CN100493506C - 化合物6-糠基氨基嘌呤在制备抗脑组织氧化损伤药物应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗脑组织氧化损伤药物的应用。6-糠基氨基嘌呤作为外源性嘌呤类物质，可以发挥动植物激素样作用，能直接捕获、清除脑组织内多余的自由基，阻止或抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应对脑组织细胞膜和细胞内生物大分子的破坏，保护脑细胞超微结构；还能促进脑组织抗氧化酶的合成并提高其活性，提高脑组织抵抗外源性和内源性氧化损伤的能力，从而保护脑细胞结构和功能的完整性，维持脑组织的正常生理功能。
Description
技术领域
本发明涉及化合物6-糠基氨基嘌呤的新用途，具体涉及化合物6-糠基氨基嘌呤在制备抗脑组织氧化损伤药物的应用，经申请人的实验研究证明化合物6-糠基氨基嘌呤能够提高动物脑组织在氧化损伤状态下的抗氧化能力。
背景技术
氧化损伤的积累是引起动物体衰老及疾病的主要原因。氧的毒性不是由于氧分子本身的反应能力，而是由于氧分子还原成水的过程中产生的许多中间产物，包括超氧阴离子、过氧化氢分子、羟自由基、氢过氧基、氢过氧化物、烷氧基、烷过氧基和单线态氧。这些中间产物包括自由基和分子，统称为活性氧，但***衡的，动物体内有一套完整的防御***来保护机体不受自由基的伤害。
研究表明，在病态和衰老的情况下脑组织比其他组织更易受自由基攻击，发生脂质过氧化反应。其原因主要有以下几方面：第一，脑组织是体内氧负荷最大的器官之一。虽然脑组织仅占人体重量的2％～3％，但却消耗了供应机体20％的氧。第二，中枢神经***的神经元几乎完全依赖于氧化磷酸化产生的三磷酸腺昔作为能量来源。第三，对于正常的成年脑组织，葡萄糖是主要的营养物质，因而，脑部有高的糖代谢和呼吸代谢。第四，脑神经元的膜结构是由高浓度的不饱和脂肪酸组成，这些脂肪酸是羟自由基潜在的反应底物。第五，脑组织中抗氧化酶的水平很低，使其更容易受到损伤。
因此，脑组织氧化损伤是动物和人体所面临的一个非常常见和严重的损伤，可引起动物和人体的衰老和其他疾病的发生，加重机体的衰老和病变。目前，市场上抗脑组织氧化损伤的药物少，且不易提取获得，纯度不高，有效成分不明确，价格高等缺点，给应用带来了很大的麻烦。开发一种来源广，纯度高，成分明确，效果好，安全无毒无害的抗脑组织氧化损伤的物质非常迫切且具有重大的意义。
化合物6-糠基氨基嘌呤是1956年Mliller在加热灭菌过的鲱鱼***DNA提取物中发现的一种具有促进细胞***活性的小分子化合物。它是一种非天然的细胞***素，俗称激动素，分子式C10H9N5O。纯品为白色固体，熔点是265-266℃，系两性化合物。易溶于稀盐酸或稀碱溶液；难溶于水、乙醇、***和丙酮。其6-糠氨基嘌呤的结构式如下：
6-糠基氨基嘌呤是第一个被发现具有细胞***素作用的物质。除具有促进细胞***、分化、和生长的作用外，还具有延缓器官衰老，诱导芽分化，增加气孔开度，诱导愈伤组织长芽，解除顶端优势，打破侧芽休眠和促进种子发芽，延缓蛋白质和叶绿素降解的作用。主要用于组织培养，促进细胞***和调节细胞分化，延缓衰老，果蔬保鲜，调节营养物质的运输，促进结实等方面。
化合物6-糠基氨基嘌呤在植物方面的抗氧化和抗衰老的作用是非常明显的，在动物和人体上还没有尝试过。
发明内容
本发明的目的在于，提供化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗动物和人体脑组织氧化损伤药物的新用途，申请人通过大量的试验首次发现6-糠基氨基嘌呤具有抗动物脑组织氧化损伤的作用，证明了该化合物6-糠基氨基嘌呤对动物和人也具有抗氧化损伤作用。可望被应用于提高脑组织抗氧化损伤能力药物的开发，也可被应用于抗衰老保健品的开发，如制成增强记忆力、抗疲劳、延缓脑组织衰老或者是术前保护药物，或者是系列能够增强抗脑组织氧化损伤能力的药物。这种药物可以用于目前所有剂型的开发应用，如制成粉剂、丸剂、片剂、针剂、冲剂、膏剂、纳米乳剂、胶囊或口服液。给药方式为口服给药、注射给药和透皮给药，用量限定在450mg/kg.b.w以内。
附图说明
图1是6-糠基氨基嘌呤对衰老小鼠脑组织形态学变化的影响图片；其中，图(1-A)为II组(×400)神经元稀疏、排列紊乱、部分神经元皱缩，核深染。图(1-B)是I组(×400)神经元排列整齐，紧密规则。图(1-C)是III组(×400)神经元排列规则，正常细胞数目增多。图(2-A)是II组(×15000)线粒体不规则肿胀、空泡变性、脊减少。图(2-B)是I组(×12000)线粒体结构正常，脊清晰。图(2-C)是III组(×20000)，损伤程度明显减轻，部分神经元粗面内质网轻度扩张。
以下结合附图和发明人给出的实验进一步验证本发明所述的6-糠基氨基嘌呤提高脑组织抗氧化损伤能力的新用途。
具体实施方式
本发明所述的脑组织氧化损伤是指生理性脑氧化损伤、病理性脑氧化损伤或药物性脑氧化损伤。
所述的生理性脑氧化损伤为随年龄增长而表现出的感觉迟钝、思维缓慢、学习记忆能力下降以及神经退行性变化表现的痴呆症状。
所述的病理性脑氧化损伤是脑梗塞、创伤性脑损伤引起的脑缺血-再灌注、阿尔茨海默病或帕金森病等伴随自由基氧化损伤的疾病所引起的脑组织氧化损伤。
所述的药物性脑损伤是由D-半乳糖、过氧化氢、β-淀粉样蛋白、谷氨酸或苯妥英钠能够直接或间接引起自由基大量产生的化学药品引起的脑组织氧化损伤。
以下是发明人给出的具体试验。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
6-糠基氨基嘌呤，购于厦门星隆达化学试剂有限公司，由美国Sanland公司生产。用0.06mol·L-1的盐酸配制成储备液，4℃保存备用，使用前用2mol·L-1NaOH滴定至近中性；丙二醛(MDA)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20060320；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20060325；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20060322；考马斯亮兰试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20060323；D-半乳糖(D-gal)，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20050711。
1.2 主要仪器
H-600透射电子显微镜，日本日立公司；UV1102紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；BS224S万分之一电子天平，北京赛多利斯仪器***有限公司；HS10268型10～100μL移液器，DRAGONMED公司生产。1.3 实验动物
清洁级ICR小鼠(Mus muscculus)，雄性，体重(20.0±2.0)g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号：陕动证字08-004号。
1.4 动物分组及处理
将45只小鼠随机分为5组，每组9只：I组(对照组)、II组(衰老模型组)、III组～V组(6-糠基氨基嘌呤保护组)。III组～V组每天分别灌胃10mg·kg-1、20mg·kg-1、40mg·kg-1的6-糠基氨基嘌呤，并同时颈背部皮下注射125mg·kg-1D-gal；II组每天灌胃等量的盐酸，颈背部皮下注射125mg·kg-1的D-gal；I组每天灌胃等量的盐酸，颈背部皮下注射等量的生理盐水；连续处理6周，每周称重，调节给药剂量。
1.5 6-糠基氨基嘌呤对衰老小鼠脑组织自由基代谢的影响
于43d从各组中随机抽取6只小鼠处死，取大脑并按质量:体积＝1:9的比例加入4℃生理盐水制成10％的组织匀浆，离心取上清待测。按说明书要求，以考马斯亮兰法测定总蛋白含量；黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力；DTNB法测定GSH-Px活性；TBA法测定MDA含量。
1.6 6-糠基氨基嘌呤对衰老小鼠脑组织形态学变化的影响
于43d每组小鼠取3只，分别给予30g/L巴比妥腹腔注射麻醉，通过左心室灌注37℃生理盐水来冲净血液，再灌注4℃的4％多聚甲醛磷酸缓冲液，固定6h，开颅取脑后，侵入4℃的20％蔗糖PB液，组织块沉淀后即可切片。用冰冻切片机对脑组织海马部位做连续冠状切片，厚度30μm，HE染色，再经酒精梯度脱水后，二甲苯透明、中性树胶封片。用普通光学显微镜进行病理组织学观察，照相，记录。
在以上小鼠开颅取脑后，取左侧大脑中央后回皮质1mm×1mm×3mm小块做透射电镜标本，经4％戊二醛固定2h，1％锇酸固定1h，梯度丙酮脱水，812环氧树脂包埋，半薄切片定位锥体细胞层，切片机切片，透射电镜观察并记录。
1.7 数据分析
数据处理使用医学统计软件SPLM 3.0(Statistical Program for LinearModeling)进行方差分析，试验结果以平均数±标准差(X±SD)表示。
2 结果
2.1 6-糠基氨基嘌呤对衰老小鼠脑组织自由基代谢的影响
由表1可知，与I组比较，II组小鼠脑组织的抗氧化酶SOD(-40.80％，P<0.05)、GSH-Px(-42.39％，P<0.05)活性显著降低；MDA(67.49％，P<0.05)含量显著升高，这表明D-半乳糖能通过扰乱自由基代谢而消耗脑组织的抗氧化酶。与II组比较，6-糠基氨基嘌呤保护组中，各项指标均有一定改善，以III组最为明显，其中SOD和GSH-Px活性分别提高了55.05％、70.17％，差异显著(p<0.05)；MDA含量降低了21.56％，差异显著(p<0.05)，说明10mg·kg-1的6-糠基氨基嘌呤能显著提高D-半乳糖致衰小鼠脑组织中的抗氧化酶活性，降低自由基含量。
表1 6-糠基氨基嘌呤对衰老小鼠脑组织自由基代谢的影响(n＝6，X±SD)
| Group | T-SOD(U/mgprot) | GSH-Px(U/mgprot) | MDA(nmol/mgprot) |
| I组 | 22.737±1.305 | 26.483±4.539 | 144.107±29.474 |
| II组 | 13.460±3.632<sup>*</sup> | 15.257±3.990<sup>*</sup> | 241.363±22.923<sup>*</sup> |
| III组 | 20.87±1.451<sup>△</sup> | 25.963±5.317<sup>△</sup> | 189.327±12.130<sup>△</sup> |
| IV组 | 20.14±3.895 | 23.873±2.625<sup>△</sup> | 194.630±11.377<sup>△</sup> |
| V组 | 19.903±5.531 | 22.697±2.999 | 217.233±25.223<sup>*</sup> |
注：与对照组相比，*p<0.05；与模型组相比△p<0.05
2.2 6-糠基氨基嘌呤对衰老小鼠脑组织形态学变化的影响
由图1-A可知，II组海马CA1区神经元分布稀疏，锥体细胞数量明显减少，且排列紊乱，胞体肿胀，胞膜融解，有空泡产生，出现核固缩，核裂解，有的神经元周围有空泡形成；I组(图1-B)海马CA1区神经细胞排列紧密而整齐，形态正常，结构完整，无变性，胶质细胞无增生；III组(图1-C)神经细胞排列较II组整齐，正常细胞数目增多。
由图2-A可知，II组神经元胞体的细胞核明显畸形，核仁偏移、线粒体畸形，肿胀，脊排列紊乱，部分脊消失，空泡变性，部分神经元核膜完整性消失，且出现嗜神经现象；I组(图2-B)线粒体结构正常，数量较多，嵴清晰可见；III组(图2-C)可明显减轻D-gal诱导的线粒体超微病理变化，但部分细胞质内仍出现线粒体肿胀且可见神经元粗面内质网轻度扩张。
3 结论
实验结果表明，6-糠基氨基嘌呤对D-半乳糖诱导的衰老小鼠脑组织SOD、GSH-Px活性降低和MDA含量升高具有明显的抑制作用，6-糠基氨基嘌呤组各项指标同模型组相比均具有一定改善；同时由光镜和透射电镜观察到6-糠基氨基嘌呤能维持脑组织正常形态，保护细胞粗面内质网和线粒体等亚细胞结构。通过该实验可以证明6-糠基氨基嘌呤具有提高小鼠脑组织抗氧化损伤能力的作用。
Claims (2)
1、化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗脑组织氧化损伤药物的应用，所述的脑组织氧化损伤是由D-半乳糖引起的自由基大量产生所导致。
2、如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物制成粉剂、丸剂、片剂、针剂、冲剂、膏剂、纳米乳剂、胶囊或口服液。
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