antígenos de
injertos de tejidos u órganos alogénicos o xenogeneicos. Estos
medicamentos están destinados a ser usados en métodos que pueden ser
usados individualmente o bien en combinación.
La siguiente Parte I presenta pruebas con
animales en las cuales se demuestra que pueden ser inducidos el
injerto, el quimerismo mixto y la tolerancia sin necesidad de
irradiación creadora de espacio hematopoyético.
La siguiente Parte II describe fuentes de células
para trasplante.
La siguiente Parte III expone la implantación de
células de médula ósea para inducir tolerancia a la disparidad del
complejo mayor de histocompatibilidad.
I. Ejemplo
1
Fueron obtenidos de la Frederick Cancer Research
Facility (Frederick, MD) ratones hembra C57BL/6NCR (B6;
H-2b.Ly-5,2) y ratones hembra
congénicos para Ly-5
B6.Ly-5,2(Ly-5.1). Los alelos
Ly-5 están descritos según la nomenclatura de Morse
et al. (1987. Immunogenetics 25:71). Todos los ratones fueron
alojados en jaulas microaisladoras esterilizadas en las cuales
recibieron alimento autoclaveado y agua potable acidificada
autoclaveada. Los receptores fueron emparejados por edades y fueron
usados a las 12 a 16 semanas de edad.
Los ratones C57BL/6NCR (B6;
H-2b.Ly-5.2) recibieron por vía
intraperitoneal los días -6 y -1 y +7 100 ml en cada caso de ascitis
que contenían anticuerpos monoclonales anti-CD4
GK1,5 y anticuerpos monoclonales anti-CD8 2.43. Este
volumen de ascitis contenía 1-2 mg de GK1.5 y
1,25-1,5 mg de 2.43 respectivamente, según medición
efectuada mediante ELISA (ELISA = inmunoanálisis ligado a enzimas)
específico de IgG2b. Los animales fueron irradiados con 0, 3,5 ó 7
Gy de irradiación tímica el día 0. Los de una serie de ratones
fueron tratados con una dosis de 200 millones de células de médula
ósea (BMC). Los de una segunda serie de ratones fueron tratados,
empezando el día 0 y repetidamente a diario por espacio de un total
de cinco días, con cuarenta millones (con un total de 200 millones
de células) de células de médula ósea de ratones
B6.Ly-5.2(Ly-5.1) congénicos
para Ly-5 que fueron administradas por vía
intravenosa. Las células de médula ósea (200 x 10^{6} células de
médula ósea) fueron obtenidas de las tibias y los fémures de
donantes B6, Ly-5.2 concordantes en cuanto al sexo
y de 6 a 14 semanas de edad. El agotamiento de las células T fue
llevado a cabo como se describe en Sykes et al. (1990. PNAS, 87:
5633-5637) usando anticuerpos monoclonales
anti-CD4 y anti-CD8 y complemento
de conejo.
La sangre periférica heparinizada fue analizada
en un Automated Cell Counter (System 9000;
Serono-Baker Diagnostics Inc., de Allentown,
PA).
La fenotipificación fue llevada a cabo en varios
puntos en el tiempo comenzando a las 2 semanas del trasplante de
médula ósea. Los animales fueron sometidos a sangría caudal, y las
células blancas de la sangre (WBCs) fueron preparadas mediante
shock hipotónico. Fueron también analizadas suspensiones de células
del bazo, timocitos, células de médula ósea y colonias de médula
ósea. Fue llevada a cabo en cada quimera y animal de control
coloración con anticuerpos monoclonales tanto específicos del
donante como específicos del receptor. Las células fueron incubadas
con 20 ml de supernatante de cultivo no diluido de
A20-1.7 (anticuerpo monoclonal
anti-Ly-5.1; IgG2a de ratón) o
104-2.1 (anticuerpo monoclonal
anti-Ly-5.2; IgG2a de ratón)
(habiendo sido los hibridomas amablemente facilitados por el Dr. S.
Kimura, del Sloan Kettering Cancer Institute, de Nueva York, NY) por
espacio de 30 minutos a 4ºC, y fueron a continuación lavadas dos
veces. Para bloquear la fijación inespecífica al FcgR de los
anticuerpos marcados, fueron añadidos a la primera incubación 10 ml
de supernatante de cultivo no diluido de 2.4G2 (anticuerpos
monoclonales para FcgR anti-ratón de rata). Los
anticuerpos monoclonales celulares fueron detectados con anticuerpos
monoclonales IgG2a anti-ratón de rata conjugados
con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Zymed laboratories. Inc.,
de Mundelein, IL), lo cual fue incubado por espacio de 30 minutos a
4ºC, siendo a continuación efectuados dos lavados y análisis en un
FACScan (Becton Dickinson, de Mountain View, CA). En todos los
experimentos, el porcentaje de células que se coloreaban con cada
anticuerpo monoclonal fue determinado a partir de histogramas de
fluorescencia monocromática y mediante la comparación con los
obtenidos de animales normales del tipo del donante y del tipo del
huésped, que fueron usados como controles positivos y negativos. El
porcentaje de células consideradas positivas tras la coloración con
un anticuerpo monoclonal fue determinado usando un corte elegido
como el nivel de fluorescencia al comienzo del pico positivo para la
cepa de control positivo, y a base de restar el porcentaje de
células coloreadas con un anticuerpo monoclonal irrelevante
(anticuerpo monoclonal IgG2a HOPC1 no reactivo más anticuerpo
monoclonal IgG2a anti-ratón conjugado con FITC). La
coloración porcentual relativa de una quimera con anticuerpo
monoclonal fue calculada utilizando la fórmula siguiente: 100% x
(positivo porcentual de quimera neto) - (positivo porcentual de
control negativo neto)/(positivo porcentual de control positivo
neto) - (positivo porcentual de control negativo neto), en la cual
el positivo porcentual neto se refiere al porcentaje obtenido tras
la sustracción de la coloración con HOPC1, y los controles
positivos y negativos eran células de apropiados ratones
Ly-5.1+ y Ly-5.2+ normales. Para las
poblaciones celulares de ensayo en las cuales la coloración con un
anticuerpo monoclonal anti-Ly-5 era
inferior a la del control negativo y el quimerismo porcentual
calculado era por consiguiente inferior a 0, los valores están
indicados como 0. Usando este método de cálculo pudo ser detectado
en las mezclas artificiales de Ly-5.2
(99,9%)/Ly-5.1 (0,1%) menos de un 0,1% de células
Ly-5.1+ contaminantes. Sin embargo, no era
detectable un pico positivo visible en mezclas artificiales que
contenían un 0,1% o menos de células Ly-5.1+, pero
era visible un pico positivo con un 1% de células
Ly-5.1+ contaminantes (datos no ilustrados). Todos
los linajes hematopoyéticos experimentaron fuerte coloración con
anticuerpos anti-Ly-5. Utilizando
registros gráficos de puntos de dispersión frontal de la luz y
dispersión de la luz a 90º (dispersión frontal y dispersión lateral
respectivamente) fueron seleccionadas poblaciones de linfocitos
(población de baja dispersión frontal y baja dispersión lateral),
de granulocitos (población de alta dispersión lateral) y de
monocitos (población de alta dispersión frontal pero de baja
dispersión lateral), y el quimerismo fue determinado por separado
para cada población. Todas las células de alta dispersión lateral en
la selección de granulocitos experimentaban coloración con
anticuerpos granulocíticos anti-ratón conjugados
con FITC (Gr-1). Las células muertas eran excluidas
segregando las células de baja dispersión frontal y alta retención
de yoduro de propidio.
A los de dos grupos de animales les fueron
administradas una inyección de 20 x 10^{7} células de médula ósea
o cinco inyecciones sobre una base diaria de 40 x 10^{6} células
de médula ósea. El análisis multilinaje de la repoblación del
donante puso de manifiesto que todos los linajes presentaban
quimerismo a largo plazo de un 10-25% que
permanecía estable por espacio de al menos 30 semanas (Figura 1).
Así, cuando son inyectadas en el ratón receptor múltiples dosis
altas de células de médula ósea, puede producirse injerto estable
de células troncales hematopoyéticas.
Fueron observados niveles significativamente
altos de injerto en la población de células T CD4 cuando los ratones
fueron pretratados con irradiación tímica según la Tabla 1, con un
incremento en virtud del cual se pasaba de aproximadamente un
0-10% a un 20-60%. La repoblación
del linaje monocítico fue incrementada pasando de un nivel de
aproximadamente un 20% hasta un nivel de entre un 30 y un 40%. Esto
está en consonancia con los resultados que indicaron previamente
que 3,5 Gy de irradiación de todo el cuerpo son suficientes para
permitir el injerto estable en la preparación singeneica. Estos
resultados indican que mientras que puede lograrse injerto en
ausencia de irradiación de todo el cuerpo o de irradiación tímica,
una dosis relativamente baja de irradiación tímica (3,5 Gy) permite
obtener un nivel más alto de injerto singeneico.
| Irradiación tímica | Injerto porcentual el día 30 | |
| CD4+ | Monocitos | |
| 0 | ND* | 20.8 |
| 11.5 | 18.2 | |
| ND | 25.3 | |
| ND | 19.4 | |
| 3.5 Gy | 31.0 | 31.4 |
| 36.6 | 31.5 | |
| 64.3 | 28.8 | |
| 28.4 | 29.6 | |
| 7.0 Gy | 37.0 | 39.0 |
| 71.3 | 36.7 | |
| 41.2 | 41.5 | |
| *No detectable |
Las células troncales hematopoyéticas
pluripotentes (PHSC) se injertan en receptores no acondicionados a
los que se administran altas dosis de médula singeneica o congénica
para Ly5. Se logró el injerto de células troncales hematopoyéticas
pluripotentes alogénicas a base de administrar a receptores B6
(H-2^{b}) una dosis alta (200 x 10^{6}) de
células de médula ósea B10.A (H-2^{a}) plenamente
no concordantes en cuanto al complejo mayor de histocompatibilidad.
Los receptores fueron acondicionados tan sólo con anticuerpos
monoclonales anti-CD4 y anti-CD8
agotadores los días -5, -1 y 7. Se logró quimerismo inicial entre
los granulocitos, monocitos y linfocitos de la sangre periférica,
con niveles máximos de un 15-33% de células del
donante a las cuatro a seis semanas del trasplante de médula ósea.
Sin embargo, el quimerismo de células T inicial era bajo (<
10%), y el quimerismo multilinaje tendía a disminuir con el paso
del tiempo. La Tabla 2 indica los bajos niveles de quimerismo en el
bazo, la médula y el timo de los animales sacrificados de 12 a 25
semanas después del trasplante de médula ósea.
A fin de optimizar el injerto, fue inducido
espacio tímico mediante la administración de irradiación tímica
(TI). Los ratones B6 recibieron anticuerpos monoclonales contra las
células T como se ha indicado anteriormente, 7 Gy de irradiación
tímica el día 0, y un total de 174 x 10^{6} células de médula
ósea B10.A plenamente no concordantes en cuanto al complejo mayor
de histocompatibilidad los días 0 a 4. En siete de diez animales,
las células del donante constituían una alta proporción de los
monocitos de las células blancas de la sangre, de los granulocitos,
de las células B y de las células CD4 y CD8 en todo momento (Fig.
2). En siete animales, el nivel de células T CD4 del donante
iniciales era similar al de otros linajes, y el quimerismo en todos
los linajes era estable a lo largo de todo el período de seguimiento
de seis meses (Fig. 2). Sin embargo, en tres animales, a pesar de
los niveles de quimerismo inicialmente altos, la representación del
donante disminuyó en algunos linajes o en todos los linajes con el
paso del tiempo (datos no ilustrados).
Los receptores del régimen de trasplante de
médula ósea alogénica a dosis altas con contenido de irradiación
tímica fueron sacrificados a las 24 a 29 semanas del trasplante de
médula ósea, y fue evaluado el quimerismo en otros tejidos. Las
quimeras de células blancas de la sangre más estables presentaban
considerable quimerismo entre las células de médula ósea, las
células B y T esplénicas y los timocitos maduros de la clase
I^{alta} (Tabla 2). Estos timos contenían también timocitos
inmaduros de la clase I^{baja} del donante. A diferencia de las
quimeras estables, los timos de las tres quimeras "inestables"
(Tabla 2) contenían pocas células de la clase I^{alta}
originarias del donante, y presentaban un variable quimerismo de las
células de médula ósea y de las células T y B esplénicas (Tabla
2).
El quimerismo multilinaje de alto nivel estable
observado en los de la mayoría de los ratones demuestra que puede
lograrse un considerable injerto de células troncales
hematopoyéticas pluripotentes alogénicas sin irradiación de todo el
cuerpo en ratones que reciben anticuerpos monoclonales agotadores
de las células T, 7 Gy de irradiación tímica y médula alogénica a
dosis altas. La representación del donante era similar a la
observada en los receptores de médula congénica para Ly5 tratados
de manera similar, lo cual indicaba que había sido completamente
superada la alorresistencia inmunológica. Estos resultados son
coherentes con nuestros estudios anteriores que demostraban que la
barrera mínima presentada por las células killer naturales del
receptor al injerto de células troncales hematopoyéticas
pluripotentes alogénicas podía ser superada fácilmente a base de
administrar adicionales células de médula ósea, lo cual sugiere que
la resistencia mediada por células killer naturales es saturable. La
observación de que para rescatar ratones irradiados letalmente son
necesarios mayores números de células troncales purificadas
alogénicas que de células troncales purificadas singeneicas puede
reflejar una imposibilidad de superar completamente la
alorresistencia mediada por células T. La presencia de poblaciones
celulares "facilitadoras" en los inóculos de médula intacta es
poco probable que haya afectado nuestros resultados, puesto que en
general se ha descrito que tales tipos de células expresan CD4 o
CD8, y las células CD4 y CD8 del donante están agotadas por los
anticuerpos monoclonales que están presentes en la circulación al
ser efectuado el trasplante de médula ósea.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los ratones fueron evaluados con respecto a la
mielosupresión. Fueron determinadas las cuentas de la sangre
completa los días -1, 1, 3, 6, 8, 10, 13 y 20 para los animales que
recibieron irradiación tímica el día 0 con o sin tratamientos con
anticuerpos monoclonales, sin trasplante de médula ósea. En los
receptores de irradiación tímica \pm anticuerpos monoclonales,
las cuentas de células blancas de la sangre de promedio alcanzaron
un nadir de 3.000/\mul el día 1, y volvieron a ser normales el
día 8. El nivel más bajo que fue alcanzado en cualquier ratón
individual fue el de 2.600/\mul. Ni las cuentas de plaquetas ni
las concentraciones de hemoglobina disminuyeron significativamente
en cualquier momento en cualquier grupo. Todos los animales
sobrevivieron sin toxicidad clínica. Por consiguiente, el
acondicionamiento del huésped con anticuerpos
monoclonales/irradiación tímica no ocasiona una toxicidad o
mielosupresión clínicamente significativa, pero permite el injerto
de células troncales hematopoyéticas pluripotentes de médula
alogénica a dosis altas.
Los receptores de trasplante de médula ósea
alogénica a dosis altas no presentaron pérdida de peso detectable u
otros signos clínicos de enfermedad del injerto contra el huésped
aguda o crónica. Los tiempos de recuperación de las células T eran
similares en los animales que recibieron acondicionamiento con
anticuerpos monoclonales/irradiación tímica con o sin trasplante de
médula ósea alogénica a dosis altas, y las producciones de células
tímicas y esplénicas eran similares en ambos grupos. El hecho de no
presentar los receptores estigmas clínicos o atrofia linfoide
asociados a la enfermedad del injerto contra el huésped refleja
probablemente el agotamiento de células T maduras en la médula del
donante por los anticuerpos monoclonales que están aún presentes en
el suero al ser efectuado el trasplante de médula ósea.
Para evaluar la tolerancia, fueron llevados a
cabo de 24 a 29 semanas después del acondicionamiento estudios de
reacciones de los linfocitos mixtos (MLR) y de linfólisis mediada
por células (CML) en los receptores que recibieron trasplante de
médula ósea y simultáneos controles que no recibieron trasplante de
médula ósea y fueron tratados de manera similar. Los cuatro
animales con quimerismo multilinaje estable presentaron tolerancia
al donante y huésped para la linfólisis específica mediada por
células, con respuestas contra un tercero similares a las de los
ratones de control que no recibieron trasplante de médula ósea (Fig.
3). Este último grupo presentó respuestas
anti-B10.A similares a las de los ratones B6 no
tratados (Fig. 3). Cuatro de seis quimeras estables presentaron
incapacidad de respuesta en las reacciones de los linfocitos mixtos
específicos del donante, mientras que dos animales presentaron en
general hiporrespuesta. En contraste, los cuatro controles que no
recibieron trasplante de médula ósea presentaron respuestas
anti-B10.A similares a las de los ratones B6 (P <
0,01 en comparación con los ratones que recibieron trasplante de
médula ósea). Globalmente, los resultados demuestran tolerancia en
las reacciones de los linfocitos mixtos y en la linfólisis mediada
por células específica del donante en los ratones que recibieron
trasplante de médula ósea alogénica a dosis altas con
acondicionamiento no mielosupresor.
De dos "quimeras inestables" en la Tabla 2,
una presentó incapacidad de respuesta en la linfólisis mediada por
células específica del donante, y otra presentó una generalizada
incapacidad de respuesta en la linfólisis mediada por células. Dos
de las tres quimeras inestables presentaron incapacidad de
respuesta en las reacciones de los linfocitos mixtos específicas
del donante, mientras que la tercera presentó incapacidad de
respuesta generalizada (datos no ilustrados). Las fuertes
respuestas observadas para los controles acondicionados que no
recibieron trasplante de médula ósea excluyen el propio régimen de
acondicionamiento como la causa de esta hipocapacidad de respuesta,
y su presencia en las quimeras inestables y la falta de evidencia de
enfermedad del injerto contra el huésped hace que la
inmunodeficiencia asociada al injerto contra el huésped constituya
una explicación poco probable. La interreactividad de los antígenos
de terceros con los antígenos del donante a los cuales los animales
eran tolerantes es la explicación más probable para las débiles
respuestas a terceros en algunos receptores de trasplante de médula
ósea.
Puesto que algunas quimeras inestables así como
algunas quimeras estables presentaron incapacidad de respuesta
específica del donante in vitro, la disminución del
quimerismo en las quimeras inestables puede ser un indicador más
sensible de la tolerancia incompleta que las reacciones de los
linfocitos mixtos o la linfólisis mediada por células. Como
alternativa, el quimerismo decreciente puede reflejar mecanismos no
inmunológicos tales como un mal injerto de las células troncales
hematopoyéticas pluripotentes. Para distinguir entre estas
posibilidades, la tolerancia fue evaluada mediante el ensayo más
riguroso, que es el del injerto cutáneo. Todas las quimeras
estables aceptaron permanentemente los injertos cutáneos del
donante, pero rechazaron rápidamente los injertos de terceros,
demostrando con ello la tolerancia específica del donante (Fig. 4).
Una quimera inestable en la cual el quimerismo decreciente estaba
limitado al linaje de las células T ("quimera inestable" Nº 2,
Tabla 2) aceptó también la piel del donante. Las otras dos quimeras
inestables rechazaron crónicamente la piel del tipo del donante los
días 105 y 48, respectivamente. En las quimeras estables, la piel
del donante con la que se efectuó un injerto repetido a las 31
semanas del trasplante de médula ósea (y los injertos originales)
continuó (y continuaron) en perfectas condiciones hasta ser
sacrificados los animales de tres a ocho semanas después. Por
consiguiente, según el criterio más riguroso del injerto cutáneo,
estos animales presentaron tolerancia permanente específica del
donante.
Fue analizado el uso de V\beta para examinar el
mecanismo de tolerancia en quimeras preparadas con médula alogénica
a dosis altas. La cepa donante, B10.A, expresa I-E,
lo cual es necesario para presentar superantígenos sacados del virus
del tumor mamario codificados en el genoma de fondo B6/B10. Los
timocitos en desarrollo cuyos receptores de antígeno de las células
T contienen V\beta11 o V\beta5, que se fijan a estos
superantígenos, son eliminados en los ratones B10.A, pero no en los
ratones B6 (H-2^{b}), que no expresan
I-E (Fig. 5). Fueron enumerados los timocitos del
huésped maduros V\beta11+ y V\beta5+ (células
H-2K^{balta} seleccionadas) y las células CD4+
periféricas. Las quimeras estables a largo plazo presentaron
eliminación de células CD4+ V\beta5 y V\beta11 entre los
linfocitos de la sangre periférica, los esplenocitos y los
timocitos B6 maduros, análogamente a los donantes B10.A normales.
Estas V\beta no fueron eliminadas en los controles que no
recibieron trasplante de médula ósea. Los porcentajes de células
V\beta8.1/2 de control eran normales en todos los grupos (Fig. 5;
no indicados los datos de los linfocitos de la sangre periférica).
Las "quimeras inestables" en la Tabla 2 presentaron una
eliminación menos completa de los timocitos tipo huésped V\beta5+
y V\beta11+ (un 1,4-4,2% de V\beta5 y un
1,1-5,1% de V\beta11) y de las células esplénicas
CD4 y de los linfocitos de la sangre periférica (no indicados) en
comparación con las quimeras estables. Así, la completa eliminación
de las V\beta que reconocen los superantígenos
I-E más del donante se correlacionaba con la
presencia de tolerancia al injerto cutáneo específico del donante y
de quimerismo mixto estable permanente, lo cual sugiere que la
eliminación intratímica era un mecanismo de tolerancia.
Puesto que las células hematopoyéticas pueden
inducir eficazmente la eliminación clonal en el timo, buscamos
I-E del donante en los timos de los receptores
utilizando inmunohistoquímica. A las 24 a 29 semanas del trasplante
de médula ósea eran claramente detectables células
I-E+ del donante en los timos de las de la mayoría
de las quimeras estables (Tabla 2). En contraste con ello, dos de
tres quimeras inestables no contenían células I-E+
del donante detectables en sus timos (Tabla 2). Globalmente, estos
resultados demuestran una correlación entre la presencia
intratímica a largo plazo de células de la clase II+ originarias del
donante y la completa eliminación de V\beta que reconocen
superantígenos presentados por las moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad del donante. Las células de la clase II+ del
donante estaban distribuidas normalmente en los timos de todos los
receptores. La irradiación tímica era esencial para la optimización
del quimerismo estable (Tabla 1) y para la tolerancia permanente a
los injertos cutáneos. Mientras que la irradiación tímica de 7 Gy no
era significativamente mielosupresora, la misma permitía lograr
altos niveles de injerto de las células troncales hematopoyéticas
pluripotentes y tolerancia delecional permanente específica del
donante.
Puede lograrse quimerismo periférico mediante las
altas dosis de médula ósea sin necesidad de irradiación total. Sin
embargo, para lograr tolerancia delecional central lo mejor es
crear espacio en el timo a fin de permitir que se desarrollen altos
niveles de quimerismo intratímico. Esto puede lograrse mediante
irradiación o mediante el uso de múltiples administraciones de
anticuerpos contra las células T, o con drogas que agoten el timo.
Puede ser apropiado un nivel de irradiación tímica de entre 3 y 7
Gy.
Fueron adquiridos ratones hembra C57BL/6
(B6:H-2^{b}), B10.A (B10.A:
H-2^{a}, K^{k}, I-A^{k},
I-E^{k}, D^{d}), BALB/c
(H-2^{d}), SJL (H-2^{a}) y A.SW
(H-2^{a}) del Frederick Cancer Research Center, de
Frederick, MD, o del The Jackson Laboratory, de Bar Harbor, ME. Los
ratones fueron mantenidos en un ambiente de microaislador exento de
patógenos específicos.
Los ratones receptores B6 hembras agrupados por
edades (de 7 a 14 semanas de edad) recibieron respectivamente 2 mg
y 1,4 mg de anticuerpos monoclonales GK1.5 anti-CD4
de ratón IgG_{2b} de rata (Dialynas et al., J. Immunol.
131:2445-2451 (1983)) y de anticuerpos monoclonales
anti-CD8 de ratón 2.43 (Sarmiento J.
Immunol. 125:2665 (1980)) por vía intraperitoneal (i.p.) los
días -5, -1 y 7 con respecto al trasplante de médula ósea. Fueron
administrados el día 0 7 Gy de irradiación tímica selectiva
(Sharabi et al., J. Exp. Med. 169:493-502
(1989)). Fueron administradas diariamente cada uno de los días 0 a
4 35-40 x 10^{6} células de médula ósea no
tratadas de ratones B10.A, totalizando cinco inyecciones (en total
174-200 x 10^{6} células de médula ósea).
La fijación inespecífica al FcgR fue bloqueada
con anticuerpo monoclonal anti-FcgR de ratón 2.4G2
(Sherman et al., Immunogenetics 12: 183-189
(1981)). Los anticuerpos monoclonales conjugados con FITC incluían
anticuerpos monoclonales anti-CD4 (Pharmingen, San
Diego, CA), anticuerpos monoclonales anti-CD8
(Caltag, San Francisco, CA y Pharmingen) y anticuerpos monoclonales
anti-MAC1 (Caltage) y anti-IghM
murina de rata (YMED), así como anticuerpos monoclonales
anti-TCRa\beta, anti-Vb5,
anti-Vb11 y anti-Vb8.1/2 adquiridos
a Pharmingen. El anticuerpo monoclonal de control negativo
HOPC1-FITC, sin reactividad para con las células
murinas, fue preparado en nuestro laboratorio. Fueron desarrollados
con ficoeritrina-estreptavidina (PEA) anticuerpos
monoclonales anti-H-2D^{d}
34-2-12 biotinilados (Ozato et al.,
Transplantation 34:113-120 (1982)),
anticuerpos monoclonales
anti-H-2K^{b} 5F1 (Sherman et al.,
Immunogenetics 12:183-189 (1981)) y
anticuerpos monoclonales de control HOPC1. Fueron adquiridos a
Pharmingen anticuerpos monoclonales anti-CD4
conjugados con ficoeritrina (Pharmingen, San Diego, CA) e IgG2a
inespecífica de rata (control negativo).
La reconstitución alogénica de varios linajes en
las células blancas de la sangre, la médula esplénica y el timo fue
evaluada mediante citometría de flujo de dos colores. Las
propiedades de dispersión frontal y de dispersión a 90 grados de la
luz fueron usadas para distinguir los linfocitos, los granulocitos
y los monocitos en las células blancas de la sangre, como se ha
descrito. La citometría de flujo de dos colores fue utilizada para
distinguir células del donante y del huésped de determinados
linajes, y el porcentaje de células del donante fue calculado como
se ha descrito (Lee et al., Transplantation
61:125-132 (1996); y Tomita et al., J. Immunol.
153:1087-1098 (1994)), a base de restar la
coloración de control de los cuadrantes que contenían células del
donante y del huésped de un determinado fenotipo, y dividiendo el
porcentaje neto de células del donante por el porcentaje neto total
de células del donante más células del huésped de ese fenotipo. Las
células muertas fueron excluidas segregando las células de baja
dispersión frontal/alta retención de yoduro de propidio. Para el
análisis de las familias V\beta de receptores de las células T
(TCR), fueron analizados como se ha descrito (Tomita et al., J.
Immunol. 153:1087-1098 (1994)) 10^{4} células T
CD4+ seleccionadas (linfocitos de la sangre periférica y bazo) o
10^{4} timocitos H-2 de la clase I^{alta}
seleccionados. Los timocitos de la clase I^{alta} incluyen
principalmente células T unipositivas maduras (Scollay et al., J.
Immunol. 124:2845 (1980))
Fueron cultivados esplenocitos en cavidades
triplicadas que contenían 4 x 10^{5} células respondedoras con 4 x
105 células estimuladoras (30 Gy) en medio RPMI 1640 suplementado
con un 15% (volumétrico) de sustituto de suero obtenido mediante
elaboración controlada (CPSR-2; Sigma), un 4% de
mezcla nutriente (7,3 mg/ml de L-glutamina, 4 x
aminoácidos no esenciales (Gibco), 2,75 mg/ml de piruvato sódico,
250 U/ml de penicilina y 250 mg/ml de estreptomicina), un 1% de
tampón Hepes y 2-mercaptoetanol 10mM a 37ºC en CO2
al 5% por espacio de tres a cuatro días antes de ser pulsados con
timidina marcada con ^{3}H y de ser recolectados 18 horas después.
El índice de simulación (S.I.) fue calculado a base de comparar las
respuestas anti-donante y
anti-terceros con las respuestas
anti-huésped, que eran similares a las cuentas de
fondo (es decir, cpm sin población de células estimuladoras).
Las reacciones de linfólisis mediada por células
fueron llevadas a cabo como se ha descrito (Sykes et al. J.
Immunol. 140:2903-2911 (1988)), exceptuando el
hecho de que fueron cultivadas en cada cavidad 8 x 10^{5} células
respondedoras con 8 x 10^{5} células estimuladoras (irradiadas con
30 Gy), y el día 5 fueron añadidos 8000^{5} linfoblastos
estimulados durante 48 horas con concanavalina A y marcados con
^{1}Cr.
Fueron implantados como se ha descrito (Sharabi
et al., J. Exp. Med. 169:493-502 (1989))
injertos de piel caudal de pleno espesor del tipo del donante y de
terceros (SJL). Los injertos fueron definidos como aceptados si
estaban en perfectas condiciones, con pelos y escamas caudales, y
fueron considerados como rechazados al producirse una completa
esfacelación o cuando formaban una costra seca.
Secciones de cuatro micras fueron preparadas a
partir de tejido tímico congelado y fueron coloreadas con
anticuerpos monoclonales ISCR3 (Watanabe et al.,
Transplantation 36:712-718 (1983),
(IgG_{2b} murina anti-I-E),
25-9-17 (IgG_{2a} murina
anti-I-A^{b}) (Ozato et al., J.
Immunol. 126:317-321 (1981)), HOPC-1
(control isotópico de IgG_{2a} de ratón) o
74-11-10 (control isotópico de
IgG_{2b} de ratón), revelados con IgG_{2a}
anti-ratón de rata biotinilada o
anti-IgG_{2b} (Pharmingen), peroxidasas del
rábano-estreptavidina y sustrato, como se ha
descrito (Tomita et al., J. Immunol. 153:1087-1098
(1994)). Las secciones coloreadas fueron analizadas por un
observador que ignoraba cuál era el animal del cual había sido
obtenido el tejido.
La significancia estadística fue determinada
utilizando la prueba t de Student para la comparación de las medias.
Se consideraba que era estadísticamente significante un valor p de
menos de 0,05.
Un donante humano viviente puede proporcionar
aproximadamente 7,5 x 10^{8} células de médula ósea/kg. Los
medicamentos de la invención son para métodos que pueden incluir la
administración de al menos 2 ó 3 veces este número (por kg) y
preferiblemente al menos 10, 15 ó 20 veces este número. Los
necesarios números de células de médula ósea pueden obtenerse
mediante la amplificación o expansión ex vivo de células
troncales humanas. La expansión ex vivo está estudiada en Emerson,
1996, Blood 87:3082. Los métodos de expansión ex vivo están
descritos más detalladamente en Petzer et al., 1996, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93:1470; Zundstra et al., 1994, BioTechnology,
12:909; y WO 95 11692 Davis et al. Las fuentes de células troncales
hematopoyéticas incluyen las células de médula ósea, las células de
sangre periférica movilizada y las células de sangre del cordón
cuando estén disponibles.
En el caso de los animales donantes
consanguíneos, como p. ej. los cerdos miniatura consanguíneos,
están disponibles números muy grandes de células troncales, puesto
que el número que puede ser suministrado no está limitado por el
número que puede ser recolectado de un solo donante.
En el caso en el que el receptor es un primate,
como p. ej. un humano, y el donante es un cerdo, como p. ej. un
cerdo miniatura, pueden ser administradas 7,5 x 10^{9} o más, y
preferiblemente entre 7,5 x 10^{9} y 15 x 10^{10} células de
médula ósea porcina/kg, a pesar de que esto variará con factores
tales como la intensidad del régimen preparativo y la salud del
receptor individual. Como se expone en la presente, estas células
pueden ser aportadas en más de una administración.
El sistema siguiente puede ser usado para
determinar o afinar el número de células porcinas que es necesario
para injertar e inducir tolerancia en un modelo de
cerdo-primate. Son administradas a monos cynomolgus
varias dosis de células de donante, y mediante los análisis que se
describen es determinado el número de células que es necesario para
el establecimiento de quimerismo y la inducción de tolerancia. El
tiempo cero está definido como el punto en el tiempo en el que las
cánulas arterial y venosa del receptor son conectadas al hígado que
va a ser sometido a perfusión.
Es inducido espacio tímico administrando 7 Gy
(700 rad) de irradiación tímica entre los días -1 y -8. No es
administrada irradiación de todo el cuerpo.
El día -1 le es inyectada al receptor una
preparación comercial (Upjohn) de globulina antitimocitos
antihumana de caballo (ATG). El receptor es anestesiado, es
insertado en el receptor un catéter intravenoso, y son retirados 6
ml de sangre total heparinizada antes de la infusión. La
preparación de ATG es entonces inyectada (50 mg/kg) por vía
intravenosa. A los 30 minutos, a las 24 horas y a las 48 horas son
retiradas para ensayo muestras de seis ml de sangre total
heparinizada. Las muestras de sangre son analizadas para determinar
el efecto del tratamiento con anticuerpos en la actividad de las
células killer naturales (siendo los blancos K562) y mediante
análisis con selector de células activadas por fluorescencia (FACS)
para las subpoblaciones de linfocitos, incluyendo los CD4, CD8,
CD3, CD11b y CD16. Si no son eliminadas las células T maduras y las
células killer naturales, puede ser administrada de nuevo ATG con
posterioridad en el procedimiento.
Para retirar los anticuerpos naturales de la
circulación del receptor antes del trasplante, el día 0 es llevada
a cabo una absorción operatoria de anticuerpos naturales (nAB)
usando un hígado de cerdo miniatura, como se indica a continuación.
A los -90 minutos es anestesiado el donante porcino, y el hígado es
preparado para la remoción mediante procedimientos operatorios
estándar. A los -60 minutos es anestesiado el mono receptor. Es
insertado un catéter intravenoso periférico, y es retirada una
muestra de 6 ml de sangre total. Mediante incisión en la línea
media, son aisladas la aorta abdominal y la vena cava. Son
insertadas en los vasos sanguíneos cánulas de Silastic que
contienen accesos laterales para el muestreo de sangre.
A los -30 minutos, el hígado es sometido a
perfusión in situ hasta volverse pálido, y entonces es
retirado del donante porcino y puesto en Lactato de Ringer frío. Al
hígado se le mantiene frío hasta justo antes de la reperfusión en
el mono. Es tomada una biopsia del hígado. A los -10 minutos, el
hígado es sometido a perfusión con solución de albúmina caliente
hasta estar caliente el hígado (a 37 grados).
En el punto 0 en el tiempo las cánulas arterial y
venosa del receptor son conectadas a la vena porta y a la vena cava
del hígado del donante, y es iniciada la perfusión. Son tomadas
biopsias del hígado a los 30 minutos y a los 60 minutos,
respectivamente. A los 30 minutos y a los 60 minutos
respectivamente son también retiradas para suero muestras de sangre
del receptor. A los 60 minutos el hígado es desconectado de las
cánulas y son reparados los grandes vasos sanguíneos del receptor.
Habiendo desempeñado su función de absorber los anticuerpos
naturales dañinos del mono receptor, el hígado es desechado. A las
2, a las 24 y a las 48 horas son retiradas del receptor adicionales
muestras de sangre para suero. La perfusión del órgano puede ser
sustituida por una perfusión de una matriz de afinidad por el
epítope por unión a \alpha1-3 galactosa, p. ej.
en forma de una columna de afinidad, como p. ej. carbohidrato VI
tipo B lineal en matriz.
Las células de médula ósea del donante porcino
son administradas mediante inyección intravenosa. La médula ósea es
recolectada e inyectada por vía intravenosa como se ha descrito
anteriormente (Pennington et al., 1988, Transplantation
45:21-26). Son típicamente administradas en
regímenes que incluyen irradiación de todo el cuerpo 7,5 x
10^{8}/kg células de médula ósea. Las pruebas iniciales para
determinar un apropiado número de células a administrar en un
régimen en el que no sea efectuada irradiación de todo el cuerpo
deberán comenzar con una gama de dosis que vaya desde varias veces
hasta 20 veces ese número. Al nivel más alto de la gama de
dosificaciones son deseables administraciones múltiples. Pueden ser
administradas citoquinas porcinas para suscitar el injerto.
Para efectuar un seguimiento del quimerismo,
puede ser utilizada citometría de flujo de dos colores. Este
análisis hace uso de anticuerpos monoclonales para distinguir entre
los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de la clase
I del donante y los antígenos comunes leucocíticos frente a los
antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de la clase I
del receptor. Como alternativa, el seguimiento del quimerismo puede
ser efectuado mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Si se comprobase que los anticuerpos naturales reaparecen
antes de ser inducida la tolerancia, y si estos anticuerpos
ocasionasen daños al tejido del donante, el protocolo puede ser
modificado para contar a continuación del trasplante de médula ósea
con tiempo suficiente para que sea establecida la tolerancia humoral
antes del trasplante del órgano. El seguimiento de la tolerancia al
antígeno del donante puede ser efectuado por métodos estándar, y p.
ej. mediante análisis de las reacciones de los linfocitos
mixtos.
\newpage
El procedimiento siguiente fue diseñado para
prolongar el tiempo por espacio del cual un órgano implantado (un
xenoinjerto) sobrevive en un huésped xenogeneico antes del rechazo.
El órgano puede ser cualquier órgano, como p. ej. un hígado, un
riñón, un páncreas o un corazón. Las principales estrategias del
método incluyen una varias de las siguientes: la eliminación de
anticuerpos naturales p. ej. a base de poner la sangre del receptor
en contacto con epítopes que reaccionen con anticuerpo natural
reactivo al donante; la inactivación de células T del donante; la
inactivación de células killer naturales del donante; el trasplante
de células troncales inductoras de tolerancia, como p. ej. células
troncales de médula ósea, y opcionalmente la implantación de tejido
estromal del donante o la administración de citoquinas del donante;
y la administración de irradiación tímica. La combinación de un
número lo suficientemente grande de células troncales del donante
administradas en combinación con irradiación tímica elimina la
necesidad de irradiación de todo el cuerpo. El método incluye
cualesquiera de estos pasos o todos ellos. Dichos pasos son
preferiblemente llevados a cabo en la secuencia que se indica a
continuación.
Primeramente le es inyectada por vía intravenosa
al receptor una preparación de globulina
anti-timocitos humanos (ATG) de caballo. La
preparación de anticuerpos elimina las células T maduras y las
células killer naturales. De no ser eliminadas, las células T
maduras suscitarían el rechazo tanto del trasplante de médula ósea
como del propio xenoinjerto tras la sensibilización. La preparación
de ATG elimina también las células killer naturales (NK). Las
células killer naturales probablemente carecen de efecto en el
órgano implantado, pero actuarían inmediatamente para rechazar la
médula ósea de nueva introducción. Puede ser usada ATG antihumana
obtenida de cualquier huésped mamífero, como p. ej. ATG producida en
cerdos, si bien hasta la fecha las preparaciones de ATG de cerdo
han venido siendo de un título inferior al de la ATG sacada de
caballos. La ATG es superior a los anticuerpos monoclonales
anti-NK, por cuanto que éstos últimos son en
general no líticos para con todas las células killer naturales del
huésped, mientras que la mezcla policlonal en la ATG es capaz de
lisar todas las células killer naturales del huésped. Pueden ser
sin embargo usados anticuerpos monoclonales
anti-NK.
La presencia de antígeno del donante en el timo
del huésped durante el período de tiempo en el cual están
regenerándose las células T del huésped tras el trasplante es
decisiva para impartir tolerancia a las células T del huésped. Si
las células troncales hematopoyéticas del donante no son capaces de
quedar establecidas en el timo del huésped y de inducir tolerancia
antes de que se regeneren las células T del huésped, pueden ser
necesarias a lo largo de todo el régimen no mieloablativo dosis
repetidas de anticuerpos de células T anti-receptor.
Puede ser necesario por espacio de varias semanas un agotamiento
continuo de las células T del huésped.
Puede ser también necesario o deseable
esplenectomizar al receptor a fin de evitar la anemia.
En segundo lugar, los anticuerpos naturales son
absorbidos de la sangre del receptor mediante hemoperfusión. Los
anticuerpos naturales (nAB) preformados son los agentes primarios
de rechazo de injertos. Los anticuerpos naturales se fijan a las
células endoteliales xenogeneicas. Estos anticuerpos son
independientes de toda exposición previa conocida a antígenos del
donante xenogeneico. Es desconocido el mecanismo en virtud del cual
es impartida tolerancia a las células B de nuevo desarrollo. Es
útil para retirar de la sangre del receptor los anticuerpos
anti-cerdo una matriz de afinidad por el epítope por
unión a \alpha1-3 galactosa, p. ej. en forma de
una columna de afinidad, como p. ej. carbohidrato VI tipo B lineal
en matriz.
El tercer paso del procedimiento no mieloablativo
es el de suministrar citoquinas o factores de crecimiento
específicos del donante para suscitar el injerto de las células
troncales del donante.
Puesto que el hígado es el sitio principal de
hematopoyesis en el feto, el hígado fetal puede también servir como
alternativa a la médula ósea como fuente de células troncales
hematopoyéticas. El timo es el principal sitio de maduración de las
células T. Cada órgano incluye una matriz estromal específica del
órgano que puede soportar la diferenciación de las respectivas
células troncales indiferenciadas implantadas en el huésped. A pesar
de que puede ser usado timo adulto, se prefiere el tejido fetal
obtenido en una etapa lo suficientemente temprana de la gestación
porque el mismo está exento de linfocitos T maduros que pueden
ocasionar enfermedad del injerto contra el huésped. Los tejidos
fetales tienden también a sobrevivir mejor que los tejidos adultos
al ser trasplantados. Como precaución adicional contra la enfermedad
del injerto contra huésped, el tejido estromal tímico puede ser
irradiado antes del trasplante, siendo p. ej. irradiado con 10 Gy
(1000 rad). Como alternativa o adicionalmente a la implantación,
pueden ser administradas células de hígado fetal en suspensión en
fluido.
En cuarto lugar, son inyectadas al interior del
receptor células de médula ósea (BMC) u otra fuente de células
troncales hematopoyéticas, como p. ej. una suspensión de hígado
fetal. Las células de médula ósea del donante se dirigen a los
apropiados sitios del receptor y crecen junto con las restantes
células del huésped y proliferan, formando una población
linfohematopoyética quimérica. En virtud de este proceso, las
células B de nueva formación (y los anticuerpos que las mismas
producen) son expuestas(os) a los antígenos del donante, con
lo cual el trasplante será reconocido como propio. Es también
observada tolerancia al donante al nivel de las células T en los
animales en los cuales se ha logrado el injerto de células troncales
hematopoyéticas, como p. ej. células de médula ósea. Cuando un
injerto orgánico es implantado en un receptor de este tipo varios
meses después de haber sido inducido el quimerismo de la médula
ósea, habrá desaparecido el anticuerpo natural contra el donante, y
el injerto deberá ser aceptado por las armas tanto humorales como
celulares del sistema inmunológico. Esta solución tiene la ventaja
añadida de permitir que el trasplante del órgano sea llevado a cabo
tras haber transcurrido a continuación del trasplante de células
hematopoyéticas, y p. ej. del trasplante de médula ósea, como p. ej.
una suspensión de hígado fetal, un período de tiempo lo
suficientemente largo como para que la salud y la inmunocompetencia
normales hayan quedado restituidas al ser efectuado el trasplante
del órgano. El uso de donantes xenogeneicos proporciona la
posibilidad de usar células de médula ósea y órganos del mismo
animal o de animales genéticamente concordantes.
Muchos de los métodos que se describen en la
técnica utilizan irradiación de todo el cuerpo para crear espacio
hematopoyético y para con ello suscitar el injerto. La necesidad de
irradiación puede ser eliminada a base de administrar un número
suficiente de células de médula ósea del donante. Esto podría
combinarse con un tratamiento, como p. ej. la irradiación tímica,
que induzca espacio tímico.
Finalmente, las células T, y en particular las
células T de los nódulos tímicos o linfáticos, pueden ser
adicionalmente suprimidas a base de administrar al receptor un corto
programa de tratamiento con un agente inmunosupresor, como p. ej.
la ciclosporina.
Mientras que cualquiera de estos procedimientos
puede ayudar a la supervivencia de un órgano implantado, los
mejores resultados se logran cuando son usados en combinación todos
los pasos. Los medicamentos de la invención están destinados a ser
usados en métodos que pueden ser usados para conferir tolerancia a
los injertos alogénicos, p. ej. cuando tanto el donante como el
receptor del injerto son humanos, y a los injertos xenogeneicos, p.
ej. cuando el donante del injerto es un animal no humano, como p.
ej. un cerdo, como p. ej. un cerdo miniatura, y el receptor del
injerto es un primate, como p. ej. un humano.
En el caso de los injertos xenogeneicos, el
donante del implante y el individuo que proporciona las células
hematopoyéticas inductoras de tolerancia o el hígado que debe ser
sometido a perfusión deberán ser el mismo individuo o deberán estar
tan estrechamente emparentados como sea posible. Por ejemplo, es
preferible sacar el tejido del implante de una colonia de donantes
que sea altamente consanguínea.
En el siguiente protocolo para preparar un mono
cynomolgus para la recepción de un riñón de un donante que es un
cerdo miniatura, el punto cero en el tiempo está definido como el
momento en el que las cánulas arterial y venosa del receptor son
conectadas al hígado que debe ser sometido a perfusión.
El día -1 es inyectada al interior del receptor
una preparación comercial (Upjohn) de globulina
anti-timocitos anti-humana (ATG). La
ATG elimina las células T maduras y las células killer naturales
que de otro modo ocasionarían el rechazo de las células de médula
ósea que son usadas para inducir tolerancia. El receptor es
anestesiado, es insertado en el receptor un catéter intravenoso, y
son retirados antes de la infusión 6 ml de sangre total
heparinizada. La preparación de ATG es entonces inyectada (50 mg/kg)
por vía intravenosa. A los 30 minutos, a las 24 horas y a las 48
horas son retiradas para ensayo muestras de seis ml de sangre total
heparinizada. Las muestras de sangre son analizadas para determinar
el efecto del tratamiento con anticuerpos en la actividad de las
células killer naturales (siendo los blancos K562) y mediante
análisis con selector de células activadas por fluorescencia (FACS)
para las subpoblaciones de linfocitos, incluyendo los CD4, CD8,
CD3, CD11b y CD16. Los datos preliminares de ambos análisis indican
que las de ambos grupos de células son eliminadas mediante la
administración de ATG. Si no son eliminadas las células T maduras y
las células killer naturales, puede ser readministrada ATG con
posterioridad en el procedimiento, tanto antes como después del
trasplante del órgano.
La irradiación subletal que es administrada en
muchos métodos de la técnica es omitida a base de incrementar el
número de células troncales administradas y a base de administrar 7
Gy (700 rad) de irradiación tímica. La irradiación tímica es
administrada el día 0.
Los anticuerpos naturales son una causa primaria
del rechazo de órganos. Para retirar de la circulación del receptor
los anticuerpos naturales antes del trasplante, el día 0 es llevada
a cabo una absorción operatoria de anticuerpos naturales (nAB)
usando un hígado de cerdo miniatura como se indica a continuación.
A los -90 minutos el donante porcino es anestesiado, y el hígado es
preparado para su remoción mediante procedimientos operatorios
estándar. A los -60 minutos es anestesiado el mono receptor. Es
insertado un catéter intravenoso periférico, y es retirada una
muestra de 6 ml de sangre total. Mediante incisión en la línea
media, son aisladas la aorta abdominal y la vena cava. Son
insertadas en los vasos sanguíneos cánulas de Silastic que contienen
accesos laterales para el muestreo de sangre.
A los -30 minutos, el hígado es sometido a
perfusión in situ hasta volverse pálido, y es entonces
retirado del donante porcino y es puesto en Lactato de Ringer frío.
Al hígado se le mantiene frío hasta justo antes de la reperfusión
en el mono. Es tomada una biopsia del hígado. A los -10 minutos el
hígado es sometido a perfusión con solución de albúmina caliente
hasta estar caliente el hígado (a 37 grados).
En el punto 0 en el tiempo, las cánulas arterial
y venosa del receptor son conectadas a la vena porta y a la vena
cava del hígado del donante, y es iniciada la perfusión. Son
tomadas biopsias del hígado a los 30 minutos y a los 60 minutos,
respectivamente. A los 30 minutos y a los 60 minutos
respectivamente son también retiradas muestras de sangre del
receptor para suero. A los 60 minutos el hígado es desconectado de
las cánulas y son reparados los grandes vasos sanguíneos del
receptor. Habiendo desempeñado su función de absorber los
anticuerpos naturales dañinos del mono receptor, el hígado es
desechado. A las 2, a las 24 y a las 48 horas son retiradas del
receptor adicionales muestras de sangre para suero. Cuando este
procedimiento fue llevado a cabo en dos perfusiones secuenciales de
hígados de cerdo, el segundo hígado no presentaba evidencia de
ligeros cambios isquémicos durante la perfusión.
Para suscitar la supervivencia a largo plazo del
órgano implantado mediante tolerancia mediada por células T y
células B, son administradas al receptor células de médula ósea del
donante para formar médula ósea quimérica. La presencia de antígenos
del donante en la médula ósea permite que las células B de nuevo
desarrollo y las células T que son objeto de nueva sensibilización
reconozcan los antígenos del donante como propios, e induce con ello
tolerancia para el órgano implantado del donante. Para estabilizar
las células de médula ósea del donante, es trasplantado bajo la
cápsula del riñón del receptor tejido estromal del donante en forma
de rebanadas de tejido de timo, hígado y/o bazo fetal. El tejido
estromal es preferiblemente implantado simultáneamente a o antes de
la administración de células troncales hematopoyéticas, como p. ej.
células de médula ósea o una suspensión de células de hígado fetal.
Son administradas células troncales suficientes para eliminar la
necesidad de irradiación preparativa o creadora de espacio
hematopoyético.
Para efectuar el seguimiento del quimerismo,
puede utilizarse citometría de flujo de dos colores. Este análisis
hace uso de anticuerpos monoclonales para distinguir entre los
antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de la clase I y
los antígenos comunes leucocíticos del donante frente a los
antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de la clase I
del receptor. Las células de médula ósea pueden ser a su vez
inyectadas ya sea simultáneamente al trasplante del órgano o bien
antes del mismo. La médula ósea es recolectada e inyectada por vía
intravenosa como se ha descrito anteriormente (Pennington et al.,
1988, Transplantation 45:21-26). Si se
comprobase que los anticuerpos naturales reaparecen antes de ser
inducida la tolerancia, y si estos anticuerpos ocasionasen daños al
injerto, el protocolo puede ser modificado para permitir que a
continuación del trasplante de médula ósea transcurra un tiempo
suficiente para que sea establecida tolerancia humoral antes del
trasplante del órgano.
Las soluciones anteriormente descritas están
diseñadas para prevenir sinérgicamente el problema del rechazo de
trasplantes.
Los medicamentos de la invención están destinados
a ser usados en métodos que pueden ser empleados en combinación,
como se ha descrito, o en parte.
El método de introducir células de médula ósea
puede ser alterado en particular a base de (1) incrementar el
intervalo de tiempo entre la inyección de las células troncales
hematopoyéticas y la implantación del injerto; (2) incrementar la
cantidad de células troncales hematopoyéticas inyectadas; (3)
variar el número de inyecciones de células troncales
hematopoyéticas; (4) variar el método de suministro de células
troncales hematopoyéticas; (5) variar la fuente tisular de células
troncales hematopoyéticas, pudiendo ser p. ej. usada una suspensión
de células de hígado fetal; o (6) variar la fuente donante de
células troncales hematopoyéticas. A pesar de que son preferibles
las células troncales hematopoyéticas sacadas del donante del
injerto, las células troncales hematopoyéticas pueden ser obtenidas
de otros individuos o de otras especies, o de cepas donantes
consanguíneas manipuladas genéticamente, o de cultivo celular in
vitro.
Pueden ser variados los métodos para preparar al
receptor para el trasplante de células troncales hematopoyéticas.
Por ejemplo, el receptor puede ser sometido a una esplenectomía.
Ésta última sería preferiblemente administrada antes del régimen no
mieloablativo, y p. ej. el día -14.
La hemoperfusión de anticuerpos naturales puede:
(1) hacer uso de otros órganos vasculares, como p. ej. el hígado,
el riñón o los intestinos; (2) hacer uso de múltiples órganos
secuenciales o matrices de afinidad; (3) variar la cantidad de
tiempo durante el cual es sometido a perfusión cada órgano o cada
matriz de afinidad; (4) variar el donante del órgano que es
sometido a perfusión. Los anticuerpos introducidos antes del
trasplante de células hematopoyéticas pueden ser variados a base
de: (1) usar anticuerpos monoclonales para subconjuntos de células T
o células killer naturales (p. ej.,
anti-NKH1_{A}, como se describe en la Patente
Estadounidense Nº 4.772.552 concedida a Hercend et al.); (2)
preparar ATG anti-humana en otros huéspedes
mamíferos (como p. ej. un mono, un cerdo, un conejo o un perro); o
(3) usar ATG anti-mono preparada en cualquiera de
los huéspedes anteriormente mencionados.
Los medicamentos de la invención están destinados
a ser usados en métodos que pueden ser empleados con otros
receptores mamíferos (como p. ej. monos rhesus) y pueden usar otros
donantes mamíferos (como p. ej. primates, ovejas o perros).
Como alternativa o adicionalmente a la
hemoperfusión, los anticuerpos del huésped pueden ser agotados
mediante la administración de un exceso de células
hematopoyéticas.
El tejido estromal introducido antes del
trasplante de células hematopoyéticas, y p. ej. antes del
trasplante de médula ósea, puede ser variado a base de: (1)
administrar el tejido de timo e hígado fetal en forma de suspensión
celular en fluido; (2) administrar tejido estromal de hígado o
tejido fetal, pero no ambos; (3) poner el implante estromal en otros
sitios encapsulados bien vascularizados; o (4) usar timo adulto o
bazo fetal como fuente de tejido estromal.
Los medicamentos aquí descritos para inducir
tolerancia a o suscitar la aceptación de un antígeno alogénico o un
injerto alogénico pueden ser usados allí donde, como entre el
donante y el receptor, haya cualquier grado de discordancia en los
loci del complejo mayor de histocompatibilidad o en otros loci que
influencien el rechazo de injertos. Preferiblemente, hay una
discordancia en al menos un locus del complejo mayor de
histocompatibilidad o al menos en otro locus que medie en el
reconocimiento y el rechazo, como p. ej. un locus de un antígeno
menor. Con respecto a los loci del complejo mayor de
histocompatibilidad de la clase I y de la clase II, el donante y el
receptor pueden ser: concordantes en la clase I y no concordantes
en la clase II; no concordantes en la clase I y concordantes en la
clase II; no concordantes en la clase I y no concordantes en la
clase II; concordantes en la clase I y concordantes en la clase II.
En cualquiera de estas combinaciones pueden ser concordantes o no
concordantes otros loci que controlen el reconocimiento y el
rechazo, como p. ej. loci de antígenos menores. Como se ha indicado
anteriormente, es preferible que haya al menos discordancia en al
menos un locus. No concordantes en la clase I del complejo mayor de
histocompatibilidad significa no concordantes para uno o varios
loci de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad, y p.
ej. en el caso de los humanos, no concordantes en uno o varios de
los HLA-A, HLA-B o
HLA-C, o en el caso de los cerdos, no concordantes
en uno o varios de los loci de los SLA de la clase I, como son p.
ej. los loci A o B porcinos. No concordantes en la clase II del
complejo mayor de histocompatibilidad significa no concordantes en
uno o varios loci del complejo mayor de histocompatibilidad de la
clase II, y p. ej. en el caso de los humanos, no concordantes en uno
o varios de los miembros del grupo que consta de un DP \alpha, un
DP\beta, un DQ \alpha, un DQ \beta, un DR \alpha o un DR
\beta, o en el caso de los cerdos, no concordantes en uno o varios
de los loci de los SLA de la clase II, y p. ej. no concordantes en
DQ \alpha o \beta, o en DR \alpha o \beta.
Los medicamentos que están destinados a ser
usados en los métodos que aquí se describen para inducir tolerancia
a un antígeno alogénico o a un injerto alogénico pueden ser usados
allí donde, como entre el donante y el receptor, haya cualquier
grado de reactividad en un análisis de los linfocitos mixtos, y p.
ej. allí donde haya ninguna, baja, intermedia o alta reactividad de
los linfocitos mixtos entre el donante y el receptor. En
realizaciones preferidas, la reactividad de los linfocitos mixtos
es usada para definir la discordancia para la clase II, y la
invención incluye medicamentos destinados a ser usados en métodos
para llevar a cabo injertos alogénicos entre individuos con
cualquier grado de discordancia en la clase II según defina un
análisis de los linfocitos mixtos. Pueden ser usados ensayos
serológicos para determinar la discordancia en loci de la clase I o
II, y la invención incluye medicamentos destinados a ser usados en
métodos para llevar a cabo injertos alogénicos entre individuos con
cualquier grado de discordancia en la clase I y/o II según medición
efectuada mediante métodos serológicos. En una realización
preferida, la invención incluye medicamentos destinados a ser usados
en métodos para llevar a cabo injertos alogénicos entre individuos
que, según determinación efectuada mediante análisis serológico y/o
de la reactividad de los linfocitos mixtos, sean no coincidentes
tanto en la clase I como en la clase II.
Los medicamentos de la invención son
particularmente útiles para sustituir un tejido u órgano afectado
por un trastorno neoplásico, y particularmente por un trastorno que
sea resistente a los modos normales de terapia, y p. ej. a la
quimioterapia o a la radioterapia. Los medicamentos de la invención
pueden ser usados para inducir tolerancia a un injerto, y p. ej. a
un aloinjerto, como p. ej. un aloinjerto de un donante que sea no
concordante en uno o varios loci de la clase I, en uno o varios
loci de la clase II, o en uno o varios loci tanto de la clase I como
de la clase II. En realizaciones preferidas: el injerto incluye
tejido del tracto digestivo o tubo digestivo, como p. ej. tejido
del estómago o tejido del intestino, y p. ej. del intestino delgado,
del intestino grueso o del colon; el injerto sustituye una parte
del sistema digestivo del receptor, y p. ej. la totalidad o una
parte del tracto digestivo o tubo digestivo, como p. ej. el
estómago, el intestino, como p. ej. el intestino delgado, el
intestino grueso o el colon.
Los medicamentos de la invención eliminan la
necesidad de irradiación preparativa de todo el cuerpo. Sin
embargo, cuando es administrada irradiación, es posible inducir
quimerismo mixto con menor toxicidad de la radiación a base de
fraccionar la dosis de radiación, es decir a base de administrar la
radiación en dos o más exposiciones o sesiones. En consecuencia, en
todo método de la invención que requiera la irradiación de un
receptor, y p. ej. de un receptor primate, como p. ej. un receptor
humano, de un xenoinjerto o aloinjerto, la radiación puede ser
administrada en una sola exposición, o bien más preferiblemente
puede ser fraccionada en dos o más exposiciones o sesiones. La suma
de las dosificaciones fraccionadas es preferiblemente igual, p. ej.
en rad o Gy, a la dosificación de radiación que puede redundar en
quimerismo mixto al ser administrada en una sola exposición. Las
fracciones son con preferencia de dosificación aproximadamente
igual. Puede también usarse en los métodos de la invención el
hiperfraccionamiento de la dosis de radiación. Las fracciones
pueden ser administradas el mismo día, o bien pueden quedar
separadas por intervalos de uno, dos, tres, cuatro, cinco o más
días.
La irradiación tímica puede ser fraccionada. Por
ejemplo, una sola dosis de 7 Gy (700 rad) puede ser sustituida por
dos fracciones de 3,5 Gy (350 rad) o por siete fracciones de 1 Gy
(100 rad), p. ej.
Los medicamentos de la invención pueden ser
usados en métodos que pueden incluir la esplenectomía del
receptor.
Como se expone en la presente, para agotar los
anticuerpos naturales del huésped puede ser usada hemoperfusión, y
p. ej. hemoperfusión con un órgano del donante. Pueden ser usados
con cualesquiera de los métodos que aquí se describen otros métodos
para agotar o de otro modo inactivar los anticuerpos naturales. Por
ejemplo, pueden ser administrados al receptor de un aloinjerto o de
un xenoinjerto drogas que agoten o inactiven los anticuerpos
naturales, como es p. ej. la desoxispergualina (DSG) (Bristol), o
anticuerpos anti-IgM. En los métodos indicados para
los medicamentos de la invención pueden usarse para agotar o de otro
modo inactivar los anticuerpos naturales del receptor uno o varios
de los métodos consistentes en la administración de DSG (o de
drogas similares), la administración de anticuerpos
anti-IgM y la hemoperfusión. Se ha comprobado que
la DSG a una concentración de 6 mg/kg/día por vía intravenosa es
útil para suprimir la función de los anticuerpos naturales en los
trasplantes de riñón de cerdo a mono cynomolgus.
En cualquiera de los métodos aquí descritos, y en
particular en los métodos clínicos o aplicados a los primates, es
preferible formar quimerismo mixto en oposición al método de
sustituir enteramente las células troncales del receptor por células
del donante.
Están también incluidos en realizaciones de la
invención métodos alternativos para la inactivación de las células
T tímicas. Algunos de los métodos aquí descritos incluyen la
administración de irradiación tímica para inactivar las células T
tímicas del huésped o para de otro modo disminuir las respuestas
mediadas por las células T tímicas del huésped a los antígenos del
donante. Se ha descubierto que la irradiación tímica que es
pertinente en los métodos alogénicos o xenogeneicos de la invención
puede ser suplementada con o sustituida por otros tratamientos que
disminuyan la respuesta mediada por las células T tímicas del
huésped (p. ej. a base de agotar las células T tímicas y/o de
modular hacia abajo uno o varios de los miembros del grupo que
consta de los receptores de las células T (TCR), los correceptores
de CD4 o los correceptores de CD8). Por ejemplo, la irradiación
tímica puede ser suplementada con o sustituida por anticuerpos
contra las células T (como p. ej. anticuerpos monoclonales
anti-CD4 y/o anti-CD8)
administrados un número de veces suficiente, en una dosificación
suficiente y por espacio de un período de tiempo suficiente para
disminuir la respuesta mediada por las células T tímicas del
huésped.
Para obtener los mejores resultados, los
anticuerpos contra las células T deberán ser administrados
repetidamente. P. ej., los anticuerpos contra las células T pueden
ser administrados una, dos, tres o más veces antes del trasplante de
médula ósea del donante. Típicamente, será administrada al paciente
aproximadamente 5 días antes del trasplante de médula ósea una
dosis de anticuerpos previa al trasplante de médula ósea.
Adicionalmente pueden ser también administradas dosis anteriores 6,
7 u 8 días antes del trasplante de médula ósea. Puede ser deseable
administrar un primer tratamiento para repetir entonces las
administraciones anteriores al trasplante de médula ósea cada
1-5 días hasta que el paciente presente un exceso de
anticuerpos en el suero y aproximadamente un agotamiento del 99% de
las células T periféricas, y para efectuar entonces el trasplante
de médula ósea. Los anticuerpos contra las células T pueden ser
también administrados una, dos, tres o más veces después del
trasplante de médula ósea del donante. Típicamente, a los
aproximadamente 2-14 días del trasplante de médula
ósea será administrado un tratamiento posterior al trasplante de
médula ósea. La administración posterior al trasplante de médula
ósea puede ser repetida tantas veces como sea necesario. Si se da
más de una administración, las administraciones pueden estar
distanciadas aproximadamente 1 semana. Pueden ser administradas
dosis adicionales si el paciente parece experimentar una
recuperación temprana o no deseada de las células T.
Preferiblemente, los anticuerpos contra las células T son
administrados al menos una vez (y preferiblemente dos, tres o más
veces) antes del trasplante de médula ósea y al menos una vez (y
preferiblemente dos, tres o más veces) después del trasplante de
médula ósea.
Algunos de los métodos aquí descritos incluyen la
administración de células troncales hematopoyéticas a un receptor.
En muchos de esos métodos, las células troncales hematopoyéticas
son administradas antes de o al ser efectuada la implantación de un
injerto (un aloinjerto o un xenoinjerto), siendo la finalidad
primaria de la administración de células troncales hematopoyéticas
la inducción de tolerancia al injerto. Los inventores han
descubierto que para crear y/o mantener la tolerancia pueden ser
deseables una o varias subsiguientes administraciones (como p. ej.
una segunda, una tercera, una cuarta o una quinta administración o
más administraciones subsiguientes) de células troncales
hematopoyéticas. Por consiguiente, la invención incluye también
métodos en los cuales son administradas células troncales
hematopoyéticas a un receptor, y p. ej. a un primate, como p. ej.
un humano, al cual le han sido previamente administradas células
troncales hematopoyéticas como parte de cualquiera de los métodos a
los que aquí se alude.
Sin pretender que ésta constituya la única teoría
válida, el inventor cree que la repetida administración de células
troncales puede suscitar quimerismo y posiblemente tolerancia
delecional a largo plazo en los receptores de injertos. En
consecuencia, todo método al que aquí se aluda y que incluya la
administración de células troncales hematopoyéticas puede incluir
adicionalmente múltiples administraciones de células troncales. En
realizaciones preferidas: son efectuadas antes de la implantación
de un injerto una primera y una segunda administración de células
troncales; es efectuada antes de la implantación de un injerto una
primera administración de células troncales y es efectuada al ser
implantado el injerto una segunda administración de células
troncales. En otras realizaciones preferidas: es efectuada antes de
la implantación de un injerto o al ser llevada a cabo la
implantación de un injerto una primera administración de células
troncales y a continuación de la implantación de un injerto es
efectuada una segunda administración de células troncales. El
período entre las administraciones de células troncales
hematopoyéticas puede ser variado. En realizaciones preferidas, una
subsiguiente administración de células troncales hematopoyéticas es
efectuada: al menos dos días, una semana, un mes o seis meses
después de la previa administración de células troncales; al menos
dos días, una semana, un mes o seis meses después de la
implantación del injerto.
El método puede incluir adicionalmente el paso de
administrar una segunda o subsiguiente dosis de células troncales
hematopoyéticas: cuando el receptor empiece a presentar signos de
rechazo, p. ej. según sea evidenciado por una disminución de la
función del órgano injertado, por una variación de la respuesta de
los anticuerpos específicos del donante en el huésped, o por una
variación de la respuesta de los linfocitos del huésped al antígeno
del donante; cuando disminuya el nivel de quimerismo; cuando el
nivel de quimerismo haya descendido hasta llegar a ser inferior a
un valor predeterminado; cuando el nivel de quimerismo llegue a un
nivel o haya descendido hasta ser inferior a un nivel en el cual la
coloración con un anticuerpo monoclonal específico de un antígeno
de las células mononucleares de la sangre periférica del donante sea
igual o inferior a la coloración con un control isotípico que no se
fije a las células mononucleares de la sangre periférica, como p.
ej. cuando el monoclonal específico del donante coloree menos de un
1-2% de las células; o bien en general según sea
necesario para mantener la tolerancia o para de otro modo prolongar
la aceptación de un injerto. Por consiguiente, los medicamentos de
la invención están destinados a ser usados en métodos que pueden
ser modificados para incluir un paso adicional de determinar si un
sujeto que ha recibido una o varias administraciones de células
troncales hematopoyéticas necesita una subsiguiente administración
de células troncales hematopoyéticas, y en caso afirmativo, de
administrar al receptor una subsiguiente dosis de células troncales
hematopoyéticas.
Cualesquiera de los métodos a los que aquí se
alude pueden incluir la administración de agentes, como p. ej.
15-desoxispergualina, micofenolato mofetil,
brequinar sódico o agentes similares, que inhiban la producción,
los niveles o la actividad de anticuerpos en el receptor. Uno o
varios de estos agentes pueden ser administrados: antes de la
implantación del tejido del donante, como p. ej. uno, dos o tres
días o una, dos o tres semanas antes de la implantación del tejido
del donante; al ser efectuada la implantación del tejido del
donante; o después de la implantación del tejido del donante, como
p. ej. uno, dos o tres días o una, dos o tres semanas después de la
implantación de un injerto.
La administración del agente puede ser iniciada:
cuando el receptor empiece a presentar signos de rechazo, p. ej.
según sea evidenciado por una disminución de la función del órgano
injertado, por una variación de la respuesta de los anticuerpos
específicos del donante en el huésped, o por una variación de la
respuesta de los linfocitos del huésped al antígeno del donante;
cuando disminuya el nivel de quimerismo; cuando el nivel de
quimerismo haya descendido hasta haber llegado a ser inferior a un
valor predeterminado; cuando el nivel de quimerismo llegue a un
nivel o haya descendido hasta haber llegado a ser inferior a un
nivel en el que la coloración con un anticuerpo monoclonal
específico de un antígeno de las células monoclonales de la sangre
periférica del donante sea igual o haya descendido hasta haber
llegado a ser inferior a la coloración con un control isotípico que
no se fije a las células mononucleares de la sangre periférica,
como p. ej. cuando el monoclonal específico del donante coloree
menos de un 1-2% de las células; o bien en general
según sea necesario para mantener la tolerancia o de otro modo
prolongar la aceptación de un injerto.
El período de tiempo a lo largo del cual es
administrado el agente (o el período de tiempo a lo largo del cual
son mantenidos en el sujeto los niveles clínicamente eficaces)
puede ser un período largo, de p. ej. seis meses o más o de un año o
más, o un período corto, p. ej. de menos de un año, más
preferiblemente de seis meses o menos, más preferiblemente de un mes
o menos, y más preferiblemente de dos semanas o menos. El período
de tiempo será en general al menos de aproximadamente una semana, y
tendrá preferiblemente una duración de al menos aproximadamente dos
semanas. En realizaciones preferidas, el período de tiempo tiene una
duración de dos o tres semanas.
Las realizaciones preferidas incluyen la
administración de 15-desoxispergualina (6
mg/kg/día) por espacio de aproximadamente dos semanas comenzando el
día de la implantación del injerto.
Algunos de los métodos a los que aquí se alude
incluyen la administración de células troncales hematopoyéticas a
un receptor. Los inventores han descubierto que la administración
de una o varias citoquinas, y preferiblemente de una citoquina de la
especie de la cual sean sacadas las células troncales, puede
suscitar el injerto, el quimerismo mixto y la tolerancia, o puede
de otro modo prolongar la aceptación de un injerto. El uso de tales
citoquinas puede eliminar la necesidad de irradiación de todo el
cuerpo. Por consiguiente, la invención incluye también medicamentos
que están destinados a ser usados en métodos en los cuales le son
administradas al receptor una o varias citoquinas, y p. ej. una
citoquina de la especie del donante.
Sin pretender que ésta constituya la única teoría
válida, los inventores creen que las citoquinas, y en particular
las citoquinas de la especie del donante, fomentan el injerto y/o
la función de las células troncales del donante o de las células de
su progenie. En consecuencia, todo método al que aquí se alude y
que incluya la administración de células troncales hematopoyéticas
puede incluir adicionalmente la administración de una citoquina,
como p. ej. SCF, IL-3 o GM-CSF. En
realizaciones preferidas, la citoquina es una citoquina que en su
interacción con las células objetivo es específica de la
especie.
La administración de una citoquina puede comenzar
antes o después de la implantación de un injerto o de la
implantación de células troncales o al ser efectuada la
implantación de un injerto o la implantación de células
troncales.
El método puede incluir adicionalmente el paso de
administrar al receptor una primera o una subsiguiente dosis de una
citoquina: cuando el receptor empiece a presentar signos de
rechazo, p. ej. según sea evidenciado por una disminución de la
función del órgano injertado, por una variación de la respuesta de
los anticuerpos específicos del donante en el huésped, o por una
variación de la respuesta de los timocitos del huésped al antígeno
del donante; cuando disminuya el nivel de quimerismo; cuando el
nivel de quimerismo haya descendido hasta haber llegado a ser
inferior a un valor predeterminado; cuando el nivel de quimerismo
haya llegado a un nivel o haya descendido hasta haber llegado a ser
inferior a un nivel en el que la coloración con un anticuerpo
monoclonal específico de un antígeno de las células mononucleares de
la sangre periférica del donante sea igual o inferior a la
coloración con un control isotípico que no se fije a las células
mononucleares de la sangre periférica, p. ej. cuando el monoclonal
específico del donante coloree menos de un 1-2% de
las células; o bien en general según sea necesario para mantener la
tolerancia o para de otro modo prolongar la aceptación de un
injerto. Por consiguiente, los medicamentos de la invención son
para métodos que pueden ser modificados para incluir un paso
adicional de determinar si un sujeto necesita terapia con
citoquina, y en caso afirmativo, de administrar una citoquina.
El período del tiempo a lo largo del cual es
(son) administrada(s) la(s) citoquina(s) (o el
período de tiempo a lo largo del cual son mantenidos en el sujeto
los niveles clínicamente eficaces) puede ser un período largo, de
p. ej. seis meses o más o de un año o más, o un período corto, p.
ej. de un año o menos, más preferiblemente de seis meses o menos,
más preferiblemente de un mes o menos, y más preferiblemente de dos
semanas o menos. El período de tiempo tendrá en general una
duración de al menos aproximadamente una semana y con preferencia de
al menos aproximadamente dos semanas.
En realizaciones preferidas, el receptor es un
primate, como p. ej. un humano, y el donante es de una especie
distinta, y p. ej. el donante es un cerdo, y: es administrado SFC
(SFC = factor de células troncales) de cerdo; es administrada
IL-3 de cerdo; es administrada una combinación de
SFC de cerdo e IL-3 de cerdo; es administrado un
factor promotor de la hematopoyesis específico de cerdo, como p.
ej. GM-SFC de cerdo, p. ej., después de la
implantación de las células troncales, y p. ej. aproximadamente un
mes después de la implantación de células troncales.
En cualquier método de aquéllos a los que aquí se
alude puede usarse además o en lugar de cualesquiera anticuerpos
contra las células T (como p. ej. ATG) un anticuerpo
anti-CD2, y preferiblemente un anticuerpo
monoclonal, como p. ej. BTI-322, o un anticuerpo
monoclonal dirigido a un epítope similar o a un epítope parcialmente
coincidente.
Otras realizaciones se sitúan dentro del ámbito
de las reivindicaciones siguientes.
Claims (14)
1. Uso de células troncales hematopoyéticas en la
preparación de un medicamento destinado a ser usado en un método
para suscitar tolerancia en un mamífero receptor de una primera
especie a un injerto obtenido de un mamífero donante de una segunda
especie; comprendiendo el método los pasos de:
introducir en dicho mamífero receptor células
troncales hematopoyéticas de dicha segunda especie;
crear espacio tímico en dicho receptor en
ausencia de irradiación de todo el cuerpo; e
introducir dicho injerto en dicho receptor;
siendo el número de células troncales del donante
administradas suficiente como para que pueda ser formado quimerismo
mixto sin irradiación creadora de espacio hematopoyético; y
no siendo dichas células troncales
hematopoyéticas obtenidas de un embrión humano.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que en el
método dicho injerto es de un cerdo.
3. El uso de la reivindicación 2, en el que en el
método dicho cerdo es un cerdo miniatura.
4. Uso de células troncales hematopoyéticas en la
preparación de un medicamento destinado a ser usado en un método
para inducir tolerancia en un mamífero receptor a un injerto
obtenido de un mamífero donante de la misma especie; comprendiendo
el método los pasos de:
introducir en dicho mamífero receptor células
troncales hematopoyéticas de dicho donante;
crear espacio tímico en dicho receptor en
ausencia de irradiación de todo el cuerpo; e
implantar dicho injerto en dicho receptor;
siendo el número de células troncales del donante
administradas suficiente como para que pueda ser formado quimerismo
mixto sin irradiación creadora de espacio hematopoyético; y
no siendo dichas células troncales
hematopoyéticas obtenidas de un embrión humano.
5. El uso de cualquier reivindicación precedente,
en el que en el método dicho receptor es un humano.
6. El uso de cualquier reivindicación precedente,
en el que en el método dicho espacio tímico es creado por uno o
varios de los procedimientos siguientes: administrar al receptor
irradiación tímica, esteroides, corticosteroides, brequinar o una
sustancia química o droga inmunosupresora.
7. El uso de la reivindicación 6, en el que en el
método dicho espacio tímico es creado a base de administrar
irradiación tímica a dicho receptor.
8. El uso de la reivindicación 6, en el que en el
método dicho espacio tímico es creado a base de administrar a dicho
receptor una sustancia química o droga inmunosupresora.
9. El uso de la reivindicación 6, en el que en el
método dicho espacio tímico es creado a base de administrar a dicho
receptor un corto programa de tratamiento con ciclosporina.
10. El uso de cualquier reivindicación
precedente, en el que en el método le son efectuadas a dicho
receptor múltiples administraciones de células troncales
hematopoyéticas.
11. El uso de cualquier reivindicación
precedente, que comprende además en el método el paso de inactivar
las células T de dicho mamífero receptor reactivas al donante.
12. El uso de cualquier reivindicación
precedente, que comprende además en el método el paso de activar
las células killer naturales de dicho mamífero receptor reactivas
al donante.
\newpage
13. El uso de cualquier reivindicación
precedente, en el que en el método dicho injerto comprende un
riñón.
14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 12, en el que en el método dicho injerto comprende un
hígado.
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|---|---|---|---|---|
| US5871728A (en) | 1995-03-31 | 1999-02-16 | University Of Pittsburgh | Method of regulating dendritic cell maturation |
| CA2253597A1 (en) * | 1996-05-09 | 1997-11-13 | The General Hospital Corporation | Mixed chimerism and tolerance |
| JP2001523645A (ja) | 1997-11-14 | 2001-11-27 | ザ・ゼネラル・ホスピタル・コーポレイション | 血液学的疾患の処置 |
| JP2002502823A (ja) | 1998-02-04 | 2002-01-29 | ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション | 移植における補刺激遮断および混合キメラ現象 |
| ATE316795T1 (de) * | 1998-03-18 | 2006-02-15 | Osiris Therapeutics Inc | Mesenchymale stammzellen für die prävention und behandlung von immunantworten bei transplantationen |
| WO2000011147A1 (en) * | 1998-08-20 | 2000-03-02 | The General Hospital Corporation | Inbred mhc-homozygous miniature swine and uses thereof |
| AU2980900A (en) | 1999-02-04 | 2000-08-25 | General Hospital Corporation, The | Methods for human allografting |
| WO2000054786A1 (en) * | 1999-03-15 | 2000-09-21 | Modex Therapeutiques, S.A. | Methods and compositions for tolerizing hosts for long term survival of tissue transplants |
| US6750023B2 (en) * | 1999-09-02 | 2004-06-15 | Corning Incorporated | Porous inorganic substrate for high-density arrays |
| AU778929B2 (en) * | 1999-12-06 | 2004-12-23 | General Hospital Corporation, The | Pancreatic stem cells and their use in transplantation |
| CA2397931A1 (en) * | 2000-01-19 | 2001-07-26 | Biotransplant, Inc. | Swine defective for transmission of porcine endogenous retrovirus and uses thereof |
| AU3929402A (en) * | 2000-11-22 | 2002-06-11 | Geron Corp | Tolerizing allografts of pluripotent stem cells |
| US20030044398A1 (en) * | 2001-03-20 | 2003-03-06 | Robl James M. | Methods for producing antibodies in mammals |
| WO2002074938A1 (en) * | 2001-03-20 | 2002-09-26 | Trustees Of Amherst College | Methods for producing antibodies in mammals |
| US20020152490A1 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-17 | Philip Lake | Tolerance-inducing thy-marrow composite tissue construct and organ |
| US20030031652A1 (en) * | 2001-04-16 | 2003-02-13 | Bernhard Hering | Systems and methods for inducing mixed chimerism |
| US20030032631A1 (en) * | 2001-08-13 | 2003-02-13 | Mcdonald George B. | Method of treatment of cancer by controlling graft-versus-leukemia using topical active corticosteriods |
| US20050058641A1 (en) * | 2002-05-22 | 2005-03-17 | Siemionow Maria Z. | Tolerance induction and maintenance in hematopoietic stem cell allografts |
| AU2003228768B2 (en) * | 2002-05-22 | 2009-02-05 | The Cleveland Clinic Foundation | Induction and maintenance of tolerance to composite tissue allografts |
| US20050112122A1 (en) * | 2003-09-02 | 2005-05-26 | Greiner Dale L. | Generation of hematopoietic chimerism and induction of central tolerance |
| US20050266001A1 (en) * | 2004-04-02 | 2005-12-01 | Hadley Gregg A | Therapeutic blockade of CD103 interactions to prevent clinical renal allograft rejection |
| US20060147429A1 (en) * | 2004-12-30 | 2006-07-06 | Paul Diamond | Facilitated cellular reconstitution of organs and tissues |
| US20060148080A1 (en) * | 2004-12-30 | 2006-07-06 | Paul Diamond | Methods for supporting and producing human cells and tissues in non-human mammal hosts |
| WO2007033221A2 (en) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for inhibition of immune responses |
| EP2063905B1 (en) | 2006-09-18 | 2014-07-30 | Raptor Pharmaceutical Inc | Treatment of liver disorders by administration of receptor-associated protein (rap)-conjugates |
| WO2008137115A1 (en) | 2007-05-03 | 2008-11-13 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Multipotent stem cells and uses thereof |
| US8574567B2 (en) * | 2007-05-03 | 2013-11-05 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Multipotent stem cells and uses thereof |
| US20120077778A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-03-29 | Andrea Bourdelais | Ladder-Frame Polyether Conjugates |
| WO2013163176A1 (en) | 2012-04-23 | 2013-10-31 | Allertein Therapeutics, Llc | Nanoparticles for treatment of allergy |
| CN105188755A (zh) | 2013-02-26 | 2015-12-23 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 实现移植物移植耐受的联合器官和造血细胞 |
| AU2014248090B2 (en) | 2013-04-03 | 2018-08-02 | N-Fold Llc | Novel nanoparticle compositions |
| GB201413240D0 (en) * | 2014-07-25 | 2014-09-10 | Hansa Medical Ab | Method |
| WO2019178106A1 (en) | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Medeor Therapeutics, Inc. | Methods for treating non-cancerous disorders using hematopoietic cells |
| US10842821B2 (en) | 2018-04-05 | 2020-11-24 | Medeor Therapeutics, Inc. | Cellular compositions derived from prior organ donors and methods of manufacture and use thereof |
| US10881692B2 (en) | 2018-04-05 | 2021-01-05 | Medeor Therapeutics, Inc. | Compositions for establishing mixed chimerism and methods of manufacture thereof |
| US11813376B2 (en) | 2018-09-18 | 2023-11-14 | Medeor Therapeutics, Inc. | Cellular compositions derived from deceased donors to promote graft tolerance and manufacture and uses thereof |
| US11435350B2 (en) | 2018-09-18 | 2022-09-06 | Medeor Therapeutics, Inc. | Methods of analysis of blood from deceased donors |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0621786B1 (en) * | 1992-01-08 | 2002-04-03 | The General Hospital Corporation | Induced tolerance to xenografts |
| US5876708A (en) * | 1992-02-19 | 1999-03-02 | The General Hospital Corporation | Allogeneic and xenogeneic transplantation |
| US5658564A (en) * | 1992-02-19 | 1997-08-19 | The General Hospital Corporation | Xenograft thymus |
| US5597563A (en) * | 1992-09-04 | 1997-01-28 | Beschorner; William E. | Method induction of antigen-specific immune tolerance |
| IL107483A0 (en) * | 1993-11-03 | 1994-02-27 | Yeda Res & Dev | Bone marrow transplantation |
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| McCallion et al. | Strategies to induce tolerance | |
| Trentin | Bone Marrow PART V Transplantation Immunology | |
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