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Die
Erfindung betrifft sogenannte Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe
auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere
fluoreszenz-optischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren. Typische
Verfahrensanwendungen beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten
Antigenen, Antikörpern
oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies.
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Einsatzmöglichkeiten
ergeben sich beispielsweise in der Medizin und der Pharmazie, in
der Bio- und Materialwissenschaft, bei der Umweltkontrolle und dem
Nachweis von in Natur oder Technik vorkommenden organischen und
anorganischen Mikroproben.
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Polymethine
sind als NIR-Marker seit langem bekannt und zeichnen sich durch
intensive, leicht in den NIR-Bereich verschiebbare Absorptionsmaxima
aus (Fabian, J.; Nakazumi, H.; Matsuoka, M.: Chem.- Rev. 1992, 92,
1197). Bei geeignetem Substituentenmuster und π-Elektronensystem fluoreszieren
sie mit ausreichender Quantenausbeute auch im NIR-Bereich. Entsprechend
finden diese Verbindungen breite Anwendung in verschiedenen Bereichen
der Technik, als Sensibilisatoren in AgX-Materialien, als Laserfarbstoffe,
als Quantenzahler, als Indikator-Farbstoffe in der Sensorik und
nicht zuletzt als Biomarker („Near-Infrared
Dyes for High Technology Applications", herausgegeben von Daehne, S.; Resch-Genger,
U.; Wolfbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers-Dordrecht/Boston/London-
1998).
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Die
Anzahl der als Biomarker verwendeten Polymethine ist begrenzt. Breite
kommerzielle Anwendung haben in diesem Sinne bisher nur das sich
vom Astraphloxin (
DE 415 534 )
abgeleitete Trimethin Cy3, bzw. das vinyloge Pentamethin Cy5 und
das doppelt vinyloge Heptamethin Cy7 mit Absorptionsmaxima bei ca.
550 nm, ca. 650 nm und ca. 750 nm gefunden (
US-PS 5 627 027 ). Darüber hinaus
wird das polysulfonierte, vom kommerziellen Heptamethin "Indocyaningreen" bzw. "Cardio Green" abgeleitete Trimethin
Cy3.5 und Pentamethin Cy5.5 angeboten (
US-PS 5 569 766 ). In der Polymethinkette
aliphatisch verbrückte
Heptamethine wurden von Patonay entwickelt (
US-PS 5 800 995 ).
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Charakteristisch
für alle
kommerziellen Biomarker sind die sich vom Inden (Fischer-Base) bzw.
Heteroinden ableitenden terminalen Heteroaromaten. Werden methylsubstituierte
Cycloimonium-Salze dieses Typs als terminale Polymethin-Bausteine
verwendet, so ist es notwendig, mindestens fünf aufeinander folgende sp2-hybridisierte Kohlenstoffatome (Pentamethine)
zwischen den Heterocyclen anzuordnen um Absorptionsmaxima an der
Grenze zum NIR-Bereich zu erzeugen.
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Ein
wesentlicher Nachteil der als Biomarker technisch genutzten NIR-Polymethin
besteht darin, daß mit
Verlängerung
der Polymethinkette im steigenden Maße nucleopile bzw. elektrophile
Angriffsmöglichkeiten auf
die Kette gegeben sind, in deren Folge es zur Zerstörung des π-Systems
kommt. Neben der ungenügenden
thermischen und photochemischen Stabilität besteht ein weiterer wesentlicher
Mangel der Polymethin darin, daß sie
neben ihren intensiven Absorptionsmaxima keine weiteren Absorptionsbanden
im sichtbaren Spektralbereich aufweisen und in diesem Spektrum,
insbesondere durch Argon-Laser mit einer Emissonswellenlänge von λ
em =
488 nm oder He/Ne-Laser mit λ
em = 633 nm bzw. entsprechende Laserdioden
ab λ
em = 670 nm, nicht unmittelbar angeregt werden
können.
Speziell die für "multiple color fluorescence
assay's" geeigneten Biomarker
können
aber nur durch diskrete, vom π-System
des Polymethins vorgegebene Lichtquellen (wie die vorgenannten)
zur Anregung gebracht werden. Um dennoch derartige Anwendungen zu
ermöglichen
(bei der Nutzung von "multiple
color fluorescence assay's" ist es notwendig
mit beispielsweise einer dieser Anregungslichtquellen verschiedene
Biomarker mit deutlich unterschiedlichen Emissionmaxima anzuregen),
erfolgt die Anregung von Cy5 durch einen Argon-Laser, indem beispielsweise
mit Hilfe von Energietransfer über
die Anregung von Fluorescein → Rhodamin → Texas Red → Cy5 eine
Emission über
die Anregung von Licht an der Grenze zum NIR-Bereich bewirkt wird
(
US-PS 5 800 996 ). Weitere
Möglichkeiten
zur Anregung von Cy5, beispielsweise durch einen Argon-Laser bestehen
darin, Mikropartikel aus intrinsischen Fluorophoren (Phycobiliproteinen)
und dem extrinsischen Cy5 zu erzeugen, die über Energiekaskaden die Anregung
des bei 650 nm absorbierenden Cy5-Derivates gestatten (Szöllösi, J.;
Damjanovich, S.; Matyus, L.: Cytometry 1998, 34, 159).
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Von
Gupta (
US-PS 5 783 673 )
werden Farbstoff-Konjukate beschrieben, die durch die Reaktion von Phycobiliprotein
mit aktivierten Fluorescein, Texas Red oder Cy5-Farbstoffen (Phycobiliprotein/Amine-Reactive
Dye – PARD)
dargestellt wurden. Diese so erhaltenen Farbstoff-Konjugate zeigen
im sichtbaren Spektralbereich zusätzliche Absorptionsbanden,
die zur Anregung genutzt werden können. Nachteilig an diesen
Proben sind die hohe Molmasse, die aufwendige Präparation und die geringe Stabilität dieser
Marker-Farbstoffe.
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Ein
weiteres Beispiel für
die Anregung von an sich bei 488 nm nicht absorbierenden Pentamethinen gibt
Glazer (
US-PS 5 760 201 ).
Durch die kovalente Verknüpfung
mit einem im gewünschten
Bereich absorbierenden Monomethin über mehrere ammoniumhaltige
optimierte Alkylspacer wird zusätzlich
eine starke Affinität
zur DNA erreicht (spezifische Ionenbindung). Auch hier ist ein entsprechender
Verfahrensaufwand zur Anregung unumgänglich. Weitere Nachteile dieser
Marker-Farbstoffe bestehen in einer ungenügenden Photo- oder Lagerstabilität, in aufwendigen
Synthese- und Reinigungsschritten, in geringen Absorptionskoeffizienten bzw.
einer unbefriedigenden Fluoreszenzquantenausbeute sowie in unerwünschten Änderungen
der optischen Eigenschaften in Gegenwart von Proteinen oder Nucleinsäureoligomeren
bzw. nach Bindung an diese.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, NIR-Marker-Farbstoffe auf
Polymethin-Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie
hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch
Laserstrahlung im sichtbaren oder im nahen IR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht
eines Argon-, Helium/Neon- oder Diodenlasers zur Fluoreszenz angeregt
werden können.
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Erfindungsgemäß werden
Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen eingesetzt, die
substituierte Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-,
das 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H-indolenin-,
2- und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9-Methylacridinderivate der allgemeinen
Formeln Ia oder Ib oder Ic
enthalten
mit Z als
wobei
- – X
bzw. Y für
ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)2 steht,
- – n
für die
Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht,
- – R1-R15 gleich oder
unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder
Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe,
eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder
zwei ortho-ständige
Reste, z. B. R2 und R3,
zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,
- – mindestens
einer der Substituenten R1-R15 einen
ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO3 -, PO3 -,
COO-, oder NR3 +, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften
dieser Farbstoffe bestimmt,
- – mindestens
einer der Substituenten R1-R15 für eine reaktive
Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit den
oben genannten Trägermolekülen ermöglicht und
- – U-V
bzw. U'-V' gleich oder unterschiedlich
sind und aus Wasserstoff, aus einer gesättigten aliphatischen, heteroaliphatischen
oder aus einer Lacton- bzw. Thiolactongruppierung bestehen können.
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In
den Unteransprüchen
2–11 sind
spezielle Ausführungsformen
zu den Marker-Farbstoffen
aufgeführt.
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Diese
substituierten Indol-, Heteroindol-, Pyridin-, Chinolin- oder Acridinderivate
der allgemeinen Formel Ia oder Ib oder Ic können als Farbstoffe zur optischen
Markierung von organischen oder anorganischen Mikropartikeln, z.
B. von Proteinen, Nucleinsäuren,
DNA, biologische Zeilen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw.
anorganischen polymerer Trägermaterialien
verwendet werden.
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Die
Markierung der Partikel kann dabei durch die Ausbildung von ionischen
Wechselwirkungen zwischen den Markern der allgemeinen Formeln Ia
oder Ib oder Ic und dem zu markierenden Materialien erfolgen.
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Die
gegenüber
Nucleophilen aktivierten funktionellen Gruppen dieser Marker vermögen kovalent
an eine OH-, NH2- oder SH-Funktion zu koppeln.
Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung
von organischen und anorganischen Materialien, wie den besagten
Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologische
Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen Polymeren.
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Diese
Kopplungsreaktion kann in wäßriger oder überwiegend
wäßriger Lösung und
vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht
ein Konjugat mit fluoreszenten Eigenschaften.
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Sowohl
die Verbindungen der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic und
davon abgeleitete Systeme können
in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und
quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften,
in Biosensoren (point of care-Messungen), Erforschung des Genoms
und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische
Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie
(FCS), im Ultra-High-Troughput-Screening (UHTS), bei der multicolor
Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung
(FISH) und in Mikroarrays (Genchips).
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Durch
die Darstellung von nichtsymmetrischen Polymethinen, die einerseits
als terminale Funktion einen leicht derivatisierbaren Heterocyclus
vom Typ der Pyridin-, Chinolin-, Indol-, Heteroindol- bzw. Acridinderivate
sowie andererseits einen neuartigen 6-Ringheterocyclus aufweisen, werden insbesondere
nachfolgende Vorteile erreicht:
Bereits Trimethine absorbieren
im Spektralbereich > 650
nm und zeigen eine gegenüber
den bisher bekannten Polymethinen mit Absorptionsmaxima > 650 nm (Penta- und
Heptamethine) eine wesentlich verbesserte photochemische und thermische
Stabilität.
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Durch „molecular
engineering" ist
es möglich,
Lage und Intensität
der Absorptions- und Emissionsmaxima beliebig zu steuern und den
Emissionswellenlängen
unterschiedlicher Anregungslaser, vor allem NIR-Laserdioden, anzupassen.
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Bedingt
durch die Auswahl geeigneter terminaler Heterocyclen zeigen die
erfindungsgemäßen Farbstoffe
zusätzliche
Absorptionsmaxima im sichtbaren bzw. NIR-Spektralbereich, die zur Anregung, beispielsweise
mit einem Argon-Laser genutzt werden können. Diese Farbstoffe sind
insbesondere zur Anwendung in „multiple
color fluorescence assay's" geeignet.
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Die
Marker-Farbstoffe sind durch relativ einfache und in zwei Stufen
durchzuführende
Synthese herstellbar, mit welcher eine Vielzahl unterschiedlich
funktionalisierter Farbstoffe, beispielsweise hinsichtlich der Gesamtladung
des Farbstoffes und der Anzahl, Spezifität und Reaktivität der zur
Immobilisierung genutzten aktivierten Gruppen, anwendungsspezifisch
zur Verfügung
gestellt werden kann.
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Die
Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten
Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden.
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Es
zeigen:
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1:
Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel
1 und 2
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2:
Synthese gemäß Ausführungsbeispiel
3
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3:
Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel
4 bis 6
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4:
Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel
7 und 8
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5:
Absorptionsspektrum von C 1601
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6:
Emissionsspektrum von C 1601 (frei, gebunden, 670 nm Diodenlaser)
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7:
Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel
11 und 12
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8:
Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel
13 und 14
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9:
Absorptionsspektrum von C 1591 – NHS-ester
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10:
Emissionsspektrum von C 1591 (frei, gebunden, 670 nm Diodenlaser)
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11:
Emissionsspektrum von C 1591 (frei, gebunden, 488 nm Ar-Ionenlaser)
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12:
Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel
19 und 20
-
Allgemeine Vorschrift zur Darstellung
von 3.1-verbrückten
2-(2-Ethoxyethenyl)-7-diethylamino-benzo[b]pyrylium
perchloraten C 1595 und L 107, vgl. 1:
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0,01
mol von einem 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]pyrylium perchlorat
der Formel 1a oder 1b werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit
2,0 g Triethoxymethan kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende
Niederschlag wird abgesaugt und aus Eisessig umkristallisiert.
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1: 6-Diethylamino-4-ethoxymethylen-1.2.3.4-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium> perchlorat C 1595:
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- 3,58 g (87%) Ausbeute, 178°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CDCl3): 1.29
(t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.78–1.82 (m,
2H), 2.54 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.59 (q,
J = 7.1 Hz, 4H), 4.53 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.3, J
= 9.3 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 9.3 Hz, 1H),
7.84 (s, 1H), 8.52 (s, 1H). – 13C NMR (CDCl3):
12.5, 15.6, 20.2, 21.8, 27.8, 45.8, 73.1, 97.1, 108.3, 115.4, 115.8,
120.3, 130.6, 145.6, 154.8, 157.8, 163.0, 167.9. – C20H26ClNO6 (411.88): ber. C 58.32, H 6.36, Cl 8.61,
N 3.40, gef. C 57.75, H 6.58, Cl 8.43, N 3.46.
-
2: 3-Diethylamino-6-ethoxymethylen-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat L 107:
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- 3,96 g (93%) Ausbeute, 158-60°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CDCl3): 1.27
(t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.75–1.77 (m,
2H), 1.85–1.87
(m, 2H), 2.58–2.61
(m, 2H), 2.79–2.83
(m, 2H), 3.58 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.56 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.99
(dd, J = 2.4, J = 9.3 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.60 (d,
J = 9.3 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 8.18 (s, 1H). – 13C
NMR (CDCl3): 12.5, 15.5, 21.1,23.8, 25.1,
29.2, 45.8, 72.4, 96.3, 113.2, 116.1, 116.3, 124.2, 130.8, 149.0,
155.0, 157.9, 162.8, 171.0. – C21H28ClNO6 (425.91): ber. C 59.22, H 6.63, Cl 8.32, N
3.29, gef. C 58.76, H 6.39, Cl 8.75, N 3.34.
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3: 3-Diethylamino-6-[3-(N-acetylanilino)-prop-2-yliden]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1590,
vgl. 2:
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2,13
g (0,005 mol) 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]pyrylium perchlorat
der Formel 1b werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 1,29 g (0,005 mol)
(3-Anilinopropenyliden)-phenyl-ammoniumchlorid
kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag
wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert:
2,00 g (74%) Ausbeute, 216-20°C
Schmelzpunkt. – 1H NMR (CD3NO2): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.64–1.69 (m,
2H), 1.82–1.87
(m, 2H), 2.00 (s, 3H), 2.49 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.89 (t, J = 6.0
Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.61 (dd, J = 11.8 Hz, J = 13.5
Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 2.4 Hz, J = 9.4
Hz, 1H), 7.36–7.39
(m, 2H), 7.54–7.65
(m, 4H), 8.21 (s, 1H), 8.27 (d, J = 13.5 Hz, 1H). – 13C NMR (CD3NO2): 12.8, 23.5, 25.2, 25.8, 25.9, 30.4, 47.2,
96.2, 109.9, 119.0, 119.3, 127.4, 129.9, 130.6, 130.7, 131.7, 132.0,
132.5, 140.1, 142.2, 151.3, 157.2, 160.1, 169.7, 171.2. – C29H33ClN2O6 (541.04): ber. C 64.38, H 6.15, Cl 6.55,
N 5.18, gef. C 63.73, H 6.15, Cl 6.81, N 5.07.
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Allgemeine Vorschrift zur Darstellung
von 3.1-verbrückten
2-[6-(N-acetylanilino)-hexatrien-1.3.5-yliden]-benzo[b]pyrylium
und thiopyrylium perchloraten C 1586, C 1573 und C 1574, vgl. 3:
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0,005
mol von einem 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]-pyrylium perchlorat
der Formel 1a, 1b oder ein 2-Methylen-4.6-diphenyl-thiopyrylium
perchlorat der Formel 1c werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit
1,42 g (0,005 mol) (5-Anilinopenta-2.4-dienyliden)-phenyl-ammonium chlorid
kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag
wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert.
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4: 6-Diethylamino-4-[5-(N-Acetylanilino)-penta-2.4-dienyliden]-1.2.3.4.-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium> perchlorat C 1586:
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- 2,65 g (96%) Ausbeute, 246-48°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CD3NO2): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.84–1.88 (m, 2H),
2.08 (s, 3H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.85 (t, J = 6 Hz, 2H),
3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.38 (dd, J = 11.4 Hz, J = 13.8 Hz, 1H),
6.55 (dd, J = 11.9 Hz, J = 14.3 Hz, 1H), 7.00–7.08 (m, 2H), 7.27–7.33 (m,
3H), 7.56–7.62
(m, 3H), 7.71–7.75
(m, 2H), 8.00 (d, J 13.8 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H). – C30H33ClN2O6 (553.05):
ber. C 65.15, H 6.01, Cl 6.41, N 5.07, gef. C 63.57, H 6.08, Cl
6.14, N 4.92.
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5: 3-Diethylamino-6-[5-(N-acetylanilino)-penta-2.4-dienylidene]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1573:
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- 2,61 g (92%) Ausbeute, 202°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CD3NO2): 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.78–1.82 (m,
2H), 1.90–1.94
(m, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.76 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 6 Hz,
2H), 3.75 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.39 (dd, J = 11.3 Hz, J = 13.9 Hz,
1H), 6.57 (dd, J = 11.9 Hz, J = 14.3 Hz, 1H), 6.98–7.06 (m,
2H), 7.32–7.36
(m, 3H), 7.52–7.63
(m, 4H), 7.77 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 8.22
(s, 1H). – 13C NMR (CD3NO2): 12.3, 22.9, 25.2, 25.5, 25.7, 30.2, 46.8,
95.7, 114.5, 118.7, 119.1, 126.0, 127.7, 129.7, 130.1, 131.1, 131.5,
132.1, 137.8, 140.1, 142.1, 144.4, 150.8, 156.9, 159.8, 169.3, 170.3. – C31H35ClN2O6 (567.08): ber. C 65.66, H 6.22, Cl 6.25,
N 4.94, gef. C 64.42, H 6.27, Cl 6.13, N 4.78.
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6: 8-[5-(N-Acetylanilino)-penta-2.4-dienylidene]-2.4-diphenyl-5.6.7.8-tetrahydro-<benzo[b]thiopyrylium>perchlorat C 1574:
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2,37
g (79%) Ausbeute, 216-18°C
Schmelzpunkt. – C34H30ClNO5S (600.13): ber. C 68.05, H 5.04, Cl 5.91,
N 2.33, S 5.34, gef. C 67.34, H 5.03, Cl 5.67, N 2.24, S 5.18.
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Allgemeine Vorschrift zur Darstellung
von 3.1-verbrückten
7-Diethylamino-2-[3-(1-alkyl-3.3-dimetyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden)-propen-1-yl]-benzo[b]pyrylium
perchloraten C 1592 und C 1601, vgl. 4:
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In
einer ersten Variante werden 0,005 mol von einem Indolderivat 2a
bzw. 2b (Mujumdar, R. T.; Ernst, L. A.; Mujumdar, S. R.; Lewis,
C. J.; Waggoner, A. S.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) zusammen
mit 2,13 g (0,005 mol) L 107 in 30 ml Acetanhydrid und 10 Tropfen
Piperidin für
ca. zehn Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach
dem Abkühlen
wird das Rohprodukt mit Ethylether gefällt und durch Säulenchromatographie
(Silicagel, Methanol/Aceton 1:1) gereinigt.
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In
einer zweiten Variante kommen (wie in 4 angedeutet)
anstelle von L 107 2,13 g (0,005 mol) von einem Perchlorat 3b (Kanitz,
A.; Hartmann, H.; Czerney, P.: J. Prakt. Chem. 1998, 340, 34) zur
Anwendung. Dabei ist es notwendig, die Reaktionszeit um ca. zehn
Minuten zu erhöhen.
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7: 3-Diethylamino-6-[2-(1-n-butyl-3.3-dimethyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden)-ethylidenl]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1592:
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- 1,87 g (63%) Ausbeute/Variante A, 1,34 g (45%) Ausbeute/Variante
B, 216-18°C
Schmelzpunkt. – HRMS-FAB (C34H43N2O):
ber. 495.337539; gef. 495.335970; D = 1.569 mmU.
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8: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(4-sulfonatobutyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen>kalium C 1601:
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- 1,25 g (36%) Ausbeute, 216-18°C Schmelzpunkt – HRMS-FAB
(C34H42KN2O7S2):
ber. 693.207053; gef. 693.203060; D = 3.99 mmU.
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9: Absorptionsspektren von C 1601:
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5 zeigt
das Absorptionsspektrum von C 1601 in reinem PBS (Phosphate Buffer
Saline) und nach der Zugabe von Albumin aus Humanserun (HSA).
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10: Fluoreszenzspekten von C 1601:
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6 zeigt
die Emissionsspektren von C 1601 (angeregt durch einen 670 nm Diodenlaser)
in reinem PBS und nach der Zugabe von HSA. Die Intensität der Fluoreszenz
hat sich nach der Zugabe von HSA um den Faktor fünf verstärkt.
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Allgemeine Vorschrift zur Darstellung
von 3.1-verbrückten
7-Diethylamino-2-[3-(1-(5-carboxypentyl-3.3-dimetyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2yliden)-propen-1-yl]-benzo[b]pyrylium
perchloraten C 1602 und C 1591, vgl. 7:
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1,77
g (0,005 mol) von einem Indolderivat 2c (Mujumdar, R. T.; Ernst,
L. A.; Mujumdar, S. R.; Lewis, C. J.; Waggoner, A. S.: Bioconjugate
Chem. 1993, 4, 105) und 0,005 mol C 1595 bzw. L 107 werden in 40
ml einer Mischung aus Pyridin/Acetanhydrid (1/1) für ca. zehn
Minuten unter Rückfluß erhitzt.
Nach dem Abkühlen wird
das Rohprodukt mit Ethylether gefällt und durch Säulenchromatographie
(Silicagel, Methanol) gereinigt.
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11: 6-Diethylamino-4-<2-[1-(5-carboxypentyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-1.2.3.4-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium> betain C 1602:
-
- 2,20 g (71%) Ausbeute, > 310°C Schmelzpunkt. – C35H44KN2O7S (657.89·H2O):
ber. C 62.20, H 6.56, N 4.14, S 4.74, gef. C 61.74, H 6.53, N 4.06,
S 4.26. – HRMS-FAB (C35H43N2O6S): ber. 619.284184; gef. 619.286390; D
= –2.205
mmU.
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12: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(5-carboxypentyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> betain C 1591:
-
- 2,15 g (68%) Ausbeute, > 340°C Schmelzpunkt. – C36H46KN2O7S (671.91·H2O):
ber. C 62.68, H 6.73, N 4.06, S 4.64, gef. C 62.37, H 6.61, N 4.07,
S 4.34. – HRMS-FAB
(C36H45N2O6S): ber. 633.299834;
gef. 633.308710; D = –8.875
mmU.
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Allgemeine Vorschrift zur Darstellung
von NHS-ester mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), vgl. 8:
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15
mg C 1602 bzw. C 1591, 14 mg DCC und 4 mg NHS werden in 1 ml trockenem
DMF gelöst
und mit 10 μl
Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wird 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt
und anschließend
filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels wird der Rückstand
mit Ether gewaschen und am Ölpumpenvakuum
getrocknet.
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13: C 1602 NHS-ester:
-
Die
Reaktion verläuft
quantitativ.
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14: C 1591-NHS-ester:
-
Die
Reaktion verläuft
quantitativ.
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15: Kovalente Markierung von Albumin aus
Humanserum (HSA) mit C 1591 NHS-ester:
-
C
1591-NHS-ester (ca. 0,5 mg) werden in 50 μl DMF und 5 mg HSA in 750 μl Bicarbonatpuffer
(0.1 mol/l, pH = 9.0) gelöst.
Beide Lösungen
werden langsam vereint und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird
das markierte HSA durch Gelchromatographie vom nicht gebundenen
Farbstoff getrennt. Als stationäre
Phase dient Sephadex G50, als Laufmittel Phosphatpuffer (22 mmol/l,
pH 7.2).
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16: Absorptionsspektren von C 1591-Derivaten:
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9 zeigt
das Absorptionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und
C 1591 kovalent gebunden an HSA. Als Lösungsmittel wurde für beide
Messungen PBS (Phosphate Buffer Saline) verwendet.
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17: Fluoreszenzspektren von C 1591-Derivaten:
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10 zeigt
das Emissionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und
C 1591 kovalent gebunden ans HSA. Zur Anregung wurde ein 670 nm
Diodenlaser (Spindler & Hoyer,
Leistung max. 3 mW) verwendet. Als Lösungsmittel für beide
Messungen diente PBS.
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18: Fluoreszenzspektren von C 1591-Derivaten:
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11 zeigt
das Emissionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und
C 1591 kovalent gebunden an HSA. Zur Anregung wurde ein 488 nm Ar-Ionenlaser
(Ion Laser Technology, Leistung max. 100 mW) verwendet. Als Lösungsmittel
für beide
Messungen diente PBS.
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19: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(3-acetoxypropyl)-3.3-dimethyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1594,
vgl. 12:
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1,94
g (0,005 mol) 1-(1-Acetoxypropyl)-2.3.3-trimethyl-3H-indolinium
iodid 2d (Brush et al.,
US-PS
5 808 044 ) und 2,13 g (0,005 mol) L 107 werden in einer
Mischung aus jeweils 20 ml Pyridin und 20 ml Acetanhydrid ca. 20
Minuten unter Rückfluß erhitzt.
Nach dem Abkühlen
wird die noch acetylierte Zwischenstufe mit Ether gefallt und im
Vakuum getrocknet. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch präparative
Säulenchromatographie
(Silicagel, Methanol). 0,87 g (29%) Ausbeute, 155-62°C Schmelzpunkt. – HRMS-FAB (C
35H
43N
2O
3): ber. 539.327368; gef. 539.328510; D = –1.142 mmU.
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20: Darstellung vom C 1594 phosphoramidit,
vgl. 12:
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Zur
Hydrolyse werden 200 mg C 1594 in 10 ml Methanol gelöst und unter
Zugabe von 50 mg Natriumcarbonat zwei Stunden gerührt. Im
Anschluß daran
wird filtriert sowie der entacylierte Farbstoff durch Zugabe von
Ether ausgefällt
und getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in trockenem DMF gelöst und mit
0.15 ml N.N-Diisopropylamin versetzt. Zu dieser Lösung gibt
man im Verlauf einer Stunde dreimal je 40 μl 2-Cyanoethyl-N.N-Diisopropylchlorophosphoramidit.
Dabei wird der Reaktionsverlauf dünnschichtchromatographisch verfolgt
und nach quantitativem Ablauf der Reaktion das Produkt direkt zum
Markieren von DNA eingesetzt.