ES2140392T5 - Metodo y composicion para mejorar los efectos adversos del envejecimiento. - Google Patents
Metodo y composicion para mejorar los efectos adversos del envejecimiento.Info
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Abstract
SE HAN DESCUBIERTO CITOQUINAS DE 6-PURINA (DE AMINO SUSTITUIDO, QUE COMPRENDE QUINETINA PARA MEJORAR LOS EFECTOS ADVERSOS DEL ENVEJECIMIENTO DE LAS CELULAS DE LOS MAMIFEROS, RALENTIZANDO O INVIRTIENDO LOS CAMBIOS MORFOLOGICOS QUE ACOMPAÑAN NORMALMENTE AL ENVEJECIMIENTO DE DICHAS CELULAS, SIN AUMENTAR SIGNIFICATIVAMENTE EL NIVEL DE CRECIMIENTO O LA CAPACIDAD PROLIFERATIVA TOTAL DE DICHAS CELULAS. ASI SE PREVEN METODOS PARA CONTRAATACAR LOS EFECTOS ADVERSOS DEL ENVEJECIMIENTO DE LAS CELULAS EN CULTIVO E IN VIVO QUE COMPRENDEN LA ADMINISTRACION DE DICHAS CELULAS EN UNA CANTIDAD DE MEJORAMIENTO DE LOS EFECTOS ADVERSOS DEL ENVEJECIMIENTO DE QUINETINA U OTRA CITOQUINA DE 6-PURINA (AMINO SUSTITUIDA). SE PREVEN TAMBIEN COMPOSICIONES PARA LLEVAR A CABO LOS METODOS. ENTRE LAS APLICACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCION ESTAN LA PRESERVACION DE LA SALUD DE LAS CELULAS DE LOS MAMIFEROS EN CULTIVO, POR APLICACION A LA PIEL HUMANA DE LOCIONES QUE CONTIENEN QUINETINA, UNGUENTOS O CREMAS, LA SALUD Y EL ASPECTODE JUVENTUD DE LA PIEL.
Description
Método y composición para mejorar los efectos
adversos del envejecimiento.
Esta invención se refiere a métodos y
composiciones para mejorar los efectos adversos del envejecimiento
en las células de los mamíferos sin aumentar la tasa de crecimiento
o la capacidad proliferativa total de las células.
Más específicamente, la invención se refiere a
métodos de uso de compuestos conocidos, quinetina y otras
citoquininas de 6-(amino sustituido)-purina, para
responder a los efectos adversos del envejecimiento sobre las
células de los mamíferos en cultivo e in vivo, incluyendo las
células de la piel humana, y a composiciones para llevar a cabo
tales métodos.
La prevención del proceso de envejecimiento
celular ha sido un objetivo persistente, aunque ilusivo, de las
ciencias biológicas. La prevención del proceso de envejecimiento
podría tener una serie de consecuencias prácticas significativas.
Por ejemplo, la producción de productos valiosos por las células en
cultivo podría ser mejorada si las células conservaran las
características de las células jóvenes. También la prevención del
envejecimiento de las células de la piel humana o de otros órganos
podría ser de significativo valor debido a la conservación asociada
de la integridad estructural y funcional. En el caso de la piel, la
mejora de los efectos adversos del envejecimiento celular podría
también incluir ventajosamente la conservación de la integridad
cosmética.
Se han identificado varios atributos para
distinguir entre las células jóvenes y las envejecidas. Por ejemplo,
se ha visto que las células de mamíferos jóvenes, incluyendo los
fibroblastos humanos, en cultivos estándares parecen saludables y
limpias; poseen una morfología fusiforme fina, regular, alargada;
están fuertemente empaquetadas en grupos que se hacen confluentes
sobre los sustratos del cultivo; no crecen una sobre otra; raras
veces tienen más de un núcleo; y producen escasos desechos en el
medio de cultivo. Por otro lado, las células fibroblastos que son
viejas, presentan muchos síntomas relacionados con la edad, tales
como morfología aplanada e irregular, tamaño anormalmente grande,
crecimiento escaso, bajo rendimiento de células por unidad de área
del sustrato de cultivo, una significativa frecuencia de células
polinucleadas, dificultad de tripsinación, y una alta tasa de
producción de desechos en el medio de cultivo. Las características
morfológicas que distinguen las células jóvenes de las viejas, así
como el alto nivel de autofluorescencia encontrado en las células
viejas, reflejan diferentes características fisiológicas y
bioquímicas que distinguen las células jóvenes de las envejecidas,
incluyendo una alta capacidad de respuesta a los factores de
crecimiento y más altas tasas de síntesis de DNA y de proteínas en
las células jóvenes.
Las características morfológicas, fisiológicas y
bioquímicas para distinguir las células jóvenes de las viejas han
sido ampliamente identificadas a partir de estudios de células
(usualmente fibroblastos) de mamíferos, incluyendo los humanos, en
cultivo. En estos estudios, la "edad" de las células en un
cultivo se mide por la cantidad de duplicaciones del número de
células que han tenido lugar desde el cultivo primario (preparado
desde un tejido) hasta el cultivo de interés derivado o descendiente
del cultivo primario.
Además, las características que distinguen las
células jóvenes de las viejas, encontradas en estudios de células en
cultivo, se aplican también a las células que aparecen in
vivo en los mamíferos vivientes y que comparten muchas
características de los fibroblastos cultivados, tales como similares
características bioquímicas y estricta represión del crecimiento (es
decir, estricta represión proliferativa). Los fibroblastos de la
capa dérmica (es decir, dermis) de la piel y de la capa de tejido
conjuntivo subyacente al epitelio de la pared interior del tracto
gastrointestinal, son ejemplos de células que presentan
características de envejecimiento similares a las encontradas para
los fibroblastos en cultivo.
Una medida de la "edad" de tales
fibroblastos en los tejidos de un animal viviente, que normalmente
se dividen periódicamente bajo estricta represión del crecimiento,
es el número de divisiones celulares que han tenido lugar entre las
células y sus predecesores en aproximadamente el tiempo de
nacimiento del mamífero. Debido a que la división celular ocurre
periódicamente, existe típicamente una correlación entre la edad
cronológica del mamífero y la edad de las células particulares
medida por las divisiones celulares entre las células y sus
predecesores en el tiempo del nacimiento.
Otras características de los fibroblastos en
cultivo, es la "capacidad proliferativa total" de las células.
Esta se mide por la cantidad de duplicaciones del número de células
que el cultivo puede experimentar antes de que cese el crecimiento
del cultivo, debido a la muerte (cese del crecimiento y de la
división) de las células "envejecidas" del mismo. Para los
cultivos de fibroblastos humanos, esta capacidad proliferativa total
es típicamente de aproximadamente 45-60
duplicaciones para un cultivo primario. Como se conoce en la
técnica, el cese del crecimiento del cultivo aparece muy
rápidamente, con una tasa de crecimiento (medida por el recíproco
del tiempo de duplicación) que disminuye desde los valores casi
normales característicos de las células jóvenes hasta cero, en sólo
algunas duplicaciones. En los cultivos de fibroblastos normales,
esto es, en los que las células no han sido transformadas hasta un
estado inmortalizado o "canceroso", la "capacidad
proliferativa total" disminuye como función del número de
duplicaciones que separa un cultivo del cultivo primario del cual se
deriva. Otros términos relacionados con la "capacidad
proliferativa total" de las células normales en cultivo, son la
"expectativa de vida" y la "duración normal de vida" de
las células. La "expectativa de vida" o "duración normal de
vida" de las células normales es la "capacidad proliferativa
total" del cultivo primario a partir del cual se deriva el
cultivo en que aparecen las células.
El hecho de que los fibroblastos normales,
particularmente los de origen humano, tienen una capacidad
proliferativa total en cultivo, estrechamente definida (dentro de
algunas duplicaciones), es una manifestación de la estricta
represión proliferativa bajo la que están tales células. Algunas
veces las células que normalmente tienen una capacidad proliferativa
total limitada, pueden ser transformadas para perder esta
limitación. Los cultivos de tales células pueden ser sometidos a
veces a pases repetidos sin ningún límite aparente sobre el número
de pases; tales células se dice que están inmortalizadas. La
inmortalización es una característica de las células cancerosas. Las
células cancerosas tienen poca o ninguna represión
proliferativa.
La medida de la capacidad proliferativa total de
las células in vivo en los animales vivientes, tales como los
fibroblastos de la dermis de la piel o de la capa de tejido
conjuntivo subyacente al epitelio intestinal, no se puede medir de
forma sencilla, como en los fibroblastos en cultivo, en términos de
un número fijado de duplicaciones, limitado a un intervalo estrecho
característico de la especie de mamífero (por ejemplo
45-60 para los humanos, como se ha indicado antes;
aproximadamente 10 para los murinos). Sin embargo, es claro que
tales células en los mamíferos vivientes, si las células son
normales, tienen una capacidad limitada para dividirse y están bajo
una estricta represión proliferativa.
Por ejemplo, los fibroblastos de cultivos
primarios establecidos con células normales a partir de la dermis
humana adulta, se sabe que tienen una capacidad proliferativa total
más baja que los fibroblastos de cultivos primarios establecidos con
células normales a partir de la dermis humana fetal o de recién
nacidos. Ciertamente, a partir de estudios con gran número de
donantes humanos, se pone de manifiesto que los fibroblastos de
cultivos primarios establecidos con células normales de la capa
dérmica, tienen capacidades proliferativas totales en cultivo, que
están inversamente relacionadas con la edad del donante.
La pérdida de la capacidad proliferativa total
limitada, característica de las células en cultivo, que se
transforman al estado inmortalizado o "canceroso", va
acompañada a menudo por una tasa de proliferación anormalmente
aumentada, a la que se denomina aquí "tasa de crecimiento". La
tasa de proliferación o tasa de crecimiento, es una medida del grado
en que se dividen las células.
Similarmente, la pérdida de la estricta represión
proliferativa, que caracteriza a las células cancerosas in
vivo, va acompañada a menudo por una tasa de crecimiento de las
células anormalmente aumentada.
En intentos previos para preservar el fenotipo
"joven" de las células que envejecen in vivo,
invariablemente se han aumentado las tasas de crecimiento de las
células. Se ha encontrado, sin embargo, que el aumento de la tasa de
crecimiento de las células, que necesariamente aumenta la tasa de
división celular, aumenta el riesgo de que las células se
transformen en el estado inmortalizado o canceroso.
Similarmente, se ha encontrado que los
tratamientos que aumentan artificialmente la capacidad proliferativa
total de las células en cultivo, más allá de su límite normal,
aumentan el riesgo de transformación hacia el estado inmortalizado o
canceroso.
Los riesgos de causar transformación, al
intervenir en la estricta represión proliferativa de las células, al
intervenir en las tasas o límites de crecimiento de la capacidad
proliferativa total o en ambos, son debidos presumiblemente a los
efectos de tales intervenciones sobre los genomas celulares o sobre
los mecanismos bioquímicos para controlar la expresión génica.
Además, los tratamientos que, al menos con las
células en cultivo, aumentan la tasa de crecimiento o la capacidad
proliferativa total, tales como los factores de crecimiento
epidérmicos y derivados de las plaquetas, insulina,
glucocorticoides, extractos de gin-seng Panax, y
hormonas vegetales de giberelina, son generalmente efectivos para
preservar el fenotipo "joven" solamente en las células
"jóvenes", para las que los tratamientos son menos necesarios.
Las células "viejas", aquellas que tienen al menos
aproximadamente 80-90% de la duración de su vida
normal transcurrido, responden poco, si lo hacen, al tratamiento,
con incluso altas concentraciones de estas sustancias (mucho más
altas que las que son efectivas con células "jóvenes", con
menos de aproximadamente la mitad de la duración de su vida normal
transcurrida).
Cualquier composición que se va a emplear para
mejorar los efectos adversos del envejecimiento sobre las células y
que aumenta la tasa de crecimiento o la capacidad proliferativa
total de las células, in vivo o en cultivo, debe ser revisada
con precaución, al menos en cuanto a la extensión en que la
composición se va a emplear sobre los tejidos (es decir, piel, pared
intestinal) que normalmente incluyen células bajo estricta represión
proliferativa.
Antes de la presente invención, no ha habido
disponibles composiciones que mejoren los efectos adversos del
envejecimiento sobre las características morfológicas, fisiológicas
y bioquímicas de las células, sin aumentos potencialmente
perjudiciales sobre la tasa de crecimiento o la capacidad
proliferativa total de las células.
Es pertinente para la presente invención entender
el papel de los fibroblastos, particularmente en la dermis de la
piel humana pero también en la correspondiente capa de tejido
conjuntivo subyacente a los tegumentos de otros mamíferos y al
epitelio de la pared interior de los tractos gastrointestinales de
los humanos y otros animales. Los fibroblastos sintetizan varios
componentes requeridos para el mantenimiento de la integridad
estructural, funcional y cosmética de la piel y de la integridad
estructural, funcional y cosmética de estos otros tejidos de
superficie cubiertos por epitelios. Estos componentes incluyen
colágeno y elastina, que son proteínas fibrosas responsables de la
estructura tridimensional de la piel y de otros tejidos de
superficie; fibronectina, una proteína que es responsable del
anclaje de las células y del mantenimiento de la morfología celular;
y varios factores proteináceos de crecimiento esenciales para el
mantenimiento de los epitelios y capas de células basales y las
capas de tejido conjuntivo subyacentes a ellos. Debido al importante
papel de la síntesis de proteínas por los fibroblastos en el
mantenimiento de la salud de la piel y de otros tejidos de
superficie y debido a que la evidencia disponible indica que la
actividad de los fibroblastos en la biosíntesis de proteínas
disminuye significativamente con la edad (por ejemplo, la tasa de
síntesis de colágeno cuando pasan de aproximadamente el 70% de
expectativa de vida para los fibroblastos derivados de feto humano,
es sólo aproximadamente el 50% de la de tales fibroblastos cuando
pasan menos del 20% de expectativa de vida), serían especialmente
ventajosos los métodos y composiciones que mejoren los efectos
adversos del envejecimiento sobre la actividad de biosíntesis de
proteínas de los fibroblastos in vivo, sin afectar la
capacidad proliferativa total o la tasa de crecimiento de tales
fibroblastos,.
La presente invención comprende citoquininas de
6-(amino sustituido)-purina que incluyen quinetina y
sus análogos de 6-amino-purina, de
la fórmula I:
en la que R_{1} es furfurilo, fenilo, bencilo,
n-alquilo de 4, 5 o 6 carbonos,
(ciclohexil)-metilo,
3,3-dimetilalilo, o
3-hidroximetil-3-metilalilo.
Las citoquininas son una clase de hormonas
vegetales definidas por su capacidad para promocionar la división
celular en explantes de tejidos vegetales en medios estándares que
contienen auxinas (otra clase de hormonas vegetales) así como
vitaminas, sales minerales y azúcar.
Los ribonucleótidos en los que una citoquinina,
particularmente quinetina
(6-furfuril-aminopurina), zeatina
(6-(3-hidroximetil-3-metilalil)-aminopurina)
o 6-(3,3-dmetilalil)- aminopurina, es el resto
básico, han sido identificados como componentes de algunos RNA de
transferencia en ciertas células vegetales y animales.
Se sabe que la quinetina forma complejos con
ciertas proteínas RNA-ligantes, de extractos de
embrión de trigo y se ha sugerido que promociona la síntesis de
proteínas en los vegetales. Spirin y Ajtkhozhin, Trends in Biochem.
Sci., April, 1985, p. 162.
Además, se ha usado la quinetina en la producción
de levaduras ricas en proteínas empleando métodos de cultivo
convencionales en los que se añade la quinetina al medio de cultivo.
Patente de Alemania del Este No. 148,889 (1981) (Derwent World
Patent Index Abstract). También se ha publicado que la quinetina
aumenta el crecimiento de los cultivos microbianos. Merck Index,
10^{th} Ed., Entrada 5148 (Merck and Co., Rahway, New Jersey,
U.S.A., 1983).
Finalmente, la patente japonesa No. 60019709
(1985) describe una composición que comprende no más del 1% de
quinetina y no más del 20% de un extracto de raíz de
litospermum no caracterizado, del que se dice que acelera la
división celular en la piel humana y que por tanto previene el
envejecimiento de la piel.
Se ha descubierto ahora, sorprendentemente, que
la exposición de las células de los mamíferos a diferentes
citoquininas de 6-(amino sustituido)-purina mejora
los efectos adversos del envejecimiento sobre tales células,
retrasando el comienzo de los cambios morfológicos relacionados con
la edad que normalmente aparecen con el envejecimiento de las
células, e incluso revirtiendo dichos efectos, y que tal exposición
tiene este efecto mejorador sin aumentar la tasa de crecimiento o la
capacidad proliferativa total de las células.
Basados en este descubrimiento, se proporcionan
nuevas composiciones y nuevos métodos para mejorar, incluso para
revertir, los efectos adversos del envejecimiento sobre las células
de los mamíferos, incluyendo dichas células en cultivo e in
vivo, tal como en la piel humana.
Por tanto, entre otras aplicaciones, los métodos
y composiciones de la invención son útiles para retrasar y revertir
la degeneración de la integridad estructural, funcional y cosmética
de la piel humana que normalmente acompaña al envejecimiento.
Como se ha discutido antes, todas las
composiciones disponibles hasta ahora para mejorar los efectos
adversos del envejecimiento sobre las características bioquímicas,
fisiológicas o morfológicas de las células de los mamíferos,
aumentan también de forma no deseable la tasa de crecimiento o la
capacidad proliferativa total de las células.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un método para mejorar los efectos adversos del envejecimiento sobre
las células de los mamíferos, cuyo método comprende administrar a
dichas células una composición que comprende, a una concentración
que es efectiva para mejorar dichos efectos adversos sobre tales
células, una citoquinina, que es una 6-(amino
sustituido)-purina.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición para mejorar los efectos adversos del envejecimiento
sobre las células de los mamíferos, comprendiendo dicha composición,
a una concentración que es efectiva para mejorar dichos efectos
adversos sobre tales células, una citoquinina, que es una 6-(amino
sustituido)-purina.
Entre las citoquininas de 6-(amino
sustituido)-purina que se pueden emplear como el
compuesto efectivo que mejora los efectos adversos de la edad, en
los métodos y composiciones de la invención están quinetina,
zeatina,
6-(3,3-dimetilalil)-aminopurina,
6-(bencil)-aminopurina,
6-(fenil)-aminopurina,
6-(n-alquil)-aminopurina, en la que
el grupo n-alquilo tiene 4, 5 o 6 carbonos y
6-(ciclohexil)-metilaminopurina. La más preferida es
la quinetina ((6-(furfuril)aminopurina).
Las células de los mamíferos, que se pueden
tratar con los métodos y composiciones de la invención, incluyen
células humanas, y células en cultivo así como células in
vivo de mamíferos vivientes.
Las células, si están en cultivo, se pueden
derivar de cualquier tejido, y si están in vivo, pueden ser
parte de cualquier tejido. Los métodos y composiciones se aplican
preferiblemente con fibroblastos de tejidos in vivo en
humanos, tales como los fibroblastos de la dermis de la piel humana
o de la capa de tejido conjuntivo subyacente al epitelio de la pared
interior del intestino delgado o del estómago humanos. La aplicación
más preferida es en las células de la piel humana.
Por tanto, la presente invención incluye
adicionalmente métodos y composiciones para llevarlos a cabo, para
retrasar (o revertir) la degeneración, que normalmente acompaña al
envejecimiento, de la integridad estructural y funcional de la piel
y del epitelio de la pared interior del tracto gastrointestinal y de
la integridad cosmética de la piel.
Los métodos y composiciones de la invención son
efectivos a concentraciones sorprendentemente y ventajosamente bajas
de la citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina.
Las concentraciones están típicamente entre 10^{-6} M y 5 x
10^{-4} M en un medio de cultivo para tejidos. A estas
concentraciones, la citoquinina aparentemente no tiene efectos
tóxicos sobre las células de los mamíferos.
Sorprendentemente, y especialmente de forma
ventajosa, los métodos de la invención no afectan de forma
significativa ni a la tasa de crecimiento ni a la capacidad
proliferativa total de las células tratadas de acuerdo con los
métodos. Las composiciones y métodos de la presente invención no
afectan a la tasa o cantidad de la síntesis de DNA en las células
tratadas. Al contrario que otras composiciones para preservar o
restaurar el fenotipo "joven" de las células que envejecen, las
composiciones y métodos de la presente invención no afectan a la
estricta represión proliferativa bajo la cual muchas células, in
vivo, tales como los fibroblastos y ciertas células de la
epidermis y otros epitelios, deben permanecer para funcionar
normalmente.
Por "mejora de los efectos adversos del
envejecimiento" sobre las células de mamíferos, se indica que el
desarrollo de los cambios morfológicos, descritos antes, que
normalmente ocurren con el "envejecimiento" en células normales
de mamíferos, en cultivo o in vivo se retrasa o se
revierte.
Los expertos pueden determinar si una
composición, a la que se exponen las células de los mamíferos al
llevar a cabo el método de la invención, incluye una cantidad de una
citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina que es
efectiva para mejorar los efectos adversos del envejecimiento sobre
las células. Los cambios morfológicos asociados con el
envejecimiento son fácilmente detectables por los expertos por medio
del examen microscópico de las células, separadas de un cultivo,
tomadas de un tejido por biopsia, o de forma similar.
En el caso de las células de mamíferos en
cultivo, que pueden ser cultivadas directamente desde los tejidos
sin ingeniería genética o que pueden ser modificadas genéticamente
para producir un producto deseado por cualquiera de las diferentes
técnicas de ingeniería genética conocidas, y que, como se conoce en
la técnica, se pueden usar para obtener valiosas proteínas, tales
como linfoquinas u hormonas para diagnóstico, aplicaciones
terapéuticas u otras, la mejora de los efectos adversos del
envejecimiento con los métodos y composiciones de la presente
invención mantiene de forma ventajosa a las células "más
jóvenes" que lo que las células son realmente. Ciertamente, la
adición de una cantidad efectiva de una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina a un medio de cultivo de células
de mamíferos, que han sufrido pases numerosas veces y que tienen
características morfológicas propias de las células envejecidas,
revierte las características morfológicas a las de las células más
jóvenes.
Las ventajas proporcionadas por las composiciones
y métodos de la presente invención para preservar, y en el caso de
revertir los efectos adversos del envejecimiento, para mejorar la
integridad funcional de las células de mamíferos in vivo,
tales como los fibroblastos de la dermis de la piel o de la capa de
tejido conjuntivo subyacente al epitelio de la pared interior del
tracto gastrointestinal de los humanos y en particular para
preservar la integridad cosmética de la piel humana, son evidentes y
se han discutido antes.
Las composiciones de acuerdo con la invención
pueden tomar cualquiera de varias formas, dependiendo de la
naturaleza y del entorno de las células a las que se tienen que
aplicar, de acuerdo con la invención, las cantidades de citoquininas
de 6-(amino sustituido)-purina que mejoran los
efectos adversos de la edad.
Para las células en cultivo, bañadas o
suspendidas en un medio de cultivo, una composición de acuerdo con
la invención es cualquier medio de cultivo usado para células de
mamíferos que está suplementado con entre aproximadamente 10^{-6}
M (es decir 1 \muM) y aproximadamente 5 x 10^{-4} M de una
citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina. Para las
citoquininas preferidas, de la fórmula I
en la que R_{1} es furfurilo, fenilo, bencilo,
n-alquilo de 4, 5 o 6 carbonos,
(ciclohexil)-metilo
(-CH_{2}(C_{6}H_{11})),
3-hidroximetil-3-metilalilo
7 o 3,3-dimetilalilo
(-CH_{2}CH=C(CH_{3})_{2}), el intervalo de
concentración en el medio de cultivo está entre 0,2 y 100 partes por
millón (ppm). Para la citoquinina más preferida, quinetina, el
intervalo de concentración preferido es desde aproximadamente 25
\muM hasta aproximadamente 250 \muM (esto es, desde
aproximadamente 5 ppm hasta aproximadamente 50 ppm) en el
medio.
En el caso de las células en cultivo, el método
de la invención de administrar a las células una cantidad de una
citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina que
mejora los efectos adversos de la edad, se lleva a cabo simplemente
bañando o cultivando las células en un medio de cultivo que es una
composición de acuerdo con la invención.
El método de la invención se lleva a cabo con
células in vivo en mamíferos, preferiblemente fibroblastos (u
otras células activas, por ejemplo queratinocitos) de la dermis de
la piel humana, o de la capa de tejido conjuntivo subyacente al
epitelio de la pared interior del tracto gastrointestinal humano,
exponiendo tales células a una cantidad de una citoquinina de
6-(amino sustituido)-purina que mejora los efectos
adversos de la edad.
Generalmente tal exposición será repetida
periódicamente a lo largo del periodo de tiempo durante el cual se
desea mejorar los efectos adversos de la edad sobre las células, de
acuerdo con la invención. La frecuencia de exposición dependerá de
las células implicadas, de dónde están localizadas en el mamífero
las células (por ejemplo, las células del tracto gastrointestinal,
en las que tiene lugar el lavado repetido con composiciones libres
de citoquininas de 6-(amino sustituido)-purina,
requieren una exposición más frecuente que las células de la piel),
y la concentración de la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina, en un intervalo de concentración
(típicamente entre aproximadamente 10 ppm y aproximadamente 1000
ppm), efectiva para penetrar hasta la capa de tejido conjuntivo
(subyacente al epitelio de la pared interior del tracto
gastrointestinal), en una concentración efectiva para mejorar los
efectos adversos del envejecimiento sobre las células activas, tales
como fibroblastos, de dicha capa de tejido conjuntivo.
Para la capa de tejido conjuntivo subyacente al
epitelio de la pared interior del tracto gastrointestinal, el método
de la invención se lleva a cabo por ingestión de una composición de
acuerdo con la invención que es una solución, suspensión, o tónico
que es fisiológicamente aceptable para administración oral y que
comprende una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina en un intervalo de concentración,
típicamente entre aproximadamente 10 ppm y aproximadamente 1000 ppm,
efectiva para penetrar hasta la capa de tejido conjuntivo subyacente
al epitelio de la pared interior del tracto gastrointestinal, en una
concentración efectiva para mejorar los efectos adversos del
envejecimiento sobre las células activas, tales como fibroblastos,
de dicha capa de tejido conjuntivo.
Para los fibroblastos (u otras células activas,
tales como los queratinocitos) de la piel humana, el método de la
invención se lleva a cabo aplicando a la superficie exterior de la
piel una composición de acuerdo con la invención que es una crema,
pomada, loción, gel, solución, perfume, sólido o similares, que es
fisiológicamente aceptable para aplicación a la superficie exterior
de la piel y que comprende una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina en un vehículo adecuado en una
concentración efectiva para penetrar hasta la dermis de la piel en
una concentración efectiva para mejorar los efectos adversos del
envejecimiento sobre las células activas, (por ejemplo
fibroblastos), de dicha dermis.
Las composiciones de la invención para uso en la
piel humana, se formulan con una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina, preferiblemente una de las de la
fórmula I definida anteriormente, en un intervalo de concentración
efectivo, típicamente entre aproximadamente 0,5 ppm y
aproximadamente 500 ppm, en una crema, pomada, loción, gel,
solución, o base sólida o vehículo conocidos en la técnica como no
tóxicos y dermatológicamente aceptables. La concentración (o
fracción de peso) de la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina disuelta, suspendida, dispersada
o similar, en una composición de la invención para uso en la piel
humana será tal que la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina se libere entre aproximadamente
0,2 ppm y aproximadamente 100 ppm a las células activas de la piel,
tales como los fibroblastos. Generalmente, los vehículos emolientes
o lubrificantes que ayudan a hidratar la piel son más preferidos que
los vehículos volátiles, tales como etanol, que secan la piel.
Ejemplos de bases o vehículos adecuados para
preparar las composiciones de la invención para uso en la piel
humana son vaselina, vaselina más siliconas volátiles, lanolina,
cold cream (USP), y pomada hidrófila (USP). Una composición
preferida de la invención tiene entre aproximadamente 10 ppm y
aproximadamente 100 ppm de quinetina en combinación con una base
adecuada de pomada o crema.
La elección de un vehículo aceptable se determina
en gran parte por el modo en que se va a administrar la citoquinina
de 6-(amino sustituido)-purina. Tales métodos
incluyen la administración tópica. Vehículos adecuados
farmacéuticamente y dermatológicamente aceptables para aplicación
tópica incluyen los adecuados para uso en lociones, cremas,
soluciones, geles, adhesivos y similares. Generalmente el vehículo
es o bien de naturaleza orgánica o bien una emulsión acuosa, capaz
de hacer que la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina se disperse, se suspenda o se
disuelva en él. El vehículo puede incluir emolientes, mejoradores de
la penetración en la piel, agentes colorantes, fragancias,
emulsificantes, agentes espesantes, y disolventes, farmacéuticamente
aceptables. Una descripción más detallada de tales formas se da a
continuación:
Las lociones pueden comprender una cantidad
efectiva de una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina (por ejemplo, una cantidad
efectiva para liberar la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina entre aproximadamente 0,2 ppm y
aproximadamente 100 ppm a las células activas de la piel, tales como
los fibroblastos); de 1% a 50%, preferiblemente de 3% a 15%, de un
emoliente; siendo el resto, agua, un alcohol C_{2} o C_{3}, o
una mezcla de agua y el alcohol. Se conocen varios emolientes.
Ejemplos de tales emolientes son los siguientes:
a. Aceites y ceras hidrocarbonados. Ejemplos son
aceite mineral, vaselina, parafina, ceresina, ozoquerita, cera
microcristalina, polietileno y perhidroescualeno.
b. Aceites de silicona, tales como
dimetilpolisiloxanos, metilfenilpolisiloxanos, copolímeros de
silicona y glicol solubles en agua y solubles en alcohol.
c. Grasas y aceites de triglicéridos, tales como
los derivados de fuentes vegetales, animales y marinas. Ejemplos
incluyen (pero no están limitados a ellos), aceite de ricino, aceite
de azafrán, aceite de semillas de algodón, aceite de maíz, aceite de
oliva, aceite de hígado de bacalao, aceite de almendras, aceite de
aguacate, aceite de palma, aceite de sésamo, y aceite de soja.
d. Ésteres de acetoglicéridos, tales como
monoglicéridos acetilados.
e. Glicéridos etoxilados, tales como
monoestearato de glicerilo etoxilado.
f. Ésteres alquílicos de ácidos grasos con 10 a
20 átomos de carbono. Los ésteres metílico, isopropílico y butílico
de ácidos grasos son útiles aquí. Ejemplos incluyen (pero no están
limitados a ellos), laurato de hexilo, laurato de isohexilo,
palmitato de isohexilo, palmitato de isopropilo, miristato de
isopropilo, oleato de decilo, oleato de isodecilo, estearato de
hexadecilo, estearato de decilo, isoestearato de isopropilo, adipato
de diisopropilo, adipato de diisohexilo, adipato de dihexildecilo,
sebacato de diisopropilo, lactato de laurilo, lactato de miristilo,
y lactato de cetilo.
g. Ésteres alquenílicos de ácidos grasos con 10 a
20 átomos de carbono. Ejemplos de los mismos incluyen (pero no están
limitados a ellos), miristato de oleilo, estearato de oleilo, y
oleato de oleilo.
h. Ácidos grasos con 9 a 22 átomos de carbono.
Ejemplos adecuados incluyen (pero no están limitados a ellos), los
ácidos pelargónico, laúrico, mirístico, palmítico, esteárico,
isoesteárico, hidroxiesteárico, oleico, linoleico, ricinoleico,
araquidónico, behénico y erúcico.
i. Alcoholes grasos con 10 a 22 átomos de
carbono. Los alcoholes laurílico, miristílico, cetílico,
hexadecílico, estearílico, isoestearílico, hidroxiestearílico,
oleílico, ricinooleílico, behenílico, erucílico y
2-octil-dodecílico, son ejemplos de
alcoholes grasos satisfactorios.
j. Éteres de alcoholes grasos. Alcoholes grasos
etoxilados de 10 a 20 átomos de carbono incluyen (pero no están
limitados a ellos) los alcoholes laurílico, cetílico, estearílico,
isoestearílico, oleílico y colesterol, que tienen unidos a ellos de
1 a 50 grupos de óxido de etileno o de 1 a 50 grupos de óxido de
propileno o una mezcla de ellos.
k. Éteres-ésteres, tales como ésteres de ácidos
grasos con alcoholes grasos etoxilados.
l. Lanolina y derivados. Lanolina, aceite de
lanolina, cera de lanolina, alcoholes de lanolina, ácidos grasos de
lanolina, lanolato de isopropilo, lanolina etoxilada, alcoholes de
lanolina etoxilados, colesterol etoxilado, alcoholes de lanolina
propoxilados, lanolina acetilada, alcoholes de lanolina acetilados,
linoleato de alcoholes de lanolina, ricinoleato de alcoholes de
lanolina, acetato de ricinoleato de alcoholes de lanolina, acetato
de alcoholes etoxilados-ésteres, hidrogenolisis de lanolina,
lanolina hidrogenada etoxilada, sorbitol
etoxilado-lanolina, y bases de absorción de lanolina
líquida y semisólida son ejemplos de emolientes derivados de la
lanolina.
m. Alcoholes polihidroxilados y derivados de
poliéteres. Propilenglicol, dipropilenglicol, polipropilenglicol
(peso molecular 2000-4000),
polioxietilen-polioxipropilenglicoles,
polioxipropilen-polioxietilenglicoles, glicerol,
glicerol etoxilado, glicerol propoxilado, sorbitol, sorbitol
etoxilado, hidroxipropil-sorbitol, polietilenglicol
(peso molecular 200-6000),
metoxi-polietilenglicoles 350, 550, 750, 2000, 5000,
homopolímeros de poli(óxido de etileno) (peso molecular
100.000-5.000.000), polialquilenglicoles y
derivados, hexilenglicol
(2-metil-2,4-pentanodiol),
1,3-butilenglicol,
1,2,6-hexanotriol, etohexadiol USP
(2-etil-1,3-hexanodiol),
glicol vecinal C_{13}-C_{14}, y
polioxipropilen-derivados de trimetilolpropano, son
ejemplos de los mismos.
n. Ésteres de alcoholes polihidroxilados. Ésteres
de ácidos grasos monohidroxilados y dihidroxilados con etilenglicol,
ésteres de ácidos grasos monohidroxilados y dihidroxilados con
dietilenglicol, ésteres de ácidos grasos monohidroxilados y
dihidroxilados con polietilenglicol (peso molecular
200-6000), ésteres de ácidos grasos monohidroxilados
y dihidroxilados con propilenglicol, monooleato de
polipropilenglicol 2000, monoestearato de polipropilenglicol 2000,
monoestearato de propilenglicol etoxilado, ésteres de ácidos grasos
monohidroxilados y dihidroxilados con glicerilo, ésteres de ácidos
grasos polihidroxilados con poliglicerol, monoestearato de glicerilo
etoxilado, monoestearato de 1,3-butilenglicol,
diestearato de 1,3-butilenglicol, éster de ácidos
grasos polihidroxilados con polioxietileno, ésteres de ácidos grasos
con sorbitano, y ésteres de ácidos grasos con
polioxietilen-sorbitano, son ésteres satisfactorios
de alcoholes polihidroxilados.
o. Ésteres de ceras, tales como cera de abejas,
esperma de ballena, miristato de miristilo, y estearato de
estearilo.
p. Derivados de cera de abejas, por ejemplo cera
de abejas con polioxietilen-sorbitol. Estos son
productos de reacción de la cera de abejas con sorbitol etoxilado de
contenido variable en óxido de etileno, que forma una mezcla de
éteres-ésteres.
q. Ceras vegetales que incluyen (pero no se
limitan a ellas), cera de carnauba y cera de candelilla.
r. Fosfolípidos, tales como lecitina y
derivados.
s. Esteroles. El colesterol y los ésteres de
ácidos grasos con colesterol son ejemplos de los mismos.
t. Amidas, tales como amidas de ácidos grasos,
amidas de ácidos grasos etoxilados, y alcanolamidas de ácidos grasos
sólidos.
Las lociones comprenden además preferiblemente de
1% a 10%, más preferiblemente de 2% a 5%, de un emulsificante. Los
emulsificantes pueden ser no iónicos, aniónicos o catiónicos.
Ejemplos de emulsificantes no iónicos satisfactorios incluyen (pero
no están limitados a ellos), alcoholes grasos con 10 a 20 átomos de
carbono, alcoholes grasos con 10 a 20 átomos de carbono condensados
con 2 a 20 moles de óxido de etileno u óxido de propileno,
alquilfenoles con 6 a 12 átomos de carbono en la cadena alquílica
condensados con 2 a 20 moles de óxido de etileno, ésteres de ácidos
grasos monohidroxilados o dihidroxilados con óxido de etileno,
ésteres de ácidos grasos monohidroxilados o dihidroxilados con
etilenglicol en los que el resto de ácido graso contiene de 10 a 20
átomos de carbono, dietilenglicol, polietilenglicoles de peso
molecular 200 a 3000, glicerol, sorbitol, sorbitano,
polioxietilen-sorbitol,
polioxietilen-sorbitano, y ésteres hidrófilos de
ceras. Emulsificantes aniónicos adecuados incluyen (pero no están
limitados a ellos), jabones de ácidos grasos, por ejemplo jabones de
sodio, potasio y trietanolamina, en los que el resto de ácido graso
contiene de 10 a 20 átomos de carbono. Otros emulsificantes
aniónicos adecuados incluyen (pero no están limitados a ellos),
alquilsulfatos de metales alcalinos, de amonio o de amonio
sustituido, arilsulfonatos de alquilo, y sulfonatos de alquil etoxi
éter con 10 a 30 átomos de carbono en el resto alquilo. Los
sulfonatos de alquil etoxi éter contienen de 1 a 50 unidades de
óxido de etileno. Entre los emulsificantes catiónicos satisfactorios
están los compuestos de amonio cuaternario, morfolinio y piridinio.
Algunos de los emolientes descritos en los párrafos anteriores
tienen también propiedades emulsificantes. Cuando una loción se
formula conteniendo uno de tales emolientes, no se necesita un
emulsificante adicional, aunque éste puede ser incluido en la
composición.
El resto de la loción es agua o un alcohol
C_{2}o C_{3}, o una mezcla de agua y el alcohol. Las lociones se
formulan por simple mezcla de todos los componentes juntos.
Preferiblemente la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina se disuelve en la mezcla.
Se pueden incluir componentes convencionales
opcionales. Uno de tales aditivos es un agente espesante a un nivel
de 1% a 10% de la composición. Ejemplos de agentes espesantes
adecuados incluyen (pero no están limitados a ellos): polímeros de
carboxipolimetileno reticulados, etilcelulosa, polietilenglicoles,
goma tragacanto, goma caraya, gomas de xantano y bentonita,
hidroxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa.
Las cremas comprenden una cantidad efectiva de
una citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina (por
ejemplo una cantidad efectiva para liberar la citoquinina de
6-(amino sustituido)-purina a una concentración de
entre aproximadamente 0,2 ppm y aproximadamente 100 ppm a las
células activas de la piel, tales como los fibroblastos); de 5% a
50%, preferiblemente de 10% a 25%, de un emoliente, siendo el resto
agua. Los emolientes descritos anteriormente pueden ser usados
también en las composiciones en forma de crema. Opcionalmente la
forma de crema contiene un emulsificante adecuado, como se ha
descrito previamente. Cuando se incluye un emulsificante, éste está
en la composición en un nivel de 3% a 50%, preferiblemente de 5% a
20%.
La forma de solución comprende una cantidad
efectiva de una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina (por ejemplo una cantidad
efectiva para liberar la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina a una concentración entre
aproximadamente 0,2 ppm y aproximadamente 100 ppm a las células
activas de la piel, tales como los fibroblastos); siendo el resto
agua, un disolvente orgánico adecuado o una combinación de agua y
dicho disolvente orgánico. Materiales orgánicos adecuados útiles
como disolvente o como una parte del sistema disolvente son los
siguientes: propilenglicol, polietilenglicol (peso molecular
200-600), polipropilenglicol (peso molecular
425-2025), glicerina, ésteres de sorbitol,
1,2,6-hexanotriol, etanol, isopropanol, tartrato de
dietilo, butanodiol, y sus mezclas. Tales sistemas disolventes
pueden contener también agua.
Estas composiciones en forma de solución pueden
ser aplicadas a la piel como tales, o también pueden ser formuladas
como un aerosol y aplicadas a la piel por pulverización. Las
composiciones en aerosol comprenden además, de 25% a 80%,
preferiblemente de 30% a 50%, de un propelente adecuado. Ejemplos de
tales propelentes son los hidrocarburos clorados, fluorados y
clorofluorados de bajo peso molecular. También se usan como gases
propelentes, óxido nitroso, dióxido de carbono, butano y propano.
Estos propelentes se usan, como es conocido en la técnica, en una
cantidad y bajo una presión adecuadas para expeler los contenidos
del recipiente.
Las composiciones en forma de gel se pueden
formular mezclando simplemente un adecuado agente espesante a las
composiciones en forma de solución descritas previamente. Ejemplos
de agentes espesantes adecuados han sido descritos previamente con
respecto a las lociones.
Las composiciones en forma de gel comprenden una
cantidad efectiva de una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina (por ejemplo una cantidad
efectiva para liberar la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina a una concentración entre
aproximadamente 0,2 ppm y aproximadamente 100 ppm a las células
activas de la piel, tales como los fibroblastos); de 5% a 75%,
preferiblemente de 10% a 50%, de un disolvente orgánico como se ha
descrito previamente; de 0,5% a 20%, preferiblemente de 1% a 10%,
del agente espesante; siendo el resto agua.
Las composiciones de formas sólidas tienen
utilidad como composiciones de tipo lápiz destinados para aplicación
a los labios o a otras partes del cuerpo. Tales composiciones
comprenden una cantidad efectiva de una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina (por ejemplo una cantidad
efectiva para liberar la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina a una concentración entre
aproximadamente 0,2 ppm y aproximadamente 100 ppm a las células
activas de la piel, tales como los fibroblastos); y de 50% a 98%,
preferiblemente de 60% a 90%, de los emolientes descritos
previamente. Esta composición puede comprender además, de 1% a 20%,
preferiblemente de 5% a 15%, de un agente espesante adecuado y
opcionalmente emulsificantes y agua. Los agentes espesantes
previamente descritos con respecto a las lociones se emplean
adecuadamente en las composiciones de forma sólida.
Un ejemplo de una composición de la invención
adecuada para aplicación a la piel facial humana puede constar de 10
ppm a 100 ppm de quinetina en una base preparada mezclando (en peso)
10 partes de monoestearato de glicerol; 10 partes de alcohol
cetílico, 30 partes de esperma de ballena, 10 partes de Tween 20
(derivado con polioxialquileno del monoestearato de sorbitano), 10
partes de Span 20 (monolaurato de sorbitano), 12,5 partes de
glicerina y 100 partes de agua. Ejemplos de ingredientes activos que
mejoran el efecto adverso de la edad que se pueden usar en lugar de
la quinetina son zeatina,
6-(3,3-dimetilalil)-aminopurina,
6-(bencil)-aminopurina, o una combinación de
quinetina y 6-(n-hexil)-aminopurina
o 6-(bencil)-aminopurina.
Otros ingredientes tales como conservantes (por
ejemplo, metilparabeno o etilparabeno), perfumes, colorantes o
similares que son conocidos en la técnica para proporcionar
estabilidad, fragancia o color deseables u otras propiedades
deseables, tales como protección frente a los rayos actínicos del
sol, a las composiciones para aplicación a la piel, se pueden
emplear también en una composición de la invención para tal
aplicación tópica.
Una composición de la invención puede incluir
también ingredientes activos que mejoran el efecto adverso de la
edad aparte de las citoquininas de 6-(amino
sustituido)-purina. Sin embargo, una ventaja de
emplear tales citoquininas solas, la de que la tasa de crecimiento y
la capacidad proliferativa total de las células tratadas no se ven
afectadas de modo significativo, tenderá a diluirse si se emplean
otros ingredientes tales que incrementan la tasa de crecimiento o la
capacidad proliferativa total, o ambas, de las células tratadas.
Consecuentemente, las composiciones preferidas de la invención
comprenderán, como único ingrediente que mejora el efecto adverso de
la edad, una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina.
Las composiciones de la invención para uso en la
piel humana se aplicarán preferiblemente una vez por día a las áreas
de la piel que se desea tratar por el método de la invención.
El método de la invención se aplicará a la piel
de una persona, aplicando a la misma, preferiblemente diariamente,
una composición de la invención adecuada para tratamiento de la piel
humana, como se ha discutido antes, durante un periodo indefinido,
es decir, tan largo como la persona desee disfrutar de la mejora de
los efectos adversos del envejecimiento de la piel, proporcionada
por el método y composición de la invención. Se precisará una
aplicación a la piel una vez al día de una composición según la
invención durante al menos aproximadamente un mes, y hasta al menos
aproximadamente un año, dependiendo de la edad de la persona, de la
condición de la piel a la que se aplica la composición, y de la
concentración (o fracción de peso) de la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina en la composición, antes de que
empiecen a ser evidentes en la superficie de la piel, los efectos
beneficiosos de retrasar el descenso de la tasa de síntesis de
proteínas y de retrasar los cambios morfológicos relacionados con la
edad en los fibroblastos de la capa de células basales de la piel.
Si se termina la aplicación del método de la invención, los efectos
del envejecimiento, mejorados por el método, volverán de nuevo
después de algún tiempo.
La invención será ahora ilustrada con los
siguientes ejemplos:
Los efectos de la quinetina sobre el crecimiento
a corto plazo de los fibroblastos normales diploides de la piel
embrionaria humana, cepa denominada como KIS, se estudiaron por los
que son conocidos en la técnica como experimentos de "curva de
crecimiento en una etapa". Para este propósito, se añadieron
números iguales de células KIS (10^{5}) a varios frascos de
cultivo que contenían medio de Eagle modificado con medio de
Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino,
antibióticos y glutamina. Se añadieron a los frascos diferentes
volúmenes de soluciones stock de quinetina preparadas en solución
equilibrada de sal (solución tampón de Hank) para obtener
concentraciones finales de 40 \muM, 80 \muM y 200 \muM de
quinetina en el medio de cultivo. Se incubaron entonces los cultivos
a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Todos los experimentos
se hicieron por triplicado.
Para determinar la frecuencia de unión de las
células tratadas con diferentes dosis de quinetina, se usó un grupo
de frascos de cultivo por cada dosis para contar el número de
células unidas a la superficie del fondo del frasco de cultivo 6
horas después de la siembra. Se realizó esto, separando en primer
lugar las células por tripsinación, resuspendiendo las mismas en
medio fresco y contando su número usando un contador Coulter.
Para la estimación de las tasas de crecimiento o
tasas de proliferación de las células tratadas y no tratadas con
quinetina, se determinó el número de células cada 24 horas en cada
grupo de frascos como se ha indicado antes. Se continuó haciendo
esto hasta que todos los cultivos se hicieron confluentes y no hubo
más incremento del número de células (usualmente
8-10 días). Se obtuvieron los siguientes
resultados.
1. Las células humanas normales no presentaron
efectos morfológicos adversos con el tratamiento con diferentes
dosis de quinetina, evaluados por examen microscópico de las células
bajo un microscopio con iluminación.
2. La quinetina no tuvo efectos tóxicos aparentes
sobre las células humanas, ya que no hubo diferencias en las uniones
celulares, desechos celulares en el medio y número de células por
unidad de área del substrato de cultivo entre las células tratadas y
no tratadas.
3. Tanto las células humanas tratadas con
quinetina como las no tratadas demostraron la misma tasa de
crecimiento y se hicieron confluentes al mismo tiempo. Esta es una
evidencia clara de que la quinetina no aumentó las tasas de
crecimiento de las células en el cultivo. En el Ejemplo II se
presenta una evidencia adicional que apoya esta afirmación.
Los efectos de la quinetina sobre la tasa de
crecimiento y la capacidad proliferativa total de las células KIS a
plazo más largo, se estudiaron por los que son conocidos en la
técnica como experimentos de "curva de longevidad". Para este
propósito, se mantuvieron al menos dieciseis cultivos paralelos de
células KIS en presencia de quinetina 40 \muM en el medio, junto
con un número igual de cultivos testigo sin tratar. Todos los
experimentos empezaron a partir de un nivel de duplicación de la
población (PDL) de seis, el cual es aproximadamente el 12% de la
expectativa normal de vida (es decir, la capacidad proliferativa
total de las células es de aproximadamente PDL = 50) in vitro
como se ha determinado previamente.
Los métodos de cultivo celular, tripsinación y
contaje del número de células fueron como se han descrito en el
Ejemplo I. Para los estudios a largo plazo, sin embargo, los
cultivos se sometieron a pases en serie cada vez que se hicieron
confluentes. Estos pasos en serie de los cultivos, se continuaron
hasta que todos los cultivos pararon de hacerse confluentes a pesar
de los cambios semanales de los medios de cultivo durante
4-5 semanas. Para estimar los números exactos de PDL
conseguidos por los cultivos tratados y no tratados con quinetina,
las células de al menos cuatro frascos de cultivo confluentes de los
16 cultivos llevados en paralelo, se subdividieron en una relación
de subdivisión de 1:4, cuando eran jóvenes y de 1:2 cuando su tasa
de crecimiento empezó a disminuir debido al envejecimiento. El
número de PDL que ha conseguido un cultivo entre la siembra de las
células y el llegar a ser confluente se determinó por: log N/log 2,
donde N = número de células en un cultivo confluente dividido por el
número de células sembradas originalmente en dicho frasco.
Finalmente, el PDL acumulativo para cada cultivo se calculó al final
de su duración de vida in vitro.
En términos de PDL acumulativo no hubo ninguna
diferencia en la duración de vida de las células humanas crecidas
con o sin la presencia continua de quinetina en el medio de cultivo.
Bajo esta serie de experimentos, ambos tipos de cultivo alcanzaron
un PDL máximo en el intervalo de 47 a 49. Esto significa que la
capacidad proliferativa total de las células no había cambiado de
forma significativa por la presencia de quinetina en el medio de
cultivo.
En términos de tiempo cronológico, sin embargo,
las células tratadas con quinetina parecieron vivir más tiempo (217
días) que los testigos (196 días). Esto es porque, al final de su
duración de vida (es decir, cuando no se puede conseguir más
confluencia), las células tratadas con quinetina siguieron
apareciendo mucho más saludables durante al menos dos semanas y sin
desprender números significativos de células muertas al medio.
En cuanto a las tasas de crecimiento, las
pendientes de las curvas de los números de duplicaciones de la
población como una función del tiempo, tanto para las células
tratadas con quinetina como para las no tratadas, fueron
experimentalmente indistinguibles. Por tanto, las tasas de
crecimiento de los cultivos tratados con quinetina y de los no
tratados, testigos, no fueron significativamente diferentes. La
quinetina no alteró significativamente el límite inherente a la
duración normal de vida (esto es, la capacidad proliferativa total),
determinado genéticamente, de las células humanas en cultivo.
Es sabido que las citoquininas, incluyendo la
quinetina, ayudan a completar las etapas finales de la división
celular, es decir, la citoquinesis, en los vegetales. Esto sugirió
que las citoquininas podrían afectar a la síntesis del DNA en las
células de los mamíferos de una forma que podría aumentar el riesgo
de que tales células, en presencia de citoquininas, puedan ser
transformadas al estado canceroso.
Se realizaron por tanto, estudios para ver los
efectos de la quinetina sobre la síntesis del DNA en células humanas
en cultivo, usando los métodos de la autorradiografía por barrido
nuclear y la absorción de ^{3}H-timidina en
material insoluble en ácido.
Para la autorradiografía, se cultivaron células
KIS en portaobjetos con cubierta de vidrio esterilizados, en
presencia de diferentes concentraciones de quinetina (40 \muM a
200 \muM) o en su ausencia. Después de diferentes duraciones del
tratamiento, se añadió ^{3}H-timidina (1
microcurio/ml) a los cultivos, bien durante un tiempo corto (2
horas) para determinar el número de células en ciclo en este tiempo,
o bien durante periodos más largos (24-48 horas)
para estimar el número de células de un cultivo que son capaces de
entrar en la fase S del ciclo celular. Después de completar el
periodo de marcaje, las células se procesaron para autorradiografía
de acuerdo con los métodos estándares. Se contaron al menos 500
células en cada porta, usando un microscopio, una vez que se
completaron los procedimientos de exposición, desarrollo y tinción.
Se determinaron por tanto los porcentajes de células en ciclo (que
habían absorbido la timidina radiactiva y la habían incorporado a su
DNA nuevamente sintetizado, produciendo núcleos oscuros
autorradiográficamente) y de células que no están en ciclo. Se
encontró que las células tratadas con quinetina y las no tratadas,
después del marcaje durante 2 horas y durante más tiempo
(24-48 horas), tenían porcentajes de células en
ciclo y no en ciclo, indistinguibles experimentalmente.
Similarmente, los estimados de la absorción de
^{3}H-timidina por las células KIS tratadas con
quinetina y las no tratadas, después de marcaje durante 90 minutos o
durante 72 horas, en términos de dpm a partir del material insoluble
en ácido por 10^{6} células medido con un contador de centelleo,
no mostraron ninguna estimulación de la síntesis del DNA por el
tratamiento con quinetina.
Como se indicó en el Ejemplo I, una gran cantidad
de muchos experimentos independientes, han demostrado que la
quinetina no induce ninguna proliferación adicional de las células
en los cultivos de células humanas. Los experimentos de este ejemplo
demuestran que la quinetina no estimula la síntesis del DNA o empuja
a las células hacia nuevos ciclos celulares más rápidamente que las
células testigo entran en tales ciclos. Por tanto, la quinetina no
altera las tasas de crecimiento celular de las células humanas.
Los cambios relacionados con la edad en la
morfología de las células durante los pases en serie son un fenómeno
bien conocido por los biólogos celulares, implicados en estudios de
envejecimiento. Los fibroblastos humanos jóvenes en cultivo, son
delgados, largos, fusiformes y están fuertemente empaquetados en
grupos que llegan a ser confluentes. Las células viejas, que han
completado más del 90% de su duración de vida, son muy grandes en
tamaño, mucho más planas, de forma irregular, con muchas vacuolas y
contienen numerosos de los llamados "cuerpos residuales" que
presentan intensa autofluorescencia a la excitación con rayos
ultravioleta cuando se observan bajo un microscopio de
fluorescencia.
Las células KIS cultivadas en presencia de
quinetina 40 \muM y cultivadas sin quinetina se compararon
morfológicamente a un PDL = 44. Las células tratadas con quinetina
no tenían una morfología típica de células viejas. Las células
tratadas con quinetina no fueron significativamente más grandes de
tamaño que las células jóvenes (por ejemplo, PDL = 14), mientras que
las células no tratadas sí lo fueron. Las células tratadas con
quinetina mantuvieron una apariencia fusiforme en una gran
extensión; no estaban colocadas irregularmente; y no contenían
tantas vacuolas ni cuerpos residuales en comparación con aquellas
que no tuvieron tratamiento con quinetina. Esta dramática retención
de algo de la apariencia de juventud, incluso durante las fases
terminales de la vida, es una evidencia significativa de la
capacidad de la quinetina, a concentraciones del orden de 10^{-6}
M a 10^{-4} M, para retrasar el comienzo de los síntomas
relacionados con la edad.
En otro grupo de experimentos, se encontró que
las células que ya habían llegado a ser viejas (por ejemplo, PDL
mayor que 40) podían revertir morfológicamente a una apariencia algo
más joven por la adición de quinetina a diferentes concentraciones
al medio de cultivo. El grado de reversión depende del extremo de la
edad de vejez alcanzada ya antes de la exposición a la quinetina,
siendo las células más jóvenes las que revierten hasta más lejos, y
de la concentración de quinetina añadida al medio y la duración del
tiempo en que la quinetina está presente. Por ejemplo, las células
KIS con más del 80% de su duración de vida completa (mayor que 40
PDL) empezaron a aparecer como células de PDL =
30-35 después de 2-3 semanas con
quinetina 200 \muM en el medio de cultivo.
La velocidad de re-adquisición de
la morfología "vieja" una vez que se ha separado la quinetina
del medio, es incierta, pero los experimentos indican que es mucho
más lenta que la velocidad de reversión a la morfología más joven
una vez que se ha introducido la quinetina en el medio.
Un parámetro del envejecimiento celular en
cultivo, es la caída del rendimiento celular (esto es, el número de
células en una capa confluente), cuando los cultivos llegan a la
edad de la vejez. Esto es debido principalmente al hecho de que las
células se hacen progresivamente más grandes con la edad. Por tanto,
si el área de los frascos de cultivo permanece la misma, el número
de células por frasco disminuye cuando las células llegan al final
de su duración de vida con pases periódicos. Un grupo de cultivos de
células KIS se cultivó con pases periódicos sin quinetina en el
medio. Otro grupo de cultivos de células KIS se trató del mismo modo
con la excepción de que se incluyó quinetina 40 \muM en el medio.
Con las células sin tratar, el rendimiento celular permaneció casi
constante a aproximadamente 1,5 x 10^{6} por 25 cm^{2} hasta un
PDL = 43 y entonces disminuyó hasta aproximadamente 3,5 x 10^{5}
por 25 cm^{2} a un PDL = 48, donde cesó el crecimiento. Con las
células tratadas, el rendimiento celular permaneció casi constante a
aproximadamente 1,5 x 10^{6} por 25 cm^{2} hasta un PDL = 48 y
entonces disminuyó hasta aproximadamente 7 x 10^{5} por 25
cm^{2} a un PDL = 49, donde cesó el crecimiento. Este
mantenimiento del rendimiento celular, característico de las células
"jóvenes", incluso durante la última fase de la vida, con
células tratadas con quinetina es altamente significativo en
términos de retrasar el comienzo de algunos de los síntomas de
envejecimiento en las células humanas por el tratamiento con
quinetina.
Claims (18)
1. Un método para mejorar los efectos adversos
del envejecimiento sobre las células de los mamíferos en cultivo,
que comprende poner en contacto las células de los mamíferos con una
composición que contiene una concentración efectiva de una
citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina, en la
que: la citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina
tiene la fórmula I:
R_{1} se selecciona entre furfurilo, fenilo,
bencilo, n-alquilo de 4, 5 o 6 carbonos,
(ciclohexil)metilo (-CH_{2}(C_{6}H_{11})), o
3-hidroximetil-3
metilalillo
(-CH_{2}CH=
\melm{\delm{\para}{CH _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2} OH}})cuya citoquinina es el único agente activo
presente en una concentración suficiente para mejorar los efectos
adversos del envejecimiento de las células, con lo que el grado de
desarrollo de las características de las células que están asociadas
con el envejecimiento celular se revierte o se retrasa; y la tasa
de crecimiento y capacidad proliferativa total de las células
subsiguiente al contacto es sustancialmente la misma que antes del
contacto.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
las células son células fibroblastos.
3. Un método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que la composición es un medio de
cultivo.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentración de la citoquinina
de 6-(amino sustituido)-purina está entre 0,5 ppm y
500 ppm.
5. Uso de una composición que contiene un
intervalo de concentración entre 0,5 ppm y 500 ppm de una
citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina, en la
que: la citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina
tiene la fórmula I:
R_{1} se selecciona entre furfurilo, fenilo,
bencilo, n-alquilo de 4, 5 o 6 carbonos,
(ciclohexil)metilo (-CH_{2}(C_{6}H_{11})), o
3-hidroximetil-3
metilalillo
(-CH_{2}CH=
\melm{\delm{\para}{CH _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2} OH}})siendo el intervalo de concentración suficiente
para mejorar los efectos adversos del envejecimiento de las células,
con lo que el grado de desarrollo de las características de las
células que están asociadas con el envejecimiento celular se
revierte o se retrasa; y la tasa de crecimiento y capacidad
proliferativa total de las células subsiguiente al contacto es
sustancialmente la misma que antes del contacto, en la fabricación
de un medicamento para mejorar los efectos adversos del
envejecimiento sobre las células de la piel de los mamíferos
diploides
normales.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que las
células son fibroblastos de la piel.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que la
composición se formula como una loción, pomada, crema, lápiz sólido
o pulverizador para aplicación a la superficie de la piel.
8. Un uso o método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que R_{1} de la fórmula I es
furfurilo o
3-hidroximetil-3-metilalilo.
9. Un uso o método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de la
citoquinina de 6-(amino sustituido)-purina está
entre 10 ppm y 100 ppm.
10. Un uso o método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina es quinetina.
11. Una composición para mejorar los efectos
adversos del envejecimiento sobre las células de los mamíferos, que
comprende entre 0,5 ppm y 500 ppm de una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina que tiene la fórmula I:
y R_{1} se selecciona entre furfurilo, fenilo,
bencilo, n-alquilo de 4, 5 o 6 carbonos,
(ciclohexil)metilo (-CH_{2}(C_{6}H_{11})),
o
3-hidroximetil-3
metilalillo
(-CH_{2}CH=
\melm{\delm{\para}{CH _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2} OH}})12. Una composición según la reivindicación 11,
que es un cosmético.
13. Una composición según la reivindicación 12,
que se formula para aplicación tópica a la superficie de la piel de
los mamíferos.
14. Una composición cosmética según la
reivindicación 12 o la reivindicación 13, en la que la composición
se formula como una loción, pomada, crema, lápiz sólido o
pulverizador.
15. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en la que R_{1} de la fórmula I es
furfurilo o
3-hidroximetil-3-metilalilo.
16. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en la que la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina de la fórmula I es quinetina.
17. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 16, en la que la concentración del compuesto
de la fórmula I está entre 10 ppm y 100 ppm.
18. Una composición oral para mejorar los efectos
adversos del envejecimiento sobre las células de los mamíferos, que
comprende una concentración efectiva de una citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina en un vehículo fisiológicamente
aceptable, en la que:
la citoquinina de 6-(amino
sustituido)-purina tiene la fórmula I:
R_{1} se selecciona entre furfurilo, fenilo,
bencilo, n-alquilo de 4, 5 o 6
carbonos(ciclohexil)metilo
(-CH_{2}(C_{6}H_{11})), o
3-hidroximetil-3
metilalillo
(-CH_{2}CH=
\melm{\delm{\para}{CH _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2} OH}})y la concentración está entre aproximadamente 10
ppm y aproximadamente 1000 ppm, y es suficiente para penetrar hasta
la capa de tejido conjuntivo del tracto gastrointestinal y con ello
mejorar los efectos adversos del envejecimiento sobre las
células.
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