ES2201101T3 - Uso de inhibidores de sulfatasas de esteroides. - Google Patents

Uso de inhibidores de sulfatasas de esteroides.

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ES2201101T3
ES2201101T3 ES95913919T ES95913919T ES2201101T3 ES 2201101 T3 ES2201101 T3 ES 2201101T3 ES 95913919 T ES95913919 T ES 95913919T ES 95913919 T ES95913919 T ES 95913919T ES 2201101 T3 ES2201101 T3 ES 2201101T3
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Roland Foulkes
John Spencer Emtage
Mark William Bodmer
Martin Rae Wales
Graham Arthur William Rook
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University College London
UCB Celltech Ltd
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University College London
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Abstract

SE DESCRIBE UN NUEVO USO MEDICO DE INHIBIDORES PARA PREVENIR LOS EFECTOS FISIOLOGICOS NORMALES DE DHEA O ESTEROIDES RELACIONADOS SOBRE LAS RESPUESTAS INMUNE Y/O INFLAMATORIA QUE PERMITE DESCUBRIR UN EFECTO GLUCOCORTICOIDE ENDOGENO.

Description

Uso de inhibidores de sulfatasas de esteroides.
La presente invención trata de un nuevo uso médico de ciertos compuestos. En especial, trata del uso de inhibidores que previenen el efecto fisiológico normal de DHEA o esteroides relacionados sobre las respuestas inmunológica y/o inflamatoria y, más especialmente, trata del uso de inhibidores de una sulfatasa de esteroides sulfatados que revela un efecto glucocorticoide endógeno.
Dehidroepiandrosterona (DHEA) es un esteroide andrógeno suave producido por la corteza adrenal y las gónadas en hombres y por las gónadas en los roedores. En todas las especies está en parte bajo el control hipotálamo-pituitario y es formada a partir de precursores esteroides comunes. Aunque DHEA puede actuar como precursor de esteroides androgénicos fisiológicamente más activos (por ejemplo testosterona), es secretada normalmente como una hormona en sí misma. DHEA es rápidamente sulfatada a DHEA-sulfato (DHEAS) antes de ser liberada a la circulación, y es esta última especie la que constituye la principal forma circulante del esteroide. Fuera del SNC, DHEAS es en sí misma inactiva. Para ejercer sus efectos fisiológicos, debe ser desulfatada por una sulfatasa de esteroides sulfatados en el sitio de acción y entonces es capaz de influir sobre eventos biológicos locales.
Los niveles de DHEAS circulante disminuyen con la edad (a diferencia de otros esteroides) y existe cierta evidencia que sugiere que la administración de DHEA exógena en ratones, puede revertir algunos de los eventos fisiológicos asociados con el fenotipo del envejecimiento (Daynes y col (1993) The Journal of Immunology. Vol 150: 12, 5219-5230). Por ejemplo, la administración de DHEAS puede revertir el incremento de la producción de IL-6 en ratones añosos (Daynes y col (1993) The Journal of Immunology. Vol 150: 12, 5219-5230). Además, DHEA puede regular la sensibilidad de los adipocitos y el músculo esquelético a la insulina (Cleary, (1991) P.S.E.B.M.Vol 196: 8-17). Sin embargo, el papel fisiológico principal puede ser su capacidad para influir sobre las respuestas inmunológicas.
La respuesta inmunológica a antígenos es generalmente mediada por células (destrucción mediada por células-T a través de antígenos procesados) o humoral(producción de anticuerpos a través del reconocimiento del antígeno completo). El patrón de producción de citoquinas por las células T_{H} involucradas en la respuesta inmunológica, puede influir en cuál de estos tipos de respuesta predomina: la inmunidad mediada por células (T_{H1}) se caracteriza por la alta producción de IL-2 e IFNg, y una baja producción de IL-4, mientras que en la inmunidad humoral (T_{H2}) el patrón es baja producción de IL-2 e IFNg y alta producción de IL-4, IL-5, IL-10. Dado que el patrón de secreción es modulado a nivel de los órganos linfáticos secundarios, la manipulación del patrón específico de citoquinas TH puede influir en el tipo y extensión de la respuesta inmunológica generada.
Se ha establecido adecuadamente que la administración de glucocorticoides exógenos a ratones (y otras especies) sensibilizados con albúmina de huevo, induce inmunosupresión, en la que las células esplénicas expresan una capacidad reducida de secretar IL-2 pero pueden aumentar la secreción de IL-4 ante el estímulo antigénico. Por el contrario, la administración de DHEA o DHEAS aumenta notablemente la secreción de IL-2 e IFNg sin afectar la liberación de IL-4. (Daynes y col (1990) Eur. J. Immunol. 20: 793-802). Cuando DHEA y dexametasona se administran conjuntamente, el efecto de la DHEA predomina, lo que es consistente con la acción de la DHEA como anti-glucocorticoide en este y otros sistemas (Daynes y col (1990) Eur. J. Immunol. 20: 793-802, Browne y col (1992) The American Journal of The Medical Sciences 303 No. 6, 366-371, y Blauer y col (1991) Endocrinology 129 No. 6, 3174-3179). Estas diferentes respuestas a glucocorticoides y DHEA son indicativas de patrones de citoquinas tipo T_{H1} y T_{H2} respectivamente, lo que sugiere que pueden influir de diferente manera sobre las respuestas inmunológicas. Se observan efectos similares si células esplénicas de animales sensibilizados son tratadas con anti-CD3 en presencia de DHEA, DHEAS o dexametasona (Daynes y col (1990) J. Exp. Med. 171: 979-996).
La respuesta al estímulo inmunológico de DHEAS biológicamente inactiva, indica que existe conversión a la forma activa DHEA por la sulfatasa de esteroides sulfatados, dentro de los límites del tejido linfoide secundario. La localización de la enzima convertidora (sulfatasa de esteroides sulfatados) está en las células presentadoras de antígeno (CPA) ya que, en preparaciones de células T purificadas tratadas con anticuerpo anti-CD3, la DHEA, pero no la DHEAS, puede aumentar la producción de IL-2. Sin embargo, si se agregan macrófagos al sistema, los dos tipos de esteroides pueden provocar un aumento en la respuesta de IL-2 (Daynes y col (1990) J. Exp. Med. 171: 979-996). Por lo tanto, el patrón de secreción de citoquinas por las células T_{H} puede ser regulado dentro del microambiente linfoide secundario bajo la influencia de esteroides adrenales, con respuestas mediadas por células favorecidas por DHEA. Este sería un efecto contraregulatorio al efecto normal de los glucocorticoides endógenos (que inhiben las respuestas mediadas por células). En efecto, se ha descrito un sitio de unión de alta afinidad para DHEA en células T murinas que es distinto del receptor de glucocorticoide de las células T (Meikle y col (1992) J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 42 No. 3/4, 293-304). Además, muchos de estas observaciones sobre los efectos de los esteroides sobre las respuestas inmunológicas en ratones, han sido demostradas usando células humanas (Susuki y col (1991) Clinical Immunology e Immunopathology 61, 202-211).
Las respuestas dependientes de T_{H1} y T_{H2} muestran cierto grado de compartimentalización anatómica; las áreas linfoides que drenan sitios no mucosos (por ejemplo bazo, ganglios linfáticos periféricos) generan predominantemente patrones de secreción de citoquinas T_{H1}, y las que drenan sitios mucosos (por ejemplo las placas de Peyer) muestran respuestas de tipo T_{H2}. En efecto, células tratadas con anti-CD3 tomadas del bazo, ganglios linfáticos periféricos o placas de Peyer de ratones sensibilizados tratados con DHEA, muestran un aumento típico en la secreción de IL-2 e IFNg, pero esto sólo ocurre en las células esplénicas o de los ganglios linfáticos periféricos cuando el tratamiento se realiza con DHEAS. De hecho, las células de las placas de Peyer no aumentan la producción de IL-2 después del tratamiento con DHEAS pero muestran una secreción aumentada de IL-4 y una baja secreción de IL-2 típicas de una respuesta tipo T_{H2} (y glucocorticoide). Esta influencia diferente de DHEA sobre la producción de citoquinas de células TH se correlaciona con la presencia de sulfatasa de DHEAS en estas áreas; por ejemplo, los ganglios linfáticos braquiales y axilares (no-mucosos) tienen una actividad de sulfatasa de DHEAS 6 veces mayor que las placas de Peyer (mucosos)(Daynes y col (1990) J. Exp. Med. 171: 979-996). Por lo tanto, en las áreas linfoides donde generalmente tienen lugar las respuestas inmunológicas mediadas por células, la producción de citoquinas es influenciada por la DHEA producida localmente, mientras que en las áreas donde predominan las respuestas humorales, DHEA tiene menos influencia, permitiendo que predominen los efectos de los glucocorticoides circulantes. Cualquier efecto de DHEA es relativamente discreto dado que es rápidamente re-sulfatada en el primer paso a través del hígado. De esto se deduce que, sin embargo, en enfermedades en las que la inmunidad celular contra antígenos específicos es patológica (por ejemplo autoinmunidad), una reducción en la influencia de DHEA sobre estas respuestas podría conducir a un estado de relativa inmunosupresión con conservación de la inmunidad humoral.
Creemos que la inhibición de la sulfatasa de esteroides sulfatados dentro de los macrófagos u otras células presentadoras de antígenos, podría conducir a una disminución de la capacidad de las células T sensibilizadas para montar una respuesta de tipo T_{H1} (aumento de IL-2 e INFg - reducción de IL-4). De este modo, podría predominar la influencia reguladora normal de otros esteroides como los glucocorticoides.
Los inhibidores que impiden el efecto fisiológico normal de DHEA o de esteroides relacionados, lo hacen actuando como anti-glucocorticoides y, en consecuencia, revelan un efecto tipo glucocorticoide endógeno. Dado que los glucocorticoides pueden actuar en procesos inflamatorios y procesos inmunológicos, este efecto tipo glucocorticoide endógeno podría entonces manifestarse como una respuesta anti-inflamatoria.
Descripción de los aspectos de la invención
La invención se basa en un procedimiento terapéutico para lograr un efecto tipo glucocorticoide endógeno en un ser humano, que comprende la administración de una cantidad efectiva de un inhibidor que impide el efecto fisiológico normal de DHEA o esteroides relacionados sobre las respuestas inmunológica y/o inflamatoria en dicho ser humano.
De esta manera, la invención proporciona el uso de un inhibidor de sulfatasa de esteroides sulfatados para la fabricación de un medicamento que revela un efecto tipo glucocorticoide endógeno.
Del modo usado en la presente invención, el término "DHEA o esteroides relacionados" se usa para denotar DHEA y metabolitos fisiológicamente activos de DHEA como, por ejemplo, DHEA-7OH, Androstenediol (AED), Androstenetriol (AET) y DHEA-16OH.
Se cree que los inhibidores alcanzan sus efectos terapéuticos por la remoción de una vía contra-reguladora que existe in vivo a través del efecto de DHEA o esteroides relacionados que revelan un efecto tipo glucocorticoide endógeno.
El efecto tipo glucocorticoide endógeno puede tener un componente anti-inflamatorio e inmunosupresor. A través de la acción que revela un efecto tipo glucocorticoide endógeno, los inhibidores producen indirectamente una respuesta inmunosupresora y/o anti-inflamatoria.
El medicamento fabricado de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, puede ser usado para prevenir o tratar cualquier condición fisiológica generalmente asociada con enfermedades inflamatorias y/o enfermedades que requieren inmunosupresión.
Las enfermedades adecuadas para el tratamiento con el inhibidor que impide el efecto fisiológico de DHEA o esteroides relacionados sobre las respuestas inmunológicas y/o inflamatorias de acuerdo con todos los aspectos de la invención descritos en la presente invención, son preferentemente las que resultan de la autoinmunidad, incluyendo, por ejemplo, artritis reumatoidea, diabetes tipo I y tipo II, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, tiroiditis, vasculitis, colitis ulcerosa, y enfermedad de Crohn, trastornos de la piel, por ejemplo psoriasis y dermatitis de contacto; enfermedad injerto contra huésped; eccema; asma y rechazo de órgano después de un transplante.
El efecto del inhibidor de manifestar un efecto tipo glucocorticoide endógeno puede determinarse midiendo las respuestas anti-inflamatorias y/o inmunosupresoras.
Los inhibidores que impiden el efecto fisiológico normal de DHEA o esteroides relacionados sobre las respuestas inmunológicas y/o inflamatorias, son inhibidores de una sulfatasa de esteroides sulfatados (E.C. 3.1.6.2). Del modo usado en la presente invención, el término "sulfatasa de esteroides sulfatados" denota una enzima que puede remover un grupo sulfato de un esteroide sulfatado. Esta enzima puede ser, por ejemplo, aril sulfatasa C (E.C. 3.1.6.1) o, mejor aún, una específica para DHEAS o esteroides sulfatados relacionados, es decir, metabolitos sulfatados derivados de DHEAS.
\newpage
Ejemplos de inhibidores de sulfatasa de esteroides sulfatados son descritas en Howarth y col J. Med. Chem (1994) 37, 219-221; y Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (1993) 3 (2) 313-318, Endocrinology (1991) 129 No. 6, 3174-3179, Bimbock y von Angener (1990) Biochemical Pharmacology 39 (11), 1709-1713; documentos de US Patent No. 5281587; Duncan y col (1993) Cancer Research 53, 298303; Li y col (1993) Steroids 58, 106-111; Dibbelt y col (1994) J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 50, 5/6, 261-266.
La interconversión de DHEA, AED, DHEA-7OH, AET y DHEA-16OH puede analizarse siguiendo las enseñanzas de Khalil y col (1994)(J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 48 5/6 545-552) o por Alena y col (1992)(Biochem 288 959-964). Deberá usarse una fuente adecuada de la actividad emzimática apropiada.
Existen sistemas de análisis disponibles comercialmente para la medición de DHEA y DHEAS, como kits de radioinmunoanálisis (ver, por ejemplo, Diagnostic Systems Laboratories, 445 Medical Centre Blvd., Webster, Texas 77598).
Pueden formularse de manera convencional composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente invención, opcionalmente con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes fisiológicamente aceptados.
Los inhibidores para el uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse para administración por vía oral, bucal, parenteral o rectal, o en una forma adecuada para la administración nasal o por inhalación o insuflación.
Para la administración por vía oral, las composiciones farmacéuticas pueden tener la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables como agentes ligantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); rellenos (por ejemplo, celulosa microcristalina o fosfato hidrogenado de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato sódico); o agentes humidificantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Los comprimidos pueden ser recubiertos por procedimientos bien conocidos en la materia. Las preparaciones líquidas para administración por vía oral pueden tener la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Estas preparaciones líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables como agentes suspensores, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Las preparaciones también pueden contener sales tampón, saborizantes, colorantes y agentes edulcorantes apropiados.
Las preparaciones para administración por vía oral pueden ser formuladas adecuadamente para lograr la liberación controlada del compuesto activo.
Para la administración por vía bucal, las composiciones pueden tener la forma de comprimidos o tabletas formuladas de manera convencional.
El inhibidor puede ser formulado para administración por vía parenteral, por ejemplo, como inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificaciones unitarias. Las composiciones pueden tener formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones, en vehículos oleosos o acuosos, y pueden tener agentes de fórmula como suspensores, estabilizantes y/o agentes dispersantes. En forma alternativa, el ingrediente activo puede presentarse en forma de polvo para ser reconstituido con un vehículo adecuado, como por ejemplo agua estéril apirógena, antes de ser usado.
El inhibidor también puede ser formulado en composiciones rectales como supositorios o enemas de retención que contengan, por ejemplo, bases convencionales para supositorios como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, el inhibidor también puede formularse como preparación de depósito. Estas formulaciones de larga acción pueden ser administradas por implantación o por inyección intramuscular.
Para la administración por vía nasal o por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se disponen convenientemente en una presentación como vaporizador de aerosol en envases presurizados o nebulizadores, con el uso de propelentes adecuados, como por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, u otro gas adecuado.
Las composiciones pueden, si se desea, ser presentadas en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más dosificaciones unitarias que contengan el ingrediente activo. El paquete o dispositivo dispensador puede ser acompañado de instrucciones para la administración.
La dosis a la que el inhibidor que impide el efecto fisiológico normal de DHEA o esteroides relacionados sobre las respuestas inmunológicas y/o inflamatorias será administrado, dependerá de la naturaleza del inhibidor y la ruta de administración, la potencia del inhibidor, y el peso corporal y patología del paciente. Las dosificaciones pueden ser, por ejemplo, entre 1 \mug/kg y 100 mg/kg, preferentemente entre 0,1 mg y 10 mg/kg y más preferentemente entre 0,1 mg y 1 mg/kg.
Como se indicó anteriormente, el inhibidor es un inhibidor de una sulfatasa de esteroides sulfatados y preferentemente sulfatasa de DHEAS (o un esteroide sulfatado relacionado). La sulfatasa de esteroides sulfatados es una enzima microsomal presente en muchos tejidos pero predominantemente en tejido linfoide (presumiblemente macrófagos) y pituitario (Milewich y col (1984) J. Steroid. Biochem. 21 No. 5, 529-538). Todavía no está claro si existen isoformas de esta enzima o si la enzima de macrófagos es distinta de la de otros tejidos. El inhibidor de la sulfatasa de esteroides es, preferentemente, más específico para la sulfatasa de DHEAS que se encuentra en macrófagos y otras células presentadoras de antígenos.
Como una primera etapa simple para probar nuestra hipótesis, se ha fabricado un par de derivados estructurales de estrona que inhiben la sulfatasa de esteroides sulfatados. Para una persona experta en la materia, será evidente que los derivados estructurales de DHEA también podrían ser fabricados y estudiados como se describe abajo. Estos han sido probados contra la enzima presente en las líneas celulares de macrófagos y la sulfatasa aislada de placenta humana, y después se estudió su capacidad para inhibir una respuesta inmune en desarrollo en sistemas celulares (por ejemplo, Reacción de Linfocitos Mezclados [RLM]) e in vivo (por ejemplo, Hipersensibilidad Retardada [HTR]). Además, se probó su capacidad de interferir con la producción de IL-2 por células T mediada por DHEAS en presencia y ausencia de macrófagos.
Los efectos de los inhibidores de acuerdo con la presente invención sobre la inflamación pueden ser medidos in vitro usando procedimientos conocidos en la materia como, por ejemplo, medir la liberación de mediadores de la inflamación, por ejemplo citoquinas, prostaglandinas, tromboxanos o FAP, e, in vivo, usando procedimientos dependientes de la inflamación como por ejemplo la pleuresía por carragenina descrita más en detalle en la presente invención.
Los efectos de los inhibidores sobre la función inmunológica pueden medirse in vitro usando procedimientos bien conocidos en la materia como en una Reacción de Linfocitos Mezclados, e in vivo en, por ejemplo, una Reacción de Hipersensibilidad Retardada.
Breve descripción de las figuras
La invención se ilustra más detalladamente haciendo referencia a los siguientes Ejemplos y Figuras, en las cuales:
Figura 1 muestra una representación esquemática de la influencia de los esteroides adrenales sobre la producción de citoquinas de las células T_{H}.
Figura 2 muestra una representación gráfica de la inhibición por CT2211 de la conversión de DHEAS por la sulfatasa U937.
Figura 3 muestra una representación gráfica de la inhibición por CT2251 de la conversión de DHEAS y ES por la sulfatasa U937.
Figura 4 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
\sqb
dhea 100\mug
\sqw
dheas 100\mug
\sqdlr
dexametasona 100\mug
\sqdr
dhea 100\mug+2210 2 mg
\sqdl
dhea 100\mug+2211 2 mg
\sqvh
dheas 100 \mug+2210 2 mg
\sqh
dheas 100 \mug+2211 2 mg
\sqp
CT2210 2mg
\sqpl
CT2211 2 mg
punto de análisis = 48 hs. Esteroides administrados por vía subcutánea en los días 0, 4 y 5, sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%.
Figura 5 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
\sqb
aceite de oliva
\sqw
dhea 100\mug
\sqdlr
dheas 100\mug
\sqdl
dexametasona 100\mug
punto de análisis = 24 hs. Esteroides administrados por vía subcutánea los días 0 y 5, sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%.
por anova ** p<0,05 vs control + dexametasona
\textdollar
\textdollar
p<0,05 vs control dhea + dheas
Figura 6 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
\sqb
DHEAS (50 mg/kg)
\sqw
DHEAS (5 mg/kg)
\sqdlr
DHEAS (50 mg/kg) y corticosterona (5mg/kg)
\sqdr
DHEAS (5 mg/kg) y corticosterona (5mg/kg)
\sqdl
DHEAS (0,5mg/kg) y corticosterona (5mg/kg)
\sqvh
DHEAS (0,05mg/kg) y corticosterona(5mg/kg)
\sqh
DHEAS (0,005mg/kg) y corticosterona(5mg/kg)
\sqp
DHEAS(0,0005mg/kg) y corticosterona(5mg/kg)
\sqpl
corticosterona (5mg/kg)
Los esteroides son administrados por vía subcutánea los días 0 y 4 en dmso 20%: aceite de oliva 80%, sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%.
Los resultados se expresan como media \pm sem, n = 10.
Figura 7 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
A
\sqb
dexametasona 5 mg/kg
\sqw
DHEA 5 mg/kg
\sqdlr
DHEA 5 mg/kg y Ct 2251 0,1 mg/kg
\sqdr
DHEA 5 mg/kg y Ct 2251 10 mg/kg
\sqdl
CT2251 0,1 mg/kg
\sqvh
CT2251 10 mg/kg
B
\sqb
dexametasona 5 mg/kg
\sqw
DHEAS 5 mg/kg
\sqdlr
DHEAS 5 mg/kg y Ct 2251 0,1 mg/kg
\sqdr
DHEAS 5 mg/kg y Ct 2251 10 mg/kg
\sqdl
CT2251 0,1 mg/kg
\sqvh
CT2251 10 mg/kg
Los esteroides son administrados por vía subcutánea los días 0 y 4 sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%.
Los resultados se expresan como media \pm sem, n = 7
Figura 8 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
\sqb
dexametasona 5 mg/kg
\sqw
CT2251 0,3 mg/kg
\sqdlr
CT2251 0,1 mg/kg
\sqdr
CT2251 0,03 mg/kg
\sqdl
CT2251 0,01 mg/kg
\sqvh
CT2251 0,003 mg/kg
\sqh
CT2251 0,001 mg/kg
punto de análisis = 24 horas. Esteroides administrados por vía subcutánea los días 0 y 4. Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%.
Resultados expresados como media \pm sem, n=7-14
Figura 9 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
\sqb
dexametasona 5 mg/kg
\sqw
dheas 50 mg/kg
\sqdlr
dheas 15 mg/kg
\sqdr
dheas 5 mg/kg
\sqdl
dheas 50 mg/kg y CT2251 0,1 mg/kg
\sqvh
dheas 15 mg/kg y CT2251 0,1 mg/kg
\sqh
dheas 5 mg/kg y CT2251 0,1 mg/kg
\sqp
CT2251 0,1 mg/kg
punto de análisis = 24 horas, esteroides administrados por vía subcutánea los días 0 y 4. Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%.
Resultados expresados como media \pm sem, n=7-14
Figura 10 muestra
A
el efecto de CT2251 sobre los macrófagos y número de células T en experimentos de sensibilización de contacto en ratones
\sqdl
vehículo control
\sqdlr
DHEAS
\sqvh
DHEAS y CT2251 10 mg/kg
\sqw
CT2251 10 mg/kg
\sqdl
DEX 5 mg/kg
\newpage
B
\sqdlr
control negativo
\sqvh
vehículo control
\sqb
DHEAS
\sqh
DHEAS y CT2251 10 mg/kg
\sqb
Ct 2251 10 mg/kg
\sqh
DEX 5 mg/kg
\sqdr
orejas normales
resultados expresados como media \pm sem.
*=p<0,05 vs DHEAS
\hskip2cm
=p<0,05 vs CT2251
\textdollar
=p<0,05 vs vehículo control
Figura 11 muestra un análisis histograma del efecto de CT2251 sobre la Hipersensibilidad Retardada (HR)
A
\sqb
DHEA 5 mg/kg
\sqw
DHEAS 5 mg/kg
\sqdlr
DEXA 5 mg/kg
\sqdr
DHEA 5 mg/kg y CT2251 10 mg/kg
\sqdl
DHEA 5 mg/kg y CT2251 0,1 mg/kg
\sqvh
CT2251 10 mg/kg
\sqh
CT2251 0,1 mg/kg
B
\sqb
DHEA 5 mg/kg
\sqw
DHEAS 5 mg/kg
\sqdlr
DEXA 5 mg/kg
\sqdr
DHEA 5 mg/kg y CT2251 10 mg/kg
\sqdl
DHEA 5 mg/kg y CT2251 0,1 mg/kg
\sqvh
CT2251 10 mg/kg
\sqh
CT2251 0,1 mg/kg
Los esteroides son administrados por vía subcutánea los días 0 y 3. Respuesta a 24 hs después del estímulo.
Resultados expresados como media \pm sem, n=7-8
\textdollar
, *p<0,05 ANOVA
Figura 12 muestra un gráfico del efecto de CT2251 sobre HR en ratas. CT2251 es administrado por vía subcutánea los días 0, 3 y 4.
\newpage
\medcirc estímulo solamente
\bullet vehículo control
\blacktriangle CT2251 10 mg/kg
\sqbullet
CT2251 1 mg/kg
\blacklozenge CT2251 0,1 mg/kg
Resultados expresados como media \pm sem, n = 6-7
Figura 13 muestra el efecto de CT2251 sobre la
\sqw
- artritis inducida por colágeno en ratones
\sqdl
- pata sometida a experimento
severidad
datos expresados como media \pm sem, n = 10. La incidencia de artritis fue 60% y 40% en los grupos de agua de grifo y aceite de oliva respectivamente.
Figura 14 muestra
A
el efecto de CT2251 y DHEAS sobre la pleuresía por carragenina
--- exudado
DEX 1 mg/kg, CT2251 10 mg/kg, DHEAS 5 mg/kg
B
el efecto de CT2251 y DHEAS sobre la pleuresía por carragenina
--- células totales
DEX 1 mg/kg, CT2251 10 mg/kg, DHEAS 5 mg/kg.
Los resultados se expresan como media \pm sem.
* = dif. sig. vs control por ANOVA.
Figura 15 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
\sqb
DHEA (5 mg/kg)
\sqw
DHEA (0,5 mg/kg)
\sqdlr
DHEA (0,05 mg/kg)
\sqdr
DHEA (0,005 mg/kg)
\sqdl
AED (5 mg/kg)
\sqvh
AED (0,5 mg/kg)
\sqh
AED (0,05 mg/kg)
Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%. Esteroides administrados por vía subcutánea los días 0 y 4, dmso 20%:aceite de oliva 80%.
Resultados expresados como media \pm sem, n=10.
Figura 16 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
\sqb
DHEAS (5 mg/kg)
\sqw
DHEAS (0,5 mg/kg)
\sqdlr
DHEAS (0,05 mg/kg)
\sqdr
DHEAS (0,005 mg/kg)
\sqdl
AEDS (5 mg/kg)
\sqvh
AEDS (0,5 mg/kg)
\sqh
AEDS (0,05 mg/kg)
\sqw
AEDS (0,005 mg/kg)
\sqp
AEDS (0,0005 mg/kg)
Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%. Esteroides administrados por vía subcutánea los días 0 y 4, dmso 20%:aceite de oliva 80%.
Resultados expresados como media \pm sem, n=10.
Figura 17 muestra un análisis histograma de los resultados de sensibilización por contacto.
\sqb
AEDS (5 mg/kg)
\sqw
AEDS (5 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg)
\sqdlr
DHEAS (5 mg/kg)
\sqdr
DHEAS (5 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg)
\sqdl
CT2251 (0,1 mg/kg)
\sqvh
DEX (5 mg/kg)
Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%. Esteroides administrados por vía subcutánea los días 0 y 4, dmso 20%:aceite de oliva 80%.
Resultados expresados como media \pm sem, n=10-11.
Figura 18 muestra un diagrama de flujo del metabolismo de DHEA.
Descripción de formas de realización específicas de la invención Ejemplos Pruebas de enzimas 1. Identificación de inhibidores potentes de sulfatasas de esteroides Protocolo para un estudio de sulfatasa de DHEAS
Procedimientos
a) Sulfatasa microsomal de esteroides de placenta humana
Enzima: Microsomas de placenta humana preparados como se describe en (Santner, S.J., y col (1984) J. Clin. Endocrinol. Metab. 59 29).
Prueba Todas las pruebas fueron realizadas por (al menos) duplicado.
La mezcla de la reacción estaba formada por PBS + 250 mM de sucrosa (microsomas placentarios), conteniendo 1\mumol/1DHEAS [concentración elegida porque aproximadamente 10*<K_{m}(app)] con 0,05% (v/v) de sustrato [^{3}H] y 0,05% (v/v) de DHEA [^{14}C]) en 0,5% (v/v) DMSO. La reacción fue iniciada por adición de enzima diluida apropiadamente (de modo que el 10% de la conversión del substrato ocurrió durante la prueba) e incubado por 30 min a 30ºC. Las reacciones fueron detenidas por la adición de 1000 \mul de tolueno a la mezcla de la reacción, mezclado por vórtices (2 min 40 seg en velocidad máxima en un mezclador por vórtices multitubos), luego se permitió reposar por 5 min. Se traspasaron 500 \mul de la capa superior (solvente) a un frasco para centelleo, se agregaron 10 ml de líquido de centelleo (Ultima Gold XR), y se contó la radioactividad en un contador de centelleo. Como controles, la enzima fue excluida de algunas mezclas de reacciones y 50% de las capas solvente y acuosa fueron removidas y contadas para radioactividad con el objeto de determinar la concentración basal (en la capa solvente) y total (en la capa acuosa) de [^{3}H]. DHEA [^{14}C] es incluida para permitir la corrección hacia atrás para tener en cuenta la recuperación del producto (DHEA)(normalmente >98%).
Efectos de los inhibidores: Los inhibidores fueron incluidos en la reacción anterior a diferentes concentraciones en 0,5% (v/v) DMSO [o 5% (v/v) DMSO si era necesario por la pobre solubilidad del inhibidor] llevando la concentración final de DMSO en la prueba a 1% (v/v) [o 5,5% (v/v)].
La enzima se probaría de manera similar para actividad de sulfatasa de estrona-sulfato, pero con ES en la prueba en lugar de DHEAS.
b) Sulfatasa de esteroides recombinante (como en Stein y col J. Biol. Chem. 264. 13865-13872, 1990; Yen y col Cell, 49, 443-454, 1987).
Enzima: Sulfatasa de esteroide recombinante de placenta humana (expresada en células NSO). Se pueden usar extractos crudos, parcialmente puros o enzima pura. La enzima se probará para la sulfatasa de esteroides de placenta humana como se describió anteriormente, excepto que la solución tampón de la prueba será Tris/HCl 50mM de pH apropiado (\sim7,5), conteniendo 0,1% (v/v) de Triton x 100.
Cálculos
1. De la velocidad de reacción de la sulfatasa de esteroide-sulfato
La proporción de dpm de 3H/14C para todas las muestras incluyendo los controles (es decir, la proporción entre dpm de 3H de la capa inferior de los controles "sin enzima" y 14C de la capa superior de los controles "sin enzima", para obtener el total de 3H/14C).
Los valores de 3H/14C de los controles "sin enzima" (antecedente), fueron sustraídos de muestras de ^{3}H/14C (no totales) para obtener los valores netos de 3H/14C.
Los valores netos de 3H/14C fueron divididos por el total, después el resultado fue multiplicado por la concentración del sustrato (1 \mumol/l) para obtener la concentración del producto.
La concentración del producto fue dividida por el tiempo de incubación (30 min) para obtener la velocidad (V) de conversión del sustrato (en \mumol/l/min).
2. Porcentaje de inhibición en presencia del inhibidor
[1-((velocidad + inhibidor)/(velocidad - inhibidor))] x 100 = % de inhibición.
donde
velocidad + inhibidor = velocidad en presencia del inhibidor, y
velocidad - inhibidor = velocidad en ausencia del inhibidor
3. CI50
Se utilizó el programa de computación MULTICALC (Pharmacia) para ajustar en el gráfico una curva no ponderada de 4 parámetros de porcentaje de inhibición (eje y) contra log (concentración del inhibidor) (eje x), y para determinar la concentración del inhibidor que reduce la actividad enzimática (en ausencia del inhibidor) en 50% (CI50).
4. K_{m} (app) y K_{i} (app)
La actividad enzimática se determinó a una variedad de concentraciones de substrato y después se calculó K_{m} a partir de estos datos usando el programa de computación Enzfitter (Leatherbarrow R.A. (1987) Enzfitter: a non.linear regresión data análisis programme for the IBM PC. Elsevier Biosoft, Cambridge U.K.). Esto se repetiría a una variedad de concentraciones de inhibidor y se determinó K_{i} a partir de los valores de K_{m}' obtenidos de acuerdo con la ecuación:
Km^{|} = Km(1 +[I]/K_{i}) donde Km^{|} = Km en presencia del inhibidor en la concentración [I].
La K_{i} media se tomará como una figura representativa.
c) Actividad de la sulfatasa de DHEAS en extractos de células U937
Procedimientos
Los inhibidores CT2211 y CT2251 fueron disueltos en 100% de etanol y 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) respectivamente, a concentraciones de 20 mM. Éstos fueron dosificados en sus respectivos solventes para obtener una gama de concentraciones de prueba. Los sustratos tritiados de DHEAS y estrona-sulfato fueron obtenidos de New England Nuclear y diluidos en etanol para obtener una concentración final de 70 nM para usar en la prueba. Las células U937 fueron desarrolladas en RPLI con contenido de 10% de suero bovino fetal y recolectadas a una concentración celular de 1x10^{6}/ml. Se lavaron en un medio libre de suero, se guardaron a -70ºC a 1x10^{6}/ml en suero salino con tampón Tris a pH 7,4 + Triton X-100 al 1% y sonicadas antes de ser usadas en la prueba.
Se agregaron 50 \mul de sustrato en etanol a cada tubo de ensayo y se quitó el solvente en un evaporador de vacío rotatorio. Para CT2211 disuelto en etanol, se agregaron 25 \mul de cada dilución a un tubo de ensayo y el solvente fue nuevamente removido por evaporación. Para CT2251 disuelto en DMSO, se añadieron a cada tubo 25 \mul de células U937 sonicadas, diluidas a un equivalente celular de 1,25 x 10^{7}/ml. Con CT2251, se agregaron a cada tubo 225 \mul de células U937 sonicadas, obteniendo una concentración final de DMSO al 10%. Los tubos fueron incubados a 37ºC durante 4 horas y la reacción detenida con metanol. Después de centrifugado, se agregó líquido de centelleo para extraer el sustrato desulfatado, y se contaron las CPM presentes en una cuota-parte de la fase orgánica, con un contador-beta.
La Figura 2 muestra la capacidad de CT2211 para inhibir la sulfatasa derivada de células U937 usando DHEAS como sustrato. La Figura 3 muestra la capacidad de CT2251 para inhibir la misma enzima usando DHEAS y estrona-sulfato como sustratos.
CPM totales
Con el objeto de obtener cuentas totales, 10 \mul de la fracción acuosa de los tubos duplicados que contenían sólo DHEA-s caliente, fueron contados después de la adición de centelleante y se calculó cpm total del modo siguiente:
cpm total = \frac{500}{10} x cpm para 10 \mul
Proporción de DHEA-s convertida a DHEA = \frac{cpm-cpm \ basal}{cpm \ total} = P
\muMoles de DHEA formada en 4 horas = P x no. total de \muMoles por tubo = M
v_{o} = M/tiempo en minutos
Total (sustrato) = \muMolar frío + \muMolar caliente
% de inhibición = \left[1 - \frac{v_{o} + inhibidor}{v_{o} - inhibidor}\right] x 100
donde v_{o} + inhibidor = velocidad en presencia del inhibidor y
v_{o} - inhibidor = velocidad en ausencia del inhibidor.
La CI_{50} se determinó como se describió previamente.
d) Otras actividades aún desconocidas de la sulfatasa de DHEAS serán probadas ampliamente como se describe arriba, usando un tampón adecuado (es decir, uno en el que la enzima tiene actividad medible).
2. Selectividad de inhibidores potentes de sulfatasa de esteroides para sulfatasa de esteroides únicamente
El efecto de los inhibidores de sulfatasa de esteroides se examinará en las actividades de otras sulfatasas relacionadas, es decir, aril-sulfatasas A y B.
\newpage
Se examinarán los efectos directos de sulfatasas de esteroides sobre enzimas/receptores de la vía de los glucocorticoides.
Se examinarán los efectos de los inhibidores de la sulfatasa de esteroides sobre la glucosa-6-fosfato dehidrogenasa.
Los efectos sobre estas enzimas/receptores se considerarán perjudiciales y serán evitados hasta donde sea posible.
3. Identificación de la captación celular de los inhibidores de DHEAS y esteroides sulfatados relacionados
Un estudio para identificar tales inhibidores medirá la captación de DHEAS-[^{3}H] o un esteroide sulfatado relacionado por una línea celular apropiada, y los efectos de los inhibidores en esa captación. Esto se describe para DHEAS-[^{3}H], pero será evidente para un experto en la materia que esto podría ser modificado usando técnicas habituales para la identificación de inhibidores de captación de esteroides sulfatados relacionados.
1. Una línea celular apropiada (es decir, una que toma DHEAS-[^{3}H] por encima de los niveles basales), se incuba con 1 \muM de DHEAS conteniendo 1% (v/v) DHEAS-[^{3}H] a 37ºC, durante un período de tiempo dado (>1h), en un medio de cultivo celular libre de suero (RPMI) +/- distintas concentraciones del inhibidor.
2. Al final de ese tiempo, las células se recolectan (si se adhieren, primero se tripsiniza la placa de cultivo celular) por centrifugación, se lava 3 veces con el excedente (10 ml) del medio de cultivo celular libre de suero y se cuenta la radioactividad en un contador de centelleo (todas las células presentes en el líquido de centelleo).
3. Cálculo
1. Captación Neta de DHEAS-[^{3}H]
[^{3}H] en células - [^{3}H] en una línea celular adecuada conocida por no captar DHEAS (por ejemplo U937), es decir basal = captación neta de [^{3}H].
2. Porcentaje de inhibición
% de inhibición = 1- \left[\frac{captación \ neta \ de \ [^{3}H] + inhibidor}{captación \ neta \ de \ [^{3}H] - inhibidor}\right] x 100
\vskip1.000000\baselineskip
donde captación neta de [^{3}H] + inhibidor = captación en presencia del inhibidor
y captación neta de [^{3}H] - inhibidor = captación en ausencia del inhibidor.
3. Valores de CI_{50}
Determinados como se describió para la inhibición de la actividad de sulfatasa.
Resultados obtenidos a la fecha:
1. vs actividad sulfatasa de DHEAS de U937
CT No CI_{50} (uM) evidente
2211 64
2251 0,04
2. vs actividad sulfatasa de DHEAS microsomal de placenta humana
CT No CI_{50} (uM) evidente
2211 152
2251 0,005
\newpage
2. Inmunología celular in vitro Función inmunológica
Los experimentos de la función de las células T ex vivo se realizan donde la interacción entre MHC-II y el receptor de las células T es un requerimiento obligatorio para la activación de las células T. Los inhibidores de la sulfatasa de esteroides sulfatados se prueban en reacciones de linfocitos mezclados, que miden la activación tanto de células T vírgenes como de células T de memoria, y en pruebas de respuesta a toxoide tetánico y al ácaro del polvo doméstico, que mide la respuesta de las células T de memoria de tipo Th1 + Th2 respectivamente.
El fundamento del experimento se basa en que, cuando los linfocitos de un individuo se mezclan con los de otro que expresa diferentes alelos HLA, se reconocerán cada uno como extraño para el otro y los linfocitos se activarán. Esta activación depende, en primer lugar, de las interacciones entre el complejo CD3/TcR de las células T y la molécula de MHC-II de las células presentadoras de antígenos. Se sabe que los anticuerpos que se unen al MHC-II inhiben esta reacción.
Los linfocitos se preparan frescos para cada experimento. Se coloca sangre venosa humana de dos individuos en tubos libres de endotoxinas que contienen heparina. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se preparan por centrifugación de gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). La concentración de CMSP se ajusta hasta 2x10^{6} cél/ml en medio RPMI 1640 (Gibco UK) que contiene Glutamina 2 mM (Gibco UK), 100u/ml/100\mug/ml de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) y suero fetal de becerro al 10% (Sigma UK), en el cual se realizan todas las manipulaciones, diluciones e incubaciones. Las CMSP de un individuo son irradiadas con 3000 rads. Estas células estimularán una respuesta por parte de las del otro individuo.
Se preparan diluciones seriadas del inhibidor por triplicado en placas micrometradas de 96 pocillos de fondo en U (Falcon UK) de 100 \mul. También se preparan pocillos de control que contienen solamente el medio de cultivo y niveles óptimos (100 nM) de Ciclosporina (Sandimmun, Sandoz), para establecer la respuesta máxima y la inhibición máxima respectivamente. Se mezclan juntos igual número de estimuladores irradiados y respondedores, y se colocan 100 \mul en cada pocillo \pm el agregado de 10 \mul de DHEA-s. También se preparan como controles pocillos que contienen solamente estimuladores o respondedores. El experimento es incubado a 37ºC, con una humedad de 100%, en CO_{2} al 5%, durante 5 días. La respuesta se mide a través de la evaluación de la proliferación durante las últimas 18 horas de cultivo por incubación con 1\muCi/pocillo de Timidina-^{3}H (Amersham UK), recolección a través de filtros de fibra de vidrio y
contado usando un contador beta.
Los resultados son graficados como CPM contra concentración de inhibidor.
Se quita el sobrenadante y se estudia la producción de IL-2, IFN\gamma, FNT y LT.
Reinducción de respuesta de células T al toxoide tetánico
El principio del experimento es que los linfocitos T de un individuo previamente inmunizado con Toxoide Tetánico (TT) responderán al TT cuando sean re-expuestos ex vivo. Esta activación es dependiente de la interacción entre el complejo CD3/TcR en las células T y la molécula del MHC-II en las células que procesan y presentan antígenos. Se sabe que los anticuerpos que se unen al MHC-II inhiben esta reacción.
Los linfocitos se preparan frescos para cada experimento. Se coloca sangre venosa humana en tubos libres de endotoxinas que contienen heparina. Las células mononucleares de sangre periférica se preparan por centrifugación por gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). La concentración de CMSP se ajusta hasta 2x10^{6} cél/ml en medio RPMI 1640 (Gibco UK) que contiene Glutmina 2 mM (Gibco UK), 100u/ml/100\mug/ml de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) y suero fetal de becerro al 10% (Sigma UK), en el cual se realizan todas las manipulaciones, diluciones e incubaciones.
Se preparan diluciones seriadas del inhibidor por triplicado en placas micrometradas de 96 pocillos de fondo en U (Falcon UK) de 100 \mul. Se añaden a los pocillos 50 \mul de una concentración óptima de TT determinada previamente por experimentación. También se preparan pocillos de control que contienen solamente el medio o Ciclosporina (Sandimmun, Sandoz) (100 nM), para establecer la respuesta máxima y la inhibición máxima respectivamente. Se agregan 50 \mul de CMSP a cada pocillo \pm el agregado de 10 \mul de DHEA-s. El experimento es incubado a 37ºC, a una humedad de 100%, en CO_{2} al 5%, durante 7 días. La respuesta se mide evaluando la proliferación durante las últimas 18 horas de cultivo por incubación con 1\muCi/pocillo de Timidina-^{3}H, recolección a través de un filtro de fibra de vidrio y contado usando un contador beta.
Los resultados son graficados como CPM contra concentración de inhibidor.
El sobrenadante también se quita y se prueba la producción de citoquinas IL-2, IL-4, IL-5, FNT, LT, IFN\gamma.
Reinducción de respuesta de células T al ácaro del polvo doméstico
El principio del experimento es que los linfocitos T de un individuo atópico de quien se conoce es alérgico al ácaro del polvo doméstico, responderán al extracto de ácaro del polvo doméstico cuando sean re-expuestos ex vivo. Esta activación depende de la interacción entre el complejo CD3/TcR de las células T y la molécula de MHC-II en las células que procesan y presentan antígenos.
Los linfocitos se preparan frescos para cada experimento. Se coloca sangre venosa humana en tubos libres de endotoxinas que contienen heparina. Las células mononucleares de sangre periférica se preparan por centrifugación por gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). La concentración de CMSP se ajusta hasta 2x10^{6} cél/ml en medio RPMI 1640 (Gibco UK) que contiene Glutmina 2 mM (Gibco UK), 100u/ml/100\mug/ml de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) y suero fetal de becerro al 10% (Sigma UK), en el cual se realizan todas las manipulaciones, diluciones e incubaciones.
Se preparan diluciones seriadas del inhibidor por triplicado en placas micrometradas de 96 pocillos de fondo en U Falcon UK) de 100 \mul. Se añaden a los pocillos 50 \mul de una concentración óptima de APD determinada previamente por experimentación. También se preparan pocillos de control que contienen solamente el medio o Ciclosporina (Sandimmun, Sandoz) (100 nM), para establecer la respuesta máxima y la inhibición máxima respectivamente. Se agregan 50 \mul de CMSP a cada pocillo \pm DHEA-s. El experimento es incubado a 37ºC, a una humedad de 100%, en CO_{2} al 5%, durante 7 días. La respuesta se mide a través de la evaluación de la proliferación durante las últimas 18 horas de cultivo por incubación con 1\muCi/pocillo de Timidina-^{3}H, recolección a través de un filtro de fibra de vidrio y contado usando un contador beta.
El sobrenadante también se quita y se analiza para IL-2, IL-4, IL-5, IFN\gamma, FNT y LT.
Los resultados son graficados como CPM contra concentración de inhibidor.
Función inmunológica
Se realizan experimentos sobre la función de células T ex vivo donde una interacción entre MHC-II y el receptor de células T no es un requerimiento obligatorio para la activación de células T.
Se usan los mitógenos PHA, Superantígenos y OKT3.
Cuando las células T se mezclan con la lectina fitohemaglutinina (PHA), enterotoxinas estafilocóccicas o el Ac OKT3 anti-CD3, responderán transformándose en células activadas, proliferando y secretando citoquinas.
Los linfocitos se preparan frescos para cada experimento. Se coloca sangre venosa humana en tubos libres de endotoxinas que contienen heparina. Las células mononucleares de sangre periférica se preparan por centrifugación por gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). La concentración de CMSP se ajusta hasta 2x10^{6} cél/ml en medio RPMI 1640 (Gibco UK) que contiene Glutmina 2 mM (Gibco UK), 100u/ml/100\mug/ml de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) y suero fetal de becerro al 10% (Sigma UK), en el cual se realizan todas las manipulaciones, diluciones e incubaciones.
Se preparan diluciones seriadas del inhibidor por triplicado en placas micrometradas de 96 pocillos de fondo en U (Falcon UK) de 100 \mul. Se añaden a los pocillos 50 \mul de una concentración óptima de mitógenos determinada previamente por experimentación. También se preparan pocillos de control que contienen solamente el medio o Ciclosporina (Sandimmun, Sandoz) (100 nM), para establecer la respuesta máxima y la inhibición máxima respectivamente. Se agregan 50 \mul de CMSP a cada pocillo \pm 10 \mul de DHEA-s. El experimento es incubado a 37ºC, a una humedad de 100%, en CO_{2} al 5%, durante 7 días. La respuesta se mide a través de la evaluación de la proliferación durante las últimas 18 horas de cultivo por incubación con 1\muCi/pocillo de Timidina-^{3}H, recolección a través de un filtro de fibra de vidrio y contado usando un contador beta.
Los resultados son graficados como CPM contra concentración de inhibidor.
El sobrenadante también se quita para análisis de citoquinas IL-2, 4, 5, LT, FNT, IFN\gamma e IL-1.
3. Farmacología in vivo de inhibidores de sulfatasa de DHEAS
Se probó el efecto de DHEA, DHEAS y sus inhibidores en 2 modelos de función inmunológica en ratones.
1. Sensibilización de contacto (SC)
En el día 0, los ratones fueron pintados en su flanco derecho afeitado, con 50 \mul de oxazalona al 2,5% o un vehículo (acetona 4:1 aceite de oliva). En el día 5, los animales fueron expuestos en la zona dorsal de sus orejas derechas a 25 \mul de oxazalona al 0,75% o al 0,25%. El espesor de las orejas se midió antes de la exposición de las orejas y 24, 48 y 72 horas después, usando un micrómetro de ingeniero. Se estableció la inflamación de la oreja como la diferencia en el espesor antes y después de la prueba. Los datos se expresan como cambio porcentual de los grupos tratados con el vehículo a los que se realizó la sensibilización y la prueba.
2. Hipersensibilidad retardada (DTH)
En el día 0, se inyectó a los animales por vía intravenosa 10^{6} SRBC lavadas en 0,1 ml de solución salina. Cuatro días después, los animales fueron estimulados en la planta de la pata trasera derecha con 10^{7} SRBC lavadas en 50 \mul de solución salina. El espesor de la planta de la pata se midió antes de la estimulación, 24, 48 y 72 horas después del estímulo usando calibres. La inflamación de la planta de la pata se define como la diferencia en el espesor antes y después del estímulo. Los datos se expresan como el cambio en porcentaje de los grupos tratados con el vehículo a los que se realizó sensibilización y estímulo.
Esteroides e inhibidores
Se administraron DHEA y DHEAS en diferentes momentos, generalmente al momento de la sensibilización (día 0) y el momento del estímulo día 3 o 4 -modelo DTH- día 4 ó 5 -modelo SC-, con el objeto de obtener un aumento de la respuesta inmunológica por encima de los animales no tratados con esteroides.
Se usaron diferentes dosis de inhibidores, y se compararon con el efecto de dexametasona como potenciales agentes inmunosupresores/antinflamantorios.
Ejemplo 1 Estudio in vivo de inhibidores de sulfatasa de esteroides sulfatados
Se probó la capacidad inmunosupresora de tres inhibidores de sulfatasa de esteroides sulfatados preparados según se describe en Howarth y col. J. Med. Chem. (1994) 37 219-221 y Howarth y col (1993) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter 3 (2) 313-318, en un modelo de sensibilización de contacto en ratón. El protocolo básico se ha resaltado anteriormente. Se realizaron dos experimentos separados.
Los inhibidores probados fueron:
CT2210: Estrona-3-0-(N,N,-dimetil)sulfamato
CT2211: Estrona-3-metilfosfonato
CT2251: Estrona-3-0-sulfamato
Sensibilización de contacto
Experimento 1
Se sensibilizaron animales con oxazolona al 2,5% en el día 0 y se estimularon en la oreja con oxazolona al 0,25% en el día 5. Se administraron esteroides (DHEA, DHEAS, dexametasona e inhibidores CT2210 y CT2211) en los días 0, 4 y 5 en inyecciones por vía subcutánea, disueltos en aceite de oliva. Los datos se presentan como cambio porcentual del grupo tratado con el vehículo al que se realizó sensibilización y estimulación (control positivo). Los animales fueron distribuidos al azar en 10 grupos de tratamiento (n=7-8 por grupo).
Grupo 1: sensibilización y estimulación más aceite de oliva (control positivo)
Grupo 2: sensibilización y estimulación más DHEA 100\mug/ratón
Grupo 3: sensibilización y estimulación más DHEAS 100 \mug/ratón
Grupo 4: sensibilización y estimulación más dexametasona 100 \mug/ratón
Grupo 5: sensibilización y estimulación más DHEA 100\mug/ratón + CT2210 2 mg/ratón
Grupo 6: sensibilización y estimulación más DHEA 100\mug/ratón + CT2211 2 mg/ratón
Grupo 7: sensibilización y estimulación más DHEAS 100 \mug/ratón + CT2210 2 mg/ratón
Grupo 8: sensibilización y estimulación más DHEAS 100 \mug/ratón + CT2211 2 mg/ratón
Grupos 9/10: sensibilización y estimulación más CT2210 o CT2211 2 mg/ratón
Los datos se exponen en la Figura 4 medidos 40 horas después de la estimulación. Tanto DHEA como DHEAS solos, aumentaron el incremento normal del espesor de la oreja observado con el procedimiento, lo que indica un efecto inmunoestimulante. La dexametasona redujo la respuesta, lo que indica un efecto inmunosupresor (o antinflamatorio). CT2210 y CT2211 fueron capaces de revertir los efectos estimulantes tanto de DHEA como de DHEAS y, además, fueron capaces de atenuar la inflamación de la oreja observada en ausencia de DHEA o DHEAS. Estos datos indican que CT2210 y CT2211, ambos inhibidores de la sulfatasa de esteroides sulfatados, son inmunosupresores en este modelo.
Experimento 2
Efecto de DHEA, DHEAS y Dexametasona (DEX)
Se distribuyeron al azar animales en 5 grupos (n=7-8) y se les administraron esteroides en los días 0 y 5 por vía subcutánea, sensibilizados con oxazalona al 2,5% y estimulados con oxazalona al 0,25%.
Grupo 1: sensibilización y estimulación más aceite de oliva (control positivo).
Grupo 2: sensibilización y estimulación solamente.
Grupo 3: sensibilización y estimulación más DHEA (100 \mug/ratón).
Grupo 4: sensibilización y estimulación más DHEAS (100 \mug/ratón).
Grupo 5: sensibilización y estimulación más DEX (100 \mug/ratón).
Los datos se exponen en la Figura 5, medidos a las 24 horas después de la estimulación. Tanto DHEA como DHEAS aumentaron significativamente la respuesta, mientras que fue inhibida por DEX. Estos datos son consistentes con el papel de DHEA y DHEAS como inmunoestimulantes/pro-inflamatorios in vivo y de DEX como inmunosupresor/antinflamatorio.
Por ANOVA ** p<0,05 vs control + dexametasona
\textdollar
\textdollar
p<0,05 vs control dhea + dheas
Experimento 3
Efecto anti-glucocorticoide de DHEA
Los datos expuestos en la Figura 6 indican que incrementando la dosis administrada de DHEAS (y por lo tanto su conversión a DHEA), existe un efecto anti-glucocorticoide funcional de DHEA en este modelo.
Se administraron esteroides los días 0 y 4 por vía subcutánea en dmso 20%:aceite de oliva 80%. Sensibilización con oxazalona 2,5% y estimulados con oxazalona 0,25%. Los resultados se presentan como media \pm sem, n=10.
Experimento 4
Efecto de inhibición de sulfatasa
Se distribuyeron al azar animales en 9 grupos (n=7) y se les administraron esteroides los días 0 y 4 por vía subcutánea, sensibilizados con oxazalona al 2,5% y estimulados con oxazalona al 0,25%. Los resultados se expresan como media \pm sem, n=7.
Grupo 1: sensibilización y estimulación más aceite de oliva (control positivo).
Grupo 2: sensibilización y estimulación más DEX (5 mg/kg)
Grupo 3: sensibilización y estimulación más DHEA (5 mg/kg)
Grupo 4: sensibilización y estimulación más DHEA (5 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg).
Grupo 5: sensibilización y estimulación más DHEA (5 mg/kg) y CT2251 (10 mg/kg).
Grupo 6: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 7: sensibilización y estimulación más CT2251 (10 mg/kg)
Grupo 8: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg)
Grupo 9: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 10: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg) y CT2251 (10 mg/kg)
Los datos usando estos inhibidores relativamente débiles se exponen en la Figura 7. Tanto DHEA como DHEAS aumentaron la inflamación normal de la oreja, mientras que fue inhibida por DEX. CT2251 (en ambas dosis) revirtió el aumento observado con DHEAS, pero no el observado con DHEA. CT2251 por sí mismo (en ambas dosis), inhibió significativamente la respuesta inflamatoria normal de la oreja. Estos datos revelan que la inhibición de la sulfatasa de esteroides sulfatados puede revertir el efecto estimulante de DHEAS, sustrato para la enzima.
Además, la respuesta inflamatoria de la oreja en sí misma es, al menos parcialmente, dependiente de un producto de la actividad de una sulfatasa endógena como DHEA, dado que la administración de CT2251 sólo provoca un efecto inmunosupresor o antinflamatorio.
Experimento 5
El efecto de CT2251 es dosis-dependiente
Se distribuyeron animales al azar en 8 grupos (n=7-14) y se les administraron esteroides los días 0 y 4 (ver Figura 8). Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%. Los resultados se presentan como la media \pm sem, n=7-14. Punto del análisis = 24 hs.
Grupo 1: sensibilización y estimulación más aceite de oliva (control positivo)
Grupo 2: sensibilización y estimulación más DEX (5 mg/kg)
Grupo 3: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,3 mg/kg)
Grupo 4: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 5: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,03 mg/kg).
Grupo 6: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,01 mg/kg)
Grupo 7: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,003 mg/kg)
Grupo 8: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,001 mg/kg)
La dexametasona inhibió el grado de inflamación de la oreja. También el tratamiento con CT2251 lo hizo de forma dosis-dependiente, siendo las dosis efectivas de 0,1 y mayores.
Experimento 6
Efecto del sustrato en la respuesta inhibitoria mediada por CT2251
Se distribuyeron al azar animales en 9 grupos (n=7-14) y se les administraron esteroides en los días 0 y 4 (ver Figura 9). Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%. Los resultados se presentan como la media \pm sem. Punto de análisis = 24 hs.
Grupo 1: sensibilización y estimulación más aceite de oliva (control positivo)
Grupo 2: sensibilización y estimulación más DEX (5 mg/kg)
Grupo 3: sensibilización y estimulación más DHEAS (50 mg/kg)
Grupo 4: sensibilización y estimulación más DHEAS (15 mg/kg)
Grupo 5: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg)
Grupo 6: sensibilización y estimulación más DHEAS (50 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 7: sensibilización y estimulación más DHEAS (15 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 8: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 9: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,1 mg/kg)
Los datos indican que el efecto inhibitorio de CT2251 sobre la respuesta inflamatoria en la oreja puede ser revertida incrementando las dosis de DHEAS, el sustrato para la enzima sulfatasa.
Experimento 7
Efecto de DHEAS e inhibición por la sulfatasa del infiltrado celular
Se asignaron animales al azar a 7 grupos (n=7-10) y se les administraron esteroides en el día 0 y 5. 24 horas después de la estimulación, se resecaron las orejas, se fijaron y se tiñeron con anticuerpos anti-CD3 (células T) o anti-Mac-1 (monocito/macrófagos) y se contaron el número de células positivas en 10 campos al azar.
Grupo 1: aceite de oliva solamente
Grupo 2: sensibilización y estimulación más aceite de oliva (vehículo control)
Grupo 3: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg)
Grupo 4: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg) y CT2251 (10 mg/kg)
Grupo 5: sensibilización y estimulación más CT2251 (10 mg/kg)
Grupo 6: sensibilización y estimulación más DEX (5 mg/kg)
Grupo 7: orejas normales
Los datos de la Figura 10 revelan que DHEAS puede aumentar el infiltrado celular inmunológico e inflamatorio en las orejas estimuladas. Esto puede revertirse efectivamente con el tratamiento concomitante con CT2251. CT2251 en sí mismo fue capaz de reducir posteriormente el número de células infiltrantes CD3 positivas. Estas observaciones indican que la estimulación o inhibición de la sulfatasa de esteroides sulfatados, puede aumentar o atenuar el desplazamiento de células de tipo inmunológico e inflamatorio en las orejas de los ratones sensibilizados.
*=p<0,05 vs DHEAS
\textdollar
= p<0,05 vs vehículo control
C=p<0,05 vs CT2251.
Hipersensibilidad retardada en el ratón
Se distribuyeron animales al azar en 10 grupos (n=7-8) y se les administraron esteroides en los días 0 y 4.
Los esteroides fueron administrados en los días 0 y 3 por vía subcutánea. La respuesta se evaluó a las 24 hs después de la estimulación. Los resultados obtenidos se expresan como la media \pm sem.
\textdollar
, * p< 0,05 ANOVA.
Grupo 1: sensibilización y estimulación más aceite de oliva (control positivo)
Grupo 2: sensibilización y estimulación más DHEA (5mg/kg)
Grupo 3: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg)
Grupo 4: sensibilización y estimulación más DEX (5 mg/kg)
Grupo 5: sensibilización y estimulación más DHEA (5 mg/kg) y CT2251 (10mg/kg)
Grupo 6: sensibilización y estimulación más DHEA (5 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 7: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg) y CT2251 (10 mg/kg)
Grupo 8: sensibilización y exposición más DHEAS (5 mg/kg) y CT2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 9: sensibilización y estimulación más CT2251 (10 mg/kg)
Grupo 10: sensibilización y estimulación más CT2251 (0,1 mg/kg)
Los datos presentados en la Figura 11 son consistentes con las observaciones hechas en el modelo de sensibilización de contacto del ratón en términos de cómo DHEA/S, DEX y CT2251 afectan los resultados. DHEA y DHEAS tienen efecto claramente pro-inmunológico (o pro-inflamatorio) y CT2251 puede efectivamente revertir el aumento de la inflamación mediado por DHEAS. También CT2251 en sí mismo puede reducir marcadamente la respuesta inflamatoria en la pata.
Hipersensibilidad retardada en la rata
Se sensibilizaron ratas Lewis con SRBC IV y se estimularon 4 días después con 10^{8}SRBC en la planta de la pata. La respuesta inflamatoria obtenida fue medida 24 y 48 hs después. Las ratas fueron distribuidas al azar en 5 grupos (n=6-7) y se les administraron esteroides en los días 0, 3 y 4, por vía subcutánea. Los resultados se expresan como la media \pm sem.
Grupo 1: solamente estimulación
Grupo 2: sensibilización y estimulación más vehículo
Grupo 3: Sensibilización y estimulación más CT2251 (10 mg/kg)
Grupo 4: Sensibilización y estimulación más CT2251 (1 mg/kg)
Grupo 5: Sensibilización y exposición más CT2251 (0,1 mg/kg)
Los datos presentados en la Figura 12 indican que CT2251 también puede suprimir una respuesta de HR en ratas.
Artritis inducida por colágeno tipo II en ratones
Se sensibilizaron ratones DBA/1 masculinos con colágeno tipo II en la base de la cola en FCA en el día 0. Los animales recibieron posteriormente una inyección de CII en FICA (Adyuvante de Freunds Incompleto) en el día 18, y se evaluó la incidencia y la severidad de la artritis desde el día 25. Los ratones fueron distribuidos al azar en 3 grupos (n=10).
Grupo 1: agua de grifo por vía oral en el día -1 y semanalmente
Grupo 2: aceite de oliva por vía oral en el día -1 y semanalmente
Grupo 3: CT2251 (10 mg/kg) en el día -1 y semanalmente
Los datos presentados en la Figura 13 muestran una incidencia de 60 y 40% en los grupos tratados con agua de grifo y aceite de oliva, con signos severos evidenciados en aquellos portadores de la enfermedad. El tratamiento con CT2251 previno el desarrollo de cualquier enfermedad.
Pleuresía por carragenina
Se anestesiaron ratas Wistar y se les administraron inyecciones intra- pleurales de carragenina al 0,5% en solución salina en hora 0. Seis horas después, se sacrificaron los animales y la cavidad pleural se lavó con 1 ml de solución salina citratada. Se midieron el volumen del líquido exudado y la concentración celular del exudado.
Los animales se distribuyeron al azar en 5 grupos de tratamiento (n=6).
Los resultados se presentan como la media \pm sem, *= dif. sig. vs control por ANOVA.
Grupo 1: solamente aceite de oliva por vía oral
Grupo 2: DEX (1 mg/kg) por vía oral a T = -1 h
Grupo 3: CT2251 (10 mg/kg) por vía oral a T = -24 hs y -1 h
Grupo 4: CT2251 (10 mg/kg) por vía oral a t = -1 h
Grupo 5: DHEAS (5 mg/kg) por vía oral a T = -24 hs y -1 h
Los datos presentados en la Figura 14 indican que DEX puede inhibir completamente la formación de líquido y reducir notablemente la afluencia celular (68%). El tratamiento con CT2251 a -24h y -1h reducen significativamente tanto el volumen del exudado (43%) como el infiltrado celular (28%), lo que indica que la inhibición de la sulfatasa de esteroide-sulfato puede reducir una respuesta inflamatoria.
Efectos de metabolites putativos de DHEA(S) en el modelo de sensibilización de contacto
\newpage
Experimento 1
Efecto de AED
Se distribuyeron los animales al azar en 8 grupos (n=10) y se les administraron esteroides en los días 0 y 4, por vía subcutánea 20% de DMSO:80% de aceite de oliva. Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%.
Grupo 1: sensibilización y estimulación más vehículo (control positivo)
Grupo 2: sensibilización y estimulación más DHEA (5 mg/kg)
Grupo 3: sensibilización y estimulación más DHEA (0,5 mg/kg)
Grupo 4: sensibilización y estimulación más DHEA (0,05 mg/kg)
Grupo 5: sensibilización y estimulación más DHEA (0,005 mg/kg)
Grupo 6: sensibilización y estimulación más AED (5 mg/kg)
Grupo 7: sensibilización y estimulación más AED (0,5 mg/kg)
Grupo 8: sensibilización y estimulación más AED (0,05 mg/kg)
Los datos que se presentan en la Figura 15 indican que AED y DHEA pueden aumentar la respuesta inflamatoria en la oreja en este modelo. El efecto de AED puede observarse disminuir a dosis de 0,05 mg/kg o menores.
Experimento 2
Efecto de AEDS
Se distribuyeron animales al azar en 10 grupos (n=10) y se les administraron esteroides en los días 0 y 4 por vía subcutánea e DMSO 20%:aceite de oliva 80%. Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%. Los resultados se obtuvieron como la media \pm sem.
Grupo 1: sensibilización y estimulación más vehículo (control positivo)
Grupo 2: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg)
Grupo 3: sensibilización y estimulación más DHEAS (0,5 mg/kg)
Grupo 4: sensibilización y estimulación más DHEAS (0,05 mg/kg)
Grupo 5: sensibilización y estimulación más DHEAS (0,005 mg/kg)
Grupo 6: sensibilización y estimulación más AEDS (5 mg/kg)
Grupo 7: sensibilización y estimulación más AEDS (0,5 mg/kg)
Grupo 8: sensibilización y estimulación más AEDS (0,05 mg/kg)
Grupo 9: sensibilización y estimulación más AEDS (0,005 mg/kg)
Grupo 10: sensibilización y estimulación más AEDS (0,0005 mg/kg)
Los datos presentados en la Figura 16 muestran que AEDS puede aumentar la respuesta inflamatoria en la oreja en este modelo. Este efecto se alcanza con dosis al menos 1000 veces menores que las observadas con DHEAS.
Experimento 3
Efecto de la inhibición de sulfatasa sobre la respuesta a AEDS
Se distribuyeron animales al azar en grupos (n=10-11) y se les administraron esteroides en los días 0 y 4 por vía subcutánea en DMSO 20%:aceite de oliva 80%. Sensibilizados con oxazalona al 2,5%, estimulados con oxazalona al 0,25%. Los resultados se informan como la media \pm sem.
Grupo 1: sensibilización y estimulación más vehículo (control positivo)
Grupo 2: sensibilización y estimulación más AEDS (5 mg/kg)
Grupo 3: sensibilización y estimulación más AEDS (0,5 mg/kg) y CT 2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 4: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg)
Grupo 5: sensibilización y estimulación más DHEAS (5 mg/kg) y CT 2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 6: sensibilización y estimulación más CT 2251 (0,1 mg/kg)
Grupo 7: sensibilización y estimulación más DEX (5 mg/kg)
Los datos presentados en la Figura 17 indican que la respuesta estimuladora observada con AEDS (y DHEAS), puede ser inhibida por un inhibidor de sulfatasa. Esto demuestra que AEDS puede servir como sustrato fisiológico para la enzima sulfatasa in vivo.

Claims (6)

1. El uso de un inhibidor de sulfatasa de esteroides sulfatados en la fabricación de un medicamento para lograr un efecto terapéutico similar al de los glucocorticoides endógenos.
2. El uso de la reivindicación 1, siendo el uso del inhibidor de sulfatasa de esteroides sulfatados para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la inflamación.
3. El uso de la reivindicación 1, siendo el uso del inhibidor de sulfatasa de esteroides sulfatados para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune.
4. El uso de la reivindicación 3, en el que la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide, diabetes tipo I o tipo II, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, tiroiditis, vasculitis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, trastornos dérmicos, eccema, asma, rechazo de órgano tras un transplante.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sulfatasa de esteroides sulfatados es la sulfatasa de DHEAS.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el inhibidor de la sulfatasa de esteroides sulfatados es estrona-3-O-(N,N,dimetil) sulfamato (CT2210), estrona-3-metilfosfonato (CT2211) o estrona-3-O-sulfamato (CT2251).
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