EP4127069A1 - Fluoreszenzfarbstoffe mit hohem stokes shift auf der basis von verbrückten benzopyryliumsalzen - Google Patents

Fluoreszenzfarbstoffe mit hohem stokes shift auf der basis von verbrückten benzopyryliumsalzen

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EP4127069A1
EP4127069A1 EP21716703.0A EP21716703A EP4127069A1 EP 4127069 A1 EP4127069 A1 EP 4127069A1 EP 21716703 A EP21716703 A EP 21716703A EP 4127069 A1 EP4127069 A1 EP 4127069A1
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EP
European Patent Office
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dimethyl
amino
ium
xanthene
ethyl
Prior art date
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Pending
Application number
EP21716703.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Schweder
Frank Lehmann
Matthias Wenzel
Peter Czerney
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dyomics GmbH
Original Assignee
Dyomics GmbH
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
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    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
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    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
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    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • C09B57/02—Coumarine dyes

Definitions

  • Fluorescence-based markers have been used for decades in biological, biotechnological and medical research as well as in medical diagnostics [Brinkley M., A Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates with Dyes, Flaptens and Cross-Linking Reagents, Bioconjugate Chem, 3 (1992) 2-12; Wagoner A Covalent Labeling of Proteins and Nucleic Acids with Fluorophores, Meth. Enzymol., 246 (1995) 362-373; Flermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press 2013; Springer Series on Fluorescence 18, 2019 (Pedras B.
  • An alternative approach for multiplex applications is the use of dyes that allow a spectral differentiation between donor and acceptor without energy transfer. Examples of this can be found in the MegaStokes dyes known since about 2002 (EP 1318 177 B1, EP 1 535 969 B1). These are preferably tailored to an excitation wavelength between 470 nm (blue-green LED) and 500 nm (488 nm Ar-ion laser), since they thus best corresponded to the state of the art for excitation light sources at the time.
  • the aim of the invention is to make fluorescent markers based on bridged benzopyrylium compounds accessible, whereby molecules K to be marked can be bound via the linker L and the reactive group A, and the fluorescent marker has as many of the following properties as possible: Shift, high photo and storage stability, solubility in aqueous media and high fluorescence quantum yields.
  • the invention describes compounds (in particular bridged benzopyrylium salts) of the general formula 1 1 and salts and solvates thereof, where
  • Rll and R12 are each independently hydrogen or alkyl, where alkyl is preferably Ci-C4-alkyl, particularly preferably methyl,
  • R2 is hydrogen, alkyl, preferably Ci-C4-alkyl, or alkenyl, hydrogen being preferred in one embodiment,
  • R3 is hydrogen, alkyl, preferably Ci-C4-alkyl, particularly preferably methyl, aryl, hydroxy or oxo, alkoxy, preferably methoxy or ethoxy, particularly preferably ethoxy, aryloxy, NR18R19 or a group Q, where R18 and R19 are each independently of one another from (i) hydrogen, (ii) benzyl, (iii) aryl, (iv) heteroaryl, (v) a reactive group A bonded via a linker L, (vi) alkyl, preferably C 1 -C 4 -alkyl, more preferably ethyl , (vii) w-sulfonic acid-alkyl (- (CH2) X -SO3), where x is preferably 1-5, especially is preferably 3, (viii) w-carboxylic acid alkyl (- (CH 2 ) V -C0 2 H), where y is preferably 1-8, particularly preferably 6, and
  • R21, R22, R23, R24 are each independently hydrogen, a sulfonic acid or a sulfonic acid derivative
  • R25 is hydrogen, alkyl, preferably Ci-Cg-alkyl, w-sulfonic acid-alkyl (- (CI- -SO), where x preferably 1-5, particularly preferably 3, or a reactive group A bonded via a linker L, or R2 and R3 to form a saturated ring, partially unsaturated ring, aromatic ring or heteroaromatic ring together with the carbon atoms to which they are attached are bound, are bridged, whereby the ring may contain further substituents,
  • R4 is hydrogen, bromine, chlorine, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative, alkyl, aryl or heteroaryl, with hydrogen, sulfonic acid and pyridine (4-pyridyl) being preferred, or R3 and R4 to form a saturated ring, partially unsaturated ring, aromatic ring or heteroaromatic ring are bridged together with the carbon atoms to which they are bound, it being possible for the ring to contain further substituents, in particular a sulfonic acid or a sulfonic acid derivative,
  • R5 is hydrogen, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative, hydrogen being preferred
  • R6 is hydrogen, bromine, chlorine, hydroxy, alkoxy (for example 6-oxyhexanoic acid), aryloxy or NR29R30, where R29 and R30 are each independently hydrogen, alkyl, aryl or a reactive group A bonded via a linker L, where R29 and R30, independently of one another, in each case preferably from (i) Ci-C4-alkyl, preferably ethyl, (ii) w-sulfonic acid-alkyl (- (CH2) X -S03), where x is preferably 1-5, particularly preferably 3, (iii) w-Carboxylic acid alkyl (- (C ⁇ J y -CC H), where y is preferably 1-8, particularly preferably 6, and (iv) ethyl esters of (iii) are selected, or R5 and R6 are selected to form a saturated one Ring, partially unsaturated ring, aromatic ring or heteroaromatic ring are bridged together with the
  • R7 is hydrogen, bromine, chlorine, hydroxy, alkoxy, aryloxy, NR31R32, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative, with hydrogen, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative being particularly is preferred, where R31 and R32, independently of one another, each selected from (i) hydrogen, (ii) benzyl, (iii) aryl, (iv) heteroaryl, (v) a reactive group A bonded via a linker L, (vi) alkyl, are preferred Ci-C4-alkyl, more preferably ethyl, (vii) w-sulfonic acid-alkyl (- (CH2) X -SO3), where x is preferably 1-5, particularly preferably 3, (viii) w-carboxylic acid alkyl (- (C ⁇ J y -CC H), where y is preferably 1-8, particularly preferably 6, and (ix) ethyl esters of (
  • R8 is hydrogen, methyl or ethyl, with hydrogen being preferred, or R7 and R8 are bridged to form a saturated ring, partially unsaturated ring, aromatic ring or heteroaromatic ring together with the carbon atoms to which they are bonded, the ring being further May contain substituents, in particular a sulfonic acid or a sulfonic acid derivative,
  • R9 is hydrogen, alkyl, preferably Ci-C 6 -alkyl, or 2-carboxyphenyl, hydrogen being preferred,
  • L is a linker selected from - (CH2) S - and - [(CH 2 ) m -0] p - (CH 2 ) m -, where m is an integer from 2-5 and p and s are each independently one represent an integer from 1-10, each compound containing no linker or one linker L with a reactive group A bonded to L for covalent bonding to a molecule K to be labeled, wherein
  • A is an amine (-NH2), hydroxy (-OH) or phosphoramidite (-0-P- [0-CH 2 -CH 2 -CN] -N [(CH (CHB) 2 ] 2 ) function, a Carboxylic acid (-COOH), an alkyl or active ester derived therefrom (NHS ester, sulfo-NHS ester, tetrafluoro-phenyl ester, p-sulfo-tetrafluoro-phenyl ester), a carboxylic acid hydrazide (- CONHNH2) or a carboxylic acid -Amid (-CONHR28) where R28 is equal to - (CH2) t -Y, where
  • Y is -OH, -NH 2 , -NH 3 + , maleimide (-N [CO-CH] 2 ), -NCS, -NCO, -NH-CO-CH 2 -l, -NH-CO-CH 2 - Br, -azide (-N3), -alkine (-CCH) or -phosphoramidite (-0-P- [0-CH 2 -CH 2 -CN] -N- [CH- (CHB) 2 ] 2 ) and t is an integer from 1-10, and
  • haptens molecules that represent an incomplete antigen and only show the effect of an antigen when they bind to proteins or cell structures
  • proteins proteins, antibodies (proteins that are formed in response to antigens)
  • low-molecular drugs effective components in drugs that, due to their relatively low molar mass up to about 800 g / mol, in contrast to proteins as very large molecules, are able to penetrate cells
  • peptides small or short-chain proteins up to about 100 linked amino acids
  • nucleotides basic building blocks of nucleic acids like DNA or RNA, which consist of a phosphate part, a monosaccharide part and a nucleobase part like adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil
  • nucleosides basic building blocks of nucleic acids like DNA or RNA that do not have a phosphate part but only consist of a monosaccharide part and a nucleobase part
  • DNA oligomers on the contrary
  • Aryl substituents and / or heteroaryl substituents (as in R3, R4, R6, R7, R18, R19, R29, R30, R31, R32) preferably contain further substituents such as sulfonic acids or sulfonic acid derivatives and / or alkoxy groups and / or substituted amino groups.
  • a compound according to the invention preferably contains at least one group selected from a sulfonic acid group, a sulfonic acid derivative, an alkoxy group and an amino group, preferably a sulfonic acid group.
  • sulfonic acid also includes the term sulfonate and the term sulfonate also includes the term sulfonic acid.
  • carboxylic acid also includes the term carboxylate and the term carboxylate also includes the term carboxylic acid.
  • the compound according to the invention preferably exhibits fluorescence.
  • the compound according to the invention is preferably a fluorescent dye.
  • the compound is preferably suitable as a fluorescent dye.
  • R3 hydroxy
  • the bridged compounds are, depending on the pH value, at low pH values as 3-hydroxy-xanthenium salts 1 and at higher pH values as 3-oxo-2H-xanthenes 4 with a neutral body.
  • R3 is preferably hydroxy, the compound being 3-oxo-2H-xanthene 4_ as a neutral base, depending on the pH.
  • one or more selected from R2-R3, R3-R4, R5-R6, R6-R7 and R7-R8 can be bridged by forming saturated rings, partially unsaturated rings, aromatic rings or heteroaromatic rings, which are independent of one another contain further substituents, in particular sulfonic acids or sulfonic acid derivatives.
  • At least one pair is selected from R3 with R4, R5 with R6, R6 with R7 and R7 with R8 to form a saturated ring, partially unsaturated ring, aromatic ring or heteroaromatic ring together with the carbon atoms to which they are attached, bridged, it being possible for each ring, independently of one another, to contain further substituents, in particular sulfonic acids or sulfonic acid derivatives.
  • R3 and R4 are not bridged together in such a way that, together with the carbon atoms to which they are attached, they form any ring selected from a saturated ring, partially unsaturated ring, aromatic ring, or heteroaromatic ring.
  • R3 and R4 are not bridged to one another in such a way that, together with the carbon atoms to which they are attached, they form an aromatic ring.
  • compounds according to the invention are indicated by the formula 5 (chromenoxanthenium compounds), to which, for example, a bridging of R2-R3 leads.
  • R13 is hydrogen, alkyl, preferably Ci-C4-alkyl, or 2-carboxyphenyl, hydrogen being particularly preferred,
  • R14 is hydrogen or alkyl, preferably Ci-C4-alkyl, with hydrogen being particularly preferred,
  • R15 is hydrogen, bromine, chlorine, hydroxy, alkoxy, aryloxy, NR33R34, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative or bridged to R16, hydrogen being particularly preferred, where R33 and R34 are each independently selected from (i) hydrogen, (ii) benzyl, ( iii) aryl, (iv) heteroaryl, (v) a reactive group A bonded via a linker L, (vi) alkyl, preferably C1-C4-alkyl, more preferably ethyl, (vii) w-sulfonic acid-alkyl (- (CH2) X -S03), where x is preferably 1-5, particularly preferably 3, (viii) w-carboxylic acid alkyl (- (CH 2 ) y -C0 2 H), where y is preferably 1-8, particularly preferably 6, and (ix) ethyl esters of (viii) are selected, or R14 and R15 are
  • R16 is hydrogen, bromine, chlorine, hydroxy, alkoxy, aryloxy or NR35R36, where NR35R36 is particularly preferred, where R35 and R36 are each independently selected from (i) hydrogen, (ii) benzyl, (iii) aryl, (iv) heteroaryl, (v) a reactive group A bonded via a linker L, (vi) alkyl, preferably C1-C4-alkyl, more preferably ethyl, (vii) w-sulfonic acid-alkyl (- (CH2) X —SO3), where x is preferably 1 -5, particularly preferably 3, is (viii) w-carboxylic acid alkyl (- (CH 2 ) y -C0 2 H), where y is preferably 1-8, particularly preferably 6, and (ix) ethyl esters of (viii) are selected it is particularly preferred that R35 and R36, independently of one another, are preferably selected from Ci-C4
  • R17 is hydrogen, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative, with hydrogen being particularly preferred, or R16 and R17 are bridged to form a saturated ring, partially unsaturated ring, aromatic ring or heteroaromatic ring together with the carbon atoms to which they are bonded, the Ring may contain further substituents, in particular a sulfonic acid or a sulfonic acid derivative.
  • Aryl substituents and / or heteroaryl substituents (as in R4, R6, R7, R15, R16, R18, R19, R33, R34, R35, R36) preferably contain further substituents such as sulfonic acids or sulfonic acid derivatives and / or alkoxy groups and / or substituted amino groups.
  • the absorption maxima are in the entire range of visible light, with a focus on 500-530 nm.
  • the compounds have a high Stokes shift in the range of 80 nm.
  • the absorption is measured, for example, at 25 ° C. in aqueous or ethanolic solutions with an extinction of 1.0 using a Specord 205 from Analytik Jena, the aqueous solutions preferably being phosphate-buffered saline solutions (PBS buffer; approx. 100 mM sodium chloride and 100 mM total phosphate) and have a pH of 7.5.
  • PBS buffer phosphate-buffered saline solutions
  • the emission is measured, for example, at 25 ° C in dilute aqueous or ethanolic solutions with an extinction of 0.1 using an FP-6600 Spectrofluorometer from Jasco, the dilute aqueous solutions preferably being phosphate-buffered saline solutions (PBS buffer; approx. 100 mM sodium chloride and 100 mM total phosphate) and have a pH of 7.5.
  • PBS buffer phosphate-buffered saline solutions
  • a compound according to the invention is preferably at least characterized in that the compound is a fluorescent compound.
  • the compound according to the invention has an absorption maximum in the wavelength range from 400 nm to 650 nm, preferably from 500 nm to 550 nm.
  • the compound according to the invention has an absorption maximum in the wavelength range from 630 nm to 700 nm, preferably from 650 nm to 690 nm.
  • the Stokes shift is preferably at least 40 nm, preferably 50 nm to 120 nm, even more preferably 70 nm to 90 nm.
  • R3 is NR18R19, where R18 and R19 are each independently selected from (i) hydrogen, (ii) benzyl, (iii) aryl, (iv) heteroaryl, (v) one via one Linker L-bonded reactive group A, (vi) alkyl, preferably C 1 -C 4 -alkyl, more preferably ethyl, (vii) w-sulfonic acid-alkyl (- (CH2) X -SO3), where x is preferably 1-5, especially is preferably 3, (viii) w-carboxylic acid alkyl (- (CH 2 ) y -C0 2 H), where y is preferably 1-8, particularly preferably 6, and (ix) ethyl esters of (viii) are selected, and where NR18R19 is particularly preferably selected from 3-aminopropane sulfonate, N-methyl aniline, 4- (methylamino)
  • a compound of the invention is preferably water-soluble.
  • a compound according to the invention is particularly preferably characterized at least by the fact that at 25 ° C. at least 1 mg, preferably 2 mg to 4 mg, of the compound is soluble in 1,000 g (1000 mg) of water.
  • the sulfonic acid groups influence the aggregation behavior and reduce non-covalent dimer formation and non-covalent attachment to biomolecules and surfaces.
  • Sulphonic acid substituents in particular which are bound directly to the dye base, also have an effect on the physico-chemical properties of the dyes in such a way that the absorption and emission wavelengths are shifted and a significant increase in the quantum yield is usually achieved.
  • the compound contains at least one sulfonic acid group.
  • a compound according to the invention preferably contains at least one group selected from a sulfonic acid group, a sulfonic acid derivative, a hydroxyl group, an amino group, a carboxylic acid and a carboxylic acid derivative.
  • the invention does not preferably include compounds in which R7 is methoxy and R3 is an amino group, in particular NR18R19, in particular NH (4-HOOCCeH 4 ), NH (4-C 2 H 5 COOC 6 H 4 ), NH (2- C2H5COOC6H4) , NH (C 6 H 5 ), N (C 2 H 5 ) 2, or N (CH 2 ) 2 (CH 2 ) 20.
  • the invention does not preferably include compounds in which R4 is bromine and R6 and R16 are N (CH 3 ) 2 .
  • the invention does not preferably include compounds in which R6 and R16 are present and one of R6 and R16 is a hydroxyl group.
  • the bridging gives stable benzopyrylium compounds which, depending on the substituents, achieve surprisingly high fluorescence quantum yields in aqueous solution.
  • the fluorescence quantum yield of a compound according to the invention is preferably 0.1 to 0.95, more preferably 0.5 to 0.9. Fluorescence quantum yields are preferably determined at 25 ° C in dilute aqueous or ethanolic solutions with an extinction of 0.1 using a Hamamatsu Absolute Photoluminescence Quantum Yield Measurement System C-9920, the dilute aqueous solutions preferably being phosphate-buffered saline solutions (PBS buffer; approx. 100 mM sodium chloride and 100 mM total phosphate) and have a pH of 7.5.
  • PBS buffer phosphate-buffered saline solutions
  • the compounds complement the already commercially available dyes with a high Stokes shift or represent better fluorescent alternatives.
  • the photo stability of the connections is very good. It is significantly higher than that of comparable coumarin-based dyes, for example as DY-510XL (see Fig. 1).
  • a compound according to the invention is preferably selected from the following compounds and their salts and solvates thereof (in the case of ions, the counterion, optionally the counterions, is preferably selected from tetrafluoroborate, chloride and sodium): 6-ethoxy-N, N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthene-10-ium-3-amine,
  • a compound according to the invention is particularly preferably selected from 6-ethoxy-N, N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthene-10-ium-3-amine tetrafluoroborate, 6 - [[6- (diethylamino) -l, l -dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl] amino] hexanoic acid chloride salt,
  • a compound according to the invention is particularly preferably selected from the following compounds and their salts and solvates thereof: 3 - [[6- [5-carboxypentyl (3-sulfonatopropyl) amino] -1, l-dimethyl-2H-xanthene-10-ium-3-yl] amino] propane-1-sulfonate,
  • a compound according to the invention is particularly preferably selected from
  • the compounds according to the invention can be used as dyes for the optical marking of organic or inorganic recognition units, e.g. B. of amino acids, peptides, proteins, antibodies, antigens, haptens, enzyme substrates, enzyme cofactors, biotin, carotenoids, hormones, neurohormones, neurotransmitters, growth factors, lectins, toxins, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, dextrans, DNA, nucleic acids , RNA, biological cells, lipids, receptor-binding pharmaceuticals or organic or inorganic polymeric carrier materials can be used.
  • organic or inorganic recognition units e.g. B. of amino acids, peptides, proteins, antibodies, antigens, haptens, enzyme substrates, enzyme cofactors, biotin, carotenoids, hormones, neurohormones, neurotransmitters, growth factors, lectins, toxins, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, dextrans,
  • the identification units can be marked by the formation of ionic or van der Waals interactions between the markers (compounds according to the invention) and the materials to be marked.
  • Both the compounds according to the invention and systems derived therefrom can be used in optical, in particular fluorescence-optical, qualitative and quantitative determination methods for diagnosing cell properties, in biosensors (point of care measurements), for researching the genome (DNA sequencing) and in miniaturization technologies.
  • Typical applications are in cytometry and cell sorting, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in ultra-high throughput screening (UHTS), in multicolor fluorescence in situ hybridization (FISH) and in microarrays (DNA- and protein chips).
  • a receptor is a molecule that has an affinity for a given ligand.
  • Receptors can be naturally occurring or man-made molecules. Receptors can be in pure form or bound to other species can be used. Receptors can be linked to a binding partner covalently or non-covalently either directly or through certain coupling mediators.
  • a ligand is a molecule that is recognized by a specific receptor.
  • ligands that can be detected by this invention include agonists and antagonists for cell membrane receptors, toxins and other toxins, viral epitopes, hormones such as opiates and steroids, hormone receptors, peptides, enzymes, enzyme substrates, agents acting as cofactors, Lectins, sugars, oligonucleotides, nucleic acids, oligosaccharides, proteins and antibodies include, but are not limited to, the substances listed.
  • one of the compounds disclosed herein is also used as a fluorescent dye and / or in a fluorescent probe or as a fluorescent probe for labeling one or more compounds selected from amino acids, peptides, proteins, antibodies, antigens, haptens, enzyme substrates, enzyme cofactors , Biotin, carotenoids, hormones, neurohormones, neurotransmitters, growth factors, lectins, toxins, carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, dextrans, nucleic acids, oligonucleotides, DNA, RNA, lipids, receptor-binding drugs and cells.
  • Compounds according to the invention can have at least one reactive group A in the form of an active ester, the active ester preferably being an NHS ester (N-hydroxysuccinimidyl ester), a sulfo-NHS ester (sulfo-hydroxysuccinimidyl ester), a TFP ester ( Tetrafluoro-phenyl ester) or an STP-ester (p-sulfo-tetrafluoro-phenyl ester), as indicated in the table below.
  • an NHS ester N-hydroxysuccinimidyl ester
  • a sulfo-NHS ester sulfo-hydroxysuccinimidyl ester
  • TFP ester Tetrafluoro-phenyl ester
  • STP-ester p-sulfo-tetrafluoro-phenyl ester
  • the compounds according to the invention can have A in the form of a carboxylic acid derivative, the carboxylic acid derivative preferably being a hydrazide, an amine, an iodoacetamide, a maleimide, an alkyne or an azide, as indicated in the table below.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a compound of the formula 1, preferably for the preparation of a compound according to the invention according to the formula 1.
  • the method comprises the reaction of (E) - (3-ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-1-ylidene) -ethyl-oxonium or (E) - [3-ethoxy-5,5-dimethyl -2- (4-pyridyl) cyclohex-2-en-l-ylidene] -ethyl-oxonium with a benzaldehyde compound, the benzaldehyde compound having a benzaldehyde group and the benzaldehyde compound having a flydroxy group in the ortho position to the benzaldehyde group .
  • the reaction is preferably carried out in an organic solvent, the organic solvent preferably being triethyl orthoformate.
  • the reaction is carried out at 70 ° C to 200 ° C, more preferably at 90 ° C to 130 ° C.
  • E) - [3-ethoxy-5,5-dimethyl-2- (4-pyridyl) cyclohex-2-en-1-ylidene] -ethyl-oxonium tetrafluoroborate is used.
  • the benzaldehyde compound is preferably selected from 2-flyroxy-4-diethylaminobenzaldehyde, 3- (N- (6-ethoxy-6-oxo-hexyl) -4-formyl-3-hydroxy-anilino) propane-1-sulfonate, ethyl 6- (N-ethyl-4-formyl-3-hydroxy-anilino) hexanoic acid, 2,4-dihydroxybenzaldehyde, 3- (6-formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l-quinolyl) propane l-sulfonate and 6- (6-formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l-quinolyl) hexanoic acid.
  • the process can include the conversion of the compound 5,5-dimethylcyclohexane-1,3-dione or 3-flydroxy-5,5-dimethyl-2- (4-pyridyl) cyclohex-2-en-1-one
  • the invention also relates to a process for the preparation of a compound of the formula 5, preferably for the preparation of a compound according to the invention according to the formula 5.
  • the process comprises the reaction of a compound of formula 1, preferably 6-ethoxy-N, N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthene-10-ium-3-amine or 6 - [(6-ethoxy-8 , 8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl) -ethyl-amino] ethyl hexanoate, with a benzaldehyde compound, the benzaldehyde compound having a benzaldehyde group and the benzaldehyde compound in the ortho position to the benzaldehyde group Has hydroxyl group.
  • the reaction is preferably carried out in an organic solvent, the organic solvent preferably being glacial acetic acid.
  • the reaction is carried out at 70 ° C to 200 ° C, more preferably at 90 ° C to 110 ° C.
  • 6-Ethoxy-N, N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthene-10-ium-3-amine tetrafluoroborate or 6 - [(6-ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthene-10 -ium-3-yl) -ethyl-amino] hexanoic acid ethyl ester tetrafluoroborate is used.
  • the benzaldehyde compound is preferably selected from 2- [4- (diethylamino) -2-hydroxy-benzoyl] benzoic acid, 4- (diethylamino) -2-hydroxy-benzaldehyde and 2-hydroxy-4-methoxy-benzaldehyde.
  • the processes according to the invention for preparing a compound of the formula 1 or 5 preferably comprise the introduction of at least one group selected from a sulfonic acid group, a sulfonic acid derivative, an alkoxy group and an amino group, particularly preferably a sulfonic acid group.
  • Fig. 1 Photostability of compounds 5, 8, 11 and 38 compared to the MegaStokes dye DY-510XL.
  • Fig.2 Emission spectra of selected compounds according to the invention in PBS.
  • UV-Vis in ethanol l, ⁇ c: 531 nm; 605 nm
  • 125 pmol of compound 5 are dissolved in 3 ml of DMF.
  • TSTU N, N, N ', N'-Tetramethyl-Q- (N-succinimidyl) uronium tetrafluoroborate
  • DIPEA diisopropyl-ethylamine
  • Connection 14 6- [5-carboxypentyl (ethyl) amino] -1, l-dimethyl-3- (4-sulfonatoanilino) -2H-xanthene-10-ium-4-sulfonate
  • mitioI compound 13 are dissolved in 2 ml oleum (20% SO3) and stirred at RT for 2 hours. The mixture is poured onto ice and stirred for a further 1 hour at RT. After blunting with sodium carbonate, purification is carried out by RP chromatography.
  • the mixture is warmed to RT and stirred at RT for a further 1 hour.
  • the organic solvents are distilled off and the product is isolated from the aqueous phase by RP chromatography.
  • UV-Vis in water pH 3 X m3x - x nm; x nm (available as Hydroxy-BPS)
  • UV-Vis in PBS l TM c : 409 nm; 485 nm UV-Vis in buffer pH 9: X max : 462 nm; X em : 536 nm
  • FIG. 1 shows the results of the irradiation of aqueous solutions (PBS pH 7.5, 100 mM & 100 mM NaCl plus 5 mM NaNs) of compounds 5, 8, 11 and 38 in comparison with the MegaStokes dye DY-510XL.
  • the solutions were adjusted to an absorbance of "1" in the absorption maximum with a layer thickness of 1 cm and irradiated with white light from the 150W Xe lamp of a fluorescence spectrometer (JASCO FP-6600, monochromator at 0 nm, column position L: 10 nm) and the Absorption was monitored at a maximum in 5 minute intervals over one hour.
  • FIG. 2 shows the fluorescence maxima of selected compounds.
  • the invention relates to novel, water-soluble fluorescent dyes with a high fluorescence quantum yield based on oxygen-containing heterocycles, their reactive derivatives and dye conjugates and their use for marking samples and detecting analytes.
  • the compounds of the new class of dyes are compatible with commercial excitation light sources and are characterized by Stokes shifts of more than 50 nm.
  • Rll and R12 are each independently hydrogen or alkyl, R2 is hydrogen, alkyl or alkenyl,
  • R4 is hydrogen, bromine, chlorine, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative, alkyl, aryl or heteroaryl and
  • R5 is hydrogen, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative
  • R6 is hydrogen, bromine, chlorine, hydroxy, alkoxy, aryloxy or NR29R30, where R29 and R30, independently of one another, are each hydrogen, alkyl, aryl or a reactive group A bonded via a linker L, where R29 and R30, independently of one another, are each preferably composed of ( i) Ci- C4-alkyl, (ii) w-sulfonic acid-alkyl (- (CH 2 ) X -S0 3 _ ), where x is 1-5, (iii) co-carboxylic acid alkyl (- (C ⁇ J y -CC H), where y is 1-8 and (iv) ethyl esters of (iii) are selected,
  • R7 is hydrogen, bromine, chlorine, hydroxy, alkoxy, aryloxy, NR31R32, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative, where R31 and R32 are each independently selected from (i) hydrogen, (ii) benzyl, (iii) aryl, (iv) heteroaryl, ( v) a reactive group A bonded via a linker L, (vi) alkyl, preferably Ci-C4-alkyl, (vii) co-sulfonic acid-alkyl (- (CH2) X -S03 _ ), where x is 1-5, (viii) co-carboxylic acid alkyl (- (CH 2 ) y -C0 2 H), where y is 1-8, and (ix) ethyl esters of (viii) are selected,
  • R8 is hydrogen, methyl or ethyl
  • R9 is hydrogen, alkyl or 2-carboxyphenyl
  • L is a linker selected from - (CH2) s - and - [(CH 2 ) m -0] p - (CH 2 ) m -, where m is an integer from 2-5 and p and s are each independently one represent integers from 1-10, each compound containing no linker or one linker L with a reactive group A bonded to L for covalent bonding to a molecule K to be labeled, where A is an amine (-NH2), hydroxy (-OH) or phosphoramidite (-0-P- [0-CH 2 -CH 2 -CN] -N [(CH (CHB) 2 ] 2 ) function, a Carboxylic acid (-COOH), an alkyl or active ester derived therefrom (NHS ester, sulfo-NHS ester, tetrafluoro-phenyl ester, p-sulfo-tetrafluoro-phenyl ester), a carboxylic acid hydra
  • Y is -OH, -NH 2 , -NH 3 + , maleimide (-N [CO-CH] 2 ), -NCS, -NCO, -NH-CO-CH 2 -l, -NH-CO-CH 2 - Br, -azide (-N3), -alkine (-CCH) or -phosphoramidite (-0-P- [0-CH 2 -CH 2 -CN] -N- [CH- (CHB) 2 ] 2 ) and t is an integer from 1-10,
  • haptens molecules that represent an incomplete antigen and only show the effect of an antigen when they bind to proteins or cell structures
  • proteins proteins, antibodies (proteins that are formed in response to antigens), low-molecular drugs (effective components in drugs, which due to their relatively low molar mass up to about 800 g / mol, in contrast to proteins as very large molecules, are able to penetrate cells
  • peptides small or short-chain proteins up to about 100 Amino acids
  • nucleotides basic building blocks of nucleic acids such as DNA or RNA, which consist of a phosphate part, a monosaccharide part and a nucleobase part such as adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil
  • nucleosides basic building blocks of nucleic acids such as DNA or RNA that do not have a phosphate part , but only consist of a monosaccharide part and a nucleobase part
  • R3 hydroxyl, the compound being 3-oxo-2H-xanthene 4 as a neutral base, depending on the pH is present.
  • Compound according to aspect 1 or 2 characterized in that at least one selected from R2-R3, R3-R4, R5-R6, R6-R7 and R7-R8 is bridged by saturated rings, partially unsaturated rings, aromatic rings or heteroaromatic rings be formed which, independently of one another, contain further substituents, in particular sulfonic acids or sulfonic acid derivatives.
  • R13 is hydrogen, alkyl or 2-carboxyphenyl
  • R14 is hydrogen, alkyl or 2-carboxyphenyl
  • R15 is hydrogen, bromine, chlorine, hydroxy, alkoxy, aryloxy, NR33R34, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative or bridged to R16, where R33 and R34 are each independently selected from (i) hydrogen, (ii) benzyl, (iii) aryl, (iv ) Heteroaryl, (v) a reactive group A bonded via a linker L, (vi) alkyl, preferably Ci-C4-alkyl, (vii) co-sulfonic acid-alkyl (- (CH2) X -S03), where x 1- 5 is, (viii) co-carboxylic acid alkyl (- (C ⁇ J y -CC H), where y is 1-8, and (ix) ethyl esters of (viii) are selected,
  • R16 is hydrogen, bromine, chlorine, hydroxy, alkoxy, aryloxy or NR35R36, where R35 and R36 are each independently selected from (i) hydrogen, (ii) benzyl, (iii) aryl, (iv) heteroaryl, (v) one via one Linker L bonded reactive group A, (vi) alkyl, preferably Ci-C4-alkyl, (vii) co-sulfonic acid alkyl (- (CH2) X -SO3 _ ), where x is 1-5, (viii) w-carboxylic acid alkyl (- (C ⁇ J y -CC H), where y is 1-8, and (ix) ethyl esters of (viii) are selected,
  • R17 is hydrogen, sulfonic acid or a sulfonic acid derivative and one or more selected from R5-R6, R6-R7, R7-R8, R14-R15, R15-R16 and R16-R17 can be bridged by saturated rings, partially unsaturated rings, aromatic Rings or heteroaromatic rings are formed which, independently of one another, can contain further substituents, in particular sulfonic acids or sulfonic acid derivatives, and preferably aryl substituents and / or heteroaryl substituents (as in R4, R6, R7, R15, R16, R18, R19, R33, R34, R35, R36) contain further substituents such as sulfonic acids or sulfonic acid derivatives and / or alkoxy groups and / or substituted amino groups.
  • R3 is NR18R19, where R18 and R19 are each independently hydrogen, alkyl, benzyl, aryl, heteroaryl or a reactive group A bonded via a linker L, where NR18R19 preferably consists of 3-aminopropanesulfonate , N-methylaniline, 4- (methylamino) benzene sulfonate, aniline, 5-carboxypentylamine and 3-carboxypropyl (methyl) amine.
  • a compound according to any one of the preceding aspects characterized in that at 25 ° C at least 1 mg of the compound is soluble in 1,000 g of water.
  • the compound is a fluorescent compound which has an absorption maximum in the wavelength range from 400 nm to 650 nm, preferably from 500 nm to 550 nm.
  • the Stokes shift is at least 40 nm, preferably 50 nm to 120 nm, even more preferably 70 nm to 90 nm.
  • connection according to any of the previous aspects, characterized in that the connection is selected from
  • a process for the preparation of a compound of formula 1, which process comprises the reaction of (E) - (3-ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-1-ylidene) -ethyl-oxonium or (E) - [ 3-ethoxy-5,5-dimethyl-2- (4-pyridyl) cyclohex-2-en-l-ylidene] ethyl oxonium with a benzaldehyde compound, the benzaldehyde compound having a benzaldehyde group and the benzaldehyde Compound in ortho position to the benzaldehyde group has a hydroxyl group.
  • a compound of formula 1 preferably 6-ethoxy-N, N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthene-10-ium-3-amine or 6 - [(6-ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthene-10-ium-3

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf neuartige, wasserlösliche Fluoreszenzfarbstoffe mit hoher Fluoreszenzquantenausbeute auf der Basis von sauerstoffhaltigen Heterocyclen, deren reaktive Derivate und Farbstoff-Konjugate sowie deren Anwendung zum Markieren von Proben und dem Nachweis von Analyten. Die Verbindungen der neuen Farbstoffklasse sind mit kommerziellen Anregungslichtquellen kompatibel und zeichnen sich durch Stokes-Verschiebungen von mehr als 50 nm aus.

Description

Fluoreszenzfarbstoffe mit hohem Stokes Shift auf der Basis von verbrückten
Benzopyryliumsalzen
Beschreibung
Stand der Wissenschaft und Forschung
Fluoreszenzbasierte Marker finden seit Jahrzehnten Einsatz in der biologischen, biotechnologischen und medizinischen Forschung sowie in der medizinischen Diagnostik [Brinkley M., A Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates with Dyes, Flaptens and Cross-Linking Reagents, Bioconjugate Chem, 3 (1992) 2-12; Waggoner A Covalent Labeling of Proteins and Nucleic Acids with Fluorophores, Meth. Enzymol., 246 (1995) 362-373; Flermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press 2013; Springer Series on Fluorescence 18, 2019 (Pedras B. Editor): Fluorescence in Industry] Ursprünglich wurden aus dem Bereich der Textil- und Sensibilisatorfarbstoffe bekannte Chromophore derivatisiert, um sie für Anwendungen im wässrig-physiologischen Milieu zu optimieren. Besondere Schwerpunkte der Entwicklungen stellten hier die Wasserlöslichkeit sowie eine hohe Quantenausbeute in wässriger Lösung dar.
Das Streben nach immer höherem Informationsgewinn bei bioanalytischen Verfahren findet seinen Ausdruck in Mehrfarb-Analysen, wie sie beispielsweise in der Durchfluß-Zytometrie [Lee L.G., NEAR-IR Dyes in Three Color Volumetrie Capillary Cytometry: Cell Analysis With 633- and 785-nm Laser Excitation, Cytometry, 21 (1995) 120-128], der DNA-Sequenzierung und verschiedenen PCR-Methoden (Roche's LightCycler) mittlerweile zum Laboralltag gehören.
Auch in der hochauflösenden optischen Mikroskopie, insbesondere der STED-Mikroskopie [Sednev M.V., Belov V.N., Hell S.W., Fluorescent dyes with large Stokes shifts for super-resolution optical microscopy of biological objects: a review, MethodsAppl.Fluoresc. 3 (2015) 042004] finden Farbstoffe mit hohem Stokes Shift Verwendung. Anfänglich wurde hier auf Farbstoff-Kombinationen zurückgegriffen, die mittels Energietransfer von einem Donor auf verschiedene Akzeptoren bei Anregung durch ein und dieselbe (monochromatisc he) Lichtquelle spektral unterscheidbare Signale liefern. Beispiele hierfür sind die DNA-Sequenzer von Amersham (jetzt GE Healthcare) und ABI (jetzt Life Technologies), die Ende der 1990er Jahre auf den Markt kamen. Ein alternativer Ansatz für Multiplex-Anwendungen stellt der Einsatz von Farbstoffen dar, die ohne Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor eine spektrale Differenzierung zulassen. Beispiele hierfür finden sich in den seit ca. 2002 bekannten MegaStokes-Farbstoffen (EP 1318 177 Bl, EP 1 535 969 Bl). Diese sind vorzugsweise auf eine Anregungswellenlänge zwischen 470 nm (blaugrüne LED) und 500 nm (488 nm-Ar-lonen-Laser) zugeschnitten, da sie somit dem damaligen Stand der Technik bei Anregungslichtquellen am besten entsprachen.
Auch die Kombination von mehreren Anregungslichtquellen mit mehr als einem Chromphor je Lichtquelle hat mittlerweile Eingang in den Stand der Technik gefunden (Solexa, W02007/135368 A2). Eine typische Anwendung ist hier das Next Generation Sequencing (NGS).
Mit der Verfügbarkeit von lichtintensiven, kurzwelligen Anregungsquellen wie UV-LEDs bzw. violetten Laserdioden verbreiterte sich auch die Basis geeigneter Fluorophore für bioanalytische Anwendungen. Beispiele hierfür sind das Pacific Orange von Molecular Probes (US 8 158 801) und eine Reihe von Benzoxazol-basierten Farbstoffen von Dyomics (US 9453 010 B2, EP 2 886 542 Bl), die in Analogie zu den MegaStokes™-Farbstoffen Mehrfarbanalysen erlaubte, allerdings bei einer Anregung um 400 nm.
Die Erfindung hat das Ziel, Fluoreszenzmarker auf der Basis von verbrückten Benzopyrylium- Verbindungen zugänglich zu machen, wobei zu markierende Moleküle K über den Linker L und die reaktive Gruppe A gebunden werden können, und der Fluoreszenzmarker möglichst viele der folgenden Eigenschaften aufweist: Großer Stokes-Shift, hohe Photo- und Lagerstabilität, Löslichkeit in wässrigen Medien und hohe Fluoreszenzquantenausbeuten.
Der Erfindung beschreibt Verbindungen (insbesondere verbrückte Benzopyryliumsalze) der allgemeinen Formel 1 1 und Salze sowie Solvate davon, wobei
Rll und R12 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff oder Alkyl sind, wobei Alkyl vorzugsweise Ci-C4-Alkyl, besonders bevorzugt Methyl, ist,
R2 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise Ci-C4-Alkyl, oder Alkenyl ist, wobei Wasserstoff in einer Ausführungsform bevorzugt ist,
R3 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise Ci-C4-Alkyl, besonders bevorzugt Methyl, Aryl, Hydroxy bzw. Oxo, Alkoxy, vorzugsweise Methoxy oder Ethoxy, besonders bevorzugt Ethoxy, Aryloxy, NR18R19 oder eine Gruppe Q ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4- Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) w-Carbonsäurealkyl (-(CH2)V-C02H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, und wobei NR18R19 besonders bevorzugt aus 3-Aminopropansulfonat, N-Methylanilin, 4- (Methylamino)benzensulfonat, Anilin, 5-Carboxypentylamin und 3-Carboxypropyl(methyl)amin ausgewählt ist, und Q eine heterocyclische Struktur ausgewählt aus einer Struktur der Formel 2 oder 3 ist, mit n= 1, 2 oder 3; wobei R20 unabhängig voneinander jeweils Alkyl, vorzugsweise Ci-Cg-Alkyl, co- Sulfonsäure-Alkyl (-(CFhJx-SOs ), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, R21, R22, R23, R24 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat sind, R25 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise Ci-Cg-Alkyl, w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CI- -SO ), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, oder R2 und R3 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten enthalten kann,
R4 Wasserstoff, Brom, Chlor, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, Alkyl, Aryl oder Heteroaryl ist, wobei Wasserstoff, Sulfonsäure und Pyridin (4-Pyridyl) bevorzugt sind, oder R3 und R4 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R5 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei Wasserstoff bevorzugt ist,
R6 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy (beispielsweise 6-Oxy-hexansäure), Aryloxy oder NR29R30 ist, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A sind, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils vorzugsweise aus (i) Ci-C4-Alkyl, bevorzugt Ethyl, (ii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (iii) w-Carbonsäurealkyl (-(C^Jy-CC H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist und (iv) Ethylestern von (iii) ausgewählt sind, oder R5 und R6 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R7 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR31R32, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat besonders bevorzugt ist, wobei R31 und R32 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt Ci-C4-Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) w-Carbonsäurealkyl (-(C^Jy-CC H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, oder R6 und R7 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R8 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, wobei Wasserstoff bevorzugt ist, oder R7 und R8 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R9 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise Ci-C6-Alkyl, oder 2-Carboxyphenyl ist, wobei Wasserstoff bevorzugt ist,
L ein Linker ausgewählt aus -(CH2)S- und -[(CH2)m-0]p-(CH2)m- ist, wobei m eine ganze Zahl von 2 - 5 ist und p und s unabhängig voneinander jeweils eine ganze Zahl von 1-10 darstellen, wobei jede Verbindung keinen oder einen Linker L mit einer an L gebundenen reaktiven Gruppe A zur kovalenten Bindung an ein zu markierendes Molekül K enthält, wobei
A eine Amin- (-NH2), Hydroxy- (-OH) oder Phosphoramidit (-0-P-[0-CH2-CH2-CN]-N[(CH(CHB)2]2) - Funktion, eine Carbonsäure (-COOH), ein davon abgeleiteter Alkyl- oder Aktiv-Ester (NHS-Ester, Sulfo- NHS-Ester, Tetrafluoro-Phenylester, p-Sulfo-Tetrafluoro-Phenylester), ein Carbonsäure-Hydrazid (- CONHNH2) oder ein Carbonsäure-Amid (-CONHR28) mit R28 gleich -(CH2)t-Y ist, wobei
Y gleich -OH, -NH2, -NH3 +, Maleimid (-N[CO-CH]2), -NCS, -NCO, -NH-CO-CH2-l, -NH-CO-CH2-Br, -Azid (- N3), -Alkin (-CCH) oder-Phosphoramidit (-0-P-[0-CH2-CH2-CN]-N-[CH-(CHB)2]2) ist und t eine ganze Zahl von 1-10 ist, und
K eine Komponente, ausgewählt aus der Gruppe Haptene (Moleküle, die ein unvollständiges Antigen darstellen und erst bei Bindung an Proteine bzw. Zellstrukturen die Wirkung eines Antigens zeigen), Proteine, Antikörper (Proteine, die als Reaktion auf Antigene gebildet werden), niedermolekulare Arzneistoffe (wirksame Bestandteile in Arzneimitteln, die aufgrund ihrer relativ geringen Molmasse bis etwa 800 g/mol, im Gegensatz zu zum Beispiel Proteinen als sehr große Moleküle, in der Lage sind, in Zellen einzudringen), Peptide (kleine bzw. kurzkettige Proteine bis etwa 100 verknüpfte Aminosäuren), Nucleotide (Grundbausteine von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die aus einem Phosphatteil, einem Monosaccharidteil und einem Nucleobasenteil wie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil bestehen), Nucleoside (Grundbausteine von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die keinen Phosphatteil besitzen, sondern nur aus einem Monosaccharidteil und einem Nucleobasenteil bestehen), DNA- Oligomere (im Gegensatz zu DNA als Makromolekül Moleküle der Desoxyribonucleinsäure mit einer relativ geringen, nicht genau definierten Anzahl an Nucleotiden), Polymere (synthethische oder natürliche, kettenförmige oder verzweigte chemische Verbindung aus sich wiederholenden Einheiten, den Monomeren; Polymere können auch als Copolymere aus mindestens zwei unterschiedlichen Monomeren in verschiedenen Mengenverhältnissen und Anordnungen bestehen), ist.
Vorzugsweise enthalten Arylsubstituenten und/oder Heteroarylsubstituenten (wie in R3, R4, R6, R7, R18, R19, R29, R30, R31, R32) weitere Substituenten wie Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate und/oder Alkoxygruppen und/oder substituierte Aminogruppen.
Vorzugsweise enthält eine erfindungsgemäße Verbindung mindestens eine Gruppe ausgewählt aus einer Sulfonsäuregruppe, einem Sulfonsäurederivat, einer Alkoxygruppe und einer Aminogruppe, bevorzugt eine Sulfonsäuregruppe.
Der Begriff Sulfonsäure umfasst auch den Begriff Sulfonat und der Begriff Sulfonat umfasst auch den Begriff Sulfonsäure. Der Begriff Carbonsäure umfasst auch den Begriff Carboxylat und der Begriff Carboxylat umfasst auch den Begriff Carbonsäure.
Die Verben „umfassen" und „enthalten" und ihre Konjugationen umfassen auch das Verb „bestehen aus" und seine Konjugationen.
Bevorzugte Ausführungsformen sind auch in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Vorzugsweise weist die erfindungsgemäße Verbindung eine Fluoreszenz auf.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Fluoreszenzfarbstoff. Mit anderen Worten, vorzugsweise ist die Verbindung als Fluoreszenzfarbstoff geeignet.
In einer Ausführungsform ist R3= Hydroxy.
Im Fall R3= Hydroxy liegen die verbrückten Verbindungen in Abhängigkeit vom pH-Wert bei niedrigen pH-Werten als 3-Hydroxy-xanthenium-Salze 1 vor und bei höheren pH-Werten als 3-Oxo-2H-xanthene 4 mit neutralem Grundkörper. In einer Ausführungsform ist R3 bevorzugt Hydroxy, wobei die Verbindung in Abhängigkeit vom pH-Wert als neutraler Grundkörper 3-Oxo-2H-xanthen 4_vorliegt.
In erfindungsgemäßen Verbindungen können ein oder mehrere ausgewählt aus R2-R3, R3-R4, R5-R6, R6-R7 und R7-R8 verbrückt sein, indem gesättigte Ringe, partiell ungesättigte Ringe, aromatische Ringe oder heteroaromatische Ringe gebildet werden, die unabhängig voneinander weitere Substituenten, insbesondere Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate, enthalten.
In einer Ausführungsform ist mindestens ein Paar ausgewählt aus R3 mit R4, R5 mit R6, R6 mit R7 und R7 mit R8 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt, wobei jeder Ring unabhängig voneinander weitere Substituenten, insbesondere Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate, enthalten kann.
In einer Ausführungsform sind R3 und R4 nicht in einer Weise miteinander verbrückt, dass sie zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, irgendeinen Ring ausgewählt aus einem gesättigten Ring, partiell ungesättigten Ring, aromatischen Ring oder heteroaromatischen Ring bilden.
In einer Ausführungsform sind R3 und R4 nicht in einer Weise miteinander verbrückt, dass sie zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden.
Weiterhin sind erfindungsgemäße Verbindungen durch die Formel 5 angegeben (Chromeno- xanthenium-Verbindungen), zu welchen z.B. eine Verbrückung von R2-R3 führt.
Neben den allgemeinen Ausführungen gilt für die zusätzlichen Substituenten R13-R17, dass
R13 Wasserstoff, Alkyl, vorzugsweise Ci-C4-Alkyl, oder 2-Carboxyphenyl ist, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist,
R14 Wasserstoff oder Alkyl, vorzugsweise Ci-C4-Alkyl, ist, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist,
R15 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR33R34, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat oder verbrückt zu R16 ist, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist, wobei R33 und R34 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4- Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) w-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-C02H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, oder R14 und R15 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R16 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy oder NR35R36 ist, wobei NR35R36 besonders bevorzugt ist, wobei R35 und R36 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4- Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) w-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-C02H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, wobei besonders bevorzugt ist, dass R35 und R36 unabhängig voneinander jeweils vorzugsweise aus Ci-C4-Alkyl, bevorzugt Ethyl, und w-Carbonsäurealkyl (-(C^Jy-CC H) ausgewählt sind, wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, oder R15 und R16 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R17 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei Wasserstoff besonders bevorzugt ist, oder R16 und R17 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann.
Vorzugsweise enthalten Arylsubstituenten und/oder Heteroarylsubstituenten (wie in R4, R6, R7, R15, R16, R18, R19, R33, R34, R35, R36) weitere Substituenten wie Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate und/oder Alkoxygruppen und/oder substituierte Aminogruppen.
Wenige Beispiele von einfachen, nicht funktionalisierten Verbindungen dieses Typs sind bekannt. In DE 2942931 Al; BASF AG; 07.05.1981; Schmidt R., Koch V. [1] wurde die Synthese von Grundkörpern der Formel 5 und deren Anwendung zum Anfärben anionisch modifizierter Textilfasern erstmals beschrieben. Es wurden keine genauen Angaben zur Fluoreszenz gemacht.
In Russian Journal of Organic Chemistry, 37(4), 2001, 527-538 ; Olekhnovich E.P., Boroshko S.L., Korobka I.V., Metelitsa A.V., Olekhnovich L.P. [2] wurden mehrere Verbindungen dieses Types mit einer eingeschränkte Kombination von einfachen, nicht funktionalisierten Substituenten hergestellt und bezüglich ihren Absorptions- und Emissionseigenschaften genauer untersucht. Dort wurde ein anderer synthetischer Zugang genutzt, der auch die Verbindungen der Formeln 1 und 4 zugänglich machte. Eine konkrete Anwendung dieser Verbindungen wurde nicht beschrieben. Diese Grundstrukturen sind nur in organischen Lösungsmitteln löslich und enthalten keine Funktionalitäten, welche die Löslichkeit in wässriger Lösung bewirkt und die das kovalente Anbinden von beispielsweise Biomolekülen ermöglichen.
Durch die Darstellung der von uns beanspruchten funktionalisierten verbrückten Benzopyrylium- Verbindungen werden folgende Vorteile erreicht:
Durch die Einführung von Linkern und reaktiven Gruppen an diesen Typen der verbrückten Benzopyryliumsalze ermöglichen wir das Eingehen einer kovalenten Bindung mit einem geeigneten Biomolekül als Voraussetzung für den Einsatz als Fluoreszenzmarker. Durch die erweiterte Auswahl an Substituenten, insbesondere um unterschiedlich substituierte Alkoxy- bzw. Aminogruppen, ist es möglich, die Wellenlängen von Absorption bzw. Emission in einem größeren Bereich einzustellen. Überraschenderweise sind die Derivate mit R3= NR18R19 chemisch ausgesprochen stabil, insbesondere auch photostabil.
Je nach Grundstruktur und Substitution liegen die Absorptionsmaxima im gesamten Bereich des sichtbaren Lichtes, mit einem Schwerpunkt bei 500-530 nm. Die Verbindungen weisen einen hohen Stokes Shifts im Bereich von 80 nm auf. Die Messung der Absorption erfolgt zum Beispiel bei 25 °C in wässrigen oder ethanolischen Lösungen mit einer Extinktion von 1,0 mit einem Specord 205 von Analytik Jena, wobei die wässrigen Lösungen bevorzugt phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS-Puffer; ca. 100 mM Natriumchlorid und 100 mM Gesamt-Phosphat) sind und einen pH von 7,5 aufweisen. Die Emission wird zum Beispiel bei 25 °C in verdünnten wässrigen oder ethanolischen Lösungen mit einer Extinktion von 0,1 mit einem FP-6600 Spectrofluorometer von Jasco gemessen, wobei die verdünnten wässrigen Lösungen bevorzugt phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS-Puffer; ca. 100 mM Natriumchlorid und 100 mM Gesamt-Phosphat) sind und einen pH von 7,5 aufweisen.
Eine erfindungsgemäße Verbindung ist vorzugsweise zumindest dadurch charakterisiert, dass es sich bei der Verbindung um eine fluoreszierende Verbindung handelt.
In einer Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Verbindung ein Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 650 nm, vorzugsweise von 500 nm bis 550 nm, auf.
In einer Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Verbindung ein Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich von 630 nm bis 700 nm, vorzugsweise von 650 nm bis 690 nm, auf.
Vorzugsweise beträgt die Stokes-Verschiebung mindestens 40 nm, vorzugsweise 50 nm bis 120 nm, noch bevorzugter 70 nm bis 90 nm.
Ferner ist wegen der höheren Stabilität in einer Ausführungsform bevorzugt, dass R3 NR18R19 ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4- Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 3, ist, (viii) w-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-C02H), wobei y vorzugsweise 1-8, besonders bevorzugt 6, ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, und wobei NR18R19 besonders bevorzugt aus 3-Aminopropansulfonat, N-Methylanilin, 4- (Methylamino)benzensulfonat, Anilin, 5-Carboxypentylamin und 3-Carboxypropyl(methyl)amin ausgewählt ist.
Durch die Substitution mit Resten, die eine Löslichkeit in Wasser ermöglichen (z.B. Sulfonsäuren), wird die Anwendbarkeit dieser Farbstoffe für analytische bzw. diagnostische Zwecke in protischen Lösungsmitteln möglich. Der hydrophile Charakter der unterschiedlichen Verbindungen kann durch die Anzahl der wasserlöslich machenden Gruppen über einen gewissen Bereich eingestellt werden. Daher ist eine erfindungsgemäße Verbindung vorzugsweise wasserlöslich. Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Verbindung zumindest dadurch charakterisiert, dass bei 25 °C mindestens 1 mg, bevorzugt 2 mg bis 4 mg, der Verbindung in 1,000 g (1000 mg) Wasser löslich sind. Weiterhin beeinflussen die Sulfonsäuregruppen das Aggregationsverhalten und verringern eine nicht kovalente Dimerenbildung sowie eine nicht-kovalente Anbindung an Biomoleküle und Oberflächen. Insbesondere Sulfonsäure-Substituenten, welche direkt am Farbstoffgrundkörper gebunden sind, wirken auch auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Farbstoffe so ein, dass die Absorptions und Emissionswellenlängen verschoben werden und in der Regel eine signifikante Erhöhung der Quantenausbeute erzielt wird.
In bestimmten Ausführungsformen ist aus diesen Gründen bevorzugt, dass die Verbindung mindestens eine Sulfonsäuregruppe enthält.
Vorzugsweise enthält eine erfindungsgemäße Verbindung mindestens eine Gruppe ausgewählt aus einer Sulfonsäuregruppe, einem Sulfonsäurederivat, einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe, einer Carbonsäure und einem Carbonsäurederivat.
Nicht von der Erfindung umfasst sind vorzugsweise Verbindungen, bei denen R7 Methoxy und R3 eine Aminogruppe, insbesondere NR18R19, insbesondere NH(4-HOOCCeH4), NH(4-C2H5COOC6H4), NH(2- C2H5COOC6H4), NH(C6H5), N(C2H5)2 oder N(CH2)2(CH2)20, ist.
Nicht von der Erfindung umfasst sind vorzugsweise Verbindungen, bei denen R4 Brom und R6 und R16 N(CH3)2 ist.
Nicht von der Erfindung umfasst sind vorzugsweise Verbindungen, bei denen R6 und R16 vorhanden ist und eines von R6 und R16 eine Hydroxygruppe ist.
Aufgrund der Verbrückung werden stabil Benzopyryliumverbindungen erhalten, die in Abhängigkeit von den Substituenten in wässriger Lösung überraschend hohe Fluoreszenz-Quantenausbeuten erreichen. Vorzugsweise beträgt die Fluoreszenz-Quantenausbeute einer erfindungsgemäßen Verbindung 0,1 bis 0,95, bevorzugter 0,5 bis 0,9. Fluoreszenzquantenausbeuten werden bevorzugt bei 25 °C in verdünnten wässrigen oder ethanolischen Lösungen mit einer Extinktion von 0,1 mit einem Hamamatsu Absolute Photoluminescence Quantum Yield Measurement System C-9920 bestimmt, wobei die verdünnten wässrigen Lösungen bevorzugt phosphatgepufferte Salzlösungen (PBS-Puffer; ca. 100 mM Natriumchlorid und 100 mM Gesamt-Phosphat) sind und einen pH von 7,5 aufweisen. Die Verbindungen ergänzen damit die bereits kommerziell verfügbaren Farbstoffe mit hohem Stokes Shift bzw. stellen besser fluoreszierende Alternativen dar.
Derivate mit R3= OH liegen in stark sauren Lösungen als Hydroxy-Benzopyryliumsalz vor und werden bei höheren pH-Werten deprotoniert. Sie liegen dann als 3-Oxo-2H-xanthene mit neutralem Grundkörper vor. Diese weisen eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute auf und sind im physiologischen pH-Bereich stabil.
Die Fotostabilität der Verbindungen ist sehr gut. Sie liegt signifikant höher als die von vergleichbaren Farbstoffen auf Cumarinbasis, zum Beispiel als DY-510XL (vgl. Abb.l).
Eine erfindungsgemäße Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus den folgenden Verbindungen und deren Salzen sowie Solvaten davon (bei Ionen ist das Gegenion, gegebenenfalls die Gegenionen, vorzugsweise ausgewählt aus Tetrafluoroborat, Chlorid und Natrium): 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin,
6-[[6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure,
3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-l-sulfonat,
3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3- yl]amino]propan-l-sulfonat,
3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H- xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester,
3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l- sulfonat,
4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat,
6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat,
6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure,
6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat,
6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2- sulfonat,
6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol,
8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol,
6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure,
3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7H-xanthen-10-ium-2-sulfonat,
3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)propan-l-sulfonat,
6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)hexansäureethylester,
3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat,
3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat,
6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl]hexansäure,
4-[[l-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll- ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat,
6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-lH-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl- amino]hexansäure,
6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure,
(2E)-l-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2- enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat,
3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3- ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-l-yl]propan-l-sulfonat,
6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3-on,
6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure, 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-l-sulfonat,
6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-Hydroxy-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-(5-Carboxypentoxy)-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-l-yl)hexansäure,
1-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
2-[3,9-Bis(diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-14-yl]benzoesäure, 6-[[9-(Diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-7-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure und
6-[Ethyl-(3-methoxy-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-9-yl)amino]hexansäure.
Eine erfindungsgemäße Verbindung ist besonders bevorzugt ausgewählt aus 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin Tetrafluoroborat, 6-[[6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure Chloridsalz,
3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-l-sulfonat, 3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3- yl]amino]propan-l-sulfonat Natriumsalz,
3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H- xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat Natriumsalz,
6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester
Tetrafluoroborat,
3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l- sulfonat,
4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat Natriumsalz,
6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat,
6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat
Natriumsalz,
6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2- sulfonat,
6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol Tetrafluoroborat, 8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol Tetrafluoroborat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure Chloridsalz, 3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7H-xanthen-10-ium-2-sulfonat Natriumsalz,
3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)propan-l-sulfonat,
6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)hexansäureethylester
Tetrafluorborat, 3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat,
3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat,
6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl]hexansäure
Chloridsalz,
4-[[l-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll- ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat Natriumsalz,
6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
Chloridsalz,
6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz,
6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
Chloridsalz,
6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-lH-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl- amino]hexansäure Chloridsalz,
6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
Chloridsalz,
6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure Chloridsalz,
(2E)-l-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2- enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat,
3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3- ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-l-yl]propan-l-sulfonat Natriumsalz, 6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3-on, 6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure, 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz, 3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-l-sulfonat Natriumsalz, 6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat di-
Natriumsalz,
6-Hydroxy-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz, 6-(5-Carboxypentoxy)-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz, 6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-l-yl)hexansäure,
1-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat Natriumsalz,
6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]amino]propan-l-sulfonat
Natriumsalz,
2-[3,9-Bis(diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-14-yl]benzoesäure Chloridsalz,
6-[[9-(Diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-7-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz und
6-[Ethyl-(3-methoxy-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-9-yl)amino]hexansäure
Chloridsalz.
Eine erfindungsgemäße Verbindung ist besonders bevorzugt ausgewählt aus den folgenden Verbindungen und deren Salzen sowie Solvaten davon: 3-[[6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3- yl]amino]propan-l-sulfonat,
4-[[6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonate,
6-[5-carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat und 6-(5-carboxypentoxy)-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat.
Eine erfindungsgemäße Verbindung ist besonders bevorzugt ausgewählt aus
3-[[6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3- yl]amino]propan-l-sulfonat Natriumsalz,
4-[[6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat Natriumsalz,
6-[5-carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz, 6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat di- Natriumsalz und
6-(5-carboxypentoxy)-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Erkennungseinheiten, z. B. von Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Haptenen, Enzymsubstraten, Enzym-Cofaktoren, Biotin, Carotinoiden, Hormonen, Neurohormonen, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren, Lectinen, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Dextranen, Nucleinsäuren, Oligonucleotiden, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, rezeptorbindenden Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen polymeren Trägermaterialien verwendet werden.
Die Markierung der Erkennungseinheiten kann dabei durch die Ausbildung von ionischen oder van der Waals-Wechselwirkungen zwischen den Markern (erfindungsgemäßen Verbindungen) und den zu markierenden Materialien erfolgen.
Weiterhin besteht auch die Möglichkeit, die Erkennungseinheit oder das Trägermaterial kovalent mit dem Fluorophor zu verbinden. Diese Kopplungsreaktion kann in wässriger oder überwiegend wässriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht eine Fluoreszenz- Sonde (Konjugat) zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von unterschiedlichen Biomaterialien bzw. anderen organischen und anorganischen Materialien.
Sowohl die erfindungsgemäßen Verbindungen als auch davon abgeleitete Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), zur Erforschung des Genoms (DNA-Sequenzierung) und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations- Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Throughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in- situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (DNA- und Protein-Chips).
Ein Rezeptor ist ein Molekül, das eine Affinität zu einem gegebenen Liganden besitzt. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Moleküle sein. Rezeptoren können in reiner Form oder gebunden an andere Spezies eingesetzt werden. Rezeptoren können kovalent oder nichtkovalent entweder direkt oder durch bestimmte Kopplungsvermittler an einen Bindungspartner angeknüpft werden.
Ein Ligand ist ein Molekül, das von einem bestimmten Rezeptor erkannt wird. Beispiele für Liganden, die durch diese Erfindung detektiert werden können, schließen Agonisten und Antagonisten für Zell- Membran-Rezeptoren, Toxine und andere Giftstoffe, virale Epitope, Hormone wie Opiate und Steroide, Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, als Kofaktoren agierende Wirkstoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine und Antikörper ein, sind aber nicht auf die angeführten Stoffe beschränkt.
Die Verwendung einer der hierin offenbarten Verbindungen für die hierin genannten Zwecke und/oder Verfahren, insbesondere als Fluoreszenzfarbstoff und/oder in einer Fluoreszenz-Sonde oder als Fluoreszenz-Sonde, ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäß ist auch Verwendung einer der hierin offenbarten Verbindungen als Fluoreszenzfarbstoff und/oder in einer Fluoreszenz-Sonde oder als Fluoreszenz-Sonde zur Markierung einer oder mehrerer Verbindungen, ausgewählt aus Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Haptenen, Enzymsubstraten, Enzym-Cofaktoren, Biotin, Carotinoiden, Hormonen, Neurohormonen, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren, Lectinen, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Dextranen, Nucleinsäuren, Oligonucleotiden, DNA, RNA, Lipiden, rezeptorbindenden Pharmaka sowie von Zellen.
Erfindungsgemäße Verbindungen können wenigstens eine reaktive Gruppe A in Form eines Aktiv- Esters aufweisen, wobei der Aktiv-Ester vorzugsweise gleich ein NHS-Ester (N- Hydroxysuccinimidylester), ein Sulfo-NHS-Ester (Sulfo-Hydroxysuccinimidylester), ein TFP-Ester (Tetrafluoro-Phenylester) oder ein STP-Ester (p-Sulfo-Tetrafluoro-Phenylester) ist, wie diese in der nachfolgenden Tabelle angegeben sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in weiteren Ausführungen A in Form eines Carbonsäurederivats aufweisen, wobei das Carbonsäurederivat vorzugsweise ein Hydrazid, ein Amin, ein lod-Acetamid, ein Maleimid, ein Alkin oder ein Azid ist, wie diese in der nachstehenden Tabelle angegeben sind.
Auch werden Verbindungen beschrieben, in denen A in Form eines Phosphoramidits vorliegt, wobei A eine Gruppe der Formel ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Fierstellung einer Verbindung der Formel 1, vorzugsweise zur Fierstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Formel 1.
Das Verfahren umfasst die Reaktion von (E)-(3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-l-yliden)-ethyl- oxonium oder (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-l-yliden]-ethyl-oxonium mit einer Benzaldehyd-Verbindung, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Flydroxygruppe aufweist.
Vorzugsweise wird die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, wobei das organische Lösungsmittel bevorzugt Orthoameisensäuretriethylester ist. Vorzugsweise wird die Reaktion bei 70 °C bis 200 °C, bevorzugter bei 90 °C bis 130 °C, durchgeführt. Vorzugsweise wird (E)- (3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-l-yliden)-ethyl-oxonium Tetrafluoroborat oder (E)-[3-Ethoxy- 5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-l-yliden]-ethyl-oxonium Tetrafluoroborat verwendet. Die Benzaldehyd-Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus 2-Flydroxy-4-diethylaminobenzaldehyd, 3- (N-(6-Ethoxy-6-oxo-hexyl)-4-formyl-3-hydroxy-anilino)propan-l-sulfonat, Ethyl 6-(N-ethyl-4-formyl-3- hydroxy-anilino)hexansäure, 2,4-Dihydroxybenzaldehyd, 3-(6-Formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l- quinolyl)propan-l-sulfonat und 6-(6-Formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l-quinolyl)hexansäure.
Das Verfahren kann in einer vorgeschalteten Reaktion die Umwandlung der Verbindung 5,5- Dimethylcyclohexan-l,3-dion oder 3-Flydroxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-l-on unter Verwendung von Orthoameisensäuretriethylester und Tetrafluoroborsäure in die Verbindung (E)-(3- Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-l-yliden)-ethyl-oxonium bzw. (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4- pyridyl)cyclohex-2-en-l-yliden]-ethyl-oxonium umfassen. Vorzugsweise erfolgt dies bei einer Temperatur zwischen 5 und 50 °C. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 5, vorzugsweise zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Formel 5.
Das Verfahren umfasst die Reaktion einer Verbindung der Formel 1, vorzugsweise von 6-Ethoxy-N,N- diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin oder 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium- 3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester, mit einer Benzaldehyd-Verbindung, wobei die Benzaldehyd- Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Hydroxygruppe aufweist.
Vorzugsweise wird die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, wobei das organische Lösungsmittel bevorzugt Eisessig ist. Vorzugsweise wird die Reaktion bei 70 °C bis 200 °C, bevorzugter bei 90 °C bis 110 °C, durchgeführt. Vorzugsweise wird 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl- 7H-xanthen-10-ium-3-amin Tetrafluoroborat oder 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3- yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester Tetrafluoroborat verwendet. Die Benzaldehyd-Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus 2-[4-(Diethylamino)-2-hydroxy-benzoyl]benzoesäure, 4-(Diethylamino)- 2-hydroxy-benzaldehyd und 2-Hydroxy-4-methoxy-benzaldehyd.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1 bzw. 5 das Einführen mindestens eine Gruppe ausgewählt aus einer Sulfonsäuregruppe, einem Sulfonsäurederivat, einer Alkoxygruppe und einer Aminogruppe, besonders bevorzugt einer Sulfonsäuregruppe.
Die Erfindung ist nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher ausgeführt.
Es zeigen
Abb.l: Photostabilität der Verbindungen 5, 8, 11 und 38 im Vergleich zum MegaStokes-Farbstoff DY- 510XL.
Abb.2: Emissionsspektren ausgewählter, erfindungsgemäßer Verbindungen in PBS.
Ausführungsbeispiele
Verbindung 1:
(E)-(3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-l-yliden)-ethyl-oxonium Tetrafluoroborat
5 mmol 5,5-Dimethylcyclohexan-l,3-dion werden in 10 ml Orthoameisensäuretriethylester suspendiert und bei Raumtemperatur mit 1,5 ml 48%iger Tetrafluoroborsäure versetzt. Nach Rühren für 30 Minuten bei RT werden 50 ml trockener Diethylether zugegeben und die Mischung bei RT für einige Stunden belassen. Der entstandene farblose Niederschlag wird filtriert, mit wenig trockenem Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute 1,1 g (78%) (C12H21BF4O2; 284,10 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 197,2 [M+] Verbindung 2:
6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin Tetrafluoroborat
3 mmol Verbindung 1 werden in 15 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit einer Lösung von 3 mmol 2-Hydroxy-4-diethylaminobenzaldehyd in 10 ml Orthoameisensäure-triethylester versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
Ausbeute 980 mg (80%) (C2IH28BF4N02; 413,26 g/mol)
MS ESI + (m/z): 326,1 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 531 nm; 605 nm
Verbindung 3:
6-[[6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure Chloridsalz
485 pmol Verbindung 2 und 1,5 mmol 6-Aminohexansäure Natriumsalz werden in 10 ml DMF suspendiert und 8 Stunden bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand durch RP-Chromatografie gereinigt.
Ausbeute: 100 mg (46%) (C25H35CIN203; 447,01 g/mol)
MS ESI- (m/z): 411,2 ([M]+)
UV-Vis in PBS: l™c: 505 nm; 570 nm; e = 39.200 l/mol*cm; QY: 0,58 UV-Vis in Ethanol: l™c: 510 nm; 575 nm; e = 32.500 l/mol*cm; QY: 0,82
Verbindung 4:
3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-l-sulfonat
1 mmol Verbindung 1 werden in 5 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit einer Lösung von 1 mmol des Aldehydes 3-(N-(6-Ethoxy-6-oxo-hexyl)-4-formyl-3-hydroxy-anilino)propan-l-sulfonat Natriumsalz in 5 ml Eisessig versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert. Ausbeute 385 mg (72%) (C28H39NO7S; 533,68 g/mol)
MS ESI + (m/z): 534,3 ([M+ H+]+)
Verbindung 5:
3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3- yl]amino]propan-l-sulfonat Natriumsalz
375 pmol Verbindung 4 und 1,5 mmol 3-Aminopropansulfonsäure Natriumsalz werden in 5 ml DMF 2 Stunden bei 40°C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 98 mg (42%) (C27H37N2NaOgS2; 620,71 g/mol)
MS ESI- (m/z): 597,2 (base, [M] ); 297,9 (25%, [M- H+]2 )
UV-Vis in PBS: l™c: 505 nm; 572 nm; e = 45.000 l/mol*cm; QY: 0,72
UV-Vis in Ethanol: 512 nm; 570 nm; e = 49.800 l/mol*cm; QY: 0,87
1H-NMR (400 MHz D20): d (ppm)= 1,10 (S, 6H, CH3); 1,24 (M, 2H, CH2); 1,40 (M, 2H, CH2); 1,67 (M, 2H, CH2); 1,89 (M, 2H, CH2); 2,04 (M, 2H, CH2); 2,32 (T, 2H, CH2); 2,45 (S, 2H, CH2); 2,87 (T, 2H, CH2); 2,92 (T, 2H, CH2); 3,14 (T, 2H, CH2); 3,35 (T, 2H, CH2); 3,46 (T, 2H, CH2); 5,64 (S, 1H, 4-H); 6,16 (S, 1H, 5-H); 6,47 (D, 1H, 7-H); 6,95 (D, 1H, 8-H); 7,26 (S, 1H, 9-H)
13C-NMR (400 MHz D20): d (ppm)= 22,27; 23,43; 24,31; 25,71; 26,17; 26,31, 26,86, 33,78; 34,20; 42,14; 42,76; 48,15; 48,29; 49,08; 50,29; 89,31; 95,96; 111,06; 111,34; 126,90; 129,46; 134,58; 151,33; 153,71; 168,62; 169,42; 178,23
Verbindung 6:
3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H- xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat Natriumsalz
125 pmol Verbindung 5 werden in 3 ml DMF gelöst. Bei 0°C werden 45 mg TSTU (N,N,N',N'- Tetramethyl-Q-(N-succinimidyl)uronium Tetrafluoroborat) und 26 pl DIPEA (Diisopropyl-ethylamin) zugegeben und es wird bei RT 20 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand durch RP-Chromatografie gereinigt.
Ausbeute: 80 mg (90%) (CsiEUoNsNaOiA; 717,78 g/mol)
MS ESI- (m/z): 694,2 (base, [M] ); 346,5 (25%, [M- H+]2 )
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 512 nm; Xem· 570 nm; e = 44.000 l/mol*cm
Verbindung 7:
6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester
Tetrafluoroborat
1 mmol Verbindung 1 und Ethyl 6-(N-ethyl-4-formyl-3-hydroxy-anilino)hexansäure werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 2 umgesetzt.
Ausbeute 420 mg (80%) (C27H38BF4NO4; 527,40 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 440,3 ([M]+)
Verbindung 8:
3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat
375 pmol Verbindung 7 und 3-Aminopropansulfonsäure Natriumsalz werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 5 wird umgesetzt.
Ausbeute: 110 mg (58%) (C26H36N2O6S; 504,63 g/mol)
MS ESI- (m/z): 503,2 ([M- H+] ); MS ESI+ (m/z): 505,3 (base, [M+ H+]+); 527,3 (15%, [M+ Na+]+)
UV-Vis in PBS: l™c: 509 nm; em: 578 nm; e = 38.500 l/mol*cm; QY: 0,58
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 511 nm; Xem· 571 nm; e = 41.600 l/mol*cm; QY 0,84
Verbindung 9:
3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l- sulfonat
375 pmol Verbindung 4 und 750 mihoI N-Methylanilin werden in 5 ml DMF bei 150°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 80 mg (38%) (C31H38N2O6S; 566,71 g/mol)
MS ESI- (m/z): 565,2 ([M- H+] ); MS ESI+ (m/z): 567,3 (80%, [M+ H+]+); 589,3 (base, [M+ Na+]+); 605,3 (70%, [M+ Ka+]+)
UV-Vis in PBS: l™c: 523 nm; em: 600 nm; e = 39.000 l/mol*cm; QY: 0,24
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 531 nm; Xem· 601 nm; e = 41.000 l/mol*cm; QY 0,47
Verbindung 10:
4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat Natriumsalz
177 pmol Verbindung 9 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch lh bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 75 mg (64%) (C31H38N2O6S; 668,75 g/mol)
MS ESI- (m/z): 645,5 (base, [M] ); 322,1 (95%, [M - H+]2 )
UV-Vis in PBS: l™c: 527 nm; em: 612 nm; e = 44.000 l/mol*cm; QY: 0,35
UV-Vis in Ethanol: 533 nm; 609 nm; e = 48.000 l/mol*cm; QY 0,57
Verbindung 11:
6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
375 pmol Verbindung 7 und N-Methylanilin werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 9 umgesetzt.
Ausbeute: 100 mg (53%) (C30H37CIN2O3; 509,08 g/mol) MS ESI+ (m/z): 473,3 ([M]+); MS ESI- (m/z): 471,2 ([M+- 2H+] )
UV-Vis in PBS: l™c: 526 nm; 606 nm; e = 39.000 l/mol*cm; QY: 0,27 UV-Vis in Ethanol: Xmax: 531 nm; Xem: 601 nm; e = 44.000 l/mol*cm; QY 0,42
Verbindung 12:
4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat
177 pmol Verbindung 11 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch lh bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 67 mg (69%) (C30H36N2O6S; 552,68 g/mol)
MS ESI- (m/z): 551,2 ([M- H+] ); MS ESI+ (m/z): 553,4 ([M+ H+]+)
UV-Vis in PBS: Xmax: 532 nm; Xem: 619 nm; e = 45.000 l/mol*cm; QY: 0,26 UV-Vis in Ethanol: Xmax: 533 nm; Xem: 610 nm; e = 50.000 l/mol*cm; QY 0,51
Verbindung 13:
6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
375 mitioI Verbindung 7 und 750 mitioI trockenes Anilin werden in 5 ml DMF bei 150°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 50 mg (27%) (C29H35CI N2O3; 495,05 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 459,3 ([M]+); MS ESI- (m/z): 457,2 ([M- 2H+] )
UV-Vis in PBS: Xmax: 526 nm; Xem: 609 nm; e = 38.000 l/mol*cm
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 532 nm; Xem· 603 nm; e = 44.000 l/mol*cm
Verbindung 14: 6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat
Natriumsalz
177 mitioI Verbindung 13 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch lh bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 30 mg (26%) (C29H33N2O9S2 Na; 640,70 g/mol)
MS ESI- (m/z): 617,3 ([M] )
UV-Vis in PBS: l™c: 545 nm; em: 625 nm; e = 40.100 l/mol*cm; QY: 0,11 UV-Vis in Ethanol: 542 nm; 616 nm; e = 45.300 l/mol*cm; QY 0,61
Verbindung 15:
6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2- sulfonat
375 pmol Verbindung 7 und 420 pmol 6-Amino-2-naphthalinsulfonsäure Hydrat werden in 5 ml Eisessig bei 120°C 8 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 18 mg (8%) (C33H36N2O6S; 588,71 g/mol)
MS ESI- (m/z): 587,3 ([M- H+] )
MS ESI+ (m/z): 589,3 ([M+ H+]+)
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 546 nm; Xem· 619 nm; e = 32.000 l/mol*cm
Verbindung 16:
6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol Tetrafluoroborat
5 mmol Verbindung 1 werden in 25 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit 5 mmol 2,4- Dihydroxybenzaldehyd versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
Ausbeute 500 mg (28%) (C17H19BF4O3; 358,14 g/mol) MS ESI + (m/z): 271,2 ([M]+)
Verbindung 17:
8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol Tetrafluoroborat
750 pmol Verbindung 16 und 1,5 mmol N-Methylanilin werden in 10 ml DMF bei 140°C 2 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
Ausbeute: 125 mg (40%) (C22H22BF4NO2; 419,22 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 332,3 ([M]+)
Verbindung 18:
6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7FI-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure Chloridsalz
286 mitioI Verbindung 17 werden in 5 ml DMF mit 80 mg K2C03 und 100 mg 6- Bromohexansäureethylester bei 120°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M FICI versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 35 mg (24%) (C28H32CINO4; 482,01 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 446,4 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 452 + 469 nm; leΐh: 520 nm
Verbindung 19:
3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7FI-xanthen-10-ium-2-sulfonat
Natriumsalz
35 mg Verbindung 18 werden in 1 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch lh bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 27 mg (59%) (C28H3oCINNaOioS2; 627,66 g/mol)
MS ESI- (m/z): 604,2 ([M] ) UV-Vis in Ethanol: Xmax: 465 nm; Xem· 522 nm; e = 18.000 l/mol*cm
UV-Vis in PBS: l™c: 460 nm; Xem: 509 nm; e = 16.500 l/mol*cm
Verbindung 20:
3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)propan-l-sulfonat
1 mmol Verbindung 1 werden in 5 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit einer Lösung von 1 mmol des Aldehydes 3-(6-Formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l-quinolyl) propan-l-sulfonat Natriumsalz in 5 ml Eisessig versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
Ausbeute 320mg (68%) (C26H33NO5S; 471,61 g/mol)
MS ESI + (m/z): 472,2 (base, [M+ FT]+); 494,3 (60%, [M+ Na+]+); 510,3 (20%, [M+ K+]+)
Verbindung 21:
6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8FI-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)hexansäureethylester
Tetrafluoroborat
1 mmol Verbindung 1 werden in 5 ml Orthoameisensäuretriethylester vorgelegt und mit einer Lösung von 1 mmol des Aldehydes 6-(6-Formyl-7-hydroxy-2,2,4-trimethyl-l-quinolyl)hexan-säure in 5 ml Eisessig versetzt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 130°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag aus Eisessig umkristallisiert.
Ausbeute 245 mg (42%) (C31H42BF4NO4; 579,47 g/mol)
MS ESI + (m/z): 492,3 ([M]+)
Verbindung 22:
3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2, 2,4,7, 7-pentamethyl-8 Fl -chromeno[3, 2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat 375 pmol Verbindung 20 und 1,5 mmol 6-Aminohexansäure Natriumsalz werden in 5 ml DMF 2 Stunden bei 40°C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP- Chromatografie.
Ausbeute: 25 mg (12%) (CsoFUo^NaOeS; 556,71 g/mol)
MS ESI- (m/z): 555,2 ([M- H+] )
MS ESI+ (m/z): 557,2 (50%, [M+ H+]+); 579,5 (base, [M+ Na+]+); 595,3 (20%, [M+ K+]+
UV-Vis in PBS: l™c: 516 nm; em: 590 nm; e = 37.500 l/mol*cm
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 531 nm; Xem· 589 nm; e = 39.000 l/mol*cm
Verbindung 23:
3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat
375 pmol Verbindung 20 und 1,5 mmol N-Methylbuttersäure Natriumsalz werden in 5 ml DMF 2 Stunden bei 40°C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP- Chromatografie.
Ausbeute: 30 mg (15%) (C29H38N2O6S; 542,69 g/mol)
MS ESI- (m/z): 541,2 ([M- H+] )
MS ESI+ (m/z): 553,3 (base, [M+ H+]+); 565,5 (20%, [M+ Na+]+); 581,3 (15%, [M+ K+]+
UV-Vis in PBS: l™c: 527 nm; em: 600 nm; e = 45.400 l/mol*cm; QY: 0,58 UV-Vis in Ethanol: 542 nm; 600 nm; e = 55.000 l/mol*cm; QY: 0,88
Verbindung 24:
6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl]hexansäure
Chloridsalz
750 pmol Verbindung 21 und 1,5 mmol N-Methylanilin werden in 5 ml DMF bei 150°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 95 mg (22%) (C34H41NCIN2O3; 561,15 g/mol)
MS ESI- (m/z): 341,3 (base, [M - H+]2 ); 683,3 (15%, [M]
UV-Vis in PBS: l™c: 548 nm; em: 632 nm; e = 39.000 l/mol*cm UV-Vis in Ethanol: lp : 555 nm; 630 nm; e = 41.000 l/mol*cm
Verbindung 25:
4-[[l-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll- ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat Natriumsalz
150 pmol Verbindung 24 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei 50°C 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch lh bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 70 mg (67%) (C34H3gNaN20gS2; 706,80 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 525,3 ([M]
UV-Vis in PBS: Xmax: 540 nm; Xem· 620 nm; e = 42.000 l/mol*cm UV-Vis in Ethanol: l,^c: 545 nm; 615 nm; e = 43.000 l/mol*cm
Verbindung 26:
6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
Chloridsalz
375 mitioI Verbindung 7, 420 mmol 4-Amino-N,N-dimethylanilin Dihydrochlorid und 700 mmol Diisopropylethylamin werden in 5 ml Eisessig bei 120°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP- Chromatografie.
Ausbeute: 44 mg (22%) (C31H40CI N3O3; 538,12 g/mol) MS ESI+ (m/z): 502,4 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 531 nm; Xem· 573 nm; e = 34.000 l/mol*cm
Verbindung 27:
6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure Chloridsalz
375 pmol Verbindung 7 und 420 pmol p-Phenylendiamin werden in 5 ml DMF bei 140°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 63 mg (33%) (C29H36CI N3O3; 510,07 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 474,3 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 530 nm; Xem· 612 nm; e = 35.000 l/mol*cm
Verbindung 28:
6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
Chloridsalz
375 pmol Verbindung 7 und 420 pmol Di-(2-picolyl)amin werden in 5 ml DMF bei 140°C 2 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 180 mg (80%) (C35H41CIN4O3; 601,18 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 565,4 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 531 nm; 593 nm; e = 28.000 l/mol*cm
Verbindung 29:
6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-lH-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl- aminojhexansäure Chloridsalz 1,2 ml einer 1,0 M Lösung von Lithiumdiisopropylamid in THF/ Hexan werden in 10 ml trockenem THF gelöst und die Mischung wird bei -10°C mit 1 mmol trockenem 2-Methylpyridin versetzt. Diese Lösung wird auf 0°C erwärmt und 30 Minuten bei 0°C gerührt. Dazu wird eine Lösung von 336 pmol Verbindung 35 in 10 ml trockenem THF langsam zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird auf RT erwärmt und noch 1 Stunde bei RT gerührt. Nach Hydrolyse mit verdünnter HCl werden die organischen Lösungsmittel abdestilliert und aus der wäßrigen Phase das Produkt durch RP- Chromatografie isoliert.
Ausbeute: 85 mg (51%) (C29H35CIN2O3; 495,05 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 459,3 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 434 nm; lqhi: 541 nm; e = 24.000 l/mol*cm
Verbindung 30:
6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
Chloridsalz
1,0 mol Verbindung 35 werden in 10 ml trockenem Pyridin gelöst und bei -40°C langsam mit 5 ml einer 0,5 M Lösung von 4-(N,N-Dimethylanilin)-magnesiumbromid in THF versetzt. Nach beendeter Zugabe wird auf diese Lösung auf RT erwärmt und 3 Stunde bei RT gerührt. Nach Hydrolyse mit verdünnter HCl werden die organischen Lösungsmittel abdestilliert und aus der wäßrigen Phase das Produkt durch RP-Chromatografie isoliert.
Ausbeute: 100 mg (18%) (C31H39CIN2O3; 523,11 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 487,5 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 664 nm; Xem· 713 nm; e = 30.000 l/mol*cm
Verbindung 31:
6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure Chloridsalz
1,0 mol Verbindung 35 werden in 10 ml trockenem THF gelöst unter Rühren bei -20°C langsam mit 3 ml einer 1,4 M Lösung von Methylmagnesiumbromid in THF/ Toluol versetzt. Nach beendeter Zugabe wird auf diese Lösung auf RT erwärmt und 1 Stunde bei RT gerührt. Nach Hydrolyse mit verdünnter HCl werden die organischen Lösungsmittel abdestilliert und aus der wäßrigen Phase das Produkt durch RP-Chromatografie isoliert. Ausbeute: 125 mg (30%) (C20H26CINO; 331,88 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 296,1 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 538 nm; Xem· 628 nm; e = 9.800 l/mol*cm
Verbindung 32:
(2E)-l-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2- enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat
1,0 mol Verbindung 31 sowie 1,1 mmol 2-[(E)-2-Anilinovinyl]-l-(5-carboxypentyl)-3,3-dimethyl-indol- l-ium-5-sulfonat werden in 4 ml Acetanhydrid und 4 ml Eisessig gelöst und unter Zusatz von 250 mg Natriumacetat 15 Minuten am Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wird durch Fällung mit Diethylether ein öliger Niederschlag erhalten, der durch RP-Chromatografie gereinigt wird.
Ausbeute: 92 mg (14%) (C38H46N2O6S; 658,85 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 659,4 (base, [M+ H+]+); 681,6 (30%, [M+ Na+]+); 697,6 (20%, [M+ K+]+
MS ESI- (m/z): 657,3 ([M- FT] )
UV-Vis in PBS: l™c: 755nm; Xem: 788 nm; e = 75.000 l/mol*cm UV-Vis in Ethanol: Xmax: 770 nm; Xem: 795 nm; e = 143.600 l/mol*cm
Verbindung 33:
3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3- ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-l-yl]propan-l-sulfonat Natriumsalz
1,0 mol Verbindung 31 sowie 1 mmol 3-[5-Formyl-3-(6-methoxy-6-oxo-hexyl)-2,4,6-trioxo- hexahydropyrimidin-l-yl]propan-l-sulfonat Natriumsalz werden in 5 ml Acetanhydrid und 5 ml Eisessig gelöst und unter Zusatz von 250 mg Natriumacetat 15 Minuten am Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wird durch Fällung mit Diethylether ein Niederschlag erhalten. Der Niederschlag wird zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M FICI und 10 ml Aceton versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 150 mg (22%) ^FUzNaNsOgS; 691,77 g/mol)
MS ESI- (m/z): 668,1 ([M] ) UV-Vis in Ethanol: Xmax: 683 nm; Xem· 719 nm; e = 67.000 l/mol*cm
Verbindung 34:
500 pmol Verbindung 2 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 80 mg (54%) rotbraunes Öl (C19H23NO2; 297,39 g/mol)
MS ESI- (m/z): 298,1 (base, [M+ H+]+); 617,4 (90%, [2M+ Na+]+)
UV-Vis in PBS: Xmax: 450 nm; Xem: 558 nm; e = 23.00 l/mol*cm
UV-Vis in Wasser pH 3: Xm3x- x nm; x nm (liegt als Hydroxy-BPS vor)
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 440 nm; 540 nm; e = 24.800 l/mol*cm
Verbindung 35:
6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure
500 pmol Verbindung 7 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 150 mg (78%) (C23H29NO4; 383,48 g/mol)
MS ESI- (m/z): 382,2 ([M- H+] ); MS ESI+ (m/z): 384,3 ([M+ H+]+)
UV-Vis in PBS: l™c: 457 nm; 559 nm; e = 24.200 l/mol*cm UV-Vis in Ethanol: l,^c: 441 nm; 540 nm; e = 25.300 l/mol*cm
Verbindung 36:
6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz 177 pmol Verbindung 35 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch lh bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 17 mg (20%) (C23H28NO7S Na; 485,53 g/mol)
MS ESI- (m/z): 462,0 (60%, [M] ); 230,4 (base, [M- H+]2 )
UV-Vis in PBS: l™c: 482 nm; em: 565 nm; e = 30.100 l/mol*cm; QY: 0,66
UV-Vis in Ethanol: 446 nm; 542 nm; e = 25.000 l/mol*cm; QY 0,90
Verbindung 37:
3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-l-sulfonat Natriumsalz
375 pmol Verbindung 4 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand mittels RP-Chromatografie mit Acetonitril- Wasser-Gradient gereinigt.
Ausbeute: 105 mg (56%) (C24H30NO7S Na; 499,55 g/mol)
MS ESI- (m/z): 476,0 (base, [M] ); 237,5 (15%, [M - H+]2 )
UV-Vis in PBS: l™c: 454 nm; em: 553 nm; e = 26.000 l/mol*cm UV-Vis in Ethanol: l,^c: 439 nm; 538 nm; e = 27.000 l/mol*cm
Verbindung 38:
6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat di- Natriumsalz
177 pmol Verbindung 37 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch lh bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 90 mg (85%) (C24H29NO10S Na; 601,60 g/mol)
MS ESI- (m/z): 556,2 (15%, [M2 + H+] ); 277,6 (base, [M]2 )
UV-Vis in PBS: l™c: 479 nm; Xem: 557 nm; e = 28.000 l/mol*cm; QY: 0,78 UV-Vis in Ethanol: Xmax: 463 nm; Xem· 544 nm; e = 31.000 l/mol*cm; QY 0,91
1H-NMR (400 MHz D20): d (ppm)= 1,26 (S, 6H, CH3); 1,32 (M, 2H, CH2); 1,51 (M, 2H, CH2); 1,54 (M, 2H, CH2); 1,94 (M, 2H, CH2); 2,30 (T, 2H, CH2); 2,31 (S, 2H, CH2); 2,89 (T, 2H, CH2); 3,27 (T, 2H, CH2); 3,43 (T, 2H, CH2); 6,71 (D, 1H, 7-H); 6,86 (S, 1H, 5-H); 7,34 (D, 1H, 8-H); 7,52 (S, 1H, 9-H)
13C-NMR (400 MHz D20): d (ppm)= 22,02; 24,23; 25,61; 25,98; 26,32; 33,34; 33,91; 48,47; 49,29; 50,23; 50,57; 97,71; 110,71; 111,46; 112,52; 128,02; 129,20; 133,93; 150,95; 153,95; 165,49; 179,17; 193,27
Verbindung 39:
6-Hydroxy-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz
750 pmol Verbindung 16 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Reinigung erfolgt durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 115 mg (45%) (CisHisNaOeS; 344,31 g/mol)
MS ESI- (m/z): 321,3 (base, [M] )
UV-Vis in PBS: l™c: 409 nm; 485 nm UV-Vis in Puffer pH 9: Xmax: 462 nm; Xem: 536 nm
Verbindung 40:
6-(5-Carboxypentoxy)-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat Natriumsalz
290 pmol Verbindung 39 werden in 5 ml DMF mit 80 mg K2C03 und 100 mg 6- Bromohexansäureethylester bei 120°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natriumhydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 33 mg (25%) (C2iH23Na08S Na; 458,46 g/mol)
MS ESI- (m/z): 435,2 (base, [M] ); 217,0 (30%, [M - H+]2 )
UV-Vis in PBS: Xmax: 407 nm; Xem: 483 nm; e = 21.000 l/mol*cm
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 403 nm; Xem· 487 nm; e = 19.500 l/mol*cm Verbindung 41:
6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-l-yl)hexansäure
375 mihoI Verbindung 21 werden in 50 ml Aceton und 10 ml 0,5 M Puffer pH 9 bei 50°C 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert. Der Rückstand wird zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie. mittels RP-Chromatografie mit Acetonitril-Wasser-Gradient gereinigt.
Ausbeute: 60 mg (38%) (C27H33NO4; 435,56 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 436,2 ([M+ H+]+)
UV-Vis in PBS: l™c: 460 nm; em: 575 nm; e = 23.000 l/mol*cm UV-Vis in Ethanol: l,^c: 463 nm; 557 nm; e = 24.000 l/mol*cm
Verbindung 42: l-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat
Natriumsalz
177 pmol Verbindung 41 werden in 2 ml Oleum (20% SO3) gelöst und bei RT 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegossen und noch lh bei RT gerührt. Nach dem Abstumpfen mit Natriumcarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie.
Ausbeute: 45 mg (48%) (C27H32NO7S Na; 537,60 g/mol)
MS ESI- (m/z): 514,2 ([M] )
UV-Vis in PBS: l™c: 487 nm; Xem: 578 nm; e = 28.000 l/mol*cm UV-Vis in Ethanol: lp : 473 nm; 559 nm; e = 30.000 l/mol*cm
Verbindung 43:
(E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-l-yliden]-ethyl-oxonium Tetrafluoroborat 4 mmol 3-Hydroxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-l-on werden in 10 ml Orthoameisen- säuretriethylester suspendiert und bei Raumtemperatur mit 1,2 ml 48%iger Tetrafluoroborsäure versetzt. Nach Rühren für 30 Minuten bei RT werden 50 ml trockener Diethylether zugegeben und die Mischung bei RT für einige Stunden belassen. Der entstandene leicht gelbliche Niederschlag wird filtriert, mit wenig trockenem Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute 970 mg (67%) (C17H24BF4NO2; 361,18 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 274,2 [M+]
Verbindung 44:
6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
1 mmol Verbindung 43 und 1 mmol Ethyl 6-(N-ethyl-4-formyl-3-hydroxy-anilino)hexansäure werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 2 umgesetzt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie. Ausbeute 97 mg (21%) (C28H32N2O4; 460,56 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 460,3 ([M+ H+]+)
UV-Vis in PBS: l™c: 472 nm; em: 573 nm; e = 13.000 l/mol*cm UV-Vis in Puffer pH 5: 523 nm; 600 nm; e = 13.300 l/mol*cm
Verbindung 45:
3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]amino]propan-l-sulfonat
Natriumsalz
1 mmol Verbindung 43 und 1 mmol Ethyl 6-(N-ethyl-4-formyl-3-hydroxy-anilino)hexansäure werden gemäß der Synthesemethode für Verbindung 2 umgesetzt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand zur Esterspaltung mit 10 ml 3 M HCl versetzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Nach Neutralisation mit Natrium-hydrogencarbonat erfolgt die Reinigung durch RP-Chromatografie. Ausbeute 97 mg (21%) (C29H34N2O4S; 554,65 g/mol)
MS ESI- (m/z): 553,2 ([M- H+] )
MS ESI+ (m/z): 555,4 ([M+ H+]+)
UV-Vis in PBS: l™c: 470 nm; em: 570 nm; e = 15.000 l/mol*cm
UV-Vis in Puffer pH 5: Xmax: 524 nm; Xem· 594 nm; e = 15.400 l/mol*cm Verbindung 46:
2-[3,9-Bis(diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-14-yl]benzoesäure Chloridsalz
1 mmol Verbindung 2 und 1 mmol 2-[4-(Diethylamino)-2-hydroxy-benzoyl] benzoesäure werden in 5 ml Eisessig 16 Stunden bei 110°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag durch RP-Chromatografie gereinigt.
Ausbeute 214 mg (34%) (C37H39CIN2O4; 611,17 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 575,4 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 664 nm; Xem· 710 nm; e = 60.000 l/mol*cm UV-Vis in PBS: l™c: 663 nm; em: 711 nm; e = 42.000 l/mol*cm
Verbindung 47:
6-[[9-(Diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-7-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure
Chloridsalz
500 mmol Verbindung 7 und 500 mitioI 4-(Diethylamino)-2-hydroxy-benzaldehyd werden in 5 ml Eisessig 16 Stunden bei 110°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag durch RP-Chromatografie gereinigt.
Ausbeute 70 mg (24%) (C34H41CIN2O4; 577,15 g/mol)
MS ESI+ (m/z): 541,3 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: Xmax: 679 nm; Xem· 713 nm; e = 80.300 l/mol*cm
UV-Vis in PBS: l™c: 670 nm; Xem: 710 nm; e = 37.000 l/mol*cm
Verbindung 48:
6-[Ethyl-(3-methoxy-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-9-yl)amino]hexansäure
Chloridsalz
1 mmol Verbindung 7 und 1 mmol 2-Hydroxy-4-methoxy-benzaldehyd werden in 5 ml Eisessig 16 Stunden bei 110°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit Diethylether gefällt und der Niederschlag durch RP-Chromatografie gereinigt.
Ausbeute 43 mg (8%) (C31H34CINO5; 536,06 g/mol) MS ESI+ (m/z): 500,2 ([M]+)
UV-Vis in Ethanol: l,^c: 654 nm; 712 nm; e = 53.000 l/mol*cm
Photostabilität ausgewählter erfindungsgemäßer Verbindungen
Figur 1 zeigt die Ergebnisse der Bestrahlung von wässrigen Lösungen (PBS pH 7,5, 100 mM & 100 mM NaCI plus 5 mM NaNs) der Verbindungen 5, 8, 11 und 38 im Vergleich zum MegaStokes-Farbstoff DY- 510XL. Hierbei wurden Die Lösungen auf eine Extinktion von „1" im Absorptionsmaximum bei einer Schichtdicke von 1 cm eingestellt und mit Weißlicht der 150W-Xe-Lampe eines Fluoreszenzspektrometers (JASCO FP-6600, Monochromator auf 0 nm, Spalteistellung L: lOnm) bestrahlt und die Absorption im Maximum in 5 min-lntervallen über eine Stunde verfolgt.
Fluoreszenzmaxima ausgewählter erfindungsgemäßer Verbindungen Figur 2 zeigt die Fluoreszenzmaxima ausgewählter Verbindungen.
Die Erfindung bezieht sich auf neuartige, wasserlösliche Fluoreszenzfarbstoffe mit hoher Fluoreszenzquantenausbeute auf der Basis von sauerstoffhaltigen Heterocyclen, deren reaktive Derivate und Farbstoff-Konjugate sowie deren Anwendung zum Markieren von Proben und dem Nachweis von Analyten. Die Verbindungen der neuen Farbstoffklasse sind mit kommerziellen Anregungslichtquellen kompatibel und zeichnen sich durch Stokes-Verschiebungen von mehr als 50 nm aus.
Weitere Aspekte der Erfindung
Nachfolgend werden weitere bevorzugte Aspekte der Erfindung dargestellt:
1. Aspekt
Verbindung der allgemeinen Formel 1 und Salze sowie Solvate davon, wobei
Rll und R12 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff oder Alkyl sind, R2 Wasserstoff, Alkyl oder Alkenyl ist,
R3 Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR18R19 oder eine Gruppe Q ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4- Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) co-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x 1-5 ist, (viii) co- Carbonsäurealkyl (-(C^Jy-CC H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, und Q eine heterocyclische Struktur ausgewählt aus einer Struktur der Formel 2 oder 3 ist, mit n= 1, 2 oder 3; wobei R20 unabhängig voneinander jeweils Alkyl, co-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X- SO3 ) oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, R21, R22, R23, R24 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat sind, R25 Wasserstoff, Alkyl, co-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03_) oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, wobei x jeweils eine ganze Zahl von 1-5 ist, und
R4 Wasserstoff, Brom, Chlor, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, Alkyl, Aryl oder Heteroaryl ist und
R5 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist,
R6 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy oder NR29R30 ist, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A sind, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils vorzugsweise aus (i) Ci- C4-Alkyl, (ii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 _), wobei x l-5ist, (iii) co-Carbonsäurealkyl (-(C^Jy-CC H), wobei y 1-8 ist und (iv) Ethylestern von (iii) ausgewählt sind,
R7 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR31R32, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei R31 und R32 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt Ci-C4-Alkyl, (vii) co-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03_), wobei x 1-5 ist, (viii) co-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-C02H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind,
R8 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,
R9 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist und
L ein Linker ausgewählt aus-(CH2)s- und -[(CH2)m-0]p-(CH2)m- ist, wobei m eine ganze Zahl von 2 - 5 ist und p und s unabhängig voneinander jeweils eine ganze Zahl von 1-10 darstellen, wobei jede Verbindung keinen oder einen Linker L enthält mit einer an L gebundenen reaktiven Gruppe A zur kovalenten Bindung an ein zu markierendes Molekül K, wobei A eine Amin- (-NH2), Hydroxy- (-OH) oder Phosphoramidit (-0-P-[0-CH2-CH2-CN]-N[(CH(CHB)2]2)- Funktion, eine Carbonsäure (-COOH), ein davon abgeleiteter Alkyl- oder Aktiv-Ester (NHS-Ester, Sulfo- NHS-Ester, Tetrafluoro-Phenylester, p-Sulfo-Tetrafluoro-Phenylester), ein Carbonsäure-Hydrazid (- CONHNH2) oder ein Carbonsäure-Amid (-CONHR28) mit R28 gleich -(CH2)t-Y ist, wobei
Y gleich -OH, -NH2, -NH3 +, Maleimid (-N[CO-CH]2), -NCS, -NCO, -NH-CO-CH2-l, -NH-CO-CH2-Br, -Azid (- N3), -Alkin (-CCH) oder-Phosphoramidit (-0-P-[0-CH2-CH2-CN]-N-[CH-(CHB)2]2) ist und t eine ganze Zahl von 1-10 ist,
K eine Komponente, ausgewählt aus der Gruppe Haptene (Moleküle, die ein unvollständiges Antigen darstellen und erst bei Bindung an Proteine bzw. Zellstrukturen die Wirkung eines Antigens zeigen), Proteine, Antikörper (Proteine, die als Reaktion auf Antigene gebildet werden), niedermolekulare Arzneistoffe (wirksame Bestandteile in Arzneimitteln, die aufgrund ihrer relativ geringen Molmasse bis etwa 800 g/mol, im Gegensatz zu zum Beispiel Proteinen als sehr große Moleküle, in der Lage sind in Zellen einzudringen), Peptide (kleine bzw. kurzkettige Proteine bis etwa 100 verknüpfte Aminosäuren), Nucleotide (Grundbausteine von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die aus einem Phosphatteil, einem Monosaccharidteil und einem Nucleobasenteil wie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil bestehen), Nucleoside (Grundbausteine von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die keinen Phosphatteil besitzen, sondern nur aus einem Monosaccharidteil und einem Nucleobasenteil bestehen), DNA- Oligomere (im Gegensatz zu DNA als Makromolekül Moleküle der Desoxyribonucleinsäure mit einer relativ geringen, nicht genau definierten Anzahl an Nucleotiden), Polymere (synthethische oder natürliche, kettenförmige oder verzweigte chemische Verbindung aus sich wiederholenden Einheiten, den Monomeren; Polymere können auch als Copolymere aus mindestens zwei unterschiedlichen Monomeren in verschiedenen Mengenverhältnissen und Anordnungen bestehen), ist.
2. Aspekt
Verbindung nach Aspekt 1, gekennzeichnet durch
R3= Hydroxy, wobei die Verbindung in Abhängigkeit vom pH-Wert als neutraler Grundkörper 3-Oxo- 2H-xanthen 4 vorliegt.
3. Aspekt
Verbindung nach Aspekt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass mindestens eine ausgewählt aus R2-R3, R3-R4, R5-R6, R6-R7 und R7-R8 verbrückt ist, indem gesättigte Ringe, partiell ungesättigte Ringe, aromatische Ringe oder heteroaromatische Ringe gebildet werden, die unabhängig voneinander weitere Substituenten, insbesondere Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate enthalten.
4. Aspekt
Verbindung nach einem der vorherigen Aspekte, gekennzeichnet durch eine Struktur der Formel 5 wobei
R13 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist,
R14 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist,
R15 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR33R34, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat oder verbrückt zu R16 ist, wobei R33 und R34 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt Ci-C4-Alkyl, (vii) co-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x 1-5 ist, (viii) co-Carbonsäurealkyl (-(C^Jy-CC H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind,
R16 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy oder NR35R36 ist, wobei R35 und R36 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt Ci-C4-Alkyl, (vii) co-Sulfonsäure- Alkyl (-(CH2)X-S03_), wobei x l-5ist, (viii) w-Carbonsäurealkyl (-(C^Jy-CC H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind,
R17 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist und ein oder mehrere ausgewählt aus R5-R6, R6-R7, R7-R8, R14-R15, R15-R16 und R16-R17 verbrückt sein können, indem gesättigte Ringe, partiell ungesättigte Ringe, aromatische Ringe oder heteroaromatische Ringe gebildet werden, die unabhängig voneinander weitere Substituenten, insbesondere Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate, enthalten können und vorzugsweise Arylsubstituenten und/oder Heteroarylsubstituenten (wie in R4, R6, R7, R15, R16, R18, R19, R33, R34, R35, R36) weitere Substituenten wie Sulfonsäuren oder Sulfonsäurederivate und/oder Alkoxygruppen und/oder substituierte Aminogruppen enthalten.
5. Aspekt
Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Aspekte, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mindestens eine Sulfonsäuregruppe enthält. 6. Aspekt
Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Aspekte, dadurch gekennzeichnet, dass R3 NR18R19 ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Alkyl, Benzyl, Aryl, Heteroaryl oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A sind, wobei NR18R19 vorzugsweise aus 3- Aminopropansulfonat, N-Methylanilin, 4-(Methylamino)benzensulfonat, Anilin, 5-Carboxypentylamin und 3-Carboxypropyl(methyl)amin ausgewählt ist.
7. Aspekt
Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Aspekte, dadurch gekennzeichnet, dass bei 25 °C mindestens 1 mg der Verbindung in 1,000 g Wasser löslich sind.
8. Aspekt
Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Aspekte, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Verbindung um eine fluoreszierende Verbindung handelt, die ein Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 650 nm, vorzugsweise von 500 nm bis 550 nm, aufweist.
9. Aspekt
Verbindung nach Aspekt 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Stokes-Verschiebung mindestens 40 nm, vorzugsweise 50 nm bis 120 nm, noch bevorzugter 70 nm bis 90 nm, beträgt.
10. Aspekt
Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Aspekte, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus
6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin,
6-[[6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure,
3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-l-sulfonat,
3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3- yl]amino]propan-l-sulfonat,
3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H- xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester,
3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l- sulfonat,
4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonat,
6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure,
6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat,
6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2- sulfonat,
6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol,
8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol,
6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure,
3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7H-xanthen-10-ium-2-sulfonat,
3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)propan-l-sulfonat,
6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)hexansäureethylester,
3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat,
3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat,
6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl]hexansäure,
4-[[l-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll- ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat,
6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-lH-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl- amino]hexansäure,
6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure,
(2E)-l-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2- enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat,
3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3- ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-l-yl]propan-l-sulfonat,
6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3-on,
6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure,
6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-l-sulfonat,
6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-Hydroxy-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-(5-Carboxypentoxy)-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-l-yl)hexansäure,
1-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
2-[3,9-Bis(diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-14-yl]benzoesäure, 6-[[9-(Diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-7-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure und
6-[Ethyl-(3-methoxy-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-9-yl)amino]hexansäure. 11. Aspekt
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1, wobei das Verfahren die Reaktion von (E)- (3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-l-yliden)-ethyl-oxonium oder (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4- pyridyl)cyclohex-2-en-l-yliden]-ethyl-oxonium mit einer Benzaldehyd-Verbindung umfasst, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Hydroxygruppe aufweist.
12. Aspekt
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 5, wobei das Verfahren die Reaktion einer Verbindung der Formel 1, vorzugsweise von 6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3- amin oder 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester, mit einer Benzaldehyd-Verbindung umfasst, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Hydroxygruppe aufweist.
13. Aspekt
Verwendung einer Verbindung nach einem der Aspekte 1 bis 10 als Fluoreszenzfarbstoff und/oder in einer Fluoreszenz-Sonde oder als Fluoreszenz-Sonde.
14. Aspekt
Verwendung nach Aspekt 13 zur Markierung von ein oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Haptenen, Enzymsubstraten, Enzym- Cofaktoren, Biotin, Carotinoiden, Hormonen, Neurohormonen, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren, Lectinen, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Dextranen, Nucleinsäuren, Oligonucleotiden, DNA, RNA, Zellen, Lipiden, rezeptorbindenden Pharmaka.
15. Aspekt
Verwendung nach Aspekt 13 oder 14 in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und/oder quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), zur Erforschung eines Genoms (DNA-Sequenzierung), in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Throughput- Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (DNA- und Protein-Chips).

Claims

Patentansprüche
1. Verbindung der allgemeinen Formel l_oder_4 und Salze sowie Solvate davon, wobei
Rll und R12 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff oder Alkyl sind,
R2 Wasserstoff, Alkyl oder Alkenyl ist,
R3 Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR18R19 oder eine Gruppe Q ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt C1-C4- Alkyl, bevorzugter Ethyl, (vii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x 1-5 ist, (viii) co- Carbonsäurealkyl (-(C^jy-CC H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, und Q eine heterocyclische Struktur ausgewählt aus einer Struktur der Formel 2 oder 3 ist, mit n= 1, 2 oder 3; wobei R20 unabhängig voneinander jeweils Alkyl, w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X- SO3 ) oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, R21, R22, R23, R24 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat sind, R25 Wasserstoff, Alkyl, co-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ) oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A ist, wobei x jeweils eine ganze Zahl von 1-5 ist, oder R2 und R3 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten enthalten kann,
R4 Wasserstoff, Brom, Chlor, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, Alkyl, Aryl oder Heteroaryl ist oder R3 und R4 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R5 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist,
R6 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy oder NR29R30 ist, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A sind, wobei R29 und R30 unabhängig voneinander jeweils vorzugsweise aus (i) Ci- C4-Alkyl, (ii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(Ch jx-SOs ), wobei x 1-5 ist, (iii) w-Carbonsäurealkyl (-(Ch jy-CC H), wobei y 1-8 ist und (iv) Ethylestern von (iii) ausgewählt sind, oder R5 und R6 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R7 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR31R32, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist, wobei R31 und R32 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt Ci-C4-Alkyl, (vii) w-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x 1-5 ist, (viii) co-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-C02H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, oder R6 und R7 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R8 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, oder R7 und R8 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R9 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist,
L ein Linker ausgewählt aus-(CH2)s- und -[(CH2)m-0]p-(CH2)m- ist, wobei m eine ganze Zahl von 2 - 5 ist und p und s unabhängig voneinander jeweils eine ganze Zahl von 1-10 darstellen, wobei die Verbindung einen Linker L mit einer an L gebundenen reaktiven Gruppe A zur kovalenten Bindung an ein zu markierendes Molekül K enthält, wobei
A eine Amin- (-NH2), Hydroxy- (-OH) oder Phosphoramidit (-0-P-[0-CH2-CH2-CN]-N[(CH(CHB)2]2)- Funktion, eine Carbonsäure (-COOH), ein davon abgeleiteter Alkyl- oder Aktiv-Ester (NHS-Ester, Sulfo- NHS-Ester, Tetrafluoro-Phenylester, p-Sulfo-Tetrafluoro-Phenylester), ein Carbonsäure-Hydrazid (- CONHNH2) oder ein Carbonsäure-Amid (-CONHR28) mit R28 gleich -(CH2)t-Y ist, wobei Y gleich -OH, -NH2, -NH3 +, Maleimid (-N[CO-CH]2), -NCS, -NCO, -NH-CO-CH2-l, -NH-CO-CH2-Br, -Azid (- N3), -Alkin (-CCH) oder-Phosphoramidit (-0-P-[0-CH2-CH2-CN]-N-[CH-(CHS)2]2) ist und t eine ganze Zahl von 1-10 ist,
K eine Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Haptenen, Proteinen, Antikörpern, niedermolekularen Arzneistoffen, Peptiden, Nucleotiden, Nucleosiden, DNA-Oligomeren, Polymeren ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch R3= Hydroxy.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass
R3 und R4 nicht in einer Weise miteinander verbrückt sind, dass sie zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden.
4. Verbindung nach Anspruch 1 oder 3, gekennzeichnet durch eine Struktur der Formel 5^ wobei
R13 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist,
R14 Wasserstoff, Alkyl oder 2-Carboxyphenyl ist,
R15 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, NR33R34, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat oder verbrückt zu R16 ist, wobei R33 und R34 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt Ci-C4-Alkyl, (vii) co-Sulfonsäure-Alkyl (-(CH2)X-S03 ), wobei x 1-5 ist, (viii) co-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-C02H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, oder R14 und R15 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R16 Wasserstoff, Brom, Chlor, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy oder NR35R36 ist, wobei R35 und R36 unabhängig voneinander jeweils aus (i) Wasserstoff, (ii) Benzyl, (iii) Aryl, (iv) Heteroaryl, (v) einer über einen Linker L gebundenen reaktiven Gruppe A, (vi) Alkyl, bevorzugt Ci-C4-Alkyl, (vii) co-Sulfonsäure- Alkyl (-(CH2)X-S03_), wobei x l-5ist, (viii) w-Carbonsäurealkyl (-(CH2)y-C02H), wobei y 1-8 ist, und (ix) Ethylestern von (viii) ausgewählt sind, oder R15 und R16 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann,
R17 Wasserstoff, Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat ist oder R16 und R17 unter Bildung eines gesättigten Ringes, partiell ungesättigten Ringes, aromatischen Ringes oder heteroaromatischen Ringes zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, verbrückt sind, wobei der Ring weitere Substituenten, insbesondere eine Sulfonsäure oder ein Sulfonsäurederivat, enthalten kann.
5. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, dass die Verbindung mindestens eine Gruppe ausgewählt aus einer Sulfonsäuregruppe, einem Sulfonsäurederivat, einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe, einer Carbonsäure und einem Carbonsäurederivat enthält, wobei vorzugsweise Verbindungen ausgenommen sind, bei denen a) R7 Methoxy und R3 eine Aminogruppe, insbesondere NR18R19, insbesondere NH(4-HOOCCeH4), NH(4-C2H5COOC6H4), NH(2-C2H5COOC6H4), NH(CSH5), N(C2H5)2 oder N(CH2)2(CH2)20, ist; b) R4 Brom und R6 und R16 N(CHB)2 ist; c) R6 und R16 vorhanden ist und eines von R6 und R16 eine Hydroxygruppe ist.
6. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mindestens eine Sulfonsäuregruppe enthält.
7. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R3 NR18R19 ist, wobei R18 und R19 unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Alkyl, Benzyl, Aryl, Heteroaryl oder eine über einen Linker L gebundene reaktive Gruppe A sind, wobei NR18R19 vorzugsweise aus 3-Aminopropansulfonat, N-Methylanilin, 4-(Methylamino)benzensulfonat, Anilin, 5- Carboxypentylamin und 3-Carboxypropyl(methyl)amin ausgewählt ist.
8. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung wasserlöslich ist, vorzugsweise dass bei 25 °C mindestens 1 mg der Verbindung in 1000 mg Wasser löslich sind.
9. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Verbindung um eine fluoreszierende Verbindung handelt, die ein Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich von 400 nm bis 650 nm, vorzugsweise von 500 nm bis 550 nm, aufweist.
10. Verbindung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Stokes-Verschiebung mindestens 40 nm, vorzugsweise 50 nm bis 120 nm, noch bevorzugter 70 nm bis 90 nm, beträgt.
11. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus
6-Ethoxy-N,N-diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin,
6-[[6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]hexansäure,
3-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-(6-ethoxy-6-oxo-hexyl)amino]propan-l-sulfonat,
3-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3- yl]amino]propan-l-sulfonat,
3-[[6-[[6-(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy-6-oxo-hexyl]-(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H- xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester,
3-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]propan-l- sulfonat,
4-[[6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- amino]benzensulfonat,
6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
4-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- amino]benzensulfonat,
6-[(6-Anilino-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure,
6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-(4-sulfonatoanilino)-2H-xanthen-10-ium-4-sulfonat,
6-[[6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]amino]naphthalen-2- sulfonat,
6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-ol,
8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-ol,
6-[[8,8-Dimethyl-6-(N-methylanilino)-7H-xanthen-10-ium-3-yl]oxy]hexansäure,
3-(5-Carboxypentoxy)-8,8-dimethyl-6-(N-methyl-4-sulfonato-anilino)-7H-xanthen-10-ium-2-sulfonat,
3-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)propan-l-sulfonat,
6-(9-Ethoxy-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl)hexansäureethylester,
3-[9-(5-Carboxypentylamino)-2, 2,4,7, 7-pentamethyl-8H-chromeno[3, 2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat,
3-[9-[3-Carboxypropyl(methyl)amino]-2,2,4,7,7-pentamethyl-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l- yl]propan-l-sulfonat,
6-[2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-(N-methylanilino)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll-ium-l-yl]hexansäure,
4-[[l-(5-Carboxypentyl)-2,2,7,7-tetramethyl-4-(sulfonatomethyl)-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-ll- ium-9-yl]-methyl-amino]benzensulfonat,
6-[[6-[3-(Dimethylamino)anilino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[6-(4-Aminoanilino)-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[6-[Bis(2-pyridylmethyl)amino]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure,
6-[[8,8-Dimethyl-6-[(E)-lH-pyridin-2-ylidenemethyl]-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl- amino]hexansäure,
6-[[6-[4-(Dimethylamino)phenyl]-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 6-[Ethyl-(6,8,8-trimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-yl)amino]hexansäure,
(2E)-l-(5-Carboxypentyl)-2-[(E)-3-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]prop-2- enyliden]-3,3-dimethyl-indolin-5-sulfonat,
3-[(5Z)-3-(5-Carboxypentyl)-5-[(2E)-2-[6-(diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3- ylidene]ethyliden]-2,4,6-trioxo-hexahydropyrimidin-l-yl]propan-l-sulfonat,
6-(Diethylamino)-l,l-dimethyl-2H-xanthen-3-on,
6-[(8,8-Dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)-ethyl-amino]hexansäure,
6-[5-Carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
3-[5-Carboxypentyl-(8,8-dimethyl-6-oxo-7H-xanthen-3-yl)amino]propan-l-sulfonat,
6-[5-Carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-Hydroxy-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-(5-Carboxypentoxy)-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat,
6-(2,2,4,7,7-Pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinolin-l-yl)hexansäure,
1-(5-Carboxypentyl)-2,2,4,7,7-pentamethyl-9-oxo-8H-chromeno[3,2-g]quinoline-10-sulfonat, 6-[[8,8-Dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure, 3-[5-Carboxypentyl-[8,8-dimethyl-6-oxo-5-(4-pyridyl)-7H-xanthen-3-yl]amino]propan-l-sulfonat,
2-[3,9-Bis(diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-14-yl]benzoesäure, 6-[[9-(Diethylamino)-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-7-ium-3-yl]-ethyl-amino]hexansäure und
6-[Ethyl-(3-methoxy-13,13-dimethyl-chromeno[3,2-b]xanthen-5-ium-9-yl)amino]hexansäure.
12. Verbindung nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus
3-[[6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3- yl]amino]propan-l-sulfonat,
4-[[6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-2H-xanthen-10-ium-3-yl]-methyl- aminojbenzensulfonate,
6-[5-carboxypentyl(ethyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat, 6-[5-carboxypentyl(3-sulfonatopropyl)amino]-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat und 6-(5-carboxypentoxy)-l,l-dimethyl-3-oxo-2H-xanthen-4-sulfonat.
13. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1 gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Verfahren die Reaktion von (E)-(3-Ethoxy-5,5-dimethyl-cyclohex-2-en-l-yliden)-ethyl- oxonium oder (E)-[3-Ethoxy-5,5-dimethyl-2-(4-pyridyl)cyclohex-2-en-l-yliden]-ethyl-oxonium mit einer Benzaldehyd-Verbindung umfasst, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Hydroxygruppe aufweist.
14. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel 5 gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Verfahren die Reaktion einer Verbindung der Formel 1, vorzugsweise von 6-Ethoxy-N,N- diethyl-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium-3-amin oder 6-[(6-Ethoxy-8,8-dimethyl-7H-xanthen-10-ium- 3-yl)-ethyl-amino]hexansäureethylester, mit einer Benzaldehyd-Verbindung umfasst, wobei die Benzaldehyd-Verbindung eine Benzaldehydgruppe aufweist und die Benzaldehyd-Verbindung in ortho-Position zur Benzaldehydgruppe eine Flydroxygruppe aufweist.
15. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Fluoreszenzfarbstoff und/oder in einer Fluoreszenz-Sonde oder als Fluoreszenz-Sonde.
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