FR3083245A1 - Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogenes et leur utilisation dans la production de bioethanol - Google Patents

Souches de saccharomyces cerevisiae exprimant des enzymes glucoamylase et xylanase exogenes et leur utilisation dans la production de bioethanol Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne des souches de levure de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiées de manière à co-exprimer un gène codant une glucoamylase d'origine fongique, un gène codant une glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, et un gène codant une xylanase d'origine fongique. Le rendement de production de bioéthanol par ces souches est supérieur à celui de souches identiques, par ailleurs, mais ne comprenant pas le gène codant la xylanase d'origine fongique. La présente invention concerne également un procédé d'obtention de ces levures ainsi que l'utilisation de ces levures dans la production de bioéthanol

Description

Souches de Saccharomyces Cerevisiae Exprimant des Enzymes Glucoamylase et Xylanase Exogènes et leur Utilisation dans la Production de Bioéthanol
Domaine de P Invention
La présente invention concerne des souches de levure de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiées de manière à co-exprimer des gènes codant des glucoarnylases d’origine fongique et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, et un gène codant une xylanase d’origine fongique. De telles souches trouvent, en particulier, application dans la production de biocarburant, notamment de bioéthanol. La présente invention concerne également un procédé d’obtention de ces levures ainsi que Putilisation de ces levures dans la production de bioéthanol.
Contexte de l’invention
La diminution des ressources en énergies non renouvelables et la préoccupation grandissante devant l’augmentation des émissions de gaz à effet de serre sont à l’origine de la nécessité de trouver des sources d’énergie alternatives aux carburants fossiles (pétrole, charbon, gaz). La biomasse végétale issue des forêts, des produits et/ou des coproduits agricoles ou agro-alimentaires constitue une source de carbone considérable pour la production de molécules d’intérêt industriel. L’éthanol produit à partir des sucres fermentescibles contenus dans les végétaux est utilisé dans les véhicules dotés de moteurs à combustion. La production du bioéthanol a ainsi connu un développement rapide aux cours des dernières années, avec une production mondiale en bioéthanol qui a plus que doublé en moins de dix ans (49.5 milliards de litres produits en 2007 contre 102 milliards de litres en 2016 - www.ethanolrfa.org/resources/industry/statistics/, Renewable Fuels Association). Les Etats-Unis et le Brésil restent les deux plus grands pays producteurs de bioéthanol, leurs productions combinées représentant 85% de la production mondiale.
Le bioéthanol dit de première génération est produit par fermentation des hexoses (sucres à six carbones) contenus dans les biomasses riches en amidon (grains de maïs, orge, blé, manioc, tubercules de pomme de terre, etc.) ou en saccharose (canne à sucre, betterave sucrière, sorgho sucrier etc.), tandis que le bioéthanol dit de deuxième génération est généré par transformation de la cellulose et de l’hémicellulose contenues dans les résidus agricoles tels que les pailles de céréales, les cannes de maïs, les résidus .. i ..
forestiers, le bois, les cultures énergétiques telles que le panic érigé ou les taillis à courte ou très courte rotation (peuplier par exemple).
Seul le bioéthanol de première génération est préparé à Γéchelle industrielle aujourd’hui. La. préparation industrielle comprend l’utilisation de souches de levure Saccharomyces cerevisiae, qui permettent de fermenter le glucose de la biomasse en éthanol avec un titre alcoolique, une productivité et un rendement élevés. Le processus permettant la conversion d’amidon en bioéthanol comprend une pré-hydrolyse et une liquéfaction de l’amidon de la biomasse, la conversion de l’amidon liquéfié en sucres fermentescibles (par hydrolyse de l’amidon), et la fermentation de ces sucres en éthanol ces deux dernières étapes étant souvent réalisées de façon simultanée. L’hydrolyse de l’amidon nécessite l’action d’enzymes dites amylolytiques. Comme les levures Saccharomyces cerevisiae sont généralement dépourvues de ce type d’enzymes, la production d’éthanol à partir de biomasse composée d’amidon est effectuée en deux étapes: une première étape d’addition d’enzymes amylolytiques à la biomasse de manière à pré-hydrolyser et liquéfier l’amidon contenu dans la biomasse, et une deuxième étape où l’on utilise d’autres enzymes (enzymes amylolytiques, cocktails enzymatiques, protéases, et/ou tréhalase, etc...) pour hydrolyser l’amidon liquéfié et une souche de Saccharomyces cerevisiae pour fermenter les sucres fermentescibles ainsi libérés.
Dans le but de simplifier la production de bioéthanol à partir de biomasse composée d’amidon, le présent Déposant a développé des souches de Saccharomyces cerevisiae comprenant, intégrés dans leur génome, des gènes de glucoamylases exogènes. Ces souches de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiées permettent de réaliser simultanément l’hydrolyse partielle de l’amidon liquéfié et la. fermentation alcoolique (WO 2017/037362). Malgré l’augmentation des performances des souches de, Saccharomyces cerevisiae ainsi modifiées, il existe toujours un besoin de disposer de nouvelles souches de levure améliorées pour la production d’éthanol de première génération.
Résumé de l’invention
D’une façon générale, la présente invention concerne des souches de levure Saccharomyces cerevisiae qui présentent des propriétés améliorées par rapport aux souches de levure spécialisées couramment utilisées dans la production de bioéthanol de première génération, et également par rapport aux souches de Saccharomyces cerevisiae ·>
comprenant, intégrés dans leur génome, des gènes de glucoamylases exogènes (WO 2017/037362). Plus spécifiquement, les Inventeurs de la présente invention ont développé une souche de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiée, ladite souche co-exprimant plusieurs gènes de glucoamylases hétérologues, et un gène de xylanase hétérologue. En particulier, les souches de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention co-expriment à la fois un gène codant une glucoamylase d’origine fongique et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, ainsi qu’un gène de xylanase d’origine fongique. Les Inventeurs ont démontré que ces souches étaient capables d’hydrolyser l’amidon liquéfié extrait de la biomasse tout en réussissant à fermenter efficacement les sucres issus de cette hydrolyse. En effet, l’utilisation d’une souche de levure selon la présente invention permet de remplacer tout ou partie de la quantité d’enzymes exogènes nécessaires lors de la conversion de l’amidon liquéfié en bioéthanol et produit du bioéthanol avec un rendement plus élevé que les souches connues dans l’art.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu’elle co-exprime :
un gène codant une xylanase d’origine fongique;
un gène codant une glucoamylase d’origine fongique; et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
Dans certains modes de réalisation, la xylanase d’origine fongique est une xylanase à’Aspergillus niger ou une xylanase de Trichoderma reesei. En particulier, la xylanase d’origine fongique peut être une xylanase à' Aspergillus niger qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 5 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 6 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 6. Alternativement, la xylanase d’origine fongique peut être une xylanase de Trichoderma reesei qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 7 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 8 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 8.
Dans certains modes de réalisation, la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 3 ou consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4.
Dans certains modes de réalisation, la glucoamylase d’origine fongique est choisie dans le groupe consistant en: une glucoamylase d’Aspergillus niger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei, une glucoamylase de Thermomyces lanuginosis, une glucoamylase de Rhizopus oryzae et une glucoamylase d'Aspergïttus oryzae. En particulier, la glucoamylase d’origine fongique peut être une glucoamylase d’Aspergillus niger qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2.
Dans certains modes de réalisation, la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention comprend:
m copies du gène codant la xylanase d’origine fongique;
n copies du gène codant la glucoamylase d’origine fongique: et p copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diasiaticus, où m est un nombre entier compris entre 1 et 10, n est un nombre entier compris entre 2 et 10, et p est un nombre entier compris entre 2 et 10.
Dans certains modes de réalisation, m est 1 ou 4.
Dans certains modes de réalisation, n est 6 et p est 4.
Dans certains modes de réalisation, le gène codant la xylanase d’origine fongique, le gène codant la glucoamylase d’origine fongique, et le gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var-. diastaiicus sont intégrés au sein du génome de la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention.
Dans certains modes de réalisation, la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention est la souche déposée le 26 avril 2017 à la CNCM sous le numéro 1-5201.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode d’obtention d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae utile pour la production de bioéthanol, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
(a) modifier génétiquement une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à ce qu’elle co-exprime un gène codant une xylanase d’origine fongique, un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de ..4..
Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ou obtenir une souche de levure de
Saccharomyces cerevisiae telle que décrite ici;
(b) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (a) sur un milieu synthétique dextrine; et (c) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode pour augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
(a) fournir une levure de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus:
(b) modifier génétiquement la. levure de l’étape (a) de manière à ce qu’elle exprime en outre un gène codant une xylanase d’origine fongique;
(c) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (b) sur un milieu synthétique dextrine; et (d) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
Dans certains modes de réalisation, la méthode pour augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae est caractérisée en ce que la levure de Saccharomyces cerevisiae de l’étape (a) est la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de production de bioéthanol à partir d’une biomasse, ladite biomasse méthode comprenant les étapes consistant à:
(a) préhydrolyser et liquéfier l’amidon de la biomasse;
(b) faire réagir l’amidon liquéfié obtenu à l’étape (a) avec une souche de levure de
Saccharomyces cerevisiae selon l’invention pour produire du bioéthanol; et (c) extraire le bioéthanol produit à l’étape (b).
.. «:..
Enfin, la présente invention concerne également Γ utilisation d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae divulguée ici, pour la production de bioéthanol.
Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l’invention est donnée ci-dessous.
Description Détaillée de l’invention
Comme mentionné plus haut, la présente invention concerne des souches de levure Saccharomyces cerevisiae ayant un rendement élevé en production de bioéthanol de première génération, en particulier de bioéthanol produit à partir de biomasse comprenant de l’amidon.
I - Souches de Saccharomyces cerevisiae Génétiquement Modifiées
Une souche de levure Saccharomyces cerevisiae selon la présente invention est caractérisée en ce qu’elle co-exprime :
un gène codant une xylanase d’origine fongique:
un gène codant une glucoamylase d’origine fongique; et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
L’expression “souche de levure” désigne une population relativement homogène de cellules de levure. Une souche de levure est obtenue à partir d’un clone, un clone étant une population de cellules obtenues à partir d’une seule cellule de levure. Dans le contexte de la présente invention, une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae de départ est toute souche de Saccharomyces cerevisiae qui peut être modifiée génétiquement pour y introduire les gènes de xylanase et de glucoamylase hétérologues selon l’invention. Dans certains modes de réalisation préférés, la souche de Saccharomyces cerevisiae de départ est une souche connue pour être utile dans la production de bioéthanol, comme par exemple les levures de Saccharomyces cerevisiae utilisées par les producteurs d’éthanol de première génération, qui sont des levures spécialisées permettant l’optimisation de la rentabilité du procédé de production. Ces levures, qui sont bien connues de l’homme du métier, sont entre autres: Ethanol Red?* (LEAF), Thermosacc'*’ (Lallemand), Angel Super Alcohol®' (Angel) et Faii1* (AB Mauri). Les qualités attendues de ces levures sont leur capacité à produire rapidement de concentrations élevées en éthanol et d’épuiser les sucres des milieux de fermentation sur les plages de température et de pH représentatives des conditions industrielles.
- 6 Comme indiqué plus haut, les souches selon la présente invention sont des souches améliorées par rapport aux souches de levure Saccharomyces cerevisiae précédemment développées par les présents Inventeurs, c’est-à-dire par rapport à des souches de levure Saccharomyces cerevisiae où l’introduction d’un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus et d’un gène codant une glucoamylase d’origine fongique avait permis d’obtenir des souches avec d’excellentes capacités d’hydrolyse de l’amidon (WO 2017/037362).
Par “gène codant une glucoamylase”, on entend ici une séquence d’acides aminés qui, lorsqu’elle est exprimée, résulte en la formation d’une protéine de glucoamylase fonctionnelle.
Par “glucoamylase”, on entend ici une enzyme capable d’hydrolyser les liaisons glycosidiques a-1,4 de l’amidon brut ou soluble à partir de l’extrémité non-réductrice de 1’amylose et de l’amylopectine. Les amylases sont également connues sous la dénomination d’amyloglucosidases ou de γ-amylases (Medline référence: EC 3.2.1.3). En plus d’agir sur les liaisons a-1,4 de l’amidon, la glucoamylase est capable d’hydrolyser lentement les liaisons a-1,6 des molécules d’amylopectine, à condition que la liaison voisine dans la séquence soit une liaison a-1,4.
Le terme “glucoamylase d’origine fongique” désigne toute glucoamylase provenant d’un champignon (fongus ou mycète) et dont le gène correspondant peut être intégré dans le génome d’une souche de levure de telle sorte que l’expression du gène résulte en la formation d’une protéine de glucoamylase fonctionnelle. En particulier, une glucoamylase d’origine fongique peut être choisie parmi les glucoamylases commerciales connues pour leur bonne activité enzymatique. Dans le contexte de la présente invention, une glucoamylase d’origine fongique peut être sélectionnée dans le groupe consistant en : une glucoamylase Aspergillus niger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei, une glucoamylase de Rhizopus oryzae, une glucoamylase à'Aspergillus oryzae et une glucoamylase Thermomyces lanuginosis. Ces glucoamylases sont connues de l’homme du métier, et leurs séquences sont accessibles sous les références GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) suivantes: Trichoderma reesei (ETS06561), Rhizopus oryzae (BAA00033), Aspergillus oryzae (BAA00841), Thermomyces lanuginosus (ABQ23180).
Dans certains modes de réalisation particuliers, la glucoamylase d’origine fongique est une glucoamylase d’Aspergillus niger ou de Saccharomycopsis fibuligera. La glucoamylase d’Aspergillus niger est codée par le gène GLAA qui possède la séquence nucléique SEQ ID NO: 1, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 2. La glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera est codée par le gène GLU0111 qui possède la séquence nucléique SEQ ID NO: 9, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 10.
La glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est codée par le gène STA1 qui possède la séquence nucléique SEQ ID NO: 3, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 4.
Dans certains modes de réalisation, une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention est caractérisée en ce qu’elle co-exprime :
un gène codant une xylanase d’origine fongique;
un gène codant une glucoamylase d’Aspergillus niger; et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. Ainsi, par exemple, une telle souche de Saccharomyces cerevisiae peut être en particulier caractérisée en ce qu’elle contient la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 et la séquence nucléique SEQ ID NO: 3. Alternativement ou additionnellement, une telle souche de Saccharomyces cerevisiae peut être en particulier caractérisée en ce que la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus a la séquence protéique SEQ ID NO: 4 et la glucoamylase d’Aspergillus niger a la séquence protéique SEQ ID NO: 2.
Une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention se distingue de la souche de Saccharomyces cerevisiae précédemment développée par les présents Inventeurs (WO 2017/037362) en ce qu’en plus du gène codant une glucoamylase d’origine fongique; et du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, elle co-exprime en outre un gène codant pour une xylanase d’origine fongique.
Par “gène codant une xylanase”, on entend ici une séquence d’acides aminés qui, lorsqu’elle est exprimée, résulte en la formation d’une protéine de xylanase fonctionnelle.
Par “xylanase”, on entend ici une enzyme glycoside hydrolase qui hydrolyse les liaisons (l--»4)-p-D-xylosidiques dans les xylanes, générant ainsi du xylose. Les xylanases sont également connues sous la dénomination d’endo-l,4-p-xylanases (Medline
- 8 référence: EC 3.2.1.8). Ces enzymes interviennent dans la dégradation de l’hémicellulose, l’un des constituants principaux des parois cellulaires chez les plantes. Elles sont produites notamment par des mycètes, des bactéries, des levures, des algues marines, des protozoaires, des escargots, des crustacés, des insectes et certaines graines, mais pas par les mammifères.
Dans le contexte de la présence l’invention, la xylanase est une xylanase d’origine fongique. Le terme “xylanase d’origine fongique” désigne toute xylanase provenant d’un champignon (fongus ou mycète) et dont le gène correspondant peut être intégré dans le génome d’une souche de levure de telle sorte que l’expression du gène résulte en la formation d’une protéine de xylanase fonctionnelle. En particulier, une xylanase d’origine fongique peut être choisie parmi les xylanases commerciales connues pour leur bonne activité enzymatique. Dans le contexte de la présente invention, une xylanase d’origine fongique peut être sélectionnée dans le groupe consistant en: une xylanase à3 Aspergillus niger, une xylanase d’Aspergillus awamori, une xylanase d’Aspergillus tubingensis, une xylanase à'Aspergillus nidulans, et une xylanase de Trichoderma reesei. Ces xylanases sont connues de l’homme du métier, et leurs séquences sont accessibles sous les références GenBank (www.ncbi.nlm.nili.gov/genbank/) suivantes: Aspergillus niger (FJ785738), Aspergillus awamori (X78115), Aspergillus tubingensis (L26988), Aspergillus nidulans (Z49892), et Trichoderma reesei (X69573).
Dans certains modes de réalisation particuliers, la xylanase d’origine fongique est une xylanase d’Aspergillus niger ou de Trichoderma reesei. La xylanase & Aspergillus niger est codée par le gène XYN1 qui a la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 5, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 6. La xylanase de Trichoderma reesei est codée par le gène XYN2 qui a la séquence nucléique consensus SEQ ID NO: 7, et a pour séquence protéique la séquence SEQ ID NO: 8.
Les expressions “glucoamylase d’origine fongique”, et “glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus” ne doivent pas être interprétées de manière stricte : elles englobent les glucoamylases d’origine fongique et de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus qui sont codées par les séquences nucléiques telles que décrites ci-dessus, mais également les variants fonctionnels de ces glucoamylases. De même, le terme “xylanase d’origine fongique”, tel qu’utilisé ici, englobe les xylanases d’origine fongique qui sont codées par les séquences nucléiques telles que décrites ci-dessus, mais également les variants fonctionnels de ces xylanases.
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Typiquement, un variant fonctionnel d’une glucoamylase ou d’une xylanase selon l’invention a une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, 90%, ou 95%, plus particulièrement de 99%, avec la séquence protéique de ladite glucoamylase ou xylanase, respectivement. Par exemple, les variants fonctionnels de la glucoamylase & Aspergillus niger ont une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, d’au moins 90%, ou d’au moins 95%, plus particulièrement d’au moins 99%, avec la séquence SEQ ID NO: 2; les variants fonctionnels de la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ont une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, d’au moins 90%, ou d’au moins 95%, plus particulièrement de 99%, avec la séquence SEQ ID NO: 4; les variants fonctionnels de la xylanase A’ Aspergillus niger ont une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, d’au moins 90%, ou d’au moins 95%, plus particulièrement de 99%, avec la séquence SEQ ID NO: 6; et les variants fonctionnels de la xylanase de Trichoderma reesei ont une séquence protéique présentant un pourcentage d’identité d’au moins 80%, d’au moins 90%, ou d’au moins 95%, plus particulièrement de 99%, avec la séquence SEQ ID NO: 8.
Le “pourcentage d’identité” est une comparaison entre des séquences d’acides aminés, et est déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale sur une fenêtre de comparaison. L’homme du métier sait comment calculer un pourcentage d’identité entre deux séquences et dispose de nombreux outils le lui permettant. L’une des deux séquences peut présenter des insertions, substitutions et des délétions d’acides aminés par rapport à l’autre séquence.
Il est dans les compétences de l’homme du métier de sélectionner des variants fonctionnels des glucoamylases et xylanases selon l’invention. Par “variant fonctionnel d’une glucoamylase”, on entend un variant qui conserve l’activité enzymatique de la glucoamylase et ce avec des caractéristiques de cinétique d’hydrolyse de l’amidon similaires. Par “variant fonctionnel d’une xylanase”, on entend un variant qui conserve l’activité enzymatique de la xylanase, et ce avec des caractéristiques de cinétique d’hydrolyse du xylane similaires. Des méthodes permettant de mesurer et de comparer des cinétiques d’hydrolyse de l’amidon et d’hydrolyse du xylane sont décrites dans la partie expérimentale de la présente demande (voir aussi WO 2017/037362).
Les souches selon l’invention peuvent être générées par n’importe quelle méthode appropriée. L’homme du métier connaît, par exemple, de multiples méthodes permettant d’introduire un gène dans une souche de levure, notamment via l’utilisation de vecteurs comprenant des cassettes d’expression. On entend par “vecteur” toute séquence d’ADN dans laquelle il est possible d’insérer des fragments d’acides nucléiques étrangers, les vecteurs permettant d’introduire de l’ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les vecteurs dérivés de viras. Les vecteurs permettent soit l’intégration des gènes hétérologues directement dans le génome de la levure, soit leur expression dans un plasmide indépendant. L’introduction de vecteurs dans une cellule hôte est un procédé largement connu de l’homme du métier. Plusieurs méthodes sont notamment décrites dans “Current Protocols in Molecular Biology”,
13.7.1-13.7.10 ; ou encore dans Ellis et al.. Integrative Biology, 2011, 3(2), 109-118.
Les modifications génétiques selon l’invention peuvent être réalisées simultanément ou séquentiellement. Ainsi, par exemple, dans certains modes de réalisation, une souche de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention est préparée à partir d’une souche de Saccharomyces cerevisiae précédemment développée par les présents Inventeurs et décrite dans WO2017/037362 (c’est-à-dire à partir une souche contenant déjà un gène codant pour une glucoamylase d’origine fongique et un gène codant pour une glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus). Alternativement, dans d’autres modes de réalisation, une souche de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention est préparée par intégration des trois gènes dans une souche de Saccharomyces cerevisiae comme, par exemple, une souche spécialisée - voir plus haut. Dans ces modes de réalisation, le gène codant une glucoamylase d’origine fongique, le gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, et le gène codant une xylanase d’origine fongique peuvent être insérés au sein d’un seul et même vecteur, ou au sein de deux ou trois vecteurs séparés. Un vecteur approprié peut être un plasmide.
Dans le contexte de la présente invention, un vecteur utilisé pour introduire un gène dans une souche de Saccharomyces cerevisiae peut contenir un marqueur de sélection. On entend par “marqueur de sélection”, un gène dont l’expression confère aux levures qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il peut s’agir par exemple d’un gène de résistance aux antibiotiques ou d’un gène permettant, la croissance de la levure dans un milieu particulier.
Dans un vecteur, un gène (de glucoamylase ou de xylanase) selon l’invention est généralement lié opérationnellement à un promoteur, un terminateur et/ou toute autre séquence nécessaire à son expression dans la levure. Les termes “lié opérationnellement” et “lié de façon opérationnelle” sont utilisés indifféremment et font référence à un lien fonctionnel entre les éléments permettant l’expression du gène et éventuellement sa régulation (séquences régulatrices 5’ et 3’) et la séquence du gène rapporteur qu’elles contrôlent. L’homme du métier sait sélectionner les promoteurs, terminateurs et autres séquences nécessaires à l’expression d’un gène dans une levure de Saccharomyces cerevisiae.
Dans certains modes de réalisation particuliers de l’invention, l’expression d’un gène (de glucoamylase et/ou de xylanase) est contrôlée par un promoteur dit “fort” (c’està-dire un promoteur ayant un potentiel transcriptionnel élevé pour que le gène soit fortement exprimé). Dans le contexte de la présente invention, un promoteur fort est par exemple le promoteur pADHl, le promoteur pTEF, ou le promoteur pTDHS.
Une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention peut comprendre plusieurs copies d’au moins un des gènes de glucoamylase d’origine fongique, de Saccharomyces cerevisiae var. di.astat.icus, et de xylanase d’origine fongique. D’une façon générale, une souche de Saccharomyces cerevisiae selon l’invention comprend, m copies du gène codant la xylanase d’origine fongique; n copies du gène codant la glucoamylase d’origine fongique; et p copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, où m est un nombre entier compris entre 1 et 10, n est un nombre entier compris entre 2 et 10, et p est un nombre entier compris entre 2 et 10. Ainsi, n et p peuvent indépendamment être égaux à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 et rn peut être égal à 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Dans certains modes de réalisation particuliers, m est égal à 1 ou 4. Dans les mêmes, ou d’autres, modes de réalisation particuliers, n est égal à 6 et p est égal à 4.
L’invention concerne en particulier la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae qui a été déposée, par le présent Déposant, à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15), en vertu du traité de Budapest, sous le numéro 1-5201 le 26 avril 2017. Cette souche comprend 6 copies du gène de glucoamylase d’Aspergillus niger, 4 copies du gène de glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus et 1 copie du gène xylanase d’Aspergillus niger.
II - Méthode d’obtention de Souches de Saccharomyces cerevisiae Génétiquement Modifiées et Utiles pour la Production de Bioéthanol
Les présents Inventeurs ont parallèlement mis au point une méthode permettant d’obtenir des souches de Saccharomyces cerevisiae utiles dans la production de bioéthanol. La méthode comprend les étapes consistant à:
(a) modifier génétiquement une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à ce qu’elle co-exprime un gène codant une xylanase d’origine fongique, un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ou obtenir une telle levure de Saccharomyces cerevisiae;
(b) mettre en culture et faire fermenter la levure de l’étape (a) sur un milieu synthétique dextrine; et (c) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation dans le milieu synthétique dextrine au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche de Saccharomyces cerevisiae déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
Comme le reconnaîtra l’homme du métier, après l’étape (a) de modification génétique, il est préférablement procédé à une sélection des clones ayant correctement intégré les gènes introduits. Ainsi, la levure de l’étape (a) qui est utilisée dans l’étape (b) est un clone ayant correctement intégré le gène codant la xylanase d’origine fongique, le gène codant la glucoamylase d’origine fongique, et le gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. L’homme du métier sait comment sélectionner de tels clones, par exemple en faisant usage d’un marqueur de sélection introduit dans la levure de Saccharomyces cerevisiae de départ. Les Exemples fournis dans le présent document décrivent un exemple de méthode de sélection des clones. Dans cet exemple, un clone obtenu à l’étape (a) est mis en culture dans un milieu riche (en nutriments, milieu type YPG), puis le surnageant de culture est transféré dans un milieu minimum contenant du xylane comme source de carbone. Une seconde levure, la levure CelluXIM (qui a été déposée par le Déposant le 12 décembre 2013 à la CNCM sous le numéro 1-4829), est ajoutée au milieu réactionnel. Un clone est sélectionné (c’est-à-dire identifié comme ayant correctement intégré les gènes introduits), s’il y a croissance de la souche CelluX1^1.
Comme le reconnaîtra l’homme du métier, la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae obtenue dans l’étape (a) de la méthode décrite ci-dessus est une souche selon la présente invention. Ses caractéristiques sont donc identiques à celles décrites dans la section précédente.
L’homme du métier sait conduire une réaction de fermentation d’une telle levure de Saccharomyces cerevisiae sur un milieu synthétique dextrine (étape (b)), et déterminer les conditions optimales pour la fermentation. On entend ici par “milieu synthétique dextrine” un milieu de culture cellulaire, préférablement un milieu de culture de cellules de levure, contenant des dextrines, tel que connu de l’homme du métier. Π s’agit par exemple d’un milieu de culture contenant des dextrines d’amidon (220 g/kg), de l’extrait de levure (5 gZkg), de l’urée (2 g/kg), du dihydrogénophosphate de potassium (1 g/kg) ainsi que des minéraux et des vitamines (comme la vitamine B1 et la vitamine B 6).
Dans l’étape (c), la sélection d’une souche de Saccharomyces cerevisiae performante et utile dans la production de bioéthanol se fait par comparaison de sa cinétique de fermentation avec celle de la souche de Saccharomyces cerevisiae déposée, par le présent Déposant le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997. Les cinétiques de fermentation peuvent être facilement mesurées par différentes techniques connues de l’homme du métier. Par exemple, la cinétique de fermentation peut-être mesurée via un suivi de fermentation par pesée au cours du temps.
La souche 1-4997, qui sert de référence, est l’une des souches précédemment développées par les présents Inventeurs et décrites dans WO 2017/037362. La souche de Saccharomyces cerevisiae 1-4997 comprend au moins 4 copies du gène codant la glucoamylase à’Aspergillus niger et au moins 3 copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
Une souche sélectionnée par une méthode selon la présente invention présente donc nécessairement des propriétés de fermentation identiques ou supérieures à la souche Saccharomyces cerevisiae 1-4997, dans un milieu synthétique dextrine. En conséquence, les présents Inventeurs ont également mis au point une méthode permettant d’augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae.
III - Méthode pour Augmenter ie Rendement de Production en Bioéthanol d’une Souches de Saccharomyces cerevisiae
La présente invention concerne donc également une méthode permettant d’augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
(a) fournir (ou obtenir) une levure de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus;
(b) modifier génétiquement la levure de l’étape (a) de manière à ce qu’elle exprime en outre un gène codant une xylanase d’origine fongique;
(c) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (b) sur un milieu synthétique dextrine; et (d) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation, dans le milieu synthétique dextrine au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
La souche de l’étape (a) peut être n’importe quelle souche de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus. Dans certains modes de réalisation, la glucoamylase d’origine fongique est sélectionnée dans le groupe consistant en: une glucoamylase A’ Aspergillus niger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de Trichoderma reesei, une glucoamylase de Rhizopus oryzae, une glucoamylase à'Aspergillus oryzae et une glucoamylase Thermomyces lanuginosis comme décrit plus haut. Dans certains modes de réalisation particuliers, la glucoamylase d’origine fongique dont le gène exogène est présent dans la souche de Saccharomyces cerevisiae de l’étape (a) est une glucoamylase d'Aspergillus niger, par exemple une glucoamylase à:Aspergillus niger codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 ou une glucoamylase dAspergillus niger consistant en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2. Dans les mêmes ou d’autres modes de réalisation particuliers, la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus dont le gène exogène est présent dans la souche de Saccharomyces cerevisiae de l’étape (a) est une glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae n&î. diastaticus codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 3 ou une glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var.
diastaticus consistant en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4.
Dans certains modes de réalisation particuliers, la souche de l’étape (a) est une souche de Saccharomyces cerevisiae co-exprimanl un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, telle que décrite dans WO 2017/037362. Par exemple, la souche de l’étape (a) est la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae déposée, par le présent Déposant, le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
L’étape (b) de modification génétique peut être effectuée par n’importe quelle méthode connue de l’homme du métier, comme déjà indiqué plus haut.
Comme indiqué plus haut, après l’étape (b) de modification génétique, il peut être procédé à une sélection des clones ayant correctement intégré le gène codant la xylanase d’origine fongique, par exemple en utilisation un marqueur de sélection.
Les étapes (c) et (d) de la méthode permettant d’augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae peuvent être effectuées comme indiqué pour la méthode de sélection selon l’invention.
L’invention concerne également toute souche de levure obtenue par une méthode de sélection ou d’augmentation de rendement selon l’invention. L’invention concerne aussi une levure obtenue par culture d’une des souches de l’invention. Les procédés de culture d’une souche de levure sont connus dans l’art, et l’homme du métier sait optimiser les conditions de culture pour chaque souche en fonction de sa nature.
Les souches de levure de l’invention et les levures obtenues par culture de ces souches sont particulièrement intéressantes pour produire du bioéthanol à partir de biomasse, en particulier à partir de biomasse contenant de l’amidon.
IV - Utilisation des Souches de Saccharomyces cerevisiae Génétiquement Modifiées pour la Production en Bioéthanol
La présente invention concerne donc l’utilisation d’une souche de Saccharomyces cerevisiae selon la présente invention pour la production de bioéthanol à partir d’une biomasse contenant de l’amidon. La présente invention concerne aussi une méthode de production de bioéthanol à partir d’une biomasse contenant de l’amidon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
(a) préhydrolyser (c’est-à-dire hydrolyser de façon partielle) et liquéfier l’amidon de la biomasse;
(b) faire réagir la biomasse contenant l’amidon pré-hydrolysé et liquéfié obtenu à l’étape (a) avec une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la présente invention pour produire du bioéthanol; et (c) extraire le bioéthanol produit à l’étape (b).
Tel qu’utilisé ici, le terme “biomasse” désigne l’ensemble des matières organiques d’origine végétale pouvant devenir source d’énergie après transformation. Préférablement, dans le contexte de l’invention, la biomasse est issue des produits et/ou coproduits agricoles ou agro-alimentaires. Par exemple, une biomasse peut être issue du maïs, du blé, de l’orge, du seigle, du sorgho, du manioc, du triticale, de la pomme de terre, de la patate douce, de la canne à sucre, de la betterave sucrière, du sorgho sucrier. Dans le contexte de la présente invention, la biomasse contient de l’amidon. Les biomasses riches en amidon peuvent être choisies, ou être issues de, par exemple, grains de maïs, orge, blé, manioc, tubercules de pomme de terre, etc.
Les étapes (a), (b) et (c) de la méthode selon l’invention peuvent être réalisées comme dans le cas d’un procédé classique de production de bioéthanol. De telles étapes sont connues de l’homme du métier.
L’invention s’applique particulièrement à la production de bioéthanol en tant que carburant, mais aussi à la production de bioéthanol pour les industries alimentaires, chimiques, pharmaceutiques et cosmétiques.
A moins qu’ils ne soient définis d’une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés dans la Description ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention.
Exemples
Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples et les figures ne sont présentés qu’à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l’invention.
- 17 Légende des Figures
Figure 1: (A) Perte de masse observée pour les transformants de la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4997 au cours d’une fermentation dans le milieu “Alcool Max”. (B) Perte de masse observée pour les transformants de la souche numéro 1-4997 au cours d’une fermentation dans le milieu “Dextrine”.
Figure 2: (A) Comparaison des cinétiques de fermentation des différentes souches étudiées. (B) Comparaison des valeurs des teneurs en éthanol, des ratios massiques glycérol/éthanol ainsi que des rendements en éthanol calculés sur le potentiel en glucose du substrat utilisé pour la fermentation des différentes souches étudiées.
Figure 3: Comparaison des sucres totaux mesurés en fin de fermentation pour les différents souches étudiées.
Exemple 1: Obtention et Caractérisation de Transformants de la Souche 1-4997 contenant 1 ou 4 copies d’un Gène codant la Xylanase A’Aspergillus niger (XYNT) ou d’un gène codant la Xylanase de Trichoderma reesei (XYN2)
La stratégie mise en œuvre pour cloner une activité xylanase dans la souche de Saccharomyces cerevisiae ER-GAND-8159-C1 (c’est-à-dire la souche déposée, par le Déposant, le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997) repose sur l’utilisation d’un système d’expression multi-intégratif. Avec ce système, il est possible d’intégrer simultanément une ou plusieurs copies d’un gène codant une xylanase donnée à un locus donné. Les Inventeurs ont choisi d’intégrer 1 copie ou 4 copies d’un des deux gènes XYN1 d’Aspergillus niger et XYN2 de Trichoderma. reesei afin de mesurer un éventuel effet lié au nombre de copies sur l’activité xylanase.
A. Obtention des Plasmides d’Expression
Xylanase d’Aspergillus niger (XYN1). Le gène XYN1 qui code la xylanase à.’ Aspergillus niger a été précédemment amplifié par PCR à partir de matériel génétique issu de la souche A’ Aspergillus niger ATCC10577. Le produit PCR a ensuite été cloné dans un vecteur d’expression (développé en interne) sous la dépendance d’un promoteur fort pADHl et du terminateur tCYCl. Le plasmide obtenu sert ensuite de matrice pour la génération des modules d’expression, comme décrit dans le paragraphe B ci-dessous.
Xylanase de Trichoderma reesei (XYN2). La xylanase de Trichoderma reesei qui a été utilisée est codée par le gène XYN2. La séquence utilisée est la version ADNc, débarrassée de ses introns et optimisée au biais de codons pour améliorer la traduction de la protéine dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Le plasmide qui possède le gène XYN2 sous dépendance du couple pADHl/tCYCl, a été utilisé comme matrice PCR pour synthétiser les modules d’expression.
B. Obtention des Modules d’Expression
La stratégie employée par les Inventeurs a consisté à intégrer simultanément plusieurs modules d’expression des gènes de xylanase dans une souche de Saccharomyces cerevisiae en une seule étape à un locus donné, en se basant sur la capacité naturelle de la levure à réaliser la recombinaison homologue in vivo. Les Inventeurs ont défini les amorces PCR à utiliser pour intégrer les modules au locus BUD5. Selon les souches développées, 1 ou 4 modules d’expression de la xylanase d’A. niger ou de la xylanase T. reesei, ainsi qu’un module de sélection ont été intégrés.
Chaque module amplifié possède des séquences recombinogéniques (Al, Bl, Cl et Dl) de part et d’autre de son promoteur et de son terminateur. Ces séquences sont apportées par les queues flottantes des amorces PCR (Tableau 1) et permettent aux modules de s’aligner et recombiner spécifiquement par homologie entre ces séquences recombinogéniques.
La présence de séquences homologues à un locus donné, par exemple le locus BUD5, aux extrémités 5’ et 3’ de la cassette d’expression multi-intégrative permet l’intégration simultanée des modules d’expression et du module de sélection par recombinaison homologue à ce locus donné.
C. Obtention et Sélection des Transformants
Obtention des Transformants. Pour chaque construction, les différents modules (voir Tableau 2) ont été mis en mélange équimolaire afin d’intégrer au locus BUD5 de la souche 1-4997, 1 ou 4 copies des xylanases de A. niger ou de T. reesei ainsi qu’un module de sélection.
La sélection des clones ayant intégré correctement les modules d’expression est réalisée dans un premier temps sur la base de la présence du module de sélection dans la cassette d’intégration. Le module de sélection comprend un couple promoteur/terminateur fort et un gène dont l’expression confère aux levures qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner sur un milieu donné. Les Inventeurs ont ainsi isolé les clones issus de chaque transformation.
Tableau 1: Listing des Amorces Utilisées et Nomenclature des Modules d’Expression Synthétisés.
Oligonucléotides sens (F) et anti-sens (R) Module
Gène de sélection (F):cgctccagaattagcggacctcttgagcggtgagcctctggca AAGAAGAGCATAACCGCTAGAGTACTT(SEQ ID NO: 11) (R):tcactgtacggtgagaacgtagatggtgtgcgcataggccact agtggatct (SEQ ID NO: 12) MO
Gène XYNÏ d’A. niger (F) : CACAC CAT C TAC GT T C T cAC C GTACAG T GAGCATAAC C G C TAG AGTACTT ( SEQ ID NO: 13) (R) : C T CAAGAACGTAGGAC GATAAC T GGT T GGAAAGC G T AAACAC G GAGTCAACAGCTTGCAAATTAAAGCCT(SEQ ID NO: 14) M5-AN
(F): SEQ ID NO: 13 (R) : T T AC GT AGAC T G AGT AGC AJÂC GGT T GAG GAG AGC T T GC AAAT T AAAGCCT (SEQ ID NO: 15) M6-AN
(F):tcctcaaccgttgctactcagtctacgtaagcataaccgctag AGTACTT ( SEQ ID NO: 16) (R) : T CAG TAGCACAGAGAAGT GTAGGAGT GTAGCAGC T T GCAAAT T AAAGCCT (SEQ ID NO: 17) M7-AN
(F) : C T ACAC T C C TACACT T C T C T GT GC T AC T GAGCA TAAC C GC TAG AGTACTT (SEQ ID NO: 18) (R) : T TAGGATACAT G CAGTAGAC GAGGTAAG CACAGC T T GCAAAT T AAAGCCT {SEQ ID NO: 19) M8-AN
(F) : T GC T TAC C T C G T CTAC T GCAT GTAT C C TAAGCATAAC CGC TAG AGTACTT (SEQ ID NO: 20) (R): SEQ ID NO: 14 M9-AN
Gène XYN2 de T. reesei (F): SEQ ID NO: 13 (R): SEQ ID NO: 14 M5-TR
(F): SEQ ID NO: 13 (R): SEQ ID NO: 15 M6-TR
(F): SEQ ID NO: 16 (R): SEQ ID NO: 17 M7-TR
(F): SEQ ID NO: 18 (R): SEQ ID NO: 19 M8-TR
(F): SEQ ID NO: 20 (R): SEQ ID NO: 14 M9-TR
Tableau 2: Mélange de modules avant transformation de la souche 1-4997.
Nombre de copies Modules utilisés Souches obtenues
1 copie XYNl d’A. niger MO ER-GAND-XAN
M5-AN
4 copies XYNl d’A. niger MO ER-GAND-XAN-4C
M6-AN
M7-AN
M8-AN
M9-AN
1 copie XYN2 de T. reesei MO ER-GAND-XTR1C
M5-TR
1 copie XYN2 de T. reesei MO ER-GAND-XTR-4C
M6-TR
M7-TR
M8-TR
M9-TR
Sélection des Transformants.
(a) Criblage Fonctionnel par rapport à 1’Activité Xylanase. Le criblage des transformants obtenus a été réalisé en 2 étapes. Dans un premier temps, les transformants obtenus ont été mis en culture dans un milieu minimum contenant du xylane de bouleau.
En effet, les clones secrétant une xylanase active ont la capacité à hydrolyser le xylane du milieu en xylose. Après cette première étape de croissance des transformants, un inoculum de CelluXIM, levure capable de consommer le xylose, a été ajouté dans chaque puits. Les puits dans lesquels une croissance de CdiuX1' est observée sont identifiés 10 comme contenant un clone sécrétant une activité xylanase. Cette approche permet d’identifier les transformants présentant le phénotype recherché. Pour ce faire, la densité optique (DO à 600nm) des cultures est mesurée en fin de croissance.
(b) Validation des Transformants Sélectionnés par PCR. Avant évaluation en fermentation, le génotype a été vérifié pour 2 transformants par construction parmi ceux identifiés comme présentant un phénotype [Xylanase]+. Un panel de réactions PCR, visant à confirmer la présence des différents gènes théoriquement présents dans les constructions obtenues, a été réalisé sur les ADN génomiques des transformants sélectionnés.
D. Caractérisation Phénotypique (Activité Xylanase) des Clones Sélectionnés
Test Phénotypique Solide. Dans ce test, 5 pL de surnageant de culture (YPG 5%, 30°C, 24 heures, 150 rpm) ont été déposés sur un milieu contenant du xylane de bouleau, et les halos d’hydrolyse du xylane ont été visualisés après coloration au rouge Congo 1% et décoloration au NaCl 1 M. Des halos d’hydrolyse ont été observés pour tous les clones considérés).
Test Phénotypique Liquide. Cette caractéristique phénotypique repose sur le même principe que celui mis en œuvre pour la sélection des transformants (voir ci-dessus). Dans ce test, 5 pL de surnageant issue d’une culture (YPG 5%) a été incubée à 50°C toute le nuit en présence de xylane de bouleau (vol/vol), puis le mélange a été inoculé avec une suspension calibrée à DOôoo am=0,05 de CelluX12*1. Des prélèvements, effectués avant et après ensemencement avec la CelluX1M, ont été analysés en HPLC pour déterminer la concentration en xylose au cours de la croissance cellulaire de CelluX1M.
Les résultats obtenus dans le test phénotypique en milieu liquide ont confirmé la corrélation entre la croissance de la CelluXIM et la consommation du xylose pour les clones considérés.
Tableau 3: Détermination de la Consommation de Xylose et Mesure de la Croissance
Cellulaire de la CelluX1M pour les Différents Transformants Sélectionnés.
Surnageant de Cultures des levures Nbre de copies N° clone Concentration Xyiose (g/U Croissance CelluX™ DO (600 nm)
T0 Tf Réduction (%) T0 Tf Coefficient muitipiicateur
1 cl1 0,32 0,03 -92% 0,05 2,2 44 x
ER-GAND-XAN cl4 0,19 0,08 59% 0,05 0,8 16x
cl1 0,26 0,03 -89% 0,05 1,5 30 x
4 cl9 0,21 0,03 -87% 0,05 1,5 30 x
1 cl3 0,22 0,08 -62% 0,05 0,9 18x
ER-GAND-TR cl8 0,18 0,03 -81% 0,05 1,1 22 x
cl2 0,23 0,03 -88% 0,05 1,9 38 x
4 cl 10 0,42 0,06 -87% 0,05 1,2 24 x
ER-GAND-8159(a? témoin 0,16 0,03 79% 0,05 0,4 8x
+ sXYNib) 3.59 0,23 -93% 0,05 2,9 58 x
Ethanol Red®<c) témoin 0,14 0,06 -56% 0,05 0,4 8x
+ sXYN 3,52 0,25 -93% 0,05 2,9 58 x
(a) ER-GAND-8159 est la souche déposée à la CNCM sous le numéro 1-4997.
(b) sXYN = solution de xylanase de T. reesei 12 U/pL (c) Ethanol Red® est une souche déposée à la CNCM le 4 septembre 2008, par le présent Déposant, sous le numéro 1-4071.
E. Evaluation des Cloues Sélectionnés en Fermentation
Détermination des Performances vis-à-vis de la Production d’Ethanol en Milieu “Alcool Max” (YFAM). Afin de déterminer si l’intégration des modules d’expression de la xylanase d’A. niger et de la xylanase de T. reesei a eu un impact sur la capacité des transformants à produire de T éthanol, ils ont été caractérisés dans un milieu dit “alcool max” qui contient 280 g/kg de saccharose (voir composition ci-dessous), ce qui permet de mesurer leur potentiel de production d’éthanol dans des conditions d’évaluation données.
Le milieu “Alcool Max” contient: 280 g/kg de saccharose, 5 g/kg d’extrait de levure, 4,7 g/kg de phosphate d’ammonium di-basique (D.A.P.), 11,5 g/kg d’acide citrique, 13,5 g/kg de citrate de sodium, ainsi que des minéraux et des vitamines.
Le suivi des pertes de masse n’a pas mis en évidence d’impact négatif de l’intégration des modules d’expression “xylanase” sur le potentiel de production d’alcool maximal des transformants, que ce soit d’un point de vue cinétique ou en point final, à l’exception du clone 1 qui possède 4 copies du gène XYN1 d’A. niger qui est très légèrement impacté au niveau cinétique (voir Figure 1(A)).
Fermentation en Milieu Dextrine. Afin de déterminer si les transformants sélectionnés ont conservé leur capacité à dégrader l’amidon via la production de glucoamylase, les transformants ont été évalués dans un milieu dextrine. En effet, la souche utilisée comme hôte pour intégrer les modules d’expression des xylanases correspond à la souche ER-GAND-8159 (CNCM 1-4997) qui possède 2 gènes d’origine différente de glucoamylase Les dextrines étant des molécules issues de l’hydrolyse de l’amidon, les clones secrétant des glucoamylases sont capables de les dégrader en glucose et ainsi de produire de l’éthanol. Les conditions de fermentation utilisées étaient identiques à celles mises en œuvre avec le milieu YFAM.
Par “milieu dextrine”, on entend un milieu synthétique contenant des dextrines, tel que connu de l’homme du métier. Il s’agit par exemple d’un milieu synthétique contenant des dextrines d’amidon (220 g/kg), de l’extrait de levure (5 g/kg), de l’urée (2 g/kg), du dihydrogénophosphate de potassium (1 g/kg) ainsi que des minéraux et des vitamines.
Tous les clones testés dans le milieu de fermentation dextrine ont conservé leur capacité à dégrader l’amidon quand on les compare à Ethanol Red^ qui n’a pu fermenter que le glucose présent au départ dans le milieu (de l’ordre de 10 g/L) (voir Figure 1(B)). On note également que le clone ER-GAND-XTR-4c clIO, qui possède 4 copies du gène
- 23 XYN2 qui code la xylanase de T. reesei, et le clone ER-GAND-XTR-lc cl8, qui possède 1 copie de ce gène, et dans une moindre mesure le clone ER-GAND-XTR-4c c!2, qui possède 4 copies de ce gène, voient leur cinétique de perte de masse négativement impactée par rapport au témoin ER-GAND-8159, ce qui n’est pas le cas pour le clone ERGAND-XTR-lc cl3 (CNCM 1-5265) avec une seule copie de XYN2, pour lequel la perte de masse est plus rapide sur les premières 24 heures et identique au témoin sur les 40 heures de fermentation qui suivent. Ces résultats suggèrent un effet lié au clone considéré plus qu’ils ne mettent en évidence un réel impact négatif de l’intégration du gène XYN2.
En revanche, les quatre transformants testés ER-GAND-XAN qui possèdent soit 1 copie, soit 4 copies du gène XYN1 (A. niger) voient leur cinétique de production de perte de masse significativement améliorée sur les premières 24 heures par rapport au témoin ER-8159-GAND-8159 (CNCM 1-4997).
Quatre transformants ont été déposés à la CNCM : la souche ER-GAND-XAN-IC cil déposée, le 26 avril 2017, à la CNCM sous le numéro d’accession 1-5201, la souche ER-GAND-XAN-4C c!9 déposée, le 20 décembre 2017, à la CNCM sous le numéro d’accession 1-5264, la souche ER-GAND-XTR-1C cl3 déposée, le 20 décembre 2017, à la CNCM) sous le numéro d’accession 1-5265, et la souche ER-GAND-XTR-4C c!2 déposée, le 20 décembre 2017, à la CNCM sous le numéro d’accession 1-5266.
F. Conclusion
L’étude décrite dans cet Exemple a permis d’obtenir des transformants de la souche ER-GAND-8159. Ces transformants possèdent 1 copie ou 4 copies des gènes de xylanase d Aspergillus niger ou de Trichoderma reesei, en utilisant la stratégie d’intégration multicopies en une seule étape via l’obtention de modules d’expression spécifiquement conçus. Dans un deuxième temps, les Inventeurs se sont attachés à valider, par PCR, le génotype des transformants obtenus ainsi que leur phénotype d’hydrolyse du xylane, et ils se sont assurés que leurs capacités de production d’éthanol et d’hydrolyse de l’amidon n’avaient pas été négativement impactées par les modifications génétiques réalisées.
Exemple 2; Evaluation des Performances Fermentaires des Souches sur un Substrat de Production de Bioéthanol
A. Préparation d’un Hydrolysat de Maïs pour Evaluation des Souches Présentant une Activité Xylanase.
- 24 Afin de mettre en œuvre les souches générées dans cette étude, un milieu de fermentation pour production de bioéthanol a été préparé. Ce milieu est défini pour se rapprocher des substrats du marché utilisant le maïs. Pour cela, des gritz de maïs (« Crème de Maïs » - MQ-FT -19, moulins Waast) ont été mis en suspension de manière à obtenir un mélange à environ 30%' de matière sèche dans l’eau. Le pH de cette suspension a ensuite été ajusté à 6 au moyen d’une solution d’hydroxyde de potassium à 40%, et une enzyme de type a-amylase (Liquozyme SC-DS, Novozymes) a été ajoutée à hauteur de 0,85 mL d’enzyme par kg de gritz mobilisé. Un traitement thermique de liquéfaction a ensuite été appliqué à la suspension pendant une durée de 3 heures à 85°C. Une composition type en sucres libérés après traitement thermique est présentée dans le Tableau 4 ci-dessous (matière sèche mesurée: 29,1%).
Tableau 4 ; Composition en Sucres Disponibles dans le Substrat Liquéfié.
Sucres Concentrations (g/kg)
Maltose 23,9
Glucose 6,3
Fructose 0,7
Glycérol 0,3
Le substrat liquéfie présente un potentiel total de glucose mesuré par méthode enzymatique de 226 ggiucostAgsubsuatB. Evaluation de la Performance en Production d’Ethanol des Souches Modifiées par Addition de Gènes Xylanase
Quatre transformants ont été testés pour leur performance en fermentation alcoolique (2 clones intégrant la xylanase d’Aspergillus niger, l’un possédant 1 copie du gène et l’autre possédant 4 copies du gène: et 2 clones possédant chacun 1 copie du gène de la xylanase de Trichoderma reseiï) sur le substrat liquéfié, en comparaison de la souche de référence ER-GAND-8159 (CNCM 1-4997).
Préparation de Crèmes de Levures à Partir des Souches Choisies pour l’Evaluation. Chacune des cinq souches retenues pour l’évaluation ont été cultivées sur boîte de Pétri pendant 24 heures puis conservées au réfrigérateur avant utilisation. Chaque souche a ensuite été prélevée et utilisée pour ensemencer 100 mL de milieu acide (par exemple milieu YM) dans des ballons de 250 mL. Les ballons ont été placés dans un incubateur une température de 26°C pendant 24 heures.
- 25 A Tissue de cette incubation, chaque milieu a été placé en centrifugation à 4500 rpm pendant 5 minutes. Après élimination du surnageant, 150 mL d’eau stérile ont été ajoutés pour procéder au lavage des levures. Une seconde centrifugation a alors été réalisée, puis après élimination du surnageant, le culot a été repris dans 20 mL d’eau stérile, homogénéisé au vortex puis stocké au froid avant d’être utilisé pour ensemencer les échantillons des tests de fermentation.
Réalisation des Essais de Fermentation. Pour chaque souche évaluée, 100 g de substrat liquéfié ont été placés en ballon de 250 mL. Un ajout d’azote minéral a été effectué sous la forme d’urée à hauteur de 0,5 g d’azote par kg de substrat. Le pH a alors été ajusté à 5 à l’aide d’une solution d’acide sulfurique 0,5 N. Chaque souche stockée sous forme de crème a ensuite été ajoutée dans le milieu à hauteur de 0,5 g de matière sèche de crème par kg de substrat. Une fois les souches ajoutées dans leurs ballons respectifs, les essais ont été placés en incubateur à 32°C, sous une agitation orbitale de 100 rpm .
Le suivi des essais a été réalisé par acquisition en ligne de la pression de CO2 générée par la fermentation, exprimée en perte de masse équivalente. En fin de fermentation, les moûts ont été prélevés et analysés par HPLC pour mesurer les concentrations des différents composés biochimiques et déterminer les bilans fermentaires.
Résultats Obtenus. La Figure 2(A) présente les cinétiques fermentaires observées. Il apparaît qu’à l’exception de la souche ER-GAND-XTR-1C-C18 qui présente un retard sur les cinétiques initiales, toutes les souches présentent un début de fermentation similaire pendant les 36 premières heures de fermentation. /Après 36 heures, la souche référence ER-GAND-8159 ralentit, de même que la souche ER-GAND-XTR-1C-C13 (I5265) dont la cinétique est identique. Les deux souches exprimant le gène xylanase d’Aspergillus niger poursuivent la. fermentation à une vitesse supérieure et produisent une quantité supérieure de CO? lors du test. La souche ER-GAND-XTR-1C-C18 qui avait un retard cinétique initial, rattrape la référence à 54 heures de fermentation et la dépasse pour terminer légèrement en retrait par rapport aux deux souches ER-GAND-XAN.
En fin de fermentation, des analyses ont été réalisées afin de mesurer les gains de performance des nouveaux transformants. La Figure 2(B) illustre les valeurs de teneur en éthanol, de ratio massique glycérol/éthanol ainsi que le rendement en éthanol calculé sur le potentiel en glucose du substrat utilisé.
On observe que les transformants ER-GAND-XAN présentent un avantage sur la production d’éthanol (meilleur titre et meilleur rendement) ainsi qu’une production réduite de glycérol. Concernant les souches ER-GAND-XTR, seul le clone 8 présente un avantage sur ces mêmes paramètres, le clone 3 étant similaire à la référence en termes de performances.
Le Tableau 5 ci-dessous présente l’ensemble des données collectées lors des tests pour comparer les performances à la référence. La partie gauche du tableau présente les valeurs brutes et la partie droite présente le gain observé en relatif par rapport à la référence.
Les souches présentant un gain en production d’éthanol présentent donc parallèlement une réduction dans la production de glycérol. Cependant, cette réduction du glycérol ne permet pas d’expliquer le gain d’alcool; le gain de rendement provient d’une consommation plus efficace du glucose du milieu rendue possible par l’action de la xylanase produite par chaque souche. Ce résultat est confirmé par les mesures de sucres totaux en fin de fermentation présentés dans la Figure 3: les souches présentant un avantage sur leur rendement en éthanol ont également un taux de sucres résiduels réduit.
Tableau 5: Résultats des Tests de Performance des Transformants
Valeurs absolues (en %) Gains relatifs par rapport à la référence (en %)
Référence* CI1* Ci9* CI3* CI8*
Pourcentage de consommation du glucose (% p/p) 95,9 96,4 (0,5) 96,2 (0,2) 96,0 (0,0) j 96,6 | (0,7)
Teneur en éthanol (g/kg) 113,6 116,9 (2,8) 117,0 (2,9) 113.3 (-0,2) i 115,6 (1,7)
Productivité volumétrique (g/kg/h) 1,62 1,59 (-2,0) 1,60 (-1,9) 1,62 (-0,2) ί 1,58 j (-3,1)
Productivité volumétrique maximale(g/kg/h) 6,1 6,0 (-L8) 6,0 M ,2) 6,0 (-L8) ί 5,9 (-3,5)
Rendement en éthanoi (% p/p) 39,7 40,7 (2,5) 40,7 (2,6) 39,6 (-0,2) ί 40,3 j (1,7)
Ratio glycérol/éthanol (% p/p) 8,9 8,5 (-5,4) 8,5 (-4,5) 8,9 (0,1) I 8,3 I (-7,6)
Rendement en glycérol (% p/p° 3,43 3,31 (-3,6) 3,35 (-2,2) 3,42 (-0,2) 3,20 I (-7,1)
* Référence = ER-GAND-8159; Cil = ER-GAND-XAN-IC-cll (1-520 1);
C19 - ER-GAND-XAN-4C-C19 (1-5264); C13 = ER-GAND-XTR- 1C-c13 (1-5265); et C18 = ER-GAND-XTR-1C-C18.
Conclusion. L’introduction des gènes codant pour la xylanase d’Aspergillus niger dans la souche ER-GAND-8159 (14997) a permis d’améliorer significativement la performance en production d’éthanol. Le gain de rendement mesuré en fermentation sur un hydrolysat de maïs se situe entre 2,5% et 2,6% par rapport à la souche de référence.
L’action de la xylanase sur la matrice de fermentation est bénéfique à Faction des glucoamylases en leur permettant un meilleur accès à l’amidon du milieu tout en réduisant la réponse en glycérol des souches. Ce double gain de sucre (réduction du flux dirigé vers le glycérol et accroissement du glucose libéré par les glucoamylases) conduit à une meilleure production d’éthanol. La souche ER-GAND-XTR-lc présente un avantage 10 similaire, bien que légèrement moindre dans cet exemple.

Claims (17)

  1. Revendications
    1. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu’elle coexprime :
    un gène codant une xylanase d’origine fongique;
    un gène codant une glucoamylase d’origine fongique; et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus.
  2. 2. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1, caractérisée en ce que la xylanase d’origine fongique est une xylanase d'Aspergillus niger ou une xylanase de Trichoderma reesei.
  3. 3. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 2, caractérisée en ce que la xylanase d’origine fongique est une xylanase d’Aspergillus niger qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 5 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 6 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 6.
  4. 4. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 2, caractérisée en ce que la xylanase d’origine fongique est une xylanase de Trichoderma reesei qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 7 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 8 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 8.
  5. 5. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 3 ou consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 4.
  6. 6. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la glucoamylase d’origine fongique est choisie dans le groupe consistant en: une glucoamylase & Aspergillus niger, une glucoamylase de Saccharomycopsis fibuligera, une glucoamylase de
    -29Trichoderma reesei, une glucoamylase de Thermomyces lanuginosis, une glucoamylase de Rhizopus oryzae et une glucoamylase à' Aspergillus oryzae.
  7. 7. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 6, caractérisée en ce que la glucoamylase d’origine fongique est une glucoamylase d’Aspergillus niger qui est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO: 1 ou qui consiste en la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2 ou un variant fonctionnel de la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 2.
  8. 8. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu’elle comprend:
    m copies du gène codant la xylanase d’origine fongique;
    n copies du gène codant la glucoamylase d’origine fongique; et p copies du gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus, où m est un nombre entier compris entre 1 et 10, n est un nombre entier compris entre 2 et 10, et p est un nombre entier compris entre 2 et 10.
  9. 9. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 8, caractérisée en ce que m est 1 ou 4.
  10. 10. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce que n est 6 et p est 4.
  11. 11. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que le gène codant la xylanase d’origine fongique, le gène codant la glucoamylase d’origine fongique, et le gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus sont intégrés au sein du génome de ladite souche de levure.
  12. 12. Souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle est la souche déposée le 26 avril 2017 à la CNCM sous le numéro 1-5201.
  13. 13. Méthode d’obtention d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae utile pour la production de bioéthanol, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
    (a) modifier génétiquement une levure de Saccharomyces cerevisiae de manière à ce qu’elle co-exprime un gène codant une xylanase d’origine fongique, un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus ou obtenir une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 ;
    (b) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (a) sur un milieu synthétique dextrine; et (c) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
  14. 14. Méthode pour augmenter le rendement de production en bioéthanol d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae, ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
    (a) fournir une levure de Saccharomyces cerevisiae co-exprimant un gène codant une glucoamylase d’origine fongique, et un gène codant la glucoamylase de Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus', (b) modifier génétiquement la levure de l’étape (a) de manière à ce qu’elle exprime en outre un gène codant une xylanase d’origine fongique;
    (c) mettre en culture et faire fermenter la levure obtenue à l’étape (b) sur un milieu synthétique dextrine; et (d) sélectionner au moins une souche présentant une cinétique de fermentation au moins égale ou supérieure à la cinétique de fermentation de la souche déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro 1-4997.
  15. 15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que la levure de Saccharomyces cerevisiae de l’étape (a) est la souche de levure de Saccharomyces cerevisiae déposée le 9 juillet 2015 à la CNCM sous le numéro I4997.
  16. 16. Méthode de production de bioéthanol à partir d’une biomasse, ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
    (a) préhydrolyser et liquéfier l’amidon de la biomasse;
    (b) faire réagir l’amidon liquéfié obtenu à l’étape (a) avec une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 pour produire du bioéthanol; et (c) extraire le bioéthanol produit à l’étape (b).
  17. 17. Utilisation d’une souche de levure de Saccharomyces cerevisiae selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, pour la production de bioéthanol.
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