JPH06319563A - Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、オリゴヌクレオチド、並びにｃ型 肝炎ウイルス遺伝子型判定方法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、オリゴヌクレオチド、並びにｃ型 肝炎ウイルス遺伝子型判定方法Info
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- JPH06319563A JPH06319563A JP14713393A JP14713393A JPH06319563A JP H06319563 A JPH06319563 A JP H06319563A JP 14713393 A JP14713393 A JP 14713393A JP 14713393 A JP14713393 A JP 14713393A JP H06319563 A JPH06319563 A JP H06319563A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】新規に解明されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
の遺伝子、特異オリゴヌクレオチド、これら検出する方
法、ＨＣＶの遺伝子型を判定する方法等を提供すること
を目的とする。 【構成】配列番号１ないし５記載の塩基配列を有するポ
リヌクレオチド、配列番号６記載のオリゴヌクレオチ
ド、これらをプライマー、プローブ等として使用するＨ
ＣＶ遺伝子の検出法、遺伝子型判定法の発明、ならびに
配列番号１５ないし１９記載のポリペプタイドの発明で
ある。 【効果】新たに発見された遺伝子型のＨＣＶ遺伝子を検
出するとともに、広い範囲に渉ってＨＣＶ遺伝子型を判
定することができる。
の遺伝子、特異オリゴヌクレオチド、これら検出する方
法、ＨＣＶの遺伝子型を判定する方法等を提供すること
を目的とする。 【構成】配列番号１ないし５記載の塩基配列を有するポ
リヌクレオチド、配列番号６記載のオリゴヌクレオチ
ド、これらをプライマー、プローブ等として使用するＨ
ＣＶ遺伝子の検出法、遺伝子型判定法の発明、ならびに
配列番号１５ないし１９記載のポリペプタイドの発明で
ある。 【効果】新たに発見された遺伝子型のＨＣＶ遺伝子を検
出するとともに、広い範囲に渉ってＨＣＶ遺伝子型を判
定することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以
下「ＨＣＶ」と略記する）のｃＤＮＡ遺伝子、これを構
成する特異オリゴヌクレオチド、これに由来する蛋白
質、ペプタイド、ならびにこれらを用いたＨＣＶ遺伝子
型判定法に関する。
下「ＨＣＶ」と略記する）のｃＤＮＡ遺伝子、これを構
成する特異オリゴヌクレオチド、これに由来する蛋白
質、ペプタイド、ならびにこれらを用いたＨＣＶ遺伝子
型判定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９８８年にＨＣＶ遺伝子の一部が解明
され発表されて以来、ＨＣＶ診断への応用可能な数多く
の技術が開発され実用化されてきた。これまで、ＨＣＶ
感染によって患者血液中に現われるＨＣＶ抗体を検出す
る抗体検査法、ならびに体内に存在するＨＣＶ遺伝子を
検出する方法が開発され広く用いられてきたが、さらに
ＨＣＶの遺伝子型を判定する方法が研究、開発され、本
発明者らもこれに深く関与してきた。これらの診断技術
に於ける現時点の最重要課題は、高い感度と各遺伝子型
に対する高い特異性を実現することである。この技術課
題を解決する為には、ＨＣＶの各遺伝子型に特異的な遺
伝子配列あるいは特異抗原の特定とそれに基づく診断技
術の確立が急務である。実際に、いくつかのＨＣＶ株に
ついては遺伝子の全配列が解明されており、さらに他の
株については遺伝子配列の一部が解明され、ＨＣＶ特異
遺伝子の配列の特定あるいはＨＣＶ特異アミノ酸配列の
特定に利用された。その結果、従来の検査法に比べ、こ
れらの情報に基づいて開発された最近の診断法は高い特
異性と感度を有するようになり、これにもとづいて、適
切な治療方針を採用できるようになりはじめた。しか
し、他方、これらの検査法を用いた場合でも、なお捕捉
できないＨＣＶ疾患例があることも判明しており、より
高い特異性と感度を有する診断法の開発が望まれてい
る。
され発表されて以来、ＨＣＶ診断への応用可能な数多く
の技術が開発され実用化されてきた。これまで、ＨＣＶ
感染によって患者血液中に現われるＨＣＶ抗体を検出す
る抗体検査法、ならびに体内に存在するＨＣＶ遺伝子を
検出する方法が開発され広く用いられてきたが、さらに
ＨＣＶの遺伝子型を判定する方法が研究、開発され、本
発明者らもこれに深く関与してきた。これらの診断技術
に於ける現時点の最重要課題は、高い感度と各遺伝子型
に対する高い特異性を実現することである。この技術課
題を解決する為には、ＨＣＶの各遺伝子型に特異的な遺
伝子配列あるいは特異抗原の特定とそれに基づく診断技
術の確立が急務である。実際に、いくつかのＨＣＶ株に
ついては遺伝子の全配列が解明されており、さらに他の
株については遺伝子配列の一部が解明され、ＨＣＶ特異
遺伝子の配列の特定あるいはＨＣＶ特異アミノ酸配列の
特定に利用された。その結果、従来の検査法に比べ、こ
れらの情報に基づいて開発された最近の診断法は高い特
異性と感度を有するようになり、これにもとづいて、適
切な治療方針を採用できるようになりはじめた。しか
し、他方、これらの検査法を用いた場合でも、なお捕捉
できないＨＣＶ疾患例があることも判明しており、より
高い特異性と感度を有する診断法の開発が望まれてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＨＣＶはその遺伝子配
列が初めて解明されてからまだ時間が浅く、ウイルス本
体は未だ確認されていない。また、全遺伝子配列が解明
されたＨＣＶ株もまだ少数であり、ＨＣＶの遺伝特性を
完全に解明したとは言えないのが実態である。したがっ
て、現在までに発表された遺伝子配列が全てのＨＣＶに
共通の情報を提供しているものか否かは明らかでない。
完全なＨＣＶ診断法を完成させるためには、現在の診断
法では捕捉できないＨＣＶの遺伝子特性を解明し、その
情報を反映させた診断法の構築が不可欠である。本発明
の目的は、今日までのＨＣＶ検査法では十分に特徴付け
られないＨＣＶ株の遺伝子配列を明かにいるとともに
し、その遺伝子特性を解明することにより、正確かつ広
範な適用範囲をもつ遺伝子型判定法と、これに用いるオ
リゴヌクレオチド等を提供することである。
列が初めて解明されてからまだ時間が浅く、ウイルス本
体は未だ確認されていない。また、全遺伝子配列が解明
されたＨＣＶ株もまだ少数であり、ＨＣＶの遺伝特性を
完全に解明したとは言えないのが実態である。したがっ
て、現在までに発表された遺伝子配列が全てのＨＣＶに
共通の情報を提供しているものか否かは明らかでない。
完全なＨＣＶ診断法を完成させるためには、現在の診断
法では捕捉できないＨＣＶの遺伝子特性を解明し、その
情報を反映させた診断法の構築が不可欠である。本発明
の目的は、今日までのＨＣＶ検査法では十分に特徴付け
られないＨＣＶ株の遺伝子配列を明かにいるとともに
し、その遺伝子特性を解明することにより、正確かつ広
範な適用範囲をもつ遺伝子型判定法と、これに用いるオ
リゴヌクレオチド等を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、今日まで
の各種ＨＣＶの検査では十分に特徴付けられないＨＣＶ
株の遺伝子本体の解明を目的として、鋭意研究を進めた
が、その結果、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性でありながら、従来
の遺伝子型判定法では型判定できなかったヒト検体から
ＲＮＡを単離し、これを用いて未知のＨＣＶ株の全遺伝
子配列を決定した。さらに本発明者らは、この新規の遺
伝子配列と従来報告された各遺伝子型の公知のＨＣＶ遺
伝子配列とを比較した結果、本発明のＨＣＶ株が公知の
遺伝子型のいずれに相当するものでなく、全く別の新し
い遺伝子型であることを解明した（発明者らは暫定的に
この遺伝子型を１ｃ型と命名した）。これに基づいて、
本発明者らは、１ｃ型遺伝子型に特異的で他の遺伝子型
には存在しない遺伝子配列を特定した。この配列を有す
るオリゴヌクレオチドをプライマーあるいはプローブと
して使用することにより１ｃ型の遺伝子型判定が可能に
なった。さらに公知の遺伝子型を含めた全ての遺伝子型
に共通な遺伝子配列を特定するとともに、この配列を有
するオリゴヌクレオチドと１ｃ型に特異的な配列を有す
る本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用
することによりで一度の検査で遺伝子型の判定が実現で
きることを見出し、本発明を完成した。本発明のポリヌ
クレオチドおよびオリゴヌクレオチドからなるプイラマ
ーならびにプローブは、ＨＣＶ各遺伝子型に共通する遺
伝子あるいは型特異的な遺伝子配列に対して特異的に結
合することにより作用を発揮するものである。ポリヌク
レオチドならびにオリゴヌクレオチドの結合には配列上
若干のの差異があっても影響を受けないことは周知のこ
とであるから、本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチドに対して若干の置換を有するポリヌクレオ
チドならびにオリゴヌクレオチドも当然本発明の範囲に
包含される。
の各種ＨＣＶの検査では十分に特徴付けられないＨＣＶ
株の遺伝子本体の解明を目的として、鋭意研究を進めた
が、その結果、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性でありながら、従来
の遺伝子型判定法では型判定できなかったヒト検体から
ＲＮＡを単離し、これを用いて未知のＨＣＶ株の全遺伝
子配列を決定した。さらに本発明者らは、この新規の遺
伝子配列と従来報告された各遺伝子型の公知のＨＣＶ遺
伝子配列とを比較した結果、本発明のＨＣＶ株が公知の
遺伝子型のいずれに相当するものでなく、全く別の新し
い遺伝子型であることを解明した（発明者らは暫定的に
この遺伝子型を１ｃ型と命名した）。これに基づいて、
本発明者らは、１ｃ型遺伝子型に特異的で他の遺伝子型
には存在しない遺伝子配列を特定した。この配列を有す
るオリゴヌクレオチドをプライマーあるいはプローブと
して使用することにより１ｃ型の遺伝子型判定が可能に
なった。さらに公知の遺伝子型を含めた全ての遺伝子型
に共通な遺伝子配列を特定するとともに、この配列を有
するオリゴヌクレオチドと１ｃ型に特異的な配列を有す
る本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用
することによりで一度の検査で遺伝子型の判定が実現で
きることを見出し、本発明を完成した。本発明のポリヌ
クレオチドおよびオリゴヌクレオチドからなるプイラマ
ーならびにプローブは、ＨＣＶ各遺伝子型に共通する遺
伝子あるいは型特異的な遺伝子配列に対して特異的に結
合することにより作用を発揮するものである。ポリヌク
レオチドならびにオリゴヌクレオチドの結合には配列上
若干のの差異があっても影響を受けないことは周知のこ
とであるから、本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチドに対して若干の置換を有するポリヌクレオ
チドならびにオリゴヌクレオチドも当然本発明の範囲に
包含される。
【０００５】すなわち、本発明は公知のＨＣＶとは異な
る新しい遺伝子型である１ｃ型を有するＨＣＶたるＨＣ
−Ｇ９のｃＤＮＡ遺伝子の発明であり、またその特異的
遺伝子配列の一部を構成する、あるいはこれに相補的な
塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドに関する発明であり、具体的には配列番号１ない
し５記載の塩基配列、またはこれに相補的な塩基配列の
全部あるいは一部を有するポリヌクレオチドあるいはオ
リゴヌクレオチドの発明である。本発明は、上記オリゴ
ヌクレオチドからなるプライマー、プローブ、あるいは
標識されたプローブの発明であり、また配列番号６記載
の塩基配列の全部あるいは一部を有するプライマーある
いはプローブに関する発明である。本発明は、上記プラ
イマーと、配列番号７ないし１４記載の遺伝子配列を有
するオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを組み合
わせて利用し、ＨＣＶ遺伝子の検出、遺伝子型の判定を
行うことができる混合プライマーに関する発明である。
また、本発明は上記プライマーあるいはプローブを単
独、あるいは同時に使用することによってＨＣＶの遺伝
子を検出する方法、または遺伝子型を判定する方法の発
明である。
る新しい遺伝子型である１ｃ型を有するＨＣＶたるＨＣ
−Ｇ９のｃＤＮＡ遺伝子の発明であり、またその特異的
遺伝子配列の一部を構成する、あるいはこれに相補的な
塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドに関する発明であり、具体的には配列番号１ない
し５記載の塩基配列、またはこれに相補的な塩基配列の
全部あるいは一部を有するポリヌクレオチドあるいはオ
リゴヌクレオチドの発明である。本発明は、上記オリゴ
ヌクレオチドからなるプライマー、プローブ、あるいは
標識されたプローブの発明であり、また配列番号６記載
の塩基配列の全部あるいは一部を有するプライマーある
いはプローブに関する発明である。本発明は、上記プラ
イマーと、配列番号７ないし１４記載の遺伝子配列を有
するオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを組み合
わせて利用し、ＨＣＶ遺伝子の検出、遺伝子型の判定を
行うことができる混合プライマーに関する発明である。
また、本発明は上記プライマーあるいはプローブを単
独、あるいは同時に使用することによってＨＣＶの遺伝
子を検出する方法、または遺伝子型を判定する方法の発
明である。
【０００６】本発明者らは、実施例１に示すように、従
来の遺伝子型判定法では型判定ができなかったＨＣＶ抗
体陽性の複数のヒト検体より所定の方法でＲＮＡを抽出
し、ＨＣ−Ｇ９については全域の遺伝子配列を特定し、
該ＨＣＶをＨＣ−Ｇ９と命名し、残りの２検体について
はその一部の配列を特定し、該検体をＳ１１７、ＳＲ０
３７と命名した。その塩基配列は配列番号１ないし５記
載のとおりである。ＨＣ−Ｇ９の全遺伝子配列は３′端
側に見られたＴストレッチ部分を除いて９４４０個の塩
基から成り、５′端に３４１塩基からなる非翻訳領域
を、続いて９０３３塩基からなり３０１１アミノ酸をコ
ードする領域が、更にこれに続く３’端に６６塩基から
なる非翻訳領域より構成されることが判明した。
来の遺伝子型判定法では型判定ができなかったＨＣＶ抗
体陽性の複数のヒト検体より所定の方法でＲＮＡを抽出
し、ＨＣ−Ｇ９については全域の遺伝子配列を特定し、
該ＨＣＶをＨＣ−Ｇ９と命名し、残りの２検体について
はその一部の配列を特定し、該検体をＳ１１７、ＳＲ０
３７と命名した。その塩基配列は配列番号１ないし５記
載のとおりである。ＨＣ−Ｇ９の全遺伝子配列は３′端
側に見られたＴストレッチ部分を除いて９４４０個の塩
基から成り、５′端に３４１塩基からなる非翻訳領域
を、続いて９０３３塩基からなり３０１１アミノ酸をコ
ードする領域が、更にこれに続く３’端に６６塩基から
なる非翻訳領域より構成されることが判明した。
【０００７】本発明者は、実施例２に示すように本発明
の対象である上記各株の塩基配列と公知の４つの遺伝子
型に属する１４株の塩基配列とを比較した、その結果、
上記株の塩基配列と既知の遺伝子型配列との間には２０
％以上の非相同性があり、本発明の遺伝子およびポリヌ
クレオチドは、いずれの公知遺伝子型にも分類できない
新規のものであることが見出された。さらに、本発明者
らは、本発明の遺伝子およびポリヌクレオチドについ
て、一部の遺伝子配列のみが公知であるＨＣＶ株に対し
ても遺伝子配列の比較を行った。その結果、本発明にか
かる遺伝子およびポリヌクレオチドは、上記一部配列の
み判明しているＨＣＶとも別型である独立した遺伝子型
として分類されることを見出した。本発明者らは本発明
にかかる新規のＨＣＶの遺伝子型を暫定的に１ｃ型と命
名した。
の対象である上記各株の塩基配列と公知の４つの遺伝子
型に属する１４株の塩基配列とを比較した、その結果、
上記株の塩基配列と既知の遺伝子型配列との間には２０
％以上の非相同性があり、本発明の遺伝子およびポリヌ
クレオチドは、いずれの公知遺伝子型にも分類できない
新規のものであることが見出された。さらに、本発明者
らは、本発明の遺伝子およびポリヌクレオチドについ
て、一部の遺伝子配列のみが公知であるＨＣＶ株に対し
ても遺伝子配列の比較を行った。その結果、本発明にか
かる遺伝子およびポリヌクレオチドは、上記一部配列の
み判明しているＨＣＶとも別型である独立した遺伝子型
として分類されることを見出した。本発明者らは本発明
にかかる新規のＨＣＶの遺伝子型を暫定的に１ｃ型と命
名した。
【０００８】本発明者らは、実施例２に示すように１ｃ
型ＨＣＶ株の遺伝子型判定に最適な遺伝子領域としてコ
ア領域を特定した。この領域から１ｃ型特異的配列を有
する配列番号６記載のオリゴヌクレオチドを得た。
型ＨＣＶ株の遺伝子型判定に最適な遺伝子領域としてコ
ア領域を特定した。この領域から１ｃ型特異的配列を有
する配列番号６記載のオリゴヌクレオチドを得た。
【０００９】本発明者らは、ＨＣＶの遺伝子検出および
遺伝子型判定に用いるべき領域が、１ｃ型遺伝子型にお
いても他の遺伝子型判定の場合と同様にコア領域にある
ことに注目し、配列番号６記載の本発明のポリヌクレオ
チドと併用することができるポリヌクレオチドを公知の
プライマーのなかから検索した。その結果、配列番号７
記載の公知のオリゴヌクレオチドの配列は１ｃ型にもよ
く保存されており、これがＨＣＶの遺伝子検出および遺
伝子型判定に於ける共通プライマーとして利用可能なこ
とが見出した。配列番号６記載の１ｃ型特異的オリゴヌ
クレオチドプライマーを公知の共通プライマーたる配列
番号７記載のオリゴヌクレオチドプライマーとを組合せ
て使用することによって、１ｃ型の遺伝子を特異的に増
幅できることを見出した。
遺伝子型判定に用いるべき領域が、１ｃ型遺伝子型にお
いても他の遺伝子型判定の場合と同様にコア領域にある
ことに注目し、配列番号６記載の本発明のポリヌクレオ
チドと併用することができるポリヌクレオチドを公知の
プライマーのなかから検索した。その結果、配列番号７
記載の公知のオリゴヌクレオチドの配列は１ｃ型にもよ
く保存されており、これがＨＣＶの遺伝子検出および遺
伝子型判定に於ける共通プライマーとして利用可能なこ
とが見出した。配列番号６記載の１ｃ型特異的オリゴヌ
クレオチドプライマーを公知の共通プライマーたる配列
番号７記載のオリゴヌクレオチドプライマーとを組合せ
て使用することによって、１ｃ型の遺伝子を特異的に増
幅できることを見出した。
【００１０】本発明では遺伝子の増幅方法としてポリメ
ラーゼ、チエイン、リアクション法（ＰＣＲ法）を好適
に利用することができる。その際、プライマーペアとし
ては、配列番号６記載のオリゴヌクレオチドと配列番号
９記載のプライマーペアの組合せも好適である。
ラーゼ、チエイン、リアクション法（ＰＣＲ法）を好適
に利用することができる。その際、プライマーペアとし
ては、配列番号６記載のオリゴヌクレオチドと配列番号
９記載のプライマーペアの組合せも好適である。
【００１１】ＰＣＲ法に於いては、第一段階として各遺
伝子型に共通な領域を増幅し、第二段階として型特異的
な増福を行うことにより、より高感度にＨＣＶ遺伝子の
検出と遺伝子型の判定がなされる。この様態のＰＣＲ法
に使用する好適なオリゴヌクレオチドペアーとしては、
第一段階用として配列番号７記載のオリゴヌクレオチド
と配列番号８記載のオリゴヌクレオチド、第二段階用と
して配列番号６記載のオリゴヌクレオチドと配列番号９
記載のオリゴヌクレオチドを例示することができる。
伝子型に共通な領域を増幅し、第二段階として型特異的
な増福を行うことにより、より高感度にＨＣＶ遺伝子の
検出と遺伝子型の判定がなされる。この様態のＰＣＲ法
に使用する好適なオリゴヌクレオチドペアーとしては、
第一段階用として配列番号７記載のオリゴヌクレオチド
と配列番号８記載のオリゴヌクレオチド、第二段階用と
して配列番号６記載のオリゴヌクレオチドと配列番号９
記載のオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００１２】また、本発明の方法によれば本発明の新規
オリゴヌクレオチド（配列番号６）を配列番号７記載な
いし配列番号１４の各既知遺伝子型特異的オリゴヌクレ
オチドプライマーまたは、共通オリゴヌクレオチドプラ
イマーとを同時に使用し、ＰＣＲ法あるいは公知の２段
階ＰＣＲ法使用して、一度の操作によりＨＣＶ遺伝子を
検出し、また遺伝子型を判定することができる。
オリゴヌクレオチド（配列番号６）を配列番号７記載な
いし配列番号１４の各既知遺伝子型特異的オリゴヌクレ
オチドプライマーまたは、共通オリゴヌクレオチドプラ
イマーとを同時に使用し、ＰＣＲ法あるいは公知の２段
階ＰＣＲ法使用して、一度の操作によりＨＣＶ遺伝子を
検出し、また遺伝子型を判定することができる。
【００１３】また、本発明者らは公知の宿主に組み込ん
で発現させ、また常法により化学合成して、本発明のポ
リペプタイドを得た。
で発現させ、また常法により化学合成して、本発明のポ
リペプタイドを得た。
【００１４】本発明のポリペプタイドにおけるアミノ酸
配列は、公知の遺伝子型ＨＣＶにおけるポリペプタイド
とコア領域において高い相同性を有するが、エンベロー
ブ（Ｅ１）およびＥ２／ＮＳ１ではその相同性が低く、
型特異的であることを示している。Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１
はウイルス粒子表面に存在する蛋白質と考えられ、この
部分に対する抗体を有する症例も少なからず見出され
る。したがって、本発明のポリペプタイドおよびその部
分オリゴペプタイドは１ｃ型特異的に抗エンベローブ抗
体の検出系の作成や、ＨＣＶワクチンに使用することが
できる。またＮＳ２〜ＮＳ５領域はプロテアーゼ等の非
構造蛋白質をコードしていると考えられ、本発明のポリ
ペプタイドおよびその部分オリゴペプタイドは非特異的
な抗体検出系やＨＣＶ増殖阻害剤の開発に用いることが
できる。
配列は、公知の遺伝子型ＨＣＶにおけるポリペプタイド
とコア領域において高い相同性を有するが、エンベロー
ブ（Ｅ１）およびＥ２／ＮＳ１ではその相同性が低く、
型特異的であることを示している。Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１
はウイルス粒子表面に存在する蛋白質と考えられ、この
部分に対する抗体を有する症例も少なからず見出され
る。したがって、本発明のポリペプタイドおよびその部
分オリゴペプタイドは１ｃ型特異的に抗エンベローブ抗
体の検出系の作成や、ＨＣＶワクチンに使用することが
できる。またＮＳ２〜ＮＳ５領域はプロテアーゼ等の非
構造蛋白質をコードしていると考えられ、本発明のポリ
ペプタイドおよびその部分オリゴペプタイドは非特異的
な抗体検出系やＨＣＶ増殖阻害剤の開発に用いることが
できる。
【００１５】
【作用】本発明は、新たに見いだされた遺伝子型である
１ｃ型のＨＣＶを含め、従来よりも広汎な遺伝子型のＨ
ＣＶを高感度に検出し、またそのＨＣＶの各遺伝子型と
同時に特異的に判定することができる。本発明の遺伝
子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマ
ー、蛋白質、ペプタイドはＣＶ遺伝子の検出ならびに遺
伝子型判定に供することができる。
１ｃ型のＨＣＶを含め、従来よりも広汎な遺伝子型のＨ
ＣＶを高感度に検出し、またそのＨＣＶの各遺伝子型と
同時に特異的に判定することができる。本発明の遺伝
子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマ
ー、蛋白質、ペプタイドはＣＶ遺伝子の検出ならびに遺
伝子型判定に供することができる。
【００１６】
【実施例】以下、本発明の実施例についての述べるが、
もとより本発明がこれらの実施例に眼定されるものでは
ない。
もとより本発明がこれらの実施例に眼定されるものでは
ない。
【００１７】実施例１ 従来の遺伝子型に分類されない複数の新規ＨＣＶ株を見
出し、その全塩基配列および一部の塩基配列を次のよう
にして決定した。
出し、その全塩基配列および一部の塩基配列を次のよう
にして決定した。
【００１８】（１）ＲＮＡの抽出 市販のＨＣＶ抗体検査薬および本発明者らによって開発
され特許出願中の抗体検査法（特願平２−１５３４０
１）ならびに、本発明者らによって別途特許出願された
オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＨＣＶ検出法
（特開平５−２３２００）によりＨＣＶ感染が確認され
ているが、本発明者により別途特許出願されているＨＣ
Ｖ遺伝子型判定に関する方法（特願平３−３０７２９
６、４−０９３９６０）ではその遺伝子型判定ができな
かった肝炎患者由来の血液検体（ＨＣ−Ｇ９、ＹＳ１１
７，およびＳＲ０３７）から次のようにしてＲＮＡを抽
出した。血清５０μｌに適当量のトリス緩衝液（１０ｍ
Ｍ、ｐＨ８．０）を加え、９０×１０３ｒｐｍにて１５
分間の遠心分離を行った。得られたペレットに２００ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％（重量／容積）
のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌの
プロテナーゼＫを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ
８．０）を加え、６０℃で１時間加温し、フェノール／
クロロフォルムで抽出を行った後、エタノール沈澱を行
いＲＮＡを得た。
され特許出願中の抗体検査法（特願平２−１５３４０
１）ならびに、本発明者らによって別途特許出願された
オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＨＣＶ検出法
（特開平５−２３２００）によりＨＣＶ感染が確認され
ているが、本発明者により別途特許出願されているＨＣ
Ｖ遺伝子型判定に関する方法（特願平３−３０７２９
６、４−０９３９６０）ではその遺伝子型判定ができな
かった肝炎患者由来の血液検体（ＨＣ−Ｇ９、ＹＳ１１
７，およびＳＲ０３７）から次のようにしてＲＮＡを抽
出した。血清５０μｌに適当量のトリス緩衝液（１０ｍ
Ｍ、ｐＨ８．０）を加え、９０×１０３ｒｐｍにて１５
分間の遠心分離を行った。得られたペレットに２００ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％（重量／容積）
のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と１ｍｇ／ｍｌの
プロテナーゼＫを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ
８．０）を加え、６０℃で１時間加温し、フェノール／
クロロフォルムで抽出を行った後、エタノール沈澱を行
いＲＮＡを得た。
【００１９】（２）ｃＤＮＡの作製 各検体より得たＲＮＡを７０℃で１分間加温した後、こ
れを急冷し鋳型ＲＮＡとした。この鋳型ＲＮＡサンプル
に１００ユニットの逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐ
ｔ；ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ）およびオリゴヌクレオチドプ
ライマー２０ｐｍｏｌを加え、４２℃、１時間反応させ
てｃＤＮＡを得た。
れを急冷し鋳型ＲＮＡとした。この鋳型ＲＮＡサンプル
に１００ユニットの逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐ
ｔ；ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ）およびオリゴヌクレオチドプ
ライマー２０ｐｍｏｌを加え、４２℃、１時間反応させ
てｃＤＮＡを得た。
【００２０】（３）ｃＤＮＡのポリメラーゼチェインリ
アクション（ＰＣＲ）による増幅 上記の操作により得られた単鎖ｃＤＮＡについて、図１
に示す領域別に、表１に示す各領域毎に設定したセンス
側オリゴヌクレオチドプライマーならびにアンチセンス
側オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーペ
アーを用て増幅を行った。増福は、ＤＮＡサーマルサイ
クラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ．Ｃｅｔｕｓ）にＧ
ｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用いてＳａｉｋｉらの方
法［Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２３９、ｐ４８７−４９
１（１９８８）］に従って３５回の増幅サイクルからな
るＰＣＲ法にて実施した。
アクション（ＰＣＲ）による増幅 上記の操作により得られた単鎖ｃＤＮＡについて、図１
に示す領域別に、表１に示す各領域毎に設定したセンス
側オリゴヌクレオチドプライマーならびにアンチセンス
側オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーペ
アーを用て増幅を行った。増福は、ＤＮＡサーマルサイ
クラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ．Ｃｅｔｕｓ）にＧ
ｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ）を用いてＳａｉｋｉらの方
法［Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２３９、ｐ４８７−４９
１（１９８８）］に従って３５回の増幅サイクルからな
るＰＣＲ法にて実施した。
【００２１】
【図１】
【００２２】
【表１】
【００２３】（４）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
ＨＣ−Ｇ９、ＹＳ１１７，およびＳＲ０３７の塩基配列
の決定 ＰＣＲにて増幅した各検体由来の各領域遺伝子をＴ４ポ
リヌクレオチドカイネース（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋ
ａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で処理後、Ｍ１３
ファージベクターに挿入し、クローン化した。塩基配列
決定はｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎ法にて、Ｓ ｅｑｕｅｎｃｅｎａｓｅ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｋｉｔ ｖｅｒ ２．０（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｒ
ａｒｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｎｉｃａｌｓ）あるいはＡｕｔ
ｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を用いて行った。各検体について、各領
域３クローンを得、それぞれについて配列を決定し、各
クローンに共通する塩基、あるいは一致率の高い塩基を
採用して配列を決定した。ＨＣ−Ｇ９については全領域
を、ＹＳ１１７ならびにＳＲ０３７については５’端よ
り６３番目の塩基から１８６７番目の塩基までの配列と
８２５９番目から９４４０番目までの配列について決定
した。配列表１にＨＣ−Ｇ９、配列表２にＹＳ１１７、
の５′側、配列表３にＹＳ１１７、の３′側、配列表４
にＳＲ０３７の５′側、配列表５にＳＲ０３７の塩基配
列の３′側の各塩基配列を示す。表２にＨＣ−Ｇ９、Ｙ
Ｓ１１７、ＳＲ０３７の配列間の相同性を示す。その結
果、これら３検体の塩基配列の相同性は９５％あり、上
記の３検体のＨＣＶは同一の遺伝子型に分類される。図
２にＨＣ−Ｇ９とこれまでに全域の塩基配列が解明され
ている１４のＨＣＶ株との塩基配列の相同性を示す。そ
の結果、ＨＣ−Ｇ９はいずれの既知の遺伝子型株の塩基
配列とも２０％以上の非相同性をしめすことが判明し
た。このことからＨＣ−Ｇ９を含む３検体由来のＨＣＶ
は従来の遺伝子型とは異なる新しい遺伝子型に分類され
ることを確認した。遺伝子配列に基づく系統分類の推定
より、この新たに見いだされた遺伝子型は大きく１型と
呼ばれる分類に属し、その分類にはすでにＩ型、ＩＩ型
が存在し、これらは１ａならびに１ｂと呼称されている
ことから、これに倣って１ｃ型と暫定的に呼ぶこととし
た。
ＨＣ−Ｇ９、ＹＳ１１７，およびＳＲ０３７の塩基配列
の決定 ＰＣＲにて増幅した各検体由来の各領域遺伝子をＴ４ポ
リヌクレオチドカイネース（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋ
ａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で処理後、Ｍ１３
ファージベクターに挿入し、クローン化した。塩基配列
決定はｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎ法にて、Ｓ ｅｑｕｅｎｃｅｎａｓｅ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｋｉｔ ｖｅｒ ２．０（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｒ
ａｒｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｎｉｃａｌｓ）あるいはＡｕｔ
ｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を用いて行った。各検体について、各領
域３クローンを得、それぞれについて配列を決定し、各
クローンに共通する塩基、あるいは一致率の高い塩基を
採用して配列を決定した。ＨＣ−Ｇ９については全領域
を、ＹＳ１１７ならびにＳＲ０３７については５’端よ
り６３番目の塩基から１８６７番目の塩基までの配列と
８２５９番目から９４４０番目までの配列について決定
した。配列表１にＨＣ−Ｇ９、配列表２にＹＳ１１７、
の５′側、配列表３にＹＳ１１７、の３′側、配列表４
にＳＲ０３７の５′側、配列表５にＳＲ０３７の塩基配
列の３′側の各塩基配列を示す。表２にＨＣ−Ｇ９、Ｙ
Ｓ１１７、ＳＲ０３７の配列間の相同性を示す。その結
果、これら３検体の塩基配列の相同性は９５％あり、上
記の３検体のＨＣＶは同一の遺伝子型に分類される。図
２にＨＣ−Ｇ９とこれまでに全域の塩基配列が解明され
ている１４のＨＣＶ株との塩基配列の相同性を示す。そ
の結果、ＨＣ−Ｇ９はいずれの既知の遺伝子型株の塩基
配列とも２０％以上の非相同性をしめすことが判明し
た。このことからＨＣ−Ｇ９を含む３検体由来のＨＣＶ
は従来の遺伝子型とは異なる新しい遺伝子型に分類され
ることを確認した。遺伝子配列に基づく系統分類の推定
より、この新たに見いだされた遺伝子型は大きく１型と
呼ばれる分類に属し、その分類にはすでにＩ型、ＩＩ型
が存在し、これらは１ａならびに１ｂと呼称されている
ことから、これに倣って１ｃ型と暫定的に呼ぶこととし
た。
【００２４】
【図２】
【００２５】
【表２】
【００２６】実施例２ １ｃ型ＨＣＶ遺伝子型判定法 （１）１ｃ型ＨＣＶの遺伝子型判定に適したプライマー
の選択 １ｃ型ＨＣＶの遺伝子型の判定に使用するプライマーを
選択するために、実施例１によって明らかになった配列
に基づき、１ｃ型ＨＣＶに於て最も塩基配列がよく保存
されており且つ既存の遺伝子型のＨＣＶ株とは相同性が
低い遺伝子領域を検索した。その結果、遺伝子判定に適
した保存領域は他の遺伝子型と同様にコア領域であるこ
とが判明した。これに基づき、コア領域より１ｃ型に特
異的な遺伝子断片の増幅に適した配列を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーの選択を行った。その結果、第一
段階の遺伝子増幅に使用するオリゴヌクレオチドプライ
マーとして配列表７および配列表８に記載した＃１８６
と＃２５６を選択し、続く第二段階増幅に使用するオリ
ゴヌクレオチドプライマーとして配列表９に記載した＃
１０４と本発明の＃３２１（配列表６）プライマーを選
択した。＃１８６、＃２５６ならびに＃１０４のオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、本発明者らにより既に報告
されており（特願平３−３０７２９６、特願平４−０９
３９６０）公知の遺伝子型判定法で使用されているオリ
ゴヌクレオチドプライマーであるが、実施例１によって
解明された１ｃ型ＨＣＶの配列にもとづき、本発明に於
いても利用可能であると判断された。これらのオリゴヌ
クレオチドプライマーは、本発明に於いて遺伝子型に特
異的な保存塩基配列を増幅する為に使用される。他方、
本発明の＃３２１オリゴヌクレオチドプライマーは実施
例１で解明した１ｃ型についてのみ特異性を有するオリ
ゴヌクレオチドプライマーである。
の選択 １ｃ型ＨＣＶの遺伝子型の判定に使用するプライマーを
選択するために、実施例１によって明らかになった配列
に基づき、１ｃ型ＨＣＶに於て最も塩基配列がよく保存
されており且つ既存の遺伝子型のＨＣＶ株とは相同性が
低い遺伝子領域を検索した。その結果、遺伝子判定に適
した保存領域は他の遺伝子型と同様にコア領域であるこ
とが判明した。これに基づき、コア領域より１ｃ型に特
異的な遺伝子断片の増幅に適した配列を有するオリゴヌ
クレオチドプライマーの選択を行った。その結果、第一
段階の遺伝子増幅に使用するオリゴヌクレオチドプライ
マーとして配列表７および配列表８に記載した＃１８６
と＃２５６を選択し、続く第二段階増幅に使用するオリ
ゴヌクレオチドプライマーとして配列表９に記載した＃
１０４と本発明の＃３２１（配列表６）プライマーを選
択した。＃１８６、＃２５６ならびに＃１０４のオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、本発明者らにより既に報告
されており（特願平３−３０７２９６、特願平４−０９
３９６０）公知の遺伝子型判定法で使用されているオリ
ゴヌクレオチドプライマーであるが、実施例１によって
解明された１ｃ型ＨＣＶの配列にもとづき、本発明に於
いても利用可能であると判断された。これらのオリゴヌ
クレオチドプライマーは、本発明に於いて遺伝子型に特
異的な保存塩基配列を増幅する為に使用される。他方、
本発明の＃３２１オリゴヌクレオチドプライマーは実施
例１で解明した１ｃ型についてのみ特異性を有するオリ
ゴヌクレオチドプライマーである。
【００２７】（２）本発明の＃３２１を使用したＨＣＶ
遺伝子の検出と１ｃ型ＨＣＶの遺伝子型判定 各遺伝子型のＨＣＶ株（ＨＣ−Ｊ１：Ｉ型、ＨＣ−Ｊ
４：ＩＩ型、ＨＣ−Ｊ６：ＩＩＩ型、ＨＣ−Ｊ８：ＩＶ
型）ならびにＨＣ−Ｇ９由来のＲＮＡから、＃１８６の
プライマーを使用してｃＤＮＡを得た。続いてｃＤＮＡ
を＃２５６ならびに＃１８６のプライマーを使用したＰ
ＣＲを利用して第一段階の増幅を行った。第一段階のＰ
ＣＲは、９４℃による変性１分、５５℃によるプライマ
ー結合反応１分３０秒、７２℃によるプライマー伸長反
応２分を１サイクルとし３５サイクル行った。第二段階
の増幅は、型特異オリゴヌクレオチドプライマーである
配列番号１１〜１４記載の＃２９６、＃１３３、＃１３
４、＃１３５および本発明の＃３２１プライマー、なら
びに型共通オリゴヌクレオチドプライマーである配列番
号９記載の＃１０４プライマーを用いたＰＣＲにて実施
した。第一段階にて増幅された増幅産物の５０分の１用
量を第二段階増幅のサンプルとしてＰＣＲを行った。反
応条件は９４℃による変性反応３０秒、６０℃によるプ
ライマー結合反応３０秒、７２℃よりなるプライマー伸
長反応３０秒で、各反応からなる１サイクルを合計３０
回繰り返した。第二段階終了後、増幅産物を１．５％の
ＮｕＳｉｅｖｅならびに１．５％のＳｅａＫｅｍ（ＦＭ
Ｃ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いたア
ガロース電気泳動し、終了後エチジウムブロマイド染色
にてＤＮＡを染色し、各バンドの移動位置より遺伝子型
を判定した。各検体の増幅産物の移動度は、各遺伝子型
別に設定されたプライマーの位置より予想された移動
度、すなわち４９、１４４、１７４、１２３、２００ｂ
ｐ（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、１ｃ型）の位置
に泳動され、各遺伝子型が判別できることが確認され
た。また、各検体の電気泳動像には予想される遺伝子型
のバンドのみが見られ、別の型に相当するバンドが現わ
れることはなかった。従って、本発明によるＨＣＶの遺
伝子型判定法は１ｃ型を含めた全ての遺伝子型について
十分に高い特異性を有することが証明された。泳動のパ
ターンを図３に示した。
遺伝子の検出と１ｃ型ＨＣＶの遺伝子型判定 各遺伝子型のＨＣＶ株（ＨＣ−Ｊ１：Ｉ型、ＨＣ−Ｊ
４：ＩＩ型、ＨＣ−Ｊ６：ＩＩＩ型、ＨＣ−Ｊ８：ＩＶ
型）ならびにＨＣ−Ｇ９由来のＲＮＡから、＃１８６の
プライマーを使用してｃＤＮＡを得た。続いてｃＤＮＡ
を＃２５６ならびに＃１８６のプライマーを使用したＰ
ＣＲを利用して第一段階の増幅を行った。第一段階のＰ
ＣＲは、９４℃による変性１分、５５℃によるプライマ
ー結合反応１分３０秒、７２℃によるプライマー伸長反
応２分を１サイクルとし３５サイクル行った。第二段階
の増幅は、型特異オリゴヌクレオチドプライマーである
配列番号１１〜１４記載の＃２９６、＃１３３、＃１３
４、＃１３５および本発明の＃３２１プライマー、なら
びに型共通オリゴヌクレオチドプライマーである配列番
号９記載の＃１０４プライマーを用いたＰＣＲにて実施
した。第一段階にて増幅された増幅産物の５０分の１用
量を第二段階増幅のサンプルとしてＰＣＲを行った。反
応条件は９４℃による変性反応３０秒、６０℃によるプ
ライマー結合反応３０秒、７２℃よりなるプライマー伸
長反応３０秒で、各反応からなる１サイクルを合計３０
回繰り返した。第二段階終了後、増幅産物を１．５％の
ＮｕＳｉｅｖｅならびに１．５％のＳｅａＫｅｍ（ＦＭ
Ｃ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いたア
ガロース電気泳動し、終了後エチジウムブロマイド染色
にてＤＮＡを染色し、各バンドの移動位置より遺伝子型
を判定した。各検体の増幅産物の移動度は、各遺伝子型
別に設定されたプライマーの位置より予想された移動
度、すなわち４９、１４４、１７４、１２３、２００ｂ
ｐ（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、１ｃ型）の位置
に泳動され、各遺伝子型が判別できることが確認され
た。また、各検体の電気泳動像には予想される遺伝子型
のバンドのみが見られ、別の型に相当するバンドが現わ
れることはなかった。従って、本発明によるＨＣＶの遺
伝子型判定法は１ｃ型を含めた全ての遺伝子型について
十分に高い特異性を有することが証明された。泳動のパ
ターンを図３に示した。
【００２８】
【図３】
【００２９】実施例３ 各国別の１ｃ型ＨＣＶの出現頻度 日本、中華人民共和国、タイ、インドネシア、ニュージ
ーランドのＨＣＶ患者検体を対象に１ｃ型の出現頻度を
本発明の実施例２の方法を使用して調べた。その結果は
表３に示すように１ｃ型ＨＣＶはインドネシアに於いて
のみ９．９％の頻度で発見され、限局された地域性を有
することが判明した。
ーランドのＨＣＶ患者検体を対象に１ｃ型の出現頻度を
本発明の実施例２の方法を使用して調べた。その結果は
表３に示すように１ｃ型ＨＣＶはインドネシアに於いて
のみ９．９％の頻度で発見され、限局された地域性を有
することが判明した。
【００３０】
【表３】
【００３１】
【発明の効果】従来４つの型に分類されていたＨＣＶの
遺伝子型は、本発明者らによって新たに５つに分類さ
れ、それぞれ特徴的な塩基配列を有することが見出され
たことにもとづき、本発明では、型特異的な配列を有す
る、あるいは型特異的配列に相補性を有するオリゴヌク
レオチドが提供される。当然、これらのオリゴヌクレオ
チドは遺伝子増幅に於けるプライマーとしてＨＣＶ遺伝
子の検出と遺伝子レベルの型判定に利用できる。また適
当な標識を加えることによりプローブとして単独に、あ
るいは遺伝子増幅と組み合わせることで遺伝子レベルの
型判定に利用できる。本発明により新たに設定されたオ
リゴヌクレオチドプライマーを利用することで、従来法
では判定不可能であった１ｃ型ＨＣＶの遺伝子型も判定
可能になることから、より完全な判定技術が確立された
と考えられる。また、本発明によって明らかにされた１
ｃ型ＨＣＶの遺伝子配列より型特異的な抗原位置の推定
が可能であり、本発明の蛋白質またはポリペプタイドは
遺伝子産物を利用した治療薬開発にも利用できる。
遺伝子型は、本発明者らによって新たに５つに分類さ
れ、それぞれ特徴的な塩基配列を有することが見出され
たことにもとづき、本発明では、型特異的な配列を有す
る、あるいは型特異的配列に相補性を有するオリゴヌク
レオチドが提供される。当然、これらのオリゴヌクレオ
チドは遺伝子増幅に於けるプライマーとしてＨＣＶ遺伝
子の検出と遺伝子レベルの型判定に利用できる。また適
当な標識を加えることによりプローブとして単独に、あ
るいは遺伝子増幅と組み合わせることで遺伝子レベルの
型判定に利用できる。本発明により新たに設定されたオ
リゴヌクレオチドプライマーを利用することで、従来法
では判定不可能であった１ｃ型ＨＣＶの遺伝子型も判定
可能になることから、より完全な判定技術が確立された
と考えられる。また、本発明によって明らかにされた１
ｃ型ＨＣＶの遺伝子配列より型特異的な抗原位置の推定
が可能であり、本発明の蛋白質またはポリペプタイドは
遺伝子産物を利用した治療薬開発にも利用できる。
【００３２】
【配列表】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃３２１） ＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣ ＧＧＧＧＡＴＣＡＧＡ ２０
【００３８】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１８６） ＡＹＧＴＡＣＣＣＣＡ ＹＧＡＧＲＴＣＧＧＣ ２０ （ＹはＴまたはＣ 。ＲはＧまたはＡ）
【００３９】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃２５６） ＣＧＣＧＣＧＭＣＮＡ ＧＧＡＡＲＲＣＴＴＣ ２０ （ＭはＡまたはＣ 。ＮはＡ，Ｔ，ＣまたはＧ 。Ｒは
ＡまたはＧ）
ＡまたはＧ）
【００４０】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１０４） ＡＧＲＡＡＲＲＣＴＴ ＣＳＧＡＧＣＧＲＴＣ ２０ （ＲはＧまたはＡ 。ＳはＣまたはＧ 。）
【００４１】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３２） ＹＲＣＣＴＴＧＧＧＣ ＡＴＡＧＧＣＴＧＡＣ ２０ （ＹはＴまたはＣ 。ＲはＧまたはＡ 。）
【００４２】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３３） ＧＡＲＣＣＡＷＣＣＴ ＧＣＣＣＡＹＣＣＹＡ ２０ （ＲはＧまたはＡ 。ＷはＴまたはＡ 。ＹはＣまたは
Ｔ 。）
Ｔ 。）
【００４３】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３４） ＣＣＡＡＲＡＧＧＧＡ ＣＧＧＧＡＲＣＣＴＣ ２０ （ＲはＧまたはＡ 。）
【００４４】配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃１３５） ＲＣＣＹＴＣＧＴＴＴ ＣＣＲＴＡＣＡＧＲＧ ２０ （ＲはＧまたはＡ 。ＹはＣまたはＴ 。）
【００４５】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列（＃２９６） ＧＧＡＴＡＧＧＣＴＧ ＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴ ２０
【００４６】
【００４７】
【００４８】
【００４９】
【００５０】
【表１】
【表２】
【表３】
【図面の簡単な説明】 図１：ＨＣＶ遺伝子配列決定に利用した増幅領域を示す
図 図２：ＨＣ−Ｇ９とこれまでに全域の塩基配列が解明さ
れている１４のＨＣＶ株との塩基配列の相同性を示す
図。 図３：実施例２にて行った電気泳動試験の泳動パターン
を示す電気泳動写真。（ａ）に従来法による判定を示
す。１ｃ型は検出されない。（ｂ）に＃３２１と＃１０
４での判定を示す。１ｃ型以外は検出されない。１はＨ
Ｃ−Ｊ１、２はＨＣ−Ｊ４、３はＨＣ−Ｊ６、４はＨＣ
−Ｊ８、５はＨＣ−Ｇ９、６はＹＳ１１７、７はＳＲ０
３７を示す。
図 図２：ＨＣ−Ｇ９とこれまでに全域の塩基配列が解明さ
れている１４のＨＣＶ株との塩基配列の相同性を示す
図。 図３：実施例２にて行った電気泳動試験の泳動パターン
を示す電気泳動写真。（ａ）に従来法による判定を示
す。１ｃ型は検出されない。（ｂ）に＃３２１と＃１０
４での判定を示す。１ｃ型以外は検出されない。１はＨ
Ｃ−Ｊ１、２はＨＣ−Ｊ４、３はＨＣ−Ｊ６、４はＨＣ
−Ｊ８、５はＨＣ−Ｇ９、６はＹＳ１１７、７はＳＲ０
３７を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (22)
- 【請求項１】配列番号１記載の塩基配列、またはこれと
相補的な塩基配列を有するＣ型肝炎ウイルス遺伝子ｃＤ
ＮＡ・ＨＣ−Ｇ９。 - 【請求項２】配列番号２記載の塩基配列、またはこれと
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドＹＳ１１７
・５′。 - 【請求項３】配列番号３記載の塩基配列、またはこれと
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドＹＳ１１７
・３′。 - 【請求項４】配列番号４記載の塩基配列、またはこれと
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドＳＲ０３７
・５′。 - 【請求項５】配列番号５記載の塩基配列、またはこれと
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドＳＲ０３７
・３′。 - 【請求項６】配列番号１〜５記載の塩基配列の一部、ま
たはこれと相補的な塩基配列の一部を構成するポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】請求項第６項記載のオリゴヌクレオチドか
らなるプライマーまたはプライマーペア。 - 【請求項８】配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド＃３２１。 - 【請求項９】配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマー。 - 【請求項１０】配列番号６記載の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドプライマーと配列番号７ないし９記載の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーの１種
以上からなるプライマーペア。 - 【請求項１１】配列番号６記載の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドプライマーと配列番号１０ないし１４記
載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーの
１種以上からなるプライマーペア。 - 【請求項１２】請求項第７項ないし第１１項記載のオリ
ゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプ
ライマーペアを使用するＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定
法。 - 【請求項１３】請求項第７項ないし第１０項記載のオリ
ゴヌクレオチドプライマーペアを使用するＣ型肝炎ウイ
ルスの遺伝子検出法。 - 【請求項１４】ポリメラーゼチエインリアクション法に
よりｃＤＮＡを増幅することを特徴とする請求項第１２
項記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定法または請求項
第１３項記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子検出法。 - 【請求項１５】請求項第１１項または第１２項記載のオ
リゴヌクレオチドプライマーを複数組使用し、複数回の
増幅を行う請求項第１３項記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝
子検出法または第１４項記載のＣ型肝炎ウイルス遺伝子
型判定法。 - 【請求項１６】請求項第６項ないし第９項記載の標識プ
ローブ。 - 【請求項１７】請求項第１６項記載の標識プローブを使
用したＣ型肝炎ウイルス遺伝子型判定法。 - 【請求項１８】配列番号１５記載のポリペプタイドＨＣ
−Ｇ９Ｐｅｏｔｅｉｎ、ならびにその部分ペプタイド。 - 【請求項１９】配列番号１６記載のポリペプタイドＹＳ
１１７・５′Ｐｅｐｔｉｄｅ、ならびにその部分ペプタ
イド。 - 【請求項２０】配列番号１７記載のポリペプタイドＹＳ
１１７・３′Ｐｅｐｔｉｄｅ、ならびにその部分ペプタ
イド。 - 【請求項２１】配列番号１８記載のポリペプタイドＳＲ
０３７・５′Ｐｅｐｔｉｄｅ、ならびにその部分ペプタ
イド。 - 【請求項２２】配列番号１９記載のポリペプタイドＳＲ
０３７・３′Ｐｅｐｔｉｄｅ、ならびにその部分ペプタ
イド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14713393A JPH06319563A (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、オリゴヌクレオチド、並びにｃ型 肝炎ウイルス遺伝子型判定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14713393A JPH06319563A (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、オリゴヌクレオチド、並びにｃ型 肝炎ウイルス遺伝子型判定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319563A true JPH06319563A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=15423315
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP14713393A Pending JPH06319563A (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、オリゴヌクレオチド、並びにｃ型 肝炎ウイルス遺伝子型判定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06319563A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6649735B1 (en) | 1992-03-06 | 2003-11-18 | N.V. Innogenetics S.A. | Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them |
| US6709828B1 (en) | 1992-03-06 | 2004-03-23 | N.V. Innogenetics S.A. | Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them |
| US6762024B2 (en) | 1993-04-27 | 2004-07-13 | Innogenetics, S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| US6974864B2 (en) | 1994-10-21 | 2005-12-13 | Innogenetics N.V. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents |
| US7196183B2 (en) | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
| US7255997B1 (en) | 1993-04-27 | 2007-08-14 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| JP2010046064A (ja) * | 1995-02-01 | 2010-03-04 | Srl Inc | Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法 |
| US8124747B2 (en) | 2003-08-29 | 2012-02-28 | Innogenetics | HCV clade and prototype sequences thereof |
-
1993
- 1993-05-13 JP JP14713393A patent/JPH06319563A/ja active Pending
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| US7157226B1 (en) | 1993-04-27 | 2007-01-02 | Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| US7195765B2 (en) | 1993-04-27 | 2007-03-27 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
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| US7855052B2 (en) | 1993-04-27 | 2010-12-21 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| US6974864B2 (en) | 1994-10-21 | 2005-12-13 | Innogenetics N.V. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents |
| US7129337B1 (en) * | 1994-10-21 | 2006-10-31 | Innogenetics N.V. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents |
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