EP4065372A1 - 3d scaffold consisting of a biocompatible polymer with a colonisation volume open at the top for biological cells, and with a canal-type vessel surrounding the colonisation volume - Google Patents

3d scaffold consisting of a biocompatible polymer with a colonisation volume open at the top for biological cells, and with a canal-type vessel surrounding the colonisation volume

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Publication number
EP4065372A1
EP4065372A1 EP20825141.3A EP20825141A EP4065372A1 EP 4065372 A1 EP4065372 A1 EP 4065372A1 EP 20825141 A EP20825141 A EP 20825141A EP 4065372 A1 EP4065372 A1 EP 4065372A1
Authority
EP
European Patent Office
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framework
channel
photopolymerizable
shaped vessel
photocrosslinkable
Prior art date
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Pending
Application number
EP20825141.3A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Lutz KLOKE
Alexander Thomas
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Cellbricks GmbH
Original Assignee
Cellbricks GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Cellbricks GmbH filed Critical Cellbricks GmbH
Publication of EP4065372A1 publication Critical patent/EP4065372A1/en
Pending legal-status Critical Current

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    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
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    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
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    • C12M23/20—Material Coatings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
    • B81B—MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS, e.g. MICROMECHANICAL DEVICES
    • B81B2201/00—Specific applications of microelectromechanical systems
    • B81B2201/05—Microfluidics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • 3D framework made of biocompatible polymer with an upwardly open colonization space for biological cells and with a channel-shaped vessel surrounding the colonization space
  • the present invention relates to a 3D framework (3-dimensional framework) made of biocompatible polymer, which has the following: a depression open to the top of the 3D framework as a colonization space for biological cells, a channel-shaped vessel inside the 3D framework that contains the Settlement space at least partially surrounds a filling opening for the channel-shaped vessel and an outlet opening for the channel-shaped vessel.
  • the present invention also relates to the production of the 3D framework according to the invention and its use for colonizing the colonization area with biological cells.
  • Spheroids are tight packs of cells with a round shape. They lack any physiological form. If the user also wants to work with several cell types in parallel in one object, he has no choice but to form a spheroid from the desired cell types. Here, however, the shape of the spheroid is undirected and leads to a random distribution of the cells in the spheroid. The cells cannot be positioned discretely from one another through this process. A vascular system cannot be built up in a directional manner by casting or spheroids. The only possibility is spontaneous self-organization by cells, which, however, is not controlled and not reproducible. A connection to a microfluidic platform is also not possible, since the respective connections are each positioned at a defined point.
  • the 3D framework according to the invention offers the possibility of creating complex biological cell architectures that can be supplied with nutrients via a vessel and connected to a microfluidic platform.
  • the 3D framework presented here is intended in particular for a user who does not have access to lithographic 3D printing or bioprinting, but would like to produce 3D cell culture constructs.
  • EP 3 018 531 A1 describes a 3-D printing method that allows multiple bioinks or cell types to be used in parallel in a printing process.
  • the 3D cell structure constructs are built up in parallel with the production of a matrix made of biocompatible polymer.
  • this method is not suitable for users who do not have a 3D lithographic printing device themselves.
  • the object according to the invention is achieved by a 3D framework made of biocompatible polymer.
  • the 3D framework has a depression open to the top of the 3D framework as a colonization space for biological cells, a channel-shaped vessel inside the 3D framework that at least partially surrounds the colonization space, a filling opening for the channel-like vessel, and an outlet opening for the channel-shaped vessel.
  • the channel-shaped vessel ensures that every part of the cell culture in the settlement area of the 3D framework is supplied with sufficient oxygen and nutrients. If a tissue cannot be adequately supplied due to a lack of vascularization, it threatens to die or lose its function.
  • the 3D framework according to the invention is produced by lithographic 3D printing. This makes it possible for the first time to build up a vascular system in a directed manner.
  • the 3D framework can be reproducibly printed in such a way that it is suitable for the microfluidic system selected in advance.
  • a biocompatible polymer is understood to mean a biological or biologically compatible polymer, a biological polymer (polymer occurring in living beings) being preferred.
  • Biologically compatible is to be understood here as meaning that this does not affect the lifespan of the biological cells, in particular that it does not have a toxic effect on the biological cells.
  • the expression “made of biocompatible polymer” is preferably understood to mean that the 3D framework is built up by a matrix made of one or more biocompatible polymers. Although it cannot be ruled out that the 3-D framework has other components in addition to biocompatible polymers, it is also possible that the 3-D framework consists only of biocompatible polymer.
  • the top of the 3D framework is preferably in the horizontal plane that is spanned by the X and Y axes. Likewise, the bottom is preferably also in the horizontal plane, which is also spanned by the X and Y axes.
  • the upper side and the lower side are preferably essentially congruent. In the direction of the Z axis, the 3-D framework extends in its height or depth.
  • the settlement area and the channel-shaped vessel are spatially separated from one another by a separation area made of biocompatible polymer, the biocompatible polymer of the separation area being designed so that nutrients from a liquid in the channel-shaped vessel are in diffuse the settlement area.
  • the recess which is open towards the top, is arranged centrally on the top with regard to the horizontal plane, which is spanned by the axes X and Y, and extends in a direction perpendicular to the horizontal Plane, the Z axis, extends to the bottom of the 3D framework.
  • the recess In the direction of the underside, the recess is closed off by biocompatible polymer, so that a filled-in cell suspension does not can emerge.
  • the recess is laterally to the plane that is spanned by the axes X and Y surrounded by an edge of the 3D framework.
  • This edge of the 3D framework is preferably designed in terms of its dimensions in such a way that the filling opening for the channel-shaped vessel is also arranged on the upper side of the 3D framework.
  • the recess which is open towards the top, is preferably annular, circular, oval or in a mixed form thereof with regard to its horizontal extension.
  • the recess open towards the top is designed to be mirror-symmetrical with respect to its horizontal extension.
  • the dimension of the extension of the depression in the plane that is spanned by the axes X and Y preferably decreases in the direction of the axis Z towards the bottom, particularly preferably in steps.
  • the recess very particularly preferably has a first and a second plane, both of which are spanned by the X and Y axes.
  • the dimension of the extension of the first plane is greater than the dimension of the extension of the second plane (both with regard to their extension in planes that are spanned by the axes X and Y) and merge with one another with a step.
  • the first level is preferably closer to the top of the 3D framework than the second level.
  • the recess space above the second level is preferably surrounded by the channel-shaped vessel, which preferably extends essentially along a plane that is spanned by the axes X and Y (“essentially” here means that the channel-shaped vessel in relation to the direction of the Z axis may have a slight slope). Due to the spatial proximity of the depression space above the second level, it can be supplied with nutrients from the channel-shaped vessel.
  • channel-shaped vessel runs below the first level, so that the recess space above the first level is also spatially adjacent and can be supplied with nutrients from the channel-shaped vessel.
  • the channel-shaped vessel surrounds the indentation open towards the top in a ring shape.
  • the 3D framework according to the invention preferably has two filling openings for the channel-shaped vessel, which are preferably arranged on the upper side of the 3D framework.
  • the two filling openings are preferably arranged on opposite sides. This has the advantage that a channel-shaped vessel running in a ring around the depression can be evenly supplied with a nutrient solution.
  • the 3D framework according to the invention preferably has two outlet openings for the channel-shaped vessel, which are preferably arranged on the side surfaces of the 3D framework that run perpendicular to the plane of the upper side.
  • the two outlet openings are preferably arranged on opposite sides of the 3D framework.
  • the 3D framework according to the invention can be obtained by a lithographic 3D printing process. This procedure is described in more detail below.
  • the present invention also relates to a 3D framework according to the invention in which the colonization space is colonized with biological cells.
  • the colonization space is colonized with biological cells.
  • the channel-shaped vessel can either be populated with biological cells or not populated.
  • the channel-shaped vessel is also populated with cells, preferably with endothelial cells to form the wall of a blood vessel.
  • the endothelial cells preferably colonize the inner surface of the channel-shaped vessel.
  • the colonization with biological cells in the colonization space or in the channel-shaped vessel is preferably carried out by filling a liquid into the colonization space or the channel-like vessel. With the latter, preferably via the filling opening (s).
  • the liquid used to colonize the colonization space or the channel-shaped vessel is preferably a suspension containing biological cells (hereinafter referred to as cell suspension).
  • the liquid used to colonize the colonization space preferably contains cell spheroids.
  • the liquid used preferably contains a gel former which, after filling, forms a stable hydrogel, as a result of which the incorporated cells or cell spheroids are immobilized.
  • enzymatically crosslinking gels eg fibrin
  • physically crosslinking gels eg collagens
  • photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can be used.
  • the settlement area is preferably populated by inserting a tissue resection or a biopsy (so-called ex vivo culture).
  • tissue resection / biopsy can be glued in with a gel-forming liquid.
  • the 3D framework according to the invention is preferably produced by a lithographic 3D printing process, preferably a stereolithographic 3D printing process.
  • a stereolithographic 3D printing process is one in which the structure of the 3D framework is gradually produced by layer-by-layer curing of photopolymerizable or photo-crosslinkable substances.
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable substances are used in the form of photopolymerizable or photocrosslinkable liquids.
  • the construction of a 3D framework from biocompatible polymer using a stereolithographic 3D printing process offers the possibility of printing a biocompatible polymer in a physiological form so that the material and architecture resemble the structure to be imitated in the human body.
  • the present invention thus also relates to a method for producing a 3D framework according to the invention by curing a photopolymerizable or photocrosslinkable substance by focusing electromagnetic radiation in a focal plane in which the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is present. Preferred embodiments of the method are described below.
  • the curing of a photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably achieved by focusing electromagnetic radiation in a focal plane in which the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is present.
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably in liquid form, for example dissolved in a solvent. In the following, this is referred to as a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • the 3D framework according to the invention can be built up by repeating the focusing of a further electromagnetic radiation in a further focal plane using a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • Photopolymerizable is to be understood here as meaning that the corresponding substance can be polymerized by the action of electromagnetic radiation and, if appropriate, the presence of a photoinitiator.
  • photocrosslinkable should be understood to mean that an oligomer or polymer can be crosslinked by the action of electromagnetic radiation and, if appropriate, the presence of a photoinitiator.
  • the 3D framework according to the invention can be constructed from a homogeneous material and consequently only comprise a biocompatible polymer of a single type.
  • the 3D framework can be built up from different biocompatible polymers, ie is a heterogeneously structured 3D framework. In doing so, its production used at least two different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids. In this way, different polymer structures can be realized within the 3D framework.
  • the area between the settlement area and the channel-shaped vessel can be surrounded by a polymer structure that differs from the polymer structure of the rest of the framework of the 3D framework in order, for example, to have a greater porosity that allows nutrients of a nutrient-containing liquid to penetrate allow the channel-shaped vessel into the settlement area.
  • the colonization space can also have columns, grids or cross braces in order to enable the biological cells to adhere to its inner surface.
  • the properties of the polymer structure or of the various polymer structures within the 3D framework can be influenced by the choice of the monomers to be polymerized or the polymers to be crosslinked in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid (s).
  • the higher the degree of crosslinking the smaller the interstices or pores of the resulting matrix of the 3D framework.
  • the 3D framework according to the invention is composed of a first biocompatible polymer and at least one further biocompatible polymer that is different from the first biocompatible polymer. Furthermore, in a variant of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the area between the colonization space and the channel-shaped vessel has the at least one further biocompatible polymer.
  • a layered build-up of the 3D framework can be achieved. It is possible to form roofed cavities, such as the channel-shaped vessel, in the 3D framework. Furthermore, undercuts and overhanging structures can also be formed, since the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can also be polymerized or crosslinked in a specific focal plane or layer if there is no already polymerized or crosslinked material underneath, but only not yet polymerized or crosslinked Liquid.
  • the filling opening (s) is / are arranged on the upper side of the 3D framework. This has the advantage that a cell suspension can be poured into the 3D framework directly from above.
  • the filling opening (s) is / are preferably arranged at the edge on the upper surface of the 3D framework.
  • the filler opening (s) is / are preferably designed as a filler neck.
  • a hollow cylindrical or hollow prismatic connector is placed on the preferably round filling opening. This makes it easier to attach a pipette tip and to fill the channel-shaped vessel with cell suspension.
  • the outlet opening (s) is / are arranged laterally on the 3D framework. This enables the outlet opening (s) to be arranged at a lower point than the filling opening, so that liquid already present in the channel-shaped vessel can be displaced by filling in a cell suspension.
  • the 3D framework according to the invention particularly preferably has two outlet openings which are arranged on opposite sides of the 3D framework.
  • the 3D framework according to the invention preferably has a flat shape, ie is preferably larger in its horizontal dimensions than in the vertical dimension.
  • the 3D framework can have any base area, such as, for example, circular, oval, rectangular or square, the last two also with rounded corners, a rectangular or square shape being preferred.
  • the 3D framework preferably extends prismatically in the vertical, ie the base area does not change significantly in the vertical direction.
  • the diameter is preferably in the range from 100 ⁇ m to 10 cm.
  • the height is preferably in the range from 100 ⁇ m to 10 cm.
  • the shape of the channel-shaped vessel can be round, oval or angular in cross section, preferably round, with a diameter in the range from 1 ⁇ m to 2 cm.
  • the settlement area preferably has a diameter in the range from 10 ⁇ m to 8 cm.
  • the volume of the settlement area is preferably in the range from 1 pl to 50 ml.
  • the 3D framework is one that can be obtained with the aid of a lithographic 3D printing process.
  • the production of the 3D framework according to the invention is preferably divided into the following process steps:
  • the further focal plane in step (V) preferably differs from the first focal plane at least with regard to the already produced polymerized or crosslinked structure or with regard to the layer of this polymerized or crosslinked structure.
  • connection of the polymerized or crosslinked structures produced in step (VI) is preferably a connection by means of covalent bonds.
  • non-covalent bonds for example based on physical interactions, are also possible.
  • One or more of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids used in the manufacturing process can contain biological cells. If the radiation of electromagnetic radiation leads to polymerization or crosslinking, the cells contained in the liquid are also embedded in a corresponding polymer. According to the invention, however, it is preferred that no biological cells are used in the lithographic 3D printing process so that the 3D framework can be stored in a simple manner before the subsequent colonization by the user can take place.
  • Wells of commercially available microtiter plates for example microtiter plates with 6, 12, 24, 48, 96, 384 or 1536 wells
  • cell culture bottles or Petri dishes can be used as reaction vessels in the manufacturing process for the 3D framework according to the invention.
  • the 3D framework according to the invention is one that is transparent at least in the range of visible light. In this way, the subsequent colonization with biological cells can be followed optically and recorded.
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable substance in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is preferably one which has a photoreactive group which can form covalent bonds with further photoreactive groups.
  • the photoreactive group is an acrylic group, by means of which the polymerization or crosslinking is brought about.
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably an acrylic compound, for example one from the following group: methacrylates, methyl acrylates, ethyl acrylates, hydroxyethyl acrylates, butyl acrylates, trimethylolpropane acrylates, triacrylate acrylates and polyacrylates (PA) in general.
  • the substance to be polymerized or crosslinked can be a polymer, an oligomer or a monomer. These are preferably carbon-based substances. In the case of the monomers, it is photopolymerized. In the case of polymers or oligomers, photocrosslinking is preferred.
  • acrylamides vinyl chloride, ethylene, propylene, isoprene, caprolactam, all amino acids, (de) oxyribonucleotides, glucose, or all monosaccharides and the aforementioned acrylates.
  • oligomers or polymers polyethylene glycol (PEG), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyketone (PK), Polyvinyl chloride (PVC), polystyrene (PS), polytetrafluoroethylene (PTFE), polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU).
  • Synthetic polymers such as silicones, polydimethylsiloxane (PDMS) or resins such as melamine or melamine-formaldehyde resins are also suitable as starting substances.
  • Biopolymers such as proteins, DNA, RNA, carbohydrates and carbohydrate derivatives, collagens, fibrins, alginates, gelatine, hyaluronic acids or polylactides are also suitable as starting substances.
  • the monomer precursors or oligomer precursors of these polymers as starting substances, provided that they can be provided in a stable manner in the solid or liquid state of aggregation.
  • a photoreactive group for example an acrylic group
  • photopolymerizable PDMS is used as a matrix or as a covering substance, gas exchange between the cells embedded in this matrix is possible.
  • different coating substances or matrices can be used.
  • a stable plastic can be used for the rest of the matrix in order to create an object that is stable on the outside and inside a matrix that enables cell growth and is less stable.
  • the starting substance supplemented by the photoreactive group is used in a liquid manner, with different viscosities being possible.
  • the production method for the 3D framework according to the invention is not limited to photopolymerizable or photocrosslinkable liquids with a certain viscosity, but rather low-viscosity liquids can also be used. Both Newtonian and non-Newtonian liquids can be used.
  • the liquids can be solutions or colloid-disperse mixtures such as suspensions.
  • the liquids can range from aqueous to oily Have character. This is determined, among other things, by the choice of the starting substances and their particle size.
  • a radical generator (a so-called photoinitiator) is also preferably used, which forms radicals at a selected wavelength of the electromagnetic radiation used in the process.
  • Suitable radical formers are, for example, anthrone derivatives such as violanthrone or isoviolanthrone, fluorescein, rubrene, anthrazine derivatives, tetrazene derivatives, benzanthrone, benzanthronil, eosin, levolinic acid derivatives, phosphine derivatives, mono- and bis-acyl phosphines, metallocenes, acetophenones, xanthones, Ketone derivatives, hydroxy ketones, amino ketones, benzoyl peroxides, pyridine salts, phenyl glyoxylates and / or iodonium salts.
  • anthrone derivatives such as violanthrone or isoviolanthrone, fluorescein, rubrene, anthrazine derivatives, tetrazene derivatives, benzanthrone, benzanthronil, eosin, levolinic acid
  • a vinyl macromer and an amine-based co-initiator are preferably used in order to allow the photopolymerization or photocrosslinking to proceed in a particularly suitable manner.
  • a co-initiator for example, ascorbic acid and tertiary amine derivatives, such as methyldiethanolamine or tetraethylamine, are suitable.
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid has a thiol derivative.
  • Suitable thiol derivatives are dithiothreitol, monofunctional cysteines, bifunctional peptides and similar compounds.
  • a substance can be added to the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid which prevents photopolymerization or photocrosslinking of deeper, liquid layers.
  • liquid solution outside the focal plane remains liquid, even if it is in the irradiation area of the focal plane lying above it. This works by absorbing the substance at the wavelength at which the polymerisation takes place (polymerising wavelength). The interception takes place in the focal plane, so that no intrusion of the polymerizing wavelength in deeper layers is possible. All substances that absorb in the desired wavelength, such as dyes, are suitable.
  • the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and / or one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquids and / or another liquid that does not have to be photopolymerizable have a temperature-sensitive gel former.
  • a temperature-sensitive gel former In particular, the use of an inverse temperature-sensitive (also referred to as reverse temperature-sensitive) gel former is provided. Such a gel former becomes firmer with increasing temperature.
  • the reaction liquid solidifies and initially only forms a metastable gel. If the liquid is not photopolymerized or photocrosslinked at the same time, the metastable gel can be liquefied again and pumped out by subsequent cooling of the 3D framework.
  • the temperature conditions to be used are exactly the opposite. If necessary, for example, a support structure can be created so that hanging structures can be created. If, on the other hand, the metastable gel is at least partially irradiated with electromagnetic radiation at a suitable wavelength, photopolymerization occurs, so that the metastable gel is converted into a stable gel or polymer in these areas.
  • the temperature-sensitive, in particular inverse-temperature-sensitive, gel former and temperature control of the reaction space make it even easier to work with hanging parts and undercuts or cavities. In this variant, too, you can continue to work with liquid structures as a support.
  • the aforementioned individual components can be contained as individual substances in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • the substances or groups preferably used for gel formation in a single polymer instead of a mixture of individual components, such a polymer would then have different functional groups which combine all of the functions required or preferably to be used for photopolymerization or photocrosslinking.
  • enzymes can also be used to digest the polymer.
  • the principle is as follows: A 3D framework with cavities / undercuts (e.g. a canal system) is printed as a solid body in that all cavities are filled with a sacrificial material during printing, which is later (i.e. after the printing is completed) by giving the correct enzyme can be resolved.
  • the sacrificial material is, for example, a digestible polymer that is digested by adding a digestive enzyme. This is an elegant strategy for creating voids with stereolithographic printing processes.
  • a hyaluronidase digesting enzyme
  • hyaluronic acid sacrificial material
  • a photoblocker can also be used in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid to create a cavity / undercut, the photoblocker restricting the curing depth of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is only introduced into the reaction vessel when the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid previously located in the reaction vessel (this can, for example, be the one photopolymerizable or photocrosslinkable Liquid or another photopolymerizable or photocrosslinkable liquid) was removed from the reaction vessel.
  • the 3D framework can be irradiated with electromagnetic radiation of a low wavelength (for example in the UV range, that is below 380 nm) during or at the end of its manufacturing process in order to achieve sterilization in this way.
  • electromagnetic radiation of a low wavelength for example in the UV range, that is below 380 nm
  • a carrier plate or carrier structure is arranged in the reaction vessel, to which the first polymerized or crosslinked structure is bound.
  • the use of such a carrier plate is advisable when the 3D framework created is not to be examined later in the reaction vessel itself, but is to be removed from the reaction vessel.
  • screw connections (such as DIN screw connections) can be present in the carrier plate in order to enable a subsequent supply of the generated 3D framework with liquids and gases. It is also possible to introduce such screw connections into the matrix of the 3D framework within the scope of the manufacturing process, that is to say to generate these screw connections there in the matrix. The creation of such screw connections in the matrix can be carried out regardless of whether a carrier plate is used or not.
  • a carrier plate is, before the step of generating a first polymerized or crosslinked structure, by irradiating electromagnetic radiation into a focal plane which is within a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid (in particular with the first or one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid) Filled area of the reaction vessel is generated by a polymerized or crosslinked support structure is formed, which has the support plate or is.
  • the support structure can have such a shape that a spacing is formed between the support plate and a bottom of the reaction vessel.
  • the Focal planes of the actual polymerization or crosslinking reactions at a greater distance from the bottom of the reaction vessel.
  • the first polymerized or crosslinked structure formed then has a greater distance from the bottom of the reaction vessel. Polymerizable or crosslinkable liquids that are no longer required can then be suctioned out of the reaction vessel particularly easily.
  • an optical system is arranged between a source for the electromagnetic radiation (radiation source), which is used to generate one and / or the other electromagnetic radiation, and the reaction vessel, which is used to focus the electromagnetic radiation on the respective focal plane in the reaction vessel serves.
  • this optical system can be refocused in order to change the focal plane within the reaction vessel.
  • Such a refocusing can be achieved, for example, by changing the distance between the optical system and the radiation source.
  • a computer-controlled stepper motor can be provided in order to convey a corresponding movement of the optical system.
  • the optical system can be, for example, a system of optical lenses or - in a case that is particularly simple in terms of construction - a single focusing lens.
  • a relative movement which can be brought about, for example, by moving the reaction vessel, by moving the carrier plate arranged in the reaction vessel, or by moving the radiation source, can also change the focal plane within the reaction vessel.
  • no refocusing of an optional optical system is consequently required. This can reduce the risk of optical misalignments.
  • one and / or the other electromagnetic radiation is directed to a defined and predeterminable area in the respective focal plane within the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and / or the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • a specific radiation pattern can be specified which strikes the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and serves at these points to polymerize or crosslink the liquid to form a polymer or a gel (the matrix).
  • a radiation pattern can be generated, for example, through the use of masks or diaphragms, but also through the use of pulsed radiation or the digital modulation of a radiation signal.
  • Polymerization or crosslinking occurs in the areas of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid that are hit by the radiation. In the other areas not struck by the radiation, the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid remains in its unpolymerized or uncrosslinked state. As a result, the radiation defines the areas where printing of the polymerized or crosslinked structure takes place.
  • the resolution depends on the wavelength of the radiation used. Even with long wavelengths that are regularly used, it is better than the resolution that can be achieved with the conventional methods known from the prior art. The more precisely the radiation source can be focused, the greater the resulting resolution. For example, very high resolutions can be achieved with a laser.
  • the irradiation pattern selected in each case can be provided by a computer program, for example. It is thus conceivable that a user creates the 3D framework to be produced by means of a CAD program. The digital object created in this way is then cut into individual irradiation planes by a suitable computer program. Furthermore, a specific photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is assigned to each level or to different locations of each level. Control information for a printer, by means of which the method described is carried out, is created for this information. These Control information specifies when which photopolymerizable or photocrosslinkable liquid has to be introduced into the reaction vessel. This control information also specifies when which image of an irradiation plane is to be projected onto the respective focal plane in the reaction vessel. In this way, the 3D framework previously created on the computer can then be converted into a real 3D framework.
  • more than one polymerized or crosslinked structure is produced in the same layer (that is to say in the same focal plane).
  • a first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is first polymerized or crosslinked.
  • the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is then removed from the reaction vessel and a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is introduced into the reaction vessel.
  • a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is introduced into the reaction vessel.
  • the second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can then be removed from the reaction vessel and a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can be introduced into the reaction vessel.
  • the fill level of this further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can now be brought to a level such that the previously formed layer is completely covered.
  • the focal plane can then be shifted and a further layer of the 3D framework to be generated can be built up using a corresponding polymerized or networked structure. It is basically possible that individual
  • Layers of the generated 3D framework are homogeneous (comprising a polymerized or crosslinked structure of a single type) and other layers are heterogeneous (comprising polymerized or crosslinked structures of different types), the number of individual structures per layer not being limited.
  • heterogeneously composed layers with 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 polymerized or crosslinked structures have proven to be useful.
  • at least the first structure of the first layer, but in particular each structure of the first layer is irradiated with the first radiation from two different directions. In this case, these two different directions are preferably opposite to one another.
  • the reaction vessel With such an irradiation from two different directions, a particularly firm anchoring of the first layer on the inner surface of the reaction vessel or on a carrier plate which is arranged in the reaction vessel is achieved. As a result, a later secure hold of the entire generated 3D framework on the reaction vessel or on a carrier plate in the reaction vessel is achieved, whereby subsequent examinations on the 3D framework can be facilitated.
  • the irradiation is typically carried out from above in a reaction vessel that is open at the top.
  • the first layer is then preferably additionally irradiated from below through the bottom of the reaction vessel.
  • the reaction vessel must be made of a material that is permeable to radiation with the selected wavelength.
  • the subsequent layers which are arranged above the first layer, are then preferably exposed from only one direction (namely preferably from above) so that the polymerized or crosslinked structures already formed are not between the focal plane of the radiation and a radiation source used to emit the radiation and are therefore not penetrated again by the radiation in front of its focal plane.
  • the first electromagnetic radiation and / or the further electromagnetic radiation have a wavelength in the range from 200 nm to 1000 nm (i.e. a wavelength that lies between the UV range and the infrared range), more preferably in the range of 350 nm and 800 nm.
  • the substances preferably used as radical formers can be excited particularly well, so that radicals are formed in order to enable polymerization or crosslinking of starting substances bearing acrylic residues.
  • suitable wavelengths of the electromagnetic radiation used are in the range from 250 nm to 950 nm, in particular from 250 nm to 850 nm, in particular from 300 nm to 800 nm, in particular from 300 nm to 750 nm, in particular from 300 nm to 700 nm, in particular from 350 nm to 650 nm and especially from 350 nm to 400 nm.
  • the radiation used for the polymerization or crosslinking can comprise the same wavelength or different wavelengths from the aforementioned wavelength range in order to enable suitable polymerization of the different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids.
  • the individual radiations can be generated by different or by one and the same radiation source.
  • the method is carried out in such a way that at least one functional element is introduced into the 3D framework while the 3D framework is being generated.
  • the functional element is selected from the group consisting of membranes, channels, pores, sensors, columns, grids, nets, cross struts, or electrically conductive supports and chemotactic preparations. Channels and pores can be integrated into the object, for example, by leaving certain areas of the formed polymerized or cross-linked structure exposed in several layers on top of one another.
  • Membranes can be formed by introducing lipid molecules into the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • salt bridges can also be introduced within the 3D framework with the help of photopolymerization or photocrosslinking. This is particularly easy if the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid contains salts, that is to say contains salts. In this way, electrical derivation and enervation of the printed 3D framework can then take place.
  • the 3D framework no longer needs to be manipulated afterwards, but can be read out directly via the sensors that have already been introduced.
  • the targeted growth / colonization of biological cells within the 3D framework can be made possible after its completion.
  • the chemotactic preparation is an attractant, it exerts a positive chemotaxis, so that the biological cells in the 3D framework will orient themselves towards areas of higher concentration of the attractant.
  • the chemotactic preparation is a deterrent, it exerts a negative chemotaxis, so that the biological cells in the 3D framework orient themselves to areas with a lower concentration of the deterrent or to areas in which the deterrent is not even present become. This enables targeted growth / colonization of cells within the 3D framework.
  • At least one fill level sensor is preferably used in order to always accurately identify the liquid level in the reaction vessel.
  • the focal plane can then be determined in which the next polymerization or crosslinking step is to be carried out.
  • the data provided by such a fill level sensor can also be used to automatically adapt the focal plane.
  • the data provided by a fill level sensor can also be used to control a pump which mediates the flow of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids into the reaction vessel. In this way, exactly such amount of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can always be introduced into the reaction vessel as is required to build up the layer that is currently desired. This keeps the amount of waste low. Furthermore, an inexpensive implementation of the entire method is made possible as a result.
  • the step of 3D printing the 3D framework can be carried out in a completely automated manner, so that intervention by a user is not required. This additionally facilitates the application of the method.
  • the period of time during which the electromagnetic radiation is radiated onto the respective focal plane can be adapted to the respective requirements of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids used. This means that each material is allowed to cure in such a time that is necessary and meaningful for the desired polymerization or crosslinking.
  • a carrier is arranged within the reaction vessel, when this carrier is raised relative to the reaction vessel, a negative pressure can result between a surrounding liquid bed and the already polymerized or crosslinked structures on the carrier.
  • a potentially prevailing negative pressure can, however, be released.
  • the carrier can be moved relative to the reaction vessel without fear of tearing off the already polymerized or crosslinked structures of the 3D framework from the carrier.
  • this carrier plate can be lifted completely out of the remaining liquid in the reaction vessel at the end of the manufacturing process.
  • the 3D framework created can then be removed from the carrier plate by the user.
  • a 3D printing device as described in EP 3018531 A1, can be used to produce the 3D framework according to the invention.
  • a temperature-sensitive, in particular an inversely temperature-sensitive, substance By adding a temperature-sensitive, in particular an inversely temperature-sensitive, substance, the creation of hanging objects and cavities in the 3D framework can be additionally improved.
  • a substance such as a poloxamer can be used in such a concentration are admixed so that the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid or a non-photopolymerizable or non-photocrosslinkable liquid gels even without irradiation in a desired temperature range.
  • the process can run as follows: If gelation is to be achieved at a temperature of approx. 20 ° C (to be referred to as "gelation temperature"), a poloxamer is added to the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid in such a concentration that the liquid gelled in this area. Mixtures of several poloxamers are also possible. If possible, the liquid can first be cooled to a temperature below the gelation point. If a hanging structure within the object is desired, the liquid containing the temperature-sensitive gelling agent can be heated to a temperature which is above the gelling temperature. The liquid then gels. At the same time, the liquid can also be photopolymerized or photocrosslinked.
  • the temperature-sensitive liquid If an area of the temperature-sensitive liquid is not photopolymerized or photocrosslinked, it is solid at the increased temperature, but can be liquefied again at any time if the temperature drops below the gelation temperature. In this way, the temperature-sensitive, gelled part can function as a support structure until the end of the printing process. After pressing has been completed, the temperature can be reduced again to below the above-mentioned exemplary setting temperature of 20 ° C. As a result, the non-polymerized or non-crosslinked, temperature-sensitive part of the liquid liquefies again and can be pumped out. If the gel liquefies, the support structure is removed and the previously supported part of the printed object, which is now photopolymerized or photocrosslinked, hangs freely.
  • the present invention also relates to a 3D framework according to the invention, the settlement area of which is at least partially colonized with biological cells.
  • the present invention also relates to the use of a 3D framework according to the invention for colonizing the settlement area with biological cells, in particular for colonization with biological cells that are supplied with nutrients within the 3D framework.
  • the present invention also relates to a method for colonizing the cavity of a 3D framework according to the invention, wherein a Cell suspension is introduced into the cavity, the biological cells introduced by the cell suspension being supplied with nutrients.
  • the present invention also relates to the use of a 3D framework according to the invention for cultivating biological cells to form a tissue or organ in its colonization area, i.e. for producing a 3D cell culture construct.
  • the present invention also relates to a method for producing a cell culture construct, or tissue or organ, by culturing biological cells in the colonization area of the 3D framework.
  • the cultivation conditions depend on the type of cells used. A person skilled in the field of biology is usually familiar with the ideal cultivation conditions for various biological cells. Those to be determined on the basis of the cell type
  • Cultivation conditions are temperature, the composition of the respective nutrient solution and the procurement of the culture vessel.
  • the conditions for human blood vessel cells from the umbilical cord can be named here as an example: 37 ° C, minimal medium with glucose, all essential amino acids, vitamins and minerals.
  • the culture is preferably located on Petri dishes or cell culture bottles that have been coated for tissue cultures (so-called tissue culture-treated surfaces). These culture conditions mentioned are favorable for numerous human cells. In the case of vascular cells, it is also necessary to use growth factors that are added to the minimal medium.
  • the 3D cell culture construct can then be penetrated with further cells, viruses, bacteria, enzymes or active substances in order to carry out tests on the construct.
  • the filling opening (s) or the opening of the settlement area can be used for this, but some substances or cells can also penetrate the material of the 3D framework in this way. In this way, for example, tumor cells can be attacked with Car-T cells.
  • this is in dry form, ie the 3D framework is dried after the process of lithographic 3D printing.
  • the 3D framework is given a more durable and easily transportable shape.
  • the 3D framework is protected from light and moisture in the refrigerator for at least six weeks storable.
  • the 3D framework shrinks slightly and becomes harder. If stored wet, the 3D framework runs the risk of spoiling more quickly.
  • the drying / vitrification is preferably carried out in a sterile environment. Suitable drying temperatures are in the range from 4 ° C to 50 ° C, more preferably in the range from 15 ° C to 25 ° C.
  • the drying can be carried out, for example, in a drying cabinet, in a climatic chamber or the like.
  • All naturally occurring eukaryotic and prokaryotic cells come into consideration as biological cells which are used for the construction of the 3D framework populated with biological cells.
  • the cells used are preferably eukaryotic cells. All cells and cell types which occur in the body of a mammal, in particular a rodent and very particularly a human, are particularly suitable.
  • the biological cells used are omnipotent or pluripotent cells.
  • the invention relates only to the use of cells that can be obtained without destroying human embryos.
  • cells from non-naturally occurring cell lines can also be used as biological cells. Artificially generated cell lines of this kind enable the customized construction of a 3D cell culture construct or three-dimensional multicellular object to be produced.
  • the framework according to the invention enables the combination of different cell types to form a 3D cell culture construct, it is particularly suitable for the production of artificial organs.
  • artificial organs can be, for example, miniaturized model objects of a naturally occurring organ, in particular a naturally occurring organ of a person or an animal, such as a mammal or a rodent. It is also possible to combine plastic polymers and biopolymers so that very stable structures can be produced in which the biological cells are embedded.
  • several 3D frameworks even with different shapes, can be created at the same time. So that the user can use the dried 3D framework according to the invention for colonization with biological cells, the 3D framework is rehydrated.
  • the 3D framework is preferably placed in water, a saline solution, a buffer, cell medium or a similar physiologically compatible liquid for a period of 60 s to 60 min. Ideally, this action takes place in a Petri dish or the like under sterile conditions. As a result, the framework regains its original size, strength and texture.
  • a suspension of biological cells and a desired solvent is preferably mixed. All solutions compatible with cells can be used as solvents. This includes all aqueous solutions that ensure cell survival. Usually substances are used to set a neutral pH value (pH 7.4) and an isotonic environment in order to get close to the fluids in the human body (e.g. blood) with the solutions.
  • the concentration of the biological cells in the solvent is preferably in a range from 100,000 to 300,000,000 cells per milliliter.
  • the cell suspension is preferably introduced into the framework via the filling opening or into the colonization space.
  • the total volume of the cell suspension to be filled is at most as large as the volume of the respective cavity (colonization space or channel-shaped vessel) of the 3D framework.
  • the user can rinse the volume into the framework, for example with the aid of a pipette.
  • Possible columns, grids or cross struts in the settlement area of the 3D framework can serve as an anchor or restraint for the biological cells during the colonization with biological cells, so that they can adhere to the 3D framework.
  • the now cell-containing construct can be further cultivated.
  • a new 3D cell culture model can now develop.
  • adherent cells the biological cells adhere to all available structures and to themselves, so that a 3D structure in the shape of the cavity of the 3D framework is created. In this way, a controlled 3D cell culture model / construct is created. If the 3D framework is to be colonized with tumor cells, for example, a 3D tumor model is created.
  • 3D cell culture constructs can be generated as models in order, for example, to depict and examine cell-cell interactions, organ biogenesis, diseases or organ functions.
  • Such a 3D cell culture construct has clear advantages over the classic two-dimensional cell culture, especially when it comes to modeling the interaction of several cell types.
  • the complexity of cell-cell interactions, the function of a natural barrier and the modeling of diseases or organs cannot be adequately represented with classic two-dimensional cell cultures.
  • the 3D framework according to the invention enables miniaturized models to be created in a particularly simple manner. Such miniaturized models have so far been partially built by hand. The effort required for this is very high; Many years of experience are also required.
  • the use of the 3D framework according to the invention provides 3D cell culture constructs which are excellently suited for generating reproducible test results.
  • the present invention has the following advantages: So far, no frameworks with undercuts or complex architectures have been possible that can be populated by a user himself.
  • the 3D framework itself functions as a hollow body, the manufacture of which would not have been possible until now without multi-material stereolithography.
  • the complex architecture with which the behavior of the cells is influenced could not be represented in this way.
  • the production method according to the invention can ensure a high level of reproducibility and parallelism. Despite the complex architecture, the 3D framework can be reproduced with millimeter precision. In addition, the system allows the production of vascular structures for the first time.
  • the system does not have to be actively shaken, as is otherwise the case in a classic shaking culture.
  • the cells remain alive in the scaffold. Due to the influence of the system, significantly longer cultivation times can be achieved.
  • the populated system can be cultivated over periods of several weeks so that it can be used as a substitute for animal experiments. Cultivation periods of several weeks have not been possible for some cell types up to now.
  • the behavior of the cells can be tracked online, since the system is preferably transparent to visible light. Continuous measurement using optical methods is guaranteed.
  • the structure is a novelty due to its shape, architecture, method of application and physical parameters.
  • Fig. 1 shows a view of an uninhabited 3D framework of a CAD
  • FIG. 2 shows a microscopic image of a printed model according to the CAD file according to FIG. 1 from below.
  • FIG. 3a shows a microscopic fluorescence image of a 3D framework according to the invention according to FIG. 2, which selectively shows those in the showing canal-shaped vessel seeded vascular cells.
  • Fig. 3b shows a transmitted light image of a 3D image according to the invention
  • FIG. 2 Scaffolding according to FIG. 2, which shows a settled cell mass in the central settlement area.
  • the 3-D framework 1 shows a model of a 3D framework 1 created in a CAD file, which can be used according to the invention.
  • the 3-D framework 1 is preferably square with rounded corners.
  • the 3D framework 1 preferably has a central, upwardly open depression as a colonization space 5 for biological cells. Furthermore, it preferably has an upwardly closed, channel-shaped vessel 2, which preferably extends in the horizontal plane around the central settlement area.
  • the upper side 7 of the 3D framework 1 is preferably located in the horizontal plane that is spanned by the X and Y axes.
  • the bottom 8 is preferably also in a horizontal plane, which is also spanned by the X and Y axes.
  • the upper side 7 and the lower side 8 are preferably essentially congruent.
  • the 3-D framework extends in its height or depth.
  • the settlement space 5 and the channel-shaped vessel 2 are preferably spatially separated from one another by a separation area 6 made of biocompatible polymer.
  • the recess which is open towards the upper side 7, is preferably arranged centrally on the upper side 7 and extends in a direction perpendicular to the horizontal plane, the axis Z, to the lower side 8 of the 3D framework.
  • the recess is preferably closed by biocompatible polymer, so that a cell suspension that has been filled in cannot escape.
  • the recess is laterally to the plane that is spanned by the axes X and Y surrounded by an edge of the 3D framework.
  • the settlement space 5, which is open towards the top 7, is preferably designed to be annular with respect to its horizontal extension.
  • the recess open towards the top 7 is designed to be mirror-symmetrical with respect to its horizontal extension.
  • the dimension of the extension of the depression in the plane spanned by the axes X and Y preferably decreases in the direction of the axis Z towards the bottom 8, particularly preferably in steps.
  • the depression very particularly preferably has a first 9 and a second plane 10, both of which are defined by the axes X. and Y are spanned.
  • the dimension of the extension of the first plane 9 is preferably greater than the dimension of the extension of the second plane 10 (both with regard to their extension in planes that are spanned by the axes X and Y), and preferably merge with one another with a step.
  • the first level 9 is preferably closer to the top 7 of the 3D framework than the second level 10.
  • the recess space above the second level 10 is preferably surrounded by the channel-shaped vessel 2, which preferably extends essentially along a plane that passes through the axes X and Y is spanned (“essentially” is intended to mean here that the channel-shaped vessel 2 can have a slight gradient in relation to the direction of the axis Z).
  • the channel-shaped vessel 2 preferably surrounds the indentation open towards the upper side 7 in an annular manner.
  • the 3D framework 1 preferably has two filling openings 3 for the channel-shaped vessel 2, which are preferably arranged on the upper side 7 of the 3D framework 1 in the form of filler necks. The two filling openings 3 are preferably arranged on opposite sides, in particular at corners.
  • the 3-D framework 1 preferably has two outlet openings 4 for the channel-shaped vessel 2, which are preferably arranged on the side surfaces 11, here on the corner edges of the 3-D framework 1, which run perpendicular to the plane of the top 7.
  • the two outlet openings 4 are preferably arranged at opposite corners of the 3D framework 1.
  • Fig. 2 shows an actually printed 3D framework 1 under the microscope from its underside. Filler neck 3, channel-shaped vessels 2 and settlement area 6 can be clearly seen.
  • the 3D framework shown in Fig. 2 is produced by the following process steps: Creation of the CAD file and calculation of the print template; Equipping the printer with photopolymerizable or photocrosslinkable liquids to be used; Calibrating the printer, axes and printhead; Execution of the print, the print platform is lowered to the first print level for the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid; Printing a first polymer from the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid for architectures consisting of polymer 1 for the first layer height of the construct to be printed; the calculated construction plan of the first polymer for the first layer height of the construct is projected onto the printing plane in which the print head is located; one or more constructs can be produced at the same time, depending on the wishes and planning of the user; the limiting factor is the size of the printing platform or the installation space;
  • the 3D framework can then be dried or used immediately.
  • the 3D framework can be stored under sterile conditions.
  • volume of settlement area 12 mm, 3 inner diameter of filling openings: 1.2 mm, diameter of channel-shaped vessels and outlet openings: 0.7 mm
  • composition of the photocrosslinkable liquid is composition of the photocrosslinkable liquid:
  • Photocrosslinkable substance gelatin methacrylate, 50 g / kg; Polyethylene glycol
  • lithium phenyl 2,4,6-trimethylbenzoyl phosphinate 5 g / kg
  • Tartrazine 2 mM
  • the entire 3D framework is printed from the photocrosslinkable liquid.
  • the depth of penetration of the light used for polymerization is regulated so that the Production of the channel-shaped vessels is made possible.
  • sacrificial inks used in another photocrosslinkable liquid; e.g. 15 g / kg hyaluronic acid dissolved in RPMI + 5 g / kg lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate
  • FIG. 3a shows a microscopic fluorescence image
  • FIG. 3b shows a transmitted light image of the canal-shaped vessel 2 populated with human venous vascular cells of the umbilical cord and of the colonization space 5 populated with human mesenchymal stromal cells.
  • the suspensions are distributed within the 3D framework and the cells can be cultivated within the 3D framework.
  • the colonization is carried out in a sterile Petri dish (diameter 10 cm), which is also used for the later culture of the 3D framework.
  • the 3-D framework is placed in the empty Petri dish in a hydrated state.
  • hMSC Human mesenchymal stromal cells
  • the canal system is colonized with human venous cells from the umbilical cord (HUVECs).
  • HUVECs umbilical cord
  • a cell suspension with 50 million HUVECs per milliliter is made up in the commercially available culture medium Endothelial Cell Growth Medium 2 (PromoCell GmbH) + 1% penicillin / streptomycin and 1.5 ⁇ l of this is pipetted into each nozzle.
  • the 3D framework is placed in the closed Petri dish for 30 min in the incubator to rest (37 ° C, 5% CO2). Then the co-culture medium Endothelial Cell Growth Medium 2 (PromoCell GmbH) + 1% penicillin / streptomycin is added and the submerged cell structure is cultivated at 37 ° C. and in a 5% CO 2 atmosphere.

Abstract

The invention relates to a 3D scaffold (3-dimensional scaffold) consisting of a biocompatible polymer, having the following: a depression that is open towards the upper face of the 3D scaffold and that acts as a colonisation volume for biological cells, a canal-type vessel, which at least partly surrounds the colonisation volume, in the interior of the 3D scaffold, a fill opening for the canal-type vessel and a discharge opening for the canal-type vessel. The present invention also relates to the production of the 3D scaffold according to the invention, and to the use thereof for colonising the colonisation chamber with biological cells.

Description

3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer mit einem nach oben offenen Besiedlungsraum für biologische Zellen und mit einem den Besiedlungsraum umgebenden kanalförmigen Gefäß 3D framework made of biocompatible polymer with an upwardly open colonization space for biological cells and with a channel-shaped vessel surrounding the colonization space
Die vorliegende Erfindung betrifft ein 3D-Gerüst (3-dimensionales Gerüst) aus biokompatiblem Polymer, das Folgendes aufweist: eine zur Oberseite des 3D-Gerüsts hin offene Vertiefung als Besiedlungsraum für biologische Zellen, ein kanalförmiges Gefäß im Inneren des 3D-Gerüsts, das den Besiedlungsraum zumindest teilweise umgibt, eine Einfüllöffnung für das kanalförmige Gefäß und eine Auslassöffnung für das kanalförmige Gefäß. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts sowie dessen Verwendung zum Besiedeln des Besiedlungsraums mit biologischen Zellen. The present invention relates to a 3D framework (3-dimensional framework) made of biocompatible polymer, which has the following: a depression open to the top of the 3D framework as a colonization space for biological cells, a channel-shaped vessel inside the 3D framework that contains the Settlement space at least partially surrounds a filling opening for the channel-shaped vessel and an outlet opening for the channel-shaped vessel. The present invention also relates to the production of the 3D framework according to the invention and its use for colonizing the colonization area with biological cells.
Bislang gibt es nur wenige Möglichkeiten, 3D-Zellkulturen herzustellen, die mit einer Nährlösung, wie bspw. Blut perfundiert werden können. Die einzigen Möglichkeiten bis jetzt sind, Sphäroide und mikrofluidische Plattformen zu kombinieren, um einen gerichteten Fluss einer Nährlösung zu simulieren. Dagegen besteht mithilfe des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts erstmals die Möglichkeit, biologische Zellen in speziellen dreidimensionalen Architekturen zu kultivieren, die über ein Gefäß mit einer Nährlösung versorgt werden können. So far there have only been a few options for producing 3D cell cultures that can be perfused with a nutrient solution such as blood. The only possibilities so far are to combine spheroids and microfluidic platforms to simulate a directional flow of a nutrient solution. On the other hand, with the aid of the 3D framework according to the invention, it is possible for the first time to cultivate biological cells in special three-dimensional architectures that can be supplied with a nutrient solution via a vessel.
Sphäroide sind enge Packungen aus Zellen mit einer runden Form. Sie lassen jegliche physiologische Form vermissen. Möchte der Anwender darüber hinaus mit mehreren Zelltypen parallel in einem Objekt arbeiten, so bleibt ihm nichts weiter übrig, als ein Sphäroid aus den gewünschten Zelltypen zu formen. Hierbei ist die Form des Sphäroids jedoch ungerichtet und führt zu einer zufälligen Verteilung der Zellen im Sphäroid. Die Zellen können durch diesen Prozess also nicht diskret voneinander positioniert werden. Ein Gefäßsystem kann durch Guss oder Sphäroide nicht gerichtet aufgebaut werden. Die einzige Möglichkeit ist eine spontane Selbstorganisation durch Zellen, die jedoch nicht kontrolliert und nicht reproduzierbar ist. Eine Anbindung an eine mikrofluidische Plattform ist ebenfalls nicht möglich, da die jeweiligen Anschlüsse jeweils an einer definierten Stelle positioniert sind. Mit den bisherigen Möglichkeiten lassen sich diese oben genannten Bedingungen nur unzureichend oder gar nicht reproduzieren. Im Gegensatz dazu bietet das erfindungsgemäße 3D-Gerüst eine Möglichkeit, um komplexe biologische Zellarchitekturen zu schaffen, die über ein Gefäß mit Nährstoffen versorgt und an eine mikrofluidische Plattform angeschlossen werden können. Das hier vorgestellte 3D- Gerüst soll insbesondere für einen Anwender gedacht sein, der keinen Zugang zu lithographischem 3D-Druck oder Bioprinting hat, jedoch 3D-Zellkulturkonstrukte hersteilen möchte. Spheroids are tight packs of cells with a round shape. They lack any physiological form. If the user also wants to work with several cell types in parallel in one object, he has no choice but to form a spheroid from the desired cell types. Here, however, the shape of the spheroid is undirected and leads to a random distribution of the cells in the spheroid. The cells cannot be positioned discretely from one another through this process. A vascular system cannot be built up in a directional manner by casting or spheroids. The only possibility is spontaneous self-organization by cells, which, however, is not controlled and not reproducible. A connection to a microfluidic platform is also not possible, since the respective connections are each positioned at a defined point. With the previous options, these above-mentioned conditions can only be reproduced inadequately or not at all. In contrast to this, the 3D framework according to the invention offers the possibility of creating complex biological cell architectures that can be supplied with nutrients via a vessel and connected to a microfluidic platform. The 3D framework presented here is intended in particular for a user who does not have access to lithographic 3D printing or bioprinting, but would like to produce 3D cell culture constructs.
In der EP 3 018 531 A1 wird ein 3D-Druckverfahren beschrieben, das es erlaubt, mit multiplen Bioinks oder Zelltypen parallel in einem Druckprozess zu arbeiten. Dabei werden die 3D-Zellkukturkonstrukte bereits parallel mit der Herstellung einer Matrix aus biokompatiblem Polymer aufgebaut. Dieses Verfahren eignet sich jedoch nicht für Anwender, die selbst über keine lithographische 3D-Druckvorrichtung verfügen. EP 3 018 531 A1 describes a 3-D printing method that allows multiple bioinks or cell types to be used in parallel in a printing process. The 3D cell structure constructs are built up in parallel with the production of a matrix made of biocompatible polymer. However, this method is not suitable for users who do not have a 3D lithographic printing device themselves.
Deshalb ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Möglichkeit zur Verfügung zu stellen, mit der ein 3D-Zellkulturkonstrukt auf einfache Art und Weise, mit einem hohen Reproduktionsgrad und einer hohen Ähnlichkeit zur physiologischen Architektur hergestellt werden kann, das über ein kanalförmiges Gefäß mit einer Nährlösung versorgt und an eine mikrofluidische Plattform angeschlossen werden kann. It is therefore the object of the present invention to provide a possibility with which a 3D cell culture construct can be produced in a simple manner, with a high degree of reproduction and a high degree of similarity to the physiological architecture, which is connected via a channel-shaped vessel with a Nutrient solution supplied and can be connected to a microfluidic platform.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer gelöst. Das 3D-Gerüst weist eine zur Oberseite des 3D-Gerüsts hin offene Vertiefung als Besiedlungsraum für biologische Zellen, ein kanalförmiges Gefäß im Inneren des 3D-Gerüsts, das den Besiedlungsraum zumindest teilweise umgibt, eine Einfüllöffnung für das kanalförmige Gefäß, und eine Auslassöffnung für das kanalförmige Gefäß auf. The object according to the invention is achieved by a 3D framework made of biocompatible polymer. The 3D framework has a depression open to the top of the 3D framework as a colonization space for biological cells, a channel-shaped vessel inside the 3D framework that at least partially surrounds the colonization space, a filling opening for the channel-like vessel, and an outlet opening for the channel-shaped vessel.
Das kanalförmige Gefäß stellt sicher, dass jeder Teil der Zellkultur in dem Besiedlungsraum des 3D-Gerüsts mit ausreichend Sauerstoff und Nährstoffen versorgt wird. Denn kann ein Gewebe aufgrund fehlender Vaskularisierung nicht ausreichend versorgt werden, so droht es abzusterben oder seine Funktion zu verlieren. Wie weiter unten detaillierter beschrieben wird das erfindungsgemäße 3D-Gerüst durch lithographischen 3D-Druck hergestellt. Dadurch besteht erstmals die Möglichkeit ein Gefäßsystem gerichtet aufzubauen. Darüber hinaus kann das 3D-Gerüst reproduzierbar so gedruckt werden, dass es jeweils passend zum vorab gewählten mikrofluidischen System ist. The channel-shaped vessel ensures that every part of the cell culture in the settlement area of the 3D framework is supplied with sufficient oxygen and nutrients. If a tissue cannot be adequately supplied due to a lack of vascularization, it threatens to die or lose its function. As described in more detail below, the 3D framework according to the invention is produced by lithographic 3D printing. This makes it possible for the first time to build up a vascular system in a directed manner. In addition, the 3D framework can be reproducibly printed in such a way that it is suitable for the microfluidic system selected in advance.
Unter einem biokompatiblen Polymer wird ein biologisches oder biologisch verträgliches Polymer verstanden, wobei ein biologisches Polymer (in Lebewesen vorkommendes Polymer) bevorzugt ist. Unter „biologisch verträglich“ soll hierin verstanden werden, dass dieses die Lebensdauer der biologischen Zellen nicht beeinflusst, insbesondere also nicht toxisch auf die biologischen Zellen wirkt. A biocompatible polymer is understood to mean a biological or biologically compatible polymer, a biological polymer (polymer occurring in living beings) being preferred. “Biologically compatible” is to be understood here as meaning that this does not affect the lifespan of the biological cells, in particular that it does not have a toxic effect on the biological cells.
Unter dem Ausdruck „aus biokompatiblem Polymer“ wird vorzugsweise verstanden, dass das 3D-Gerüst durch eine Matrix aus einem oder mehreren biokompatiblen Polymeren aufgebaut ist. Es ist zwar nicht ausgeschlossen, dass das 3D-Gerüst weitere Bestandteile neben biokompatiblen Polymeren aufweist, es ist jedoch auch möglich, dass das 3D-Gerüst lediglich aus biokompatiblem Polymer besteht. The expression “made of biocompatible polymer” is preferably understood to mean that the 3D framework is built up by a matrix made of one or more biocompatible polymers. Although it cannot be ruled out that the 3-D framework has other components in addition to biocompatible polymers, it is also possible that the 3-D framework consists only of biocompatible polymer.
Die Oberseite des 3D-Gerüsts liegt vorzugsweise in der horizontalen Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird. Ebenso liegt die Unterseite vorzugsweise ebenso in der horizontalen Ebene, die ebenso durch die Achsen X und Y aufgespannt wird. Vorzugsweise sind die Oberseite und die Unterseite im Wesentlichen deckungsgleich. In Richtung der Achse Z erstreckt sich das 3D-Gerüst in seiner Höhe bzw. Tiefe. The top of the 3D framework is preferably in the horizontal plane that is spanned by the X and Y axes. Likewise, the bottom is preferably also in the horizontal plane, which is also spanned by the X and Y axes. The upper side and the lower side are preferably essentially congruent. In the direction of the Z axis, the 3-D framework extends in its height or depth.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts ist es bevorzugt, dass der Besiedlungsraum und das kanalförmige Gefäß räumlich voneinander durch einen Abtrennbereich aus biokompatiblem Polymer abgetrennt sind, wobei das biokompatible Polymer des Abtrennbereichs so gestaltet ist, dass Nährstoffe aus einer Flüssigkeit in dem kanalförmigen Gefäß in den Besiedlungsraum diffundieren. In one embodiment of the 3D scaffold according to the invention, it is preferred that the settlement area and the channel-shaped vessel are spatially separated from one another by a separation area made of biocompatible polymer, the biocompatible polymer of the separation area being designed so that nutrients from a liquid in the channel-shaped vessel are in diffuse the settlement area.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts ist es bevorzugt, dass die zur Oberseite hin offene Vertiefung im Hinblick auf die horizontale Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird, mittig an der Oberseite angeordnet ist und sich in einer Richtung senkrecht zur horizontalen Ebene, der Achse Z, zur Unterseite des 3D- Gerüsts hin erstreckt. In Richtung der Unterseite ist die Vertiefung durch biokompatibles Polymer abgeschlossen, so dass eine eingefüllte Zellsuspension nicht austreten kann. Die Vertiefung ist seitlich zu der Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird von einem Rand des 3D-Gerüsts umgeben. Dieser Rand des 3D- Gerüsts ist in seinen Dimensionen vorzugsweise so ausgebildet, dass die Einfüllöffnung für das kanalförmige Gefäß ebenso an der Oberseite des 3D-Gerüsts angeordnet ist. In one embodiment of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the recess, which is open towards the top, is arranged centrally on the top with regard to the horizontal plane, which is spanned by the axes X and Y, and extends in a direction perpendicular to the horizontal Plane, the Z axis, extends to the bottom of the 3D framework. In the direction of the underside, the recess is closed off by biocompatible polymer, so that a filled-in cell suspension does not can emerge. The recess is laterally to the plane that is spanned by the axes X and Y surrounded by an edge of the 3D framework. This edge of the 3D framework is preferably designed in terms of its dimensions in such a way that the filling opening for the channel-shaped vessel is also arranged on the upper side of the 3D framework.
Die zur Oberseite hin offene Vertiefung ist vorzugsweise in Bezug auf ihre horizontale Erstreckung ringförmig, kreisförmig, oval oder in einer Mischform davon ausgebildet. Besonders bevorzugt ist die zur Oberseite hin offene Vertiefung in Bezug auf ihre horizontale Erstreckung spiegelsymmetrisch ausgebildet. Die Dimension der Erstreckung der Vertiefung in der Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird, nimmt vorzugsweise in Richtung der Achse Z zur Unterseite hin ab, besonders bevorzugt stufenförmig. Ganz besonders bevorzugt weist die Vertiefung eine erste und eine zweite Ebene auf, die beide durch die Achsen X und Y aufgespannt sind. Die Dimension der Erstreckung der ersten Ebene ist größer als die Dimension der Erstreckung der zweiten Ebene (beide im Hinblick auf ihre Erstreckung in Ebenen, die von den Achsen X und Y aufgespannt sind), und gehen mit einer Stufe ineinander über. The recess, which is open towards the top, is preferably annular, circular, oval or in a mixed form thereof with regard to its horizontal extension. Particularly preferably, the recess open towards the top is designed to be mirror-symmetrical with respect to its horizontal extension. The dimension of the extension of the depression in the plane that is spanned by the axes X and Y preferably decreases in the direction of the axis Z towards the bottom, particularly preferably in steps. The recess very particularly preferably has a first and a second plane, both of which are spanned by the X and Y axes. The dimension of the extension of the first plane is greater than the dimension of the extension of the second plane (both with regard to their extension in planes that are spanned by the axes X and Y) and merge with one another with a step.
Die erste Ebene liegt vorzugsweise näher an der Oberseite des 3D-Gerüsts als die zweite Ebene. Dabei ist der Vertiefungsraum oberhalb der zweiten Ebene vorzugsweise von dem kanalförmigen Gefäß umgeben, das sich vorzugsweise im Wesentlichen entlang einer Ebene erstreckt, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird („im Wesentlichen“ soll hierin bedeuten, dass das kanalförmige Gefäß in Bezug auf die Richtung der Achse Z ein leichtes Gefälle aufweisen kann). Durch die räumliche Nachbarschaft des Vertiefungsraums oberhalb der zweiten Ebene kann dieser mit Nährstoffen aus dem kanalförmigen Gefäß versorgt werden. The first level is preferably closer to the top of the 3D framework than the second level. The recess space above the second level is preferably surrounded by the channel-shaped vessel, which preferably extends essentially along a plane that is spanned by the axes X and Y (“essentially” here means that the channel-shaped vessel in relation to the direction of the Z axis may have a slight slope). Due to the spatial proximity of the depression space above the second level, it can be supplied with nutrients from the channel-shaped vessel.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass das kanalförmige Gefäß unterhalb der ersten Ebene verläuft, so dass der Vertiefungsraum oberhalb der ersten Ebene ebenso räumlich benachbart ist und mit Nährstoffen aus dem kanalförmigen Gefäß versorgt werden kann. Furthermore, it is preferred that the channel-shaped vessel runs below the first level, so that the recess space above the first level is also spatially adjacent and can be supplied with nutrients from the channel-shaped vessel.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts ist es bevorzugt, dass das kanalförmige Gefäß die zur Oberseite hin offene Vertiefung ringförmig umgibt. In a further embodiment of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the channel-shaped vessel surrounds the indentation open towards the top in a ring shape.
Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst weist vorzugsweise zwei Einfüllöffnungen für das kanalförmige Gefäß auf, die vorzugsweise an der Oberseite des 3D-Gerüsts angeordnet sind. Die beiden Einfüllöffnungen sind dabei vorzugsweise an gegenüberliegenden Seiten angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass ein ringförmig um die Vertiefung verlaufendes kanalförmiges Gefäß gleichmäßig mit einer Nährlösung versorgt werden kann. The 3D framework according to the invention preferably has two filling openings for the channel-shaped vessel, which are preferably arranged on the upper side of the 3D framework. The two filling openings are preferably arranged on opposite sides. This has the advantage that a channel-shaped vessel running in a ring around the depression can be evenly supplied with a nutrient solution.
Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst weist vorzugsweise zwei Auslassöffnungen für das kanalförmige Gefäß auf, die vorzugsweise an den Seitenflächen des 3D-Gerüsts angeordnet sind, die senkrecht zu der Ebene der Oberseite verlaufen. Die beiden Auslassöffnungen sind vorzugsweise an gegenüberliegenden Seiten des 3D-Gerüsts angeordnet. Durch die Anwesenheit von zwei Einfüllöffnungen und zwei Auslassöffnungen eines ringförmigen ausgebildeten kanalförmigen Gefäßes ist es möglich, die biologischen Zellen gleichmäßig mit Nährstoffen zu versorgen. The 3D framework according to the invention preferably has two outlet openings for the channel-shaped vessel, which are preferably arranged on the side surfaces of the 3D framework that run perpendicular to the plane of the upper side. The two outlet openings are preferably arranged on opposite sides of the 3D framework. The presence of two filling openings and two outlet openings of an annular channel-shaped vessel makes it possible to supply the biological cells with nutrients evenly.
Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst ist durch ein lithographisches 3D-Druckverfahren erhältlich. Dieses Verfahren wird weiter unten genauer beschrieben. The 3D framework according to the invention can be obtained by a lithographic 3D printing process. This procedure is described in more detail below.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein erfindungsgemäßes 3D-Gerüst, bei dem der Besiedlungsraum mit biologischen Zellen besiedelt ist. In dem Besiedlungsraum befinden sich vorzugsweise biologische Zellen, die als 3D-Zellkulturkonstrukt kultiviert werden. Dabei kann das kanalförmige Gefäß entweder mit biologischen Zellen besiedelt oder nicht besiedelt sein. Vorzugsweise ist das kanalförmige Gefäß jedoch ebenso mit Zellen besiedelt, vorzugsweise mit Endothelzellen zur Bildung der Wand eines Blutgefäßes. Dabei besiedeln die Endothelzellen vorzugsweise die innere Oberfläche des kanalförmigen Gefäßes. Die Besiedlung mit biologischen Zellen in dem Besiedlungsraum bzw. im kanalförmigen Gefäß erfolgt vorzugsweise durch Einfüllen einer Flüssigkeit in den Besiedlungsraum oder das kanalförmige Gefäß. Bei letzterem vorzugsweise über die Einfüllöffnung(en). Die zur Besiedlung des Besiedlungsraums bzw. des kanalförmigen Gefäßes verwendete Flüssigkeit ist vorzugsweise eine biologische Zellen enthaltende Suspension (im Folgenden Zellsuspension genannt). In einer weiteren Ausführungsform enthält die zur Besiedlung des Besiedlungsraums verwendete Flüssigkeit vorzugsweise Zellsphäroide. In einer weiteren Ausführungsform enthält die verwendete Flüssigkeit vorzugsweise einen Gelbildner, der nach dem Einfüllen ein stabiles Hydrogel bildet, wodurch die inkorporierten Zellen bzw. Zellsphäroide immobilisiert werden. Als stoffliche Grundlage des Gelbildners können enzymatisch vernetzende Gele (z.B. Fibrin), physikalisch vernetzende Gele (z.B. Kollagene) oder photopolymerisierbare bzw. photovernetzbare Flüssigkeiten eingesetzt werden. The present invention also relates to a 3D framework according to the invention in which the colonization space is colonized with biological cells. In the settlement area there are preferably biological cells that are cultivated as a 3D cell culture construct. The channel-shaped vessel can either be populated with biological cells or not populated. Preferably, however, the channel-shaped vessel is also populated with cells, preferably with endothelial cells to form the wall of a blood vessel. The endothelial cells preferably colonize the inner surface of the channel-shaped vessel. The colonization with biological cells in the colonization space or in the channel-shaped vessel is preferably carried out by filling a liquid into the colonization space or the channel-like vessel. With the latter, preferably via the filling opening (s). The liquid used to colonize the colonization space or the channel-shaped vessel is preferably a suspension containing biological cells (hereinafter referred to as cell suspension). In a further embodiment, the liquid used to colonize the colonization space preferably contains cell spheroids. In a further embodiment, the liquid used preferably contains a gel former which, after filling, forms a stable hydrogel, as a result of which the incorporated cells or cell spheroids are immobilized. As the material basis of the gel former, enzymatically crosslinking gels (eg fibrin), physically crosslinking gels (eg collagens) or photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can be used.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Besiedlung des Besiedlungsraums vorzugsweise durch Einsetzen eines Geweberesektats oder einer Biopsie (sog. ex vivo Kultur). In einer weiteren Ausführungsform kann das Geweberesektat/die Biopsie mit einer gelbildenden Flüssigkeit eingeklebt werden. In a further embodiment, the settlement area is preferably populated by inserting a tissue resection or a biopsy (so-called ex vivo culture). In a further embodiment, the tissue resection / biopsy can be glued in with a gel-forming liquid.
Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst wird vorzugsweise durch ein lithographisches 3D- Druckverfahren hergestellt, vorzugsweise ein stereolithographisches 3D- Druckverfahren. Unter einem stereolithographischen 3D-Druckverfahren versteht man eines, bei dem die Struktur des 3D-Gerüsts nach und nach durch schichtweises Aushärten von photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanzen hergestellt wird. Dabei werden die photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanzen in Form von photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten eingesetzt. Der Aufbau eines 3D-Gerüsts aus biokompatiblem Polymer durch ein stereolithographisches 3 D- Druckverfahren bietet die Möglichkeit, ein biokompatibles Polymer in eine physiologische Form zu drucken, so dass Material und Architektur der nachzuahmenden Struktur im menschlichen Körper ähneln. Da die biologischen Zellen erst anschließend zur Besiedlung in das 3D-Gerüst eingebracht werden können, ist es möglich, ein 3D-Zellkulturkonstrukt jeglichen Zelltyps in dem erfindungsgemäßen 3D- Gerüst aufzubauen. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts durch Aushärten einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanz durch Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung in einer Fokusebene, in der die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz vorliegt. Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens werden weiter unten beschrieben. The 3D framework according to the invention is preferably produced by a lithographic 3D printing process, preferably a stereolithographic 3D printing process. A stereolithographic 3D printing process is one in which the structure of the 3D framework is gradually produced by layer-by-layer curing of photopolymerizable or photo-crosslinkable substances. The photopolymerizable or photocrosslinkable substances are used in the form of photopolymerizable or photocrosslinkable liquids. The construction of a 3D framework from biocompatible polymer using a stereolithographic 3D printing process offers the possibility of printing a biocompatible polymer in a physiological form so that the material and architecture resemble the structure to be imitated in the human body. Since the biological cells can only then be introduced into the 3D framework for colonization, it is possible to build up a 3D cell culture construct of any cell type in the 3D framework according to the invention. The present invention thus also relates to a method for producing a 3D framework according to the invention by curing a photopolymerizable or photocrosslinkable substance by focusing electromagnetic radiation in a focal plane in which the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is present. Preferred embodiments of the method are described below.
Bei der Herstellung des 3D-Gerüsts wird das Aushärten einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanz vorzugsweise durch Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung in einer Fokusebene erreicht, in der die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz vorliegt. Vorzugsweise liegt dabei die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz flüssig, beispielsweise gelöst in einem Lösungsmittel vor. Hier wird im Folgenden von einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit gesprochen. During the production of the 3D framework, the curing of a photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably achieved by focusing electromagnetic radiation in a focal plane in which the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is present. The photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably in liquid form, for example dissolved in a solvent. In the following, this is referred to as a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
Durch Wiederholen des Fokussierens einer weiteren elektromagnetischen Strahlung in einer weiteren Fokusebene unter Verwendung einer weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit kann das erfindungsgemäße 3D-Gerüst aufgebaut werden. The 3D framework according to the invention can be built up by repeating the focusing of a further electromagnetic radiation in a further focal plane using a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
Das Herstellungsverfahren des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts wird weiter unten noch im Detail beschrieben. The manufacturing method of the 3D framework according to the invention is described in detail further below.
Unter „photopolymerisierbar“ soll hierin verstanden werden, dass die entsprechende Substanz durch Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung und gegebenenfalls der Anwesenheit eines Photoinitiators polymerisierbar ist. Ebenso soll unter „photovernetzbar“ verstanden werden, dass ein Oligomer oder Polymer durch Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung und gegebenenfalls der Anwesenheit eines Photoinitiators vernetzt werden kann. “Photopolymerizable” is to be understood here as meaning that the corresponding substance can be polymerized by the action of electromagnetic radiation and, if appropriate, the presence of a photoinitiator. Likewise, “photocrosslinkable” should be understood to mean that an oligomer or polymer can be crosslinked by the action of electromagnetic radiation and, if appropriate, the presence of a photoinitiator.
Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst kann aus einem homogenen Material aufgebaut sein und folglich nur ein biokompatibles Polymer eines einzigen Typs umfassen. In einer Variante kann das 3D-Gerüst aus verschiedenen biokompatiblen Polymeren aufgebaut sein, d.h. ist ein heterogen aufgebautes 3D-Gerüst. Dabei werden bei dessen Herstellung mindestens zwei verschiedene photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten eingesetzt. Auf diese Weise können unterschiedliche Polymerstrukturen innerhalb des 3D-Gerüsts verwirklicht werden. So kann beispielsweise der Bereich zwischen dem Besiedlungsraum und dem kanalförmigen Gefäß von einer Polymerstruktur umgeben sein, die sich von der Polymerstruktur des übrigen Gerüsts des 3D-Gerüsts unterscheidet, um beispielsweise eine größere Porosität aufzuweisen, die ein Durchdringen von Nährstoffen einer Nährstoff-haltigen Flüssigkeit aus dem kanalförmigen Gefäß in den Besiedlungsraum ermöglichen. The 3D framework according to the invention can be constructed from a homogeneous material and consequently only comprise a biocompatible polymer of a single type. In a variant, the 3D framework can be built up from different biocompatible polymers, ie is a heterogeneously structured 3D framework. In doing so, its production used at least two different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids. In this way, different polymer structures can be realized within the 3D framework. For example, the area between the settlement area and the channel-shaped vessel can be surrounded by a polymer structure that differs from the polymer structure of the rest of the framework of the 3D framework in order, for example, to have a greater porosity that allows nutrients of a nutrient-containing liquid to penetrate allow the channel-shaped vessel into the settlement area.
Der Besiedlungsraum kann auch Säulen, Gitter oder Querstreben aufweisen, um ein Adhärieren der biologischen Zellen an seiner inneren Oberfläche zu ermöglichen. The colonization space can also have columns, grids or cross braces in order to enable the biological cells to adhere to its inner surface.
Die Eigenschaften der Polymerstruktur oder der verschiedenen Polymerstrukturen innerhalb des 3D-Gerüsts können durch die Wahl der zu polymerisierenden Monomere oder der zu vernetzenden Polymere in der/den photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit(en) beeinflusst werden. Je kleiner das Molekulargewicht der polymerisierbaren oder vernetzbaren Einheiten, desto kleiner sind in der Regel die Zwischenräume oder Poren der entstehenden Matrix des 3D-Gerüsts. Im zuletzt genannten Fall hängt es jedoch auch stark von der Anzahl der vernetzbaren Einheiten an den Polymeren und somit dem Vernetzungsgrad ab. Je höher der Vernetzungsgrad, desto kleiner sind in der Regel die Zwischenräume oder Poren der entstehenden Matrix des 3D-Gerüsts. Es ist prinzipiell möglich, mit dem lithographischen 3D- Druckverfahren in jeder Schicht unterschiedliche Polymer- oder Monomerlösungen einzusetzen, um ein 3D-Gerüst mit hoher Komplexität oder Diversität zu erhalten. The properties of the polymer structure or of the various polymer structures within the 3D framework can be influenced by the choice of the monomers to be polymerized or the polymers to be crosslinked in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid (s). The smaller the molecular weight of the polymerizable or crosslinkable units, the smaller the interstices or pores of the resulting matrix of the 3D framework are as a rule. In the latter case, however, it also depends heavily on the number of crosslinkable units on the polymers and thus the degree of crosslinking. The higher the degree of crosslinking, the smaller the interstices or pores of the resulting matrix of the 3D framework. In principle, it is possible with the lithographic 3D printing process to use different polymer or monomer solutions in each layer in order to obtain a 3D framework with a high level of complexity or diversity.
In anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass das erfindungsgemäße 3D-Gerüst aus einem ersten biokompatiblen Polymer und mindestens einem weiteren biokompatiblen Polymer aufgebaut ist, das von dem ersten biokompatiblen Polymer verschieden ist. Weiterhin ist es in einer Variante des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts bevorzugt, dass der Bereich zwischen Besiedlungsraum und kanalförmigen Gefäß das mindestens eine weitere biokompatible Polymer aufweist. In other words, it is preferred according to the invention that the 3D framework according to the invention is composed of a first biocompatible polymer and at least one further biocompatible polymer that is different from the first biocompatible polymer. Furthermore, in a variant of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the area between the colonization space and the channel-shaped vessel has the at least one further biocompatible polymer.
Durch die unterschiedlichen Fokusebenen, in denen eine Polymerisierung oder Vernetzung der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten stattfindet, kann ein schichtweiser Aufbau des 3D-Gerüsts erreicht werden. Dabei ist es möglich, überdachte Hohlräume, wie das kanalförmige Gefäß, in dem 3D-Gerüst auszubilden. Weiterhin können auch Hinterschnitte und überhängende Strukturen ausgebildet werden, da eine Polymerisierung oder Vernetzung der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit in einer bestimmten Fokusebene beziehungsweise Schicht auch dann erfolgen kann, wenn darunter kein bereits polymerisiertes oder vernetztes Material angeordnet ist, sondern lediglich noch nicht polymerisierte oder nicht vernetzte Flüssigkeit. Eine Polymerisierung oder Vernetzung von einer außerhalb der Fokusebene vorliegenden photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit bleibt aus; vielmehr wird nur diejenige photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit polymerisiert oder vernetzt, die innerhalb der Fokusebene liegt. Dennoch dient die außerhalb der Fokusebene vorhandene Flüssigkeit zur temporären Stützung der in der Fokusebene vorhandenen Flüssigkeit, ohne dass hierfür feste Stützstrukturen erforderlich wären. Due to the different focus levels in which a polymerization or crosslinking of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids takes place, a layered build-up of the 3D framework can be achieved. It is possible to form roofed cavities, such as the channel-shaped vessel, in the 3D framework. Furthermore, undercuts and overhanging structures can also be formed, since the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can also be polymerized or crosslinked in a specific focal plane or layer if there is no already polymerized or crosslinked material underneath, but only not yet polymerized or crosslinked Liquid. There is no polymerization or crosslinking of a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid present outside the focal plane; rather, only that photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is polymerized or crosslinked which lies within the focal plane. Nevertheless, the liquid present outside the focal plane serves to temporarily support the liquid present in the focal plane, without the need for fixed support structures.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts ist es bevorzugt, dass die Einfüllöffnung(en) an der Oberseite des 3D-Gerüsts angeordnet ist/sind. Dies hat den Vorteil, dass eine Zellsuspension direkt von oben in das 3D-Gerüst eingefüllt werden kann. Die Einfüllöffnung(en) ist/sind vorzugsweise am Rand an der oberen Fläche des 3D-Gerüsts angeordnet. Die Einfüllöffnung(en) ist/sind vorzugsweise als Einfüllstutzen ausgebildet. Hierfür ist es bevorzugt, dass auf die vorzugsweise runde Einfüllöffnung ein hohlzylindrischer oder hohlprismatischer Stutzen aufgesetzt ist. Dieser erleichtert das Ansetzen einer Pipettenspitze und das Befüllen des kanalförmigen Gefäßes mit Zellsuspension. In one embodiment of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the filling opening (s) is / are arranged on the upper side of the 3D framework. This has the advantage that a cell suspension can be poured into the 3D framework directly from above. The filling opening (s) is / are preferably arranged at the edge on the upper surface of the 3D framework. The filler opening (s) is / are preferably designed as a filler neck. For this purpose, it is preferred that a hollow cylindrical or hollow prismatic connector is placed on the preferably round filling opening. This makes it easier to attach a pipette tip and to fill the channel-shaped vessel with cell suspension.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts ist es bevorzugt, dass die Auslassöffnung(en) seitlich an dem 3D-Gerüst angeordnet ist/sind. Dies ermöglicht, dass die Auslassöffnung(en) an einem tieferen Punkt als die Einfüllöffnung angeordnet sind, so dass im kanalförmigen Gefäß schon vorhandene Flüssigkeit durch das Einfüllen einer Zellsuspension verdrängt werden kann. Besonders bevorzugt weist das erfindungsgemäße 3D-Gerüst zwei Auslassöffnungen auf, die an gegenüberliegenden Seiten des 3D-Gerüsts angeordnet sind. Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst hat vorzugsweise eine flache Form, d.h. ist in seinen horizontalen Dimensionen vorzugsweise größer als in der vertikalen Dimension. Das 3D-Gerüst kann jegliche Grundfläche aufweisen, wie beispielsweise kreisförmig, oval, rechteckig oder quadratisch, die beiden letzten auch mit abgerundeten Ecken, wobei eine rechteckige oder quadratische Form bevorzugt ist. Vorzugsweise erstreckt sich das 3D-Gerüst in der Vertikalen prismatisch, d.h. die Grundfläche ändert sich in der vertikalen Richtung nicht wesentlich. Der Durchmesser liegt vorzugsweise im Bereich von 100 pm bis 10 cm. Die Höhe liegt vorzugsweise im Bereich von 100 pm bis 10 cm. Die Form des kanalförmigen Gefäßes kann im Querschnitt rund, oval oder eckig sein, vorzugsweise rund, mit einem Durchmesser im Bereich von 1 pm bis 2 cm. Der Besiedlungsraum hat vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von 10 pm bis 8 cm. Das Volumen des Besiedlungsraums liegt vorzugsweise im Bereich von 1 pl bis 50 ml. In one embodiment of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the outlet opening (s) is / are arranged laterally on the 3D framework. This enables the outlet opening (s) to be arranged at a lower point than the filling opening, so that liquid already present in the channel-shaped vessel can be displaced by filling in a cell suspension. The 3D framework according to the invention particularly preferably has two outlet openings which are arranged on opposite sides of the 3D framework. The 3D framework according to the invention preferably has a flat shape, ie is preferably larger in its horizontal dimensions than in the vertical dimension. The 3D framework can have any base area, such as, for example, circular, oval, rectangular or square, the last two also with rounded corners, a rectangular or square shape being preferred. The 3D framework preferably extends prismatically in the vertical, ie the base area does not change significantly in the vertical direction. The diameter is preferably in the range from 100 μm to 10 cm. The height is preferably in the range from 100 μm to 10 cm. The shape of the channel-shaped vessel can be round, oval or angular in cross section, preferably round, with a diameter in the range from 1 μm to 2 cm. The settlement area preferably has a diameter in the range from 10 μm to 8 cm. The volume of the settlement area is preferably in the range from 1 pl to 50 ml.
Wie bereits weiter oben genannt, ist in einer Ausgestaltung der Erfindung das 3D- Gerüst eines, das mithilfe eines lithographischen 3D-Druckverfahrens erhältlich ist. As already mentioned above, in one embodiment of the invention the 3D framework is one that can be obtained with the aid of a lithographic 3D printing process.
Das 3D-Druckverfahren wird nun im Folgenden detaillierter beschrieben: The 3D printing process is now described in more detail below:
Vorzugsweise ist die Herstellung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts in folgende Verfahrensschritte unterteilt: The production of the 3D framework according to the invention is preferably divided into the following process steps:
(I) Einbringen einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit in ein Reaktionsgefäß, (I) introducing a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid into a reaction vessel,
(II) Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung auf eine Fokusebene, die innerhalb eines mit der Flüssigkeit gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt, (II) focusing electromagnetic radiation on a focal plane which lies within an area of the reaction vessel filled with the liquid,
(III) Erzeugen einer polymerisierten oder vernetzten Struktur in einer Schicht der Fokusebene in dem Reaktionsgefäß durch die elektromagnetische Strahlung, (III) generating a polymerized or cross-linked structure in a layer of the focal plane in the reaction vessel by means of the electromagnetic radiation,
(IV) Einbringen einer weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß, so dass eine zuvor erzeugte polymerisierte oder vernetzte Struktur zumindest teilweise mit der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit bedeckt ist, (IV) introducing a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid into the reaction vessel, so that a previously generated polymerized or crosslinked structure is at least partially covered with the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid,
(V) Fokussieren einer weiteren elektromagnetischen Strahlung auf eine weitere Fokusebene, die innerhalb eines mit der weiteren Flüssigkeit gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt, (V) focusing a further electromagnetic radiation on a further focal plane, which lies within a region of the reaction vessel filled with the further liquid,
(VI) Erzeugen einer weiteren polymerisierten oder vernetzten Struktur in einer weiteren Schicht in dem Reaktionsgefäß durch die weitere elektromagnetische Strahlung, wobei die weitere polymerisierte oder vernetzte Struktur unmittelbar auf der zuvor erzeugten polymerisierten oder vernetzten Struktur angeordnet und mit dieser verbunden ist, (VI) generating a further polymerized or crosslinked structure in a further layer in the reaction vessel by means of the further electromagnetic radiation, the further polymerized or crosslinked structure being arranged directly on the previously generated polymerized or crosslinked structure and connected to it,
(VII) Wiederholen der Schritte (IV) bis (VI) mit jeweils einer weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit, bis das 3D-Gerüst erzeugt ist. (VII) Repeat steps (IV) to (VI) each with a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid until the 3D framework is produced.
Die weitere Fokusebene in Schritt (V) unterscheidet sich vorzugsweise von der ersten Fokusebene zumindest in Bezug auf die bereits erzeugte polymerisierte oder vernetzte Struktur bzw. in Bezug auf die Schicht dieser polymerisierten oder vernetzten Struktur. The further focal plane in step (V) preferably differs from the first focal plane at least with regard to the already produced polymerized or crosslinked structure or with regard to the layer of this polymerized or crosslinked structure.
Bei der Verbindung der in Schritt (VI) erzeugten polymerisierten oder vernetzten Strukturen handelt es sich vorzugsweise um eine Verbindung durch kovalente Bindungen. Es sind jedoch auch nicht-kovalente Bindungen, beispielsweise auf der Grundlage physikalischer Wechselwirkungen möglich. The connection of the polymerized or crosslinked structures produced in step (VI) is preferably a connection by means of covalent bonds. However, non-covalent bonds, for example based on physical interactions, are also possible.
Eine oder mehrere der im Herstellungsverfahren verwendeten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten können biologische Zellen enthalten. Wenn es infolge der Einstrahlung der elektromagnetischen Strahlung zu einer Polymerisierung oder Vernetzung kommt, werden die in der Flüssigkeit enthaltenen Zellen mit in ein entsprechendes Polymer eingebettet. Es ist erfindungsgemäß jedoch bevorzugt, dass in dem lithographischen 3D-Druckverfahren keine biologischen Zellen eingesetzt werden, damit das 3D-Gerüst auf einfache Weise gelagert werden kann, bevor die nachträgliche Besiedlung durch den Anwender erfolgen kann. Als Reaktionsgefäße können in dem Herstellungsverfahren für das erfindungsgemäße 3D-Gerüst Kavitäten (sogenannte wells) handelsüblicher Mikrotiterplatten (beispielsweise Mikrotiterplatten mit 6, 12, 24, 48, 96, 384 oder 1536 Kavitäten), Zellkulturflaschen oder Petrischalen verwendet werden. One or more of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids used in the manufacturing process can contain biological cells. If the radiation of electromagnetic radiation leads to polymerization or crosslinking, the cells contained in the liquid are also embedded in a corresponding polymer. According to the invention, however, it is preferred that no biological cells are used in the lithographic 3D printing process so that the 3D framework can be stored in a simple manner before the subsequent colonization by the user can take place. Wells of commercially available microtiter plates (for example microtiter plates with 6, 12, 24, 48, 96, 384 or 1536 wells), cell culture bottles or Petri dishes can be used as reaction vessels in the manufacturing process for the 3D framework according to the invention.
In einer weiteren Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße 3D-Gerüst eines, das zumindest im Bereich des sichtbaren Lichts transparent ist. Auf diese Weise kann die nachträgliche Besiedlung mit biologischen Zellen optisch verfolgt und festgehalten werden. In a further embodiment, the 3D framework according to the invention is one that is transparent at least in the range of visible light. In this way, the subsequent colonization with biological cells can be followed optically and recorded.
Die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit ist vorzugsweise eine, die eine photoreaktive Gruppe aufweist, die mit weiteren photoreaktiven Gruppen kovalente Bindungen eingehen kann. The photopolymerizable or photocrosslinkable substance in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is preferably one which has a photoreactive group which can form covalent bonds with further photoreactive groups.
In einer Variante ist die photoreaktive Gruppe eine Acrylgruppe, mittels derer die Polymerisierung oder Vernetzung bewerkstelligt wird. D.h. die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz ist vorzugsweise eine Acrylverbindung, bspw. eine aus der folgenden Gruppe: Methacrylate, Methylacrylate, Ethylacrylate, Hydroxyethylacrylate, Butylacrylate, Trimethylolpropanacrylate, Triacrylatacrylate und Polyacrylate (PA) im Allgemeinen. In a variant, the photoreactive group is an acrylic group, by means of which the polymerization or crosslinking is brought about. That is, the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably an acrylic compound, for example one from the following group: methacrylates, methyl acrylates, ethyl acrylates, hydroxyethyl acrylates, butyl acrylates, trimethylolpropane acrylates, triacrylate acrylates and polyacrylates (PA) in general.
Bei der zu polymerisierenden oder zu vernetzenden Substanz kann es sich um ein Polymer, ein Oligomer oder ein Monomer handeln. Vorzugsweise handelt es sich hier um Substanzen auf Kohlenstoffbasis. Im Fall der Monomere wird photopolymerisiert. Im Falle der Polymere oder Oligomere wird vorzugsweise photovernetzt. The substance to be polymerized or crosslinked can be a polymer, an oligomer or a monomer. These are preferably carbon-based substances. In the case of the monomers, it is photopolymerized. In the case of polymers or oligomers, photocrosslinking is preferred.
Als zu polymerisierende Monomere können beispielsweise die Folgenden eingesetzt werden: Acrylamide, Vinylchlorid, Ethylen, Propylen, Isopren, Caprolactam, sämtliche Aminosäuren, (Des)Oxyribonucleotide,, Glucose, bzw. sämtliche Monosaccharide sowie die zuvor genannten Acrylate. The following can be used as monomers to be polymerized: acrylamides, vinyl chloride, ethylene, propylene, isoprene, caprolactam, all amino acids, (de) oxyribonucleotides, glucose, or all monosaccharides and the aforementioned acrylates.
Als Oligomere oder Polymere können die Folgenden eingesetzt werden: Polyethylenglykol (PEG), Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polyketon (PK), Polyvinylchlorid (PVC), Polystyrol (PS), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU). Ferner sind synthetische Polymere wie Silikone, Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Harze wie etwa Melamin- oder Melamin-Formaldehyd-Harze als Ausgangssubstanz geeignet. Ferner sind Biopolymere wie etwa Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate und Kohlenhydratderivate, Kollagene, Fibrine, Alginate, Gelatine, Hyaluronsäuren oder Polylactide als Ausgangssubstanzen geeignet. Statt der vorgenannten Polymere können auch jeweils die Monomervorstufen oder Oligomervorstufen dieser Polymere als Ausgangssubstanzen eingesetzt werden, sofern diese in stabiler Weise im festen oder flüssigen Aggregatzustand bereitgestellt werden können. Durch das Einbringen einer photoreaktiven Gruppe, bspw. einer Acrylgruppe, in die Ausgangssubstanz wird diese photopolymerisierbar bzw. photovernetzbar gemacht. Durch die strahlungsinduzierte Kopplung der Acrylreste zwischen verschiedenen Molekülen der Ausgangssubstanz wird eine polymerisierte oder vernetzte Matrix hergestellt. The following can be used as oligomers or polymers: polyethylene glycol (PEG), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyketone (PK), Polyvinyl chloride (PVC), polystyrene (PS), polytetrafluoroethylene (PTFE), polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU). Synthetic polymers such as silicones, polydimethylsiloxane (PDMS) or resins such as melamine or melamine-formaldehyde resins are also suitable as starting substances. Biopolymers such as proteins, DNA, RNA, carbohydrates and carbohydrate derivatives, collagens, fibrins, alginates, gelatine, hyaluronic acids or polylactides are also suitable as starting substances. Instead of the aforementioned polymers, it is also possible in each case to use the monomer precursors or oligomer precursors of these polymers as starting substances, provided that they can be provided in a stable manner in the solid or liquid state of aggregation. By introducing a photoreactive group, for example an acrylic group, into the starting substance, it is made photopolymerizable or photocrosslinkable. The radiation-induced coupling of the acrylic residues between different molecules of the starting substance creates a polymerized or cross-linked matrix.
Wenn photopolymerisierbares PDMS als Matrix bzw. als Hüllsubstanz eingesetzt wird, ist ein Gasaustausch zwischen den in dieser Matrix eingebetteten Zellen möglich. Wie bereits erwähnt, können unterschiedliche Hüllsubstanzen bzw. Matrices eingesetzt werden. So kann beispielsweise neben PDMS oder einer anderen Matrix, die eine gute Biokompatibilität aufweist, ein stabiler Kunststoff für die restliche Matrix eingesetzt werden, um so ein nach außen stabiles Objekt, in dessen Innerem eine das Zellwachstum ermöglichende Matrix mit geringerer Stabilität vorliegt, zu erzeugen. If photopolymerizable PDMS is used as a matrix or as a covering substance, gas exchange between the cells embedded in this matrix is possible. As already mentioned, different coating substances or matrices can be used. For example, in addition to PDMS or another matrix that has good biocompatibility, a stable plastic can be used for the rest of the matrix in order to create an object that is stable on the outside and inside a matrix that enables cell growth and is less stable.
Die um die photoreaktive Gruppe ergänzte Ausgangssubstanz wird in flüssiger Weise eingesetzt, wobei unterschiedliche Viskositäten möglich sind. Das heißt, das Herstellungsverfahren für das erfindungsgemäße 3D-Gerüst ist nicht auf photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten mit einer bestimmten Viskosität beschränkt, sondern es können auch niedrigviskose Flüssigkeiten eingesetzt werden. Es können sowohl Newton’sche als auch nicht-Newton’sche Flüssigkeiten eingesetzt werden. The starting substance supplemented by the photoreactive group is used in a liquid manner, with different viscosities being possible. This means that the production method for the 3D framework according to the invention is not limited to photopolymerizable or photocrosslinkable liquids with a certain viscosity, but rather low-viscosity liquids can also be used. Both Newtonian and non-Newtonian liquids can be used.
Die Flüssigkeiten können Lösungen oder kolloid-disperse Gemische, wie etwa Suspensionen, sein. Die Flüssigkeiten können dabei einen wässrigen bis öligen Charakter haben. Dies wird u.a. durch die Wahl der Ausgangssubstanzen und deren Partikelgröße bestimmt. The liquids can be solutions or colloid-disperse mixtures such as suspensions. The liquids can range from aqueous to oily Have character. This is determined, among other things, by the choice of the starting substances and their particle size.
Damit eine Photopolymerisierung oder Photovernetzung der eine photoreaktive Gruppe tragenden Ausgangssubstanz erreicht werden kann, wird zudem vorzugsweise ein Radikalbildner (ein sogenannter Photoinitiator) eingesetzt, der bei einer ausgewählten Wellenlänge der im Rahmen des Verfahrens eingesetzten elektromagnetischen Strahlung Radikale bildet. In order to achieve photopolymerization or photocrosslinking of the starting substance carrying a photoreactive group, a radical generator (a so-called photoinitiator) is also preferably used, which forms radicals at a selected wavelength of the electromagnetic radiation used in the process.
Geeignete Radikalbildner sind beispielsweise Anthronderivate wie etwa Violanthron oder Isoviolanthron, Fluoreszein, Rubren, Anthrazinderivate, Tetrazenderivate, Benzanthron, Benzanthronil, Eosin, Levolinsäurederivate, Phospin-Derivate, Mono- und Bis-Acyl-Phosphine, Metallocene, Acetophenone, Benzophenone, Xanthone, Quinone, Keton-Derivate, Hydroxyketone, Aminoketone, Benzoyl-Peroxide, Pyridin- Salze, Phenylglyoxylate und/oder lodonium-Salze. Suitable radical formers are, for example, anthrone derivatives such as violanthrone or isoviolanthrone, fluorescein, rubrene, anthrazine derivatives, tetrazene derivatives, benzanthrone, benzanthronil, eosin, levolinic acid derivatives, phosphine derivatives, mono- and bis-acyl phosphines, metallocenes, acetophenones, xanthones, Ketone derivatives, hydroxy ketones, amino ketones, benzoyl peroxides, pyridine salts, phenyl glyoxylates and / or iodonium salts.
Vorzugsweise werden zusätzlich zu dem Radikalbildner auch noch ein Vinylmakromer und ein Amin-basierter Co-Initiator eingesetzt, um die Photopolymerisation oder Photovernetzung in besonders geeigneter Weise ablaufen zu lassen. Als Co-Initiator sind beispielsweise Ascorbinsäure und tertiäre Aminderivate, wie etwa Methyldiethanolamin oder Tetraethylamin geeignet. In addition to the radical generator, a vinyl macromer and an amine-based co-initiator are preferably used in order to allow the photopolymerization or photocrosslinking to proceed in a particularly suitable manner. As a co-initiator, for example, ascorbic acid and tertiary amine derivatives, such as methyldiethanolamine or tetraethylamine, are suitable.
In einer Variante weist die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit ein Thiolderivat auf. Geeignete Thiolderivate sind Dithiothreitol, monofunktionale Cysteine, bifunktionale Peptide und ähnliche Verbindungen. In one variant, the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid has a thiol derivative. Suitable thiol derivatives are dithiothreitol, monofunctional cysteines, bifunctional peptides and similar compounds.
Darüber hinaus kann der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit eine Substanz zugesetzt werden, die eine Photopolymerisation oder Photovernetzung tieferer, flüssiger Schichten verhindert. So bleibt flüssige Lösung außerhalb der Fokusebene flüssig, auch wenn sie sich im Einstrahlbereich der über ihr liegenden Fokusebene befindet. Dies funktioniert durch eine Absorption der Substanz bei der Wellenlänge, bei der die Polymerisation stattfindet (polymerisierende Wellenlänge). Das Abfangen findet in der Fokusebene statt, so dass kein Eindringen der polymerisierenden Wellenlänge in tiefere Schichten möglich ist. Geeignet sind alle Substanzen, die in der gewünschten Wellenlänge absorbieren, wie etwa Farbstoffe. In addition, a substance can be added to the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid which prevents photopolymerization or photocrosslinking of deeper, liquid layers. In this way, liquid solution outside the focal plane remains liquid, even if it is in the irradiation area of the focal plane lying above it. This works by absorbing the substance at the wavelength at which the polymerisation takes place (polymerising wavelength). The interception takes place in the focal plane, so that no intrusion of the polymerizing wavelength in deeper layers is possible. All substances that absorb in the desired wavelength, such as dyes, are suitable.
Darüber hinaus ist es in einer Variante möglich, dass die eine photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und/oder eine der weiteren photopolymerisierbaren oder photvernetzbaren Flüssigkeiten und/oder eine andere Flüssigkeit, die nicht photopolymerisierbar sein muss, einen temperatursensitiven Gelbildner aufweisen. Insbesondere ist der Einsatz eines invers-temperatursensitiven (auch als revers temperatursensitiv bezeichneten) Gelbildners vorgesehen. Ein solcher Gelbildner wird mit steigender Temperatur fester. Durch ein Erwärmen des Reaktionsgefäßes erstarrt die Reaktionsflüssigkeit und bildet ein zunächst nur metastabiles Gel. Sollte die Flüssigkeit nicht gleichzeitig photopolymerisiert oder photovernetzt werden, kann durch ein nachfolgendes Abkühlen des 3D-Gerüsts das metastabile Gel wieder verflüssigt und abgepumpt werden. Bei gewöhnlichen temperatursensitiven Gelbildnern liegen die anzuwendenden Temperaturverhältnisse genau umgekehrt. So kann bei Bedarf beispielsweise eine Stützstruktur erstellt werden, so dass hängende Strukturen erzeugbar sind. Wird das metastabile Gel hingegen zumindest teilweise mit elektromagnetischer Strahlung in geeigneter Wellenlänge bestrahlt, kommt es zu einer Photopolymerisierung, so dass das metastabile Gel in diesen Bereichen in ein stabiles Gel bzw. Polymer umgesetzt wird. In addition, it is possible in a variant that the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and / or one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquids and / or another liquid that does not have to be photopolymerizable have a temperature-sensitive gel former. In particular, the use of an inverse temperature-sensitive (also referred to as reverse temperature-sensitive) gel former is provided. Such a gel former becomes firmer with increasing temperature. When the reaction vessel is heated, the reaction liquid solidifies and initially only forms a metastable gel. If the liquid is not photopolymerized or photocrosslinked at the same time, the metastable gel can be liquefied again and pumped out by subsequent cooling of the 3D framework. In the case of conventional temperature-sensitive gel formers, the temperature conditions to be used are exactly the opposite. If necessary, for example, a support structure can be created so that hanging structures can be created. If, on the other hand, the metastable gel is at least partially irradiated with electromagnetic radiation at a suitable wavelength, photopolymerization occurs, so that the metastable gel is converted into a stable gel or polymer in these areas.
Mit anderen Worten ausgedrückt, kann durch den temperatursensitiven, insbesondere invers-temperatursensitiven, Gelbildner und eine Temperaturkontrolle des Reaktionsraumes noch einfacher mit hängenden Partien und Hinterschnitten oder Hohlräumen gearbeitet werden. Auch in dieser Variante kann weiterhin mit flüssigen Strukturen als Stütze gearbeitet werden. In other words, the temperature-sensitive, in particular inverse-temperature-sensitive, gel former and temperature control of the reaction space make it even easier to work with hanging parts and undercuts or cavities. In this variant, too, you can continue to work with liquid structures as a support.
Es ist darüber hinaus möglich, einen Temperaturgradienten vorzusehen, so dass ein metastabiles Gel nicht in allen Bereichen der mit dem temperatursensitiven, insbesondere invers-temperatursensitiven, Gelbildner versetzten Flüssigkeit erfolgt. Mit Hilfe eines solchen Gradienten können noch komplexere Strukturen erzeugt werden. It is also possible to provide a temperature gradient so that a metastable gel does not occur in all areas of the liquid to which the temperature-sensitive, in particular inverse-temperature-sensitive, gelling agent is added. With the help of such a gradient, even more complex structures can be created.
Die vorgenannten einzelnen Komponenten können als individuelle Substanzen in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit enthalten sein. Alternativ ist es auch möglich, die zur Gelbildung vorzugsweise eingesetzten Substanzen bzw. Gruppen in einem einzigen Polymer durch entsprechende Synthese zu realisieren. Statt einer Mischung aus einzelnen Komponenten würde ein derartiges Polymer dann unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweisen, die alle für eine Photopolymerisation oder Photovernetzung benötigten bzw. vorzugsweise einzusetzenden Funktionen in sich vereinen. Ferner ist es auch denkbar, lediglich einige der für die Photopolymerisation oder Photovernetzung vorzugsweise eingesetzten Funktionen bzw. Gruppen in einem Polymer vorzusehen und andere für die Photopolymerisation oder Photovernetzung vorzugsweise einzusetzende Funktionen bzw. Gruppen in separaten Einzelkomponenten der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit zuzumischen. The aforementioned individual components can be contained as individual substances in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid. Alternatively It is also possible to realize the substances or groups preferably used for gel formation in a single polymer by appropriate synthesis. Instead of a mixture of individual components, such a polymer would then have different functional groups which combine all of the functions required or preferably to be used for photopolymerization or photocrosslinking. Furthermore, it is also conceivable to provide only some of the functions or groups preferably used for photopolymerization or photocrosslinking in a polymer and to mix other functions or groups preferably used for photopolymerization or photocrosslinking in separate individual components of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
Alternativ oder zusätzlich zu der Bildung von Hohlräumen oder kanalförmigen Gefäßen über die Verwendung eines Gelbildners können auch Enzyme zur Verdauung des Polymers eingesetzt werden. Das Prinzip ist das Folgende: Ein 3D-Gerüst mit Hohlräumen/Hinterschnitten (z.B. einem Kanalsystem) wird als solider Körper gedruckt, indem alle Hohlräume beim Druck mit einem Opfermaterial ausgefüllt sind, welches später (d.h. nach Abschluss des Drucks) durch Gabe des richtigen Enzyms aufgelöst werden kann. Das Opfermaterial ist bspw. ein verdaubares Polymer, das durch Zugabe eines verdauenden Enzyms verdaut wird. Dies ist eine elegante Strategie zum Schaffen von Hohlräumen mit stereolithografischen Druckverfahren. Beispielsweise kann eine Hyaluronidase (verdauendes Enzym) Hyaluronsäure (Opfermaterial) verdauen, so dass an der Stelle im 3D-Gerüst, in der die Hyaluronidase eingesetzt wird, ein Hohlraum entsteht. Dieses Prinzip ist bereits in der Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen DE 10 2019 200 792.9 beschrieben. Alternativ kann zur Schaffung eines Hohlraums/Hinterschnittes auch ein Photoblocker in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit eingesetzt werden, wobei der Photoblocker die Aushärtetiefe der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit einschränkt. As an alternative or in addition to the formation of cavities or channel-shaped vessels via the use of a gel former, enzymes can also be used to digest the polymer. The principle is as follows: A 3D framework with cavities / undercuts (e.g. a canal system) is printed as a solid body in that all cavities are filled with a sacrificial material during printing, which is later (i.e. after the printing is completed) by giving the correct enzyme can be resolved. The sacrificial material is, for example, a digestible polymer that is digested by adding a digestive enzyme. This is an elegant strategy for creating voids with stereolithographic printing processes. For example, a hyaluronidase (digesting enzyme) can digest hyaluronic acid (sacrificial material) so that a cavity is created at the point in the 3D framework in which the hyaluronidase is used. This principle is already described in the patent application with the official file number DE 10 2019 200 792.9. Alternatively, a photoblocker can also be used in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid to create a cavity / undercut, the photoblocker restricting the curing depth of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
In einer Variante wird die weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit erst dann in das Reaktionsgefäß eingebracht, wenn die zuvor im Reaktionsgefäß befindliche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit (dies kann beispielsweise die eine photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit oder eine weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit sein) aus dem Reaktionsgefäß entfernt wurde. In a variant, the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is only introduced into the reaction vessel when the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid previously located in the reaction vessel (this can, for example, be the one photopolymerizable or photocrosslinkable Liquid or another photopolymerizable or photocrosslinkable liquid) was removed from the reaction vessel.
In einer Variante kann das 3D-Gerüst während oder am Ende seines Herstellungsprozesses mit elektromagnetischer Strahlung einer niedrigen Wellenlänge (beispielsweise im UV-Bereich, also unterhalb von 380 nm) bestrahlt werden, um auf diese Weise eine Sterilisation zu erreichen. In a variant, the 3D framework can be irradiated with electromagnetic radiation of a low wavelength (for example in the UV range, that is below 380 nm) during or at the end of its manufacturing process in order to achieve sterilization in this way.
In einer Variante ist eine Trägerplatte oder Trägerstruktur in dem Reaktionsgefäß angeordnet, an die die erste polymerisierte oder vernetzte Struktur gebunden wird. Der Einsatz einer derartigen Trägerplatte bietet sich dann an, wenn das erzeugte 3D- Gerüst später nicht im Reaktionsgefäß selbst untersucht werden soll, sondern aus dem Reaktionsgefäß entnommen werden soll. In der Trägerplatte können beispielsweise Schraubanschlüsse (wie etwa DIN-Schraubanschlüsse) vorhanden sein, um eine nachfolgende Versorgung des erzeugten 3D-Gerüsts mit Flüssigkeiten und Gasen zu ermöglichen. Es ist auch möglich, derartige Schraubanschlüsse in die Matrix des 3D- Gerüsts im Rahmen des Herstellungsverfahrens einzubringen, diese Schraubanschlüsse also dort in der Matrix zu generieren. Das Erzeugen derartiger Schraubanschlüsse in der Matrix kann unabhängig davon vorgenommen werden, ob eine Trägerplatte eingesetzt wird oder nicht. In a variant, a carrier plate or carrier structure is arranged in the reaction vessel, to which the first polymerized or crosslinked structure is bound. The use of such a carrier plate is advisable when the 3D framework created is not to be examined later in the reaction vessel itself, but is to be removed from the reaction vessel. For example, screw connections (such as DIN screw connections) can be present in the carrier plate in order to enable a subsequent supply of the generated 3D framework with liquids and gases. It is also possible to introduce such screw connections into the matrix of the 3D framework within the scope of the manufacturing process, that is to say to generate these screw connections there in the matrix. The creation of such screw connections in the matrix can be carried out regardless of whether a carrier plate is used or not.
In einer Variante wird eine Trägerplatte vor dem Schritt des Erzeugens einer ersten polymerisierten oder vernetzen Struktur durch das Einstrahlen einer elektromagnetischen Strahlung in eine Fokusebene, die innerhalb eines mit einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit (insbesondere mit der ersten oder einer der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit) gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt, erzeugt, indem eine polymerisierte oder vernetzte Trägerstruktur gebildet wird, die die Trägerplatte aufweist oder darstellt. Das heißt, in dieser Variante werden nicht nur die eigentlichen polymerisierten oder vernetzten Strukturen, sondern auch die Trägerstruktur durch eine Polymerisierungs- oder Vernetzungsreaktion erzeugt. In a variant, a carrier plate is, before the step of generating a first polymerized or crosslinked structure, by irradiating electromagnetic radiation into a focal plane which is within a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid (in particular with the first or one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid) Filled area of the reaction vessel is generated by a polymerized or crosslinked support structure is formed, which has the support plate or is. This means that in this variant, not only the actual polymerized or crosslinked structures, but also the support structure are produced by a polymerization or crosslinking reaction.
Die Trägerstruktur kann eine solche Form haben, dass zwischen der Trägerplatte und einem Boden des Reaktionsgefäßes ein Abstand gebildet ist. Dadurch weisen dann die Fokusebenen der eigentlichen Polymerisierungs- oder Vernetzungsreaktionen einen größeren Abstand zum Boden des Reaktionsgefäßes auf. Insbesondere weist die erste gebildete polymerisierte oder vernetzte Struktur dann einen größeren Abstand zum Boden des Reaktionsgefäßes auf. Dann lassen sich nicht mehr benötigte polymerisierbare oder vernetzbare Flüssigkeiten besonders leicht aus dem Reaktionsgefäß absaugen. The support structure can have such a shape that a spacing is formed between the support plate and a bottom of the reaction vessel. As a result, the Focal planes of the actual polymerization or crosslinking reactions at a greater distance from the bottom of the reaction vessel. In particular, the first polymerized or crosslinked structure formed then has a greater distance from the bottom of the reaction vessel. Polymerizable or crosslinkable liquids that are no longer required can then be suctioned out of the reaction vessel particularly easily.
In einer Variante wird zwischen einer Quelle für die elektromagnetische Strahlung (Strahlungsquelle), die zur Erzeugung der einen und/oder der weiteren elektromagnetischen Strahlung dient, und dem Reaktionsgefäß ein optisches System angeordnet, das zur Fokussierung der elektromagnetischen Strahlung auf die jeweilige Fokusebene in dem Reaktionsgefäß dient. Dabei ist es in einer Variante vorgesehen, dass eine Refokussierung dieses optischen Systems erfolgen kann, um die Fokusebene innerhalb des Reaktionsgefäßes zu ändern. Eine derartige Refokussierung kann beispielsweise durch eine Veränderung des Abstands des optischen Systems zur Strahlungsquelle erreicht werden. Dabei kann ein computergesteuerter Schrittmotor vorgesehen sein, um eine entsprechende Bewegung des optischen Systems zu vermitteln. Beim optischen System kann es sich beispielsweise um ein System optischer Linsen oder - in einem konstruktiv besonders einfach gelagerten Fall - um eine einzelne Fokussierlinse handeln. In a variant, an optical system is arranged between a source for the electromagnetic radiation (radiation source), which is used to generate one and / or the other electromagnetic radiation, and the reaction vessel, which is used to focus the electromagnetic radiation on the respective focal plane in the reaction vessel serves. In one variant, it is provided that this optical system can be refocused in order to change the focal plane within the reaction vessel. Such a refocusing can be achieved, for example, by changing the distance between the optical system and the radiation source. A computer-controlled stepper motor can be provided in order to convey a corresponding movement of the optical system. The optical system can be, for example, a system of optical lenses or - in a case that is particularly simple in terms of construction - a single focusing lens.
In einer Variante ist es auch möglich, eine Relativbewegung zwischen dem Reaktionsgefäß oder einer in dem Reaktionsgefäß angeordneten Trägerplatte auf der einen Seite und der Strahlungsquelle, die zur Erzeugung der einen und/oder der weiteren Lichtstrahlung dient, auf der anderen Seite durchzuführen. Denn durch eine derartige Relativbewegung, die beispielsweise durch eine Bewegung des Reaktionsgefäßes, durch eine Bewegung der in dem Reaktionsgefäß angeordneten Trägerplatte oder durch eine Bewegung der Strahlungsquelle bewerkstelligt werden kann, kann die Fokusebene innerhalb des Reaktionsgefäßes ebenfalls geändert werden. Bei dieser Variante ist folglich keine Refokussierung eines optional einzusetzenden optischen Systems erforderlich. Dadurch kann die Gefahr optischer Dejustagen reduziert werden. In einer weiteren Verfahrensvariante zur Herstellung des erfindungsgemäßen 3D- Gerüsts werden die eine und/oder die weitere elektromagnetische Strahlung auf einen definierten und vorbestimmbaren Bereich in der jeweiligen Fokusebene innerhalb der einen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit und/oder der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit gelenkt. Das heißt, es kann ein spezifisches Strahlungsmuster vorgegeben werden, das auf die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit trifft und an diesen Stellen zu einer Polymerisierung oder Vernetzung der Flüssigkeit zur Bildung eines Polymers bzw. eines Gels (der Matrix) dient. Ein derartiges Strahlungsmuster kann beispielsweise durch den Einsatz von Masken oder Blenden, aber auch durch den Einsatz einer gepulsten Strahlung oder die digitale Modulierung eines Strahlungssignals erzeugt werden. An den Bereichen der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit, die von der Strahlung getroffen werden, kommt es zu einer Polymerisierung oder Vernetzung. An den anderen, nicht von der Strahlung getroffenen Bereichen verbleibt die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit indes in ihrem nicht polymerisierten oder nicht vernetzten Zustand. Dadurch definiert die Strahlung die Bereiche, an denen ein Drucken der polymerisierten oder vernetzten Struktur erfolgt. Mit einem derartigen strahlungsunterstützten Drucken sind weitaus höhere Auflösungen möglich, als dies bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren der Fall ist. Die Auflösung hängt dabei von der Wellenlänge der eingesetzten Strahlung ab. Sie ist selbst bei regelmäßig eingesetzten großen Wellenlängen besser als die Auflösung, die mit den herkömmlichen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, realisierbar ist. Je genauer die Strahlungsquelle fokussiert werden kann, desto größer ist die resultierende Auflösung. Beispielsweise können mit einem Laser sehr hohe Auflösungen erreicht werden. In a variant, it is also possible to carry out a relative movement between the reaction vessel or a carrier plate arranged in the reaction vessel on the one hand and the radiation source, which is used to generate one and / or the other light radiation, on the other. This is because such a relative movement, which can be brought about, for example, by moving the reaction vessel, by moving the carrier plate arranged in the reaction vessel, or by moving the radiation source, can also change the focal plane within the reaction vessel. With this variant, no refocusing of an optional optical system is consequently required. This can reduce the risk of optical misalignments. In a further variant of the method for producing the 3D framework according to the invention, one and / or the other electromagnetic radiation is directed to a defined and predeterminable area in the respective focal plane within the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and / or the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid. This means that a specific radiation pattern can be specified which strikes the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and serves at these points to polymerize or crosslink the liquid to form a polymer or a gel (the matrix). Such a radiation pattern can be generated, for example, through the use of masks or diaphragms, but also through the use of pulsed radiation or the digital modulation of a radiation signal. Polymerization or crosslinking occurs in the areas of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid that are hit by the radiation. In the other areas not struck by the radiation, the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid remains in its unpolymerized or uncrosslinked state. As a result, the radiation defines the areas where printing of the polymerized or crosslinked structure takes place. With such a radiation-assisted printing, far higher resolutions are possible than is the case with the methods known from the prior art. The resolution depends on the wavelength of the radiation used. Even with long wavelengths that are regularly used, it is better than the resolution that can be achieved with the conventional methods known from the prior art. The more precisely the radiation source can be focused, the greater the resulting resolution. For example, very high resolutions can be achieved with a laser.
Das jeweils gewählte Bestrahlungsmuster kann beispielsweise von einem Computerprogramm bereitgestellt werden. So ist es denkbar, dass ein Anwender das herzustellende 3D-Gerüst mittels eines CAD-Programms erstellt. Das derart erstellte digitale Objekt wird dann von einem geeigneten Computerprogramm in einzelne Bestrahlungsebenen zerschnitten. Ferner wird jeder Ebene bzw. unterschiedlichen Orten einer jeden Ebene eine bestimmte photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit zugeordnet. Zu diesen Informationen werden Steuerinformationen für einen Drucker erstellt, mittels dessen das beschriebene Verfahren durchgeführt wird. Diese Steuerinformationen geben vor, wann welche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht werden muss. Ferner geben diese Steuerinformationen vor, wann welches Bild einer Bestrahlungsebene auf die jeweilige Fokusebene im Reaktionsgefäß projiziert werden soll. Auf diese Weise lässt sich dann das zuvor am Computer erstellte 3D-Gerüst in ein reales 3D-Gerüst überführen. The irradiation pattern selected in each case can be provided by a computer program, for example. It is thus conceivable that a user creates the 3D framework to be produced by means of a CAD program. The digital object created in this way is then cut into individual irradiation planes by a suitable computer program. Furthermore, a specific photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is assigned to each level or to different locations of each level. Control information for a printer, by means of which the method described is carried out, is created for this information. These Control information specifies when which photopolymerizable or photocrosslinkable liquid has to be introduced into the reaction vessel. This control information also specifies when which image of an irradiation plane is to be projected onto the respective focal plane in the reaction vessel. In this way, the 3D framework previously created on the computer can then be converted into a real 3D framework.
In einer Variante wird mehr als eine polymerisierte oder vernetzte Struktur in derselben Schicht (das heißt, in derselben Fokusebene) erzeugt. Dazu erfolgt zunächst eine Polymerisierung oder Vernetzung einer ersten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit. Anschließend wird die erste photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß entfernt und eine zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht. Nun werden nur solche Bereiche innerhalb der Fokusebene im Reaktionsgefäß bestrahlt, die zuvor nicht bestrahlt wurden und an denen folglich noch keine polymerisierte oder vernetzte Struktur vorliegt. Dadurch können unterschiedliche Matrices in ein und derselben Schicht erzeugt werden. Es werden folglich mehrere polymerisierte oder vernetzte Strukturen in ein und derselben Schicht gebildet, so dass eine heterogene Schicht resultiert. Anschließend kann die zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß entfernt und eine weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht werden. Der Füllstand dieser weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit kann nun auf ein solches Niveau gebracht werden, dass die zuvor gebildete Schicht vollständig überdeckt ist. Dann kann die Fokusebene verschoben werden und eine weitere Schicht des zu erzeugenden 3D-Gerüsts durch eine entsprechende polymerisierte oder vernetzte Struktur aufgebaut werden. Dabei ist es grundsätzlich möglich, dass einzelneIn a variant, more than one polymerized or crosslinked structure is produced in the same layer (that is to say in the same focal plane). For this purpose, a first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is first polymerized or crosslinked. The first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is then removed from the reaction vessel and a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is introduced into the reaction vessel. Now only those areas within the focal plane in the reaction vessel are irradiated that were not previously irradiated and consequently where there is no polymerized or crosslinked structure. This means that different matrices can be produced in one and the same layer. Consequently, several polymerized or crosslinked structures are formed in one and the same layer, so that a heterogeneous layer results. The second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can then be removed from the reaction vessel and a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can be introduced into the reaction vessel. The fill level of this further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can now be brought to a level such that the previously formed layer is completely covered. The focal plane can then be shifted and a further layer of the 3D framework to be generated can be built up using a corresponding polymerized or networked structure. It is basically possible that individual
Schichten des erzeugten 3D-Gerüsts homogen (umfassend eine polymerisierte oder vernetzte Struktur eines einzigen Typs) und andere Schichten heterogen (umfassend polymerisierte oder vernetzte Strukturen unterschiedlichen Typs) vorliegen, wobei die Anzahl der einzelnen Strukturen pro Schicht nicht begrenzt ist. In der Praxis haben sich neben einer einzigen polymerisierten oder vernetzten Struktur pro Schicht heterogen zusammengesetzte Schichten mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 polymerisierten oder vernetzten Strukturen als sinnvoll herausgestellt. In einer Variante wird zumindest die erste Struktur der ersten Schicht, insbesondere aber jede Struktur der ersten Schicht, aus zwei unterschiedlichen Richtungen mit der ersten Strahlung bestrahlt. Dabei sind diese beiden unterschiedlichen Richtungen vorzugsweise einander entgegengesetzt. Mit einer derartigen Bestrahlung aus zwei unterschiedlichen Richtungen wird eine besonders feste Verankerung der ersten Schicht auf der inneren Oberfläche des Reaktionsgefäßes bzw. auf einer Trägerplatte, die in dem Reaktionsgefäß angeordnet ist, erreicht. Dadurch wird ein späterer sicherer Halt des gesamten erzeugten 3D-Gerüsts an dem Reaktionsgefäß bzw. an einer Trägerplatte in dem Reaktionsgefäß erreicht, wodurch nachfolgende Untersuchungen an dem 3D-Gerüst erleichtert werden können. Typischerweise erfolgt die Bestrahlung bei einem nach oben offenen Reaktionsgefäß von oben. Die erste Schicht wird in dieser Variante dann vorzugsweise zusätzlich von unten durch den Boden des Reaktionsgefäßes hindurch bestrahlt. Dazu muss das Reaktionsgefäß aus einem Material gefertigt sein, das für die Strahlung mit der gewählten Wellenlänge durchlässig ist. Die nachfolgenden Schichten, die oberhalb der ersten Schicht angeordnet sind, werden dann vorzugsweise wiederum nur aus einer Richtung (nämlich vorzugsweise von oben) belichtet, damit die bereits gebildeten polymerisierten oder vernetzten Strukturen nicht zwischen der Fokusebene der Strahlung und einer zur Aussendung der Strahlung eingesetzten Strahlungsquelle liegen und somit nicht von der Strahlung vor deren Fokusebene erneut durchstrahlt werden. Layers of the generated 3D framework are homogeneous (comprising a polymerized or crosslinked structure of a single type) and other layers are heterogeneous (comprising polymerized or crosslinked structures of different types), the number of individual structures per layer not being limited. In practice, in addition to a single polymerized or crosslinked structure per layer, heterogeneously composed layers with 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 polymerized or crosslinked structures have proven to be useful. In one variant, at least the first structure of the first layer, but in particular each structure of the first layer, is irradiated with the first radiation from two different directions. In this case, these two different directions are preferably opposite to one another. With such an irradiation from two different directions, a particularly firm anchoring of the first layer on the inner surface of the reaction vessel or on a carrier plate which is arranged in the reaction vessel is achieved. As a result, a later secure hold of the entire generated 3D framework on the reaction vessel or on a carrier plate in the reaction vessel is achieved, whereby subsequent examinations on the 3D framework can be facilitated. The irradiation is typically carried out from above in a reaction vessel that is open at the top. In this variant, the first layer is then preferably additionally irradiated from below through the bottom of the reaction vessel. For this purpose, the reaction vessel must be made of a material that is permeable to radiation with the selected wavelength. The subsequent layers, which are arranged above the first layer, are then preferably exposed from only one direction (namely preferably from above) so that the polymerized or crosslinked structures already formed are not between the focal plane of the radiation and a radiation source used to emit the radiation and are therefore not penetrated again by the radiation in front of its focal plane.
In einer Variante weisen die erste elektromagnetische Strahlung und/oder die weitere elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge im Bereich von 200 nm bis 1000 nm (also eine Wellenlänge, die zwischen dem UV-Bereich und dem Infrarot-Bereich liegt), stärker bevorzugt im Bereich von 350 nm und 800 nm auf. Mit derartigen Wellenlängen lassen sich die bevorzugt als Radikalbildner eingesetzten Substanzen besonders gut anregen, so dass Radikale gebildet werden, um eine Polymerisierung oder Vernetzung von Acrylreste tragenden Ausgangssubstanzen zu ermöglichen. In one variant, the first electromagnetic radiation and / or the further electromagnetic radiation have a wavelength in the range from 200 nm to 1000 nm (i.e. a wavelength that lies between the UV range and the infrared range), more preferably in the range of 350 nm and 800 nm. With such wavelengths, the substances preferably used as radical formers can be excited particularly well, so that radicals are formed in order to enable polymerization or crosslinking of starting substances bearing acrylic residues.
Weitere geeignete Wellenlängen der eingesetzten elektromagnetischen Strahlung liegen im Bereich von 250 nm bis 950 nm, insbesondere von 250 nm bis 850 nm, insbesondere von 300 nm bis 800 nm, insbesondere von 300 nm bis 750 nm, insbesondere von 300 nm bis 700 nm, insbesondere von 350 nm bis 650 nm und ganz besonders von 350 nm bis 400 nm. Die zur Polymerisation oder Vernetzung eingesetzten Strahlungen können dieselbe Wellenlänge oder aber verschiedene Wellenlängen aus dem vorgenannten Wellenlängenbereich umfassen, um eine geeignete Polymerisation der unterschiedlichen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten zu ermöglichen. Dabei können die einzelnen Strahlungen durch unterschiedliche oder aber durch ein und dieselbe Strahlungsquelle erzeugt werden. Es ist auch möglich, innerhalb einer Schicht (und damit innerhalb einer Fokusebene) nacheinander verschiedene Wellenlängen einzusetzen, um unterschiedliche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten in derselben Schicht zu polymerisieren oder zu vernetzen, wenn eine heterogene Schicht aus unterschiedlichen polymerisierten oder vernetzten Strukturen gebildet werden soll. Further suitable wavelengths of the electromagnetic radiation used are in the range from 250 nm to 950 nm, in particular from 250 nm to 850 nm, in particular from 300 nm to 800 nm, in particular from 300 nm to 750 nm, in particular from 300 nm to 700 nm, in particular from 350 nm to 650 nm and especially from 350 nm to 400 nm. The radiation used for the polymerization or crosslinking can comprise the same wavelength or different wavelengths from the aforementioned wavelength range in order to enable suitable polymerization of the different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids. The individual radiations can be generated by different or by one and the same radiation source. It is also possible to use different wavelengths one after the other within a layer (and thus within a focal plane) in order to polymerize or crosslink different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids in the same layer, if a heterogeneous layer is to be formed from different polymerized or crosslinked structures.
In einer Variante wird das Verfahren derart durchgeführt, dass während der Erzeugung des 3D-Gerüsts mindestens ein funktionelles Element in das 3D-Gerüst eingebracht wird. Das funktionelle Element ist dabei ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Membranen, Kanälen, Poren, Sensoren, Säulen, Gittern, Netzen, Querstreben, oder elektrisch leitenden Trägern und chemotaktischen Präparaten. Kanäle und Poren können beispielsweise in das Objekt integriert werden, indem bestimmte Bereiche der gebildeten polymerisierten oder vernetzten Struktur in mehreren Schichten übereinander freigelassen werden. Membranen können durch das Einbringen von Lipidmolekülen in die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit gebildet werden. In one variant, the method is carried out in such a way that at least one functional element is introduced into the 3D framework while the 3D framework is being generated. The functional element is selected from the group consisting of membranes, channels, pores, sensors, columns, grids, nets, cross struts, or electrically conductive supports and chemotactic preparations. Channels and pores can be integrated into the object, for example, by leaving certain areas of the formed polymerized or cross-linked structure exposed in several layers on top of one another. Membranes can be formed by introducing lipid molecules into the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
Darüber hinaus können mit Hilfe der Photopolymerisation oder Photovernetzung ebenfalls Salzbrücken innerhalb des 3D-Gerüsts eingebracht werden. Dies ist besonders einfach möglich, wenn die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit Salze enthält, also salzhaltig ist. Auf diesem Wege kann nachfolgend eine elektrische Ableitung und Enervierung des gedruckten 3D-Gerüsts erfolgen. In addition, salt bridges can also be introduced within the 3D framework with the help of photopolymerization or photocrosslinking. This is particularly easy if the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid contains salts, that is to say contains salts. In this way, electrical derivation and enervation of the printed 3D framework can then take place.
Über bereits während des Herstellungsprozesses in das 3D-Gerüst eingebrachte Sensoren braucht das hergestellte 3D-Gerüst nachträglich nicht mehr manipuliert zu werden, sondern kann unmittelbar über die bereits eingebrachten Sensoren ausgelesen werden. Dies erleichtert nachfolgende Analysen des mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts erheblich. Beispielsweise durch das Einbringen elektrisch leitender Träger, wie etwa Elektroden, wird es besonders einfach, bei einer nachfolgenden Untersuchung des gebildeten 3D-Gerüsts das elektrische Potential bzw. die elektrischen Eigenschaften des besiedelten 3D-Gerüsts zu analysieren. Using sensors already introduced into the 3D framework during the manufacturing process, the 3D framework no longer needs to be manipulated afterwards, but can be read out directly via the sensors that have already been introduced. This makes subsequent analyzes of the 3D framework populated with biological cells much easier. For example, by bringing in Electrically conductive carriers, such as electrodes, make it particularly easy to analyze the electrical potential or the electrical properties of the populated 3D framework in a subsequent examination of the 3D framework that has been formed.
Durch das Einbringen chemotaktischer Präparate, die in einer Variante in unterschiedlichen Schichten in unterschiedlichen Konzentrationen eingebracht werden können, um so einen Gradienten zu erzeugen, lässt sich das gezielte Wachstum/Besiedeln von biologischen Zellen innerhalb des 3D-Gerüsts nach dessen Fertigstellung ermöglichen. Wenn es sich bei dem chemotaktischen Präparat um einen Lockstoff handelt, übt er eine positive Chemotaxis aus, so dass sich die biologischen Zellen im 3D-Gerüst zu Bereichen höherer Konzentration des Lockstoffes hin orientieren werden. Handelt es sich bei dem chemotaktischen Präparat indes um einen Schreckstoff, übt er eine negative Chemotaxis aus, so dass sich die biologischen Zellen im 3D-Gerüst zu Bereichen niedrigerer Konzentration des Schreckstoffes bzw. zu Bereichen, in denen der Schreckstoff gar nicht vorhanden ist, orientieren werden. Dadurch lässt sich ein zielgerichtetes Wachstum/Besiedeln von Zellen innerhalb des 3D-Gerüsts erreichen. By introducing chemotactic preparations, which can be introduced in a variant in different layers in different concentrations in order to create a gradient, the targeted growth / colonization of biological cells within the 3D framework can be made possible after its completion. If the chemotactic preparation is an attractant, it exerts a positive chemotaxis, so that the biological cells in the 3D framework will orient themselves towards areas of higher concentration of the attractant. However, if the chemotactic preparation is a deterrent, it exerts a negative chemotaxis, so that the biological cells in the 3D framework orient themselves to areas with a lower concentration of the deterrent or to areas in which the deterrent is not even present become. This enables targeted growth / colonization of cells within the 3D framework.
Vorzugsweise wird zumindest ein Füllstandssensor eingesetzt, um die Flüssigkeitshöhe im Reaktionsgefäß stets genau zu erkennen. Aufgrund dieser Füllstandsinformationen kann dann die Fokusebene bestimmt werden, in der der nächste Polymerisations- oder Vernetzungsschritt durchgeführt werden soll. Die von einem derartigen Füllstandssensor bereitgestellten Daten können auch dazu dienen, die Fokusebene automatisiert anzupassen. Über die von einem Füllstandssensor bereitgestellten Daten kann auch eine Pumpe gesteuert werden, die den Zufluss der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten in das Reaktionsgefäß vermittelt. Auf diese Weise kann stets genau eine solche Menge der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten in das Reaktionsgefäß eingebracht werden, die zum Aufbau der gerade gewünschten Schicht erforderlich ist. Dadurch werden Abfallmengen gering gehalten. Ferner wird dadurch eine kostengünstige Realisierung des gesamten Verfahrens ermöglicht. Der Schritt des 3D-Druckens des 3D-Gerüsts kann vollständig automatisiert durchgeführt werden, so dass ein Eingriff eines Benutzers nicht erforderlich ist. Dies erleichtert die Verfahrensanwendung zusätzlich. At least one fill level sensor is preferably used in order to always accurately identify the liquid level in the reaction vessel. On the basis of this level information, the focal plane can then be determined in which the next polymerization or crosslinking step is to be carried out. The data provided by such a fill level sensor can also be used to automatically adapt the focal plane. The data provided by a fill level sensor can also be used to control a pump which mediates the flow of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids into the reaction vessel. In this way, exactly such amount of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can always be introduced into the reaction vessel as is required to build up the layer that is currently desired. This keeps the amount of waste low. Furthermore, an inexpensive implementation of the entire method is made possible as a result. The step of 3D printing the 3D framework can be carried out in a completely automated manner, so that intervention by a user is not required. This additionally facilitates the application of the method.
Die Zeitdauer, während der die elektromagnetische Strahlung auf die jeweilige Fokusebene eingestrahlt wird, kann an die jeweiligen Anforderungen der eingesetzten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten angepasst werden. Das heißt, jedem Material wird zur Aushärtung eine solche Zeit zugestanden, die für die gewünschte Polymerisierung oder Vernetzung erforderlich und sinnvoll ist. The period of time during which the electromagnetic radiation is radiated onto the respective focal plane can be adapted to the respective requirements of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids used. This means that each material is allowed to cure in such a time that is necessary and meaningful for the desired polymerization or crosslinking.
Wenn ein Träger innerhalb des Reaktionsgefäßes angeordnet ist, kann sich beim Anheben dieses Trägers relativ zum Reaktionsgefäß ein Unterdrück zwischen einem umgebenden Flüssigkeitsbett und den bereits polymerisierten oder vernetzen Strukturen auf dem Träger ergeben. Durch das Absaugen der Reste der für den vorherigen Polymerisations- oder Vernetzungsschritt noch im Reaktionsgefäß befindlichen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit und das Einbringen einer neuen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit kann ein potentiell herrschender Unterdrück jedoch entspannt werden. Dadurch kann der Träger relativ zum Reaktionsgefäß bewegt werden, ohne dass ein Abreißen der bereits polymerisierten oder vernetzten Strukturen des 3D-Gerüsts von dem Träger befürchtet werden muss. If a carrier is arranged within the reaction vessel, when this carrier is raised relative to the reaction vessel, a negative pressure can result between a surrounding liquid bed and the already polymerized or crosslinked structures on the carrier. By suctioning off the residues of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid still in the reaction vessel for the previous polymerization or crosslinking step and introducing a new photopolymerizable or photocrosslinkable liquid, a potentially prevailing negative pressure can, however, be released. As a result, the carrier can be moved relative to the reaction vessel without fear of tearing off the already polymerized or crosslinked structures of the 3D framework from the carrier.
Wenn das 3D-Gerüst auf einer Trägerplatte erzeugt wird, kann diese Trägerplatte nach Ende des Herstellungsprozesses komplett aus der noch verbliebenen Flüssigkeit im Reaktionsgefäß herausgehoben werden. Anschließend kann das erzeugte 3D-Gerüst vom Anwender von der Trägerplatte entfernt werden. If the 3D framework is generated on a carrier plate, this carrier plate can be lifted completely out of the remaining liquid in the reaction vessel at the end of the manufacturing process. The 3D framework created can then be removed from the carrier plate by the user.
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts kann beispielsweise eine 3D- Druckvorrichtung verwendet werden, wie sie in EP 3018531 A1 beschrieben ist. For example, a 3D printing device, as described in EP 3018531 A1, can be used to produce the 3D framework according to the invention.
Durch Zusatz einer temperatursensitiven, insbesondere einer invers temperatursensitiven, Substanz kann die Erzeugung von hängenden Objekten und Hohlräumen in dem 3D-Gerüst zusätzlich verbessert werden. Hierbei kann beispielsweise eine Substanz wie etwa ein Poloxamer in einer solchen Konzentration zugemischt werden, dass die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit oder eine nicht photopolymerisierbare oder nicht photovernetzbare Flüssigkeit auch ohne Bestrahlung in einem gewünschten Temperaturbereich geliert. By adding a temperature-sensitive, in particular an inversely temperature-sensitive, substance, the creation of hanging objects and cavities in the 3D framework can be additionally improved. For example, a substance such as a poloxamer can be used in such a concentration are admixed so that the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid or a non-photopolymerizable or non-photocrosslinkable liquid gels even without irradiation in a desired temperature range.
Beispielhaft kann das Verfahren so ablaufen: Wenn eine Gelierung bei einer Temperatur von ca. 20 °C (beispielhaft als „Geliertemperatur“ zu bezeichnen) erreicht werden soll, mischt man der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit ein Poloxamer in einer solchen Konzentration bei, dass die Flüssigkeit in diesem Bereich geliert. Es sind auch Mischungen aus mehreren Poloxameren möglich. Wenn möglich, kann die Flüssigkeit zunächst auf eine Temperatur unter dem Gelierpunkt gekühlt werden. Ist eine hängende Struktur innerhalb des Objekts gewünscht, kann die Flüssigkeit, die den temperatursensitiven Gelbildner enthält, auf eine Temperatur erwärmt werden, die über der Geliertemperatur liegt. Die Flüssigkeit geliert dann. Parallel dazu kann die Flüssigkeit ebenfalls photopolymerisiert oder photovernetzt werden. Sollte ein Bereich der temperatursensitiven Flüssigkeit nicht photopolymerisiert oder photovernetzt werden, ist diese bei der erhöhten Temperatur zwar fest, bei einer Absenkung der Temperatur unterhalb der Geliertemperatur jedoch jederzeit wieder verflüssigbar. So kann der temperatursensitive, gelierte Teil als Stützstruktur bis zum Ende des Druckprozesses fungieren. Nach Abschluss des Drückens kann die Temperatur wieder unter die oben genannte beispielhafte Geliertemperatur von 20 °C gesenkt werden. Als Folge verflüssigt sich der nicht polymerisierte oder nicht vernetzte, temperatursensitive Teil der Flüssigkeit wieder und kann abgepumpt werden. Wird das Gel verflüssigt, wird die Stützstruktur entfernt und der ehemals gestützte Teil des gedruckten Objektes, das nun photopolymerisiert oder photovernetzt ist, hängt frei. The process can run as follows: If gelation is to be achieved at a temperature of approx. 20 ° C (to be referred to as "gelation temperature"), a poloxamer is added to the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid in such a concentration that the liquid gelled in this area. Mixtures of several poloxamers are also possible. If possible, the liquid can first be cooled to a temperature below the gelation point. If a hanging structure within the object is desired, the liquid containing the temperature-sensitive gelling agent can be heated to a temperature which is above the gelling temperature. The liquid then gels. At the same time, the liquid can also be photopolymerized or photocrosslinked. If an area of the temperature-sensitive liquid is not photopolymerized or photocrosslinked, it is solid at the increased temperature, but can be liquefied again at any time if the temperature drops below the gelation temperature. In this way, the temperature-sensitive, gelled part can function as a support structure until the end of the printing process. After pressing has been completed, the temperature can be reduced again to below the above-mentioned exemplary setting temperature of 20 ° C. As a result, the non-polymerized or non-crosslinked, temperature-sensitive part of the liquid liquefies again and can be pumped out. If the gel liquefies, the support structure is removed and the previously supported part of the printed object, which is now photopolymerized or photocrosslinked, hangs freely.
In einer Ausgestaltung betrifft die vorliegende Erfindung auch ein erfindungsgemäßes 3D-Gerüst, dessen Besiedlungsraum zumindest teilweise mit biologischen Zellen besiedelt ist. In anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung also auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts zum Besiedeln des Besiedlungsraums mit biologischen Zellen, insbesondere zur Besiedlung mit biologischen Zellen, die innerhalb des 3D-Gerüsts mit Nährstoffen versorgt werden. Anders ausgedrückt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Besiedeln des Hohlraums eines erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts, wobei eine Zellsuspension in den Hohlraum eingebracht wird, wobei die durch die Zellsuspension eingebrachten biologischen Zellen mit Nährstoffen versorgt werden. In one embodiment, the present invention also relates to a 3D framework according to the invention, the settlement area of which is at least partially colonized with biological cells. In other words, the present invention also relates to the use of a 3D framework according to the invention for colonizing the settlement area with biological cells, in particular for colonization with biological cells that are supplied with nutrients within the 3D framework. In other words, the present invention also relates to a method for colonizing the cavity of a 3D framework according to the invention, wherein a Cell suspension is introduced into the cavity, the biological cells introduced by the cell suspension being supplied with nutrients.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen 3D- Gerüsts zum Kultivieren von biologischen Zellen zu einem Gewebe oder Organ in dessen Besiedlungsraum, d.h. zur Herstellung eines 3D-Zellkulturkonstrukts. Anders ausgedrückt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkulturkonstrukts, bzw. Gewebes oder Organs, durch Kultivieren von biologischen Zellen im Besiedlungsraum des 3D-Gerüsts. Die Kultivierungsbedingungen sind abhängig von dem Typ der verwendeten Zellen. Einem Fachmann auf dem Gebiet der Biologie sind die idealen Kultivierungsbedingungen für verschiedene biologische Zellen in der Regel bekannt. Die anhand des Zelltyps zu bestimmendenThe present invention also relates to the use of a 3D framework according to the invention for cultivating biological cells to form a tissue or organ in its colonization area, i.e. for producing a 3D cell culture construct. In other words, the present invention also relates to a method for producing a cell culture construct, or tissue or organ, by culturing biological cells in the colonization area of the 3D framework. The cultivation conditions depend on the type of cells used. A person skilled in the field of biology is usually familiar with the ideal cultivation conditions for various biological cells. Those to be determined on the basis of the cell type
Kultivierungsbedingungen sind Temperatur, Zusammensetzung der jeweiligen Nährlösung und Beschaffung des Kulturgefäßes. Beispielhaft können hier die Bedingungen für humane Blutgefäßzellen aus der Nabelschnur genannt werden: 37°C, Minimalmedium mit Glucose, alle essenziellen Aminosäuren, Vitamine und Mineralien. Die Kultur befindet sich hierbei vorzugsweise auf Petrischalen oder Zellkulturflaschen, die für Gewebekulturen (sog. tissue culture-treated surfaces) beschichtet wurden. Diese genannten Kulturbedingungen sind für zahlreiche humane Zellen günstig. Bei Gefäßzellen ist zusätzlich der Einsatz von Wachstumsfaktoren notwendig, die dem Minimalmedium hinzugegeben werden. Cultivation conditions are temperature, the composition of the respective nutrient solution and the procurement of the culture vessel. The conditions for human blood vessel cells from the umbilical cord can be named here as an example: 37 ° C, minimal medium with glucose, all essential amino acids, vitamins and minerals. The culture is preferably located on Petri dishes or cell culture bottles that have been coated for tissue cultures (so-called tissue culture-treated surfaces). These culture conditions mentioned are favorable for numerous human cells. In the case of vascular cells, it is also necessary to use growth factors that are added to the minimal medium.
Anschließend kann das 3D-Zellkulturkonstrukt mit weiteren Zellen, Viren, Bakterien, Enzymen oder Wirkstoffen penetriert werden, um Tests an dem Konstrukt vorzunehmen. Hierzu können die Einfüllöffnung(en) oder die Öffnung des Besiedlungsraums verwendet werden, manche Substanzen oder Zellen können das Material des 3D-Gerüsts jedoch auch so durchdringen. Auf diesem Weg können beispielsweise Tumorzellen mit Car-T-Zellen angegriffen werden. The 3D cell culture construct can then be penetrated with further cells, viruses, bacteria, enzymes or active substances in order to carry out tests on the construct. The filling opening (s) or the opening of the settlement area can be used for this, but some substances or cells can also penetrate the material of the 3D framework in this way. In this way, for example, tumor cells can be attacked with Car-T cells.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts liegt dieses in trockener Form vor, d.h. das 3D-Gerüst wird nach dem Vorgang des lithographischen 3D- Druckens getrocknet. Dabei bekommt das 3D-Gerüst eine haltbarere und besser zu transportierende Form. Nach Abschluss der Trocknung/Vitrifikation ist das 3D-Gerüst licht- und feuchtigkeitsgeschützt im Kühlschrank für mindestens sechs Wochen lagerfähig. Hierbei schrumpft das 3D-Gerüst leicht und wird härter. Eine nasse Lagerung lässt das 3D-Gerüst Gefahr laufen, schneller zu verderben. Die Trocknung/Vitrifikation wird vorzugsweise in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Geeignete Trocknungstemperaturen liegen im Bereich von 4°C bis 50°C, stärker bevorzugt im Bereich von 15°C bis 25°C. Die Trocknung kann beispielsweise in einem Trockenschrank, in einer Klimakammer oder in Ähnlichem durchgeführt werden. In one embodiment of the 3D framework according to the invention, this is in dry form, ie the 3D framework is dried after the process of lithographic 3D printing. The 3D framework is given a more durable and easily transportable shape. After drying / vitrification is complete, the 3D framework is protected from light and moisture in the refrigerator for at least six weeks storable. The 3D framework shrinks slightly and becomes harder. If stored wet, the 3D framework runs the risk of spoiling more quickly. The drying / vitrification is preferably carried out in a sterile environment. Suitable drying temperatures are in the range from 4 ° C to 50 ° C, more preferably in the range from 15 ° C to 25 ° C. The drying can be carried out, for example, in a drying cabinet, in a climatic chamber or the like.
Als biologische Zellen, die für den Aufbau des mit biologischen Zellen besiedelten 3D- Gerüsts eingesetzt werden, kommen sämtliche natürlich vorkommenden eukaryotischen und prokaryotischen Zellen in Betracht. Vorzugsweise handelt es sich bei den eingesetzten Zellen um eukaryotische Zellen. Besonders geeignet sind alle Zellen und Zelltypen, die im Körper eines Säugetiers, insbesondere eines Nagers und ganz besonders eines Menschen, Vorkommen bzw. diesen Körper aufbauen. In einer Variante handelt es sich bei den eingesetzten biologischen Zellen um omnipotente oder pluripotente Zellen. Dabei bezieht sich die Erfindung in einer Variante nur auf den Einsatz solcher Zellen, die ohne die Zerstörung menschlicher Embryonen gewonnen werden können. Neben natürlich vorkommenden Zellen können als biologische Zellen auch Zellen nicht natürlich vorkommender Zelllinien verwendet werden. Derartige künstlich generierte Zelllinien ermöglichen den maßgeschneiderten Aufbau eines herzustellenden 3D-Zellkulturkonstrukts bzw. dreidimensionalen mehrzelligen Objektes. All naturally occurring eukaryotic and prokaryotic cells come into consideration as biological cells which are used for the construction of the 3D framework populated with biological cells. The cells used are preferably eukaryotic cells. All cells and cell types which occur in the body of a mammal, in particular a rodent and very particularly a human, are particularly suitable. In one variant, the biological cells used are omnipotent or pluripotent cells. In one variant, the invention relates only to the use of cells that can be obtained without destroying human embryos. In addition to naturally occurring cells, cells from non-naturally occurring cell lines can also be used as biological cells. Artificially generated cell lines of this kind enable the customized construction of a 3D cell culture construct or three-dimensional multicellular object to be produced.
Da das erfindungsgemäße Gerüst die Kombination verschiedener Zelltypen zu einem 3D-Zellkulturkonstrukt ermöglicht, eignet es sich insbesondere zur Herstellung künstlicher Organe. Derartige künstliche Organe können beispielsweise miniaturisierte Modellobjekte eines natürlich vorkommenden Organs, insbesondere eines natürlich vorkommenden Organs eines Menschen oder eines Tieres, wie etwa eines Säugetieres oder eines Nagers sein. Es ist auch möglich, Kunststoffpolymere und Biopolymere zu kombinieren, so dass sehr stabile Gebilde hergestellt werden können, in denen die biologischen Zellen eingebettet sind. Während eines einzelnen Druckvorganges können mehrere 3D-Gerüste, auch mit unterschiedlichen Formen, gleichzeitig erzeugt werden. Damit der Anwender das erfindungsgemäße getrocknete 3D-Gerüst zur Besiedlung mit biologischen Zellen verwenden kann, wird das 3D-Gerüst rehydratisiert. Dafür wird das 3D-Gerüst vorzugsweise über einen Zeitraum von 60 s bis 60 min vorzugsweise in Wasser, einer Salzlösung, einem Puffer, Zellmedium oder einer ähnlichen physiologisch verträglichen Flüssigkeit eingelegt. Idealerweise erfolgt diese Handlung in einer Petrischale oder Ähnlichem unter sterilen Bedingungen. Hierdurch gewinnt das Gerüst wieder seine ursprüngliche Größe, Festigkeit und Beschaffenheit zurück. Since the framework according to the invention enables the combination of different cell types to form a 3D cell culture construct, it is particularly suitable for the production of artificial organs. Such artificial organs can be, for example, miniaturized model objects of a naturally occurring organ, in particular a naturally occurring organ of a person or an animal, such as a mammal or a rodent. It is also possible to combine plastic polymers and biopolymers so that very stable structures can be produced in which the biological cells are embedded. During a single printing process, several 3D frameworks, even with different shapes, can be created at the same time. So that the user can use the dried 3D framework according to the invention for colonization with biological cells, the 3D framework is rehydrated. For this purpose, the 3D framework is preferably placed in water, a saline solution, a buffer, cell medium or a similar physiologically compatible liquid for a period of 60 s to 60 min. Ideally, this action takes place in a Petri dish or the like under sterile conditions. As a result, the framework regains its original size, strength and texture.
Zur Besiedlung des Gerüsts mit biologischen Zellen wird vorzugsweise eine Suspension aus biologischen Zellen und einem gewünschten Lösungsmittel gemischt. Als Lösungsmittel können alle mit Zellen kompatiblen Lösungen eingesetzt werden. Das umfasst alle wässrigen Lösungen, die das Überleben von Zellen gewährleisten. Für gewöhnlich werden Stoffe zum Einstellen eines neutralen pH-Wertes (pH 7.4) und eines isotonischen Milieus eingesetzt, um mit den Lösungen den Flüssigkeiten im menschlichen Körper (z.B. Blut) nahe zu kommen. Die Konzentration der biologischen Zellen in dem Lösungsmittel liegt dabei vorzugsweise in einem Bereich von 100.000 bis 300.000.000 Zellen pro Milliliter. Für die Besiedlung des 3D-Gerüsts wird die Zellsuspension vorzugsweise über die Einfüllöffnung oder in den Besiedlungsraum in das Gerüst eingebracht. Es ist dabei bevorzugt, dass das Gesamtvolumen der einzufüllenden Zellsuspension maximal so groß wie das Volumen des jeweiligen Hohlraums (Besiedlungsraum oder kanalförmiges Gefäß) des 3D-Gerüsts ist. Wenn die gewünschte Zellkonzentration eingestellt ist, kann der Anwender das Volumen beispielsweise mit Hilfe einer Pipette in das Gerüst einspülen. In order to colonize the framework with biological cells, a suspension of biological cells and a desired solvent is preferably mixed. All solutions compatible with cells can be used as solvents. This includes all aqueous solutions that ensure cell survival. Usually substances are used to set a neutral pH value (pH 7.4) and an isotonic environment in order to get close to the fluids in the human body (e.g. blood) with the solutions. The concentration of the biological cells in the solvent is preferably in a range from 100,000 to 300,000,000 cells per milliliter. For the colonization of the 3D framework, the cell suspension is preferably introduced into the framework via the filling opening or into the colonization space. It is preferred that the total volume of the cell suspension to be filled is at most as large as the volume of the respective cavity (colonization space or channel-shaped vessel) of the 3D framework. When the desired cell concentration has been set, the user can rinse the volume into the framework, for example with the aid of a pipette.
Mögliche Säulen, Gitter oder Querstreben in dem Besiedlungsraum des 3D-Gerüsts können bei der Besiedlung mit biologischen Zellen als Anker oder Rückhalt für die biologischen Zellen dienen, so dass sie an dem 3D-Gerüst anhaften können. Possible columns, grids or cross struts in the settlement area of the 3D framework can serve as an anchor or restraint for the biological cells during the colonization with biological cells, so that they can adhere to the 3D framework.
Nachdem die Zellsuspension in das 3D-Gerüst eingefüllt wurde, kann das jetzt zellhaltige Konstrukt weiter kultiviert werden. Je nach innerem Konstrukt des Hohlraums kann sich jetzt ein neues 3D-Zellkulturmodell ausbilden. Bei adhärenten Zellen adhärieren die biologischen Zellen an alle verfügbaren Strukturen und sich selbst, so dass eine 3D-Struktur in der Form des Hohlraums des 3D-Gerüsts entsteht. Auf diesem Weg entsteht kontrolliert ein 3D-Zellkulturmodell/-konstrukt. Sollte das 3D- Gerüst beispielsweise mit Tumorzellen besiedelt werden, entsteht ein 3D- Tumormodell. After the cell suspension has been poured into the 3D framework, the now cell-containing construct can be further cultivated. Depending on the internal construct of the cavity, a new 3D cell culture model can now develop. In the case of adherent cells, the biological cells adhere to all available structures and to themselves, so that a 3D structure in the shape of the cavity of the 3D framework is created. In this way, a controlled 3D cell culture model / construct is created. If the 3D framework is to be colonized with tumor cells, for example, a 3D tumor model is created.
Mit dem erfindungsgemäßen 3D-Gerüst können komplexe biologische 3D- Zellkulturkonstrukte als Modelle erzeugt werden, um beispielsweise Zell-Zell- Interaktionen, die Organbiogenese, Krankheiten oder Organfunktionen darzustellen und zu untersuchen. Ein derartiges 3D-Zellkulturkonstrukt hat gegenüber der klassischen zweidimensionalen Zellkultur deutliche Vorteile, insbesondere, wenn es um die Modellierung des Zusammenspiels mehrerer Zelltypen geht. Denn die Komplexität von Zell-Zell-Interaktionen, die Funktion einer natürlichen Barriere und die Modellierung von Krankheiten oder Organen können mit den klassischen zweidimensionalen Zellkulturen nicht hinreichend abgebildet werden. With the 3D framework according to the invention, complex biological 3D cell culture constructs can be generated as models in order, for example, to depict and examine cell-cell interactions, organ biogenesis, diseases or organ functions. Such a 3D cell culture construct has clear advantages over the classic two-dimensional cell culture, especially when it comes to modeling the interaction of several cell types. The complexity of cell-cell interactions, the function of a natural barrier and the modeling of diseases or organs cannot be adequately represented with classic two-dimensional cell cultures.
Darüber hinaus ermöglicht das erfindungsgemäße 3D-Gerüst die Erstellung miniaturisierter Modelle in besonders einfacher Art und Weise. Derartige miniaturisierte Modelle wurden bislang teilweise von Hand aufgebaut. Der hierfür erforderliche Aufwand ist sehr hoch; zudem ist langjährige Erfahrung notwendig. In addition, the 3D framework according to the invention enables miniaturized models to be created in a particularly simple manner. Such miniaturized models have so far been partially built by hand. The effort required for this is very high; Many years of experience are also required.
Schließlich kann mit der Zellbesiedlung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts eine hohe Reproduzierbarkeit unterschiedlicher Exemplare des gleichen 3D-Zellkulturkonstrukts gewährleistet werden. Die Verwendung eines 3D-Gerüsts ermöglicht zudem den gerichteten Aufbau einer 3D-Zellkultur. Folglich lässt sich durch die Verwendung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts nicht nur die Herstellung gegenüber anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren beschleunigen, vielmehr weisen die erzeugten 3D-Zellkulturkonstrukte auch stets die gleiche Qualität auf. Eine derart hohe Reproduzierbarkeit ist in der Biotechnologie besonders vorteilhaft. Denn bei der Analyse und Entwicklung neuer pharmazeutischer Produkte reduziert ein Test an stets gleich bleibenden dreidimensionalen Zellkulturen die Entwicklungskosten erheblich. Wenn derart komplexe dreidimensionale Strukturen hingegen per Hand aufgebaut werden, sind individuelle Schwankungen unvermeidlich. Damit wird es aber praktisch unmöglich, reproduzierbare Testergebnisse zu erhalten. Demgegenüber liefert die Verwendung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts 3D-Zellkulturkonstrukte, die für die Erzeugung reproduzierbarer Testergebnisse hervorragend geeignet sind. Die vorliegende Erfindung weist folgende Vorteile auf: Bisher waren keine Gerüste mit Hinterschnitten oder komplexen Architekturen möglich, die von einem Anwender selbst besiedelt werden können. Das 3D-Gerüst fungiert selbst als Hohlkörper, dessen Herstellung ohne Multimaterial-Stereolithographie bis jetzt nicht möglich gewesen wäre. Die komplexe Architektur, mit der auf das Verhalten der Zellen Einfluss genommen wird, wäre so nicht abzubilden. Durch den erfindungsgemäßen Herstellungsweg kann eine hohe Reproduzierbarkeit und Parallelität gewährleistet werden. Das 3D-Gerüst lässt sich trotz komplexer Architektur mit einer millimetergenauen Präzision reproduzieren. Darüber hinaus erlaubt das System erstmals die Herstellung von vaskulären Strukturen. Dabei muss das System nicht aktiv geschüttelt werden, wie sonst in einer klassischen Schüttelkultur. Die Zellen verbleiben lebend im Gerüst. Durch den Einfluss des Systems lassen sich deutlich längere Kultivierungszeiten erreichen. So kann das besiedelte System beispielsweise über Zeiträume von mehreren Wochen kultiviert werden, so dass es Einsatz als Ersatzprodukt für Tierversuche finden kann. Kultivierungszeiträume von mehreren Wochen waren für manche Zelltypen bislang nicht möglich. Des Weiteren lässt sich das Verhalten der Zellen online verfolgen, da das System für sichtbares Licht vorzugsweise transparent ist. Eine kontinuierliche Messung durch optische Methoden ist gewährleistet. Zusammenfassend stellt das Gerüst durch seine Form, Architektur, Methode der Anwendung, physikalische Parameter eine Neuerung dar. Finally, with the cell colonization of the 3D framework according to the invention, a high level of reproducibility of different specimens of the same 3D cell culture construct can be ensured. The use of a 3D framework also enables the targeted construction of a 3D cell culture. Consequently, by using the 3D framework according to the invention, not only can the production be accelerated compared to other methods known from the prior art, but the 3D cell culture constructs generated also always have the same quality. Such a high reproducibility is particularly advantageous in biotechnology. Because when analyzing and developing new pharmaceutical products, a test on three-dimensional cell cultures that always remain the same reduces development costs considerably. When such complex three-dimensional structures are built by hand, however, individual fluctuations are inevitable. However, this makes it practically impossible to obtain reproducible test results. In contrast, the use of the 3D framework according to the invention provides 3D cell culture constructs which are excellently suited for generating reproducible test results. The present invention has the following advantages: So far, no frameworks with undercuts or complex architectures have been possible that can be populated by a user himself. The 3D framework itself functions as a hollow body, the manufacture of which would not have been possible until now without multi-material stereolithography. The complex architecture with which the behavior of the cells is influenced could not be represented in this way. The production method according to the invention can ensure a high level of reproducibility and parallelism. Despite the complex architecture, the 3D framework can be reproduced with millimeter precision. In addition, the system allows the production of vascular structures for the first time. The system does not have to be actively shaken, as is otherwise the case in a classic shaking culture. The cells remain alive in the scaffold. Due to the influence of the system, significantly longer cultivation times can be achieved. For example, the populated system can be cultivated over periods of several weeks so that it can be used as a substitute for animal experiments. Cultivation periods of several weeks have not been possible for some cell types up to now. Furthermore, the behavior of the cells can be tracked online, since the system is preferably transparent to visible light. Continuous measurement using optical methods is guaranteed. In summary, the structure is a novelty due to its shape, architecture, method of application and physical parameters.
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand von konkreten Ausführungsformen veranschaulicht werden, die in den folgenden Figuren gezeigt sind: The present invention will now be illustrated with the aid of specific embodiments which are shown in the following figures:
Fig. 1: Fig. 1 zeigt eine Ansicht eines unbesiedelten 3D-Gerüsts einer CAD-Fig. 1: Fig. 1 shows a view of an uninhabited 3D framework of a CAD
Datei mit einem zentralen Besiedlungsraum sowie zwei den Besiedlungsraum umgebenden kanalförmigen Gefäße mit zwei Einfüllöffnungen an der Oberseite und zwei seitlichen Auslassöffnungen. File with a central settlement area and two channel-shaped vessels surrounding the settlement area with two filling openings on the top and two side outlet openings.
Fig. 2: Fig. 2 zeigt eine mikroskopische Aufnahme eins gedruckten Modells nach der CAD-Datei nach Fig. 1 von unten. FIG. 2: FIG. 2 shows a microscopic image of a printed model according to the CAD file according to FIG. 1 from below.
Fig. 3a: Fig. 3a zeigt eine mikroskopische Fluoreszenzaufnahme eines erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts nach Fig. 2, die selektiv die in dem kanalförmigen Gefäß gesäten Gefäßzellen aufzeigt. FIG. 3a: FIG. 3a shows a microscopic fluorescence image of a 3D framework according to the invention according to FIG. 2, which selectively shows those in the showing canal-shaped vessel seeded vascular cells.
Fig. 3b: Fig. 3b zeigt eine Durchlichtaufnahme eines erfindungsgemäßen 3D-Fig. 3b: Fig. 3b shows a transmitted light image of a 3D image according to the invention
Gerüsts nach Fig. 2, die eine angesiedelte Zellmasse im zentralen Besiedlungsraum zeigt. Scaffolding according to FIG. 2, which shows a settled cell mass in the central settlement area.
Fig. 1 zeigt ein in einer CAD-Datei erstelltes Modell eines 3D-Gerüsts 1, das erfindungsgemäß verwendet werden kann. Das 3D-Gerüst 1 ist vorzugsweise quadratisch mit abgerundeten Ecken ausgebildet. Das 3D-Gerüst 1 weist vorzugsweise eine zentrale, nach oben offene Vertiefung als Besiedlungsraum 5 für biologische Zellen auf. Weiterhin weist es vorzugsweise ein nach oben geschlossenes, kanalförmiges Gefäß 2 auf, das sich vorzugsweise in der horizontalen Ebene um den zentralen Besiedlungsraum erstreckt. Die Oberseite 7 des 3D-Gerüsts 1 liegt vorzugsweise in der horizontalen Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird. Ebenso liegt die Unterseite 8 vorzugsweise ebenso in einer horizontalen Ebene, die ebenso durch die Achsen X und Y aufgespannt wird. Vorzugsweise sind die Oberseite 7 und die Unterseite 8 im Wesentlichen deckungsgleich. In Richtung der Achse Z erstreckt sich das 3D-Gerüst in seiner Höhe bzw. Tiefe. Der Besiedlungsraum 5 und das kanalförmige Gefäß 2 sind vorzugsweise räumlich voneinander durch einen Abtrennbereich 6 aus biokompatiblem Polymer abgetrennt. Die zur Oberseite 7 hin offene Vertiefung ist im Hinblick auf die horizontale Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird, vorzugsweise mittig an der Oberseite 7 angeordnet und erstreckt sich in einer Richtung senkrecht zur horizontalen Ebene, der Achse Z, zur Unterseite 8 des 3D-Gerüsts hin. In Richtung der Unterseite 8 ist die Vertiefung vorzugsweise durch biokompatibles Polymer abgeschlossen, so dass eine eingefüllte Zellsuspension nicht austreten kann. Die Vertiefung ist seitlich zu der Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird von einem Rand des 3D-Gerüsts umgeben. Der zur Oberseite 7 hin offene Besiedlungsraum 5 ist vorzugsweise in Bezug auf ihre horizontale Erstreckung ringförmig ausgebildet. Besonders bevorzugt ist die zur Oberseite 7 hin offene Vertiefung in Bezug auf ihre horizontale Erstreckung spiegelsymmetrisch ausgebildet. Die Dimension der Erstreckung der Vertiefung in der Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird, nimmt vorzugsweise in Richtung der Achse Z zur Unterseite 8 hin ab, besonders bevorzugt stufenförmig. Ganz besonders bevorzugt weist die Vertiefung eine erste 9 und eine zweite Ebene 10 auf, die beide durch die Achsen X und Y aufgespannt sind. Die Dimension der Erstreckung der ersten Ebene 9 ist vorzugsweise größer als die Dimension der Erstreckung der zweiten Ebene 10 (beide im Hinblick auf ihre Erstreckung in Ebenen, die von den Achsen X und Y aufgespannt sind), und gehen vorzugsweise mit einer Stufe ineinander über. Die erste Ebene 9 liegt vorzugsweise näher an der Oberseite 7 des 3D-Gerüsts als die zweite Ebene 10. Dabei ist der Vertiefungsraum oberhalb der zweiten Ebene 10 vorzugsweise von dem kanalförmigen Gefäß 2 umgeben, das sich vorzugsweise im Wesentlichen entlang einer Ebene erstreckt, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird („im Wesentlichen“ soll hierin bedeuten, dass das kanalförmige Gefäß 2 in Bezug auf die Richtung der Achse Z ein leichtes Gefälle aufweisen kann). Durch die räumliche Nachbarschaft des Vertiefungsraums oberhalb der zweiten Ebene 10 kann dieser mit Nährstoffen aus dem kanalförmigen Gefäß 2 versorgt werden. Weiterhin ist es bevorzugt, dass das kanalförmige Gefäß 2 unterhalb der ersten Ebene 9 verläuft, so dass der Vertiefungsraum oberhalb der ersten Ebene 9 ebenso räumlich benachbart ist und mit Nährstoffen aus dem kanalförmigen Gefäß 2 versorgt werden kann. Vorzugsweise umgibt das kanalförmige Gefäß 2 die zur Oberseite 7 hin offene Vertiefung ringförmig. Das 3D-Gerüst 1 weist vorzugsweise zwei Einfüllöffnungen 3 für das kanalförmige Gefäß 2 auf, die vorzugsweise an der Oberseite 7 des 3D-Gerüsts 1 in Form von Einfüllstutzen angeordnet sind. Die beiden Einfüllöffnungen 3 sind dabei vorzugsweise an gegenüberliegenden Seiten, insbesondere an Ecken angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass das ringförmig um die Vertiefung verlaufendes kanalförmiges Gefäß 2 gleichmäßig mit einer Nährlösung versorgt werden kann. Das 3D-Gerüst 1 weist vorzugsweise zwei Auslassöffnungen 4 für das kanalförmige Gefäß 2 auf, die vorzugsweise an den Seitenflächen 11, hier an den Eckkanten des 3D-Gerüsts 1, angeordnet sind, die senkrecht zu der Ebene der Oberseite 7 verlaufen. Die beiden Auslassöffnungen 4 sind vorzugsweise an gegenüberliegenden Ecken des 3D-Gerüsts 1 angeordnet. Durch die Anwesenheit von zwei Einfüllöffnungen 3 und zwei Auslassöffnungen 4 eines ringförmigen ausgebildeten kanalförmigen Gefäßes 2 ist es möglich die biologischen Zellen gleichmäßig mit Nährstoffen zu versorgen. 1 shows a model of a 3D framework 1 created in a CAD file, which can be used according to the invention. The 3-D framework 1 is preferably square with rounded corners. The 3D framework 1 preferably has a central, upwardly open depression as a colonization space 5 for biological cells. Furthermore, it preferably has an upwardly closed, channel-shaped vessel 2, which preferably extends in the horizontal plane around the central settlement area. The upper side 7 of the 3D framework 1 is preferably located in the horizontal plane that is spanned by the X and Y axes. Likewise, the bottom 8 is preferably also in a horizontal plane, which is also spanned by the X and Y axes. The upper side 7 and the lower side 8 are preferably essentially congruent. In the direction of the Z axis, the 3-D framework extends in its height or depth. The settlement space 5 and the channel-shaped vessel 2 are preferably spatially separated from one another by a separation area 6 made of biocompatible polymer. With regard to the horizontal plane that is spanned by the axes X and Y, the recess, which is open towards the upper side 7, is preferably arranged centrally on the upper side 7 and extends in a direction perpendicular to the horizontal plane, the axis Z, to the lower side 8 of the 3D framework. In the direction of the underside 8, the recess is preferably closed by biocompatible polymer, so that a cell suspension that has been filled in cannot escape. The recess is laterally to the plane that is spanned by the axes X and Y surrounded by an edge of the 3D framework. The settlement space 5, which is open towards the top 7, is preferably designed to be annular with respect to its horizontal extension. Particularly preferably, the recess open towards the top 7 is designed to be mirror-symmetrical with respect to its horizontal extension. The dimension of the extension of the depression in the plane spanned by the axes X and Y preferably decreases in the direction of the axis Z towards the bottom 8, particularly preferably in steps. The depression very particularly preferably has a first 9 and a second plane 10, both of which are defined by the axes X. and Y are spanned. The dimension of the extension of the first plane 9 is preferably greater than the dimension of the extension of the second plane 10 (both with regard to their extension in planes that are spanned by the axes X and Y), and preferably merge with one another with a step. The first level 9 is preferably closer to the top 7 of the 3D framework than the second level 10. The recess space above the second level 10 is preferably surrounded by the channel-shaped vessel 2, which preferably extends essentially along a plane that passes through the axes X and Y is spanned (“essentially” is intended to mean here that the channel-shaped vessel 2 can have a slight gradient in relation to the direction of the axis Z). Due to the spatial proximity of the depression space above the second level 10, it can be supplied with nutrients from the channel-shaped vessel 2. Furthermore, it is preferred that the channel-shaped vessel 2 runs below the first level 9, so that the recess space above the first level 9 is also spatially adjacent and can be supplied with nutrients from the channel-shaped vessel 2. The channel-shaped vessel 2 preferably surrounds the indentation open towards the upper side 7 in an annular manner. The 3D framework 1 preferably has two filling openings 3 for the channel-shaped vessel 2, which are preferably arranged on the upper side 7 of the 3D framework 1 in the form of filler necks. The two filling openings 3 are preferably arranged on opposite sides, in particular at corners. This has the advantage that the channel-shaped vessel 2 running in a ring around the depression can be uniformly supplied with a nutrient solution. The 3-D framework 1 preferably has two outlet openings 4 for the channel-shaped vessel 2, which are preferably arranged on the side surfaces 11, here on the corner edges of the 3-D framework 1, which run perpendicular to the plane of the top 7. The two outlet openings 4 are preferably arranged at opposite corners of the 3D framework 1. The presence of two filling openings 3 and two outlet openings 4 of an annular channel-shaped vessel 2 makes it possible to supply the biological cells uniformly with nutrients.
Fig. 2 zeigt ein tatsächlich gedrucktes 3D-Gerüst 1 unter dem Mikroskop von seiner Unterseite. Einfüllstutzen 3, kanalförmige Gefäße 2 und Besiedlungsraum 6 sind deutlich zu erkennen. Das in Fig. 2 gezeigte 3D-Gerüst wird durch folgende Verfahrensschritte hergestellt: Erstellung des CAD-Files und Berechnung der Druckvorlage; Rüsten des Druckers mit zu verwendenden photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten; Kalibrieren des Druckers, der Achsen und des Druckkopfs; Ausführung des Druckes, Druckplattform senkt sich auf die erste Druckebene für die erste photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit; Druck eines ersten Polymers aus der ersten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit für Architekturen bestehend aus Polymer 1 für die erste Schichthöhe des zu druckenden Konstrukts; dabei wird der berechnete Bauplan des ersten Polymers für die erste Schichthöhe des Konstrukts auf die Druckebene projiziert, in der sich der Druckkopf befindet; hierbei können ein oder mehrere Konstrukte gleichzeitig hergestellt werden, je nach Wunsch und Planung des Anwenders; begrenzender Faktor ist dabei die Größe der Druckplattform bzw. des Bauraums; Wenn nötig, Waschschritt des Druckers um ein Verschleppen von dem erstenFig. 2 shows an actually printed 3D framework 1 under the microscope from its underside. Filler neck 3, channel-shaped vessels 2 and settlement area 6 can be clearly seen. The 3D framework shown in Fig. 2 is produced by the following process steps: Creation of the CAD file and calculation of the print template; Equipping the printer with photopolymerizable or photocrosslinkable liquids to be used; Calibrating the printer, axes and printhead; Execution of the print, the print platform is lowered to the first print level for the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid; Printing a first polymer from the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid for architectures consisting of polymer 1 for the first layer height of the construct to be printed; the calculated construction plan of the first polymer for the first layer height of the construct is projected onto the printing plane in which the print head is located; one or more constructs can be produced at the same time, depending on the wishes and planning of the user; the limiting factor is the size of the printing platform or the installation space; If necessary, washing step of the printer to avoid a carryover from the first one
Polymer in eine zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und umgekehrt zu verhindern - optional (sofern ein zweites Polymer benötigt wird); Wenn nötig, Druck des zweiten Polymers für Architekturen bestehend aus dem zweiten Polymer für die erste Schicht - optional (sofern ein zweites Polymer verwendet wird); Wiederholung der Schritte sechs und sieben wenn ein drittes Polymer verwendet wird; Veränderung der Druckebene um die zweite Schichthöhe drucken zu können; Druck des ersten Polymers für Architekturen bestehend aus dem ersten Polymer für die zweite Schichthöhe des zu druckenden Konstrukts; Wenn nötig, Waschschritt des Druckers, um ein Verschleppen des erstenPrevent polymer into a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and vice versa - optional (if a second polymer is required); If necessary, printing the second polymer for architectures consisting of the second polymer for the first layer - optional (if a second polymer is used); Repeating steps six and seven if a third polymer is used; Change of the print level in order to be able to print the second layer height; Printing the first polymer for architectures consisting of the first polymer for the second layer height of the construct to be printed; If necessary, wash step the printer to avoid a drag on the first
Polymers in die zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und umgekehrt zu verhindern - optional (sofern zweites Polymer verwendet wird); Wenn nötig, Druck des zweiten Polymers aus einer zweiten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit für Architekturen bestehend aus dem zweiten Polymer für die zweite Schicht - optional (sofern ein zweites Polymer verwendet wird); 13.) Wiederholung der Schritte 11 und 12 wenn ein drittes Polymer benötigt wird;Prevent polymer into the second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and vice versa - optional (if second polymer is used); If necessary, printing the second polymer from a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid for architectures consisting of the second polymer for the second layer - optional (if a second polymer is used); 13.) Repeat steps 11 and 12 if a third polymer is required;
14.) Veränderung der Druckebene um die dritte Schichthöhe drucken zu können;14.) Change of the print level in order to be able to print the third layer height;
15.) Wederholung der Schritte fünf bis acht bis die vollständige Architektur gedruckt wurde; 15.) Repeat steps five through eight until the complete architecture has been printed;
16.) Nach Abschluss des Druckes wird die Druckplattform in die Ausgangsebene gefahren und das erhaltene 3D-Gerüst entfernt; 16.) After the printing is complete, the printing platform is moved to the starting level and the 3D framework obtained is removed;
17.) Im Anschluss kann das 3D-Gerüst getrocknet oder sofort verwendet werden.17.) The 3D framework can then be dried or used immediately.
18.) Wrd das 3D-Gerüst getrocknet, findet dies in einer sterilen Atmosphäre statt; hierbei wird dem 3D-Gerüst sämtliches Wasser entzogen, so dass ein trockenes Polymergerüst entsteht; 18.) If the 3D framework is dried, this takes place in a sterile atmosphere; in the process, all water is removed from the 3D framework, so that a dry polymer framework is created;
19.) Nach dem Trocknen kann das 3D-Gerüst unter sterilen Bedingungen gelagert werden. 19.) After drying, the 3D framework can be stored under sterile conditions.
Konkrete Bedingungen und Parameter für die Herstellung des 3D-Gerüsts nach Fig. 2: Specific conditions and parameters for the production of the 3D framework according to Fig. 2:
Äußerer Durchmesser 3D-Gerüst: 5,0 mm Höhe 3D-Gerüst: 2,5 mm External diameter of the 3D framework: 5.0 mm Height of the 3D framework: 2.5 mm
Volumen Besiedlungsraum: 12 mm3 Innendurchmesser Einfüllöffnungen: 1,2 mm Durchmesser kanalförmige Gefäße und Auslassöffnungen: 0,7 mm Volume of settlement area: 12 mm, 3 inner diameter of filling openings: 1.2 mm, diameter of channel-shaped vessels and outlet openings: 0.7 mm
Zusammensetzung der photovernetzbaren Flüssigkeit: Composition of the photocrosslinkable liquid:
Lösungsmittel: RPMI 1640 + 25 mM HEPES (Biochrom FG 1383), Phosphate- buffered Saline Solvent: RPMI 1640 + 25 mM HEPES (Biochrom FG 1383), phosphate-buffered saline
Photovernetzbare Substanz: Gelatine-Methacrylat, 50 g/kg; Polyethylenglycol-Photocrosslinkable substance: gelatin methacrylate, 50 g / kg; Polyethylene glycol
Diacrylat, 50 g/L Diacrylate, 50 g / L
Weitere Additive: Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat, 5 g/kg; Tartrazin, 2 mM; Other additives: lithium phenyl 2,4,6-trimethylbenzoyl phosphinate, 5 g / kg; Tartrazine, 2 mM;
Aus der photovernetzbaren Flüssigkeit wird das gesamte 3D-Gerüst gedruckt. Durch Zusatz des Photoblockers Tartrazin in der photovernetzbaren Flüssigkeit wird die Penetrationstiefe des zur Polymerisation verwendeten Lichts reguliert, sodass die Herstellung der kanalförmigen Gefäße ermöglicht wird. Alternativ könnten zur Herstellung des kanalförmigen Gefäßes Opfertinten (eingesetzt in einer weiteren photovernetzbaren Flüssigkeit; z.B. 15 g/kg Hyaluronsäure gelöst in RPMI + 5 g/kg Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat gedruckt und anschließend mit Hyaluronidase verdaut, um das Gefäß zu erzeugen) verwendet werden, die nach Abschluss des Drucks hydrolytisch oder durch enzymatisches Verdauen aufgelöst werden. The entire 3D framework is printed from the photocrosslinkable liquid. By adding the photoblocker tartrazine to the photocrosslinkable liquid, the depth of penetration of the light used for polymerization is regulated so that the Production of the channel-shaped vessels is made possible. Alternatively, sacrificial inks (used in another photocrosslinkable liquid; e.g. 15 g / kg hyaluronic acid dissolved in RPMI + 5 g / kg lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate) could be printed and then digested with hyaluronidase to close the vessel to produce the channel-shaped vessel generate), which are hydrolytically or enzymatically digested after the printing is complete.
Fig. 3a zeigte eine mikroskopische Fluoreszenzaufnahme und Fig. 3b eine Durchlichtaufnahme des mit humanen venösen Gefäßzellen der Nabenschnur besiedelten kanalförmigen Gefäßes 2 und des mit humanen mesenchymalen Stromazellen besiedelten Besiedlungsraums 5. Dazu werden folgende weitere Verfahrensschritte durchgeführt: 3a shows a microscopic fluorescence image and FIG. 3b shows a transmitted light image of the canal-shaped vessel 2 populated with human venous vascular cells of the umbilical cord and of the colonization space 5 populated with human mesenchymal stromal cells.
20.) Es wird eine Zellsuspension mit einer vom Anwender vorher eingestellten20.) It becomes a cell suspension with a previously set by the user
Konzentration in den Besiedlungsraums des gemäß 1.) bis 19.) hergestellten 3D- Gerüst pipettiert; dabei wird ein Zellsuspensionsvolumen verwendet, das maximal dem Volumen des Besiedlungsraums des 3D-Gerüsts entspricht; weiterhin wird eine Zellsuspension mit einer vom Anwender vorher eingestellten Konzentration über die beiden Einfüllstutzen in die kanalförmigen Gefäße pipettiert; wird das 3D-Gerüst in Schritt 18.) getrocknet, muss es zuvor zur erneuten Verwendung vom Anwender wieder hydratisiert werden; hierzu eignet sich ein steriles Medium, wie Wasser, PBS, Zellkulturmedium oder ähnliches; Concentration pipetted into the settlement area of the 3D framework produced according to 1.) to 19.); a cell suspension volume is used that corresponds at most to the volume of the settlement area of the 3D framework; Furthermore, a cell suspension with a concentration previously set by the user is pipetted into the channel-shaped vessels via the two filler necks; If the 3D framework is dried in step 18.), it must first be rehydrated by the user before it can be used again; a sterile medium such as water, PBS, cell culture medium or the like is suitable for this;
21.) Durch das Einpipettieren werden die Suspensionen innerhalb des 3D-Gerüsts verteilt und die Zellen können innerhalb des 3D-Gerüsts kultiviert werden. 21.) By pipetting in, the suspensions are distributed within the 3D framework and the cells can be cultivated within the 3D framework.
Die Besiedlungen werden in einer sterilen Petrischale (Durchmesser 10 cm) vorgenommen, die ebenfalls für die spätere Kultur des 3D-Gerüsts genutzt wird. Das 3D-Gerüst wird hydratisiert in die leere Petrischale gesetzt. The colonization is carried out in a sterile Petri dish (diameter 10 cm), which is also used for the later culture of the 3D framework. The 3-D framework is placed in the empty Petri dish in a hydrated state.
In den zentralen Besiedlungsraum werden humane mesenchymale Stromazellen (hMSC) ausgesät. Dazu wird eine Zellsuspension mit 20 Millionen hMSCs pro Milliliter in dem Kulturmedium DMEM high glucose +Pyruvat +L-Glutamin +10% fetales Rinderserum +1% Penicillin/Streptomycin angesetzt und davon 10 pl in den vorher trockengelegten Besiedlungsbereich einpipettiert. Human mesenchymal stromal cells (hMSC) are sown in the central settlement area. For this purpose, a cell suspension with 20 million hMSCs per milliliter in the culture medium DMEM high glucose + pyruvate + L-glutamine + 10% fetal Bovine serum + 1% penicillin / streptomycin are used and 10 μl of this are pipetted into the previously drained colonization area.
Das Kanalsystem wird mit humanen venösen Gefäßzellen aus der Nabelschnur (HUVECs) besiedelt. Dazu wird eine Zellsuspension mit 50 Millionen HUVECs pro Milliliter in dem kommerziell erhältlichen Kulturmedium Endothelial Cell Growth Medium 2 (PromoCell GmbH) +1% Penicillin/Streptomycin angesetzt und davon je 1,5 pl pro Stutzen einpipettiert. The canal system is colonized with human venous cells from the umbilical cord (HUVECs). For this purpose, a cell suspension with 50 million HUVECs per milliliter is made up in the commercially available culture medium Endothelial Cell Growth Medium 2 (PromoCell GmbH) + 1% penicillin / streptomycin and 1.5 μl of this is pipetted into each nozzle.
Nach den Besiedlungen wird das 3D-Gerüst in der geschlossenen Petrischale für 30 min in den Inkubator zum Ruhen gestellt (37°C, 5% CO2). Danach wird das Ko- Kulturmedium Endothelial Cell Growth Medium 2 (PromoCell GmbH) + 1% Penicillin/Streptomycin hinzugegeben und das submerse Zellgerüst bei 37°C und in einer 5% C02-Atmosphäre kultiviert. After the colonization, the 3D framework is placed in the closed Petri dish for 30 min in the incubator to rest (37 ° C, 5% CO2). Then the co-culture medium Endothelial Cell Growth Medium 2 (PromoCell GmbH) + 1% penicillin / streptomycin is added and the submerged cell structure is cultivated at 37 ° C. and in a 5% CO 2 atmosphere.
Liste der Bezugszeichen: List of reference symbols:
1 3D-Gerüst 1 3D framework
2 kanalförmiges Gefäß2 channel-shaped vessel
3 Einfüllöffnung 3 filling opening
4 Auslassöffnung 4 outlet opening
5 Besiedlungsraum5 settlement area
6 Abtrennbereich 6 separation area
7 Oberseite 7 top
8 Unterseite 8 bottom
9 erste Ebene 9 first level
10 zweite Ebene 10 second level
11 Seitenflächen 11 side faces

Claims

Patentansprüche Claims
1. 3D-Gerüst (1) aus biokompatiblem Polymer, das Folgendes aufweist: 1. 3D framework (1) made of biocompatible polymer, which has the following:
(a) eine zur Oberseite (7) des 3D-Gerüsts hin offene Vertiefung als Besiedlungsraum (5) für biologische Zellen; (a) a depression open towards the top (7) of the 3D framework as a colonization space (5) for biological cells;
(b) ein kanalförmiges Gefäß (2) im Inneren des 3D-Gerüsts, das den Besiedlungsraum (5) zumindest teilweise umgibt; (b) a channel-shaped vessel (2) in the interior of the 3D framework, which at least partially surrounds the settlement area (5);
(c) eine Einfüllöffnung (3) für das kanalförmige Gefäß (2); und (c) a filling opening (3) for the channel-shaped vessel (2); and
(d) eine Auslassöffnung (4) für das kanalförmige Gefäß (2). (d) an outlet opening (4) for the channel-shaped vessel (2).
2. 3D-Gerüst (1) nach Anspruch 1, wobei der Besiedlungsraum (5) und das kanalförmige Gefäß (2) räumlich voneinander durch einen Abtrennbereich (6) aus biokompatiblem Polymer abgetrennt sind, wobei das biokompatible Polymer des Abtrennbereichs (6) so gestaltet ist, dass Nährstoffe aus einer Flüssigkeit in dem kanalförmigen Gefäß (2) in den Besiedlungsraum (5) diffundieren. 2. 3D framework (1) according to claim 1, wherein the settlement area (5) and the channel-shaped vessel (2) are spatially separated from one another by a separation area (6) made of biocompatible polymer, the biocompatible polymer of the separation area (6) being designed in this way is that nutrients diffuse from a liquid in the channel-shaped vessel (2) into the settlement area (5).
3. 3D-Gerüst (1) nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zur Oberseite (7) hin offene Vertiefung im Hinblick auf die horizontale Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird, mittig an der Oberseite (7) angeordnet ist und sich in einer Richtung senkrecht zur horizontalen Ebene, der Achse Z, zur Unterseite des 3D- Gerüsts (1) hin erstreckt. 3. 3D framework (1) according to claim 1 or 2, wherein the recess open towards the upper side (7) is arranged centrally on the upper side (7) with regard to the horizontal plane which is spanned by the axes X and Y and extends in a direction perpendicular to the horizontal plane, the axis Z, to the underside of the 3-D framework (1).
4. 3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die zur Oberseite (7) hin offene Vertiefung in Bezug auf ihre horizontale Erstreckung ringförmig, kreisförmig, oval oder in einer Mischform davon ausgebildet ist. 4. 3D framework (1) according to one of claims 1 to 3, wherein the recess open towards the top (7) is annular, circular, oval or a mixed form thereof with respect to its horizontal extension.
5. 3D-Gerüst (1) nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Dimension der Erstreckung der Vertiefung in der Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird, in Richtung der Achse Z zur Unterseite (8) hin abnimmt. 5. 3D framework (1) according to claim 3 or 4, wherein the dimension of the extension of the recess in the plane which is spanned by the axes X and Y decreases in the direction of the axis Z towards the bottom (8).
6. 3D-Gerüst (1) nach Anspruch 5, worin die Abnahme der Dimension der Erstreckung stufenförmig verläuft. 6. 3D framework (1) according to claim 5, wherein the decrease in the dimension of the extension is stepped.
7. 3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Vertiefung eine erste (9) und eine zweite Ebene (10) aufweist, die beide durch die Achsen X und Y aufgespannt sind, und wobei die Dimension der Erstreckung der ersten Ebene (9) größer als die Dimension der Erstreckung der zweiten Ebene (10) ist. 7. 3D framework (1) according to one of claims 1 to 6, wherein the recess has a first (9) and a second plane (10), both of which are spanned by the axes X and Y, and wherein the dimension of the extension the first level (9) is greater than the dimension of the extent of the second level (10).
8. 3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das kanalförmige Gefäß (2) die zur Oberseite hin offene Vertiefung ringförmig umgibt. 8. 3D framework (1) according to one of claims 1 to 7, wherein the channel-shaped vessel (2) surrounds the recess open towards the top in an annular manner.
9. 3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das zwei Einfüllöffnungen (3) für das kanalförmige Gefäß (2) aufweist, die vorzugsweise an der Oberseite (7) des 3D-Gerüsts (1) angeordnet sind. 9. 3D framework (1) according to one of claims 1 to 8, which has two filling openings (3) for the channel-shaped vessel (2), which are preferably arranged on the top (7) of the 3D framework (1).
10. 3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das zwei Auslassöffnungen (4) für das kanalförmige Gefäß (2) aufweist, die vorzugsweise an den Seitenflächen (11) des 3D-Gerüsts (1) angeordnet sind, die senkrecht zu der Ebene der Oberseite (7) verlaufen. 10. 3D framework (1) according to one of claims 1 to 9, which has two outlet openings (4) for the channel-shaped vessel (2), which are preferably arranged on the side surfaces (11) of the 3D framework (1), which run perpendicular to the plane of the top (7).
11. 3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das durch ein lithographisches 3D-Druckverfahren erhältlich ist. 11. 3D framework (1) according to one of claims 1 to 10, which is obtainable by a lithographic 3D printing process.
12. 3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Besiedlungsraum (5) mit Zellen besiedelt ist. 12. 3D framework (1) according to one of claims 1 to 11, wherein the settlement area (5) is populated with cells.
13. Verfahren zur Herstellung eines 3D-Gerüsts (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 durch Aushärten einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanz durch Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung in einer Fokusebene, in der die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz vorliegt. 13. A method for producing a 3D framework (1) according to any one of claims 1 to 12 by curing a photopolymerizable or photocrosslinkable substance by focusing electromagnetic radiation in a focal plane in which the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is present.
14. Verwendung eines 3D-Gerüst (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Besiedlung mit biologischen Zellen, die innerhalb des 3D-Gerüsts mit Nährstoffen versorgt werden. 14. Use of a 3D framework (1) according to any one of claims 1 to 12 for colonization with biological cells that are within the 3D framework with nutrients are supplied.
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