ES2180382B2 - METHOD OF DETECTION OF A MUTATION IN THE PROMOTER OF THE GENE OF UDP-GLUCURONOSIL TRANSFERASE BILIRRUBINE, ASSOCIATED WITH THE GILBERT SYNDROME. - Google Patents

Abstract

Diagnóstico molecular del síndrome de Gilbert mediante una amplificación competitiva cuantitativa. El procedimiento de diagnóstico permite detectar la presencia de la mutación asociada con síndrome de Gilbert. Caracterizado porque se utiliza amplificación cuantitativa y competitiva sobre DNA genómico y con tres cebadores con los que generar un producto específico del alelo con mutación, y otro producto no específico para la misma región del DNA. La asignación genotípica se efectúa tras el cálculo del porcentaje del producto específico respecto del control interno, y por comparación con valores límite. Método de aplicación con procedimientos manuales y cuantificación densitométrica o por sistemas automáticos con registros en tiempo real. Es de aplicación en los laboratorios clínicos por su mejor practicabilidad y menor costo con respecto a otros procedimientos establecidos.Molecular diagnosis of Gilbert's syndrome through a quantitative competitive amplification. The diagnostic procedure allows to detect the presence of the mutation associated with Gilbert's syndrome. Characterized because quantitative and competitive amplification is used on genomic DNA and with three primers with which to generate a specific product of the allele with mutation, and another product not specific for the same region of the DNA. The genotypic assignment is made after the calculation of the percentage of the specific product with respect to the internal control, and by comparison with limit values. Application method with manual procedures and densitometric quantification or by automatic systems with real-time records. It is applicable in clinical laboratories because of its better practicability and lower cost compared to other established procedures.

Description

Método de detección de una mutación en el promotor del gen de la Bilirrubina UDP-glucuronosil transferasa, asociada con el síndrome de Gilbert.Method of detecting a mutation in the Bilirubin gene promoter UDP-glucuronosyl transferase, associated with the Gilbert's syndrome

Método de detección de una mutación en el promotor del gen de la Bilirrubina UDP-glucuronosil transferasa, asociada con el síndrome de Gilbert. Un método de aplicación en análisis clínicos y bioquímicos.Method of detecting a mutation in the Bilirubin gene promoter UDP-glucuronosyl transferase, associated with the Gilbert's syndrome A method of application in clinical analysis and biochemicals.

Bosma PJ, Roy Chowdhury J, Bakker C, et al.: "The genetic basis of the reduced expression of bilirrubin UDP-glucuronosyltransferase 1 in Gilbert's syndrome" New England Journal of Medicine, 1995; 333:1171-75, describieron la asociación del síndrome de Gilbert con una mutación por inserción de un par de bases timina-adenina (TA) en el extremo 5' del promotor del gen de la bilirrubina uridindifosfato glucuronosil transferasa. Así, los pacientes Gilbert estudiados presentaron una región polimérica de siete pares de bases TA en homocigosis y no tenían ninguna otra mutación en toda la estructura del gen; mientras que los individuos normales se caracterizaron por presentar seis repeticiones de bases TA.Bosma PJ, Roy Chowdhury J, Bakker C, et al .: "The genetic basis of the reduced expression of bilirubin UDP-glucuronosyltransferase 1 in Gilbert's syndrome" New England Journal of Medicine , 1995; 333: 1171-75, described the association of Gilbert's syndrome with a mutation by insertion of a pair of thymine-adenine bases (TA) at the 5 'end of the promoter of the uridine diphosphate glucuronosyl transferase gene. Thus, the Gilbert patients studied presented a polymer region of seven base pairs TA in homozygosis and had no other mutation in the entire gene structure; while normal individuals were characterized by six repetitions of TA bases.

Con base en ese estudio, Monaghan G, Ryan M, Seddon R; et al. "Genetic variation in bilirrubin UDP-glucuronosyltransferase gene promoter and Gilbert's syndrome". The Lancet, 1996; 347:578-81, diferenciaron dos tipos de síndrome de Gilbert: leve y severo. El primero de ellos se relaciona con la inserción de un par de bases TA en el promotor y el segundo, menos frecuente, se hereda de forma dominante y se debe a mutaciones heterocigotas en la región codificante del gen, en cualquiera de los cinco exones que lo integran. Concluyeron que las mutaciones en el exón 1 reducen la afinidad de la bilirrubina por el centro catalítico de la enzima, mientras que las mutaciones en los exones 4 y 5 merman la afinidad por el co-substrato, el UDP-glucuronato.Based on that study, Monaghan G, Ryan M, Seddon R; et al. "Genetic variation in bilirubin UDP-glucuronosyltransferase gene promoter and Gilbert's syndrome". The Lancet , 1996; 347: 578-81, differentiated two types of Gilbert's syndrome: mild and severe . The first one is related to the insertion of a pair of TA bases in the promoter and the second, less frequent, is inherited in a dominant way and is due to heterozygous mutations in the coding region of the gene, in any of the five exons that They integrate it. They concluded that mutations in exon 1 reduce the affinity of bilirubin for the catalytic center of the enzyme, while mutations in exons 4 and 5 decrease affinity for the co-substrate, UDP-glucuronate.

Sampietro M, Lupica L, Perrero L, et al.: "TATA-box mutant in the promoter of the uridine diphosphate glucuronosyltransferase gene in Italian patients with Gilbert's syndrome" Ital J Gastroenterol Hepatol, 1998; 30:194-8, estudiaron la frecuencia con que la mutación apareció en el promotor de alguno de los dos alelos del gen en la población italiana. Así, el 93% de los individuos diagnosticados de síndrome de Gilbert, presentó la mutación en homocigosis o en heterocigosis; mientras que sólo el 44% de la población no Gilbert presentó la mutación, y de ellos, el 55% mostró un genotipo homocigoto y, aunque presentaron niveles de bilirrubina elevados, éstos no fueron suficientes para diagnosticarlos de síndrome de Gilbert. Como resultado de su estudio, los autores concluyeron que la inserción del par de bases TA en el promotor está estrechamente ligado al síndrome de Gilbert en Italia, si bien podrían estar implicados otros factores genéticos o adquiridos para desarrollar la hiperbilirrubinemia característica de este síndrome.Sampietro M, Lupica L, Perrero L, et al .: "TATA-box mutant in the promoter of the uridine diphosphate glucuronosyltransferase gene in Italian patients with Gilbert's syndrome" Ital J Gastroenterol Hepatol , 1998; 30: 194-8, studied the frequency with which the mutation appeared in the promoter of either of the two alleles of the gene in the Italian population. Thus, 93% of individuals diagnosed with Gilbert's syndrome presented the mutation in homozygosis or heterozygosis; while only 44% of the non-Gilbert population presented the mutation, and of these, 55% showed a homozygous genotype and, although they had elevated bilirubin levels, these were not sufficient to diagnose them of Gilbert's syndrome. As a result of their study, the authors concluded that the insertion of the TA base pair in the promoter is closely linked to Gilbert's syndrome in Italy, although other genetic or acquired factors could be involved to develop the characteristic hyperbilirubinemia of this syndrome.

Otros grupos de investigación encontraron la asociación entre el síndrome de Gilbert y el polimorfismo de la región polimérica –TA- del promotor del gen. Así, Iolascon A, Faienza MF, Perrotta S, et al. "(TA)8 allele in the UGT1A1 gene promoter of a Caucasian with Gilbert's syndrome". Haematologica, 1999; 84: 106-109, señalaron la presencia de una variante de la mutación de ocho repeticiones del par TA encontrada en un individuo blanco (raza caucasoide). Esta variante es más frecuente en la raza negra (Beutler E, Gelbart T, Demina A. "Racial variability in the UDP-glucuronosyltransferase 1 (UGT1A1) promoter: a balanced polymorphism for regulation of bilirrubin metabolism?" PNAS, 1998 Jul 7; 95 (14): 8170-8174), para la que también se describieron regiones poliméricas constituidas por cinco pares de bases TA; sin embargo, este menor número de repeticiones se asocia con niveles de bilirrubina más bajos.Other research groups found the association between Gilbert's syndrome and the polymorphism of the polymer region –TA- of the gene promoter. Thus, Iolascon A, Faienza MF, Perrotta S, et al. "(TA) 8 allele in the UGT1A1 gene promoter of a Caucasian with Gilbert's syndrome". Haematology , 1999; 84: 106-109, noted the presence of a variant of the eight repetition mutation of the TA pair found in a white individual (Caucasian race). This variant is more frequent in the black race (Beutler E, Gelbart T, Demina A. "Racial variability in the UDP-glucuronosyltransferase 1 (UGT1A1) promoter: a balanced polymorphism for regulation of bilirubin metabolism?" PNAS , 1998 Jul 7; 95 (14): 8170-8174), for which polymer regions consisting of five base pairs TA were also described; however, this lower number of repetitions is associated with lower bilirubin levels.

Los procedimientos utilizados por los distintos grupos de investigación mencionados para detectar la presencia de la mutación, en los individuos de sus respectivos estudios, fue la secuenciación de la región promotora del gen, o bien, la amplificación de un fragmento de DNA genómico y la asignación del número de repeticiones del promotor por la variación del tamaño que supone la inserción de un par de bases, utilizando la electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes o no desnaturalizantes (Bancroft JD, Kreamer B, Gourley GR. "Gilbert syndrome accelerates development of neonatal jaundice". J Pediatr, 1998; 132:656-60).The procedures used by the different research groups mentioned to detect the presence of the mutation, in the individuals of their respective studies, were the sequencing of the promoter region of the gene, or the amplification of a genomic DNA fragment and the assignment of the number of promoter repetitions due to the variation in the size of the insertion of a base pair, using electrophoresis in denaturing or non-denaturing polyacrylamide gels (Bancroft JD, Kreamer B, Gourley GR. "Gilbert syndrome accelerates development of neonatal jaundice " J Pediatr , 1998; 132: 656-60).

Proponemos un nuevo procedimiento de detección de la mutación asociada al síndrome de Gilbert en la raza blanca, basado en el trabajo desarrollado por Graack H-R y Kress H.: "Detection of frame-shift within homopolymeric DNA tracts using the amplification refractory mutation system (ARMS)". BioTechniques, 1999; 27:662-666; así como los de Zhu KY y Clark JM: "Addition of a competitive primer can dramatically improve the specificity of PCR amplification of specific alleles". BioTechniques, 1996; 21:586-590; y Mai M, Grabs R, Barnes RD, Vafiadis P y Polychronakos C: "Shortened PCR cycles in a conventional thermal cycler". BioTechniques, 1998; 25:208-210, y que posibilita la asignación genotípica de este síndrome mediante una amplificación competitiva y el análisis cuantitativo del producto mutado, respecto de un control interno de amplificación, utilizando geles de agarosa, que resulta menos sofisticados y más rápidos que los utilizados en los laboratorios de investigación como son la secuenciación, o la asignación del tamaño de la región polimérica tras la separación electroforética de hasta 16 horas con geles de poliacrilamida. Este procedimiento es fácilmente adaptable a termocicladores con detección en tiempo real del producto amplificado por el empleo de sondas marcadas y/o la utilización de agentes intercalantes del DNA, junto con el estudio de las temperaturas de fusión (Tm) de los productos generados.We propose a new procedure for detection of the mutation associated with Gilbert's syndrome in the white race, based on the work developed by Graack HR and Kress H .: "Detection of frame-shift within homopolymeric DNA tracts using the amplification refractory mutation system (ARMS ) ". BioTechniques , 1999; 27: 662-666; as well as those of Zhu KY and Clark JM: "Addition of a competitive primer can dramatically improve the specificity of PCR amplification of specific alleles". BioTechniques , 1996; 21: 586-590; and Mai M, Grabs R, Barnes RD, Vafiadis P and Polychronakos C: "Shortened PCR cycles in a conventional thermal cycler". BioTechniques , 1998; 25: 208-210, and which enables the genotypic assignment of this syndrome through competitive amplification and quantitative analysis of the mutated product, with respect to an internal control of amplification, using agarose gels, which is less sophisticated and faster than those used in research laboratories such as sequencing, or the allocation of the size of the polymer region after electrophoretic separation of up to 16 hours with polyacrylamide gels. This procedure is easily adaptable to thermal cyclers with real-time detection of the amplified product by the use of labeled probes and / or the use of DNA intercalating agents, together with the study of melting temperatures (Tm) of the products generated.

El fundamento del método analítico que se propone se recoge en la figura 1. Se han diseñado tres cebadores, SEQ.ID.No.2 y el SEQ.ID.No.3, con los que obtenemos, tras la amplificación, un fragmento específico que detecta la presencia del alelo mutado (siete repeticiones TA en la región polimérica del promotor), si bien no es del todo específica para este alelo y se puede generar resultado positivo en menor cuantía cuando la molécula de DNA diana presenta sólo seis repeticiones TA (ver figura 2). El tercer cebador, SEQ.ID.No. 4, compite con el segundo de los cebadores por la enzima Taq DNA polimerasa y contribuye a aumentar la especificidad del producto para las siete repeticiones. Además el segundo producto será utilizado como control positivo de la reacción de amplificación y como referencia interna para la cuantificación de la banda específica de mutación que se obtiene en cada muestra analizada. De esta forma se soluciona el problema del los métodos existentes que, por fallo en la reacción de amplificación, no generen un producto de la reacción y se interprete como ausencia de mutación.The basis of the proposed analytical method is collected in figure 1. Three primers have been designed, SEQ.ID.No.2 and SEQ.ID.No.3, with which we obtain, after amplification, a specific fragment that detects the presence of mutated allele (seven TA repetitions in the polymer region of the promoter), although it is not entirely specific for this allele and it can generate a positive result in smaller amounts when the target DNA molecule has only six TA repeats (see figure 2). The third primer, SEQ.ID.No. 4, compete with the second of the primers by the enzyme Taq DNA polymerase and contributes to increase product specificity for seven repetitions In addition the second product will be used as positive control of the amplification reaction and as a reference internal for quantification of the specific mutation band which is obtained in each sample analyzed. This way you solves the problem of existing methods that, due to failure in the amplification reaction, do not generate a reaction product and be interpreted as absence of mutation.

La reacción de amplificación se ha de realizar en condiciones óptimas de temperatura, que para nuestro cebador específico -SEQ.ID.No3- es de 63°C. A esta temperatura se limita la posibilidad de obtener resultado positivo con el alelo normal pero no se anula totalmente. Otras condiciones optimizadas son: concentración de cloruro magnésico (1.0 mM); unidades de Taq DNA polimerasa (0.5 UI por reacción de 20 \muL); cantidad de DNA genómico purificado por métodos habituales desde sangre anticoagulada, desecada o bien de enjuagues bucales (100 ng); dNTP (200 \muM); cebadores SEQ.ID.No.2 y SEQ.ID.No.3, en concentración equimolar (0.2 \muM); cebador SEQ.ID.No.4 (0.1 \muM) y la presencia de dimetilsulfóxido y glicerol al 1% (v/v) de cada uno. El volumen final de la reacción es de 20 \muL.The amplification reaction must be carried out in optimum temperature conditions, which for our primer Specific -SEQ.ID.No3- is 63 ° C. At this temperature it is limited the possibility of obtaining a positive result with the normal allele but it doesn't cancel out completely. Other optimized conditions are: concentration of magnesium chloride (1.0 mM); DNA Taq units polymerase (0.5 IU per 20 µL reaction); amount of DNA genomic purified by usual methods from blood anticoagulated, dried or mouthwash (100 ng); dNTP (200 µM); primers SEQ.ID.No.2 and SEQ.ID.No.3, in equimolar concentration (0.2 µM); primer SEQ.ID.No.4 (0.1 µM) and the presence of 1% dimethyl sulfoxide and glycerol (v / v) each. The final reaction volume is 20 µL.

Elaborada la mezcla de reacción se coloca en un termociclador estándar para tubos de 200 \mul de capacidad con el siguiente programa de ciclos y temperatura: 1 x (94°C, 1 min.); 30 x (94°C, 10 s; 63°C, 2 s; 72°C 10 s); 1 x (72°C 1 min.). Con este procedimiento se acorta la duración de la reacción de amplificación a sólo 58 min. lo que ahorra casi dos horas en el diagnóstico de esta enfermedad con respecto a amplificación estándar.Elaborated the reaction mixture is placed in a standard thermal cycler for 200 µl capacity tubes with the following cycle and temperature program: 1 x (94 ° C, 1 min.); 30 x (94 ° C, 10 s; 63 ° C, 2 s; 72 ° C 10 s); 1 x (72 ° C 1 min.). With This procedure shortens the reaction duration of amplification at only 58 min. which saves almost two hours in the diagnosis of this disease with respect to amplification standard.

La visualización del resultado supone la realización de una electroforesis de 20 minutos de duración en tampón Tris-borato 45 mM, pH 8.0, ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 1 mM sobre geles submarinos de agarosa al 2% y que contenga bromuro de etidio 0.5 \mug/mL. El gel se prepara según procedimiento habitual en el laboratorio. Al transiluminar el gel con luz ultravioleta de corta longitud de onda se observan, típicamente, dos bandas de fragmentos de DNA correspondiente a los productos específicos (110 pares de bases) y control interno (160 pares de bases). El análisis densitométrico de los dos productos de la reacción permite calcular el porcentaje de la banda específica respecto de la banda control, y con el valor obtenido se realiza la asignación genotípica para la mutación. Cuando el valor resultante supera el límite de corte de 20% se interpreta con la presencia de la mutación en al menos uno de los alelos; cuando la mutación está presente en homocigosis el valor de corte se eleva al 35%.The display of the result assumes the performing a 20-minute electrophoresis in 45 mM Tris-borate buffer, pH 8.0, acid ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 mM on underwater gels of 2% agarose and containing 0.5 µg / mL ethidium bromide. The Gel is prepared according to the usual procedure in the laboratory. To the transilluminate the gel with short wavelength ultraviolet light typically two bands of DNA fragments are observed corresponding to specific products (110 base pairs) and internal control (160 base pairs). Densitometric analysis of the two reaction products allows to calculate the percentage of the specific band with respect to the control band, and with the value obtained the genotypic assignment for the mutation. When the resulting value exceeds the cutoff limit of 20% is interpreted with the presence of the mutation in at least one of the alleles; when the mutation is present in homozygosis the Cut value rises to 35%.

Con este procedimiento de detección del carácter mutado se reducen los errores de asignación genotípica, que tienen lugar con los geles de poliacrilamida, como consecuencia de la pequeña diferencia de tamaño del producto amplificado (sólo dos bases) y que la mayoría de las veces depende de la subjetivad del analista, en especial cuando se está en presencia de un heterocigoto. En el método propuesto, la detección de la mutación se realiza por procedimientos densitométricos y realizando una cuantificación relativa a un producto de reacción generado en el mismo tubo de ensayo, con lo que se elimina la subjetividad del análisis. Frente a la secuenciación presenta su menor complejidad y laboriosidad (geles de poliacrilamida desnaturalizantes de grandes dimensiones) así como su menor costo (al compararlo con los secuenciadores automáticos).With this character detection procedure mutated genotypic assignment errors are reduced, which have place with polyacrylamide gels, as a result of the Small difference in amplified product size (only two bases) and that most of the time it depends on the subjectivity of the analyst, especially when in the presence of a heterozygous In the proposed method, mutation detection It is performed by densitometric procedures and performing a quantification relative to a reaction product generated in the same test tube, which eliminates the subjectivity of the analysis. Facing sequencing, it presents its least complexity and industriousness (denaturing polyacrylamide gels of large dimensions) as well as its lower cost (when compared to  automatic sequencers).

Por otra parte, la visualización del resultado con geles de agarosa emplea aproximadamente 45 minutos (electroforesis, tinción y densitometría) frente a las 16 horas del procedimiento con geles de poliacrilamida. Si además tenemos en cuenta que el procedimiento de elaboración de los geles de agarosa, y su posterior densitometría no requiere un entrenamiento especializado o diferente al utilizado habitualmente en los laboratorios clínicos, hacen este nuevo método útil para su uso rutinario en el diagnóstico de pacientes con sospecha clínica de síndrome de Gilbert.Moreover, the display of the result with agarose gels it takes approximately 45 minutes (electrophoresis, staining and densitometry) versus 16 hours of the procedure with polyacrylamide gels. If we also have in  note that the procedure for making gels agarose, and its subsequent densitometry does not require a specialized training or different from the one commonly used in clinical laboratories, they make this new method useful for their routine use in the diagnosis of patients with clinical suspicion of Gilbert's syndrome.

La identificación de la presencia de la mutación en las muestras también es posible cuando se utilizan termocicladores automatizados que permitan el seguimiento y detección de la reacción de la amplificación utilizando sondas marcadas y/o agentes intercalantes del DNA de la reacción combinado con el cálculo de la curva de fusión (Tm) de los productos resultantes, lo que puede evitar la realización de los geles de agarosa y la cuantificación densitométrica relativa del fragmento mutado. En estos termocicladores se puede emplear la señal registrada por el instrumento (fluorescencia o espectrofotometría) máxima del pico resultante de aplicar la derivada de primer orden a la curva de fusión de los productos de amplificación, para establecer la proporción relativa del producto mutado con respecto al control interno de amplificación, si bien es necesario establecer los niveles de corte para los homocigotos mutados y los heterocigotos con respecto la homocigoto no mutado.The identification of the presence of the mutation In the samples it is also possible when used automated thermal cyclers that allow monitoring and amplification reaction detection using probes labeled and / or reaction DNA intercalating agents combined with the calculation of the melting curve (Tm) of the resulting products, which can prevent the realization of agarose gels and the relative densitometric quantification of mutated fragment In these thermal cyclers you can use the signal recorded by the instrument (fluorescence or maximum spectrophotometry) of the peak resulting from applying the first-order derivative to the melting curve of the products of amplification, to establish the relative proportion of the product mutated with respect to internal amplification control, although it is necessary to set the cut levels for homozygotes mutated and heterozygous with respect to the homozygous no mutated

Figura 1: esquema que representa el lugar de hibridación de los cebadores SEQ.ID.No 2, 3 y 4, en la región promotora del gen y su posición relativa respecto de la región polimérica TA (linea engrosada) que presenta la mutación.Figure 1: scheme representing the place of hybridization of primers SEQ.ID.No 2, 3 and 4, in the region promoter of the gene and its relative position with respect to the region Polymeric TA (thickened line) presenting the mutation.

Figura 2: esquema de los dos posibles modos de hibridación del cebador –SEQ.ID.No.3- específico para la mutación, cuando se empareja con el alelo normal. La situación en la que el extremo 3' del cebador no híbrida, no genera producto de amplificación; cuando híbrida la reacción de amplificación está limitada por la optimización de los factores que influyen en la reacción.Figure 2: Scheme of the two possible modes of primer hybridization -SEQ.ID.No.3- specific for the mutation, when paired with the normal allele. The situation in which the 3 'end of the non-hybrid primer, does not generate product of amplification; when hybrid the amplification reaction is limited by the optimization of the factors that influence the reaction.

El procedimiento de diagnóstico supone tres etapas: A. obtención del DNA genómico a partir de células nucleadas del paciente; B. amplificación por reacción en cadena de la polimerasa; C. visualización y cuantificación del resultado.The diagnostic procedure involves three Stages: A. Obtaining genomic DNA from cells patient nucleated; B. chain reaction amplification of polymerase; C. visualization and quantification of Outcome.

Ejemplo IExample I A. Obtención del DNA genómico de sangre total frescaA. Obtaining genomic DNA from fresh whole blood

1.one.

1 mL de sangre venosa anticoagulada con EDTA.1 mL of blood vein anticoagulated with EDTA.

2.two.

Adicionar 1 mL de Ficoll Hypaque (Ammershan-Pharmacia).Add 1 mL of Ficoll Hypaque (Ammershan-Pharmacia).

3.3.

Centrifugar a 1000 g durante 5 min.Centrifuge at 1000 g for 5 min.

4.Four.

Separar el sobrenadante para tubo limpio y volver a centrifugar como en 3.Separate the supernatant for clean tube and centrifuge again as in 3.

5.5.

El sedimento de células se resuspende en 150 \muL de tampón TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5).The sediment of cells are resuspended in 150 µL of TBS buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5).

6.6.

Se adiciona 150 \muL de tampón de lisis (Tris\cdotHCl 400 mM, EDTA 100 mM, SDS 1% pH 8.0) y se agita uno o dos minutos.150 is added µL of lysis buffer (400 mM Tris • HCl, 100 mM EDTA, SDS 1% pH 8.0) and stir one or two minutes.

7.7.

Adicionar 25 \mul de una disolución de proteinasa K (Boehringer Mannheim (10 mg/mL de agua) e incubar 1 hora a 56°C.Add 25 \ mul of a proteinase K solution (Boehringer Mannheim (10 mg / mL of water) and incubate 1 hour at 56 ° C.

8.8.

Transferir 300 \muL de la digestión de la etapa 7 a un tubo de vacío de 5 mL con gel separador (tipo Vacutainer o Venojet).Transfer 300 µL of step 7 digestion to a 5 mL vacuum tube with separating gel (type Vacutainer or Venojet).

9.9.

Incorporar 1 mL de una mezcla fenol:cloroformo (1:1) (Sigma) y agitar repetidas veces hasta conseguir una emulsión. Centrifugar a 1000 g, 2 min.Incorporate 1 mL of a phenol mixture: chloroform (1: 1) (Sigma) and stir repeatedly until you get an emulsion. Centrifuge at 1000 g, 2 min.

10.10.

Repetir el paso 9 .Repeat step 9 .

11.eleven.

Incorporar 1 mL de cloroformo (Sigma), emulsionar y centrifugar como en 9.Incorporate 1 mL of chloroform (Sigma), emulsify and centrifuge as in 9.

12.12.

Transferir 300 \muL de la fase superior acuosa a un tubo limpio de 1.5 mL capacidad.Transfer 300 µL of the upper aqueous phase to a clean 1.5 mL tube capacity.

13.13.

Adicionar 30 \muL de acetato amónico 3 M y 750 \muL de etanol absoluto frío (-20°C). Agitar por inversión varias veces hasta hacerse visible la nube de DNA.Add 30 µL of 3M ammonium acetate and 750 µL of cold absolute ethanol (-20 ° C). Shake by inversion several times until the DNA cloud

14.14.

Recoger el DNA con espátula estéril o por centrifugación 2 min. a 5000 g y lavarlo sin resuspender en etanol frío al 70%. Centrifugar y eliminar el etanol desecando 10 min. en concentrador de vacío (tipo Speed vac).Collect the DNA with sterile spatula or centrifugation 2 min. to 5000 g and wash it without resuspend in 70% cold ethanol. Centrifuge and remove ethanol drying out 10 min. in vacuum concentrator (Speed type vac).

15.fifteen.

Resuspender el DNA en 50 - 100 \muL de agua estéril. Cuantificar a 260 nm y ajustar la concentración a 100 ng/\muL.Resuspend the DNA in 50-100 µL of sterile water. Quantify at 260 nm and adjust the concentration at 100 ng / µL.

B. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasaB. Chain reaction amplification of the polymerase

1.one.

Preparar la mezcla de reacción en un tubo de 200 \muL, adecuado para el termociclador, colocado en un baño de agua-hielo, con los componentes y volúmenes descritos a continuación para 1 muestra de 20 \muL:Prepare the mixture reaction in a 200 µL tube, suitable for the thermocycler, placed in a water-ice bath, with the components and volumes described below for 1 20 sample:

a. Agua desionizada estérilto. Deionized water sterile 9 \muL9 µL b. Tampón de amplificación 10 Xb. Amplification buffer 10 X 2 \muL2 µL c. Cloruro magnésico 20 mMc. Magnesium Chloride 20 mM 1 \muL1 µL d. Mezcla de dNTP 4 mMd. DNTP Mix 4 mM 1\muL1 µL e. Mezcla de cebadoresand. Mix of primers SEQ.ID.No. 2 y 3SEQ.ID.No. 2 and 3 1 pmoles/\muL;one pmoles / µL; SEQ.ID.No.4SEQ.ID.No.4 0.5 pmoles por \muL)0.5 pmoles per \ muL) Siendo SEQ.ID.No2: 5'-CTgCTACCTTTgTggACTGACAgC-3';Being SEQ.ID.No2: 5'-CTgCTACCTTTgTggACTGACAgC-3 '; SEQ.ID.No3: 5'-gCCCTCTCCTACTTATATATATATATATATggC-3'; ySEQ.ID.No3: 5'-gCCCTCTCCTACTTATATATATATATATATggC-3 '; Y SEQ.ID.No4: 5'-ACAgCCATggCgCCTTTgCT-3'SEQ.ID.No4: 5'-ACAgCCATggCgCCTTTgCT-3 ' f. DNA genómico (100 ng/\muL)F. Genomic DNA (100 ng / µL) 1 \muL1 µL g. Taq DNA polimerasa 0.25 U/\muLg. Taq DNA polymerase 0.25 U / µL 2 \muL2 µL

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2.two.

Colocar en el termociclador y ejecutar los siguientes ciclosPlace in thermocycler and run the following cycles

a.to.

Ciclo 1 (94°C, 1 min.), una vez.Cycle 1 (94 ° C, 1 min.), once.

b.b.

Ciclo 2 (94°C, 10 s; 63°C, 2 s; 72°C 10 s), repetir 30 veces.Cycle 2 (94 ° C, 10 s; 63 ° C, 2 s; 72 ° C 10 s), repeat 30 times.

c.c.

Ciclo 3 (72°C 1 min.), una vez.Cycle 3 (72 ° C 1 min.), once.

C. Visualización y cuantificación por electroforesis y densitometríaC. Visualization and quantification by electrophoresis and densitometry

1.one.

Confeccionar un gel de agarosa al 2% en tampón TBE y con 0.5 \mug de bromuro de etidio:Make a gel 2% agarose in TBE buffer and with 0.5 µg of bromide ethidium:

a.to.

Pesar 1 g de agarosa (MS-8, Pronadisa).Weigh 1 g of agarose (MS-8, Pronadisa).

b.b.

Añadir 50 mL de tampón TBE 0.5X (Tris-borato 45 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0).Add 50 mL of 0.5X TBE buffer (45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA, pH 8.0).

c.c.

Calentar a 90°C hasta obtener una disolución transparente.Heat to 90 ° C until a clear solution is obtained.

d.d.

Dejar enfriar lentamente hasta 60°C e incorporar 50 \muL de bromuro de etidio 0.5 mg/mL. Mezclar evitando la formación de burbujas.Let cool slowly up to 60 ° C and incorporate 50 µL of ethidium bromide 0.5 mg / mL Mix avoiding the formation of bubbles.

e.and.

Verter en un molde horizontal de 5 x 8 cm hasta conseguir un espesor de 0.5 cm de gel. Colocar un peine adecuado de 3 x 1 mm cada diente y a una distancia de 1 mm del fondo del gel. Dejar enfriar 30 min.Pour into a mold horizontal 5 x 8 cm until a thickness of 0.5 cm of gel is achieved. Place a suitable comb of 3 x 1 mm each tooth and at a distance 1 mm from the bottom of the gel. Let cool 30 min.

f.F.

Sumergir el gel en posición horizontal en una cubeta de electroforesis con tampón TBE 0.5X.Dip the gel in horizontal position in an electrophoresis cuvette with TBE buffer 0.5X

2.two.

Mezclar 8 \muL de la reacción con 2 \muL de tampón de carga 5X (tampón TBE 5X, glicerol 50%, azul de bromofenol 0.1%).Mix 8 µL of the reaction with 2 µL of 5X loading buffer (5X TBE buffer, 50% glycerol, 0.1% bromophenol blue).

3.3.

Aplicar la mezcla de a un pocillo del gel.Apply the mixture from to a well of the gel.

4.Four.

Cargar 8 \muL del marcador phi X174/HaeIII.Load 8 µL of Phi marker X174 / HaeIII.

5.5.

Conectar los electrodos a una fuente y aplicar 6 V/cm durante 20 min.Connect the electrodes to a source and apply 6 V / cm for 20 min.

6.6.

Visualizar por transiluminación con luz ultravioleta y digitalizar la imagen.Display by ultraviolet light transillumination and digitize the image.

a.to.

Realizar una densitometría de cada calle y calcular el porcentaje de la banda específica de 110 pares de bases respecto de la banda control de 160 pares de base.Make a densitometry of each street and calculate the percentage of the band 110 base pairs specific to the control band of 160 base pairs

7.7.

Comparar con los siguientes valores de corte:Compare with following cut-off values:

a.to.

% (específico/control)< 20% homocigoto normal, ausencia de mutación.% (specific / control) <20% homozygous normal, absence of mutation.

b.b.

% (específico/control) entre 22 y 32% heterocigoto.% (specific / control) between 22 and 32% heterozygous.

c.c.

% (específico/control) >35 homocigoto para la mutación de siete repeticiones.% (specific / control)> 35 homozygous for the seven mutation repetitions

Ejemplo IIExample II A. Obtención del DNA genómico a partir de células del epitelio bucalA. Obtaining genomic DNA from cells in the oral epithelium

1.one.

Enjuagar la boca con 5 mL de suero fisiológico (Cloruro sódico 0.9%).Rinse mouth with 5 mL of physiological serum (0.9% sodium chloride).

2.two.

Recoger en un tubo de 10 mL. Centrifugar a 1000 g durante 5 min.Pick up in a tube 10 mL Centrifuge at 1000 g for 5 min.

3.3.

Resuspender el sedimento de células en 275 \muL de tampón de lisis (Tris HCl 400 mM, EDTA 100 mM, SDS 1%, pH 8.0) y se agita uno o dos minutos.Resuspend the cell pellet in 275 µL lysis buffer (Tris HCl 400 mM, 100 mM EDTA, 1% SDS, pH 8.0) and stir one or two minutes

4.Four.

Adicionar 25 \mul de una disolución de proteinasa K (Boehringer Mannheim (10 mg/mL de agua) e incubar 1 hora a 56°C.Add 25 \ mul of a proteinase K solution (Boehringer Mannheim (10 mg / mL of water) and incubate 1 hour at 56 ° C.

5.5.

Adicionar 100 \muL de cloruro sódico 6M. Agitar vigorosamente 15 segundos.Add 100 µL of 6M sodium chloride. Shake vigorously 15 seconds.

6.6.

Centrifugar a 10 000 g durante 6 min.Centrifuge at 10 000 g for 6 min.

7.7.

Separar el sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 mL de capacidad y centrifugar nuevamente a 10 000 g durante 3 min.Separate the supernatant to a clean tube of 1.5 mL capacity and centrifuge again at 10,000 g for 3 min.

8.8.

Transferir 300 \muL de sobrenadante limpio a un nuevo tubo y adicionar 30 \muL de acetato amónico 3 M y 750 \muL de etanol absoluto frío (-20°C). Agitar por inversión varias veces hasta hacerse visible la nube de DNA.Transfer 300 µL of clean supernatant to a new tube and add 30 µL of 3M ammonium acetate and 750 µL of cold absolute ethanol (-20 ° C). Shake by inversion several times until the DNA cloud

9.9.

Recoger el DNA con espátula estéril o por centrifugación 2 min. a 5000 g y lavarlo sin resuspender en etanol frío al 70%. Centrifugar y eliminar el etanol desecando 10 min. en concentrador de vacío (tipo Speed vac).Collect the DNA with sterile spatula or centrifugation 2 min. to 5000 g and wash it without resuspending in 70% cold ethanol. Centrifuge and remove the ethanol drying out 10 min. in vacuum concentrator (Speed type vac).

10.10.

Resuspender el DNA en 50 - 100 \muL de agua estéril. Cuantificar a 260 nm y ajustar la concentración a 100 ng/\muL. Resuspend the DNA in 50-100 µL of sterile water. Quantify at 260 nm and adjust the concentration to 100 ng / µL.

B. Amplificación por reaccióin en cadena de la polimerasa, con Hot Start en termociclador con detección en tiempo real.B. Polymerase chain reaction amplification, with Hot Start in thermal cycler with real-time detection.

1.one.

Preparar la mezcla de reacción en un tubo, adecuado para el termociclador, con los volúmenes descritos a continuación para 1 muestra. volumen final de 20 \muL:Prepare the mixture reaction in a tube, suitable for the thermal cycler, with the volumes described below for 1 sample. final volume of 20 µL:

       \dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a. Agua desionizada estéril \+ 8  \mu L\cr  b. Tampón de
amplificación 10 X \+ 2  \mu L\cr  c. Cloruro magnésico 20 mM  \+ 1
 \mu L\cr  d. Mezcla de dNTP 4 mM \+ 1  \mu L\cr  e. DNA genómico
(100 ng/ \mu L) \+ 1 \mu L\cr  f. Taq DNA polimerasa 0.25 U/ \mu L
\+ 2 \mu L\cr  g. Agente intercalante (SYBR green I) \+ 1  \mu L\cr 
h. Cubrir con 25  \mu L de aceite
mineral\+\cr}\ dotable {\ tabskip \ tabcolsep # \ hfil \ + # \ hfil \ tabskip0ptplus1fil \ dddarstrut \ cr} {
 to. Sterile deionized water \ + 8 \ mu L \ cr b. Buffer
10 X \ + 2 µL \ cr c amplification. 20 mM \ + 1 magnesium chloride
 \ mu L \ cr d. Mixture of 4 mM dNTP \ + 1 µL \ cr e. Genomic DNA
(100 ng / \ muL) \ + 1 \ mu L \ cr f. Taq DNA polymerase 0.25 U / µL
\ + 2 \ mu L \ cr g. Intercalating agent (SYBR green I) \ + 1 \ mu L \ cr
h. Cover with 25 µL of oil
mineral \ + \ cr}
    

2.two.

Colocar en el termociclador calentar la mezcla a 80°C de 3 a 5 minutos.Place in Heat cycler heat the mixture to 80 ° C for 3 to 5 minutes.

3.3.

Adicionar 4 \muL de la mezcla de cebadores:Add 4 µL of the primer mix:

a. SEQ.ID.No. 2 y 3to. SEQ.ID.No. 2 and 3 1 pmoles/\muL;1 pmoles / µL; b. SEQ.ID.No.4b. SEQ.ID.No.4 0.5 pmoles por \muL)0.5 pmoles per µL) Siendo SEQ.ID.No2: 5'-CTgCTACCTTTgTggACTGACAgC-3';Being SEQ.ID.No2: 5'-CTgCTACCTTTgTggACTGACAgC-3 '; SEQ.ID.No3: 5'-gCCCTCTCCTACTTATATATATATATATATggC-3'; ySEQ.ID.No3: 5'-gCCCTCTCCTACTTATATATATATATATATggC-3 '; Y SEQ.ID.No4: 5 '-ACAgCCATggCgCCTTTgCT-3 'SEQ.ID.No4: 5 '-ACAgCCATggCgCCTTTgCT-3 '

4.Four.

Ejecutar los siguientes ciclosRun the following cycles

a.to.

Ciclo 1 (94°C, 1 min.), una vez.Cycle 1 (94 ° C, 1 min.), once.

b.b.

Ciclo 2 (94°C, 10 s; 63°C, 2 s; 72°C 10 s), repetir 30 vecesCycle 2 (94 ° C, 10 s; 63 ° C, 2 s; 72 ° C 10 s), repeat 30 times

c.c.

Ciclo 3 (72°C 1 min.); ejecutar una vez.Cycle 3 (72 ° C 1 min.); run once.

C. Visualización y cuantificación en termociladores con detección en tiempo realC. Visualization and quantification in thermocilators with real time detection

1.one.

Finalizada la reacción de amplificación registrar la curva de fusión en cada tubo registrando la señal medida por el instrumento (espectrofotométrica o fluorimétrica) frente a la temperatura.Finished the amplification reaction record the melting curve in each tube recording the signal measured by the instrument (spectrophotometric or fluorimetric) versus temperature.

2.two.

Calcular la derivada negativa de primer orden de la señal registrada frente a la temperatura.Calculate the negative first-order derivative of the signal registered against temperature.

3.3.

Establecer el valor máximo de señal para los dos picos obtenidos en cada muestra.Set value maximum signal for the two peaks obtained in each shows.

4.Four.

Comparar con los siguientes valores de corte aproximados:Compare with following approximate cut-off values:

a.to.

% (específico/control)< 20% homocigoto normal, ausencia de mutación.% (specific / control) <20% homozygous normal, absence of mutation.

b.b.

% (específico/control) entre 22 y 30% heterocigoto.% (specific / control) between 22 and 30% heterozygous.

c.c.

% (específico/control) >32 homocigoto para la mutación de 7 repeticiones.% (specific / control)> 32 homozygous for the mutation of 7 repetitions

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<110> UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA<110> UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<120> Diagnóstico molecular del Síndrome de Gilbert mediante una amplificación competitiva cuantitativa<120> Molecular diagnosis of the Syndrome Gilbert through a quantitative competitive amplification

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<130> Gilbert<130> Gilbert

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<150> P200001770<150> P200001770

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<151> 2000-07-17<151> 2000-07-17

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<160> 4<160> 4

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<170> PatentIn version 3.1<170> PatentIn version 3.1

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<210> 1<210> 1

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<211> 531<211> 531

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<300><300>

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<308> AF352795<308> AF352795

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<309> 2001-02-23<309> 2001-02-23

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<313> (279)..(295)<313> (279) .. (295)

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<400> 1<400> 1

2two

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<210> 2<210> 2

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<211> 24<211> 24

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<400> 2<400> 2

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

\dddseqskip

ctgctacctt tgtggactga cagc

\hfill

24

 \ dddseqskip 

ctgctacctt tgtggactga cagc

 \ hfill 

24

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<210> 3<210> 3

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<211> 33<211> 33

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<400> 3<400> 3

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

\dddseqskip

gccctctcct acttatatat atatatatat ggc

\hfill

33

 \ dddseqskip 

gccctctcct acttatatat atatatatat ggc

 \ hfill 

33

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<210> 4<210> 4

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<211> 20<211> 20

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<212> DNA<212> DNA

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

         \vskip1.000000\baselineskip\ vskip1.000000 \ baselineskip
      

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

<400> 4<400> 4

         \vskip0.333000\baselineskip\ vskip0.333000 \ baselineskip
      

\dddseqskip

acagccatgg cgcctttgct

\hfill

20

 \ dddseqskip 

acagccatgg cgcctttgct

 \ hfill 

twenty

Claims (1)

1. Método de detección de una mutación en el promotor del gen de la Bilirrubina UDP-glucuronosil transferasa, asociada con el síndrome de Gilbert1. Method of detecting a mutation in the Bilirubin gene promoter UDP-glucuronosyl transferase, associated with the Gilbert's syndrome caracterizado por characterized by

a)to)

Amplificación de un fragmento del promotor con la reacción en cadena de la polimerasa utilizando DNA genómico como diana y tres cebadores (SEQ.ID.No.2: 5'-ctgctacctttgtggactgacagc-3' ; SEQ.ID.No. 3: 5'-gccctctcctacttatatatatatatatatggc-3'; y SEQ.ID.No. 4: 5'-acagccatggcgcctttgct-3') que generan un producto específico para la mutación y otro no específico, que es utilizado como control interno de la reacción.Amplification of a promoter fragment with polymerase chain reaction using genomic DNA as a target and three primers (SEQ.ID.No.2: 5'-ctgctacctttgtggactgacagc-3 '; SEQ.ID.No. 3: 5'-gccctctcctacttatatatatatatatatggc-3 '; and SEQ.ID.No. 4: 5'-acagccatggcgcctttgct-3 ') that generate a specific product for the mutation and another not specific, which is used as internal control of the reaction.

b)b)

Los cebadores SEQ.ID.No. 3, específico para la mutación, y el cebador SEQ.ID.No. 4, hibridan en la misma cadena del DNA diana, distantes entre si para poder obtener, con el cebador SEQ.ID.No.2, dos productos diferenciables por su temperatura de fusión, o por su separación en geles de agarosa al 1 - 2%.The primers SEQ.ID.No. 3, specific for the mutation, and primer SEQ.ID.No. 4, hybridize on the same target DNA chain, distant from each other to obtain, with the primer SEQ.ID.No.2, two products differentiable by its melting temperature, or by its separation in 1-2% agarose gels.

c)c)

Los productos "específico" y "control" son el resultado de una competencia por el acoplamiento de la enzima polimerasa en las condiciones óptimas de la reacción: Temperatura de hibridación 63°C; concentración de cloruro magnésico 1.0 mM, 0.5 : U de enzima/20 \muL de reacción, cebadores SEQ.ID.No. 2 y 3 de 0.2 \muM cada uno; y cebador SEQ.ID.No. 4 a una concentración 0.1 \muM; con la presencia de dimetilsulfóxido y glicerol al 1% (v/v) cada uno.The products "specific" and "control" are the result of a competition for the coupling of the enzyme polymerase in the optimal reaction conditions: Hybridization temperature 63 ° C; 1.0 mM magnesium chloride concentration, 0.5: U of enzyme / 20 µL reaction, primers SEQ.ID.No. 2 and 3 of 0.2 µM each; and primer SEQ.ID.No. 4 at a concentration 0.1 µM; with the presence of dimethyl sulfoxide and 1% glycerol (v / v) each.

d)d)

Se establece la presencia de la mutación en una muestra en base a una cuantificación por densitometría o espectrofluorometría del producto específico para la mutación respecto del control interno de cada muestra.The presence of the mutation in a sample based on a quantification by densitometry or spectrofluorometry of specific product for mutation with respect to internal control of each sample.

e)and)

La asignación genotípica se establece por comparación con puntos de corte para el homocigoto normal, heterocigoto y homocigoto mutado.The assignment genotypic is established by comparison with cut-off points for the normal homozygous, heterozygous and mutated homozygous.