EP4069718A1 - Souche de champignon ayant une viscosite diminuee - Google Patents

Souche de champignon ayant une viscosite diminuee

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EP4069718A1
EP4069718A1 EP20842255.0A EP20842255A EP4069718A1 EP 4069718 A1 EP4069718 A1 EP 4069718A1 EP 20842255 A EP20842255 A EP 20842255A EP 4069718 A1 EP4069718 A1 EP 4069718A1
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EP
European Patent Office
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strain
fungus
gene
gel3
cellulosic
Prior art date
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Pending
Application number
EP20842255.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Frédérique BIDARD-MICHELOT
Etienne JOURDIER
Fadhel Ben Chaabane
Thiziri AOUAM
Sabine PRIGENT
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IFP Energies Nouvelles IFPEN
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
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Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a strain of fungus, in particular filamentous, having a reduced viscosity, in which the ID78713 (GEL3) gene has been invalidated.
  • the invention also relates to the various uses of this strain, as well as the method of genetic modification making it possible to obtain a strain according to the invention.
  • filamentous ones such as the fungus Trichoderma reesei
  • enzymes for example cellulases
  • filamentous fungi are therefore useful in the production sectors of second generation biofuels or even biobased products derived from sugars originating from (ligno) cellulosic biomass.
  • patent EP 448 430 B1 describes an optimized industrial production of cellulases by Trichoderma reesei. This production is carried out using a fed-batch protocol (feed without drawing off) using a feed solution containing lactose as inducing sugar for the production of cellulases. This fermentation process comprises two stages: a first stage of growth of the fungus in the presence of an excess of carbon source and a second stage of production of enzymes thanks to the addition of an inducer in the medium with an optimized flow rate. These steps are carried out in a liquid medium in bioreactors with stirring and in the presence of oxygen because the fungus is strictly aerobic. Another example of an optimized process for the production of cellulases is described in patent EP 2 744899 B1.
  • Bodie and Pratt envisaged in application PCT / US2012 / 034379 to invalidate the mpgl gene in order to alter the viscosity of a strain of fungus. Additional invalidations have also been considered (among the sfb3, sebl, gas1, crzl or even tps2 genes).
  • the present invention is thus based on the unexpected results of the inventors who have demonstrated that the invalidation of the ID78713 (GEL3) gene, in a strain of fungus (belonging in particular to the class of sordariomycetes), made it possible to obtain a strain having a drastically reduced viscosity compared to a parent strain in which said ID78713 (GEL3) gene has not been invalidated.
  • the inventors have in fact demonstrated that the invalidation of the ID78713 (GEL3) gene alters the viscosity of said fungi, in particular filamentous fungi.
  • the inventors of the present invention are thus the first to have demonstrated that the ID78713 (GEL3) gene could influence the viscosity phenotype of strains of fungi.
  • the ID78713 (GEL3) gene codes for a protein of the 72 family of glycoside hydrolases, in particular a 1, 3 ⁇ -glucanosyltransferase.
  • the present invention therefore relates to a strain of fungus in which the ID78713 (GEL3) gene has been invalidated.
  • the present invention also relates to a method of genetic modification of a strain of fungus according to the invention, comprising a step of invalidating the ID78713 (GEL3) gene.
  • the present invention also relates to a method for producing mushroom biomass, comprising a step of culturing a strain of fungus according to the invention, in a culture medium comprising a suitable substrate.
  • the present invention also relates to a process for the production of proteins of interest, in particular enzymes, comprising a step of culturing a strain of fungus according to the invention, in a culture medium comprising an appropriate substrate.
  • the present invention further relates to a process for producing bio-based products from cellulosic or lignocellulosic substrates, comprising a step of using the strain of fungus according to the invention, to produce cellulolytic enzymes.
  • the present invention also relates to a process for producing a biofuel from cellulosic or lignocellulosic substrates, comprising a step of using the fungus strain according to the invention, to produce cellulolytic enzymes.
  • the present invention also relates to various uses of the strain according to the invention, for the production of proteins of interest, for the hydrolysis of cellulose or lignocellulose into glucose, for the production of biobased products from cellulosic or lignocellulosic substrates, or for the production of biofuel.
  • the present invention relates to the use of a strain of fungus according to the invention, to improve the properties of a compatible strain, in particular industrial.
  • the present invention thus relates to a strain of fungus in which the ID78713 (GEL3) gene has been invalidated.
  • the ID78713 (GEL3) gene is no longer functional.
  • the ID78713 (GEL3) gene is invalidated.
  • the present invention thus relates to a variant strain of fungus, in which the ID78713 (GEL3) gene has been invalidated. In other words, this means, for example, that in the strain according to the invention the protein corresponding to the gene ID78713 (GEL3) is not produced. Alternatively, the protein corresponding to the ID78713 gene (GEL3) can be produced, but it is not functional.
  • the term "variant strain” is understood to mean a strain genetically modified from a parent strain.
  • the term "parent strain” is understood to mean a strain from which the variant strain is derived or derived, and in which the ID78713 (GEL3) gene has not been invalidated.
  • the strain according to the invention thus corresponds to a variant strain derived from a parent strain, said variant strain having a reduced viscosity relative to the parent strain and said variant strain comprising at least one genetic modification corresponding to the invalidation of the ID78713 gene. (GEL3).
  • the term "functional gene” is understood in particular to mean a gene which makes it possible to produce a functional protein.
  • the term "functional protein” is understood in particular to mean a protein which has activity, for example with the protein encoded by the gene ID78713 (GEL3), a glycoside hydrolase activity.
  • said strain of fungus has a reduced viscosity compared to a parent strain in which the ID78713 (GEL3) gene has not been invalidated.
  • the fungus strain has a viscosity at least 3 times lower compared to the parent strain, more particularly at least 8 or 10 times lower,
  • a reduced viscosity compared to the parent strain means that the variant strain has a lower viscosity than that of the parent strain.
  • the viscosity of the variant strain according to the invention and that of the parent strain must be compared for the same concentration of fungus in the fermentation must.
  • the viscosity is preferably measured by the method described in Example 2, also described in the publication Hardy et al., Rheology, Vol. 27, 43-48 (2015), or using the following parameters (for example referred to as Test A):
  • the mobile (rotor) used is a propeller with a diameter of 38 mm, a height of 32 mm, a pitch of 29 mm and with a strip 8 mm wide; - a bucket (stator) with an internal diameter of 45 mm;
  • the viscosity according to the invention is measured using an AR2000 rheometer from TA Instruments, in particular by a logarithmic sweep with a shear rate of between 4 and 100 s 1 at a temperature of 27 ° C, even more preferably using a sweep carried out in a round trip (from 4 s 1 to 100 s 1 then from 100 s 1 to 4 s 1 ).
  • the strain according to the invention has a viscosity of about 1.5 Pa.s, as measured at 27 ° C, using an AR2000 rheometer from TA Instruments by logarithmic scanning at a rate of shears of 5 s 1 , when the fungus concentration is approximately 35 g / L.
  • the "fungus concentration” means the concentration in the medium in which the viscosity is measured. Typically the medium corresponds to a fermentation must. According to the invention, the term “approximately” means that the values should not be understood as strict values. Thus, “approximately 1.5 Pa.s” means values between 1.45 Pa.s to 1.55 Pa.s, and “approximately 35 g / L” means values between 34.5 g / L to 35.5 g / L .
  • the strain according to the invention has a viscosity reduced by at least 50% relative to a parent strain.
  • the term “at least 50%” means all the values between 50% and 100%, in particular the values of 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62 %, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99% and 100%.
  • the strain according to the invention has a viscosity reduced by at least 65% relative to a parent strain.
  • a percentage decrease can for example be calculated according to the following formula: ((final value - initial value) / initial value) * 100.
  • the GEL3 gene (also named ID 78713 in the reference genome of Trichoderma reesei, see htfps: //www.uniprot.ora/uniprot/G0RL27) codes for a protein which belongs to the 72 family of glycoside hydrolases. These enzymes are, for example, b-1, 3-glucanosyltransglycosylases which are involved in the biogenesis of the cell wall in fungi. According to the invention the term ID 78713 is preferred over the term GEL3.
  • the ID78713 (GEL3) gene is represented by SEQ ID NO: 2, but can also correspond to a variant of this gene or to an orthologous gene.
  • the ID78713 (GEL3) gene is only represented by SEQ ID NO: 2.
  • "a gene variant or an orthologous gene” means a gene which also codes for a protein which belongs to the family 72 of glycoside hydrolases.
  • the variant of the ID78713 (GEL3) gene or a gene ortholog of the ID78713 (GEL3) gene is typically represented by a sequence having at least 80% identity with the gene of SEQ ID NO: 2.
  • the variant of the ID78713 (GEL3) gene or a gene ortholog of gene ID78713 (GEL3) thus corresponds to a gene derived from the sequence represented by SEQ ID NO: 2. More particularly, the variant of gene ID78713 (GEL3) or a gene ortholog of gene ID78713 (GEL3) is represented with a sequence having at least 90% identity with the gene of SEQ ID NO: 2, in particular at least 95%, preferably at least 98% or 99%.
  • the ID78713 (GEL3) gene is represented by SEQ ID NO: 2, and the protein encoded by the ID78713 (GEL3) gene is represented by SEQ ID NO: 3.
  • the variant of the ID78713 (GEL3) gene or a gene ortholog of gene ID78713 (GEL3) codes either for the protein of SEQ ID NO: 3, or for a sequence having at least 80% identity with said SEQ ID NO: 3, in particular at least 90%, more particularly at least 95%, 98% or 99%.
  • the term "at least 80%” means all the values between 80% and 100%, in particular the values of 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% and 100%.
  • the percentage identity of a given sequence with respect to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 means the percentage identity over the total length of the sequences. The percentage thus corresponds to the number of identical nucleotides / residues between this given sequence and SEQ ID NO: 2 or 3 divided by the number of nucleotides or residues in the longer of the two sequences.
  • the invalidated gene ID78713 corresponds to a gene represented by SEQ ID NO: 2 or to a gene having at least 80% identity with the gene of SEQ ID NO: 2, in particular at least 90% and more particularly at least 95%.
  • the invalidated gene ID78713 corresponds to a gene represented by SEQ ID NO: 2.
  • the strain according to the invention thus comprises a deletion of the gene encoding the protein represented by SEQ ID NO: 3.
  • the ID78713 (GEL3) gene has been invalidated by mutagenesis or by homologous recombination.
  • invalidation consists of a deletion of all or part of the ID78713 (GEL3) gene.
  • the ID78713 (GEL3) gene has been invalidated using an invalidation cassette.
  • said invalidation cassette is represented by SEQ ID NO: 1, and is used in particular in a fungus belonging to the species Trichoderma reesei.
  • Mutagenesis is a technique commonly used in genetic engineering. It aims to voluntarily introduce mutations into DNA in order to create genes genetically modified. According to the invention, mutagenesis is more particularly understood as site-directed mutagenesis. Site-directed mutagenesis makes it possible to introduce identified mutations into a specific gene. To do this, the DNA of interest (here the ID78713 (GEL3) gene) containing the mutations is synthesized and then introduced into the cell to be mutated, typically using a vector, where the repair mechanism of the DNA takes care of integrating it into the genome.
  • GEL3 the DNA of interest
  • Homologous recombination is a technique commonly used in genetic engineering which involves an exchange between DNA molecules, typically using a vector.
  • vector is understood to mean any DNA sequence into which it is possible to insert fragments of foreign nucleic acid, the vectors allowing the introduction of foreign DNA into a host cell.
  • vectors are plasmids, cosmids, artificial yeast chromosomes (YAC), artificial bacterial chromosomes (BAC) and artificial chromosomes derived from bacteriophage P1 (PAC), vectors derived from viruses.
  • YAC yeast chromosome
  • BAC artificial bacterial chromosomes
  • PAC bacteriophage P1
  • the vector according to the invention allows the introduction of a mutation or a deletion.
  • said invalidation cassette comprises three DNA fragments:
  • the "target gene” is understood to mean the ID78713 (GEL3) gene.
  • the regions upstream and downstream of the target gene are two recombinant elements, one at each end of the gene, and are necessary to precisely target the sequence to be invalidated.
  • the region upstream of the target gene (that is to say the sequence 5 ′ upstream of the gene ID78713 (GEL3)) is in particular represented by the sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the region downstream of the target gene (that is to say the sequence 3 ′ downstream of the gene ID78713 (GEL3)) is in particular represented by the sequence of SEQ ID NO: 12.
  • selection marker is understood to mean a gene whose expression confers on the cells which contain it a characteristic allowing them to be selected.
  • the use of a selection marker makes it possible to identify cells that have integrated a genetic modification compared to those that have not. This is, for example, a gene for resistance to antibiotics, in particular the gene for resistance to the antibiotic hygromycin hph, as represented by SEQ ID NO: 11.
  • the invalidation cassette preferably consists of a resistance gene placed under the control of a promoter and of a terminator, with upstream and downstream the 5 ′ flanking regions. and 3 'of the ID78713 gene (GEL3).
  • the invalidation cassette consists of a gene from resistance to the antibiotic hygromycin hph placed under the control of the GPDa promoter and of the TRPc terminator (Punt and van den Hondel, 1992) with upstream and downstream the 5 'and 3' flanking regions of the ID78713 gene (GEL3).
  • said invalidation cassette may be operationally linked to a promoter, a terminator or any other sequence necessary for its expression in a host cell.
  • the invalidation cassette can be amplified according to conventional techniques well known to those skilled in the art, typically by a method chosen from conventional cloning, PCR fusion, or even in vivo cloning by PCR.
  • this invalidation cassette is amplified by PCR, in particular using the sequences represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the invalidation cassette is then introduced by recombination into a strain, in particular of Trichoderma reesei, which does not express a selection marker gene. Those skilled in the art can easily identify the selection marker genes relevant for the implementation of the invention.
  • the variant / mutant strains having incorporated the invalidation cassette are selected according to the expression or not of the selection marker; the clones which have been transformed expressing said selection marker.
  • the mutant strains are identified using the primers of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. These genetic recombination techniques are well known to man. of career.
  • the fungus is a filamentous fungus.
  • the filamentous fungus is chosen from the classes of orbiliomycetes, pezizomycetes, dothideomycetes, eurotiomycetes, lecanoromycetes, leotiomycetes, sordariomycetes and saccharomycetes.
  • the filamentous fungus according to the invention belongs to the class of sordariomycetes, in particular to the genus Trichoderma, and more particularly to the species Trichoderma reesei.
  • the parent strain of Trichoderma reesei can be the strain QM6a (deposited under the number ATCC 13631), or a strain resulting from the natural isolate QM6a (obtained in particular by random or directed mutagenesis), such as the Rut-C30 strain (deposited under the number ATCC 56765), the strain deposited under the number CNCM 1-5221 (deposited on August 3, 2017 with the CNCM, National Collection of Cultures of Microorganisms from the Institut Pasteur, located 25 rue du Do Budapest Roux, F-75724 Paris cedex 15), the strain NG14 (deposited under the number ATCC 56767) or the strain QM9414 (deposited under the number ATCC 26921).
  • the strains according to the invention exhibit a low viscosity phenotype while retaining their ability to produce proteins of interest.
  • the invention also relates to a method of genetic modification of a strain of fungus according to the invention, as mentioned above, comprising a step of invalidating the ID78713 (GEL3) gene.
  • the modification process The genetics of a strain according to the invention thus make it possible to obtain fungus strains that are less viscous compared with the parent fungus strain. This is why the strain according to the invention can be considered as a variant of the parent fungus strain.
  • the fungus strain according to the invention generates a lower viscosity compared to the parent strain for a given shear rate, at the same biomass concentration, and at the same temperature.
  • the step of invalidating the ID78713 (GEL3) gene is carried out using a step of mutagenesis or homologous recombination.
  • the step of invalidating the ID78713 (GEL3) gene is carried out using an invalidation cassette as mentioned above, in particular represented by SEQ ID NO: 1, in a fungus belonging to the species Trichoderma reesei.
  • the present invention also relates to a method for producing mushroom biomass, comprising a step of culturing a strain of fungus according to the invention, in a culture medium comprising a suitable substrate. This step thus allows the growth of the fungus strain according to the invention.
  • suitable substrates for the growth of fungus strains are familiar with suitable substrates for the growth of fungus strains.
  • the present invention also relates to a method for producing proteins of interest, in particular enzymes, comprising a step of culturing a strain of fungus according to the invention, in a culture medium comprising a suitable substrate.
  • the invention thus relates to the use of a strain of fungus according to the invention, for the production of proteins of interest.
  • said method thus comprises a phase of growth of a strain of fungus according to the invention, then a phase of growth and production of proteins of interest by said strain.
  • said growth phase is carried out in the presence of a growth substrate and said phase of growth and production of proteins of interest is carried out in the presence of an inducing substrate.
  • the growth substrate and the inducing substrate are preferably carbonaceous substrates.
  • the carbonaceous growth substrate is preferably chosen from lactose, glucose, xylose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomeric sugars of the enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, and / or a crude extract of water-soluble pentoses from of the pretreatment of a cellulosic biomass.
  • the inducing carbonaceous substrate is thus preferably chosen from lactose, cellobiose, sophorose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomeric sugars of the enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, and / or a crude extract of water-soluble pentoses originating from the pretreatment. cellulosic biomass.
  • the proteins of interest are all the proteins which can be produced by a fungus, naturally or else by genetic modification (for example after transformation using an appropriate vector).
  • the proteins of interest according to the invention are enzymes, in particular cellulolytic enzymes such as cellulases or hemicellulases.
  • the enzymes are cellulases.
  • the term “cellulases” is understood more particularly to mean enzymes chosen from endoglucanases, exoglucanases and glucosidases, and more particularly ⁇ -glucosidase.
  • the term “cellulase” more particularly refers to an enzyme suitable for the hydrolysis of cellulose and allowing microorganisms (such as Trichoderma reesel) which produce them to use cellulose as a source of carbon, by hydrolyzing this polymer into simple sugars. (glucose).
  • cellulases by a strain according to the invention in particular Trichoderma reesei, can be determined by any techniques customary for a person skilled in the art, or alternatively by the techniques described in patents EP 448 430 B1 or EP 2 744 899 B1.
  • a correlation between total secreted proteins and cellulases can be made because in T. reesei, the main exoglucanases (CBHI, CBHII) and endoglucanases (EGI, EGII) can represent up to 90% of the total amount of secreted proteins.
  • CBHI, CBHII main exoglucanases
  • EGI, EGII endoglucanases
  • the present invention also relates to a process for producing bio-based products from cellulosic or lignocellulosic substrates, comprising a step of using the strain of fungus according to the invention, to produce cellulolytic enzymes.
  • the invention therefore also relates to the use of a strain of fungus according to the invention, for the production of bio-based products from cellulosic or lignocellulosic substrates.
  • the present invention relates to a method of producing a biofuel from cellulosic or lignocellulosic substrates, comprising a step of using the strain of fungus according to the invention to produce cellulolytic enzymes.
  • the invention thus relates to the use of a strain of fungus according to the invention, for the production of biofuel from cellulosic or lignocellulosic substrates.
  • biofuel more particularly means a second generation biofuel, that is to say derived from non-food resources.
  • biofuel can also be defined as being any product resulting from the transformation of biomass and which can be used for energy purposes.
  • biogas products which can be incorporated (possibly after subsequent transformation) into a fuel or be a fuel in its own right, such as alcohols (ethanol, butanol and / or isopropanol depending on the type of fermentation organism used), solvents (acetone), acids (butyric), lipids and their derivatives (fatty acids with short or long chains, fatty acid esters), as well as hydrogen.
  • the biofuel according to the invention is an alcohol, for example ethanol, butanol and / or isopropanol. More preferably, the biofuel according to the invention is ethanol. In another embodiment, the biofuel is biogas. In another embodiment, the product is a molecule of interest to the chemical industry, such as, for example, another alcohol such as 1, 2-propane diol, 1, 3-propane diol, 1, 4-butane diol. , 2,3-butanediol, organic acids such as acetic, propionic, acrylic, butyric, succinic, malic, fumaric, citric, itaconic, or hydroxy acids such as glycolic, hydroxypropionic, or lactic acid.
  • another alcohol such as 1, 2-propane diol, 1, 3-propane diol, 1, 4-butane diol.
  • 2,3-butanediol organic acids such as acetic, propionic, acrylic, butyric, succinic, malic, fuma
  • the method of producing a biofuel from cellulosic or lignocellulosic substrates comprises: i) a step of pretreating a cellulosic or lignocellulosic substrate in order to obtain a pretreated substrate , ii) a step of using the strain according to the invention to produce cellulolytic enzymes, iii) a step of enzymatic hydrolysis of the pretreated substrate obtained in step i), in the presence of the cellulolytic enzymes obtained in step ii), in order to obtain a hydrolyzate, iv) a stage of alcoholic fermentation of the hydrolyzate obtained, v) a stage of separation, in particular by distillation.
  • the process for producing a biofuel from cellulosic or lignocellulosic substrates comprises: i) a step of pretreating a cellulosic or lignocellulosic substrate in order to obtain a pretreated substrate, ii) a step of using the strain according to the invention to produce cellulolytic enzymes, iii) a step of enzymatic hydrolysis of the pretreated substrate obtained in step i), in the presence of the cellulolytic enzymes obtained in l step ii), in order to obtain a hydrolyzate, iv) a step of alcoholic fermentation of the hydrolyzate obtained, v) a step of separation, in particular by distillation, said steps iii) and iv) being carried out simultaneously.
  • SSF Simullaneous Saccharification and Fermentation
  • the step of pretreating a cellulosic or lignocellulosic substrate is a step of suspending said cellulosic or lignocellulosic substrate in the aqueous phase.
  • the hydrolyzate obtained in step iii) is a hydrolyzate containing glucose.
  • the alcoholic fermentation step of the hydrolyzate obtained is a fermentation step, in the presence of a fermenting organism, of the glucose obtained from the hydrolyzate so as to produce a fermentation must .
  • a fermentation organism is, for example, a yeast.
  • the separation step is a separation of the biofuel and the fermentation must, in particular by distillation.
  • the cellulosic or lignocellulosic substrate to be hydrolyzed is suspended in the aqueous phase at a rate of 6 to 40% of dry matter, preferably 20 to 30%.
  • the pH is adjusted between 4 and 5.5, preferably between 4.8 and 5.2 and the temperature between 40 ° C and 60 ° C, preferably between 45 ° C and 50 ° C.
  • the hydrolysis reaction is started by adding enzymes which act on the pretreated substrate.
  • the usual amount of enzymes used is 10 to 30 mg of protein excreted per gram of pretreated substrate or less.
  • the reaction generally lasts 15 to 48 hours.
  • the reaction is followed by assaying the sugars released, in particular glucose.
  • the sugar solution is separated from the non-hydrolyzed solid fraction, essentially consisting of lignin, by filtration or centrifugation and then treated in a fermentation unit.
  • the enzymes and the fermenting organism are added simultaneously and then incubated at a temperature between 30 ° C and 35 °. C to produce fermentation must.
  • the cellulose present in the pre-treated substrate is converted into glucose, and at the same time, in the same reactor, the fermentation organism (for example a yeast) converts the glucose into the final product according to a process of SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) known to those skilled in the art.
  • SSF Simultaneous Saccharification and Fermentation
  • the smooth running of the operation may require the addition of a greater or lesser quantity of exogenous cellulolytic mixture.
  • the invention also relates to the use of a strain of fungus according to the invention, for the hydrolysis of cellulose or lignocellulose to glucose.
  • the invention also relates to the use of a strain of fungus according to the invention, to improve the properties of a compatible strain, in particular industrial.
  • FIG. 1 represents the apparent viscosities measured at a shear of 5 s 1 for different strains cultivated in shaken flasks
  • FIG. 2 represents the apparent viscosities measured at a shear of 5s 1 for different strains cultivated in a bioreactor (RutC30 and TR3126 -LGEL3)
  • FIG. 3 represents the apparent viscosities measured at a shear of 5s 1 for different strains cultivated in a bioreactor (CL847 and CL847-AGEZ.3)
  • Example 1a Invalidation of the ID78713 (GEL3) gene in a hyperproductive strain
  • the invalidation cassette for ID78713 (GEL3) consists of the gene for resistance to the antibiotic hygromycin hph placed under the control of the GPDa promoter and the TRPc terminator (Punt and van den Hondel, 1992) with upstream and in downstream the 5 'and 3' flanking regions of the ID78713 gene (GEL3). This sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the DNA cassette has been synthesized and the cassette is inserted into a plasmid pEX-A (available, for example, from Addgene). After amplification and extraction of the plasmid, the invalidation cassette was amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) using the primers p61 and p62 (see Table 2 below).
  • Example 1b Invalidation of the ID78713 (GEL3) gene in a hyperproductive strain
  • a second strain was tested: it is the strain CL847 (Durand H et al.).
  • the transformation of the CL847 strain was carried out by the protoplast method (Penttilà M et al., Doi: 10.1016 / 0378-1119 (87) 90110-7).
  • Example 1a integration at the locus of the invalidation cassette was verified.
  • the strains invalidated for the ID78713 (GEL3) gene thus obtained are called CL847-AGEZ_3.
  • the mobile (rotor) used is a wide stainless steel propeller with a diameter of 38 mm, a height of 32 mm, a pitch of 29 mm and with a ribbon of 8 mm wide.
  • This propeller is used with a bucket (stator) of 45 mm internal diameter and a vertical space between the rotor and the stator of 500 ⁇ m.
  • the propeller is assimilated to a Couette cylinder with a radius of 14 mm.
  • the cup is filled with 70mL of a fermentation wort taken from a reactor (stirred flask, for example as indicated in Example 3, or bioreactor).
  • the viscosity measurements are carried out by a logarithmic sweep of shear rate between 4 s 1 and 100 s 1 , at a temperature of 27 ° C. This range corresponds to the average shear rate expected on an industrial scale.
  • the scan is performed in a round trip (from 4 s 1 to 100 s 1 then from 100 s 1 to 4 s -1 ).
  • the rheology measurements were carried out in duplicate.
  • the cultures in shaken flasks are carried out in Fernbach flasks 19 cm in diameter, containing 400 ml of culture medium, inoculated with spores of different strains from cryotubes, and incubated at 150 rpm and 30 ° C in an Infors Multitron incubator.
  • the culture medium has the following final composition:
  • the pH of the culture medium is adjusted to 6.0 with 30% sodium hydroxide.
  • the components are sterilized for 20 minutes at 121 ° C (the glucose is sterilized separately from the other compounds).
  • Example 4 comparison of viscosities in shaken flask cultures
  • the two strains tested are:
  • Example 5 Culture protocol in a bioreactor
  • the cultures in bioreactors are carried out in fermenters 16 cm in diameter, containing 2 L of culture medium, inoculated at 10% v / v from a preculture produced according to the protocol described in Example 3
  • the stirring is carried out by a Rayneri 8cm turbine. diameter, at a fixed speed of 1000 rpm.
  • the temperature is controlled at 27 ° C, and the pH is controlled at 4.8 by automatic addition of a 5N ammonia solution.
  • the culture medium has the following final composition:
  • the compounds are sterilized for 20 minutes at 121 ° C (the glucose is sterilized separately from the other compounds)
  • Example 6 Comparison of the viscosities in cultures in a bioreactor
  • Example 7 Comparison of the viscosities of two other strains in cultures in a bioreactor

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Abstract

L'invention concerne une souche de champignon ayant une viscosité diminuée, dans laquelle le gène ID 78713 (GEL3) a été invalidé. L'invention concerne également les différentes utilisations de cette souche, ainsi que le procédé de modification génétique.

Description

Description
Titre : SOUCHE DE CHAMPIGNON AYANT UNE VISCOSITE DIMINUEE
[0001] La présente invention concerne une souche de champignon, notamment filamenteux, ayant une viscosité diminuée, dans laquelle le gène ID78713 ( GEL3 ) a été invalidé. L’invention concerne également les différentes utilisations de cette souche, ainsi que le procédé de modification génétique permettant d’obtenir une souche selon l’invention.
Contexte de l’invention
[0002] Les souches de champignon, notamment filamenteux, tel que le champignon Trichoderma reesei, sont aujourd’hui majoritairement utilisées pour la production d’enzymes. Ces enzymes, par exemple les cellulases, sont en effet utilisées pour hydrolyser la biomasse cellulosique ou lignocellulosique en sucres simples. Les enzymes produites par les champignons filamenteux sont donc utiles dans les filières de production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés issus de sucres provenant de biomasse (ligno)cellulosique.
[0003] Afin d’améliorer la production de biocarburants de seconde génération ou encore des produits biosourcés, il a ainsi été envisagé d’améliorer la production de cellulases.
[0004] Par exemple, le brevet EP 448 430 B1 décrit une production industrielle optimisée de cellulases par Trichoderma reesei. Cette production est réalisée en protocole fed-batch (alimentation sans soutirage) en utilisant une solution d'alimentation contenant du lactose comme sucre inducteur de la production de cellulases. Ce procédé de fermentation comprend deux étapes : une première étape de croissance du champignon en présence d’un excès de source carbonée et une deuxième étape de production d’enzymes grâce à l’ajout d’un inducteur dans le milieu avec un débit optimisé. Ces étapes sont réalisées en milieu liquide dans des bioréacteurs sous une agitation et en présence d’oxygène car le champignon est aérobie stricte. Un autre exemple de procédé optimisé de production de cellulases est décrit dans le brevet EP 2 744899 B1.
[0005] En plus de l’optimisation des procédés de production de cellulases, il a également été envisagé de modifier génétiquement les souches de champignons afin de modifier leur capacité de production. Ainsi, la demande de brevet EP 18 197010.4 décrit une souche de Trichoderma reesei hyperproductrice d’enzymes cellulolytiques.
[0006] Des procédés de fermentation et souches utiles pour améliorer la production d’enzymes cellulolytiques par des champignons filamenteux, et ce faisant de produits biosourcés mais également des biocarburants de seconde génération, sont donc déjà décrits dans l’art antérieur.
[0007] Néanmoins, la morphologie des champignons filamenteux industriels a des conséquences non négligeables sur la conception et la conduite des procédés de fermentation car elle augmente la viscosité du milieu de culture. La viscosité a ainsi un effet négatif sur le transfert en oxygène et limite la concentration maximale en champignon qui peut être visée à la fin de l’étape de croissance (et donc par conséquence, ceci limite la quantité d’enzymes cellulolytiques pouvant être produites).
[0008] Afin de pallier ce problème, il a dans un premier temps été envisagé d’agiter les fermenteurs à des vitesses plus importantes. Cependant, l’augmentation de l’agitation n’est pas une solution idéale car cela engendre une dépense énergétique accrue et une augmentation du cisaillement sur le mycélium, ce qui a également un impact négatif sur la production d’enzymes cellulolytiques.
[0009] Il a également été envisagé d’altérer la viscosité de champignons filamenteux en modifiant leur génome. Ces modifications consistent principalement à invalider des gènes, l’absence des protéines ou enzymes produites par ces gènes entraînant un changement dans le fonctionnement des cellules (Bodie et Pratt 2012; Dodge, Virag et Ward 2012).
[0010] Ainsi, Bodie et Pratt ont envisagé dans la demande PCT/US2012/034379 d’invalider le gène mpgl afin d’altérer la viscosité d’une souche de champignon. Des invalidations supplémentaires ont également été envisagées (parmi les gènes sfb3, sebl, gas1, crzl ou encore tps2).
[0011] De leur côté, Dodge, Virag et Ward ont envisagé dans la demande PCT/US2011/049164 d’invalider le gène sfb3.
[0012] Des souches de champignons modifiées génétiquement dans le but d’altérer leur viscosité par rapport à des souches non mutées (i.e. les souches parentes) sont donc déjà décrites dans l’art antérieur. Il est cependant à noter que l’art antérieur est muet quant à des valeurs spécifiques d’amélioration de la viscosité par rapport aux souches parentes.
[0013] Par ailleurs, il existe toujours un besoin pour de nouvelles souches moins visqueuses. De plus, il existe toujours un besoin pour de nouvelles souches plus performantes, permettant une meilleure croissance du champignon par rapport aux souches parentes.
Bref exposé de l’invention
[0014] La présente invention repose ainsi sur les résultats inattendus des inventeurs qui ont mis en évidence que l’invalidation du gène ID78713 (GEL3), dans une souche de champignon (appartenant notamment à la classe des sordariomycètes), permettait d’obtenir une souche ayant une viscosité drastiquement diminuée par rapport à une souche parente dans laquelle ledit gène ID78713 ( GEL3 ) n’a pas été invalidé. Les inventeurs ont en effet mis en évidence que l’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) altérait la viscosité desdits champignons, notamment les champignons filamenteux. L’utilisation d’une telle souche permet ainsi de réduire la viscosité d’un moût de fermentation à iso concentration de champignons (c’est-à-dire pour une même concentration de champignons dans le moût), ce qui permet ainsi de réduire les coûts des procédés de fermentation des champignons filamenteux. Cela permet en outre d’augmenter la productivité du procédé en obtenant des concentrations en champignon plus élevées. En effet la productivité volumique en enzymes est proportionnelle à la concentration en champignon et à la vitesse spécifique de production d’enzymes. Ainsi, le fait d’avoir une souche moins visqueuse permet de monter à des concentrations en champignon plus élevées et d’augmenter la productivité du procédé en enzymes.
[0015] Les inventeurs de la présente invention sont ainsi les premiers à avoir mis en évidence que le gène ID78713 ( GEL3 ) pouvait influencer le phénotype viscosité des souches de champignons. En effet, le gène ID78713 ( GEL3 ) code pour une protéine de la famille 72 des glycosides hydrolases, notamment une 1 ,3^-glucanosyltransferase. Le document Mouyna et al., Microbiology (1998), 144,3171-3180, décrit l’obtention d’un mutant d ’Aspergillus fumigatus (un champignon appartenant à la classe des Eurotiomycetes), dans lequel le gène codant pour une 1 ,3^-glucanosyltransferase BGT1 est invalidé, néanmoins les auteurs en concluent que la souche variante ne présentent pas de phénotype différent pas rapport à la souche parente.
[0016] La présente invention concerne donc une souche de champignon dans laquelle le gène ID78713 (GEL3) a été invalidé.
[0017] La présente invention concerne aussi un procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’invention, comprenant une étape d’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ).
[0018] La présente invention concerne aussi un procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
[0019] La présente invention concerne également un procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
[0020] La présente invention concerne en outre un procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques.
[0021] La présente invention concerne aussi un procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques.
[0022] La présente invention concerne également différentes utilisations de la souche selon l’invention, pour la production de protéines d’intérêt, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose, pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, ou encore pour la production de biocarburant. [0023] Enfin, la présente invention concerne l’utilisation d'une souche de champignon selon l’invention, pour améliorer les propriétés d’une souche compatible, notamment industrielle.
Exposé de l’invention
[0024] Dans un premier aspect, la présente invention concerne ainsi une souche de champignon dans laquelle le gène ID78713 ( GEL3 ) a été invalidé. Ainsi, dans la souche selon l’invention, le gène ID78713 ( GEL3 ) n’est plus fonctionnel. Cela signifie également que dans la souche selon l’invention le gène ID78713 ( GEL3 ) est invalidé. La présente invention concerne ainsi une souche variante de champignon, dans laquelle le gène ID78713 ( GEL3 ) a été invalidé. En d’autres termes, cela signifie par exemple que dans la souche selon l’invention la protéine correspondant au gène ID78713 ( GEL3 ) n’est pas produite. Alternativement, la protéine correspondant au gène ID78713 ( GEL3 ) peut être produite, mais elle n’est pas fonctionnelle.
[0025] Selon l’invention, le terme « souche variante » s’entend d’une souche modifiée génétiquement par rapport à une souche parente. Selon l’invention, le terme « souche parente » s’entend ainsi d’une souche dont est issue ou dérivée la souche variante, et dans laquelle le gène ID78713 ( GEL3 ) n’a pas été invalidé. La souche selon l’invention correspond ainsi à une souche variante dérivée d’une souche parente, ladite souche variante possédant une viscosité diminuée par rapport à la souche parente et ladite souche variante comprenant au moins une modification génétique correspondant à l’invalidation du gène ID78713 (GEL3).
[0026] Selon l’invention, le terme « gène fonctionnel » s’entend notamment d’un gène qui permet de produire une protéine fonctionnelle.
[0027] Selon l’invention, le terme « protéine fonctionnelle » s’entend notamment d’une protéine qui possède une activité, par exemple avec la protéine codée par le gène ID78713 ( GEL3 ) une activité de glycoside hydrolase.
[0028] Selon l’invention, ladite souche de champignon possède une viscosité diminuée par rapport à une souche parente dans laquelle le gène ID78713 ( GEL3 ) n’a pas été invalidé. Selon un mode de réalisation préféré, la souche de champignon a une viscosité au moins 3 fois plus faible par rapport à la souche parente, plus particulièrement au moins 8 ou 10 fois plus faible,
[0029] L’expression « une viscosité diminuée par rapport à la souche parente » signifie que la souche variante a une viscosité inférieure à celle de la souche parente. L’homme du métier sait que la viscosité de la souche variante selon l’invention et celle de la souche parente doivent être comparée pour une même concentration en champignon dans le moût de fermentation.
[0030] Selon l’invention la viscosité est préférentiellement mesurée par la méthode décrite dans l’Exemple 2, également décrite dans la publication Hardy et al., Rhéologie, Vol. 27, 43-48 (2015), ou encore à l’aide des paramètres suivants (dénommé par exemple Test A) :
- le mobile (rotor) utilisé est une hélice d’un diamètre de 38 mm, d’une hauteur de 32 mm, d’un pas de 29 mm et avec un ruban de 8 mm de largeur ; - un godet (stator) de 45 mm de diamètre intérieur ;
- un espace vertical entre le rotor et le stator de 500 miti ; et du protocole suivant :
- remplissage du godet avec 70 ml_ d’un milieu dont on souhaite mesurer la viscosité ;
- mesures de viscosité par un balayage logarithmique de taux de cisaillements compris entre 4 s 1 et 100 s 1 , puis de 100 s 1 à 4 s i , à une température de 27°C ;
- optionnellement, réalisation des mesures en duplicate.
[0031] Préférentiellement, la viscosité selon l’invention est mesurée à l’aide d’un rhéomètre AR2000 de TA Instruments, notamment par un balayage logarithmique de taux de cisaillements compris entre 4 et 100 s 1 à une température de 27°C, encore plus préférentiellement à l’aide d’un balayage réalisé en un aller-retour (de 4 s 1 à 100 s 1 puis de 100 s 1 à 4 s 1). Selon un mode de réalisation, la souche selon l’invention a une viscosité d’environ 1.5 Pa.s, telle que mesurée à 27°C, à l’aide d’un rhéomètre AR2000 de TA Instruments par balayage logarithmique à un taux de cisaillements de 5 s 1, lorsque la concentration en champignon est d’environ 35 g/L. La « concentration en champignon » s’entend de la concentration dans le milieu dans lequel la viscosité est mesurée. Typiquement le milieu correspond à un moût de fermentation. Selon l’invention le terme « environ » signifie que les valeurs ne doivent pas être comprises comme des valeurs strictes. Ainsi, « environ 1.5 Pa.s » s’entend des valeurs comprises entre 1.45 Pa.s à 1.55 Pa.s, et « environ 35 g/L » s’entend des valeurs comprises entre 34.5 g/L à 35.5 g/L.
[0032] Selon l’invention, et dans un autre mode de réalisation particulier, la souche selon l’invention a une viscosité diminuée d’au moins 50% par rapport à une souche parente. Selon l’invention le terme « au moins 50% » signifie toutes les valeurs comprises entre 50% et 100%, notamment les valeurs de 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%. Préférentiellement, la souche selon l’invention a une viscosité diminuée d’au moins 65% par rapport à une souche parente. L’homme du métier sait calculer un pourcentage de diminution. Un tel taux de diminution peut par exemple se calculer selon la formule suivante : ((valeur finale - valeur initiale)/valeur initiale)*100.
[0033] Le gène GEL3 (également nommé ID 78713 dans le génome de référence de Trichoderma reesei, voir htfps://www.uniprot.ora/uniprot/G0RL27) code pour une protéine qui appartient à la famille 72 des glycosides hydrolases. Ces enzymes sont par exemple des b-1 ,3- glucanosyltransglycosylases qui interviennent dans la biogénèse de la paroi cellulaire chez les champignons. Selon l’invention le terme ID 78713 est préféré au terme GEL3.
[0034] Selon l’invention, le gène ID78713 ( GEL3 ) est représenté par la SEQ ID NO : 2, mais peut également correspondre à un variant de ce gène ou à un gène orthologue. Préférentiellement, le gène ID78713 ( GEL3 ) est uniquement représenté par la SEQ ID NO : 2. [0035] Selon l’invention, « un variant de gène ou un gène orthologue » s’entend d’un gène qui code également pour une protéine qui appartient à la famille 72 des glycosides hydrolases. Le variant du gène ID78713 ( GEL3 ) ou un gène orthologue du gène ID78713 ( GEL3 ) est typiquement représenté par une séquence ayant au moins 80% d’identité avec le gène de SEQ ID NO : 2. Le variant du gène ID78713 ( GEL3 ) ou un gène orthologue du gène ID78713 ( GEL3 ) correspond ainsi à un gène dérivé de la séquence représentée par SEQ ID NO : 2. Plus particulièrement, le variant du gène ID78713 ( GEL3 ) ou un gène orthologue du gène ID78713 ( GEL3 ) est représenté par une séquence ayant au moins 90% d’identité avec le gène de SEQ ID NO : 2, notamment au moins 95%, de préférence au moins 98% ou 99%.
[0036] Le gène ID78713 ( GEL3 ) est représenté par la SEQ ID NO : 2, et la protéine codée par le gène ID78713 ( GEL3 ) est représentée par la SEQ ID NO : 3. Ainsi, le variant du gène ID78713 (GEL3) ou un gène orthologue du gène ID78713 ( GEL3 ) code soit pour la protéine de SEQ ID NO : 3, soit pour une séquence ayant au moins 80% d’identité avec ladite SEQ ID NO : 3, notamment au moins 90%, plus particulièrement au moins 95%, 98% ou 99%.
[0037] Selon l’invention le terme « au moins 80% » signifie toutes les valeurs comprises entre 80% et 100%, notamment les valeurs de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%. L’homme du métier sait calculer un pourcentage d’identité entre deux séquences. Par exemple, selon l’invention, le pourcentage d'identité d'une séquence donnée par rapport à SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3 s’entend du pourcentage d’identité sur la longueur totale des séquences. Le pourcentage correspond ainsi au nombre de nucléotides/résidus identiques entre cette séquence donnée et SEQ ID NO : 2 ou 3 divisé par le nombre de nucléotides ou résidus dans la plus longue des deux séquences.
[0038] Ainsi, dans un mode de réalisation, dans ladite souche selon l’invention, le gène ID78713 (GEL3) invalidé correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO : 2 ou à un gène ayant au moins 80% d’identité avec le gène de SEQ ID NO : 2, notamment au moins 90% et plus particulièrement au moins 95%. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, dans ladite souche selon l’invention, le gène ID78713 ( GEL3 ) invalidé correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO : 2. Selon ce dernier mode de réalisation, la souche selon l’invention comprend ainsi une délétion du gène codant pour la protéine représentée par la SEQ ID NO : 3.
[0039] Dans un aspect préféré, dans la souche selon l’invention, le gène ID78713 ( GEL3 ) a été invalidé par mutagénèse ou par recombinaison homologue. Selon l’invention, l’invalidation consiste en une délétion de tout ou partie du gène ID78713 (GEL3). Préférentiellement, dans la souche selon l’invention, le gène ID78713 ( GEL3 ) a été invalidé à l’aide d’une cassette d’invalidation. Encore plus préférentiellement, ladite cassette d’invalidation est représentée par la SEQ ID NO : 1 , et est notamment utilisée chez un champignon appartenant à l’espèce Trichoderma reesei.
[0040] La mutagénèse est une technique communément utilisée en génie génétique. Elle vise à introduire volontairement des mutations dans l’ADN afin de créer des gènes génétiquement modifiés. Selon l’invention, la mutagénèse s’entend plus particulièrement de la mutagénèse dirigée. La mutagénèse dirigée permet en effet d’introduire des mutations identifiées dans un gène précis. Pour ce faire, l’ADN d’intérêt (ici le gène ID78713 ( GEL3 )) contenant les mutations est synthétisé puis introduit dans la cellule à muter, typiquement à l’aide d’un vecteur, où le mécanisme de réparation de l’ADN s’occupe de l’intégrer dans le génome.
[0041] La recombinaison homologue est une technique communément utilisée en génie génétique qui consiste à un échange entre molécules d’ADN, typiquement à l’aide d’un vecteur.
[0042] Le terme « vecteur » s’entend de toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC), les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage P1 (PAC), les vecteurs dérivés de virus. Le vecteur selon l'invention permet l'introduction d'une mutation ou d'une délétion.
[0043] Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette d’invalidation comprend trois fragments d'ADN :
(1) une région en amont du gène cible,
(2) un marqueur de sélection, et
(3) une région en aval du gène cible.
[0044] Dans le cas de la présente invention, le « gène cible » s’entend du gène ID78713 (GEL3). Les régions en amont et en aval du gène cible sont deux éléments de recombinaison, un à chaque extrémité du gène, et sont nécessaires pour cibler de façon précise la séquence à invalider.
[0045] Selon l’invention, la région en amont du gène cible (c’est-à-dire la séquence 5’ en amont du gène ID78713 ( GEL3 )) est notamment représentée par la séquence de SEQ ID NO : 10.
[0046] Selon l’invention, la région en aval du gène cible (c’est-à-dire la séquence 3’ en aval du gène ID78713 ( GEL3 )) est notamment représentée par la séquence de SEQ ID NO : 12.
[0047] L’expression « marqueur de sélection » s’entend d’un gène dont l’expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. L’utilisation d’un marqueur de sélection permet en effet d’identifier les cellules ayant intégré une modification génétique par rapport à celles qui ne l’ont pas intégrée. Il s’agit par exemple d’un gène de résistance aux antibiotiques, notamment le gène de résistance à l’antibiotique hygromycine hph, tel que représenté par la SEQ ID NO : 11.
[0048] Plus précisément, selon l’invention, la cassette d’invalidation est préférentiellement constituée d’un gène de résistance placé sous le contrôle d’un promoteur et d’un terminateur, avec en amont et en aval les régions flanquantes 5’ et 3’ du gène ID78713 (GEL3). Encore plus préférentiellement, selon l’invention, la cassette d’invalidation est constituée d’un gène de résistance à l’antibiotique hygromycine hph placé sous le contrôle du promoteur GPDa et du terminateur TRPc (Punt et van den Hondel, 1992) avec en amont et en aval les régions flanquantes 5’ et 3’ du gène ID78713 (GEL3). Selon l’invention, ladite cassette d’invalidation pourra être liée opérationnellement à un promoteur, un terminateur ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans une cellule hôte.
[0049] La cassette d’invalidation peut être amplifiée selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier, typiquement par une méthode choisie parmi le clonage classique, la fusion PCR, ou encore le clonage in vivo par PCR. Préférentiellement, cette cassette d’invalidation est amplifiée par PCR, notamment à l’aide des séquences représentée par les SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5. Le cassette d’invalidation est ensuite introduite par recombinaison dans une souche, notamment de Trichoderma reesei, qui n'exprime pas un gène du marqueur de sélection. L'homme du métier peut aisément identifier les gènes de marqueur de sélection pertinents pour la mise en œuvre de l'invention. Après culture, les souches variantes/mutantes ayant incorporé la cassette d’invalidation sont sélectionnées en fonction de l'expression ou non du marqueur de sélection; les clones ayant été transformés exprimant ledit marqueur de sélection. Il s’agit des souches selon l’invention. Préférentiellement, les souches mutantes sont identifiées à l’aide des amorces de SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8 et SEQ ID NO : 9. Ces techniques de recombinaison génétiques sont bien connues de l’homme du métier. Dans un aspect préféré, selon l’invention, le champignon est un champignon filamenteux. Encore plus préférentiellement, le champignon filamenteux est choisi parmi les classes des orbiliomycètes, des pézizomycètes, des dothideomycètes, des eurotiomycètes, des lecanoromycètes, des léotiomycètes, des sordariomycètes et des saccharomycètes. De façon avantageuse, le champignon filamenteux selon l’invention appartient à la classe des sordariomycètes, notamment au genre Trichoderma, et plus particulièrement à l’espèce Trichoderma reesei.
[0050] Lorsque le champignon appartient à l’espèce Trichoderma reesei, selon l’invention, la souche parente de Trichoderma reesei peut être la souche QM6a (déposée sous le numéro ATCC 13631), ou encore une souche issue de l’isolat naturel QM6a (notamment obtenue par mutagénèse aléatoire ou dirigée), telle que la souche Rut-C30 (déposée sous le numéro ATCC 56765), la souche déposée sous le numéro CNCM 1-5221 (déposée le 03 août 2017 auprès de la CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l’Institut Pasteur, située 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15), la souche NG14 (déposée sous le numéro ATCC 56767) ou encore la souche QM9414 (déposée sous le numéro ATCC 26921). Typiquement, les souches selon l’invention présentent un phénotype de faible viscosité tout en conservant leur capacité à produire des protéines d’intérêt.
[0051] Dans un deuxième aspect, l’invention concerne également un procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’invention, telle que mentionné ci-dessus, comprenant une étape d’invalidation du gène ID78713 (GEL3). Le procédé de modification génétique d’une souche selon l’invention permet ainsi d’obtenir des souches de champignon moins visqueuses par rapport à la souche de champignon parent. C’est pourquoi la souche selon l’invention peut être considérée comme un variant de la souche de champignon parent. Ainsi, durant sa croissance, la souche de champignon selon l’invention génère une viscosité moins élevée par rapport à la souche parente pour un taux de cisaillement donné, à même concentration en biomasse, et à même température.
[0052] Préférentiellement, dans ledit procédé de modification génétique selon l’invention, l’étape d’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) est réalisée à l’aide d’une étape de mutagénèse ou de recombinaison homologue. Encore plus préférentiellement, dans ledit procédé de modification génétique selon l’invention, l’étape d’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) est réalisée à l’aide d’une cassette d’invalidation telle que mentionnée ci-dessus, notamment représentée par la SEQ ID NO : 1 , chez un champignon appartenant à l’espèce Trichoderma reesei.
[0053] Dans un troisième aspect, la présente invention concerne aussi un procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié. Cette étape permet ainsi la croissance de la souche de champignon selon l’invention. L’homme du métier connaît les substrats appropriés à la croissance des souches de champignon.
[0054] Dans un quatrième aspect, la présente invention concerne également un procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’invention, dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié. L’invention concerne ainsi l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production de protéines d’intérêt.
[0055] De façon avantageuse, ledit procédé comprend ainsi une phase de croissance d’une souche de champignon selon l’invention, puis une phase de croissance et de production de protéines d’intérêt par ladite souche. Encore plus préférentiellement, ladite phase de croissance est réalisée en présence d’un substrat de croissance et ladite phase de croissance et de production de protéines d’intérêt est réalisée en présence d’un substrat inducteur. Le substrat de croissance et le substrat inducteur sont de préférence des substrats carbonés.
[0056] Ainsi, le substrat carboné de croissance est choisi de préférence parmi le lactose, le glucose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique.
[0057] Le substrat carboné inducteur est ainsi choisi de préférence parmi le lactose, le cellobiose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, et/ou un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d’une biomasse cellulosique. [0058] Selon l’invention, les protéines d’intérêt sont toutes les protéines pouvant être produites par un champignon, de façon naturelle ou bien par modification génétique (par exemple après transformation à l’aide d’un vecteur approprié).
[0059] De façon avantageuse, les protéines d’intérêt selon l’invention sont des enzymes, notamment des enzymes cellulolytiques telles que des cellulases ou des hémicellulases. De façon préférée, les enzymes sont des cellulases. Selon l’invention, le terme « cellulases » s’entend plus particulièrement des enzymes choisies parmi les endoglucanases, les exoglucanases et les glucosidases, et plus particulièrement la b-glucosidase. Le terme « cellulase » fait plus particulièrement référence à une enzyme adaptée à l'hydrolyse de la cellulose et permettant aux microorganismes (tels que Trichoderma reesel) qui les produisent d'utiliser la cellulose comme source de carbone, en hydrolysant ce polymère en sucres simples (glucose). La production de cellulases par une souche selon l’invention, notamment Trichoderma reesei, peut être déterminée par toutes techniques usuelles pour l’homme du métier, ou encore par les techniques décrites dans les brevets EP 448430 B1 ou EP 2 744899 B1 .
[0060] Une corrélation entre protéines totales sécrétées et cellulases peut être faite car chez T. reesei, les exoglucanases (CBHI, CBHII) et les endoglucanases (EGI, EGII) principales peuvent représenter jusqu’à 90% de la quantité totale de protéines sécrétées (voir par exemple Markov, A.V., Gusakov, A.V., Kondratyeva, E.G., Okunev, O. N., Bekkarevich, A. O., and Sinitsyn, A.P. (2005). New Effective Method for Analysis of the Component Composition of Enzyme Complexes from Trichoderma reesei. Biochemistry (Moscow) 70, 657-663).
[0061] Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne également un procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention, pour produire des enzymes cellulolytiques. L’invention concerne donc également l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production de produits biosourcés à partir de de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
[0062] Dans un sixième aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques. L’invention concerne ainsi l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour la production de biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
[0063] Selon l’invention, le terme « biocarburant » s’entend plus particulièrement d’un biocarburant de seconde génération, c’est-à-dire issu de ressources non alimentaires. Selon l’invention, le terme « biocarburant » peut également être défini comme étant tout produit issu de la transformation de la biomasse et pouvant être utilisé à des fins énergétiques. D’une part et sans vouloir se limiter, on peut citer à titre d’exemple des biogaz, des produits pouvant être incorporés (éventuellement après transformation ultérieure) à un carburant ou être un carburant à part entière, tels que des alcools (l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol selon le type d’organisme fermentaire utilisé), des solvants (acétone), des acides (butyrique), des lipides et leurs dérivés (acides gras à courtes ou longues chaînes, esters d’acides gras), ainsi que l’hydrogène. De manière préférée, le biocarburant selon l’invention est un alcool, par exemple l’éthanol, le butanol et/ou l’isopropanol. Plus préférentiellement, le biocarburant selon l’invention est l’éthanol. Dans un autre mode de réalisation, le biocarburant est du biogaz. Dans un autre mode de réalisation, le produit est une molécule intéressant l'industrie chimique, comme par exemple, un autre alcool tel que le 1 ,2- propane diol, le 1 ,3-propane diol, le 1 ,4-butane diol, le 2,3-butane diol, des acides organiques comme l'acide acétique, propionique, acrylique, butyrique, succinique, malique, fumarique, citrique, itaconique, ou des hydroxyacides comme l'acide glycolique, hydroxypropionique, ou lactique.
[0064] Dans un aspect préféré, le procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon l’invention, comprend : i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité, ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques, iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat, iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, v) une étape de séparation, notamment par distillation.
[0065] Dans un aspect encore plus préféré, le procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon l’invention, comprend : i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité, ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’invention pour produire des enzymes cellulolytiques, iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité obtenu à l’étape i), en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii), afin d’obtenir un hydrolysat, iv) une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, v) une étape de séparation, notamment par distillation, lesdites étapes iii) et iv) étant réalisées simultanément. Cela est typiquement le cas dans les procédés de production dits « SSF » (Simullaneous Saccharification and Fermentation).
[0066] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique est une étape de mise en suspension en phase aqueuse dudit substrat cellulosique ou lignocellulosique.
[0067] Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolysat obtenu à l’étape iii) est un hydrolysat contenant du glucose. [0068] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu est une étape de fermentation, en présence d'un organisme fermentaire, du glucose issu de l'hydrolysat de manière à produire un moût de fermentation. Un organisme fermentaire est par exemple une levure.
[0069] Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de séparation est une séparation du biocarburant et du moût de fermentation, notamment par distillation.
[0070] Selon un mode de réalisation encore plus préféré, le substrat cellulosique ou lignocellulosique à hydrolyser est mis en suspension en phase aqueuse à raison de 6 à 40% de matière sèche, de préférence 20 à 30%. Le pH est ajusté entre 4 et 5,5, de préférence entre 4,8 et 5,2 et la température entre 40°C et 60°C, de préférence entre 45°C et 50°C. La réaction d'hydrolyse est démarrée par l'ajout des enzymes agissant sur le substrat prétraité. La quantité d’enzymes habituellement utilisée est de 10 à 30 mg de protéines excrétées par gramme de substrat prétraité ou moins. La réaction dure généralement de 15 à 48 heures. La réaction est suivie par dosage des sucres libérés, notamment le glucose. La solution de sucres est séparée de la fraction solide non hydrolysée, essentiellement constituée de lignine, par filtration ou centrifugation et ensuite traitée dans une unité de fermentation.
[0071] Selon un autre mode de réalisation encore plus préféré, lorsque l’étape d’hydrolyse et de fermentation sont réalisées conjointement, les enzymes et l'organisme fermentaire sont ajoutés simultanément puis incubés à une température comprise entre 30°C et 35°C pour produire un moût de fermentation. Selon ce mode de réalisation, la cellulose présente dans le substrat pré-traité est convertie en glucose, et en même temps, dans le même réacteur, l'organisme fermentaire (par exemple une levure) convertit le glucose en produit final selon un procédé de SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) connu de l'homme du métier. Selon les capacités métaboliques et hydrolytiques de l'organisme fermentaire, le bon déroulement de l'opération peut nécessiter l'addition d'une quantité plus ou moins importante de mélange cellulolytique exogène.
[0072] Dans un septième aspect, l’invention concerne également l’utilisation d’une souche de champignon selon l’invention, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose.
[0073] Dans un huitième aspect, l’invention concerne également l’utilisation d'une souche de champignon selon l’invention, pour améliorer les propriétés d’une souche compatible, notamment industrielle.
[0074] Dans la présente description, les définitions et préférences indiquées dans un aspect s’appliquent mutatis mutandis aux autres aspects. Par exemples, toutes les définitions et préférences indiquées dans le premier aspect de l’invention ci-dessus s’appliquent également aux deuxième, troisième, quatrième, cinquième, sixième, septième et huitième aspect.
Brève description des Figures [0075] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées.
Fig. 1
[0076] [Fig. 1] représente les viscosités apparentes mesurées à un cisaillement de 5 s 1 pour différentes souches cultivées en fioles agitées
Fig. 2
[0077] [Fig. 2] représente les viscosités apparentes mesurées à un cisaillement de 5s 1 pour différentes souches cultivées en bioréacteur (RutC30 et TR3126 -LGEL3)
Fig. 3 [0078] [Fig. 3] représente les viscosités apparentes mesurées à un cisaillement de 5s 1 pour différentes souches cultivées en bioréacteur (CL847 et CL847-AGEZ.3)
Séquences de la présente invention
[0079] [Tableau 1]
Liste des références citées dans la présente demande de brevet
[0080] Durand H, Clanet M, Tiraby G. Genetic improvement of Trichoderma reesei for large scale cellulase production. Enzyme Microb Technol 1988, 10:341-346. [0081] Guangtao Z, Hartl L, Schuster A, Polak S, Schmoll M, Wang T, Seidl V, Seiboth B.,
(2009). Gene targeting in a nonhomologous end joining déficient Hypocrea jecorina. J Biotechnol. 139(2):146-51.
[0082] Montenecourt, B. S.; Eveleigh, D. E. (1977) Semiquantitative Plate Assay for
Détermination of Cellulase Production by Trichoderma viride. In : Applied and environmental microbiology, vol. 33, n° 1 , p. 178-183
[0083] Penttilà M, Nevalainen H, Ràtto M, Salminen E, Knowles J., (1987). A versatile transformation System for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene. 61(2):155- 64.
[0084] Punt, P. J.; van den Hondel, C. A., (1992) Transformation of filamentous fungi based on hygromycin B and phleomycin résistance markers. In : Methods in enzymology, vol. 216, p. 447- 457. [0085] Te'o VS, Bergquist PL, Nevalainen KM. ,(2002). Biolistic transformation of Trichoderma reesei using the Bio-Rad seven barrels Hepta Adaptor System. J Microbiol Methods. 51(3):393-9.
Exemples
[0086] Exemple 1a : Invalidation du gène ID78713 (GEL3) dans une souche hyperproductrice
[0087] La cassette d’invalidation pour ID78713 ( GEL3 ) est constituée du gène de résistance à l’antibiotique hygromycine hph placé sous le contrôle du promoteur GPDa et du terminateur TRPc (Punt et van den Hondel, 1992) avec en amont et en aval les régions flanquantes 5’ et 3’ du gène ID78713 ( GEL3 ). Cette séquence est représentée en SEQ ID NO : 1. La cassette d’ADN a été synthétisée et la cassette est insérée dans un plasmide pEX-A (disponible par exemple auprès d’Addgene). Après amplification et extraction du plasmide, la cassette d’invalidation a été amplifiée par PCR (Polymerase Chain Reaction) à l’aide des amorces p61 et p62 (voir le Tableau 2 ci-après).
[0088] [Tableau 2]
[0089] Séquences des amorces de la présente invention [0090] La souche utilisée pour la transformation est la souche hyperproductrice RutC30
(Montenecourt et Eveleigh, 1977) dont le gène KU70 (ID 63200) a été invalidé en remplaçant la séquence codante par le gène codant pour le marqueur de sélection AmdS (Pentillà et al., 1987). L’invalidation de ce gène favorise la recombinaison homologue (Guangtao et al., 2009). Cette souche est appelée TR3126. [0091] Les transformations de la souche TR3126 avec la cassette représentée par la SEQ ID
NO : 1 ont été effectuées par Biolistique (Te'o et al., 2002) en utilisant 5 pg de cassette purifiée. L’intégration au locus de la cassette d’invalidation a été vérifiée par PCR avec une amorce (p91) en amont de la cassette et une amorce (p78) dans le gène hph (vérification 5’) et une amorce (p92) en aval de la cassette et une amorce (p79) dans le gène hph (vérification 3’). Les souches invalidées pour le gène ID78713 ( GEL3 ) ainsi obtenues sont nommées TR3126 -l GEL3.
[0092] Exemple 1b : Invalidation du gène ID78713 { GEL3 ) dans une souche hyperproductrice
[0093] Une deuxième souche a été testée : il s’agit de la souche CL847 (Durand H et al.). [0094] La transformation de la souche CL847 a été effectué par la méthode des protoplastes (Penttilà M et al., doi: 10.1016/0378-1119(87)90110-7). De façon similaire à l’exemple 1a, l’intégration au locus de la cassette d’invalidation a été vérifiée. Les souches invalidées pour le gène ID78713 (GEL3) ainsi obtenues sont nommées CL847-AGEZ_3.
[0095] Exemple 2 : Méthode de mesure de la viscosité
[0096] Pour la mesure de rhéologie, le mobile (rotor) utilisé est une hélice large en acier inoxydable d’un diamètre de 38 mm, d’une hauteur de 32 mm, d’un pas de 29 mm et avec un ruban de 8 mm de largeur. Cette hélice est utilisée avec un godet (stator) de 45 mm de diamètre intérieur et un espace vertical entre le rotor et le stator de 500 pm. Après calibration, l’hélice est assimilée à un cylindre de Couette d’un rayon de 14 mm.
[0097] Le godet est rempli avec 70mL d’un moût de fermentation prélevé dans un réacteur (fiole agitée, par exemple comme indiqué dans l’Exemple 3, ou bioréacteur). Les mesures de viscosité sont réalisées par un balayage logarithmique de taux de cisaillements compris entre 4 s 1 et 100 s 1, à une température de 27°C. Cette gamme correspond au taux de cisaillement moyen attendu à l’échelle industrielle. Le balayage est réalisé en un aller-retour (de 4 s 1 à 100 s 1 puis de 100 s 1 à 4 s-1). Les mesures de rhéologie ont été effectuées en duplicate.
[0098] Toutes les mesures ont été effectuées sur le rhéomètre AR2000 de TA Instruments.
[0099] Exemple 3 : Protocole de culture en fioles agitées
[0100] Les cultures en fioles agitées sont réalisées dans des fioles de Fernbach de 19 cm de diamètre, contenant 400mL de milieu de culture, ensemencées avec des spores de différentes souches à partir de cryotubes, et mises en incubation à 150 rpm et 30°C dans un incubateur Infors Multitron.
[0101] Le milieu de culture possède la composition finale suivante :
- 5,6 g/L de (NH4)2S04
- 4,4 g/L de K2HP04
- 0,3 g/L de MgS0 ,7H20 - 0,15 g/L de CaCI2,2H20
- 1 mL/L de solution d’oligo éléments (FeS04 : 5 g/L, MnS04 : 1 ,4 g/L, ZnS04 : 1 ,4 g/L, CoCI2 : 3,7 g/i)
- 5,85 g/L de BTCA (butane tetracarboxylic acid)
- 3,0 g/L de KOH en cristaux
- 1 ,5 g/L de cornsteep (par exemple Roquette Solulys®)
- 30 g/L de glucose
[0102] Le pH du milieu de culture est ajusté à 6.0 avec de la soude 30%. [0103] Les composants sont stérilisés durant 20 minutes à 121°C (le glucose est stérilisé séparément des autres composés).
[0104] Des prélèvements réguliers de 2 mL sont effectués pour suivre le glucose résiduel. Puis quand le glucose résiduel est inférieur à 5 g/L (ce qui correspond à une concentration en champignon de l’ordre de 10g/L), un prélèvement de 100mL est effectué pour mesurer précisément la concentration en champignon (par filtration puis séchage sur filtres de 1 ,2pm) et la viscosité du moût (selon la méthode décrite dans l’exemple 2).
[0105] Exemple 4 : comparaison des viscosités dans des cultures en fiole agitées
[0106] Deux souches ont été cultivées en duplicate selon la méthode décrite dans l’Exemple 3, puis la viscosité du moût de fermentation a été caractérisée selon la méthode décrite dans l’Exemple 2 :
[0107] Les deux souches testées sont :
- La souche TR3126 -AGEL3 présentant l’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) ;
- La souche parente TR3126 utilisée comme contrôle de viscosité forte [0108] Les mesures de concentration en champignons montrent que les concentrations sont du même ordre dans toutes les cultures réalisées, autour de 10g/L de champignon en suspension (voir le Tableau 3 ci-dessous).
[0109] [Tableau 3] [0110] Concentration en champignon pour les souches testées (expériences réalisées en duplicate)
[0111] Les mesures de viscosité (présentées en Figure 1) montrent que l’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) a entraîné une baisse drastique de la viscosité. A un cisaillement de 5 s 1, la viscosité obtenue pour la souche TR3126 -LGEL3 est environ 8 à 10 fois plus faible que celle du témoin visqueux (TR3126).
[0112] Exemple 5 : Protocole de culture en bioréacteur
[0113] Les cultures en bioréacteurs sont réalisées dans des fermenteurs de 16 cm de diamètre, contenant 2L de milieu de culture, ensemencés à 10%v/v à partir d’une pré-culture réalisée selon le protocole décrit dans l’Exemple 3. L’agitation est effectuée par une turbine Rayneri de 8cm de diamètre, à une vitesse fixe de 1000 rpm. La température est contrôlée à 27°C, et le pH est contrôlé à 4,8 par ajout automatique d’une solution d’ammoniaque à 5N.
[0114] Le milieu de culture possède la composition finale suivante :
- 3 mL/L d’acide orthophosphorique à 85%
- 0,25 mL/L d’acide sulfurique à 96%
- 1 ,66 g/L de potasse KOH en cristaux
- 2,8 -0,6
- 0,6
- 0,12 g/L de Na2HP0 ,12H20
- 1 mL/L de solution d’oligos éléments (FeS04 : 5 g/L, MnS04 : 1 ,4 g/L, ZnS04 : 1 ,4 g/L, CoCI2 : 3,7 g/i)
- 1 g/L de cornsteep (par exemple Roquette Solulys®)
- 80 g/L de glucose
[0115] Les composés sont stérilisés durant 20 minutes à 121°C (le glucose est stérilisé séparément des autres composés)
[0116] Le pH du milieu de culture est ajusté puis contrôlé à 4,8 avec la solution d’ammoniaque servant au contrôle du pH
[0117] Des prélèvements réguliers d’environ 100 mL sont effectués pour : (i) suivre le glucose résiduel, (ii) mesurer précisément la concentration en champignon (par filtration puis séchage sur filtres de 1 ,2pm) et (iii) mesurer la viscosité du moût (selon la méthode décrite dans l’Exemple 2).
[0118] Exemple 6 : Comparaison des viscosités dans des cultures en bioréacteur
[0119] Deux souches ont été cultivées en duplicate selon la méthode décrite dans l’Exemple 5, et la viscosité du moût de fermentation a été caractérisée (pour différentes concentrations en champignon dans le moût) selon la méthode décrite dans l’Exemple 2 :
- La souche TR3126 -AGEL3 présentant l’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 )
- La souche de référence Rut-C30 (utilisée comme contrôle de viscosité forte)
La caractérisation de la viscosité à différentes concentrations en champignon montre un réel avantage apporté par l’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) (voir la Figure 2) avec :
- comme en fioles agitées, une viscosité environ 10 fois plus faible quand la concentration en champignon est de l’ordre de 10 g/L ;
- une viscosité environ 3 fois plus faible quand la concentration est de l’ordre de 25 g/L ;
- la viscosité de la souche invalidée pour ID78713 ( GEL3 ) (TR3126-AGEL3) à 35g/L du même ordre que la viscosité de la souche sauvage (Rut-C30) à 15 g/L. [0120] Ainsi, une culture de la souche invalidée pour ID78713 ( GEL3 ) à 35g/L ne demande pas plus d’énergie pour l’agitation qu’une culture de la souche sauvage à 15g/L, ce qui permet d’augmenter la productivité de la culture à même dépense énergétique.
[0121] Exemple 7 : Comparaison des viscosités de deux autres souches dans des cultures en bioréacteur
[0122] Deux souches ont été cultivées selon la méthode décrite dans l’Exemple 5, et la viscosité du moût de fermentation a été caractérisée (pour différentes concentrations en champignon dans le moût) selon la méthode décrite dans l’Exemple 2 :
- La souche CL847-AGEL3 présentant l’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) - La souche parent CL847 (utilisée comme témoin)
[0123] La caractérisation de la viscosité à différentes concentrations en champignon montre à nouveau dans la souche CL847 un avantage apporté par l’invalidation du gène ID78713 ( GEL3 ) (voir la Figure 3) avec une viscosité environ 3 fois plus faible quand la concentration en champignon est de l’ordre de 12 à 14 g/L.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Souche de champignon dans laquelle le gène ID78713 a été invalidé.
[Revendication 2] Souche de champignon selon la revendication 1 , ladite souche possédant une viscosité diminuée par rapport à une souche parente dans laquelle le gène ID78713 ( GEL3 ) n’a pas été invalidé.
[Revendication 3] Souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle le gène ID78713 a été invalidé par mutagénèse ou par recombinaison homologue, notamment à l’aide d’une cassette d’invalidation telle que représentée par la SEQ ID NO : 1.
[Revendication 4] Souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le champignon est un champignon filamenteux, notamment appartenant à la classe des sordariomycètes plus particulièrement appartenant au genre Trichoderma, et encore plus particulièrement à l’espèce Trichoderma reesei.
[Revendication 5] Souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le gène ID78713 correspond à un gène représenté par la SEQ ID NO : 2 ou un gène ayant au moins 80% d’identité avec le gène de SEQ ID NO : 2, notamment au moins 90% et plus particulièrement au moins 95%.
[Revendication 6] Procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant une étape d’invalidation du gène ID78713.
[Revendication 7] Procédé de modification génétique d’une souche de champignon selon la revendication 6, dans lequel l’étape d’invalidation du gène ID78713 est réalisée par mutagénèse, par recombinaison homologue ou plus préférentiellement à l’aide d’une cassette d’invalidation représentée par la SEQ ID NO : 1.
[Revendication 8] Procédé de production de biomasse de champignon, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
[Revendication 9] Procédé de production de protéines d’intérêt, notamment des enzymes, comprenant une étape de culture d'une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 dans un milieu de culture comprenant un substrat approprié.
[Revendication 10] Procédé de production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 pour produire des enzymes cellulolytiques.
[Revendication 11] Procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques, comprenant une étape d’utilisation de la souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 pour produire des enzymes cellulolytiques.
[Revendication 12] Procédé de production d'un biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques selon la revendication 11 , comprenant :
- i) une étape de prétraitement d'un substrat cellulosique ou lignocellulosique afin d’obtenir un substrat prétraité, - ii) une étape d’utilisation de la souche selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 pour produire des enzymes cellulolytiques,
- iii) une étape d'hydrolyse enzymatique du substrat prétraité, en présence des enzymes cellulolytiques obtenues à l’étape ii) et d'un substrat approprié, afin d’obtenir un hydrolysat,
- une étape de fermentation alcoolique de l'hydrolysat obtenu, l’étape iv) étant optionnellement réalisée en simultané avec l’étape iii).
- v) une étape de séparation, notamment par distillation.
[Revendication 13] Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, pour la production de protéines d’intérêt, plus particulièrement des enzymes, notamment des enzymes cellulolytiques telles que des cellulases.
[Revendication 14] Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, pour l'hydrolyse de la cellulose ou de la lignocellulose en glucose.
[Revendication 15] Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, pour la production de produits biosourcés à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques. [Revendication 16] Utilisation d’une souche de champignon selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, pour la production de biocarburant à partir de substrats cellulosiques ou lignocellulosiques.
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