ES2176342T5 - Secuencias del genotipo 7 del virus de la hepatitis c y su utilizacion como agentes profilacticos, terapeuticos y de diagnosticos. - Google Patents
Secuencias del genotipo 7 del virus de la hepatitis c y su utilizacion como agentes profilacticos, terapeuticos y de diagnosticos. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS GENOMICOS Y A LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS CORRESPONDIENTES A LA REGION DE CODIFICACION DE ESTOS GENOMAS. LA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DE TIPOS Y SUBTIPOS DE HCV QUE SON DIFERENTES DE LAS SECUENCIAS DE TIPOS Y SUBTIPOS DE HCV CONOCIDAS. EN PARTICULAR, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DEL HCV TIPO 7, NUEVAS SECUENCIAS DEL HCV TIPO 9, NUEVAS SECUENCIAS DEL HCV TIPO 10 Y NUEVAS SECUENCIAS DEL HCV TIPO 11. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS DE LOS SUBTIPOS 1D, 1E, 1F Y 1G DEL HCV TIPO 1; NUEVAS SECUENCIAS DE LOS SUBTIPOS 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K Y 2L DEL HCV TIPO 2; NUEVAS SECUENCIAS DEL SUBTIPO 3G DEL HCV TIPO 3; NUEVAS SECUENCIAS DE LOS SUBTIPOS 4K, 4L Y 4M DEL HCV TIPO 4; A UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE LAS MISMAS Y A SU USO PARA DIAGNOSTICOS, PROFILAXIS Y TERAPIAS. EN PARTICULAR, EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN NUEVAS SECUENCIAS ESPECIFICAS PARA LOS TIPOSDE LAS REGIONES DEL NUCLEO, LAS REGIONES E1 Y LA NS5 DE NUEVOS HCV TIPO 7, 9, 10 Y 11, ASI COMO NUEVAS VARIANTES (SUBTIPOS) DE LOS HCV TIPO 1, 2, 3 Y 4. ESTAS SECUENCIAS NUEVAS DE HCV SON UTILES PARA DIAGNOSTICAR LA PRESENCIA GENOTIPOS O SEROTIPOS DEL HCV TIPO 1 Y/O TIPO 2 Y/O TIPO 3 Y/O TIPO 4 Y/O TIPO 7 Y/O TIPO 9 Y/O TIPO 10 Y/O TIPO 11 EN UNA MUESTRA BIOLOGICA. ADEMAS, LA DISPONIBILIDAD DE ESTAS NUEVAS SECUENCIAS ESPECIFICAS PARA LOS TIPOS PUEDE AUMENTAR LA SENSIBILIDAD GENERAL DE DETECCION DEL HCV Y DEBERIA DEMOSTRAR TAMBIEN SU UTILIDAD PARA FINES PROFILACTICOS Y TERAPEUTICOS.
Description
Secuencias del genotipo 7 del virus de la
hepatitis C y su utilización como agentes profilácticos,
terapéuticos y de diagnósticos.
La presente invención se refiere a nuevas
secuencias de genotipo 7 del virus de la hepatitis C (HCV) y a su
utilización como agentes profilácticos, terapéuticos y de
diagnóstico.
La presente invención se refiere a secuencias
genómicas de nucleótidos y secuencias de aminoácidos
correspondientes a la zona de codificación de estos genomas. La
invención se refiere a nuevas secuencias de tipos y subtipos que
son diferentes de las secuencias conocidas de tipos y subtipos de
HCV. Más particularmente, la presente invención se refiere a
secuencias del tipo 7 de HCV, un procedimiento para prepararlas y su
utilización para diagnóstico, profilaxis y terapia.
El problema técnico que subraya la presente
invención es proporcionar nuevas secuencias de HCV de los tipos y/o
subtipos de HCV desconocidos hasta ahora. Más particularmente, la
presente invención proporciona nuevas secuencias de tipo específico
de la parte central, de las zonas E1 y NS5 del nuevo tipo 7 del HCV.
Estas nuevas secuencias de HCV son útiles para diagnosticar la
presencia de genotipos o serotipos del tipo 7 del HCV en una
muestra biológica. Por otra parte, la disponibilidad de estas nuevas
secuencias de tipo específico puede aumentar la sensibilidad
general de la identificación del HCV y podrían demostrar así mismo
ser útiles con fines profilácticos y terapéuticos.
Se ha descubierto que los virus de la hepatitis
C (HCV) son la causa principal de hepatitis no-A y
no-B. Se han determinado las secuencias de los
clones de cADN que abarcan el genoma completo de cepas de varios
prototipos (Kato y otros, 1990; Choo y otros, 1991; Okamoto y
otros, 1991; Okamoto y otros, 1992). La comparación de estas cepas
demuestra que la variabilidad en las secuencias del nucleótido se
puede utilizar para distinguir por lo menos 2 genotipos diferentes,
tipo 1 (HCV-1 y HCV-J) y tipo 2
(HC-J6 y HC-J8), con una homología
media del 68% aproximadamente. Dentro de cada tipo, existen por lo
menos dos subtipos (p. ej. representados por HCV-1
y HCV-J), que presentan una homología media de
aproximadamente el 79%. Los genomas de HCV que pertenecen al mismo
subtipo muestran homologías medias de más del 90% (Okamoto y otros,
1992). Sin embargo, la secuencia parcial del nucleótido de la zona
NS5 de las cepas HCV-T presentó en su mayor parte
el 67% de homología con las secuencias publicadas anteriormente,
indicando la existencia de todavía otro tipo de HCV (Mori y otros,
1992). Se han publicado partes de la zona 5'
no-traducida (UR),de la parte central, de las zonas
de NS3 y NS5 de este tipo 3, estableciendo además distancias
evolutivas similares entre los 3 genotipos principales y sus
subtipos (Chan y otros, 1992). El tipo 4 se descubrió posteriormente
(Stuyver y otros, 1993b; Simmonds y otros, 1993a; Bukh y otros,
1993; Stuyver y otros, 1994b). Además de grupos del HCV del tipo 5
(Stuyver y otros, 1993c; Simmonds y otros, 1993c; Bukh y otros,
1993; Stuyver y otros, 1994b) y del tipo 6 (Bukh y otros, 1993;
Simmonds y otros, 1993c). En la Tabla 3 se da una panorámica del
estado actual de la técnica con relación a los genotipos del HCV.
El sistema de nomenclatura propuesto por los inventores de la
presente solicitud ha sido aceptado actualmente por científicos de
todo el mundo (Simmonds y otros, 1994).
El objetivo de la presente invención es
proporcionar unas nuevas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
del HCV que permitan la detección de la infección por HCV.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar unas nuevas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
del HCV que faciliten la clasificación de los fluidos biológicos
infectados en diferentes grupos serológicos.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar nuevas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del
HCV que mejoren la magnitud de la identificación general del
HCV.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar nuevas secuencias de HCV, útiles para el diseño de
composiciones de vacunas profilácticas o terapéuticas de HCV.
Otro objetivo de la presente invención es
proporcionar una composición farmacéutica que consiste en
anticuerpos producidos contra los polipéptidos codificados por estas
nuevas secuencias de HCV, para terapia o diagnóstico.
Todos los objetivos de la presente invención se
satisfacen a través de las siguientes formas de realización de la
presente invención.
La presente invención se refiere más
particularmente a un ácido polinucleico del HCV, que tiene una
secuencia de nucleótido que es exclusiva para un tipo o subtipo de
HCV no identificado en lo sucesivo, que es distinta de los subtipos
de HCV 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 4a, 4b,
4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 5a ó 6a, estando dichos subtipos de
HCV clasificados en la Tabla 3 por comparación de una parte de la
secuencia del nucleótido del gen NS5 que abarca la posiciones 7932 a
8271, mostrándose dicha numeración de aminoácidos en la Tabla 1 y
conteniendo dicho ácido polinucleico por lo menos un nucleótido
diferente a dichas secuencias conocidas de nucleótidos del HCV o de
su complemento. La secuencia de las cepas conocidas del HCV se
pueden observar en cualquier base de datos de secuencias de
nucleótidos conocidas en la materia (tal como, por ejemplo, en la
base de datos de EMBL).
\newpage
La presente invención se refiere también a un
ácido polinucleico que presenta una secuencia de nucleótidos que es
exclusiva por lo menos para uno de los subtipos 7a, 7c ó 7d de HCV,
estando dichos subtipos del HCV clasificados según se definió
anteriormente.
Se ha de indicar que la diferencia de
nucleótido(s) en los ácidos polinucleicos de la invención
puede implicar una diferencia de aminoácidos en las
correspondientes secuencias de aminoácidos codificadas por dichos
ácidos polinucleicos. Una composición según la presente invención
puede contener sólo secuencias de ácido polinucleico o secuencias
de ácido polinucleico mezcladas con cualquier excipiente conocido en
materia de diagnóstico, profilaxis o terapia.
Según una forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un ácido polinucleico que codifica
una poliproteína que comprende en su secuencia de aminoácidos por lo
menos uno de los restos de aminoácido siguientes:
A58, H70, Q71 ó N71, D106, I134, E135, E150,
K197, L235, A242, E260 ó K260, L293, 1300, S2646, V2642, Q2653,
H2656, K2663, A2667 ó V2667, D2677, I2707, A2709, F2730, L2746,
S2749 ó P2749, T2752 ó V2752, D2753 ó G2753,
estando dicha anotación compuesta por una letra
que representa el residuo de aminoácido de su código de una letra y
un número que representa la numeración del aminoácido según Kato y
otros (1980), como se muestra en la Tabla 1, o una parte de dicho
ácido polinucleico que es exclusiva del tipo 7 del HCV definido en
la Tabla 5 y que contiene por lo menos un nucleótido diferente de
las secuencias del nucleótido conocidas del HCV, o de su
complemento.
Cada uno de los residuos mencionados
anteriormente se pueden observar en la Figuras 2, 4 ó 6 que
presentan las nuevas secuencias de aminoácidos de la presente
invención alineadas con las secuencias conocidas de otros tipos o
subtipos del HCV para la zona central/E1.
Según otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un ácido polinucleico que codifica
una poliproteína del HCV que comprende en su secuencia de
aminoácidos por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada
de la lista siguiente:
- VRHQTGRTWAQ según los subtipos 7a y 7c
- (SEC ID nº 115)
- VRQNQGRTWAQ según el subtipo 7d
- (SEC ID nº 116)
- AHYTNKSGLYHL según el subtipo 7c
- (SEC ID nº 136)
- LNYANKSGLYHL según el subtipo 7d
- (SEC ID nº 137)
- VYEAETLILHL según el subtipo 7c
- (SEC ID nº 153)
- VYEANGMILHL según el subtipo 7d
- (SEC ID nº 154)
- VKXXNQSRCWVQA según el subtipo 7c
- (SEC ID nº 172)
- VKTGNLTKCWLSA según el subtipo 7d
- (SEC ID nº 173)
- VPNASTPVTG según el subtipo 7c
- (SEC ID nº 188)
- VQNASVSIRG según el subtipo 7d
- (SEC ID nº 189)
- RPRMHQVVQE según el subtipo 7c
- (SEC ID nº 205)
- RPRMYEIAQD según el subtipo 7d
- (SEC ID nº 206)
o una parte de dicho ácido polinucleico que es
exclusiva del tipo 7 del HCV según se definió en la Tabla 5 o en su
complemento.
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Utilizando el sistema LiPA no codificador de 5'
(Stuyver y otros, 1993) y un nuevo sistema LiPA de la parte central
que comprende sondas múltiples para los subtipos 1a, 1b, 1c, 2a, 2b
ó 2c procedentes de la zona del núcleo (Stuyver y otros, 1995),
seleccionaron muestras procedentes del Benelux, Camerún, Francia y
Vietnan debido a sus reactividades aberrantes (cepas CAM1078, FR2,
FR1, VN4, VN12, VN13 y NE98). Algunas muestras, junto con muchas
otras muestras, se secuenciaron como control para tipificación. Los
resultados del secuenciado, sin embargo, indicaron el
descubrimiento de nuevos subtipos (cepas BNL1, BNL2, BNL3, FR4,
BNL4, BNL5, BNL6, BNL7, BNL8, BNL9, BNL10, BNL11 y BNL12). Se
analizaron en el marco de la invención las secuencias del nucleótido
en zonas centrales y de E1 que no han sido todavía notificadas
anteriormente,. Las secuencias genómicas de las cepas subtipo 7a,
7c y 7d se publicaron por vez primera en la presente invención. Se
analizó así mismo la zona NS5B.
El termino "ácido polinucleico" se refiere
a una secuencia de un ácido nucleico de una o doble hélice que
puede contener por lo menos 8 nucleótidos contiguos en común con la
secuencia completa de nucleótidos. Un ácido polinucleico de más de
100 nucleótidos aproximadamente de longitud se refiere también con
frecuencia como un oligonucleótido. Un ácido polinucleico se puede
componer de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, nucleótidos
análogos o nucleótidos modificados o se puede haber adaptado con
fines terapéuticos. Un ácido polinucleico puede además comprender
un clon del cADN de doble hélice que se puede utilizar con fines de
clonación o para terapia in vivo o en profilaxis.
Los oligonucleótidos según la presente
invención, utilizados como cebadores o sondas además pueden contener
o estar compuestos por nucleótidos análogos tales como
fosforotioatos (Matsukura y otros, 1987), alquilfosforiatos (Miller
y otros, 1979) o péptidos de ácidos nucleicos (Nielsen y otros,
1991; Nielsen y otros, 1993) o pueden contener agentes
intercaladores (Asseline y otros, 1984).
Como la mayoría de las demás variaciones o
modificaciones introducidas en las secuencias originales de ADN de
la invención, estas variaciones necesitarán adaptaciones con
respecto a las condiciones en las que se debería utilizar el
oligonucleótido para conseguir la especificidad y sensibilidad
requeridas. Sin embargo, los resultados eventuales serán
esencialmente los mismos a los obtenidos con los oligonucleótidos
sin modificar.
La introducción de estas modificaciones puede
ser ventajosa para influir positivamente en las propiedades tales
como las cinéticas de hibridación, la reversibilidad de la formación
del híbrido, la estabilidad biológica de las moléculas de
oligonucleótido, etc.
Los ácidos polinucleicos de la invención pueden
estar comprendidos en una composición de cualquier clase. Dicha
composición puede ser para utilización de diagnóstico, terapéutica o
profiláctica.
La expresión "secuencias que son exclusivas
para un tipo o subtipo de HCV" se refiere a una secuencia que no
es compartida por ningún otro tipo o subtipo de HCV y se puede
utilizar por eso para identificar exclusivamente este tipo o
subtipo de HCV. La variabilidad de la secuencia se demuestra en la
presente invención entre los tipos y subtipos de HCV descubiertos
recientemente (véase Tabla 5) y los tipos y subtipos conocidos de
HCV (véase Tabla 3) y es por lo tanto a partir de estas zonas de
variabilidad de secuencias en particular que se pueden obtener
ácidos polinucleicos específicos de tipos o subtipos,
oligonucleótidos, polipéptidos y péptidos. El término
"específicos de tipos o subtipos" se refiere a que la secuencia
es exclusiva para este tipo o subtipo de HCV implicado.
La expresión "nucleótidos correspondientes
a" se refiere a nucleótidos que son homólogos o complementarios
a una secuencia de nucleótido indicada o a una zona dentro de una
secuencia de HCV específica.
El término "zona de codificación"
corresponde a la zona del genoma del HCV que codifica la
poliproteína del HCV. De hecho, comprende el genoma completo con
excepción de la zona 5' no traducida y de la zona 3' no
traducida.
El término "poliproteína del HCV" se
refiere a la poliproteína del HCV de la cepa HCV-J
(Kato y otros, 1990). El resto de adenina en la posición 330 (Kato
y otros, 1990) es el primer resto del codón ATG que inicia la larga
poliproteína del HCV de 3010 aminoácidos en las cepas
HCV-J y de otro tipo 1b y de 3011 aminoácidos en
cepas de HCV-1 y de otro tipo 1a y de 3033
aminoácidos en las cepas HC-J6 y
HC-J8 del tipo 2 (Okamoto y otros, 1992).
Esta adenina se designa a la posición 1, a nivel
del ácido nucleico y esta metionina se designa a la posición 1, a
nivel del aminoácido, en la presente invención. Como las cepas del
tipo 1a contienen 1 aminoácido extra en la zona NS5A, las
secuencias de codificación del tipo 1a y 1b tienen idéntica
numeración en la zona central, de E1, de NS3 y de NS4 pero difieren
en la zona NS5B como se indica en la Tabla 1. Las cepas del tipo 2
tienen 4 aminoácidos más en la zona E2 y 17 ó 18 aminoácidos más en
la zona NS5 comparadas con las cepas de tipo 1 y se diferenciarán
en la numeración de las cepas del tipo 1 en la zona NS3/4 y en las
zonas NS5b según se indica en la Tabla 1. Inserciones similares
comparadas con el tipo 1 (pero de diferente tamaño) se pueden
observar también en las secuencias del tipo 3a que afectan a la
numeración de los aminoácidos del tipo 3a de acuerdo con esto.
Otras inserciones o eliminaciones se pueden observar fácilmente en
las secuencias de tipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 después
de la alineación con secuencias conocidas del HCV.
- Tabla 1:
- Comparación del sistema de numeración de nucleótidos y aminoácidos del HCV utilizado en la presente invención (*) con la numeración utilizada para otras cepas del prototipo. Por ejemplo, 8352/8564 indica la zona designada por la numeración desde el nucleótido 8352 al nucleótido 8564, descrita por Kato y otros (1990). Ya que el sistema de numeración de la presente invención empieza en el sitio de inicio de la poliproteína, los 329 nucleótidos de la zona 5' sin traducir descritos por Kato y otros (1990) se han de sustraer y la zona correspondiente se numera desde el nucleótido 8023 ("8352-329") hasta el 8325 ("8564-329").
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El término "genotipo" utilizado en la
presente invención se refiere a ambos tipos y/o subtipos.
El término "tipo de HCV" corresponde a un
grupo de cepas de HCV de las que el genoma completo presenta más
del 73% , preferentemente más del 74% de homología a nivel del ácido
nucleico, o del que la zona NS5 entre las posiciones de nucleótidos
7932 y 8271 muestran más del 75,4% de homología a nivel del ácido
nucleico, o que la poliproteína completa del HCV muestra más del
78% de homología a nivel de aminoácidos, o del que la zona NS5
entre aminoácidos en las posiciones 2645 y 2757 muestran más del 80%
de homología al nivel de aminoácidos, en poliproteínas de las demás
cepas del grupo, comenzando con dicha numeración en el primer codón
ATG o en la primera metionina de la larga poliproteína del HCV de la
cepa HCV-J (Kato y otros, 1990). Las cepas que
pertenecen a diferentes tipos de HCV presentan homologías, en todo
el genoma completo, de menos del 74%, preferentemente menos del
73%, al nivel del ácido nucleico y menos del 78% al nivel de
aminoácidos. Las cepas que pertenecen al mismo tipo generalmente
presentan homologías de aproximadamente el 90 al 99% al nivel del
ácido nucleico y del 95 al 96% al nivel de aminoácidos cuando
pertenecen al mismo subtipo, y los que pertenecen al mismo tipo
pero diferentes subtipos presentan homologías preferentemente de
aproximadamente el 76% al 82% (más particularmente de
aproximadamente el 77% al 80%) al nivel del ácido nucleico y del 85%
al 86% al nivel de aminoácido.
Más preferentemente la definición de los tipos
de HCV se concluye a partir de la clasificación de las cepas de HCV
según sus distancias al nucleótido calculadas como de detalla a
continuación:
- (1)
- basado en el análisis filogenético de las secuencias del ácido nucleico en la zona NS5B entre los nucleótidos 7935 y 8274 (Choo y otros, 1991) ó 8261 y 8600 (Kato y otros, 1990) ó 8342 y 8681 (Okamoto y otros, 1991), las cepas que pertenecen al mismo tipo de HCV presentan distancias menores de 0,34, típicamente menores de 0,33, y más típicamente menores de 0,32, y las cepas que pertenecen al mismo subtipo presentan distancias de nucleótido de menos de 0,135, frecuentemente de menos de 0,13 y con más frecuencia de menos de 0,125, variando frecuentemente entre 0,0003 y 0,1151 y por consiguiente las cepas que pertenecen al mismo tipo, pero a diferentes subtipos presentan distancias de nucleótido que varían desde 0,135 a 0,34, variando con frecuencia desde 0,1384 a 0,2977 y con más frecuencia variando de 0,15 a 0,32 y las cepas que pertenecen a diferentes tipos de HCV presentan distancias de nucleótido mayores de 0,34, con frecuencia mayores de 0,35 y más frecuentemente mayores de 0,358, variando con más frecuencia de 0,3581 a 0,6670.
- (2)
- basado en el análisis filogenético de las secuencias del ácido nucleico en la zona E1 de la parte central entre los nucleótidos 378 y 957, las cepas que pertenecen al mismo tipo de HCV presentan distancias de nucleótido de menos de 0,38, frecuentemente de menos de 0,37 y con más frecuencia de menos de 0,364, y las cepas que pertenecen al mismo subtipo presentan distancias de nucleótido menores de 0,17, con frecuencia menores de 0,16 y con más frecuencia menores de 0,15, más frecuentemente menores de 0,135, más frecuentemente menores de 0,134, y por consiguiente las cepas que pertenecen al mismo tipo pero a diferentes subtipos presentan distancias de nucleótido que varían de 0,15 a 0,38, variando frecuentemente de 0,16 a 0,37, y variando con más frecuencia de 0,17 a 0,36, variando más frecuentemente de 0,133 a 0,379, y las cepas que pertenecen a diferentes tipos de HCV presentan distancias de nucleótido mayores de 0,34, 0,35, 0,36, frecuentemente de más de 0,365 y con mayor frecuencia mayores de 0,37.
\vskip1.000000\baselineskip
En un análisis filogenético comparativo de
secuencias disponibles, se calcularon los intervalos de las
distancias moleculares evolutivas para diferentes formas del
genoma, basadas en 19.781 comparaciones de parejas mediante el
programa DNADIST del paquete PHYLIP versión 3.5c (Felsenstein, 1993)
de interferencia de filogenia. Los resultados se muestran en la
Tabla 2 e indican que aunque la mayoría de las distancias obtenidas
en cada zona están de acuerdo con la clasificación de una cepa
determinada, solamente los intervalos obtenidos en la zona 340bp
NS5B no se solapan y por consiguiente son concluyentes. Sin embargo,
como se realizó en la presente invención, es preferible obtener la
información de la secuencia de por lo menos 2 zonas antes de la
clasificación final de una cepa dada.
La designación de un número para los diferentes
tipos de HCV y la nomenclatura del HCV se basa en el descubrimiento
cronológico de diferentes tipos. El sistema de numeración utilizado
en la presente invención puede fluctuar todavía según acuerdos o
pautas internacionales. Por ejemplo, el "tipo 4" se debería
cambiar por el "tipo 5" o el "tipo 6". Así mismo las
distancias en al límite elegidas arbitrariamente entre los tipos,
subtipos y las cepas pueden estar todavía sujetos a cambios según
pautas o acuerdos internacionales. Por consiguiente los tipos 7a,
8a, 8b y 9a pueden por ejemplo denominarse 6b, 6c, 6d y 6d en el
futuro; y el tipo 10a que presenta afinidad con el genotipo 3 se
puede indicar 3g en lugar de 10a.
El término "subtipo" corresponde a un grupo
de cepas del HCV del que la poliproteína completa presenta una
homología de más del 90% a los niveles de ácido nucleico y de
aminoácido, o de la zona NS5 entre las posiciones del nucleótido.
7932 y 8271 muestran una homología de más del 90% a nivel del ácido
nucleico en las partes correspondientes de los genomas de las demás
cepas del mismo grupo, comenzando con dicha numeración con el resto
de adenina del codón de iniciación de la poliproteína del HCV. Las
cepas que pertenecen al mismo tipo pero a diferentes subtipos de
HCV presentan homologías de más del 74% al nivel de ácido nucleico y
más 78% a nivel del aminoácido.
Se ha de entender que las zonas extremadamente
variables tales como las zonas E1, E2 y NS4 presentarán homologías
inferiores que la homología media del genoma completo de la
poliproteína.
Utilizando este criterio, se pueden clasificar
las cepas de HCV en por lo menos 11 tipos. Se pueden distinguir
claramente varios subtipos en los tipos 1, 2, 3, 4 y 7: 1a, 1b, 1c,
1d, 1e, 1f, 1g, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 2k, 2l, 3a, 3b,
3c, 3d, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 4m,
7a, 7c y 7d basados en homologías de UR 5' y en las zonas de
codificación. En la Tabla 3 se presenta una panorámica de la
mayoría de las cepas publicadas y su clasificación propuesta según
el sistema de tipificación de la presente invención así como de
otras clasificaciones propuestas.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "complemento" se refiere a una
secuencia de nucleótido que es complementaria de una secuencia
indicada y que es capaz de hibridar a las secuencias indicadas.
\newpage
La composición de la invención puede comprender
muchas combinaciones. A modo de ejemplo, la composición de la
invención puede comprender:
- dos (o más) ácidos nucleicos de la misma zona
o,
- dos ácidos nucleicos (o más), de diferentes
zonas respectivamente, para la misma cepa o para cepas
diferentes,
- o ácidos nucleicos de las mismas zonas y de
por lo menos dos zonas diferentes (para la misma cepa o para
diferentes cepas).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere particularmente
a un ácido polinucleico definido anteriormente que tiene una
secuencia seleccionada de cualquiera de SEC ID nº 43, 45, 47, 89,
91, 93 ó una parte de dicho ácido polinucleico que es exclusivo para
el tipo 7 del HCV como se definió en la Tabla 5, o su
complemento.
La presente invención se refiere más
particularmente a un ácido polinucleico definido anteriormente, que
codifica las zonas de 5' UR,de la parte central/E1, de la NS4 o de
la NS5B o una parte de ellas.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a un ácido polinucleico definido anteriormente que presenta
una secuencia de cADN.
Las variantes de la secuencia de los ácidos
polinucleicos también están incluidas en la presente invención
seleccionadas de entre cualquiera de las secuencias del nucleótido
dadas en cualquiera de los números de SEC ID dados anteriormente
con dichas variantes de secuencia que contienen la eliminación y/o
las inserciones de uno o más nucleótidos, especialmente las
inserciones o eliminaciones de 1 ó más codones, principalmente en
los extremos de los oligonucleótidos (3' ó 5'), o las sustituciones
de algunos nucleótidos no esenciales (es decir, nucleótidos no
esenciales para discriminar entre diferentes genotipos de HCV) por
otros (que comprenden nucleótidos modificados y/o inosina), por
ejemplo, una secuencia de tipo 1 ó 2 se puede modificar en una
secuencia de tipo 7 sustituyendo algunos nucleótidos de la
secuencia de tipo 1 ó 2 con nucleótidos de tipo específico del tipo
7 mostrados por ejemplo en las Figuras 1 y 2.
Las variantes de ácidos polinucleicos preferidos
particularmente de la presente invención comprenden además
secuencias que presentan un alto grado de homología (similitud) con
cualesquiera de los ácidos polinucleicos de la invención descritos
anteriormente. Particularmente las secuencias que son por lo menos
el 80%, 85%, 90%, 95% o más homólogas a dichas secuencias de ácido
polinucleico de la invención. Preferentemente dichas secuencias que
presentan variación menor del del 20%, 15%, 10% ó 5% de los
nucleótidos originales de dicha secuencia de ácido polinucleico.
Las secuencias de ácido polinucleico según la
presente invención que son homólogas a la secuencias representadas
por una SEC ID nº se pueden caracterizar y aislar según cualquiera
de las técnicas conocidas en la materia, tales como la
amplificación mediante cebadores específicos de secuencia,
hibridación con sondas específicas de secuencia en condiciones más
o menos severas, procedimientos de detección serológica o vía
sistema de tipificación LiPA.
Otras variantes preferidas de ácidos
polinucleicos de la presente invención comprenden secuencias que son
redundantes como resultado de la degeneración del código genético
comparadas con cualesquiera de los ácidos polinucleicos de la
presente invención dados anteriormente. Estas secuencias variantes
de ácido polinucleico codificarán de este modo la misma secuencia
de aminoácidos ya que los ácidos polinucleicos proceden de
ellos.
Así mismo se incluyen dentro del alcance de la
presente invención las secuencias de la zona 5' no codificadora
que se pueden obtener fácilmente a partir de las cepas tipo 7
subtipo 7a, 7c ó 7d descritas en esta memoria. Dichas secuencias
pueden contener motivos específicos del tipo o subtipo que se pueden
emplear para análisis de hibridación específica del tipo y/o
subtipo, p. ej. tales como las descritas por Stuyver y otros
(1993).
Las secuencias del ácido polinucleico de los
genomas indicados anteriormente de las zonas no descritas todavía
en los presentes ejemplos, el listado de las figuras y de la
secuencia se pueden conseguir mediante cualquiera de las técnicas
conocidas en la materia, tales como las técnicas de amplificación
que utilizan cebadores adecuados de las secuencias de estos nuevos
genomas dados en la Figura 1 de la presente invención.
La presente invención también se refiere a un
cebador de oligonucleótido que comprende parte de un ácido
polinucleico definido anteriormente, siendo dicho cebador capaz de
actuar como cebador para los ácidos nucleicos del tipo 7 del HCV
específicamente ampliador.
El término "cebador" se refiere a una
secuencia de oligonucleótido de ADN de una hélice capaz de actuar
como un punto de inicio para la síntesis de un producto de
amplificación del cebador complementario de la hélice del ácido
nucleico a copiar. La longitud y la secuencia del cebador debe ser
tal que permita al cebador la síntesis de producto de
amplificación. Preferentemente el cebador es aproximadamente de 5 a
50 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerán de
la complejidad de los objetivos del ADN o del ARN necesarios, así
como de las condiciones de utilización del cebador tales como la
temperatura y la fuerza iónica.
El hecho de que los cebadores de amplificación
no tengan que ser exactamente iguales a la secuencia de la plantilla
correspondiente para garantizar la propia amplificación se documenta
ampliamente en la bibliografía (Kwok y otros, 1990).
El procedimiento de amplificación utilizado
puede ser la reacción en cadena de polimerasa (PCR; Saiki y otros,
1988), la reacción en cadena de la ligasa (LCR; Landgren y otros,
1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), la amplificación
basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA; Guatelli y otros,
1990; Compton, 1991), el sistema de amplificación basado en la
transcripción (TAS; Kwoh y otros, 1989), la amplificación del
desplazamiento de la hélice (SDA; Duck, 1990; Walker y otros, 1992)
o la amplificación mediante Q\beta replicasa (Lizardi y otros,
1988; Lomeli y otros, 1989) o cualquier otro procedimiento adecuado
para amplificar las moléculas de ácido nucleico utilizando la
extensión del cebador. Durante la amplificación, los productos
amplificados se pueden marcar convenientemente bien utilizando
cebadores marcados o incorporando nucleótidos marcados. Los
marcadores pueden ser isotópicos (^{32}P, ^{35}S, etc.) o no
isotópicos (biotina, digoxigenina, etc.). La reacción de
amplificación se repite entre 20 y 70 veces, ventajosamente entre 25
y 45 veces.
La presente invención así mismo se refiere a una
sonda de oligonucleótido que comprende parte de un ácido
polinucleico definido anteriormente, siendo dicha sonda capaz de
actuar como sonda de hibridación para detección específica y/o
clasificación en tipos y/o subtipos de un ácido nucleico del HCV que
contiene dicha secuencia de nucleótido, estando dicha sonda marcada
o unida a un sustrato sólido.
El término "sonda" se refiere a
oligonucleótidos específicos de secuencia de una sola hélice que
presentan una secuencia que es complementaria de la secuencia
objetivo de el/los genotipo(s) del HCV a detectar.
Preferentemente, estas sondas son
aproximadamente de 5 a 50 nucleótidos de longitud, más
preferentemente de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos.
El término "soporte sólido" se puede
referir a cualquier sustrato al que se pueda acoplar una sonda de
oligonucleótido, con la condición de que mantenga sus propiedades
de hibridación y con la condición de que el nivel de fondo de
hibridación se mantenga bajo. Con frecuencia el sustrato sólido será
una placa de microvaloración, una membrana (p. ej. nylón o
nitrocelulosa) o microesferas (lecho). Antes de la aplicación a la
membrana o fijación puede ser conveniente modificar la sonda de
ácido nucleico para facilitar la fijación o mejorar la eficacia de
hibridación. Dichas modificaciones pueden abarcar la terminación del
homopolímero, el acoplamiento con diferentes grupos reactivos tales
como los grupos alifáticos, grupos NH_{2}, grupos SH, grupos
carboxílicos o acoplamiento con biotina o haptenos.
La presente invención también se refiere a un
equipo de diagnóstico para utilización en la determinación del
genotipo del HCV, comprendiendo dicho equipo un cebador definido
anteriormente.
La presente invención se refiere también a un
equipo de diagnóstico para utilización en la determinación del
genotipo del HCV, comprendiendo dicho equipo una sonda definida
anteriormente.
La presente invención se refiere también a un
equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que
dicha(s) sonda(s) está(n) unida(s) a un
sustrato sólido.
La presente invención se refiere también a un
equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que un intervalo
de dichas sondas está unido a posiciones específicas sobre un
sustrato sólido.
La presente invención se refiere también a un
equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que dicho
soporte sólido es una tira de membrana y dichas sondas están
acopladas a la membrana en forma de líneas paralelas.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la identificación de los ácidos nucleicos del HCV
presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i) la extracción del ácido nucleico de la
muestra, si es posible
(ii) la amplificación del ácido nucleico con un
cebador por lo menos definido anteriormente,
(iii) la identificación de los ácidos nucleicos
amplificados.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la identificación de los ácidos nucleicos del HCV
presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i) la extracción del ácido nucleico de la
muestra, si es posible
(ii) la amplificación del ácido nucleico, si es
posible, con un cebador por lo menos definido anteriormente, o con
un cebador universal del HCV,
\newpage
(iii) la hibridación de los ácidos nucleicos de
la muestra biológica, si es posible en condiciones desnaturalizadas,
en condiciones apropiadas con una o más sondas definidas
anteriormente, estando dichas sondas preferentemente unidas a un
sustrato sólido,
(iv) el lavado en condiciones apropiadas, si es
posible
(v) la identificación de los híbridos
formados.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la identificación de la presencia de uno o más
genotipos del HCV presentes en la muestra biológica, que
comprende:
(i) la extracción del ácido nucleico de la
muestra, si es posible
(ii) específicamente la amplificación del ácido
nucleico con un cebador por lo menos definido anteriormente,
(iii) la identificación de dichos ácidos
nucleicos amplificados.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la identificación de la presencia de uno o más
genotipos del HCV presentes en una muestra biológica, que
comprende:
(i) la extracción del ácido nucleico de la
muestra, si es posible
(ii) si es posible, la amplificación del ácido
nucleico con un cebador por lo menos definido anteriormente o con
un cebador universal del HCV,
(iii) la hibridación de los ácidos nucleicos de
la muestra biológica, si es posible en condiciones desnaturalizadas,
en condiciones apropiadas con una o más sondas definidas
anteriormente, estando dichas sondas preferentemente unidas a un
sustrato sólido,
(iv) el lavado en condiciones apropiadas, si es
posible
(v) identificación de los híbridos formados,
(vi) deducción de la presencia de uno o más
genotipos del HCV presentes del modelo de hibridación observado.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere también a un
procedimiento definido anteriormente, en el que dichas sondas se
caracterizan además según se definió anteriormente.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento definido anteriormente, en el que dichos ácidos
nucleicos están marcados durante o después de la amplificación.
Preferentemente, esta técnica se podría realizar
en la zona 5' no codificadora, de la parte central o de la NS5B.
El término "ácido nucleico" se puede
también referir a una hélice del analito y corresponde a una
molécula de ácido nucleico de una o de doble hélice. Está hélice del
analito es preferentemente un ARN, cADN o un cADN amplificado con
hélice positiva o negativa.
El término "muestra biológica" se refiere a
cualquier muestra biológica (tejido o fluido) que contenga
secuencias de ácido nucleico del HCV y se refiere más
particularmente a muestras de suero o de plasma sanguíneos.
El término "cebador universal del HCV" se
refiere a secuencias complementarias de oligonucleótido de
cualquiera de las zonas conservadas del genoma del HCV.
La expresión hibridación "apropiada" y las
condiciones de lavado se han de entender como severas y son
generalmente conocidas en la materia (p. ej. Maniatis y otros,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982).
Sin embargo, según la solución de hibridación
(SSC, SSPE, etc.), estás sondas se deberían hibridar a su
temperatura apropiada para alcanzar suficiente especifidad.
El término "marcado" se refiere a la
utilización de ácidos nucleicos marcados. Éste puede comprender la
utilización de nucleótidos incorporados mediante la etapa de
amplificación de la polimerasa tal como ilustra Saiki y otros (1988)
o Bej y otros (1990) o cebadores marcados, o mediante cualquier otro
procedimiento conocido por los expertos en la materia.
El procedimiento de la invención comprende las
etapas de contacto de cualquiera de las sondas definidas
anteriormente, con uno de los siguientes elementos:
- -
- una muestra biológica en la que los ácidos nucleicos están disponibles para hibridación,
- -
- o los ácidos nucleicos purificados contenidos en la muestra biológica,
- -
- o una única copia procedente de los ácidos nucleicos purificados,
- -
- o una copia amplificada procedente de los ácidos nucleicos purificados, estando dichos elementos o dichas sondas unidos a un sustrato sólido.
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La expresión "deduciendo la presencia de uno o
más genotipos del HCV presentes en el modelo de hibridación
observado" se refiere a la identificación de la presencia de
genomas en la muestra analizando el modelo de enlace de un panel de
sondas de oligonucleótido. Las sondas individuales pueden
proporcionar información útil concerniente a la presencia o
ausencia de genomas del HCV en una muestra. Por otra parte, la
variación de los genomas del HCV está dispersada en la naturaleza,
por eso con poca frecuencia alguna sonda es capaz de identificar
únicamente un genoma específico del HCV. Además, la identidad de un
genotipo del HCV se puede deducir del modelo de unión de un panel
de sondas de oligonucleótido, que son específicas para (diferentes)
segmentos de los diferentes genomas del HCV. Dependiendo de la
elección de estas sondas de oligonucleótido, cada genotipo conocido
del HCV corresponderá a un modelo de hibridación específico en la
utilización de una combinación específica de sondas. Cada genotipo
del HCV será capaz además de ser discriminado por cualquier otro
genotipo del HCV amplificado con los mismos cebadores, dependiendo
de la elección de las sondas de oligonucleótido. La comparación de
los modelos generados o de las sondas definitivamente de hibridación
para una muestra que contiene una o más secuencias desconocidas del
HCV en un esquema de modelos de hibridación esperados, permite a
uno deducir claramente los genotipos del HCV presentes en dicha
muestra.
La presente invención se refiere de este modo a
un procedimiento definido anteriormente, en el que una o más sondas
de hibridación se seleccionan de entre cualquiera de las SEC ID nº
43, 45, 47, 89, 91, 93, o variantes de la secuencia de éstas
definidas anteriormente.
Para distinguir los genomas del HCV amplificados
de otros, los ácidos polinucleicos objetivo se hibridan con una
serie de sondas de ADN de secuencia especifica que se dirigen a las
zonas genotípicas del HCV (zonas exclusivas) localizadas en los
ácidos polinucleicos del HCV.
La mayoría de estas sondas se dirigen a la
mayoría de las zonas de tipo o subtipo específicos de los genotipos
del HCV, pero algunas pueden estar motivadas para hibridar a más de
un genotipo del HCV.
Según la solución de hibridación (SSC, SSPE,
etc.), estas sondas deberían estar severamente hibridadas a su
temperatura apropiada para alcanzar suficiente especifidad. Sin
embargo, modificando ligeramente las sondas de ADN, bien añadiendo
o borrando uno o unos pocos nucleótidos en sus extremos (3' ó 5'), o
sustituyendo algunos nucleótidos no esenciales (es decir,
nucleótidos no esenciales para discriminar entre tipos) por otros
(incluyendo nucleótidos modificados o inosina) estas sondas o sus
variantes pueden estar motivadas para hibridar específicamente en
las mismas condiciones de hibridación (es decir la misma temperatura
y la misma solución de hibridación). También puede ser beneficioso
cambiar la cantidad (concentración) de la sonda utilizada para
obtener más resultados de hibridación específica. Debería indicarse
en este contexto, que las sondas de la misma longitud, respecto a
su contenido de GC, se hibridarán específicamente aproximadamente a
la misma temperatura en soluciones de TMACI (Jacobs y otros,
1988).
Los procedimientos de análisis adecuados para
los objetivos de la presente invención para detectar los hibridos
formados entre la sondas de oligonucleótidos y las secuencias de
ácido nucleico en una muestra puede comprender cualesquiera de los
formatos de análisis conocidos en la materia, tal como el formato
convencional de manchas puntuales, la hibridación en
sándwich o hibridación inversa. Por ejemplo, la
identificación se puede realizar utilizando un formato de manchas
puntuales, estando unida a una membrana la muestra amplificada sin
marcar, estando incorporada la membrana a una sonda marcada por lo
menos en condiciones adecuadas de hibridación y de lavado, y estando
controlada la presencia de la sonda de enlace.
Un procedimiento alternativo y preferido es un
formato de manchas puntuales, en el que la secuencia amplificada
contiene una marca. En esta formato, las sondas de oligonucleótido
sin marcar se unen a un soporte sólido y se exponen a la muestra
marcada en condiciones de hibridación severa apropiada y posterior
lavado. Se debe entender que se puede utilizar también cualquier
otro procedimiento de análisis que cuente con la formación de un
híbrido entre los ácidos nucleicos de la muestra y las sondas de
oligonucleótidos según la presente invención.
Según una forma de realización ventajosa, el
procedimiento para identificar uno o más genotipos del HCV
contenidos en una muestra biológica comprende las etapas de puesta
en contacto de las copias amplificadas del ácido nucleico del HCV
procedentes de la muestra biológica, con sondas de oligonucleótido
que han sido inmovilizadas como líneas paralelas en un soporte
sólido.
Según este procedimiento ventajoso, las sondas
se inmovilizan en un formato de análisis de sonda de línea (LiPA).
Este es un formato de hibridación inversa (Saiki y otros, 1989) que
utilizan tiras de membrana en las diversas sondas (oligonucleótidos
de control positivo o negativo inclusive) que se pueden aplicar
convencionalmente como líneas paralelas.
La invención se refiere también de este modo a
un soporte sólido, preferentemente una tira de membrana, que lleva
en su superficie, una o más sondas definidas anteriormente,
acopladas al soporte en forma de líneas paralelas.
El LiPA es una prueba de hibridación muy rápida
y de utilización fácil. Los resultados se pueden leer después de 4
horas después del inicio de la amplificación. Después de la
amplificación durante la que generalmente se incorpora una marca no
isotópica en el producto no amplificado, y de la desnaturalización
alcalina, el producto amplificado se pone en contacto con las
sondas en la membrana y se realiza la hibridación durante 1 a 1,5 h
aproximadamente, se detecta el ácido polinucleico hibridado. Del
modelo de hibridación generado, se puede deducir visualmente el
tipo de HCV, pero utilizando preferentemente software
dedicado. El formato LiPA es totalmente compatible con los equipos
de detección disponibles en el comercio, dando de este modo una
interpretación automática muy fiable de los resultados. Todas estas
ventajas hacen al formato LiPA capaz para la utilización de la
detección del HCV en una situación de rutina. El formato LiPA sería
particularmente ventajoso para detectar la presencia de diferentes
genotipos
de HCV.
de HCV.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para detectar e identificar nuevos genotipos de HCV,
diferentes de los genomas conocidos del HCV, que comprenden las
etapas de:
- determinar a qué genotipo de HCV pertenecen
los nucleótidos presentes en una muestra biológica, según el
procedimiento definido anteriormente,
- secuenciado de la porción de la secuencia del
genoma del HCV correspondiente a la sonda hibridante aberrantemente
del nuevo genotipo a determinar, en el caso de observar una muestra
que no genera un modelo de hibridación compatible con los definidos
en la Tabla 3.
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La presente invención se refiere además a un
procedimiento para preparar un ácido polinucleico según la presente
invención. Estos procedimientos incluyen cualquier procedimiento
conocido en la materia para preparar ácidos polinucleicos (p. ej.
el procedimiento del fosfodiéster para sintetizar oligonucleótidos
según describe Agarwal y otros,1972, Agnew. Chem. Int., Ed.
Engl. 11:451, el procedimiento fosfotriéster de Hsiung y otros,
1979, Nucleic Acid Res. 6:1371, o el procedimiento de
dietilfosforamidita automatizado de Beaucage y otros, 1981,
Tetrahedron Letters 22:1859 a 1862.). Por otra parte, los
ácidos polinucleicos de la presente invención pueden ser aislados
de fragmentos de ADN o ARN naturales o clonados. Además, los
oligonucleótidos según la presente invención se pueden sintetizar
automáticamente en instrumentos comerciales vendidos por una
variedad de fabricantes.
La presente invención se refiere además
particularmente a un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos codificada por un ácido polinucleico según se definió
anteriormente, o una parte de éste que es exclusiva para el tipo 7
del HCV definido en la Tabla 5, o un análogo de éste que es
sustancialmente homólogo y biológicamente equivalente, según se
define en la reivindicación 23.
El término "polipéptido" se refiere a un
polímero de aminoácidos y no hace referencia a una longitud
específica del producto; de este modo, péptidos, oligopéptidos y
proteínas están comprendidos dentro de la definición de
polipéptido. Este término tampoco se refiere o excluye
modificaciones post-expresión del polipéptido, por
ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y
similares. Comprendidos dentro de la definición están, por ejemplo,
los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido
(incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, PNA, etc.),
polipéptidos con conexiones sustituidas, además de otras
modificaciones conocidas en la materia que tienen lugar o no en la
naturaleza.
Al término "exclusivo" se hizo referencia
anteriormente.
"Biológicamente equivalente" según se
utiliza en toda la memoria y las reivindicaciones, significa que las
composiciones son inmunológicamente equivalentes a las proteínas
(polipéptidos) o péptidos de la invención definidas anteriormente y
más adelante.
"Sustancialmente homólogo" según se utiliza
en toda la memoria subsiguiente y en las reivindicaciones para
describir proteínas y péptidos, significa un grado de homología en
la secuencia de aminoácidos para las proteínas o péptidos de la
invención. Preferentemente el grado de homología es superior a 90,
preferentemente superior a 95, siendo para un grupo de proteínas
preferidas particularmente superior a 99, homólogo con las proteínas
o péptidos de la
invención.
invención.
El término "análogo" según se utiliza en
toda la memoria o en las reivindicaciones, para describir proteínas
y péptidos de la presente invención, comprende cualquier proteína o
péptido que tenga una secuencia de restos de aminoácidos
sustancialmente idéntica a una secuencia específicamente mostrada en
esta memoria en la que uno o más restos han sido sustituidos
conservadoramente por un resto biológicamente equivalente. Ejemplos
de sustituciones conservadoras comprenden la sustitución de un resto
unipolar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina o
metionina por otro, la sustitución del resto unipolar (hidrófilo)
por otro tal como arginina o lisina, glutamina o asparagina,
glicina o serina, la sustitución de un resto básico tal como lisina,
histidina o arginina por otro, o la sustitución de un resto ácido,
tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro. En la Tabla 4
se pueden encontrar ejemplos de mutaciones admisibles según la
presente invención.
La frase "sustitución conservadora"
comprende también la utilización de un resto derivado químicamente
en lugar de un resto no derivado con la condición de que la proteína
o péptido resultante sea biológicamente equivalente a la proteína o
péptido de la invención.
"Derivado químico" se refiere a una
proteína o un péptido que tiene uno o más restos derivados
químicamente mediante reacción de un grupo funcional secundario.
Ejemplos de dichas moléculas derivadas comprenden, pero no se
limitan a, las moléculas en las que los grupos amino libres se han
derivado para formar cloruros de amina, grupos
p-toluensulfonil, grupos carbobenzoxi, grupos
terc-butoxicarbonil, grupos cloracetil o grupos
formil. Los grupos carboxil libres se pueden derivar para formar
sales, metil y etil ésteres u otros tipos de ésteres o hidrazidas.
Los grupos hidroxil libres se pueden derivar para formar derivados
de O-acil o de O-alquil. El
imidazol nitrógeno de histidina se puede derivar para formar
N-imbenzilhistidina. También están comprendidos
como derivados químicos las proteínas o péptidos que contienen uno o
más derivados de aminoácidos naturales y de los veinte aminoácidos
típicos. Por ejemplo: 4-hidroxiprolina se puede
sustituir por prolina; 5-hidroxilisina se puede
sustituir por lisina; 3-metilhistidina se puede
sustituir por histidina; homoserina se puede sustituir por serina y
ornitina se puede sustituir por lisina. Las proteínas o péptidos de
la presente invención también comprenden cualquier proteína o
péptido que tenga una o más adiciones y/o eliminaciones o restos
relativos a la secuencia de un péptido cuya secuencia se muestra en
esta memoria, con tal que el péptido sea biológicamente equivalente
a las proteínas o péptidos de la invención.
Obsérvese que, en el nivel de la secuencia
aminoácido, por lo menos un aminoácido diferente (con respecto a
secuencias conocidas de aminoácidos del HCV) es suficiente para
formar parte de la invención, lo que significa que los polipéptidos
de la invención corresponden a ácidos polinucleicos que tienen por
lo menos un nucleótido diferente (con respecto a las secuencias
conocidas de ácido polinucleico del HCV) que implican un aminoácido
diferente en la poliproteína codificada.
Como las zonas NS4 y de la parte central son
conocidas por contener diversos epítopos, por ejemplo caracterizados
en la solicitud de la patente
EP-A-0 489 968, y como es de esperar
que la proteína E1 esté sometida al ataque inmunitario como parte
de la envoltura vírica y es de esperar que contenga epítopos, los
epítopos de NS4, de la parte central y de E1 de los nuevos tipos y
subtipos dados a conocer en esta memoria diferirán consecuentemente
de los epítopos presentes en los genotipos conocidos anteriormente.
Esto está ejemplificado mediante la especificidad de tipo de los
péptidos sintéticos de NS4 según describen Simmonds y otros (1993c)
y Stuyver y otros (1993b) y PCT/EP 94/01323 y la especificidad de
tipo de las proteínas E1 recombinantes según describen Martens y
otros (1994).
Los péptidos según la presente invención
contienen preferentemente por lo menos 3 aminoácidos contiguos del
HCV, preferentemente 4 ó 5, preferentemente 6 ó 7 sin embargo por lo
menos 8 aminoácidos contiguos del HCV, por lo menos 10 ó por lo
menos 15 (por ejemplo por lo menos 9, 10, 11, 12, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más
aminoácidos).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los polipéptidos de la invención, y
particularmente los fragmentos, se pueden preparar mediante síntesis
química clásica.
La síntesis se puede realizar en solución
homogénea o en fase sólida.
Por ejemplo, la técnica de síntesis en solución
homogénea que se puede utilizar es la descrita por Houbenweyl en el
libro titulado "Methode der organischen chemie"
(Procedimiento de química orgánica) editado por E. Wunsh, vol.
15-1 y II. THIEME, Stuttgart, 1974.
Los polipéptidos de la invención se pueden
preparar así mismo en fase sólida según los procedimientos descritos
por Atherton y Shepard en su libro titulado "Solid phase
peptide synthesis" (IRL Press, Oxford, 1989).
Los polipéptidos según esta invención se pueden
preparar mediante técnicas de ADN recombinante como las descritas
por Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
La presente invención se refiere particularmente
a un polipéptido según se definió anteriormente, que comprende en su
secuencia de aminoácidos por lo menos uno de los siguientes restos
de aminoácidos:
A58, H70, Q71 ó N71, D106, I134, E135, E150,
K197, L235, A242, E260 ó K260, L293, I300, S2646, V2652, Q2653,
H2656, K2663, A2667 ó V2667, D2677, I2707, A2709, F2730, L2746,
S2749 ó P2749, T2752 ó V2752, D2753 ó G2753.
estando compuesta dicha notación por una letra
que representa el resto de aminoácido mediante su código de una
letra y un número que representa la numeración del aminoácido según
Kato y otros, 1990 como se muestra en la Tabla 1 (véase también la
numeración en las Figuras 2, 4 y 6), o una parte de éste que es
exclusiva para el tipo 7 del HCV según se define en la Tabla 5, o
un análogo de éste que es sustancialmente homólogo y biológicamente
equivalente a dicho polipéptido o a parte de éste, según se define
en alguna de las reivindicaciones 23 a 27.
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Estos restos de aminoácido exclusivos se pueden
deducir de la alineación de las nuevas secuencias de aminoácidos
del HCV dadas en la Figura 3 para todas las secuencias del HCV
conocidas. En las Figuras 2, 4 y 6 se da por ejemplo un
alineamiento con las nuevas secuencias, representado por la SEC ID
nº 1 a 106. Debería ser obvio que las alineaciones dadas en estas
figuras se pueden completar con todas las secuencias de HCV
conocidas para ilustrar que cualquiera de los restos exclusivos
dados anteriormente es verdaderamente exclusivo para por lo menos
una de las nuevas secuencias de HCV de la presente invención.
Dentro del grupo de restos de aminoácidos
exclusivos y nuevos de la presente invención, se pueden encontrar
restos exclusivos que son específicos para los siguientes nuevos
tipos (subtipos) de HCV según el sistema de clasificación de HCV
utilizado en la presente invención: cepas del tipo 1 subtipo 1d, 1e,
1f ó 1g; cepas del tipo 2 subtipo 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 2k ó 2l;
cepas del tipo 3 subtipo 3g; cepas del tipo 1 subtipo 4k, 4l ó 4m;
cepas del tipo 7 subtipo 7a, 7b, ó 7d; cepas del tipo 9, del tipo 10
o del tipo 11. Para conseguir estos restos se pueden utilizar las
alineaciones dadas en la Figuras 2, 4 y 6 para deducir la
especificidad de tipo y/o subtipo de cualquiera de los restos
exclusivos dados anteriormente.
Por ejemplo, T190 (identificado en el tipo 1d)
se refiere a una treonina en la posición 190 (véase Figura 2). En
otras secuencias se puede identificar sólo una serina (S190) o
excepcionalmente una alanina (A190 en el tipo 10a).
Los polipéptidos según esta forma de realización
de la invención pueden estar marcados posiblemente, o unidos a un
sustrato sólido, o acoplados a una molécula de portador tal como la
biotina o mezclados con un adyuvante apropiado, todos conocidos en
la materia y según la utilización pretendida (de diagnóstico,
terapéutica o profiláctica).
La presente invención se refiere además a un
polipéptido definido anteriormente, que comprende en su secuencia
de aminoácidos por lo menos una de las secuencias representadas por
SEC ID nº 115, 116, 136, 137, 153, 154, 172, 173, 188, 189, 205 ó
206 como se relacionó anteriormente, o una parte de éstas que es
exclusiva para el tipo 7 del HCV definido en la Tabla 5, o un
análogo de éste que es sustancialmente homólogo y biológicamente
equivalente a dicho polipéptido o de parte de éste, definido en la
reivindicación 25.
La presente invención se refiere además a un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en cualesquiera
de las SEC ID nº 44, 46, 48, 90, 92 ó 94, o una parte de éstas que
es exclusiva para el tipo 7 según se define en la Tabla 5, o un
análogo de éstas que es sustancialmente homólogo y biológicamente
equivalente a dicho polipéptido o de parte de éstas, definido en la
reivindicación 26.
La zona variable en la proteína de la parte
central (PARTE CENTRAL V en la Fig. 2) ha demostrado ser útil para
serotipado (Machida y otros, 1992). La secuencia de las secuencias
del tipo 7 (subtipo de secuencias 7a, 7c y 7d) de la presente
invención presentan características de tipo específico en esta zona.
El péptido de los aminoácidos 68 a 78 (zona central V) presenta la
secuencia exclusiva para las secuencias de la presente invención
(véase la Figura 2):
- VRHQTGRTWAQ como para los subtipos 7a y 7c
- (SEC ID nº 115)
- VRQNQGRTWAQ como para el subtipo 7d
- (SEC ID nº 116)
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Se pueden identificar cinco zonas variables de
tipo específico (V1 a V5) después de la alineación de las secuencias
de aminoácidos de E1 de los genotipos de la presente invención con
los genotipos ya conocidos, como se muestra en la Figura 2.
La zona V1 abarca los aminoácidos 192 a 203, es
decir los 10 aminoácidos con terminal amino de la proteína E1. Se
pueden deducir las secuencias exclusivas siguientes mostradas en la
Figura 2:
- AHYTNKSGLYHL como para el subtipo 7c
- (SEC ID nº 136)
- LNYANKSGLYHL como para el subtipo 7d
- (SEC ID nº 137)
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La zona V2 abarca los aminoácidos 213 a 223. Las
secuencias exclusivas siguientes se pueden encontrar en la zona V2,
como se muestra en la Figura 2:
- VYEAETLILHL como para el subtipo 7c
- (SEC ID nº 153)
- VYEANGMILHL como para el subtipo 7d
- (SEC ID nº 154)
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La zona V3 abarca los aminoácidos 230 a 242. Las
siguientes secuencias exclusivas de la zona V3 se pueden deducir de
la Figura 2:
- VKXXNQSRCWVQA como para el subtipo 7c
- (SEC ID nº 172)
- VKTGNLTKCWLSA como para el subtipo 7d
- (SEC ID nº 173)
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La zona V4 abarca los aminoácidos 248 a 257. Las
siguientes secuencias exclusivas de la zona V4 se pueden deducir de
la Figura 2:
- VPNASTPVTG como para el subtipo 7c
- (SEC ID nº 188)
- VQNASVSIRG como para el subtipo 7d
- (SEC ID nº 189)
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La zona V5 abarca los aminoácidos 294 a 303. Los
siguientes péptidos exclusivos de la zona V5 se pueden deducir de la
Figura 2:
- RPRMHQVVQE como para el subtipo 7c
- (SEC ID nº 205)
- RPRMYEIAQD como para el subtipo 7d
- (SEC ID nº 206)
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de péptidos dada anteriormente es
particularmente útil para el desarrollo para el tratamiento, y el
desarrollo de la vacuna y del diagnóstico.
Así mismo está comprendido en la presente
invención cualquier péptido o polipéptido sintético (véase más
adelante) que contenga en su cadena peptídica por lo menos un
derivado del epítopo de los péptidos definidos anteriormente. Así
mismo está comprendido dentro de la presente invención cualquier
péptido o polipéptido que comprenda en su cadena peptídica por lo
menos 6, 7, 8 ó 9 aminoácidos contiguos derivados de los péptidos
definidos anterior-
mente.
mente.
Según se utiliza en esta memoria, "epítopo"
o "determinante antigénico" significa una secuencia de
aminoácidos que es inmunorreactiva. Generalmente un epítopo consta
por lo menos de 3 a 4 aminoácidos, y más generalmente, consta por
lo menos de 5 ó 6 aminoácidos, algunas veces el epítopo consta de
aproximadamente 7 a 8, o incluso aproximadamente 10 aminoácidos.
La presente invención se refiere particularmente
a cualquier péptido (véase más adelante) o polipéptido contenido en
cualesquiera de las secuencias de aminoácidos representadas en SEC
ID nº 44, 46, 48, 90, 92, 94 (véase Tabla 5 y Figura 3, sección de
Ejemplos).
La presente invención se refiere así mismo a un
polipéptido recombinante codificado por un ácido polinucleico
definido anteriormente, o a una parte de éste que es exclusiva para
cualesquiera de los subtipos o tipos definidos en la Tabla 5, o a
un análogo de éste que sea sustancialmente homólogo y biológicamente
equivalente a dicho polipéptido.
La presente invención se refiere así mismo a un
vector de expresión recombinante que comprende un ácido polinucleico
o a una parte de éste como se definió anteriormente, ligado
operativamente a elementos de control de transcripción y traducción
procarióticos, eucarióticos o víricos.
En general dicho vector recombinante comprenderá
una secuencia del vector, una secuencia del iniciador procariótico,
eucariótico o vírico apropiado, seguida de las secuencias del
nucleótido definidas anteriormente, permitiendo dicho vector
recombinante la expresión de cualesquiera de los polipéptidos
definidos anteriormente, en un huésped procariótico o eucariótico o
en mamíferos vivos cuando se inyectan como ADN desnudo, y más
particularmente un vector recombinante que permite la expresión de
cualesquiera de las nuevas secuencias del HCV de la invención
abarcando particularmente las siguientes posiciones de
aminoácidos:
- un polipéptido que empieza en la zona entre
las posiciones 1 y 10 y que acaba en cualquier posición en la zona
entre las posiciones 70 y 420, más particularmente un polipéptido
que abarca las posiciones 1 a 70, 1 a 85, las posiciones 1 a 120,
las posiciones 1 a 150, las posiciones 1 a 191, o las posiciones 1 a
200, para la expresión de la proteína de la parte central, y un
polipéptido que abarca las posiciones 1 a 263, las posiciones 1 a
326, las posiciones 1 a 383, o las posiciones 1 a 420, para la
expresión de la proteína de la parte central y de E1;
- un polipéptido que empieza en cualquier
posición en la zona entre las posiciones 117 y 192 y que acaba en
cualquier posición en la zona entre las posiciones 263 y 420, para
la expresión de E1, o las formas que tienen la zona hidrófoba
eliminada (posiciones 264 a 293 más o menos 8 aminoácidos);
\newpage
- un polipéptido que empieza en cualquier
posición en la zona entre las posiciones 1556 y 1688 y que acaba en
cualquier posición en la zona entre las posiciones 1739 y 1764, para
la expresión del antígeno NS4, más particularmente; un polipéptido
que empieza en las posición 1658 y que acaba en la posición 1711,
para la expresión del antígeno NS4a, y más particularmente, un
polipéptido que empieza en la posición 1712 y que acaba en la zona
entre las posiciones 1743 y 1972 (por ejemplo 1712 a 1743, 1712 a
1764, 1712 a 1782, 1712 a 1972, 1712 a 1782, 1712 a 1902), para la
expresión del antígeno NS4b o de partes de éste.
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Cualquier otra construcción del vector HCV
conocida en la materia se puede utilizar también para los
polipéptidos recombinantes de la presente invención.
Así mismo cualesquiera de los procedimientos de
purificación conocidos para las proteínas recombinantes se pueden
utilizar para la producción de los polipéptidos recombinantes de la
presente invención, particularmente los procedimientos de
purificación del polipéptido recombinante expuestos en el documento
nº WO 96/04385 in nombre de Innogenetics N.V.
El término "vector" puede comprender un
plásmido, un cósmido, un fago, o un animal transgénico. Los vectores
BCG o adenovíricos, así como los virus recombinantes de avipox,
pueden ser particularmente útiles para el desarrollo de la
vacuna.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para la producción de un polipéptido recombinante
definido anteriormente, que comprende:
- la transformación de un huésped celular
apropiado con un vector recombinante, en el que se ha insertado un
ácido polinucleico o una parte de este según se definió
anteriormente, bajo el control de elementos reguladores
apropiados,
- el cultivo de dicho huésped celular
transformado en condiciones que permitan la expresión de dicha
inserción, y,
la recogida de dicho polipéptido.
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El término "expresado recombinantemente"
utilizado en el contexto de la presente invención se refiere al
hecho de que las proteínas de la presente invención se producen
mediante procedimientos de expresión recombinantes que existen en
los procarióticas, o eucarióticas inferiores o superiores tratados
en detalle más adelante.
El término "eucariótica inferior" se
refiere a las células huésped tales como levaduras, hongos y
similares. Los eucariótas inferiores son generalmente (pero no
necesariamente) unicelulares. Los eucariótas inferiores preferidos
son las levaduras, particularmente especies dentro de
Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia (p.
ej. Pichia pastoris), Hansenula (p. ej. Hansenula
polymorpha), Yarowia, Schwaniomyces, Schizosaccharomyces,
Zygosaccharomyces y similares. Saccharomyces cerevisiae, S.
carlsbergensis y K. lactis son los huéspedes de levadura
más utilizados generalmente, y son huéspedes apropiados de
hongos.
El término "procariótas" se refiere a los
huéspedes tales como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus,
Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o
Streptomyces. Estos huéspedes también están contemplados en
la presente invención.
El término "eucarióta superior" se refiere
a las células huésped procedentes de animales superiores tales como
mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células huésped de
eucariótas superiores preferidas actualmente proceden del hamster
chino (p. ej. CHO), del mono (p. ej. células COS y Vero), del riñón
de la cría del hamster (BHK), del riñón del cerdo (PK15), de las
células 13 del riñón del conejo (RK13), de la línea celular 143B
del osteosarcoma humano, de la línea celular humana HeLa y de las
líneas celulares similares a Hep G2 del hepatoma humano y de las
líneas celulares de insectos (p. ej. Spodoptera frugiperda).
Las células huésped se pueden proporcionar en suspensión o en
cultivos en matraz, cultivos de tejidos, cultivos de órganos y
similares. Por otra parte las células huésped pueden ser también
animales transgénicos.
El término "polinucleótido o ácido nucleico
recombinante" significa un polinucleótido o ácido nucleico del
cADN genómico, de origen semisintético o sintético que, en virtud de
su origen o manipulación: (1) no está relacionado con toda o parte
de un polinucleótido con el que está relacionado en la naturaleza,
(2) está ligado a un polinucleótido distinto al que se une en la
naturaleza, o (3) no tiene lugar en la naturaleza.
El término "células huésped recombinantes",
"células huésped", "células", "líneas celulares",
"cultivos celulares" y dichos otros términos que indican
microorganismos o líneas celulares eucarióticas superiores
cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que
pueden existir o han existido utilizadas como receptoras para un
vector recombinante u otro polinucleótido de transferencia, y
comprenden la progenie de la célula original que ha sido
transfectada. Se comprende que la progenie de una célula paterna
individual puede no ser necesariamente totalmente idéntica en
morfología o en el complemento del ADN genómico o total como el
original paterno, debido a la mutación natural, accidental o
deliberada.
\newpage
El término "replicón" es cualquier elemento
genético, p. ej., un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido,
etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación dentro
de una célula; es decir, capaz de replicación bajo su propio
control.
El término "vector" es un replicón que
comprende así mismo secuencias que proporcionan la replicación y/o
la expresión de un marco de lectura abierto deseado.
El término "secuencia de control" se
refiere a las secuencias de polinucleótido que se necesitan para
efectuar la expresión de las secuencias codificadoras a las que
están unidas. La naturaleza de dichas secuencias de control se
diferencia dependiendo del organismo; en los procariótas, dichas
secuencias de control comprenden generalmente el iniciador, el
sitio de unión ribosónica, los sitios de corte y empalme y los
finalizadores; en los eucariotas, generalmente, dichas secuencias
de control comprenden iniciadores, sitios de corte y empalme,
finalizadores y, en algunos casos, aumentadores. El término
"secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos
los componentes cuya presencia sea necesaria para la expresión, y
puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa,
por ejemplo, las secuencias del líder que gobierna la secreción.
El término "iniciador" es una secuencia de
nucleótido que está compuesta por secuencias de consenso que
permiten la unión de la ARN polimerasa a la plantilla del ADN de
tal forma que la producción de mARN comienza en el sitio de inicio
de la transcripción normal para el gen estructural adyacente.
La expresión "unido operativamente" se
refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos de
este modo están en una relación que les permite funcionar en su
manera pretendida. Una secuencia de control "unida
operativamente" a una secuencia de codificación está unida de tal
manera que la expresión de la secuencia de codificación se consigue
en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El segmento del cADN del HCV que codifica la
secuencia deseada insertada en la secuencia del vector puede estar
unida a una señal en secuencia. Dicha señal en secuencia puede ser
de una fuente distinta del HCV, p. ej. la secuencia principal de
IgG o del activador plasminógeno del tejido (tpa) para la expresión
en las células de mamíferos, o la secuencia del factor \alpha de
apareamiento para la expresión en las células de levadura, pero las
construcciones particularmente preferidas según la presente
invención contienen secuencias en señal que aparecen en el genoma
HCV antes de los respectivos puntos de partida de las proteínas.
Se puede utilizar una variedad de vectores para
obtener la expresión recombinante de las proteínas de la envoltura
oligoméricas específicas de la presente invención. Los eucariotas
inferiores tales como levaduras y cepas mutantes de glucosilación
se transforman típicamente en plásmidos, o se transforman en un
virus recombinante. Los vectores se pueden replicar en el huésped
independientemente o se pueden integrar en el genoma de la célula
huésped.
Los eucariótas superiores se pueden transformar
con vectores o se pueden infectar con un virus recombinante, por
ejemplo un virus de vacuna recombinante. Las técnicas y los vectores
para inserción de ADN extraño en el virus de la vacuna son bien
conocidas en la materia, y utilizan, por ejemplo la recombinación
homóloga. Una amplia variedad de secuencias de iniciación víricas,
si es posible secuencias del finalizador y secuencias de adición de
poli(A), si es posible secuencias del aumentador, y si es
posible secuencias de amplificación, requeridas todas para la
expresión en mamíferos, están disponibles en la materia. La vacuna
es particularmente preferida, ya que la vacuna detiene la expresión
de las proteínas de la célula huésped. La vacuna es así mismo mucho
más preferida ya que permite la expresión de p. ej. las proteínas E1
y E2 del HCV en células o individuos que está inmunizados con el
virus vivo de la vacuna recombinante. Para la vacunación de humanos
el avipox y el virus modificado de Ankara (AMV) son particularmente
útiles los vectores.
Son así mismo conocidos los vectores de
transferencia de expresión de insectos procedentes del baculovirus
Autographa californica del virus de la polihedrosis nuclear
(AcNPV), que es un vector de expresión vírica independiente del
cooperador. Los vectores de expresión procedentes de este sistema
utilizan generalmente el iniciador del gen de polihedrina vírica
fuerte para dirigir la expresión de los genes heterólogos. Los
vectores diferentes, así como los procedimientos para la
introducción del ADN heterólogo en el sitio deseado del
baculovirus, están disponibles para los expertos en la materia para
la expresión del baculovirus. Así mismo son conocidas en la materia
las diferentes señales de modificación
post-traductora reconocidas por las células de
insectos.
La presente invención se refiere así mismo a una
célula huésped transformada con un vector recombinante como se
definió anteriormente.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para detectar anticuerpos en el HCV presentes en la
muestra biológica, que comprende:
(i) puesta en contacto de la muestra biológica a
analizar por la presencia del HCV con un polipéptido como se definió
anteriormente,
(ii) identificación del complejo inmunológico
formado entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido.
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La presente invención se refiere además a un
procedimiento para la tipificación, que comprende:
(i) puesta en contacto de la muestra biológica a
analizar para la presencia del HCV con un polipéptido definido
anteriormente,
(ii) identificación del complejo inmunológico
formado entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido.
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La presente invención se refiere además a un
equipo de diagnóstico para utilización en la identificación de la
presencia del HCV, comprendiendo dicho equipo por lo menos un
polipéptido definido anteriormente, estando dicho polipéptido
preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere además a un
equipo de diagnóstico para tipificación del HCV, comprendiendo dicho
equipo por lo menos un polipéptido definido anteriormente, estando
dicho polipéptido preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere además a un
equipo de diagnóstico según se definió anteriormente, comprendiendo
dicho equipo un intervalo de dichos polipéptidos que están unidos a
posiciones específicas sobre un sustrato sólido.
La presente invención se refiere además a un
equipo de diagnóstico según se definió anteriormente, en el que
dicho soporte sólido es una tira de membrana y dichos polipéptidos
están acoplados a la membrana en forma de líneas paralelas.
Los procedimientos de inmunoanálisis según la
presente invención pueden utilizar antígenos de diferentes campos
de las secuencias del nuevo y único polipéptido de la presente
invención que se mantienen lineales (en el caso de los péptidos) y
de los epítopos conformacionales (en el caso de los polipéptidos)
reconocidos por los anticuerpos en el suero de individuos
infectados por HCV. Está dentro del alcance de la invención
utilizar, por ejemplo, antígenos oligoméricos individuales o
específicos, antígenos diméricos, así como combinaciones de
antígenos oligoméricos individuales o específicos. Los antígenos del
HCV de la presente invención se pueden emplear prácticamente en
cualquier formato de análisis que emplee un antígeno conocido para
detectar anticuerpos. Desde luego, debería ser evitado o adaptado
un formato que desnaturalice el epítopo conformacional del HCV. Una
característica común de todos estos análisis, es que el antígeno se
pone en contacto con el componente corporal sospechoso de contener
anticuerpo del HCV en condiciones que permitan al antígeno unirse a
cualquier anticuerpo presente en el componente. Dichas condiciones
serán típicamente la temperatura fisiológica, el pH y la fuerza
iónica utilizando un exceso de antígeno. La incubación
del antígeno con la muestra es seguida de la identificación de los inmunocomplejos comprendidos en el antígeno.
del antígeno con la muestra es seguida de la identificación de los inmunocomplejos comprendidos en el antígeno.
El diseño del inmunoanálisis está sujeto a una
cantidad de variación y se conocen muchos formatos en la materia.
Los protocolos pueden utilizar, por ejemplo, soportes sólidos o
inmunoprecipitación. La mayoría de los análisis implican la
utilización de anticuerpo o polipéptido marcado; las marcas pueden
ser, por ejemplo, enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes,
radioactivas o moléculas coloreadas. Los análisis que amplifican las
señales del inmunocomplejo son también conocidas; ejemplos de los
cuales son los análisis que utilizan biotina y avidina o
estreptavidina, e inmunoanálisis con enzima marcada y mediada, tales
como los análisis ELISA.
Los inmunoanálisis pueden estar, sin limitación,
en un formato heterogéneo u homogéneo, y ser de tipo estándar o
competitivo. En formato heterogéneo, el polipéptido está unido
típicamente a una matriz o soporte sólido para facilitar la
separación de la muestra del polipéptido después de la incubación.
Ejemplos de soportes sólidos que se pueden utilizar son la
nitrocelulosa, (p. ej., en forma de membranas o pocillos de
microvaloración), cloruro de polivinilo (p. ej., en hojas o
pocillos de microvaloración), látex de poliestireno (p. ej., en
lechos o placas de microvaloración, fluoruro de polivinilidina
(conocido como Immunolon^{TM}), papel diazotado, membranas de
nylón, lechos activados y lechos de Proteína A. Por ejemplo, se
pueden utilizar placas de microvaloración de Dinatech
Immunolon^{TM} 1 ó Immunolon^{TM} 2 ó lechos de poliestireno de
0,25 pulgadas (Precision Plastic Ball) en el formato
heterogéneo. El soporte sólido que contiene los polipéptidos
antigénicos se lava típicamente después de separarlo de la muestra
de la prueba y antes para identificación de los anticuerpos unidos.
Ambos formatos estándar y competitivo son conocidos en la
materia.
En un formato homogéneo, la muestra de prueba se
incuba con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo,
puede estar en condiciones que precipite cualquier complejo
antígeno-anticuerpo que se forme. Ambos formatos
estándar y competitivo para estos análisis son conocidos en la
materia.
En un formato estándar, se controla directamente
la cantidad de anticuerpos del HCV en los complejos
anticuerpo-antígeno. Esto se puede realizar
determinando si los anticuerpos marcados por
anti-xenogenéico (p. ej. antihumano) que reconocen
un epítopo se unirá sobre anticuerpos anti-HCV
debido a la formación del complejo. En un formato competitivo, la
cantidad de anticuerpos de HCV en la muestra se deduce controlando
el efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de
anticuerpo marcado (u otro ligando en competencia) en el
complejo.
Los complejos formados que comprenden el
anticuerpo anti-HCV (o en el caso de análisis
competitivos, la cantidad de anticuerpo en competencia) se
identifica mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas,
dependiendo del formato. Por ejemplo, los anticuerpos del HCV
marcados en el complejo se pueden identificar utilizando un
conjugado anti-xenogenéico 1g acomplejado con un
marca (p. ej. una marca de enzima).
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En un formato de análisis de inmunoprecipitación
o aglutinación la reacción entre los antígenos del HCV y el
anticuerpo forman una red que precipita de la solución o suspensión
y forma una capa visible o película de precipitado. Si ningún
anticuerpo anti-HCV está presente en la muestra de
prueba, no se forma ningún precipitado visible.
Actualmente existen 3 tipos específicos de
análisis de aglutinación de partículas (PA). Estos análisis se
utilizan para la identificación de anticuerpos para varios antígenos
cuando recubren a un soporte. Un tipo de este análisis es el
análisis de hemaglutinación utilizando glóbulos rojos (RBCs) que
están sensibilizados por un antígeno (o anticuerpo) que adsorbe
pasivamente los RBC. La adición de anticuerpos del antígeno
específico presentes en el componente corporal, si existe, da lugar
a que los RBCs recubiertos con el antígeno purificado se
aglutinen.
Para eliminar las reacciones potenciales no
específicas en el análisis de hemaglutinación, se pueden utilizar
dos portadores artificiales en lugar de RBC en la PA. Los más
habituales de éstos son las partículas de látex. Sin embargo,se
pueden utilizar también partículas de gelatina. Los análisis que
utilizan uno de estos portadores se basan en la aglutinación pasiva
de las partículas recubiertas con antígenos purificados.
Los antígenos del HCV de la presente invención
comprendidos en los epítopos comformacionales se empaquetarán
típicamente en forma de un equipo para utilizar en estos
inmunoanálisis. El equipo contendrá normalmente en recipientes
separados el antígeno del HCV natural, las formulaciones del
anticuerpo de control (positivo y/o negativo), el anticuerpo
marcado cuando el formato del análisis necesita el mismo y los
reactivos generadores de la señal (p. ej. el sustrato de la enzima)
si la marca no genera una señal directamente. El antígeno natural
del HCV puede estar ya unido a una matriz sólida o separado con
reactivos para unirlo a la matriz. Las instrucciones (p. ej.
escritas, cinta magnetofónica, CD-ROM, etc.) para
realizar el análisis están incluidas generalmente en el equipo.
Los inmunoanálisis que utilizan el antígeno del
HCV natural son útiles en la detección sanguínea para la
precipitación de una irrigación en la que falta el HCV
potencialmente infeccioso. El procedimiento para la preparación del
riego sanguíneo comprende las siguiente etapas. La reacción de un
componente corporal, preferentemente sangre o un componente de la
sangre, de la sangre de un individuo donante con polipéptidos del
HCV de la presente invención que permitan una reacción inmunológica
entre los anticuerpos del HCV, si existen, y el antígeno del HCV.
La detección si se forman complejos antígeno
anti-HCV - antígeno del HCV como resultado de la
reacción. La sangre que contribuye al riego sanguíneo es de
donantes que no presentan anticuerpos en los antígenos del HCV
natural.
En el caso de reactividad positiva del antígeno
del HCV, es preferible repetir el inmunoanálisis para reducir la
posibilidad de falsos positivos. Por ejemplo, en la detección a gran
escala de la sangre para la producción de productos sanguíneos (p.
ej. transfusión sanguínea, plasma, Factor VIII, inmunoglobulina,
etc.) las pruebas de "detección" están formateadas típicamente
para aumentar la sensibilidad (para asegurar que no pasa sangre
contaminada) a expensas de la especifidad; es decir, se aumenta la
cantidad de falsos positivos. Así pues, es típico aplazar solamente
para prueba adicional a aquellos donantes que son "repetidamente
reactivos"; es decir positivos en dos o más pruebas de
inmunoanálisis en la muestra del donante. Sin embargo, para
confirmación de la positividad del HCV, las pruebas de
"confirmación" se formatean típicamente para aumentar la
especificidad (para asegurar que ninguna muestra de falso positivo
se ha confirmado) a expensas de la sensibilidad.
La fase sólida seleccionada puede comprender
granos de polímeros o de vidrio, de nitrocelulosa, de
micropartículas, micropocillos de un plato de reacción, tubos de
ensayo y lechos magnéticos. La señal que genera el compuesto puede
comprender un enzima, un compuesto luminiscente, un elemento
radioactivo y un compuesto quimioluminiscente. Ejemplos de enzimas
comprenden la fosfatasa alcalina, la peroxidasa del rábano picante y
la beta-galactosidasa. Ejemplos de compuestos
intensificadores comprenden la biotina, anti-biotina
y avidina. Para bloquear los efectos de sustancias similares al
Factor reumatoide la muestra de la prueba se somete a condiciones
suficientes para bloquear el efecto de las sustancias similares al
Factor reumatoide. Estas condiciones comprenden el poner en
contacto la muestra de prueba con una cantidad de IgG
anti-humana para formar una mezcla, y la incubación
de la mezcla durante un tiempo y en unas condiciones suficientes
para formar un producto de mezcla de reacción sustancialmente exento
de sustancias similares al Factor reumatoide.
La presente invención se refiere a un formato de
inmunoanálisis en el que los polipéptidos (o péptidos) de la
invención están acoplados a una membrana en forma de líneas
paralelas. Este formato de análisis es particularmente ventajoso con
fines de tipificación del HCV.
La presente invención se refiere además a una
composición farmacéutica que comprende por lo menos un polipéptido
(recombinante) según se definió anteriormente y un excipiente,
diluyente o portador adecuado.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento de prevención de la infección por HCV, que comprende
la administración de la composición farmacéutica según se definió
anteriormente para un mamífero en una cantidad eficaz para estimular
la producción del anticuerpo protector o la respuesta del linfocito
T protector.
La presente invención se refiere a la
utilización de una composición según se definió anteriormente en un
procedimiento para la prevención de la infección por HCV.
La presente invención se refiere además a una
vacuna para la inmunización de un mamífero contra la infección por
HCV, que comprende por lo menos un polipéptido (recombinante)
definido anteriormente, en un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
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El término "inmunogénico" se refiere a la
capacidad de una sustancia para producir una respuesta humoral y/o
celular, sola o ligada a un portador, en presencia o ausencia de un
adyuvante. "Neutralización" se refiere a una respuesta
inmunitaria que bloquea la infecciosidad, bien parcial o totalmente,
de un agente infeccioso. Una vacuna es una composición inmunógena
capaz de conseguir protección frente al HCV, parcial o
completamente. Una vacuna puede además ser útil para el tratamiento
de un individuo, en cuyo caso se denomina vacuna terapéutica.
El término "terapéutico" se refiere a una
composición capaz de tratar la infección por HCV. El término
"cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de polipéptido que
lleva suficiente epítopo para provocar una respuesta inmunógena en
el individuo al que se administra o por otra parte inmunoreacciona
detectablemente en su sistema pretendido (p. ej. inmunoanálisis).
Preferentemente, la cantidad eficaz es suficiente para efectuar el
tratamiento, según se definió anteriormente. La cantidad exacta
necesaria variará según la aplicación. Para las aplicaciones como
vacuna o para la generación de antisuero/anticuerpos policlonales,
por ejemplo, la cantidad eficaz puede variar dependiendo de las
especies, edad, y condición general del individuo, de la gravedad de
la enfermedad a tratar, del polipéptido en particular seleccionado
y su modo de administración, etc. Se cree además que las cantidades
eficaces, se encuentran dentro de un intervalo no crítico,
relativamente grande. Una cantidad eficaz apropiada se puede
determinar fácilmente utilizando sólo experimentación de rutina. Los
intervalos de proteínas preferidos para la profilaxis de la
enfermedad por el HCV son 0,01 a 100 \mug/dosis, preferentemente
de 0,1 a 50 \mug/dosis. Pueden ser necesarias varias dosis por
individuo para conseguir una respuesta inmunitaria suficiente y
protección posterior frente a la enfermedad por HCV.
La presente invención se refiere además a una
vacuna definida anteriormente, que comprende por lo menos un
polipéptido (recombinante) definido anteriormente, siendo dicho
polipéptido exclusivo para por lo menos uno de los subtipos o tipos
definidos anteriormente.
Dichas composiciones de vacuna pueden comprender
composiciones de vacuna profilácticas así como terapéuticas.
Los portadores farmacéuticamente aceptables
comprenden cualquier portador que no provoque él mismo la producción
de anticuerpos poderosos en el individuo que recibe la composición.
Portadores adecuados son macromoléculas típicamente largas,
metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos
polilácticos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos;
y partículas de virus inactivas. Dichos portadores son bien
conocidos por los expertos en la materia.
Los adyuvantes preferidos para aumentar la
eficacia de la composición comprenden, pero no se limitan a:
hidróxido de aluminio (alum),
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP) como se encuentra en la patente U.S. nº
4.606.918,
N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina
(nor-MDP),
N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina
(MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes
extraídos de las bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de
trehalosa y el esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una
emulsión de escualeno al 2%/Tween 80. Cualquiera de los 3
componentes MPL, TDM o CWS se puede también utilizar solo o
combinado 2 a 2. Adicionalmente, los adyuvantes tales como Stimulon
(Cambridge Bioscience, Worcester, MA).
Las composiciones inmunógenas utilizadas como
vacunas comprenden una "cantidad suficiente" o "una cantidad
inmunológicamente eficaz" de las proteínas de la presente
invención, así como cualquier otro de los componentes necesitados,
mencionados anteriormente. "Cantidad inmunológicamente eficaz",
significa que la administración de la cantidad a un individuo, bien
en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el
tratamiento, definido anteriormente. Esta cantidad varía
dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar,
del grupo taxonómico del individuo a tratar (p. ej. primates no
humanos, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmunitario
del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección
deseado, de la formulación de la vacuna, del juicio del doctor
sobre el tratamiento de la situación médica, de la cepa del HCV
infectante, y de otros factores relevantes. Es de esperar que la
cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede
determinar mediante pruebas de rutina. Generalmente, la cantidad
variará de 0,01 a 1000 \mug/dosis, más particularmente de 0,1 a
100 \mug/dosis.
Las proteínas de la invención pueden servir así
mismo como portadores de vacuna al presentar homólogos (p. ej.
epítopos de linfocitos T o epítopos de linfocitos B de por ejemplo
zonas de la parte central, E1, E2, NS2, NS3, NS4 ó NS5) o haptenos
heterólogos (distintos del HCV), de la misma forma que el antígeno
de superficie de la hepatitis B (véase la solicitud de la patente
europea nº 174 444). En esta utilización, las proteínas de la
envoltura proporcionan un portador inmunógeno capaz de estimular una
respuesta inmunitaria a los haptenos o antígenos conjugados en el
agregado. El antígeno puede estar conjugado bien mediante
procedimientos químicos convencionales, o puede estar clonado en el
gen que codifica E1 y/o E2 en una posición que corresponde a una
zona hidrófila de la proteína. Dichas zonas hidrófilas comprenden la
zona V1 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 191 a 202),
la zona V2 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 213 a 223),
la zona V3 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 230 a
242), la zona V4 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 230
a 242), la zona V5 (que abarca las posiciones de los aminoácidos 294
a 303) y la zona V6 (que abarca las posiciones de los aminoácidos
329 a 336). Otra posición útil para la inserción de haptenos es la
zona hidrófoba (que abarca aproximadamente las posiciones de los
aminoácidos 264 a 293). Se demuestra en la presente invención que
esta zona se puede eliminar sin afectar la reactividad de la
proteína E1 eliminada con antisueros. Por lo tanto, los haptenos se
pueden insertar en el sitio de la eliminación.
Las composiciones inmunógenas se administran
convencionalmente por vía parenteral, típicamente mediante
inyección, por ejemplo, por vía subcutánea o por vía intramuscular.
Las formulaciones adecuadas para otros procedimientos de
administración comprenden las formulaciones orales y los
supositorios. La dosis de tratamiento puede ser un programa de una
sola dosis o un programa de dosis múltiple. La vacuna se puede
administrar junto con otros agentes inmunorregulatorios.
La administración de el/los inmunogen(es)
de la presente invención puede ser bien con fines profilácticos o
terapéuticos. Cuando se suministra profilácticamente, el/los
inmunogen(es) se suministra(n) antes de cualquier
exposición al HCV o antes de cualquier síntoma debido a la infección
del HCV. La administración profiláctica del inmunogen sirve para
prevenir o atenuar cualquier infección posterior del HCV en un
mamífero. Cuando se suministra terapéuticamente, el/los
inmunogen(es) se suministra(n) al principio (o
inmediatamente después) de la infección o al principio de cualquier
síntoma de infección o de la enfermedad producida por el HCV. La
administración terapéutica de el/los inmunogen(es) sirve para
atenuar la infección o la enfermedad.
Además para utilizar como vacuna, las
composiciones se pueden utilizar para preparar anticuerpos para las
proteínas (E1) del HCV. Los anticuerpos se pueden utilizar
directamente como agentes antivíricos. Para preparar anticuerpos,
se inmuniza un animal huésped utilizando las proteínas naturales E1
en la partícula de virus unida a un portador como se describió
anteriormente para las vacunas. El suero o el plasma del huésped se
recoge después de un intervalo de tiempo apropiado para proporcionar
una composición que comprende anticuerpos que reaccionan con la
proteína (E1) de la partícula de virus. La fracción de
gammaglobulina de los anticuerpos de IgG se puede obtener, por
ejemplo, utilizando sulfato de amonio saturado o DEAE Sephadex, u
otras técnicas conocidas en la materia. Los anticuerpos están
sustancialmente exentos de muchos de los efectos secundarios
adversos que pueden estar relacionados con otros agentes antivíricos
tales como los fármacos.
La presente invención se refiere así mismo
particularmente a un péptido que corresponde a una secuencia de
aminoácidos codificada mediante por lo menos una de las secuencias
genómicas del HCV definidas anteriormente, siendo dicho péptido
exclusivo para el tipo 7 del HCV definido en la Tabla 5, o un
análogo de éste sustancialmente homólogo y biológicamente
equivalente.
La presente invención se refiere particularmente
a un péptido que comprende por lo menos un epítopo exclusivo de las
nuevas secuencias de la invención representadas por las SEC ID nº
43, 45, 47, 89, 91, 93, 44, 46, 48, 90, 92, 94, 115, 116, 136, 137,
153, 154, 172, 173, 188, 189, 205 ó 206.
La presente invención se refiere así mismo
particularmente a un péptido que comprende en su secuencia un resto
de aminoácidos exclusivo de la invención definido anteriormente.
La presente invención se refiere particularmente
a un péptido que está biotinilado según se explica en el documento
nº WO 93/18054.
Todas las formas de realización (formatos de
inmunoanálisis, vacunas, composiciones, utilizaciones, etc.)
ilustradas para los polipéptidos de la invención como anteriormente
se refieren así mismo a los péptidos de la invención.
La presente invención se refiere así mismo a un
procedimiento para la identificación de los anticuerpos para el HCV
presentes en una muestra biológica, que comprende:
(i) la puesta en contacto de la muestra
biológica a analizar la presencia del HCV con un péptido definido
anteriormente,
(ii) la identificación del inmunocomplejo
formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere así mismo a un
procedimiento para la tipificación del HCV, que comprende:
(i) la puesta en contacto de la muestra
biológica a analizar la presencia del HCV con un péptido definido
anteriormente,
(ii) la identificación del inmunocomplejo
formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere así mismo a un
equipo de diagnóstico para utilización en la identificación de la
presencia del HCV, comprendiendo dicho equipo por lo menos un
péptido definido anteriormente, estando dicho péptido
preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere así mismo a un
equipo de diagnóstico para la tipificación del HCV, comprendiendo
dicho equipo un péptido por lo menos definido anteriormente, estando
dicho péptido preferentemente unido a un soporte sólido.
\newpage
La presente invención se refiere así mismo a un
equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que dichos
péptidos se seleccionan de entre los siguientes:
- por lo menos un péptido NS4,
- por lo menos un péptido NS4 y por lo menos un
péptido de la parte central,
- por lo menos un péptido NS4 y por lo menos un
péptido de la parte central y por lo menos un péptido de E1,
- por lo menos un péptido NS4 y por lo menos un
péptido de E1.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere así mismo a un
equipo de diagnóstico definido anteriormente, comprendiendo dicho
equipo un intervalo de dichos péptidos que está unido a posiciones
específicas en un sustrato sólido.
La presente invención se refiere así mismo a un
equipo de diagnóstico definido anteriormente, en el que dicho
soporte sólido es una tira de membrana y dichos péptidos están
acoplados a la membrana en forma de líneas paralelas.
La presente invención se refiere así mismo a una
composición farmacéutica que comprende por lo menos una definida
anteriormente y un excipiente, diluyente o portador adecuado.
La presente invención se refiere así mismo a un
procedimiento de prevención de la infección por HCV, que comprende
la administración de la composición farmacéutica definida
anteriormente para un mamífero en una cantidad eficaz para estimular
la producción del anticuerpo protector o la respuesta protectora de
los linfocitos T.
La presente invención se refiere así mismo a la
utilización de una composición definida anteriormente en un
procedimiento para la prevención de la infección por HCV.
La presente invención se refiere así mismo a una
vacuna para la inmunización de un mamífero contra la infección por
HCV, que comprende por lo menos un péptido definido anteriormente,
en un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere así mismo a una
vacuna definida anteriormente, que comprende por lo menos un péptido
definido anteriormente, siendo dicho péptido exclusivo para el tipo
7 del HCV definido en la Tabla 5.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
producido en la inmunización por lo menos con un polipéptido o un
péptido definidos anteriormente, siendo dicho anticuerpo
específicamente reactivo con cualesquiera de dichos polipéptidos o
péptidos, y siendo dicho anticuerpo preferentemente un anticuerpo
monoclonal.
Los anticuerpos monoclonales de la invención se
pueden producir mediante cualquier hibridoma que tenga tendencia a
formarse según los procedimientos clásicos de las células esplénicas
de un animal, particularmente de un ratón o de una rata, inmunizada
contra los polipéptidos del HCV según la invención definidos
anteriormente por una parte, y de las células de una línea celular
de mieloma por otra parte, y para ser seleccionadas por la
capacidad del hibridoma para producir los anticuerpos monoclonales
que reconocen los polipéptidos que se han utilizado inicialmente
para la inmunización de los animales.
Los anticuerpos implicados en la invención se
pueden marcar mediante una marca apropiada de tipo enzimático,
fluorescente o radiactivo.
Los anticuerpos monoclonales según está forma de
realización preferida de la invención pueden ser versiones
humanizadas de anticuerpos monoclonales de ratón elaborados mediante
tecnología de ADN recombinante, a partir de partes de secuencias de
ADN genómico de ratón y/o humano que codifican cadenas de H y L o
que codifican clones de cADN para cadenas de H y L.
Por otra parte los anticuerpos monoclonales
según esta forma de realización preferida de la invención pueden
ser anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos según la
presente forma de realización de la invención pueden proceder de
linfocitos de la sangre periférica de pacientes infectados con el
tipo 7 del HCV (subtipos 7a, 7c ó 7d), o vacunados contra el HCV.
Dichos anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo,
mediante repoblación de linfocitos de la sangre periférica humana
(PBL) de ratones con carencia inmunitaria combinada grave (SCID)
(para reseña reciente, véase Duchosal y otros, 1992) o mediante
detección de los linfocitos transformados por el virus de Eppstein
Barr de individuos infectados o vacunados por la presencia de
linfocitos B reactivos mediante los antígenos de la presente
invención.
La invención se refiere así mismo a la
utilización de la proteínas de la invención, de sus muteínas o de
los péptidos procedentes de éstos para la selección de anticuerpos
recombinantes mediante el procedimiento de clonación de repertorio
(Persson y otros, 1991).
\newpage
Los anticuerpos dirigidos a los péptidos
procedentes de un determinado genotipo se puede utilizar bien para
la detección de 5 de dichos genotipos del HCV o como agentes
terapéuticos.
La presente invención se refiere así mismo a un
procedimiento para la detección de antígenos presentes en una
muestra biológica, que comprende:
(i) la puesta en contacto de dicha muestra
biológica con un anticuerpo definido anteriormente,
(ii) la identificación de inmunocomplejos
formados entre dichos antígenos del HCV y dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere así mismo a un
procedimiento para la tipificación del HCV, que comprende:
(i) la puesta en contacto de dicha muestra
biológica con un anticuerpo definido anteriormente,
(ii) la identificación de inmunocomplejos
formados entre dichos antígenos del HCV y dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere así mismo a un
equipo de diagnóstico para utilización en la detección de la
presencia del HCV, comprendiendo dicho equipo por lo menos un
anticuerpo definido anteriormente, estando dicho anticuerpo
preferentemente unido a un soporte sólido.
La presente invención se refiere así mismo a un
equipo de diagnóstico para la tipificación del HCV, comprendiendo
dicho equipo por lo menos un anticuerpo definido anteriormente,
estando dicho anticuerpo preferentemente unido a un soporte
sólido.
La presente invención se refiere así mismo a un
equipo de diagnóstico definido anteriormente, comprendiendo dicho
equipo un intervalo de dichos anticuerpos que están unidos en
posiciones específicas sobre un sustrato sólido.
La presente invención se refiere así mismo a una
composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo
definido anteriormente y un excipiente, diluyente o portador
adecuado.
La presente invención se refiere así mismo a un
procedimiento de prevención o tratamiento de la infección por HCV,
que comprende la administración de la composición farmacéutica
definida anteriormente para un mamífero en una cantidad eficaz.
La presente invención se refiere así mismo a la
utilización de una composición definida anteriormente en un
procedimiento para la prevención o el tratamiento de la infección
por HCV.
El genotipo se puede también identificar
mediante un anticuerpo de tipo específico definido anteriormente,
que puede también estar unido a cualquier secuencia de
polinucleótido que puede ser amplificada después mediante PCR para
detectar el inmunocomplejo formado (Immuno-PCR, Sano
y otros, 1992).
Algunas publicaciones de la solicitudes de
patentes referidas en esta memoria se incorporan como referencia.
Los ejemplos siguientes ilustran aspectos de la invención pero no
pretenden de ninguna manera limitar su alcance.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
Alineación de las secuencias del nucleótido de
la zona central/E1 de algunas de las cepas de los tipos y subtipos
identificados recientemente de la presente invención, con otras
cepas de subtipos de prototipo conocido.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Alineación de las secuencias de aminoácidos de
la zona central/E1 de algunas de las cepas de los tipos y subtipos
identificados recientemente de la presente invención, con otras
cepas de subtipos de prototipo conocido.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos
obtenidas a partir de nuevas cepas del HCV de la presente invención
(SEC ID nº 1 a 106).
\newpage
Figura
4
Alineación de las secuencias de aminoácidos de
la zona central /E1 de algunas de las cepas de los tipos y subtipos
identificados recientemente de la presente invención, con otras
cepas de subtipos de prototipo conocido.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
Alineación de las secuencias de nucleótido de la
zona NS5b de algunas de las cepas de los tipos y subtipos
identificados recientemente de la presente invención, con otras
cepas de subtipos de prototipo conocido.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
Alineación de las secuencias de aminoácidos de
la zona NS5b de algunas de las cepas de los tipos y subtipos
identificados recientemente de la presente invención, con otras
cepas de subtipos de prototipo conocido.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
5
Panorámicas de los nuevos subtipos y tipos de la
presente invención y de las zonas secuenciadas. Los subtipos entre
paréntesis se han sustituido por los tipos sin paréntesis siguiendo
la clasificación de Tokita y otros (1994).
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinaron los anticuerpos del HCV en las
muestras de suero de donantes de sangre cameruniana (CAM) con
Innotest HCV AbIII y se confirmaron mediante
INNO-LIA HCV III (Innogenetics, Amberes, Bélgica).
Se consiguieron muestras de suero de pacientes con infección de
hepatitis C crónica de varios centros en los países del Benelux
(BNL), de Francia (FR), de Paquistán (PAK), de Egipto (EG) y de
Vietnam (VN).
Se seleccionaron muestras del Benelux, Camerún,
Francia y Vietnam a causa de sus reactividades aberrantes (cepas
CAM1078, FR2, FR1, VN4, VN12, VN13, NE98 y otras (véase Tabla
5)).
\vskip1.000000\baselineskip
El aislamiento del ARN, la síntesis del cADN,
PCR, la clonación y el genotipado de LiPA utilizando productos de
amplificación UR de 5' biotinilados, se realizaron según describe
(Stuyver y otros, hacía 1994). Se utilizaron los productos UR de
5', de la parte central/E1 y de PCR de NS5B para secuenciado
directo. La secuencia de los cebadores universales HCPr95, HCPr96,
HCPr98 y HCPr29 de 5' UR, se describió anteriormente (Stuyver y
otros, antes de 1993). Se describieron así mismo los siguientes
cebadores (Stuyver y otros, hacía 1994): HCPr41, un cebador de la
cadena transcrita para la amplificación de la zona central; HCPr52 y
HCPr54 para la amplificación de la zona central/E1 y HCPr206 y
HCPr207 para la amplificación de una zona de NS5B de
340-bp.
Se analizaron muestras de suero BNL1, BNL2,
BNL3, BNL4, BNL5, BNL6, BNL7, BNL8, BNL9, BNL10, BNL11, BNL12,
CAM1078, FR2, FR16, FR4, FR13, VN13, VN4, VN12, FR1, NE98 y FR19 en
la zona central/E1 por secuenciado directo. Las muestras de suero
BNL1, BNL2, FR17, CAM1078, FR2, FR16, BNL3, FR4, BNL5, FR13, FR18,
PAK64, BNL8, BNL12, EG81, VN13, VN4, VN12, FR1, NE98, FR14, FR15 y
FR19 se analizaron también en la zona de NS5B por secuenciado
directo. Se obtuvieron las secuencias parciales de 5' UR,de la parte
central, de E1 y de NS5B. La longitud de las secuencias obtenidas
es suficiente para clasificar las secuencias obtenidas en nuevos
tipos o subtipos, basados en las distancias filogenéticas para
secuencias conocidas. Las siguientes secuencias se podrían obtener
(las secuencias de nucleótido tienen la SEC ID nº impar, las
secuencias de aminoácidos tienen la SEC ID nº par): SEC ID nº 1, 3,
5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,
41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73,
75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 y 105.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de éstos se dan en SEC ID
nº 2, 4, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,
38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70,
72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102,
104 y 106. La Tabla 5 da una panorámica de estas secuencias.
\newpage
Las secuencias publicadas anteriormente se
tomaron de la base de datos EMBL/Genbank. Las alineaciones se
crearon utilizando el programa HCVALIGN (Stuyver y otros, hacia
1994). Las secuencias se presentaron en un formato secuencial en el
Paquete de Inferencias de filogenia (PHYLIP) versión 3.5 (programa
de dominio público disponible libremente de la Universidad de
Washington, Seattle, USA). Se produjeron matrices de distancia
mediante DNADIST utilizando la asignación del parámetro
Kimura-2 y se analizaron además en NEIGHBOR,
utilizando la asignación de acoplamiento neighbor. Se
utilizó el programa DRAWTREE para crear resultados gráficos.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos análisis indicaron el agrupamiento de
BNL1, BNL2, CAM1078, FR2, FR16 y FR17 con cepas del tipo 1, todavía
ninguna de estas secuencias agrupadas junto con cualquiera de los
subtipos de tipo 1 conocidos 1a, 1b ó 1c. BNL1, BNL2 y FR17 se
agruparon claramente juntas y se podrían asignar a un nuevo subtipo
d de tipo 1, mientras que CAM1078 se podría clasificar en otro
nuevo subtipo 1e, FR2 se podría clasificar en otro subtipo 1f de
tipo 1 y FR16 se podría clasificar todavía en otro subtipo 1g de
tipo 1. Ventajosamente, las 3 cepas del tipo 1d (BNL1, BNL2 y FR17)
y la cepa FR16 del 1g se obtuvieron de pacientes de origen étnico
marroquí que residían en Europa.
Otro grupo de cepas mostró homología en otras
secuencias de tipo 2, pero ninguna de las cepas BNL3, FR4, BNL4,
BNL5, BNL6, FR13 ó FR18 se prodrían clasificar en uno de los
subtipos 2a, 2b, 2c conocidos de tipo 2 (Bukh y otros, 1993), ó 2d
(Stuyver y otros, hacia 1994). Basada en las distancias
filogenéticas a otras cepas de tipo 2 y a otras cepas del grupo,
cada una de estas cepas se podría clasificar en un nuevo subtipo del
tipo 2. A BNL3 se le asignó el subtipo 2e, a FR4 el subtipo 2f, a
BNL4 el subtipo 2g, a BNL5 el subtipo 2h y BNL6 se prodría
clasificar todavía en otro subtipo 2i del tipo 2. Si la cepa HN4
publicada anteriormente está clasificada como 2j, las FR13 y FR18
se pueden clasificar en dos nuevos subtipos 2k y 2l del tipo 2. Sin
embargo, la posibilidad de que FR13 y FR18 puedan pertenecer a los
subtipos 2g ó 2i no ha sido todavía excluida. La clasificación
definitiva se puede conseguir determinando las secuencias NS5B de
las cepas BNL4 y BNL6, que pertenecen a los subtipos 2g y 2i,
respectivamente.
La cepa PAK64 presentaba homología con las
secuencias de tipo 3, pero no se podía clasificar en uno de los
subtipos 3a a f de tipo 3. Basado en las distancias filogenéticas a
otras cepas de tipo 3, PAK64 se podría clasificar en un nuevo
subtipo de tipo 3. A PAK64 se le asignó el subtipo 3g. Sin embargo,
la posibilidad de que PAK64 pertenezca a un nuevo subtipo de tipo 3
no se puede excluir estrictamente ya que se ha secuenciado
solamente una zona del genoma. La clasificación definitiva se puede
conseguir determinando las secuencias de la parte central/E1 de la
cepa PAK64 tras la amplificación con los cebadores HcPr52 y
HcPr54.
Entre las muestras del Benelux y de Egipto que
se analizaron, algunas secuencias se agruparon con los subtipos 4c
y 4d del tipo 4 identificados anteriormente. Sin embargo, BNL7,
BNL8, BNL9, BNL10, BNL11, BNL12 y EG81 se agruparon en nuevos
subtipos de tipo 4. Las cepas BNL7, BNL8, BNL9, BNL10 y BNL11 se
agruparon de nuevo por separado de BNL12 y EG81 en un nuevo subtipo
4k. Este subtipo fue el subtipo predominante en los países del
Benelux. BNL12 y EG81 se segregaron así mismo en subtipos separados.
A BNL12 se asignó a otro nuevo subtipo 41 y EG81 se asignó a todavía
otro nuevo subtipo 4m.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas FR1, VN4, VN12, VN13, NE98, FR14, FR15
y FR19 no se agrupan con ninguno de los tipos 6 principales del
HCV. VN4, VN12 y VN13 estaban muy distanciadas respecto al genotipo
6, pero los análisis filogenéticos indicaban que estas cepas
deberían estar asignadas a nuevos tipos principales. VN13, VN4 y
VN12 se relacionaron con el nivel del subtipo y se asignaron a los
tipos 7a, 7c y 7d, respectivamente.
FR1 no se relacionó con ninguna cepa conocida y
se le asignó el genotipo 9a. NE98 presenta una distancia relacionada
con las secuencias de tipo 3. FR14, FR15 y FR19 presentan una
distancia muy relacionada con las secuencias de tipo 2, todavía el
análisis filogenético indicó que las cepas a clasificar en un nuevo
tipo 11 principal, pertenecen todas al mismo subtipo denominado
11a. Dependiendo de las pautas internacionales de asignación de los
nivelas de tipo y subtipo, FR14, FR15 y FR19 se pueden también
clasificar en un subtipo de tipo 2 adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Barany F (1991). Genetic disease
detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase.
Proc Natl Acad Sci USA 88: 189-193.
Bej A, Mahbubani M, Miller
R, Di Cesare J, Haff L, Atlas R (1990)
Mutiplex PCR amplification and immobilized capture probes for
detection of bacterial pathogens and indicators in water. Mol
Cell Probes 4:353-365.
Bukh J, Purcell R, Miller R
(1992). Sequence analysis of the 5' noncoding region of
hepatitis C virus. Proc Natl. Acad. Sci USA 89:
4942-4946.
Bukh J, Purcell R, Miller R
(1993). At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted
by sequence analysis of the putative E1 gene of isolates collected
worldwide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
8234-8238.
Cha T, Beal E, Irvine B,
Kolberg J, Chien D, Kuo G, Urdea M
(1992) At least five related, but distinct, hepatitis C viral
genotypes exist. Proc Natl Acad Sci USA
89:7144-7148.
Chan S-W, Simmonds
P, McOmish F, Yap P, Mitchell R, Dow B,
Follett E (1991) Serological responses to infection
with three different types of hepatitis C virus. Lancet
338:1991.
Chan S-W, McOmish
F, Holmes E, Dow B, Peutherer J, Follett
E, Yap P, Simmonds P (1992) Analysis of a new
hepatitis C virus type and its phylogenetic relationship to existing
variants. J Gen Virol 73:1131-1141.
Chomczynski P, Sacchi N
(1987) Single step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction.
Anal Biochem 162:156-159.
Choo Q, Richman K, Han J,
Berger K, Lee C, Dong C, Gallegos C,
Coit D, Medina-Selby A, Barr P,
Weiner A, Bradley D, Kuo G, Houghton M
(1991) Genetic organization and diversity of the hepatitis C
virus. Proc Natl Acad Sci USA
88:2451-2455.
Compton J (1991). Nucleic acid
sequence-based amplification. Nature,
350:91-92.
Duchosal A, Eming S, Fisher
P (1992) Immunization of
hu-PBL-SCID mice and the resue of
human monoclonal Fab fragments through combinatorial libraries.
Nature 355:258-262.
Duck P (1990). Probe amplifier
system based on chimeric cycling oligonucleotides.
Biotechniques 9, 142-147.
Guatelli J, Whitfield K,
Kwoh D, Barringer K, Richmand D,
Gengeras T (1990) Isothermal, in vitro
amplification of nucleid acids by a multienzyme reaction modeled
after retroviral replication. Proc Natl Acad Sci USA 87:
1874-1878.
Hijikata M, Kato N,
Ootsuyama Y, Nakagawa M, Shimotohmo K
(1991) Gene mapping of the putative structural region of the
hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis.
Proc Natl Acad Sci USA 88, 5547-5551.
Jacobs K, Rudersdorf R,
Neill S, Dougherty J, Brown E, Fritsch E
(1988) The thermal stability of oligonucleotide duplexes is
sequence independent in tetraalkylammonium salt solutions:
application to identifying recombinant DNA clones. Nucl Acids
Res 16:4637-4650.
Kato N, Hijikata M,
Ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S,
Sugimura T, Shimotohno K (1990) Molecular
cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients
with non-A, non-B hepatitis. Proc
Natl Acad Sci USA 87:9524-9528.
Kwoh D, Davis G, Whitfield
K, Chappelle H, Dimichele L, Gingeras T
(1989). Transcription-based amplification
system and detection of amplified human inmmunodeficiency virus type
1 with a bead-based sandwich hybridization format.
Proc Natl Acad Sci USA, 86:1173-1177.
Kwok S, Kellogg D, McKinney
N, Spasic D, Goda L, Levenson C, Sinisky
J (1990). Effects of primer-template
mismatches on the polymerase chain reaction: Human immunodeficiency
views type 1 model studies. Nucl. Acids. Res., 18: 999.
Landgren U, Kaiser R,
Sanders J, Hood L (1988). A
ligase-mediated gene detection technique.
Science 241: 1077-1080.
Lizardi P, Guerra C, Lomeli
H, Tussie-Luna I, Kramer F
(1988) Exponential amplification of recombinant RNA
hybridization probes. Bio/Technology 6:
1197-1202.
Lomeli H, Tyagi S,
Printchard C, Lisardi P, Kramer F (1989)
Quantitative assays based on the use of replicatable hybridization
probes. Clin Chem 35: 1826-1831.
Machida A, Ohnuma H, Tsuda
F, Munekata E, Tanaka T, Akahane Y,
Okamoto H, Mishiro S (1992) Hepatology
16. 886:891.
Maniatis T, Fritsch E,
Sambrook J (1982) Molecular cloning: a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, HY.
Mori S, Kato N, Yagyu A,
Tanaka T, Ikeda Y, Petchclai B,
Chiewsilp P, Kurimura T, Shimotohno K
(1992) A new type of hepatitis C virus in patients in
Thailand. Biochem Biophys Res Comm
183:334-342.
\newpage
Okamoto H. Okada S,
Sugiyama Y, Kurai Z, Iizuka H, Machida
A, Miyakawa Y, Mayumi M (1991) Nucleotide
sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a
human carrier: comparison with reported isolates for conserved and
divergent regions. J. Gen. Virol
72:2697-2704.
Okamoto H, Kurai K, Okada
S, Yamamoto K, Lizuka H, Tanaka T,
Fukuda S, Tsuda F, Mishiro S (1992)
Full-lenght sequences of a hepatitis C virus genome
having poor homology to reported isolates: comparative study of four
distinct genotypes. Virology 188:331-341.
Persson M, Caothien R,
Burton D (1991). Generation of diverse
hight-affinity human monoclonal antibodies by
repertoire cloning. Proc Natl Acad Sci USA
89:2432-2436.
Saiki R, Gelfand D, Stoffel
S, Scharf S, Higuchi R, Horn G, Mullis
K, Erlich H (1988). Primer-directed
enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science 239:487-491.
Saiki R, Walsh P, Levenson
C, Erlich H (1989) Genetic analysis of amplified DNA
with immobilized sequence-specific oligonucleotide
probes (1989) Proc Natl Acad Sci USA
86:6230-6234.
Sano T, Smith C, Cantor C
(1992) Immuno-PCR: very sensitive antigen
detection by means of specific antibody-DNA
conjugates. Science 258:120-122.
Simmonds P, McOmsh F, Yap
P, Chan S, Lin C, Dusheiko G, Saeed A,
Holmes E (1993a), Sequence variability in the 5'
non-coding region of hepatitis C virus:
identification of a new virus type and restrictions on sequence
diversity. J Gen Virology, 74:661-668.
Stuyver L, Rossau R, Wyseur
A, Duhamel M, Vanderborght B, Van Heuverswyn H,
Maertens G (1993b) Typing of hepatitis C virus (HCV)
isolates and characterization of new (sub)types using a Line
Probe Assay. J. Gen Virology, 74:
1093-1102.
Tokita et al. (1994)
Hepatitis C virus variants from Vietnam are classifiable into the
seventh, eighth, and ninth major genetic groups. Proc Natl Acad
Sci, 91:11022-11026.
Walker G, Little M, Nadeau
J, Shank D (1992). Isothermal in vitro
amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system
Proc. Natl. Acad Sci USA 89:392-396.
Wu D, Wallace B (1989). The
ligation amplification reaction (LAR)-amplification
of specific DNA sequences using sequential rounds of
template-dependent ligation. Genomics
4:560-569.
Miller P, Yano J, Yano E,
Carroll C, Jayaram K, Ts'o P (1979)
Nonionic nucleic acid analogues. Synthesis and characterization of
dideoxyribonucleoside methylphosphonates. Biochemistry
18(23):5134-43.
Nielsen P, Egholm M, Berg
R, Buchardt O (1991)
Sequence-selective recognition of DNA by strand
displacement with a thymine-substituted polyamide.
Science 254(5037): 1497-500.
Nielsen P, Egholm M, Berg
R, Buchardt O (1993) Sequence specific inhibition of
DNA restriction enzyme cleavage by PNA.
Nucleic-Acids-Res.
21(2): 197-200.
Asseline U, Delarue M,
Lancelot G, Toulme F, Thuong N (1984)
Nucleic acid-binding molecules with high affinity
and base sequence specificity: intercalating agents covalently
linked to oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81(11): 3297-301.
Matsukura M, Shinozuka K,
Zon G, Mitsuya H, Reitz M, Cohen J,
Broder S (1987) Phosphorothioate analogs of
oligodeoxynucleotides: inhibitors of replication and cytopathic
effects of human immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84(21): 7706-10.
Maertens, G., Ducatteeuw, A.,
Stuyver, L., Vandeponseele, P., Venneman, A.,
Wyseur, A., Bosman, F., Heijtink, R. & de
Martynoff, G. (1994) Low prevalence of
anti-E1 antibodies reactive to recombinant type 1b
E1 envelope protein in type 2, 3 and 4 sera, but high prevalence in
subtypes 1a and 1b. In: Viral Hepatitis and Liver Disease,
Proceedings of the International Symposium on Viral Hepatitis and
Liver Disease (Eds. Nishioka, K., Suzuki, H., Mishiro, S., and Oda,
T.), pp 314-316, Springer-Verlag
Tokyo.
Simmonds, P., Rose, K.A.,
Graham, S., Chan, S.-W., McOmish, F.,
Dow, B.C., Follett, E.A.C., Yap, P.L., &
Marsden, H (1993b) Mapping of
serotype-specific, immunodominant epitopes in the
NS4 region of hepatitis C virus (HCV): Use of
type-specific peptides to serologically discriminate
infections with HCV type 1,2 and 3. J. Clin. Microbiol. 31,
1493-1503.
Simmonds, P., Holmes, E.C.,
Cha, T.-A., Chan, S.-W., McOmish, F.,
Irvine, B., Beall, E., Yap, P.L.,
Kolberg, J., & Urdea, M.S. (1993c) J.
Gen. Virol. 74, 2391-2399.
Stuyver, L., Van Arnhem, W.,
Wyseur, A. & Maertens, G. (1994) Cloning
and phylogenetic analysis of the Core, E2, and NS3/4 regions of
hepatitis C virus type 5a. Biochem. Biophys. Res. Comm. 202,
1308-1314.
Simmonds, P., Alberti, A.,
Alter, H., Bonino, F., Bradley, D.W.
Bréchot, C., Brouwer, J., Chan, S.-W.,
Chayama K., Chen, D.-S., Choo, Q.-L.,
Colombo, M., Cuypers, T., Date, T.,
Dusheiko, G., Esteban, J.I., Fay, O.,
Hadziyannis, S., Han, J., Hatzakis, A.,
Holmes, E.C., Hotta, H., Houghton, M.,
Irvine, B., Kohara, M., Kolberg, J.A.,
Kuo, G., Lau, J. Y.N., Lelie, P.N.
Maertens G., McOmish, F., Miyamura, T.,
Mizokami, M., Nomoto, A., Prince A.M.,
Reesink, H.W., Rice, C., Roggendorf, M.,
Schalm, S., Shikata, T., Shimotohno, K.,
Stuyver, L., Trépo, C., Weiner, A., Yap,
P.L. & Urdea, M.S. (1994) A proposed system for
the nomenclature of hepatitis C virus genotypes. Hepatology
19, 1321-1324.
Stuyver, L., Van Arnhem, W.,
Wyseur, A., DeLeys, R & Maertens, G.
(1993a) Analysis of the putative E1 envelope and NS4a epitope
regions of HCV type 3. Biochem. Biophys. Res. Comm. 192,
635-641.
Stuyver, L., Rossau, R.,
Wyseur, A., Duhamel, M., Vanderborght, B., Van
Heuverswyn, H. & Maertens, G. (1993b)
Tuping of hepatitis C virus isolated and characterization of new
subtypes using a line probe assay. J. Gen. Virol. 74,
1093-1102.
Stuyver, L., Wysseur, A., Van
Arnhem, W., Rossau, R., Delaporte, E.,
Dazza, M.-C., Van Doom, L.-J., Kleter, B. &
Maertens, G. (1994a) The use of a line probe assay as
a tool to detect new types or subtypes of hepatitis C virus. In:
Viral Hepatitis and Liver Disease, Proceedings of the International
Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (Eds. Nishioka, K.,
Suzuki, H., Mishiro, S., and Oda, T.), pp 317-319,
Springer-Verlag Tokyo.
Stuyver, L., Van Arnhem, W.
Wyseur, A. & Maertens, G. (1994b) Cloning
and Phylogenetic analysis of the Core, E2, and NS3/4 regions of the
hepatitis C virus type 5a. Biochem. Biophys. Res. Comm. 202,
1308-1314.
Stuyver, L., Van Arnhem, W.,
Wyseur, A., Hernandez, F., Delaporte, E., &
Maertens, G. (1994c) Classification of hepatitis C
viruses based on phylogenetics analysis of the E1 and NS5B regions
and identification of 5 new subtypes. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91.
Stuyver et al. (1995)
Hepatitis C virus genotyping by means of 5'-UR/core
line probe assays and molecular analysis of untypeable samples.
Virus Reasearch (in press).
Claims (61)
1. Un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7
seleccionado del grupo constituido por:
- -
- una secuencia de nucleótidos de HCV que tiene una homología de al menos 90% o más con las secuencias representadas en SEQ ID NO 45,
- -
- una secuencia de nucleótidos de HCV que tiene homología de al menos 85% o más con cualquiera de las secuencias representadas en SEQ ID NO 43 ó 47,
- -
- una secuencia de nucleótidos de HCV que tiene una homología de al menos 80% o más con cualquiera de las secuencias representadas en SEQ ID NO 89, 91 ó 93,
- -
- o el complemento del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 que
contiene una secuencia de 8 o más nucleótidos contiguos, secuencia
que es exclusiva para una secuencia de nucleótidos de HCV
seleccionada del grupo constituido por:
- -
- SEQ ID NO 45 en la región que abarca las posiciones 1 a 413 de la región Core,
- -
- SEQ ID NO 43 ó 47 en la región que abarca las posiciones 1 a 957 de la región Core/E1,
- -
- SEQ ID NO 89, 91 ó 93 en la región que abarca las posiciones 7932 a 8271 de la región NS5,
- -
- o el complemento del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de
acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que codifica una poliproteína de
HCV tipo 7 que comprende en su secuencia de aminoácidos al menos uno
de los residuos de aminoácidos siguientes:
- A58, H70, Q71 o N71, D106, I134, E135, E150,
K197, L235, A242, E260 o K260, L293, I300, S2646, V2652, Q2653,
H2656, K2663, A2667 o V2667, D2677, I2707, A2709, F2730, L2746,
S2749 o P2749, T2752 o V2752, D2753 o G2753,
estando compuesta dicha notación por una letra
que representa el residuo de aminoácido de acuerdo con su código de
una sola letra, y un número que representa la numeración del
aminoácido como se muestra en la Tabla 1, o el complemento de dicho
poli(ácido nucleico) de HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un poli(ácido nucleico) que codifica una
poliproteína de HCV que comprende en su secuencia de aminoácidos al
menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista
siguiente:
o el complemento de dicho poli(ácido nucleico)
de HCV.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un poli(ácido nucleico) de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que tiene una secuencia
seleccionada de cualquiera de SEQ ID NOs 43, 45, 47, 89, 91 ó 93, o
el complemento de dicho poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 o dicha
parte.
6. Un poli(ácido nucleico) de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que codifica la región 5'
UR, Core/E1, NS4 o NS5B.
7. Un poli(ácido nucleico) de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que es una secuencia de
cDNA.
8. Un iniciador oligonucleotídico que comprende
parte de un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, siendo capaz dicho
iniciador de actuar como iniciador para amplificar específicamente
ácidos nucleicos de HCV tipo 7.
9. Una sonda oligonucleotídica que comprende
parte de un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, siendo capaz dicha sonda
de actuar como sonda de hibridación para detección y/o clasificación
específicas de un ácido nucleico de HCV tipo 7 que contiene dicha
secuencia de nucleótidos.
10. Un kit de diagnóstico para uso en la
determinación del genotipo de HCV, comprendiendo dicho kit un
iniciador de acuerdo con la reivindicación 8.
11. Un kit de diagnóstico para uso en la
determinación del genotipo de HCV, comprendiendo dicho kit una sonda
de acuerdo con la reivindicación 9.
12. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 11, en donde dicha o dichas sondas está(n)
fijada(s) a un sustrato sólido.
13. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 12, en donde una gama de dichas sondas están fijadas
a localizaciones específicas en un sustrato sólido.
14. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 13, en donde dicho sustrato sólido es una tira de
membrana y dichas sondas están acopladas a la membrana en la forma
de líneas paralelas.
15. Un método para la detección de ácidos
nucleicos de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende
determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico de HCV
tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 por
medio de una reacción en secuencia.
16. Un método para la detección de ácidos
nucleicos de HCV presentes en una muestra biológica, que
comprende:
- (i)
- amplificar los ácidos nucleicos de dicha muestra biológica con al menos un iniciador de acuerdo con la reivindicación 8, y,
- (ii)
- detectar los ácidos nucleicos amplificados.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un método para la detección de ácidos
nucleicos de HCV presentes en una muestra biológica, que
comprende:
- (i)
- hibridar los ácidos nucleicos de dicha muestra biológica en condiciones apropiadas con una o más sondas de acuerdo con la reivindicación 9, y,
- (ii)
- detectar los híbridos formados.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Un método para detectar la presencia de uno
o más genotipos de HCV presentes en una muestra biológica, que
comprende:
- (i)
- amplificar específicamente el ácido nucleico con al menos un iniciador de acuerdo con la reivindicación 8,
- (ii)
- detectar dichos ácidos nucleicos amplificados, y,
- (iii)
- inferir la presencia de uno o más genotipos de HCV a partir del patrón observado de fragmentos amplificados.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
19. Un método para detectar la presencia de uno
o más genotipos de HCV presentes en una muestra biológica, que
comprende:
- (i)
- hibridar los ácidos nucleicos de la muestra biológica en condiciones apropiadas con una o más sondas de acuerdo con la reivindicación 9,
- (ii)
- detectar los híbridos formados, y,
- (iii)
- inferir la presencia de uno o más genotipos de HCV del patrón de hibridación observado.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Un método de acuerdo con la reivindicación
19, en donde dichas sondas se caracterizan adicionalmente
como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación
16 ó 18, en donde dichos ácidos nucleicos se marcan durante o
después de la amplificación.
22. Un polipéptido de HCV tipo 7 que tiene una
secuencia de aminoácidos codificada por un poli(ácido nucleico) de
HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
7.
23. Un polipéptido de HCV tipo 7 de acuerdo con
la reivindicación 22 que comprende en su secuencia de aminoácidos al
menos uno de los residuos de aminoácidos siguientes: A58, H70, Q71 o
N71, D106, I134, E135, E150, K197, L235, A242, E260 o K260, L293,
I300, S2646, V2652, Q2653, H2656, K2663, A2667 o V2667, D2677,
I2707, A2709, F2730, L2746, S2749 o P2749, T2752 o V2752, D2753 o
G2753, estando compuesta dicha notación por una letra que representa
el residuo de aminoácido por su código de una sola letra, y un
número que representa la numeración del aminoácido como se muestra
en la Tabla 1.
24. Un polipéptido de HCV tipo 7 de acuerdo con
la reivindicación 22, que comprende en su secuencia de aminoácidos
al menos una de las secuencias representadas por cualquiera de SEQ
ID NOs 115, 116, 136, 137, 153, 154, 172, 173, 188, 189, 205 ó 206
como se enumeran en la reivindicación 4.
25. Un polipéptido de HCV tipo 7 que tiene una
secuencia de aminoácidos como la representada en cualquiera de SEQ
ID NOs 44, 46, 48, 90, 92 ó 94, o una parte de la misma, que es
exclusiva para de HCV tipo 7.
26. Un polipéptido recombinante codificado por
un poli(ácido nucleico) de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7.
27. Un método para producción de un polipéptido
recombinante de la reivindicación 26, que comprende:
- -
- transformar un hospedador celular apropiado con un vector recombinante, en el cual un poli(ácido nucleico) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 se ha insertado bajo el control de los elementos reguladores apropiados,
- -
- cultivar dicho hospedador celular transformado en condiciones que permiten la expresión de dicha inserción, y
- -
- cosechar dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Un vector de expresión recombinante que
comprende un poli(ácido nucleico) de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 enlazado operativamente a elementos de
transcripción procariotas, eucariotas o virales y elementos de
control de la traducción.
29. Una célula hospedadora transformada con un
vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 28.
30. Un método para detección de anticuerpos
para de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
- (i)
- poner en contacto la muestra biológica a analizar en cuanto a la presencia de HCV con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, y,
- (ii)
- detectar el complejo inmunológico formado entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
31. Un método para tipificación de HCV, que
comprende:
- (i)
- poner en contacto la muestra biológica a analizar respecto a la presencia de HCV con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, y,
- (ii)
- detectar el complejo inmunológico formado entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido.
\global\parskip1.000000\baselineskip
32. Un kit de diagnóstico para uso en la
detección de la presencia de HCV, comprendiendo dicho kit al menos
un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22
a 26.
33. Un kit de diagnóstico para tipificación de
HCV, comprendiendo dicho kit al menos un polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26.
34. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 32 ó 33, comprendiendo dicho kit una gama de
polipéptidos que están fijados a localizaciones específicas sobre un
sustrato sólido.
35. Un kit de diagnóstico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en donde dicho sustrato
sólido es una tira de membrana y dichos polipéptidos están acoplados
a la membrana en la forma de líneas paralelas.
36. Una composición farmacéutica que comprende
al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 26 y un excipiente, diluyente o vehículo
adecuado.
37. Uso de una composición farmacéutica de
acuerdo con la reivindicación 36 para la preparación de una
composición farmacéutica que estimula la producción de anticuerpo
protector o respuesta protectora de las células T.
38. Uso de una composición de acuerdo con la
reivindicación 36 para la preparación de una composición
farmacéutica para prevención de la infección por HCV.
39. Una vacuna para inmunización de un mamífero
contra la infección por HCV, que comprende al menos un polipéptido
de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a
26, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
40. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
39, que comprende al menos un polipéptido de HCV tipo 7 de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26.
41. Un péptido de HCV tipo 7 correspondiente a
una secuencia de aminoácidos codificada por al menos uno de los
poli(ácidos nucleicos) de HCV tipo 7 de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7.
42. Un método para detección de anticuerpos para
de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
- (i)
- poner en contacto la muestra biológica a analizar en cuanto a la ausencia de anticuerpos de HCV con un péptido de acuerdo con la reivindicación 41, y,
- (ii)
- detectar el complejo inmune formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
43. Un método para tipificación de HCV, que
comprende:
- (i)
- poner en contacto la muestra biológica a analizar en cuanto a la presencia de HCV con un péptido de acuerdo con la reivindicación 41, y,
- (ii)
- detectar el complejo inmune formado entre dichos anticuerpos y dicho péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
44. Un kit de diagnóstico para uso en la
detección de la presencia de HCV, comprendiendo dicho kit al menos
un péptido de acuerdo con la reivindicación 41.
45. Un kit de diagnóstico para tipificación de
HCV, comprendiendo dicho kit al menos un péptido de acuerdo con la
reivindicación 41.
46. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 44 ó 45, en donde dichos péptidos se seleccionan de
la lista siguiente:
- -
- al menos un péptido NS4,
- -
- al menos un péptido NS4 y al menos un péptido Core,
- -
- al menos un péptido NS4 y al menos un péptido Core y al menos un péptido E1, o,
- -
- al menos un péptido NS4 y al menos un péptido E1.
\vskip1.000000\baselineskip
47. Un kit de diagnóstico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46, comprendiendo dicho kit
una gama de péptidos que están fijados a localizaciones específicas
en dicho sustrato sólido.
48. Un kit de diagnóstico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 44 a 47, en donde dicho sustrato
sólido es una tira de membrana y dichos péptidos están acoplados a
la membrana en forma de líneas paralelas.
49. Una composición farmacéutica que comprende
al menos un péptido de acuerdo con la reivindicación 41 y
excipiente, diluyente o vehículo adecuado.
50. Uso de una composición farmacéutica de
acuerdo con la reivindicación 49 para la preparación de una
composición farmacéutica que estimula la producción de anticuerpo
protector o respuesta protectora de las células T.
51. Uso de una composición de acuerdo con la
reivindicación 49 para la preparación de una composición
farmacéutica que previene la infección por HCV.
52. Una vacuna para inmunizar un mamífero contra
la infección por HCV, que comprende al menos un péptido de acuerdo
con la reivindicación 41, en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
53. Un anticuerpo generado por inmunización con
al menos un polipéptido o péptido de HCV tipo 7 de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26 ó 41, siendo dicho
anticuerpo específicamente reactivo con cualquiera de dichos
polipéptidos o péptidos, y siendo preferiblemente dicho anticuerpo
un anticuerpo monoclonal.
54. Un método para la detección de los antígenos
de HCV presentes en una muestra biológica, que comprende:
- (i)
- poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53, y,
- (ii)
- detectar los complejos inmunes formados entre dichos antígenos de HCV y dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
55. Un método para tipificación de HCV, que
comprende:
- (i)
- poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53, y,
- (ii)
- detectar los complejos inmunes formados entre dichos antígenos de HCV y dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
56. Un kit de diagnóstico para uso en la
detección de la presencia de HCV, comprendiendo dicho kit al menos
un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53.
57. Un kit de diagnóstico para tipificación de
HCV, comprendiendo dicho kit al menos un anticuerpo de acuerdo con
la reivindicación 53.
58. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 56 ó 57, comprendiendo dicho kit una gama de
anticuerpos que están fijados a localizaciones específicas en un
sustrato sólido.
59. Una composición farmacéutica que comprende
al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 53, y un
excipiente, diluyente o vehículo adecuado.
60. Uso de una composición farmacéutica de
acuerdo con la reivindicación 59 para la preparación de una
composición farmacéutica que previene o trata la infección por
HCV.
61. Uso de una composición de acuerdo con la
reivindicación 59 para la preparación de una vacuna para tratar o
prevenir la infección por HCV.
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---|---|---|---|
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EP94870166 | 1994-10-21 | ||
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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Family
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7129337B1 (es) |
EP (2) | EP0804584B2 (es) |
JP (2) | JPH10507643A (es) |
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BR (1) | BR9509421A (es) |
CA (1) | CA2201703A1 (es) |
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DK (1) | DK0804584T3 (es) |
ES (1) | ES2176342T5 (es) |
PT (1) | PT804584E (es) |
WO (1) | WO1996013590A2 (es) |
Families Citing this family (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9620075D0 (en) * | 1996-09-26 | 1996-11-13 | Dynal As | Method |
US7078500B1 (en) * | 1998-01-30 | 2006-07-18 | The General Hospital Corporation | Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus |
ES2310701T3 (es) | 1998-04-17 | 2009-01-16 | Innogenetics N.V. | Metodos para mejorar la conformacion de proteinas por medio de agentes reductores. |
WO1999055385A2 (de) * | 1998-04-28 | 1999-11-04 | Wolfgang Bergter | Radioimmunpharmaka zur therapie der hepatitis c |
DE69922958T3 (de) * | 1998-06-24 | 2008-06-26 | Innogenetics N.V. | Hcv hüllproteine partikel : verwendung für therapeutische impfung |
KR100801123B1 (ko) * | 2000-08-17 | 2008-02-05 | 트리펩 아베 | 리바비린 함유 백신 및 이것의 사용 방법 |
US6858590B2 (en) * | 2000-08-17 | 2005-02-22 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
US7022830B2 (en) * | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
US6680059B2 (en) * | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
US7101561B2 (en) | 2000-12-01 | 2006-09-05 | Innogenetics N.V. | Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
GB0126782D0 (en) * | 2001-11-07 | 2002-01-02 | Medical Res Council | Assay |
ES2596753T3 (es) * | 2003-08-29 | 2017-01-11 | Fujirebio Europe N.V. | Nuevo clado del virus de la hepatitis C y secuencias prototipo del mismo |
US7473773B2 (en) * | 2004-01-07 | 2009-01-06 | Third Wave Technologies, Inc. | Determination of hepatitis C virus genotype |
RU2267496C2 (ru) * | 2004-01-15 | 2006-01-10 | Сергей Иванович Черныш | Противоопухолевые и антивирусные пептиды |
US7968697B2 (en) * | 2005-05-25 | 2011-06-28 | Chrontech Pharma Ab | Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene |
US8067208B2 (en) | 2005-06-30 | 2011-11-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Probes and methods for hepatitis C virus typing using multidimensional probe analysis |
KR101505201B1 (ko) | 2005-12-12 | 2015-03-24 | 에이씨 이뮨 에스.에이. | 치료적 특성을 갖는 베타 1-42 특이적인 단일클론성 항체 |
CL2007002070A1 (es) | 2006-07-14 | 2008-02-08 | Ac Immune S A Genentech Inc | Anticuerpo quimerico o humanizado, o fragmentos de ellos, que se adhieren especificamente a por lo menos un epitopo en la proteina beta-amiloide; molecula de acido nucleico que lo codifica; composicion que lo comprende; su uso para tratar enfermedade |
KR20190003862A (ko) | 2006-07-14 | 2019-01-09 | 에이씨 이뮨 에스.에이. | 아밀로이드 베타에 대해 인간화된 항체 |
KR101500017B1 (ko) | 2006-08-25 | 2015-03-09 | 더 맥파레인 버넷 인스티튜트 포 메디칼 리서치 앤드 퍼블릭 헬스 리미티드 | 재조합 hcv e2 당단백질 |
US20110136678A1 (en) | 2006-10-20 | 2011-06-09 | Erwin Sablon | Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns3/4a genomic region |
US20090325145A1 (en) | 2006-10-20 | 2009-12-31 | Erwin Sablon | Methodology for analysis of sequence variations within the hcv ns5b genomic region |
US20100183513A1 (en) | 2006-11-24 | 2010-07-22 | Wolfgang Froestl | N-(methyl) -1h-pyrazol-3-amine, n-(methyl)-pyridin-2-amine and n-(methyl)-thiazol-2-amine derivatives for the treatment of diseases associated with amyloid or amyloid-like proteins, like e.g. alzheimer's |
NZ601843A (en) | 2007-06-12 | 2014-01-31 | Ac Immune Sa | Monoclonal anti beta amyloid antibody |
EP2574345A1 (en) | 2007-06-12 | 2013-04-03 | AC Immune S.A. | Humanized antibodies to amyloid beta |
EA018102B1 (ru) * | 2007-08-09 | 2013-05-30 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ идентификации генотипа и подтипа вируса гепатита c на биологическом микрочипе |
US20090214593A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-08-27 | Tripep Ab | Immunogen platform |
US8071561B2 (en) | 2007-08-16 | 2011-12-06 | Chrontech Pharma Ab | Immunogen platform |
EP2650308A3 (en) | 2007-10-05 | 2014-11-12 | Genentech, Inc. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
EP2311823A1 (en) | 2009-10-15 | 2011-04-20 | AC Immune S.A. | 2,6-Diaminopyridine compounds for treating diseases associated with amyloid proteins or for treating ocular diseases |
US20110256064A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Ac Immune, S.A. | Novel Compounds for the Treatment of Diseases Associated with Amyloid or Amyloid-like Proteins |
DK2558446T5 (da) | 2010-04-16 | 2019-12-09 | Ac Immune Sa | Nye forbindelser til behandling af sygdomme associerede med amyloid- eller amyloidlignende proteiner |
US8962241B2 (en) * | 2010-07-20 | 2015-02-24 | California Institute Of Technology | Triggered molecular geometry based bioimaging probes |
NZ606357A (en) | 2010-07-30 | 2015-05-29 | Genentech Inc | Safe and functional humanized anti beta-amyloid antibody |
CA2812865C (en) | 2010-10-07 | 2021-01-26 | Ac Immune S.A. | Phosphospecific antibodies recognising tau |
KR101854943B1 (ko) | 2010-10-26 | 2018-05-04 | 에이씨 이뮨 에스.에이. | 소수성 부분을 통해 변형된 펩티드를 포함하는 리포솜 기반 구조체 |
EP3135689B1 (en) | 2011-10-07 | 2018-12-19 | AC Immune S.A. | Phosphospecific antibodies recognising tau |
BR112014024769A2 (pt) | 2012-04-05 | 2017-12-12 | Ac Immune Sa | anticorpo humanizado tau |
SI2859017T1 (sl) | 2012-06-08 | 2019-05-31 | Sutro Biopharma, Inc. | Protitelesa, ki vsebujejo specifične nenaravne aminokislinske ostanke, postopki njihove priprave in postopki njihove uporabe |
EP2863955B1 (en) | 2012-06-26 | 2016-11-23 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use |
CN102766701B (zh) * | 2012-07-04 | 2016-05-04 | 福州泰普生物科学有限公司 | 丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒及方法 |
ES2728864T3 (es) | 2012-08-31 | 2019-10-29 | Sutro Biopharma Inc | Aminoácidos modificados que comprenden un grupo azido |
MX2015012872A (es) | 2013-03-15 | 2016-02-03 | Ac Immune Sa | Anticuerpos anti-tau y metodos de uso. |
WO2014183109A1 (en) * | 2013-05-10 | 2014-11-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for simultaneous detection of hcv antigen/antibody |
ES2865473T3 (es) | 2013-07-10 | 2021-10-15 | Sutro Biopharma Inc | Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso |
MX2016002719A (es) | 2013-09-05 | 2016-09-06 | Ab2 Bio Sa | Proteina de union a interleucina 18 (il-18bp) en enfermedades inflamatorias. |
EP3055298B1 (en) | 2013-10-11 | 2020-04-29 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use |
MY194040A (en) | 2015-03-05 | 2022-11-09 | Ab2 Bio Sa | Il-18 binding protein (il-18bp) and antibodies in inflammatory diseases |
WO2017218698A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies with engineered ch2 domains, compositions thereof and methods of using the same |
GB201807367D0 (en) | 2018-05-04 | 2018-06-20 | Univ Newcastle | Biomarker |
US20230095053A1 (en) | 2020-03-03 | 2023-03-30 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use |
US20230173021A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-06-08 | Ab2 Bio Sa | IL-18 Binding Protein (IL-18BP) In Respiratory Diseases |
EP3943097A1 (en) | 2020-07-24 | 2022-01-26 | AB2 Bio SA | Car-t cell therapy |
WO2023166206A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Ab2 Bio Sa | Il-18 binding protein (il-18bp) in the treatment of vexas |
WO2024006563A1 (en) | 2022-07-01 | 2024-01-04 | Sutro Biopharma, Inc. | Il-12 mutants with reduced toxicity, compositions thereof and methods of using the same |
WO2024044780A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Sutro Biopharma, Inc. | Interleukin-18 variants and uses thereof |
WO2024098023A2 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Sutro Biopharma, Inc. | Interferon alpha polypeptides and conjugates |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990011089A1 (en) | 1989-03-17 | 1990-10-04 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics and vaccines |
CA2065287C (en) | 1989-09-15 | 1999-12-21 | Tatsuo Miyamura | New hcv isolates |
US5372928A (en) | 1989-09-15 | 1994-12-13 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus isolates |
LU87861A1 (fr) | 1989-12-18 | 1991-10-08 | Wellcome Found | Agent viral |
AU652941B2 (en) | 1990-06-25 | 1994-09-15 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, The | Non-A, Non-B hepatitis virus particles |
JPH06508026A (ja) | 1991-05-08 | 1994-09-14 | カイロン コーポレイション | 診断と治療に用いるhcvゲノム配列 |
RU2148587C1 (ru) * | 1991-06-24 | 2000-05-10 | Чирон Корпорейшн | Полипептид и способ его получения, реагент для иммуноанализа, способ определения присутствия антител и способ индукции иммунного ответа |
EP0532167A3 (en) | 1991-08-09 | 1993-03-31 | Immuno Japan Inc. | Non-a, non-b hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems |
PL171489B1 (pl) | 1991-09-13 | 1997-05-30 | Chiron Corp | Sposób wytwarzania kompozycji immunogenicznej reagujacej immunologicznie krzyzowo z wieloma izolatami HCV PL |
EP0610436B9 (en) | 1991-11-21 | 2003-03-26 | Common Services Agency | Hepatitis-c virus testing |
EP0984068B1 (en) * | 1993-04-27 | 2012-03-28 | Innogenetics N.V. | Sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
JPH06319563A (ja) * | 1993-05-13 | 1994-11-22 | Imuno Japan:Kk | C型肝炎ウイルス遺伝子、オリゴヌクレオチド、並びにc型 肝炎ウイルス遺伝子型判定方法 |
US5514539A (en) | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
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1995
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MAERTENS et al. | Patent 2201703 Summary |