DE102019132180B3

DE102019132180B3 - 3D framework made of biocompatible polymer with a covered cavity for colonization with biological cells

Info

Publication number: DE102019132180B3
Application number: DE102019132180.8A
Authority: DE
Inventors: Lutz Kloke; Alexander Thomas; Anna-Klara Amler
Original assignee: Cellbricks GmbH
Current assignee: Cellbricks GmbH
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2021-04-29
Anticipated expiration: 2039-11-28

Abstract

Die Erfindung betrifft ein 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer, das einen zumindest teilweise überdachten Hohlraum im Inneren des 3D-Gerüsts, eine Einfüllöffnung und mindestens eine Auslassöffnung aufweist, wobei die Einfüllöffnung so ausgebildet ist, dass der Hohlraum mit einer Flüssigkeit befüllbar ist, und wobei die mindestens eine Auslassöffnung so ausgebildet ist, dass beim Befüllen des Hohlraums mit Flüssigkeit bereits vorhandene Flüssigkeit aus dem Hohlraum verdrängt wird und austritt. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts zum Besiedeln des Hohlraums mit biologischen Zellen.The invention relates to a 3D framework made of biocompatible polymer, which has an at least partially covered cavity inside the 3D framework, a filling opening and at least one outlet opening, the filling opening being designed so that the cavity can be filled with a liquid, and wherein the at least one outlet opening is designed so that when the cavity is filled with liquid, any liquid that is already present is displaced from the cavity and exits. The present invention also relates to the use of the 3D framework according to the invention for colonizing the cavity with biological cells.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein 3D-Gerüst (3-dimensionales Gerüst) aus biokompatiblem Polymer, das einen zumindest teilweise überdachten Hohlraum im Inneren des 3D-Gerüsts, eine Einfüllöffnung und mindestens eine Auslassöffnung aufweist, wobei die Einfüllöffnung so ausgebildet ist, dass der Hohlraum mit einer Flüssigkeit befüllbar ist, und wobei die mindestens eine Auslassöffnung so ausgebildet ist, dass beim Befüllen des Hohlraums mit Flüssigkeit bereits vorhandene Flüssigkeit aus dem Hohlraum verdrängt wird und austritt. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts sowie dessen Verwendung zum Besiedeln des Hohlraums mit biologischen Zellen.The present invention relates to a 3D framework (3-dimensional framework) made of biocompatible polymer, which has an at least partially covered cavity inside the 3D framework, a filling opening and at least one outlet opening, the filling opening being designed so that the cavity with can be filled with a liquid, and wherein the at least one outlet opening is designed such that when the cavity is filled with liquid, liquid already present is displaced from the cavity and exits. The present invention also relates to the production of the 3D framework according to the invention and its use for colonizing the cavity with biological cells.

Bislang gibt es nur wenige Möglichkeiten, 3D-Zellkulturen in einer gerichteten Form herzustellen. Die einzigen Möglichkeiten sind bis jetzt die Herstellung von Sphäroiden oder mikrofluidischen Plattformen, oder der Guss eines Gels mit darin suspendierten Zellen. Dagegen besteht mithilfe des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts erstmals die Möglichkeit, biologische Zellen in speziellen dreidimensionalen Architekturen zu kultivieren, die einer physiologischen Architektur deutlich näher sind.So far there are only a few possibilities to produce 3D cell cultures in a directed form. The only options so far are the production of spheroids or microfluidic platforms, or the casting of a gel with cells suspended in it. On the other hand, with the aid of the 3D framework according to the invention, it is possible for the first time to cultivate biological cells in special three-dimensional architectures that are significantly closer to a physiological architecture.

Sphäroide sind enge Packungen aus Zellen mit einer runden Form. Sie lassen jegliche physiologische Form vermissen. Möchte der Anwender darüber hinaus mit mehreren Zelltypen parallel in einem Objekt arbeiten, so bleibt ihm nichts weiter übrig, als ein Sphäroid aus den gewünschten Zelltypen zu formen. Hierbei ist die Form des Sphäroids jedoch ungerichtet und führt zu einer zufälligen Verteilung der Zellen im Sphäroid. Die Zellen können durch diesen Prozess also nicht diskret voneinander positioniert werden. Diese zufällige Verteilung verringert die Aussagekraft der Modelle, wenn daran beispielsweise Versuche mit Viren, Bakterien oder Substanzen wie Pharmazeutika durchgeführt werden sollen. Da keine physiologische Architektur erreicht wird, können z. B. auch kaum direkte Rückschlüsse auf das in vivo-Verhalten im Körper gezogen werden. Darüber hinaus fehlt ebenfalls die extrazelluläre Matrix (ECM) des Körpers. Die Interaktion zwischen ECM und der Zelle hat ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf die Biologie der Zelle. Es ist wichtig für die Zelle, eine Umgebung vorzufinden, die ihrer gewohnten, physiologischen Nische entspricht. Ist dies nicht der Fall, kann es schnell zu einer Dedifferenzierung, einem Absterben oder einfach zur Stasis der Zelle kommen. Des Weiteren muss die ECM in den physikalischen Parametern wie bspw. Steifigkeit oder Porosität den in vivo-Bedingungen ähneln. Als letztes ist die Form selbst ein entscheidender Faktor. Die Form einer physiologischen Umgebung hat ebenfalls einen Einfluss auf die Funktion. So muss z. B. eine Vaskularisierung gesichert sein, wenn eine Versorgung von größerem Gewebe gewährleistet werden soll. Kann ein Gewebe aufgrund fehlender Vaskularisierung nur unzureichend versorgt werden, droht es abzusterben oder seine Funktion zu verlieren.Spheroids are tight packs of cells with a round shape. They lack any physiological form. If the user also wants to work with several cell types in parallel in one object, he has no choice but to form a spheroid from the desired cell types. Here, however, the shape of the spheroid is undirected and leads to a random distribution of the cells in the spheroid. The cells cannot be positioned discretely from one another by this process. This random distribution reduces the informative value of the models if, for example, tests with viruses, bacteria or substances such as pharmaceuticals are to be carried out on them. Since no physiological architecture is achieved, z. For example, no direct conclusions can be drawn about the in vivo behavior in the body. In addition, the body's extracellular matrix (ECM) is also missing. The interaction between the ECM and the cell also has a significant influence on the biology of the cell. It is important for the cell to find an environment that corresponds to its usual, physiological niche. If this is not the case, it can quickly lead to dedifferentiation, death or simply stasis of the cell. Furthermore, the physical parameters of the ECM, such as stiffness or porosity, must be similar to the in vivo conditions. Lastly, the shape itself is a crucial factor. The shape of a physiological environment also has an impact on function. So z. B. a vascularization can be ensured if a supply of larger tissue is to be guaranteed. If a tissue cannot be adequately supplied due to a lack of vascularization, it threatens to die or lose its function.

Mit den bisherigen Möglichkeiten lassen sich diese oben genannten Bedingungen nur unzureichend oder gar nicht reproduzieren. Im Gegensatz dazu bietet das erfindungsgemäße 3D-Gerüst eine Möglichkeit, um komplexe biologische Zellarchitekturen zu schaffen. Das hier vorgestellte 3D-Gerüst soll insbesondere für einen Anwender gedacht sein, der keinen Zugang zu lithographischem 3D-Druck oder Bioprinting hat, jedoch 3D-Zellkulturkonstrukte herstellen möchte.With the previous options, these above-mentioned conditions can only be reproduced inadequately or not at all. In contrast to this, the 3D framework according to the invention offers the possibility of creating complex biological cell architectures. The 3D framework presented here is intended in particular for a user who does not have access to lithographic 3D printing or bioprinting, but wants to produce 3D cell culture constructs.

In der EP 3 018 531 A1 wird ein 3D-Druckverfahren beschrieben, das es erlaubt, mit multiplen Bioinks oder Zelltypen parallel in einem Druckprozess zu arbeiten. Dabei werden die 3D-Zellkukturkonstrukte bereits parallel mit der Herstellung einer Matrix aus biokompatiblem Polymer aufgebaut. Dieses Verfahren eignet sich jedoch nicht für Anwender, die selbst über keine lithographische 3D-Druckvorrichtung verfügen.In the EP 3 018 531 A1 describes a 3D printing process that allows multiple bioinks or cell types to be used in parallel in one printing process. The 3D cell structure constructs are built up in parallel with the production of a matrix made of biocompatible polymer. However, this method is not suitable for users who do not have a lithographic 3D printing device themselves.

Deshalb ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Möglichkeit zur Verfügung zu stellen, mit der ein 3D-Zellkulturkonstrukt auf einfache Art und Weise, mit einem hohen Reproduktionsgrad und einer hohen Ähnlichkeit zur physiologischen Architektur hergestellt werden kann, damit an diesen 3D-Zellkulturkonstrukten beispielsweise Tests mit Bakterien, Viren oder Wirkstoffen durchgeführt werden können.It is therefore the object of the present invention to provide a possibility with which a 3D cell culture construct can be produced in a simple manner, with a high degree of reproduction and a high degree of similarity to the physiological architecture, so that, for example, on these 3D cell culture constructs Tests with bacteria, viruses or active substances can be carried out.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer gelöst. Das 3D-Gerüst weist einen zumindest teilweise überdachten Hohlraum im Inneren des 3D-Gerüsts, eine Einfüllöffnung sowie mindestens eine Auslassöffnung auf. Die Einfüllöffnung ist dabei so ausgebildet, dass der Hohlraum mit einer Flüssigkeit befüllbar ist. Die mindestens eine Auslassöffnung ist so ausgebildet, dass beim Befüllen des Hohlraums mit Flüssigkeit bereits vorhandene Flüssigkeit aus dem Hohlraum verdrängt wird und austritt.The object according to the invention is achieved by a 3D framework made of biocompatible polymer. The 3D framework has an at least partially covered cavity inside the 3D framework, a filling opening and at least one outlet opening. The filling opening is designed in such a way that the cavity can be filled with a liquid. The at least one outlet opening is designed in such a way that when the cavity is filled with liquid, any liquid that is already present is displaced from the cavity and exits.

Unter einem biokompatiblen Polymer wird ein biologisches oder biologisch verträgliches Polymer verstanden, wobei ein biologisches Polymer (in Lebewesen vorkommendes Polymer) bevorzugt ist. Unter „biologisch verträglich“ soll hierin verstanden werden, dass dieses die Lebensdauer der biologischen Zellen nicht beeinflusst, insbesondere also nicht toxisch auf die biologischen Zellen wirkt.A biocompatible polymer is understood to mean a biological or biologically compatible polymer, a biological polymer (polymer occurring in living beings) being preferred. In this context, “biologically compatible” should be understood to mean that it does not affect the lifespan of the biological cells, in particular that it does not have a toxic effect on the biological cells.

Unter dem Ausdruck „aus biokompatiblem Polymer“ wird vorzugsweise verstanden, dass das 3D-Gerüst durch eine Matrix aus einem oder mehreren biokompatiblen Polymeren aufgebaut ist. Es ist zwar nicht ausgeschlossen, dass das 3D-Gerüst weitere Bestandteile neben biokompatiblen Polymeren aufweist, es ist jedoch auch möglich, dass das 3D-Gerüst lediglich aus biokompatiblem Polymer besteht.The expression “made of biocompatible polymer” is preferably understood to mean that the 3D framework is built up by a matrix of one or more biocompatible polymers. Although it is not ruled out that the 3D framework has further components in addition to biocompatible polymers, it is also possible that the 3D framework consists only of biocompatible polymer.

Die zum Befüllen des Hohlraums verwendete Flüssigkeit ist vorzugsweise eine biologische Zellen enthaltende Suspension (im Folgenden Zellsuspension genannt). Die zuvor im Hohlkörper enthaltene Flüssigkeit enthält vorzugsweise keine biologischen Zellen und wird durch die Zellsuspension verdrängt. In einer weiteren Ausführungsform enthält die zur Besiedlung des Hohlraums verwendete Flüssigkeit vorzugsweise Zellsphäroide. In einer weiteren Ausführungsform enthält die verwendete Flüssigkeit vorzugsweise einen Gelbildner, der nach dem Einfüllen ein stabiles Hydrogel bildet, wodurch die inkorporierten Zellen bzw. Zellsphäroide immobilisiert werden. Als stoffliche Grundlage des Gelbildners können enzymatisch vernetzende Gele (z.B. Fibrin), physikalisch vernetzende Gele (z.B. Kollagene) oder photopolymerisierbare bzw. photovernetzbare Flüssigkeiten eingesetzt werden.The liquid used to fill the cavity is preferably a suspension containing biological cells (hereinafter referred to as cell suspension). The liquid previously contained in the hollow body preferably does not contain any biological cells and is displaced by the cell suspension. In a further embodiment, the liquid used to colonize the cavity preferably contains cell spheroids. In a further embodiment, the liquid used preferably contains a gel former which, after filling, forms a stable hydrogel, as a result of which the incorporated cells or cell spheroids are immobilized. Enzymatically crosslinking gels (e.g. fibrin), physically crosslinking gels (e.g. collagens) or photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can be used as the material basis of the gel former.

In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Besiedlung des Hohlraums vorzugsweise durch Einsetzen eines Geweberesektats oder einer Biopsie (sog. ex vivo Kultur). In einer weiteren Ausführungsform kann das Geweberesektat/die Biopsie mit einer gelbildenden Flüssigkeit eingeklebt werden.In a further embodiment, the cavity is preferably colonized by inserting a tissue resection or a biopsy (so-called ex vivo culture). In a further embodiment, the tissue resection / biopsy can be glued in with a gel-forming liquid.

Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst wird vorzugsweise durch lithographisches 3D-Druckverfahren hergestellt, vorzugsweise ein stereolithographisches 3D-Druckverfahren. Unter einem stereolithographischen 3D-Druckverfahren versteht man eines, bei dem die Struktur des 3D-Gerüsts nach und nach durch schichtweises Aushärten von photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanzen hergestellt wird. Dabei werden die photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanzen in Form von photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten eingesetzt. Der Aufbau eines 3D-Gerüsts aus biokompatiblem Polymer durch ein stereolithographisches 3D-Druckverfahren bietet die Möglichkeit, ein biokompatibles Polymer in eine physiologische Form zu drucken, so dass Material und Architektur der nachzuahmenden Struktur im menschlichen Körper ähneln. Da die biologischen Zellen erst anschließend zur Besiedlung in das 3D-Gerüst eingebracht werden können, ist es möglich, ein 3D-Zellkulturkonstrukt jeglichen Zelltyps in dem erfindungsgemäßen 3D-Gerüst aufzubauen.The 3D framework according to the invention is preferably produced by a lithographic 3D printing process, preferably a stereolithographic 3D printing process. A stereolithographic 3D printing process is one in which the structure of the 3D framework is gradually produced by curing photopolymerizable or photocrosslinkable substances in layers. The photopolymerizable or photocrosslinkable substances are used in the form of photopolymerizable or photocrosslinkable liquids. The construction of a 3D framework from biocompatible polymer using a stereolithographic 3D printing process offers the possibility of printing a biocompatible polymer in a physiological form so that the material and architecture resemble the structure to be imitated in the human body. Since the biological cells can only then be introduced into the 3D framework for colonization, it is possible to build up a 3D cell culture construct of any cell type in the 3D framework according to the invention.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts durch Aushärten einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanz durch Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung in einer Fokusebene, in der die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz vorliegt. Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens werden weiter unten beschrieben.The present invention thus also relates to a method for producing a 3D framework according to the invention by curing a photopolymerizable or photocrosslinkable substance by focusing electromagnetic radiation in a focal plane in which the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is present. Preferred embodiments of the method are described below.

Bei der Herstellung des 3D-Gerüsts wird das Aushärten einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanz vorzugsweise durch Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung in einer Fokusebene erreicht, in der die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz vorliegt. Vorzugsweise liegt dabei die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz flüssig, beispielsweise gelöst in einem Lösungsmittel vor. Hier wird im Folgenden von einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit gesprochen.During the production of the 3D framework, the curing of a photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably achieved by focusing electromagnetic radiation in a focal plane in which the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is present. The photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably in liquid form, for example dissolved in a solvent. In the following, this is referred to as a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.

Durch Wiederholen des Fokussierens einer weiteren elektromagnetischen Strahlung in einer weiteren Fokusebene unter Verwendung einer weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit kann das erfindungsgemäße 3D-Gerüst aufgebaut werden.The 3D framework according to the invention can be built up by repeating the focusing of a further electromagnetic radiation in a further focal plane using a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.

Das Herstellungsverfahren des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts wird weiter unten noch im Detail beschrieben.The manufacturing method of the 3D framework according to the invention is described in detail further below.

Unter „photopolymerisierbar“ soll hierin verstanden werden, dass die entsprechende Substanz durch Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung und gegebenenfalls der Anwesenheit eines Photoinitiators polymerisierbar ist. Ebenso soll unter „photovernetzbar“ verstanden werden, dass ein Oligomer oder Polymer durch Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung und gegebenenfalls der Anwesenheit eines Photoinitiators vernetzt werden kann.“Photopolymerizable” is to be understood here as meaning that the corresponding substance can be polymerized by the action of electromagnetic radiation and, if appropriate, the presence of a photoinitiator. Likewise, “photocrosslinkable” should be understood to mean that an oligomer or polymer can be crosslinked by the action of electromagnetic radiation and, if appropriate, the presence of a photoinitiator.

Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst kann aus einem homogenen Material aufgebaut sein und folglich nur ein biokompatibles Polymer eines einzigen Typs umfassen. In einer Variante kann das 3D-Gerüst aus verschiedenen biokompatiblen Polymeren aufgebaut sein, d.h. ist ein heterogen aufgebautes 3D-Gerüst. Dabei werden bei dessen Herstellung mindestens zwei verschiedene photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten eingesetzt. Auf diese Weise können unterschiedliche Polymerstrukturen innerhalb des 3D-Gerüsts verwirklicht werden. So kann beispielsweise der zumindest teilweise überdachte Hohlraum von einer Polymerstruktur umgeben sein, die sich von der Polymerstruktur des äußeren Gerüsts des 3D-Gerüsts unterscheidet, um beispielsweise eine größere Porosität aufzuweisen, die ein Eindringen der biologischen Zellen in die Matrix des 3D-Gerüsts zu ermöglichen. Weiterhin kann der zumindest teilweise überdachte Hohlraum auch Säulen, ein Gitter oder Querstreben aufweisen, um zum einen das Dach des Hohlraums zu stützen und zum anderen ein Adhärieren der biologischen Zellen an der Oberfläche innerhalb des Hohlraums zu ermöglichen. Die Eigenschaften der Polymerstruktur oder der verschiedenen Polymerstrukturen innerhalb des 3D-Gerüsts können durch die Wahl der zu polymerisierenden Monomere oder der zu vernetzenden Polymere in der/den photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit(en) beeinflusst werden. Je kleiner das Molekulargewicht der polymerisierbaren oder vernetzbaren Einheiten, desto kleiner sind in der Regel die Zwischenräume oder Poren der entstehenden Matrix des 3D-Gerüsts. Im zuletzt genannten Fall hängt es jedoch auch stark von der Anzahl der vernetzbaren Einheiten an den Polymeren und somit dem Vernetzungsgrad ab. Je höher der Vernetzungsgrad, desto kleiner sind in der Regel die Zwischenräume oder Poren der entstehenden Matrix des 3D-Gerüsts. Es ist prinzipiell möglich, mit dem lithographischen 3D-Druckverfahren in jeder Schicht unterschiedliche Polymer- oder Monomerlösungen einzusetzen, um ein 3D-Gerüst mit hoher Komplexität oder Diversität zu erhalten.The 3D framework according to the invention can be constructed from a homogeneous material and consequently only comprise a biocompatible polymer of a single type. In a variant, the 3D framework can be built up from different biocompatible polymers, ie is a heterogeneously structured 3D framework. At least two different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids are used in its production. In this way, different polymer structures can be realized within the 3D framework. For example, the at least partially covered cavity can be surrounded by a polymer structure that differs from the polymer structure of the outer framework of the 3D framework in order, for example, to have a greater porosity that enables the biological cells to penetrate into the matrix of the 3D framework . Furthermore, the at least partially covered cavity can also have columns, a grid or cross struts in order to on the one hand to support the roof of the cavity and on the other hand to enable the biological cells to adhere to the surface within the cavity. The properties of the polymer structure or the various polymer structures within the 3D framework can be influenced by the choice of the monomers to be polymerized or the polymers to be crosslinked in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid (s). The smaller the molecular weight of the polymerizable or crosslinkable units, the smaller the interstices or pores of the resulting matrix of the 3D framework are as a rule. In the latter case, however, it also depends heavily on the number of crosslinkable units on the polymers and thus the degree of crosslinking. The higher the degree of crosslinking, the smaller the interstices or pores of the resulting matrix of the 3D framework. In principle, it is possible to use different polymer or monomer solutions in each layer with the lithographic 3D printing process in order to obtain a 3D framework with a high level of complexity or diversity.

In anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass das erfindungsgemäße 3D-Gerüst aus einem ersten biokompatiblen Polymer und mindestens einem weiteren biokompatiblen Polymer aufgebaut ist, das von dem ersten biokompatiblen Polymer verschieden ist. Weiterhin ist es in einer Variante des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts bevorzugt, dass der den Hohlraum umgebende Bereich des 3D-Gerüsts das mindestens eine weitere biokompatible Polymer aufweist.In other words, it is preferred according to the invention that the 3D framework according to the invention is composed of a first biocompatible polymer and at least one further biocompatible polymer that is different from the first biocompatible polymer. Furthermore, in a variant of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the region of the 3D framework surrounding the cavity has the at least one further biocompatible polymer.

Durch die unterschiedlichen Fokusebenen, in denen eine Polymerisierung oder Vernetzung der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten stattfindet, kann ein schichtweiser Aufbau des 3D-Gerüsts erreicht werden. Dabei ist es möglich, den zumindest teilweise überdachten Hohlraum in dem 3D-Gerüst auszubilden. Weiterhin können auch Hinterschnitte und überhängende Strukturen ausgebildet werden, da eine Polymerisierung oder Vernetzung der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit in einer bestimmten Fokusebene beziehungsweise Schicht auch dann erfolgen kann, wenn darunter kein bereits polymerisiertes oder vernetztes Material angeordnet ist, sondern lediglich noch nicht polymerisierte oder nicht vernetzte Flüssigkeit. Eine Polymerisierung oder Vernetzung von einer außerhalb der Fokusebene vorliegenden photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit bleibt aus; vielmehr wird nur diejenige photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit polymerisiert oder vernetzt, die innerhalb der Fokusebene liegt. Dennoch dient die außerhalb der Fokusebene vorhandene Flüssigkeit zur temporären Stützung der in der Fokusebene vorhandenen Flüssigkeit, ohne dass hierfür feste Stützstrukturen erforderlich wären.Due to the different focal planes in which polymerization or crosslinking of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids takes place, a layered structure of the 3D framework can be achieved. It is possible to form the at least partially covered cavity in the 3D framework. Furthermore, undercuts and overhanging structures can also be formed, since the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can also be polymerized or crosslinked in a certain focal plane or layer if there is no already polymerized or crosslinked material underneath, but only not yet polymerized or not crosslinked Liquid. There is no polymerization or crosslinking of a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid present outside the focal plane; rather, only that photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is polymerized or crosslinked which lies within the focal plane. Nevertheless, the liquid present outside the focal plane serves to temporarily support the liquid present in the focal plane without the need for fixed support structures.

In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts ist es bevorzugt, dass die Einfüllöffnung an der Oberseite des 3D-Gerüsts angeordnet ist. Dies hat den Vorteil, dass eine Zellsuspension direkt von oben in das 3D-Gerüst eingefüllt werden kann. Die Einfüllöffnung ist vorzugsweise mittig an der oberen Fläche des 3D-Gerüsts angeordnet. Der Durchmesser der Einfüllöffnung ist dabei vorzugsweise kleiner als der Durchmesser des zugänglichen Hohlraums, so dass der Hohlraum zumindest teilweise durch die obere Fläche des 3D-Gerüsts überdacht vorliegt. Die Einfüllöffnung ist vorzugsweise als Einfüllstutzen ausgebildet. Hierfür ist es bevorzugt, dass auf die vorzugsweise runde Einfüllöffnung ein hohlzylindrischer oder hohlprismatischer Stutzen aufgesetzt ist. Dieser erleichtert das Ansetzen einer Pipettenspitze und das Befüllen des Hohlraums mit Zellsuspension.In one embodiment of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the filling opening is arranged on the upper side of the 3D framework. This has the advantage that a cell suspension can be poured into the 3D framework directly from above. The filling opening is preferably arranged centrally on the upper surface of the 3D framework. The diameter of the filling opening is preferably smaller than the diameter of the accessible cavity, so that the cavity is at least partially covered by the upper surface of the 3D framework. The filler opening is preferably designed as a filler neck. For this purpose, it is preferred that a hollow cylindrical or hollow prismatic nozzle is placed on the preferably round filling opening. This makes it easier to attach a pipette tip and to fill the cavity with cell suspension.

In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts ist es bevorzugt, dass die mindestens eine Auslassöffnung seitlich an dem 3D-Gerüst angeordnet ist. Dies ermöglicht, dass die Auslassöffnung an einem tieferen Punkt als die Einfüllöffnung angeordnet ist, so dass im Hohlraum schon vorhandene Flüssigkeit durch das Einfüllen der Zellsuspension verdrängt werden kann. Dabei ist die mindestens eine Auslassöffnung vorzugsweise über einen Kanal mit dem Hohlraum verbunden, der sich im Wesentlichen horizontal erstreckt. Besonders bevorzugt weist das erfindungsgemäße 3D-Gerüst mehr als eine Auslassöffnung auf, die über mehrere Kanäle mit dem Hohlraum verbunden sind. Noch stärker bevorzugt, weist das erfindungsgemäße 3D-Gerüst eine Mehrzahl an Auslassöffnungen auf, die über eine Mehrzahl an Kanälen mit dem Hohlraum verbunden sind. Die Mehrzahl an Auslassöffnungen und Kanälen ist vorzugsweise seitlich, sternförmig um den vorzugsweise zentral im 3D-Gerüst angeordneten Hohlraum angeordnet. Dies ermöglicht, dass sich bei der Besiedlung des Hohlraums mit adhärenten Zellen kleine Sphäroide über die Kanäle und Auslassöffnungen abschnüren können.In one embodiment of the 3D framework according to the invention, it is preferred that the at least one outlet opening is arranged on the side of the 3D framework. This enables the outlet opening to be arranged at a lower point than the filling opening, so that liquid already present in the cavity can be displaced by the filling in of the cell suspension. The at least one outlet opening is preferably connected to the cavity via a channel which extends essentially horizontally. The 3D framework according to the invention particularly preferably has more than one outlet opening, which are connected to the cavity via several channels. Even more preferably, the 3D framework according to the invention has a plurality of outlet openings which are connected to the cavity via a plurality of channels. The plurality of outlet openings and channels are preferably arranged laterally, in a star shape, around the cavity, which is preferably arranged centrally in the 3D framework. This enables small spheroids to constrict via the channels and outlet openings when the cavity is colonized with adherent cells.

Das erfindungsgemäße 3D-Gerüst hat vorzugsweise eine flache Form, d.h. ist in seinen horizontalen Dimensionen vorzugsweise größer als in der vertikalen Dimension. Das 3D-Gerüst kann jegliche Grundfläche aufweisen, wie beispielsweise kreisförmig, oval, rechteckig oder quadratisch, die beiden letzten auch mit abgerundeten Ecken, wobei eine kreisförmige oder ovale Form bevorzugt ist. Vorzugsweise erstreckt sich das 3D-Gerüst in der Vertikalen prismatisch, d.h. die Grundfläche ändert sich in der vertikalen Richtung nicht wesentlich. Der Durchmesser liegt vorzugsweise im Bereich von 500 µm bis 10 cm, insbesondere aber orientiert sich der Durchmesser an der Größe von Wellplatten, d.h. liegt vorzugsweise konkret bei 6,8 mm (96-Well), 10,4 mm (48-Well), 16,2 mm (24-Well) und 34,6 mm (6-Well). Die Höhe liegt vorzugsweise im Bereich von 500 µm bis 10 cm. Ist der Hohlkörper ein zentral angeordneter Hohlkörper, liegt sein Volumen vorzugsweise im Bereich von 10 µl bis 50 ml.The 3D framework according to the invention preferably has a flat shape, ie is preferably larger in its horizontal dimensions than in the vertical dimension. The 3D framework can have any base area, such as, for example, circular, oval, rectangular or square, the last two also with rounded corners, a circular or oval shape being preferred. The 3-D framework preferably extends prismatically in the vertical, ie the base area does not change significantly in the vertical direction. The diameter is preferably in the range from 500 μm to 10 cm, but in particular it is oriented The diameter corresponds to the size of corrugated plates, ie is preferably 6.8 mm (96-well), 10.4 mm (48-well), 16.2 mm (24-well) and 34.6 mm (6-well) ). The height is preferably in the range from 500 µm to 10 cm. If the hollow body is a centrally arranged hollow body, its volume is preferably in the range from 10 μl to 50 ml.

Für das bessere Verständnis der Dimensionen des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts werden diese anhand von Ebenen oder Richtungen beschrieben, die durch die Achsen X, Y und Z definiert werden, die jeweils senkrecht zueinander stehen. Die Oberseite und die Unterseite des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts liegen in Ebenen, die von den Achsen X und Y aufgespannt werden. Die Erstreckung in der Höhe bzw. Tiefe erfolgt entlang der Achse Z. Die Einfüllöffnung ist vorzugsweise mittig an der Oberseite angeordnet, d.h. erstreckt sich ebenso in einer Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird. Die Oberseite und die Unterseite sind vorzugsweise deckungsgleich. In Richtung der Erstreckung der Achse Z ist das erfindungsgemäße 3D-Gerüst vorzugsweise hohlzylindrisch oder hohlprismatisch. An der/den Seitenfläche(n) (d.h. senkrecht zur Fläche der Oberseite und Unterseite) befinden sich vorzugsweise die Auslassöffnungen. Der/die Kanal/Kanäle, der/die die Auslassöffnung(en) mit dem Hohlraum verbindet/verbinden, verläuft/verlaufen vorzugsweise im Wesentlichen entlang einer Ebene, die von den Achsen X und Y aufgespannt wird. „Im Wesentlichen“ soll dabei mit einschließen, dass der/die Kanal/Kanäle auch leicht abschüssig zu der/den Auslassöffnung(en) verlaufen kann/können. Weist das erfindungsgemäße 3D-Gerüst eine Mehrzahl an Kanälen auf, so sind diese in der Ebene, die durch die Achsen X und Y aufgespannt wird, vorzugsweise in konstanten Abständen voneinander beabstandet, und verlaufen vorzugsweise sternförmig. Dabei ist es besonders bevorzugt, dass die Grundfläche (Unterseite und Oberseite) ringförmig, insbesondere kreisförmig, ist. Die Überdachung des Hohlraums wird besonders bevorzugt durch Säulen im Inneren des Hohlraums abgestützt, wobei die Säulen in Richtung der Achse Z verlaufen. Hinsichtlich ihres Querschnitts können die Säulen verschiedene Formen aufweisen, bspw. rund, eckig, halbkreisförmig oder sichelförmig, wobei eine Form bevorzugt ist, die die innere Oberfläche des Hohlraums erhöht. Das erhöht die Möglichkeit des Adhärierens der biologischen Zellen an dem 3D-Gerüst. Aus diesem Gesichtspunkt ist ein sichelförmiger Querschnitt der Säulen besonders bevorzugt.For a better understanding of the dimensions of the 3D framework according to the invention, these are described using planes or directions that are defined by the axes X, Y and Z, which are each perpendicular to one another. The top and bottom of the 3D framework according to the invention lie in planes that are spanned by the X and Y axes. The height or depth extends along the Z axis. The filling opening is preferably arranged centrally on the upper side, i.e. it also extends in a plane that is spanned by the X and Y axes. The top and the bottom are preferably congruent. In the direction of the extension of the axis Z, the 3D framework according to the invention is preferably hollow-cylindrical or hollow-prismatic. The outlet openings are preferably located on the side surface (s) (i.e. perpendicular to the surface of the top and bottom). The channel (s) that connect / connect the outlet opening (s) to the cavity preferably runs essentially along a plane that is spanned by the X and Y axes. “Essentially” is intended to include that the channel (s) can also run slightly downhill towards the outlet opening (s). If the 3D framework according to the invention has a plurality of channels, these are preferably spaced apart from one another at constant intervals in the plane that is spanned by the axes X and Y, and preferably run in a star shape. It is particularly preferred that the base area (bottom and top) is ring-shaped, in particular circular. The roofing of the cavity is particularly preferably supported by columns in the interior of the cavity, the columns running in the direction of the Z axis. With regard to their cross-section, the columns can have various shapes, for example round, angular, semicircular or sickle-shaped, a shape which increases the inner surface of the cavity is preferred. This increases the possibility of the biological cells adhering to the 3D framework. From this point of view, a sickle-shaped cross section of the pillars is particularly preferred.

Wie bereits weiter oben genannt, ist in einer Ausgestaltung der Erfindung das 3D-Gerüst eines, das mithilfe eines lithographischen 3D-Druckverfahrens erhältlich ist.As already mentioned above, in one embodiment of the invention the 3D framework is one that can be obtained with the aid of a lithographic 3D printing process.

Das 3D-Druckverfahren wird nun im Folgenden detaillierter beschrieben:

Vorzugsweise ist die Herstellung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts in folgende Verfahrensschritte unterteilt:
- (I) Einbringen einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit in ein Reaktionsgefäß,
- (II) Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung auf eine Fokusebene, die innerhalb eines mit der Flüssigkeit gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt,
- (III) Erzeugen einer polymerisierten oder vernetzten Struktur in einer Schicht der Fokusebene in dem Reaktionsgefäß durch die elektromagnetische Strahlung,
- (IV) Einbringen einer weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß, so dass eine zuvor erzeugte polymerisierte oder vernetzte Struktur zumindest teilweise mit der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit bedeckt ist,
- (V) Fokussieren einer weiteren elektromagnetischen Strahlung auf eine weitere Fokusebene, die innerhalb eines mit der weiteren Flüssigkeit gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt,
- (VI) Erzeugen einer weiteren polymerisierten oder vernetzten Struktur in einer weiteren Schicht in dem Reaktionsgefäß durch die weitere elektromagnetische Strahlung, wobei die weitere polymerisierte oder vernetzte Struktur unmittelbar auf der zuvor erzeugten polymerisierten oder vernetzten Struktur angeordnet und mit dieser verbunden ist,
- (VII) Wiederholen der Schritte (IV) bis (VI) mit jeweils einer weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit, bis das 3D-Gerüst erzeugt ist.

The 3D printing process is now described in more detail below:

The production of the 3D framework according to the invention is preferably divided into the following process steps:
- (I) introducing a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid into a reaction vessel,
- (II) focusing electromagnetic radiation on a focal plane which lies within an area of the reaction vessel filled with the liquid,
- (III) generating a polymerized or cross-linked structure in a layer of the focal plane in the reaction vessel by means of the electromagnetic radiation,
- (IV) introducing a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid into the reaction vessel, so that a previously generated polymerized or crosslinked structure is at least partially covered with the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid,
- (V) focusing a further electromagnetic radiation on a further focal plane which lies within a region of the reaction vessel filled with the further liquid,
- (VI) generating a further polymerized or crosslinked structure in a further layer in the reaction vessel by means of the further electromagnetic radiation, the further polymerized or crosslinked structure being arranged directly on the previously generated polymerized or crosslinked structure and connected to it,
- (VII) Repeat steps (IV) to (VI) each with a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid until the 3D framework is produced.

Die weitere Fokusebene in Schritt (V) unterscheidet sich vorzugsweise von der ersten Fokusebene zumindest in Bezug auf die bereits erzeugte polymerisierte oder vernetzte Struktur bzw. in Bezug auf die Schicht dieser polymerisierten oder vernetzten Struktur. The further focal plane in step (V) preferably differs from the first focal plane at least with regard to the already produced polymerized or crosslinked structure or with regard to the layer of this polymerized or crosslinked structure.

Bei der Verbindung der in Schritt (VI) erzeugten polymerisierten oder vernetzten Strukturen handelt es sich vorzugsweise um eine Verbindung durch kovalente Bindungen. Es sind jedoch auch nicht-kovalente Bindungen, beispielsweise auf der Grundlage physikalischer Wechselwirkungen möglich.The connection of the polymerized or crosslinked structures produced in step (VI) is preferably a connection by means of covalent bonds. However, non-covalent bonds, for example based on physical interactions, are also possible.

Eine oder mehrere der im Herstellungsverfahren verwendeten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten können biologische Zellen enthalten. Wenn es infolge der Einstrahlung der elektromagnetischen Strahlung zu einer Polymerisierung oder Vernetzung kommt, werden die in der Flüssigkeit enthaltenen Zellen mit in ein entsprechendes Polymer eingebettet. Es ist erfindungsgemäß jedoch bevorzugt, dass in dem lithographischen 3D-Druckverfahren keine biologischen Zellen eingesetzt werden, damit das 3D-Gerüst auf einfache Weise gelagert werden kann, bevor die nachträgliche Besiedlung durch den Anwender erfolgen kann.One or more of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids used in the manufacturing process can contain biological cells. If, as a result of exposure to electromagnetic radiation, a If polymerisation or cross-linking occurs, the cells contained in the liquid are also embedded in a corresponding polymer. According to the invention, however, it is preferred that no biological cells are used in the lithographic 3D printing process so that the 3D framework can be stored in a simple manner before the subsequent colonization by the user can take place.

Als Reaktionsgefäße können in dem Herstellungsverfahren für das erfindungsgemäße 3D-Gerüst Kavitäten (sogenannte wells) handelsüblicher Mikrotiterplatten (beispielsweise Mikrotiterplatten mit 6, 12, 24, 48, 96, 384 oder 1536 Kavitäten), Zellkulturflaschen oder Petrischalen verwendet werden.Wells of commercially available microtiter plates (for example microtiter plates with 6, 12, 24, 48, 96, 384 or 1536 wells), cell culture bottles or Petri dishes can be used as reaction vessels in the manufacturing process for the 3D framework according to the invention.

In einer weiteren Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße 3D-Gerüst eines, das zumindest im Bereich des sichtbaren Lichts transparent ist. Auf diese Weise kann die nachträgliche Besiedlung mit biologischen Zellen optisch verfolgt und festgehalten werden.In a further embodiment, the 3D framework according to the invention is one that is transparent at least in the range of visible light. In this way, the subsequent colonization with biological cells can be followed optically and recorded.

Die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit ist vorzugsweise eine, die eine photoreaktive Gruppe aufweist, die mit weiteren photoreaktiven Gruppen kovalente Bindungen eingehen kann.The photopolymerizable or photocrosslinkable substance in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is preferably one which has a photoreactive group which can enter into covalent bonds with further photoreactive groups.

In einer Variante ist die photoreaktive Gruppe eine Acrylgruppe, mittels derer die Polymerisierung oder Vernetzung bewerkstelligt wird. D.h. die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz ist vorzugsweise eine Acrylverbindung, bspw. eine aus der folgenden Gruppe: Methacrylate, Methylacrylate, Ethylacrylate, Hydroxyethylacrylate, Butylacrylate, Trimethylolpropanacrylate, Triacrylatacrylate und Polyacrylate (PA) im allgemeinen.In a variant, the photoreactive group is an acrylic group, by means of which the polymerization or crosslinking is brought about. That is, the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably an acrylic compound, for example one from the following group: methacrylates, methyl acrylates, ethyl acrylates, hydroxyethyl acrylates, butyl acrylates, trimethylolpropane acrylates, triacrylate acrylates and polyacrylates (PA) in general.

Bei der zu polymerisierenden oder zu vernetzenden Substanz kann es sich um ein Polymer, ein Oligomer oder ein Monomer handeln. Vorzugsweise handelt es sich hier um Substanzen auf Kohlenstoffbasis. Im Fall der Monomere wird photopolymerisiert. Im Falle der Polymere oder Oligomere wird vorzugsweise photovernetzt.The substance to be polymerized or crosslinked can be a polymer, an oligomer or a monomer. These are preferably carbon-based substances. In the case of the monomers, it is photopolymerized. In the case of polymers or oligomers, photocrosslinking is preferred.

Als zu polymerisierende Monomere können beispielsweise die Folgenden eingesetzt werden: Acrylamide, Vinylchlorid, Ethylen, Propylen, Isopren, Caprolactam, sämtliche Aminosäuren, (Des-)Oxyribonucleotide, Glucose, bzw. sämtliche Monosaccharide sowie die zuvor genannten Acrylate.The following can be used as monomers to be polymerized: acrylamides, vinyl chloride, ethylene, propylene, isoprene, caprolactam, all amino acids, (de) oxyribonucleotides, glucose, or all monosaccharides and the aforementioned acrylates.

Als Oligomere oder Polymere können die Folgenden eingesetzt werden: Polyethylenglykol (PEG), Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polyketon (PK), Polyvinylchlorid (PVC), Polystyrol (PS), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU). Ferner sind synthetische Polymere wie Silikone, Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Harze wie etwa Melamin- oder Melamin-Formaldehyd-Harze als Ausgangssubstanz geeignet. Ferner sind Biopolymere wie etwa Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate und Kohlenhydratderivate, Kollagene, Fibrine, Alginate, Gelatine, Hyaluronsäuren oder Polylactide als Ausgangssubstanzen geeignet. Statt der vorgenannten Polymere können auch jeweils die Monomervorstufen oder Oligomervorstufen dieser Polymere als Ausgangssubstanzen eingesetzt werden, sofern diese in stabiler Weise im festen oder flüssigen Aggregatzustand bereitgestellt werden können. Durch das Einbringen einer photoreaktiven Gruppe, bspw. einer Acrylgruppe, in die Ausgangssubstanz wird diese photopolymerisierbar bzw. photovernetzbar gemacht. Durch die strahlungsinduzierte Kopplung der Acrylreste zwischen verschiedenen Molekülen der Ausgangssubstanz wird eine polymerisierte oder vernetzte Matrix hergestellt.The following can be used as oligomers or polymers: polyethylene glycol (PEG), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyketone (PK), polyvinyl chloride (PVC), polystyrene (PS), polytetrafluoroethylene (PTFE), polymethyl methacrylate (PMMA), Polycarbonate (PC), polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU). Synthetic polymers such as silicones, polydimethylsiloxane (PDMS) or resins such as melamine or melamine-formaldehyde resins are also suitable as starting substances. Biopolymers such as proteins, DNA, RNA, carbohydrates and carbohydrate derivatives, collagens, fibrins, alginates, gelatine, hyaluronic acids or polylactides are also suitable as starting substances. Instead of the aforementioned polymers, it is also possible in each case to use the monomer precursors or oligomer precursors of these polymers as starting substances, provided that they can be provided in a stable manner in the solid or liquid state of aggregation. By introducing a photoreactive group, for example an acrylic group, into the starting substance, it is made photopolymerizable or photocrosslinkable. The radiation-induced coupling of the acrylic residues between different molecules of the starting substance creates a polymerized or cross-linked matrix.

Wenn photopolymerisierbares PDMS als Matrix bzw. als Hüllsubstanz eingesetzt wird, ist ein Gasaustausch zwischen den in dieser Matrix eingebetteten Zellen möglich. Wie bereits erwähnt, können unterschiedliche Hüllsubstanzen bzw. Matrices eingesetzt werden. So kann beispielsweise neben PDMS oder einer anderen Matrix, die eine gute Biokompatibilität aufweist, ein stabiler Kunststoff für die restliche Matrix eingesetzt werden, um so ein nach außen stabiles Objekt, in dessen Innerem eine das Zellwachstum ermöglichende Matrix mit geringerer Stabilität vorliegt, zu erzeugen.If photopolymerizable PDMS is used as a matrix or as a covering substance, gas exchange between the cells embedded in this matrix is possible. As already mentioned, different coating substances or matrices can be used. For example, in addition to PDMS or another matrix that has good biocompatibility, a stable plastic can be used for the rest of the matrix in order to create an object that is stable on the outside and inside a matrix that enables cell growth and is less stable.

Die um die photoreaktive Gruppe ergänzte Ausgangssubstanz wird in flüssiger Weise eingesetzt, wobei unterschiedliche Viskositäten möglich sind. Das heißt, das Herstellungsverfahren für das erfindungsgemäße 3D-Gerüst ist nicht auf photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten mit einer bestimmten Viskosität beschränkt, sondern es können auch niedrigviskose Flüssigkeiten eingesetzt werden. Es können sowohl Newton'sche als auch nicht-Newton'sche Flüssigkeiten eingesetzt werden. Die Flüssigkeiten können Lösungen oder kolloid-disperse Gemische, wie etwa Suspensionen, sein. Die Flüssigkeiten können dabei einen wässrigen bis öligen Charakter haben. Dies wird u.a. durch die Wahl der Ausgangssubstanzen und deren Partikelgröße bestimmt.The starting substance supplemented by the photoreactive group is used in a liquid manner, with different viscosities being possible. That is to say that the production method for the 3D framework according to the invention is not limited to photopolymerizable or photocrosslinkable liquids with a certain viscosity, but rather low-viscosity liquids can also be used. Both Newtonian and non-Newtonian liquids can be used. The liquids can be solutions or colloid-disperse mixtures such as suspensions. The liquids can have an aqueous to oily character. This is determined, among other things, by the choice of the starting substances and their particle size.

Damit eine Photopolymerisierung oder Photovernetzung der eine photoreaktive Gruppe tragenden Ausgangssubstanz erreicht werden kann, wird zudem vorzugsweise ein Radikalbildner (ein sogenannter Photoinitiator) eingesetzt, der bei einer ausgewählten Wellenlänge der im Rahmen des Verfahrens eingesetzten elektromagnetischen Strahlung Radikale bildet.So that a photopolymerization or photocrosslinking of the starting substance carrying a photoreactive group can be achieved, a radical generator (a so-called photoinitiator) is also preferably used, which forms radicals at a selected wavelength of the electromagnetic radiation used in the process.

Geeignete Radikalbildner sind beispielsweise Anthronderivate wie etwa Violanthron oder Isoviolanthron, Fluoreszein, Rubren, Anthrazinderivate, Tetrazenderivate, Benzanthron, Benzanthronil, Eosin, Levolinsäurederivate, Phospin-Derivate, Mono- und Bis-Acyl-Phosphine, Metallocene, Acetophenone, Benzophenone, Xanthone, Quinone, Keton-Derivate, Hydroxyketone, Aminoketone, Benzoyl-Peroxide, Pyridin-Salze, Phenylglyoxylate und/oder lodonium-Salze.Suitable radical formers are, for example, anthrone derivatives such as violanthrone or isoviolanthrone, fluorescein, rubrene, anthrazine derivatives, tetrazene derivatives, benzanthrone, benzanthronil, eosin, levolinic acid derivatives, phosphine derivatives, mono- and bis-acyl phosphines, metallocenes, acetophenones, xanthones, Ketone derivatives, hydroxy ketones, amino ketones, benzoyl peroxides, pyridine salts, phenyl glyoxylates and / or iodonium salts.

Vorzugsweise werden zusätzlich zu dem Radikalbildner auch noch ein Vinylmakromer und ein Amin-basierter Co-Initiator eingesetzt, um die Photopolymerisation oder Photovernetzung in besonders geeigneter Weise ablaufen zu lassen. Als Co-Initiator sind beispielsweise Ascorbinsäure und tertiäre Aminderivate, wie etwa Methyldiethanolamin oder Tetraethylamin geeignet.In addition to the radical generator, a vinyl macromer and an amine-based co-initiator are preferably used in order to allow the photopolymerization or photocrosslinking to proceed in a particularly suitable manner. As a co-initiator, for example, ascorbic acid and tertiary amine derivatives, such as methyldiethanolamine or tetraethylamine, are suitable.

In einer Variante weist die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit ein Thiolderivat auf. Geeignete Thiolderivate sind Dithiothreitol, monofunktionale Cysteine, bifunktionale Peptide und ähnliche Verbindungen.In one variant, the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid has a thiol derivative. Suitable thiol derivatives are dithiothreitol, monofunctional cysteines, bifunctional peptides and similar compounds.

Darüber hinaus kann der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit eine Substanz zugesetzt werden, die eine Photopolymerisation oder Photovernetzung tieferer, flüssiger Schichten verhindert. So bleibt flüssige Lösung außerhalb der Fokusebene flüssig, auch wenn sie sich im Einstrahlbereich der über ihr liegenden Fokusebene befindet. Dies funktioniert durch eine Absorption der Substanz bei der Wellenlänge, bei der die Polymerisation stattfindet (polymerisierende Wellenlänge). Das Abfangen findet in der Fokusebene statt, so dass kein Eindringen der polymerisierenden Wellenlänge in tiefere Schichten möglich ist. Geeignet sind alle Substanzen, die in der gewünschten Wellenlänge absorbieren, wie etwa Farbstoffe.In addition, a substance can be added to the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid which prevents photopolymerization or photocrosslinking of deeper, liquid layers. In this way, liquid solution outside the focal plane remains liquid, even if it is in the irradiation area of the focal plane lying above it. This works by absorbing the substance at the wavelength at which the polymerisation takes place (polymerising wavelength). The interception takes place in the focal plane, so that no penetration of the polymerizing wavelength into deeper layers is possible. All substances that absorb in the desired wavelength, such as dyes, are suitable.

Darüber hinaus ist es in einer Variante möglich, dass die eine photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und/oder eine der weiteren photopolymerisierbaren oder photvernetzbaren Flüssigkeiten und/oder eine andere Flüssigkeit, die nicht photopolymerisierbar sein muss, einen temperatursensitiven Gelbildner aufweisen. Insbesondere ist der Einsatz eines invers-temperatursensitiven (auch als reverstemperatursensitiv bezeichneten) Gelbildners vorgesehen. Ein solcher Gelbildner wird mit steigender Temperatur fester. Durch ein Erwärmen des Reaktionsgefäßes erstarrt die Reaktionsflüssigkeit und bildet ein zunächst nur metastabiles Gel. Sollte die Flüssigkeit nicht gleichzeitig photopolymerisiert oder photovernetzt werden, kann durch ein nachfolgendes Abkühlen des 3D-Gerüsts das metastabile Gel wieder verflüssigt und abgepumpt werden. Bei gewöhnlichen temperatursensitiven Gelbildnern liegen die anzuwendenden Temperaturverhältnisse genau umgekehrt. So kann bei Bedarf beispielsweise eine Stützstruktur erstellt werden, so dass hängende Strukturen erzeugbar sind. Wird das metastabile Gel hingegen zumindest teilweise mit elektromagnetischer Strahlung in geeigneter Wellenlänge bestrahlt, kommt es zu einer Photopolymerisierung, so dass das metastabile Gel in diesen Bereichen in ein stabiles Gel bzw. Polymer umgesetzt wird.In addition, it is possible in a variant that the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and / or one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquids and / or another liquid that does not have to be photopolymerizable have a temperature-sensitive gel former. In particular, the use of an inverse temperature-sensitive (also referred to as reverse temperature-sensitive) gel former is provided. Such a gelling agent becomes more solid with increasing temperature. When the reaction vessel is heated, the reaction liquid solidifies and initially only forms a metastable gel. If the liquid is not photopolymerized or photocrosslinked at the same time, the metastable gel can be liquefied again and pumped out by subsequent cooling of the 3D framework. In the case of conventional temperature-sensitive gel formers, the temperature conditions to be used are exactly the opposite. For example, if necessary, a support structure can be created so that hanging structures can be created. If, on the other hand, the metastable gel is at least partially irradiated with electromagnetic radiation at a suitable wavelength, photopolymerization occurs, so that the metastable gel is converted into a stable gel or polymer in these areas.

Mit anderen Worten ausgedrückt, kann durch den temperatursensitiven, insbesondere invers-temperatursensitiven, Gelbildner und eine Temperaturkontrolle des Reaktionsraumes noch einfacher mit hängenden Partien und Hinterschnitten oder Hohlräumen gearbeitet werden. Auch in dieser Variante kann weiterhin mit flüssigen Strukturen als Stütze gearbeitet werden.In other words, the temperature-sensitive, in particular inverse-temperature-sensitive, gel former and temperature control of the reaction space make it even easier to work with hanging parts and undercuts or cavities. In this variant, too, it is still possible to work with liquid structures as a support.

Es ist darüber hinaus möglich, einen Temperaturgradienten vorzusehen, so dass ein metastabiles Gel nicht in allen Bereichen der mit dem temperatursensitiven, insbesondere invers-temperatursensitiven, Gelbildner versetzten Flüssigkeit erfolgt. Mit Hilfe eines solchen Gradienten können noch komplexere Strukturen erzeugt werden.It is also possible to provide a temperature gradient so that a metastable gel does not occur in all areas of the liquid to which the temperature-sensitive, in particular inverse-temperature-sensitive, gelling agent is added. With the help of such a gradient, even more complex structures can be created.

Die vorgenannten einzelnen Komponenten können als individuelle Substanzen in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit enthalten sein. Alternativ ist es auch möglich, die zur Gelbildung vorzugsweise eingesetzten Substanzen bzw. Gruppen in einem einzigen Polymer durch entsprechende Synthese zu realisieren. Statt einer Mischung aus einzelnen Komponenten würde ein derartiges Polymer dann unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweisen, die alle für eine Photopolymerisation oder Photovernetzung benötigten bzw. vorzugsweise einzusetzenden Funktionen in sich vereinen. Ferner ist es auch denkbar, lediglich einige der für die Photopolymerisation oder Photovernetzung vorzugsweise eingesetzten Funktionen bzw. Gruppen in einem Polymer vorzusehen und andere für die Photopolymerisation oder Photovernetzung vorzugsweise einzusetzende Funktionen bzw. Gruppen in separaten Einzelkomponenten der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit zuzumischen.The aforementioned individual components can be contained as individual substances in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid. Alternatively, it is also possible to implement the substances or groups preferably used for gel formation in a single polymer by appropriate synthesis. Instead of a mixture of individual components, such a polymer would then have different functional groups which combine all of the functions required or preferably to be used for photopolymerization or photocrosslinking. Furthermore, it is also conceivable to provide only some of the functions or groups preferably used for photopolymerization or photocrosslinking in a polymer and to mix other functions or groups preferably used for photopolymerization or photocrosslinking in separate individual components of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.

Alternativ oder zusätzlich zu der Bildung von Hohlräumen über die Verwendung eines Gelbildners können auch Enzyme zur Verdauung des Polymers eingesetzt werden. Das Prinzip ist das Folgende: Ein 3D-Gerüst mit Hohlräumen/Hinterschnitten (z.B. einem Kanalsystem) wird als solider Körper gedruckt, indem alle Hohlräume beim Druck mit einem Opfermaterial ausgefüllt sind, welches später (d.h. nach Abschluss des Drucks) durch Gabe des richtigen Enzyms aufgelöst werden kann. Das Opfermaterial ist bspw. ein verdaubares Polymer, das durch Zugabe eines verdauenden Enzyms verdaut wird. Dies ist eine elegante Strategie zum Schaffen von Hohlräumen mit stereolithografischen Druckverfahren. Beispielsweise kann eine Hyaluronidase (verdauendes Enzym) Hyaluronsäure (Opfermaterial) verdauen, so dass an der Stelle im 3D-Gerüst, in der die Hyaluronidase eingesetzt wird, ein Hohlraum entsteht. Dieses Prinzip ist bereits in der Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen DE 10 2019 200 792.9 beschrieben. Alternativ kann zur Schaffung eines Hohlraums/Hinterschnittes auch ein Photoblocker in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit eingesetzt werden, wobei der Photoblocker die Aushärtetiefe der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit einschränkt.As an alternative or in addition to the formation of cavities via the use of a gelling agent, enzymes can also be used to digest the polymer. The principle is as follows: A 3D framework with cavities / undercuts (e.g. a canal system) is printed as a solid body in that all cavities are filled with a sacrificial material during printing, which is later (i.e. after completion of the printing) by giving the correct enzyme can be resolved. The sacrificial material is, for example, a digestible polymer that by adding a digestive enzyme is digested. This is an elegant strategy for creating voids with stereolithographic printing processes. For example, a hyaluronidase (digesting enzyme) can digest hyaluronic acid (sacrificial material) so that a cavity is created at the point in the 3D framework in which the hyaluronidase is used. This principle is already in the patent application with the official file number DE 10 2019 200 792.9 described. Alternatively, a photoblocker can also be used in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid to create a cavity / undercut, the photoblocker restricting the curing depth of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.

In einer Variante wird die weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit erst dann in das Reaktionsgefäß eingebracht, wenn die zuvor im Reaktionsgefäß befindliche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit (dies kann beispielsweise die eine photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit oder eine weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit sein) aus dem Reaktionsgefäß entfernt wurde.In one variant, the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is only introduced into the reaction vessel when the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid previously located in the reaction vessel (this can be, for example, the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid or another photopolymerizable or photocrosslinkable liquid) has been removed from the reaction vessel has been.

In einer Variante kann das 3D-Gerüst während oder am Ende seines Herstellungsprozesses mit elektromagnetischer Strahlung einer niedrigen Wellenlänge (beispielsweise im UV-Bereich, also unterhalb von 380 nm) bestrahlt werden, um auf diese Weise eine Sterilisation zu erreichen.In a variant, the 3D framework can be irradiated with electromagnetic radiation of a low wavelength (for example in the UV range, that is below 380 nm) during or at the end of its manufacturing process in order to achieve sterilization in this way.

In einer Variante ist eine Trägerplatte oder Trägerstruktur in dem Reaktionsgefäß angeordnet, an die die erste polymerisierte oder vernetzte Struktur gebunden wird. Der Einsatz einer derartigen Trägerplatte bietet sich dann an, wenn das erzeugte 3D-Gerüst später nicht im Reaktionsgefäß selbst untersucht werden soll, sondern aus dem Reaktionsgefäß entnommen werden soll. In der Trägerplatte können beispielsweise Schraubanschlüsse (wie etwa DIN-Schraubanschlüsse) vorhanden sein, um eine nachfolgende Versorgung des erzeugten 3D-Gerüsts mit Flüssigkeiten und Gasen zu ermöglichen. Es ist auch möglich, derartige Schraubanschlüsse in die Matrix des 3D-Gerüsts im Rahmen des Herstellungsverfahrens einzubringen, diese Schraubanschlüsse also dort in der Matrix zu generieren. Das Erzeugen derartiger Schraubanschlüsse in der Matrix kann unabhängig davon vorgenommen werden, ob eine Trägerplatte eingesetzt wird oder nicht.In one variant, a carrier plate or carrier structure is arranged in the reaction vessel, to which the first polymerized or crosslinked structure is bound. The use of such a carrier plate is advisable when the 3D framework created is not to be examined later in the reaction vessel itself, but is to be removed from the reaction vessel. For example, screw connections (such as DIN screw connections) can be present in the carrier plate in order to enable a subsequent supply of the generated 3D framework with liquids and gases. It is also possible to introduce such screw connections into the matrix of the 3D framework within the scope of the manufacturing process, that is to say to generate these screw connections there in the matrix. The creation of such screw connections in the matrix can be carried out regardless of whether a carrier plate is used or not.

In einer Variante wird eine Trägerplatte vor dem Schritt des Erzeugens einer ersten polymerisierten oder vernetzen Struktur durch das Einstrahlen einer elektromagnetischen Strahlung in eine Fokusebene, die innerhalb eines mit einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit (insbesondere mit der ersten oder einer der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit) gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt, erzeugt, indem eine polymerisierte oder vernetzte Trägerstruktur gebildet wird, die die Trägerplatte aufweist oder darstellt. Das heißt, in dieser Variante werden nicht nur die eigentlichen polymerisierten oder vernetzten Strukturen, sondern auch die Trägerstruktur durch eine Polymerisierungs- oder Vernetzungsreaktion erzeugt.In a variant, a carrier plate is, before the step of generating a first polymerized or crosslinked structure, by irradiating electromagnetic radiation into a focal plane which is within a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid (in particular with the first or one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid) Filled area of the reaction vessel is generated by a polymerized or crosslinked support structure is formed, which has the support plate or is. That is, in this variant, not only the actual polymerized or crosslinked structures, but also the support structure are produced by a polymerization or crosslinking reaction.

Die Trägerstruktur kann eine solche Form haben, dass zwischen der Trägerplatte und einem Boden des Reaktionsgefäßes ein Abstand gebildet ist. Dadurch weisen dann die Fokusebenen der eigentlichen Polymerisierungs- oder Vernetzungsreaktionen einen größeren Abstand zum Boden des Reaktionsgefäßes auf. Insbesondere weist die erste gebildete polymerisierte oder vernetzte Struktur dann einen größeren Abstand zum Boden des Reaktionsgefäßes auf. Dann lassen sich nicht mehr benötigte polymerisierbare oder vernetzbare Flüssigkeiten besonders leicht aus dem Reaktionsgefäß absaugen.The support structure can have such a shape that a spacing is formed between the support plate and a bottom of the reaction vessel. As a result, the focal planes of the actual polymerization or crosslinking reactions are at a greater distance from the bottom of the reaction vessel. In particular, the first polymerized or crosslinked structure formed then has a greater distance from the bottom of the reaction vessel. Polymerizable or crosslinkable liquids that are no longer required can then be suctioned out of the reaction vessel particularly easily.

In einer Variante wird zwischen einer Quelle für die elektromagnetische Strahlung (Strahlungsquelle), die zur Erzeugung der einen und/oder der weiteren elektromagnetischen Strahlung dient, und dem Reaktionsgefäß ein optisches System angeordnet, das zur Fokussierung der elektromagnetischen Strahlung auf die jeweilige Fokusebene in dem Reaktionsgefäß dient. Dabei ist es in einer Variante vorgesehen, dass eine Refokussierung dieses optischen Systems erfolgen kann, um die Fokusebene innerhalb des Reaktionsgefäßes zu ändern. Eine derartige Refokussierung kann beispielsweise durch eine Veränderung des Abstands des optischen Systems zur Strahlungsquelle erreicht werden. Dabei kann ein computergesteuerter Schrittmotor vorgesehen sein, um eine entsprechende Bewegung des optischen Systems zu vermitteln. Beim optischen System kann es sich beispielsweise um ein System optischer Linsen oder - in einem konstruktiv besonders einfach gelagerten Fall - um eine einzelne Fokussierlinse handeln.In a variant, an optical system is arranged between a source for the electromagnetic radiation (radiation source), which is used to generate one and / or the other electromagnetic radiation, and the reaction vessel, which is used to focus the electromagnetic radiation on the respective focal plane in the reaction vessel serves. In a variant, it is provided that this optical system can be refocused in order to change the focal plane within the reaction vessel. Such a refocusing can be achieved, for example, by changing the distance between the optical system and the radiation source. A computer-controlled stepper motor can be provided in order to convey a corresponding movement of the optical system. The optical system can be, for example, a system of optical lenses or - in a case that is particularly simple in terms of construction - a single focusing lens.

In einer Variante ist es auch möglich, eine Relativbewegung zwischen dem Reaktionsgefäß oder einer in dem Reaktionsgefäß angeordneten Trägerplatte auf der einen Seite und der Strahlungsquelle, die zur Erzeugung der einen und/oder der weiteren Lichtstrahlung dient, auf der anderen Seite durchzuführen. Denn durch eine derartige Relativbewegung, die beispielsweise durch eine Bewegung des Reaktionsgefäßes, durch eine Bewegung der in dem Reaktionsgefäß angeordneten Trägerplatte oder durch eine Bewegung der Strahlungsquelle bewerkstelligt werden kann, kann die Fokusebene innerhalb des Reaktionsgefäßes ebenfalls geändert werden. Bei dieser Variante ist folglich keine Refokussierung eines optional einzusetzenden optischen Systems erforderlich. Dadurch kann die Gefahr optischer Dejustagen reduziert werden.In a variant, it is also possible to carry out a relative movement between the reaction vessel or a carrier plate arranged in the reaction vessel on the one hand and the radiation source, which is used to generate one and / or the other light radiation, on the other. This is because such a relative movement, which can be brought about, for example, by moving the reaction vessel, by moving the carrier plate arranged in the reaction vessel, or by moving the radiation source, can also change the focal plane within the reaction vessel. In this variant, there is consequently no refocusing of an optical system that can be used optionally required. This can reduce the risk of optical misalignments.

In einer weiteren Verfahrensvariante zur Herstellung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts werden die eine und/oder die weitere elektromagnetische Strahlung auf einen definierten und vorbestimmbaren Bereich in der jeweiligen Fokusebene innerhalb der einen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit und/oder der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit gelenkt. Das heißt, es kann ein spezifisches Strahlungsmuster vorgegeben werden, das auf die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit trifft und an diesen Stellen zu einer Polymerisierung oder Vernetzung der Flüssigkeit zur Bildung eines Polymers bzw. eines Gels (der Matrix) dient. Ein derartiges Strahlungsmuster kann beispielsweise durch den Einsatz von Masken oder Blenden, aber auch durch den Einsatz einer gepulsten Strahlung oder die digitale Modulierung eines Strahlungssignals erzeugt werden. An den Bereichen der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit, die von der Strahlung getroffen werden, kommt es zu einer Polymerisierung oder Vernetzung. An den anderen, nicht von der Strahlung getroffenen Bereichen verbleibt die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit indes in ihrem nicht polymerisierten oder nicht vernetzten Zustand. Dadurch definiert die Strahlung die Bereiche, an denen ein Drucken der polymerisierten oder vernetzten Struktur erfolgt. Mit einem derartigen strahlungsunterstützten Drucken sind weitaus höhere Auflösungen möglich, als dies bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren der Fall ist. Die Auflösung hängt dabei von der Wellenlänge der eingesetzten Strahlung ab. Sie ist selbst bei regelmäßig eingesetzten großen Wellenlängen besser als die Auflösung, die mit den herkömmlichen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, realisierbar ist. Je genauer die Strahlungsquelle fokussiert werden kann, desto größer ist die resultierende Auflösung. Beispielsweise können mit einem Laser sehr hohe Auflösungen erreicht werden.In a further variant of the method for producing the 3D framework according to the invention, one and / or the other electromagnetic radiation is directed to a defined and predeterminable area in the respective focal plane within the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and / or the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid. This means that a specific radiation pattern can be specified which strikes the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and serves at these points to polymerize or crosslink the liquid to form a polymer or a gel (the matrix). Such a radiation pattern can be generated, for example, through the use of masks or diaphragms, but also through the use of pulsed radiation or the digital modulation of a radiation signal. Polymerization or crosslinking occurs in the areas of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid that are hit by the radiation. In the other areas not affected by the radiation, however, the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid remains in its unpolymerized or uncrosslinked state. As a result, the radiation defines the areas where printing of the polymerized or crosslinked structure takes place. With such a radiation-assisted printing, far higher resolutions are possible than is the case with the methods known from the prior art. The resolution depends on the wavelength of the radiation used. Even with large wavelengths that are regularly used, it is better than the resolution that can be achieved with the conventional methods known from the prior art. The more precisely the radiation source can be focused, the greater the resulting resolution. For example, very high resolutions can be achieved with a laser.

Das jeweils gewählte Bestrahlungsmuster kann beispielsweise von einem Computerprogramm bereitgestellt werden. So ist es denkbar, dass ein Anwender das herzustellende 3D-Gerüst mittels eines CAD-Programms erstellt. Das derart erstellte digitale Objekt wird dann von einem geeigneten Computerprogramm in einzelne Bestrahlungsebenen zerschnitten. Ferner wird jeder Ebene bzw. unterschiedlichen Orten einer jeden Ebene eine bestimmte photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit zugeordnet. Zu diesen Informationen werden Steuerinformationen für einen Drucker erstellt, mittels dessen das beschriebene Verfahren durchgeführt wird. Diese Steuerinformationen geben vor, wann welche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht werden muss. Ferner geben diese Steuerinformationen vor, wann welches Bild einer Bestrahlungsebene auf die jeweilige Fokusebene im Reaktionsgefäß projiziert werden soll. Auf diese Weise lässt sich dann das zuvor am Computer erstellte 3D-Gerüst in ein reales 3D-Gerüst überführen.The selected irradiation pattern can be provided, for example, by a computer program. It is thus conceivable that a user creates the 3D framework to be produced by means of a CAD program. The digital object created in this way is then cut into individual irradiation planes by a suitable computer program. Furthermore, a specific photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is assigned to each level or to different locations of each level. Control information for a printer, by means of which the described method is carried out, is created for this information. This control information specifies when which photopolymerizable or photocrosslinkable liquid has to be introduced into the reaction vessel. This control information also specifies when which image of an irradiation plane is to be projected onto the respective focal plane in the reaction vessel. In this way, the 3D framework previously created on the computer can then be converted into a real 3D framework.

In einer Variante wird mehr als eine polymerisierte oder vernetzte Struktur in derselben Schicht (das heißt, in derselben Fokusebene) erzeugt. Dazu erfolgt zunächst eine Polymerisierung oder Vernetzung einer ersten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit. Anschließend wird die erste photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß entfernt und eine zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht. Nun werden nur solche Bereiche innerhalb der Fokusebene im Reaktionsgefäß bestrahlt, die zuvor nicht bestrahlt wurden und an denen folglich noch keine polymerisierte oder vernetzte Struktur vorliegt. Dadurch können unterschiedliche Matrices in ein und derselben Schicht erzeugt werden. Es werden folglich mehrere polymerisierte oder vernetzte Strukturen in ein und derselben Schicht gebildet, so dass eine heterogene Schicht resultiert. Anschließend kann die zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß entfernt und eine weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht werden. Der Füllstand dieser weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit kann nun auf ein solches Niveau gebracht werden, dass die zuvor gebildete Schicht vollständig überdeckt ist. In a variant, more than one polymerized or crosslinked structure is produced in the same layer (that is to say in the same focal plane). For this purpose, a first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is first polymerized or crosslinked. The first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is then removed from the reaction vessel and a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is introduced into the reaction vessel. Now only those areas within the focal plane in the reaction vessel are irradiated that were not previously irradiated and that consequently have no polymerized or crosslinked structure. This means that different matrices can be produced in one and the same layer. Consequently, several polymerized or crosslinked structures are formed in one and the same layer, so that a heterogeneous layer results. The second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can then be removed from the reaction vessel and a further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can be introduced into the reaction vessel. The fill level of this further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can now be brought to such a level that the previously formed layer is completely covered.

Dann kann die Fokusebene verschoben werden und eine weitere Schicht des zu erzeugenden 3D-Gerüsts durch eine entsprechende polymerisierte oder vernetzte Struktur aufgebaut werden. Dabei ist es grundsätzlich möglich, dass einzelne Schichten des erzeugten 3D-Gerüsts homogen (umfassend eine polymerisierte oder vernetzte Struktur eines einzigen Typs) und andere Schichten heterogen (umfassend polymerisierte oder vernetzte Strukturen unterschiedlichen Typs) vorliegen, wobei die Anzahl der einzelnen Strukturen pro Schicht nicht begrenzt ist. In der Praxis haben sich neben einer einzigen polymerisierten oder vernetzten Struktur pro Schicht heterogen zusammengesetzte Schichten mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 polymerisierten oder vernetzten Strukturen als sinnvoll herausgestellt.The focal plane can then be shifted and a further layer of the 3D framework to be generated can be built up using a corresponding polymerized or cross-linked structure. In principle, it is possible that individual layers of the generated 3D framework are homogeneous (comprising a polymerized or crosslinked structure of a single type) and other layers are heterogeneous (comprising polymerized or crosslinked structures of different types), whereby the number of individual structures per layer is not is limited. In practice, in addition to a single polymerized or crosslinked structure per layer, heterogeneously composed layers with 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 polymerized or crosslinked structures have proven to be useful.

In einer Variante wird zumindest die erste Struktur der ersten Schicht, insbesondere aber jede Struktur der ersten Schicht, aus zwei unterschiedlichen Richtungen mit der ersten Strahlung bestrahlt. Dabei sind diese beiden unterschiedlichen Richtungen vorzugsweise einander entgegengesetzt. Mit einer derartigen Bestrahlung aus zwei unterschiedlichen Richtungen wird eine besonders feste Verankerung der ersten Schicht auf der inneren Oberfläche des Reaktionsgefäßes bzw. auf einer Trägerplatte, die in dem Reaktionsgefäß angeordnet ist, erreicht. Dadurch wird ein späterer sicherer Halt des gesamten erzeugten 3D-Gerüsts an dem Reaktionsgefäß bzw. an einer Trägerplatte in dem Reaktionsgefäß erreicht, wodurch nachfolgende Untersuchungen an dem 3D-Gerüst erleichtert werden können. Typischerweise erfolgt die Bestrahlung bei einem nach oben offenen Reaktionsgefäß von oben. Die erste Schicht wird in dieser Variante dann vorzugsweise zusätzlich von unten durch den Boden des Reaktionsgefäßes hindurch bestrahlt. Dazu muss das Reaktionsgefäß aus einem Material gefertigt sein, das für die Strahlung mit der gewählten Wellenlänge durchlässig ist. Die nachfolgenden Schichten, die oberhalb der ersten Schicht angeordnet sind, werden dann vorzugsweise wiederum nur aus einer Richtung (nämlich vorzugsweise von oben) belichtet, damit die bereits gebildeten polymerisierten oder vernetzten Strukturen nicht zwischen der Fokusebene der Strahlung und einer zur Aussendung der Strahlung eingesetzten Strahlungsquelle liegen und somit nicht von der Strahlung vor deren Fokusebene erneut durchstrahlt werden.In one variant, at least the first structure of the first layer, but in particular each structure of the first layer, is irradiated with the first radiation from two different directions. These two different directions are preferably opposite to one another. With such an irradiation from two different directions, one becomes particularly firm Anchoring the first layer on the inner surface of the reaction vessel or on a carrier plate which is arranged in the reaction vessel is achieved. As a result, a later secure hold of the entire 3D framework created is achieved on the reaction vessel or on a carrier plate in the reaction vessel, whereby subsequent examinations on the 3D framework can be facilitated. The irradiation is typically carried out from above in a reaction vessel that is open at the top. In this variant, the first layer is then preferably additionally irradiated from below through the bottom of the reaction vessel. For this purpose, the reaction vessel must be made of a material that is permeable to radiation with the selected wavelength. The subsequent layers, which are arranged above the first layer, are then preferably only exposed from one direction (namely preferably from above) so that the polymerized or crosslinked structures already formed are not between the focal plane of the radiation and a radiation source used to emit the radiation and are therefore not penetrated again by the radiation in front of its focal plane.

In einer Variante weisen die erste elektromagnetische Strahlung und/oder die weitere elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge im Bereich von 200 nm bis 1000 nm (also eine Wellenlänge, die zwischen dem UV-Bereich und dem Infrarot-Bereich liegt), stärker bevorzugt im Bereich von 350 nm und 800 nm auf. Mit derartigen Wellenlängen lassen sich die bevorzugt als Radikalbildner eingesetzten Substanzen besonders gut anregen, so dass Radikale gebildet werden, um eine Polymerisierung oder Vernetzung von Acrylreste tragenden Ausgangssubstanzen zu ermöglichen.In one variant, the first electromagnetic radiation and / or the further electromagnetic radiation have a wavelength in the range from 200 nm to 1000 nm (i.e. a wavelength that lies between the UV range and the infrared range), more preferably in the range of 350 nm and 800 nm. With such wavelengths, the substances preferably used as radical formers can be excited particularly well, so that radicals are formed in order to enable polymerization or crosslinking of starting substances bearing acrylic residues.

Weitere geeignete Wellenlängen der eingesetzten elektromagnetischen Strahlung liegen im Bereich von 250 nm bis 950 nm, insbesondere von 250 nm bis 850 nm, insbesondere von 300 nm bis 800 nm, insbesondere von 300 nm bis 750 nm, insbesondere von 300 nm bis 700 nm, insbesondere von 350 nm bis 650 nm und ganz besonders von 350 nm bis 400 nm.Further suitable wavelengths of the electromagnetic radiation used are in the range from 250 nm to 950 nm, in particular from 250 nm to 850 nm, in particular from 300 nm to 800 nm, in particular from 300 nm to 750 nm, in particular from 300 nm to 700 nm, in particular from 350 nm to 650 nm and especially from 350 nm to 400 nm.

Die zur Polymerisation oder Vernetzung eingesetzten Strahlungen können dieselbe Wellenlänge oder aber verschiedene Wellenlängen aus dem vorgenannten Wellenlängenbereich umfassen, um eine geeignete Polymerisation der unterschiedlichen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten zu ermöglichen. Dabei können die einzelnen Strahlungen durch unterschiedliche oder aber durch ein und dieselbe Strahlungsquelle erzeugt werden. Es ist auch möglich, innerhalb einer Schicht (und damit innerhalb einer Fokusebene) nacheinander verschiedene Wellenlängen einzusetzen, um unterschiedliche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten in derselben Schicht zu polymerisieren oder zu vernetzen, wenn eine heterogene Schicht aus unterschiedlichen polymerisierten oder vernetzten Strukturen gebildet werden soll.The radiation used for the polymerization or crosslinking can comprise the same wavelength or different wavelengths from the aforementioned wavelength range in order to enable suitable polymerization of the different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids. The individual radiations can be generated by different or by one and the same radiation source. It is also possible to use different wavelengths one after the other within a layer (and thus within a focal plane) in order to polymerize or crosslink different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids in the same layer, if a heterogeneous layer is to be formed from different polymerized or crosslinked structures.

In einer Variante wird das Verfahren derart durchgeführt, dass während der Erzeugung des 3D-Gerüsts mindestens ein funktionelles Element in das 3D-Gerüst eingebracht wird. Das funktionelle Element ist dabei ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Membranen, Kanälen, Poren, Sensoren, Säulen, Gittern, Netzen, Querstreben, oder elektrisch leitenden Trägern und chemotaktischen Präparaten. Kanäle und Poren können beispielsweise in das Objekt integriert werden, indem bestimmte Bereiche der gebildeten polymerisierten oder vernetzten Struktur in mehreren Schichten übereinander freigelassen werden. Membranen können durch das Einbringen von Lipidmolekülen in die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit gebildet werden.In one variant, the method is carried out in such a way that at least one functional element is introduced into the 3D framework while the 3D framework is being generated. The functional element is selected from the group consisting of membranes, channels, pores, sensors, columns, grids, nets, cross struts, or electrically conductive supports and chemotactic preparations. Channels and pores can be integrated into the object, for example, by leaving certain areas of the formed polymerized or cross-linked structure exposed in several layers one on top of the other. Membranes can be formed by introducing lipid molecules into the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.

Darüber hinaus können mit Hilfe der Photopolymerisation oder Photovernetzung ebenfalls Salzbrücken innerhalb des 3D-Gerüsts eingebracht werden. Dies ist besonders einfach möglich, wenn die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit Salze enthält, also salzhaltig ist. Auf diesem Wege kann nachfolgend eine elektrische Ableitung und Enervierung des gedruckten 3D-Gerüsts erfolgen.In addition, salt bridges can also be introduced within the 3D framework with the aid of photopolymerization or photocrosslinking. This is particularly easy if the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid contains salts, that is to say contains salts. In this way, electrical derivation and enervation of the printed 3D framework can subsequently take place.

Über bereits während des Herstellungsprozesses in das 3D-Gerüst eingebrachte Sensoren braucht das hergestellte 3D-Gerüst nachträglich nicht mehr manipuliert zu werden, sondern kann unmittelbar über die bereits eingebrachten Sensoren ausgelesen werden. Dies erleichtert nachfolgende Analysen des mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts erheblich. Beispielsweise durch das Einbringen elektrisch leitender Träger, wie etwa Elektroden, wird es besonders einfach, bei einer nachfolgenden Untersuchung des gebildeten 3D-Gerüsts das elektrische Potential bzw. die elektrischen Eigenschaften des besiedelten 3D-Gerüsts zu analysieren.Using sensors already introduced into the 3D framework during the manufacturing process, the manufactured 3D framework no longer needs to be manipulated afterwards, but can be read out directly via the sensors that have already been introduced. This makes subsequent analyzes of the 3D framework populated with biological cells much easier. For example, by introducing electrically conductive supports such as electrodes, it becomes particularly easy to analyze the electrical potential or the electrical properties of the populated 3D framework in a subsequent examination of the 3D framework that has been formed.

Durch das Einbringen chemotaktischer Präparate, die in einer Variante in unterschiedlichen Schichten in unterschiedlichen Konzentrationen eingebracht werden können, um so einen Gradienten zu erzeugen, lässt sich das gezielte Wachstum/Besiedeln von biologischen Zellen innerhalb des 3D-Gerüsts nach dessen Fertigstellung ermöglichen. Wenn es sich bei dem chemotaktischen Präparat um einen Lockstoff handelt, übt er eine positive Chemotaxis aus, so dass sich die biologischen Zellen im 3D-Gerüst zu Bereichen höherer Konzentration des Lockstoffes hin orientieren werden. Handelt es sich bei dem chemotaktischen Präparat indes um einen Schreckstoff, übt er eine negative Chemotaxis aus, so dass sich die biologischen Zellen im 3D-Gerüst zu Bereichen niedrigerer Konzentration des Schreckstoffes bzw. zu Bereichen, in denen der Schreckstoff gar nicht vorhanden ist, orientieren werden. Dadurch lässt sich ein zielgerichtetes Wachstum/Besiedeln von Zellen innerhalb des 3D-Gerüsts erreichen.By introducing chemotactic preparations, which in a variant can be introduced in different layers in different concentrations in order to create a gradient, the targeted growth / colonization of biological cells within the 3D framework can be enabled after its completion. If the chemotactic preparation is an attractant, it exerts a positive chemotaxis, so that the biological cells in the 3D framework will orient themselves towards areas of higher concentration of the attractant. However, if the chemotactic preparation is a deterrent, it exerts a negative chemotaxis so that the biological cells in the 3D framework orient themselves to areas with a lower concentration of the deterrent or to areas in which the deterrent is not even present become. This enables targeted growth / colonization of cells within the 3D framework.

Vorzugsweise wird zumindest ein Füllstandssensor eingesetzt, um die Flüssigkeitshöhe im Reaktionsgefäß stets genau zu erkennen. Aufgrund dieser Füllstandsinformationen kann dann die Fokusebene bestimmt werden, in der der nächste Polymerisations- oder Vernetzungsschritt durchgeführt werden soll. Die von einem derartigen Füllstandssensor bereitgestellten Daten können auch dazu dienen, die Fokusebene automatisiert anzupassen. Über die von einem Füllstandssensor bereitgestellten Daten kann auch eine Pumpe gesteuert werden, die den Zufluss der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten in das Reaktionsgefäß vermittelt. Auf diese Weise kann stets genau eine solche Menge der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten in das Reaktionsgefäß eingebracht werden, die zum Aufbau der gerade gewünschten Schicht erforderlich ist. Dadurch werden Abfallmengen gering gehalten. Ferner wird dadurch eine kostengünstige Realisierung des gesamten Verfahrens ermöglicht.At least one fill level sensor is preferably used in order to always accurately identify the liquid level in the reaction vessel. On the basis of this level information, the focal plane can then be determined in which the next polymerization or crosslinking step is to be carried out. The data provided by such a fill level sensor can also be used to automatically adapt the focal plane. The data provided by a fill level sensor can also be used to control a pump that mediates the flow of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids into the reaction vessel. In this way, exactly such an amount of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can always be introduced into the reaction vessel as is required to build up the layer that is currently desired. This keeps the amount of waste low. Furthermore, an inexpensive implementation of the entire method is made possible as a result.

Der Schritt des 3D-Druckenss des 3D-Gerüsts kann vollständig automatisiert durchgeführt werden, so dass ein Eingriff eines Benutzers nicht erforderlich ist. Dies erleichtert die Verfahrensanwendung zusätzlich.The step of 3D printing the 3D framework can be carried out in a completely automated manner, so that intervention by a user is not required. This additionally facilitates the application of the method.

Die Zeitdauer, während der die elektromagnetische Strahlung auf die jeweilige Fokusebene eingestrahlt wird, kann an die jeweiligen Anforderungen der eingesetzten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten angepasst werden. Das heißt, jedem Material wird zur Aushärtung eine solche Zeit zugestanden, die für die gewünschte Polymerisierung oder Vernetzung erforderlich und sinnvoll ist.The period of time during which the electromagnetic radiation is radiated onto the respective focal plane can be adapted to the respective requirements of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids used. This means that each material is allowed to cure in such a time that is necessary and sensible for the desired polymerization or crosslinking.

Wenn ein Träger innerhalb des Reaktionsgefäßes angeordnet ist, kann sich beim Anheben dieses Trägers relativ zum Reaktionsgefäß ein Unterdruck zwischen einem umgebenden Flüssigkeitsbett und den bereits polymerisierten oder vernetzen Strukturen auf dem Träger ergeben. Durch das Absaugen der Reste der für den vorherigen Polymerisations- oder Vernetzungsschritt noch im Reaktionsgefäß befindlichen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit und das Einbringen einer neuen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit kann ein potentiell herrschender Unterdruck jedoch entspannt werden. Dadurch kann der Träger relativ zum Reaktionsgefäß bewegt werden, ohne dass ein Abreißen der bereits polymerisierten oder vernetzten Strukturen des 3D-Gerüsts von dem Träger befürchtet werden muss.If a carrier is arranged within the reaction vessel, when this carrier is raised relative to the reaction vessel, a negative pressure can result between a surrounding liquid bed and the already polymerized or crosslinked structures on the carrier. However, by sucking off the residues of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid still in the reaction vessel for the previous polymerization or crosslinking step and introducing a new photopolymerizable or photocrosslinkable liquid, a potentially prevailing negative pressure can be released. As a result, the carrier can be moved relative to the reaction vessel without fear of tearing off the already polymerized or crosslinked structures of the 3D framework from the carrier.

Wenn das 3D-Gerüst auf einer Trägerplatte erzeugt wird, kann diese Trägerplatte nach Ende des Herstellungsprozesses komplett aus der noch verbliebenen Flüssigkeit im Reaktionsgefäß herausgehoben werden. Anschließend kann das erzeugte 3D-Gerüst vom Anwender von der Trägerplatte entfernt werden.If the 3D framework is generated on a carrier plate, this carrier plate can be lifted completely out of the remaining liquid in the reaction vessel at the end of the manufacturing process. The 3D framework created can then be removed from the carrier plate by the user.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts kann beispielsweise eine 3D-Druckvorrichtung verwendet werden, wie sie in EP 3 018 531 A1 beschrieben ist.For example, a 3D printing device can be used to produce the 3D framework according to the invention, as shown in FIG EP 3 018 531 A1 is described.

Durch Zusatz einer temperatursensitiven, insbesondere einer invers-temperatursensitiven, Substanz kann die Erzeugung von hängenden Objekten und Hohlräumen in dem 3D-Gerüst zusätzlich verbessert werden. Hierbei kann beispielsweise eine Substanz wie etwa ein Poloxamer in einer solchen Konzentration zugemischt werden, dass die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit oder eine nicht photopolymerisierbare oder nicht photovernetzbare Flüssigkeit auch ohne Bestrahlung in einem gewünschten Temperaturbereich geliert.By adding a temperature-sensitive, in particular an inverse-temperature-sensitive, substance, the creation of hanging objects and cavities in the 3D framework can be additionally improved. For example, a substance such as a poloxamer can be added in such a concentration that the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid or a non-photopolymerizable or non-photocrosslinkable liquid gels even without irradiation in a desired temperature range.

Beispielhaft kann das Verfahren so ablaufen: Wenn eine Gelierung bei einer Temperatur von ca. 20 °C (beispielhaft als „Geliertemperatur“ zu bezeichnen) erreicht werden soll, mischt man der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit ein Poloxamer in einer solchen Konzentration bei, dass die Flüssigkeit in diesem Bereich geliert. Es sind auch Mischungen aus mehreren Poloxameren möglich. Wenn möglich, kann die Flüssigkeit zunächst auf eine Temperatur unter dem Gelierpunkt gekühlt werden. Ist eine hängende Struktur innerhalb des Objekts gewünscht, kann die Flüssigkeit, die den temperatursensitiven Gelbildner enthält, auf eine Temperatur erwärmt werden, die über der Geliertemperatur liegt. Die Flüssigkeit geliert dann. Parallel dazu kann die Flüssigkeit ebenfalls photopolymerisiert oder photovernetzt werden. Sollte ein Bereich der temperatursensitiven Flüssigkeit nicht photopolymerisiert oder photovernetzt werden, ist diese bei der erhöhten Temperatur zwar fest, bei einer Absenkung der Temperatur unterhalb der Geliertemperatur jedoch jederzeit wieder verflüssigbar. So kann der temperatursensitive, gelierte Teil als Stützstruktur bis zum Ende des Druckprozesses fungieren. Nach Abschluss des Druckens kann die Temperatur wieder unter die oben genannte beispielhafte Geliertemperatur von 20 °C gesenkt werden. Als Folge verflüssigt sich der nicht polymerisierte oder nicht vernetzte, temperatursensitive Teil der Flüssigkeit wieder und kann abgepumpt werden. Wird das Gel verflüssigt, wird die Stützstruktur entfernt und der ehemals gestützte Teil des gedruckten Objektes, das nun photopolymerisiert oder photovernetzt ist, hängt frei.For example, the process can proceed as follows: If gelation is to be achieved at a temperature of approx. 20 ° C (to be referred to as "gelation temperature"), a poloxamer is added to the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid in such a concentration that the liquid gelled in this area. Mixtures of several poloxamers are also possible. If possible, the liquid can first be cooled to a temperature below the gelation point. If a hanging structure within the object is desired, the liquid containing the temperature-sensitive gelling agent can be heated to a temperature which is above the gelling temperature. The liquid then gels. At the same time, the liquid can also be photopolymerized or photocrosslinked. If an area of the temperature-sensitive liquid is not photopolymerized or photocrosslinked, it is solid at the increased temperature, but can be liquefied again at any time when the temperature drops below the gelation temperature. In this way, the temperature-sensitive, gelled part can function as a support structure until the end of the printing process. After printing has been completed, the temperature can be reduced again to below the above-mentioned exemplary gelation temperature of 20 ° C. As a result, the non-polymerized or non-crosslinked, temperature-sensitive part of the liquid liquefies again and can be pumped out. If the gel liquefies, the support structure is removed and the former supported part of the printed object, which is now photopolymerized or photocrosslinked, hangs freely.

In einer Ausgestaltung betrifft die vorliegende Erfindung auch ein erfindungsgemäßes 3D-Gerüst, dessen Hohlraum zumindest teilweise mit biologischen Zellen besiedelt ist. In anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung also auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts zum Besiedeln des Hohlraums mit biologischen Zellen. Anders ausgedrückt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Besiedeln des Hohlraums eines erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts, wobei eine Zellsuspension in den Hohlraum eingebracht wird.In one embodiment, the present invention also relates to a 3D framework according to the invention, the cavity of which is at least partially populated with biological cells. In other words, the present invention also relates to the use of a 3D framework according to the invention for colonizing the cavity with biological cells. In other words, the present invention also relates to a method for colonizing the cavity of a 3D framework according to the invention, wherein a cell suspension is introduced into the cavity.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts zum Kultivieren von biologischen Zellen zu einem Gewebe oder Organ in dessen Hohlraum, d.h. zur Herstellung eines 3D-Zellkulturkonstrukts. Anders ausgedrückt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkulturkonstrukts, bzw. Gewebes oder Organs, durch Kultivieren von biologischen Zellen im Hohlraum des 3D-Gerüsts. Die Kultivierungsbedingungen sind abhängig von dem Typ der verwendeten Zellen. Einem Fachmann auf dem Gebiet der Biologie sind die idealen Kultivierungsbedingungen für verschiedene biologische Zellen in der Regel bekannt. Die anhand des Zelltyps zu bestimmenden Kulturbedingungen sind Temperatur, Zusammensetzung der jeweiligen Nährlösung und Beschaffung des Kulturgefäßes. Beispielhaft können hier die Bedingungen für humane Blutgefäßzellen aus der Nabelschnur genannt werden: 37°C und 5% CO₂, Minimalmedium mit Glucose, alle essenziellen Aminosäuren, Vitamine und Mineralien. Die Kultur befindet sich hierbei vorzugsweise auf Petrischalen oder Zellkulturflaschen, die für Gewebekulturen (sog. tissue culture-treated surfaces) beschichtet wurden. Diese genannten Kulturbedingungen sind für zahlreiche humane Zellen günstig. Bei Gefäßzellen ist zusätzlich der Einsatz von Wachstumsfaktoren notwendig, die dem Minimalmedium hinzugegeben werden.The present invention also relates to the use of a 3D framework according to the invention for cultivating biological cells to form a tissue or organ in its cavity, ie for producing a 3D cell culture construct. In other words, the present invention also relates to a method for producing a cell culture construct, or tissue or organ, by culturing biological cells in the cavity of the 3D framework. The cultivation conditions depend on the type of cells used. A person skilled in the field of biology is usually familiar with the ideal cultivation conditions for various biological cells. The culture conditions to be determined on the basis of the cell type are temperature, composition of the respective nutrient solution and procurement of the culture vessel. The conditions for human blood vessel cells from the umbilical cord can be named here as an example: 37 ° C and 5% CO ₂ , minimal medium with glucose, all essential amino acids, vitamins and minerals. The culture is preferably located on Petri dishes or cell culture bottles that have been coated for tissue cultures (so-called tissue culture-treated surfaces). These culture conditions mentioned are favorable for numerous human cells. In the case of vascular cells, it is also necessary to use growth factors that are added to the minimal medium.

Anschließend kann das 3D-Zellkulturkonstrukt mit weiteren Zellen, Viren, Bakterien, Enzymen oder Wirkstoffen penetriert werden, um Tests an dem Konstrukt vorzunehmen. Hierzu können einerseits die Einfüllöffnung oder die seitlichen Kanäle benutzt werden, manche Substanzen oder Zellen können das Material des 3D-Gerüsts jedoch auch so durchdringen. Auf diesem Weg können beispielsweise Tumorzellen mit Car-T-Zellen angegriffen werden.The 3D cell culture construct can then be penetrated with further cells, viruses, bacteria, enzymes or active substances in order to carry out tests on the construct. On the one hand, the filling opening or the lateral channels can be used for this purpose, but some substances or cells can also penetrate the material of the 3D framework in this way. In this way, for example, tumor cells can be attacked with Car-T cells.

In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts liegt dieses in trockener Form vor, d.h. das 3D-Gerüst wird nach dem Vorgang des lithographischen 3D-Druckens getrocknet. Dabei bekommt das 3D-Gerüst eine haltbarere und besser zu transportierende Form. Nach Abschluss der Trocknung/Vitrifikation ist das 3D-Gerüst licht- und feuchtigkeitsgeschützt im Kühlschrank für mindestens sechs Wochen lagerfähig. Hierbei schrumpft das 3D-Gerüst leicht und wird härter. Eine nasse Lagerung lässt das 3D-Gerüst Gefahr laufen, schneller zu verderben. Die Trocknung/Vitrifikation wird vorzugsweise in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Geeignete Trocknungstemperaturen liegen im Bereich von 4°C bis 50°C, stärker bevorzugt im Bereich von 15°C bis 25°C. Die Trocknung kann beispielsweise in einem Trockenschrank, in einer Klimakammer oder in Ähnlichem durchgeführt werden.In one embodiment of the 3D framework according to the invention, this is in dry form, i.e. the 3D framework is dried after the process of lithographic 3D printing. The 3D framework is given a more durable and easily transportable shape. After drying / vitrification is complete, the 3D framework can be stored in the refrigerator for at least six weeks, protected from light and moisture. The 3D framework shrinks slightly and becomes harder. Wet storage means that the 3D framework runs the risk of spoiling more quickly. The drying / vitrification is preferably carried out in a sterile environment. Suitable drying temperatures are in the range from 4 ° C to 50 ° C, more preferably in the range from 15 ° C to 25 ° C. The drying can be carried out, for example, in a drying cabinet, in a climatic chamber or the like.

Als biologische Zellen, die für den Aufbau des mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts eingesetzt werden, kommen sämtliche natürlich vorkommenden eukaryotischen und prokaryotischen Zellen in Betracht. Vorzugsweise handelt es sich bei den eingesetzten Zellen um eukaryotische Zellen. Besonders geeignet sind alle Zellen und Zelltypen, die im Körper eines Säugetiers, insbesondere eines Nagers und ganz besonders eines Menschen, vorkommen bzw. diesen Körper aufbauen. In einer Variante handelt es sich bei den eingesetzten biologischen Zellen um omnipotente oder pluripotente Zellen. Dabei bezieht sich die Erfindung in einer Variante nur auf den Einsatz solcher Zellen, die ohne die Zerstörung menschlicher Embryonen gewonnen werden können. Neben natürlich vorkommenden Zellen können als biologische Zellen auch Zellen nicht natürlich vorkommender Zelllinien verwendet werden. Derartige künstlich generierte Zelllinien ermöglichen den maßgeschneiderten Aufbau eines herzustellenden 3D-Zellkulturkonstrukts bzw. dreidimensionalen mehrzelligen Objektes. Als biologische Zellen können nicht nur adhärente Zellen, sondern auch Suspensionszellen eingesetzt werden. Mit bisherigen Systemen war es bisher nicht möglich, 3D-Zellkulturkonstrukte aus Suspensionszellen zu generieren, da diese von alleine nicht aneinanderwachsen. Befindet sich jedoch im Hohlraum des 3D-Gerüsts eine Stützstruktur, wie Säulen oder ein Gitter, so ist es mit dem 3D-Gerüst möglich, ein Zellkulturkonstrukt aus Suspensionszellen bereitzustellen, wie beispielsweise einen Lymphknoten, an dem dann Versuche durchgeführt werden können.All naturally occurring eukaryotic and prokaryotic cells come into consideration as biological cells which are used for the construction of the 3D framework populated with biological cells. The cells used are preferably eukaryotic cells. All cells and cell types which occur in the body of a mammal, in particular a rodent and very particularly a human, or which build up this body are particularly suitable. In one variant, the biological cells used are omnipotent or pluripotent cells. In one variant, the invention relates only to the use of cells which can be obtained without destroying human embryos. In addition to naturally occurring cells, cells from non-naturally occurring cell lines can also be used as biological cells. Artificially generated cell lines of this kind enable the customized construction of a 3D cell culture construct or three-dimensional multicellular object to be produced. Not only adherent cells but also suspension cells can be used as biological cells. With previous systems it was not possible to generate 3D cell culture constructs from suspension cells, as these do not grow together on their own. However, if there is a support structure, such as columns or a grid, in the cavity of the 3D framework, the 3D framework can be used to provide a cell culture construct from suspension cells, such as a lymph node, on which experiments can then be carried out.

Da das erfindungsgemäße Gerüst die Kombination verschiedener Zelltypen zu einem 3D-Zellkulturkonstrukt ermöglicht, eignet es sich insbesondere zur Herstellung künstlicher Organe. Derartige künstliche Organe können beispielsweise miniaturisierte Modellobjekte eines natürlich vorkommenden Organs, insbesondere eines natürlich vorkommenden Organs eines Menschen oder eines Tieres, wie etwa eines Säugetieres oder eines Nagers sein. Es ist auch möglich, Kunststoffpolymere und Biopolymere zu kombinieren, so dass sehr stabile Gebilde hergestellt werden können, in denen die biologischen Zellen eingebettet sind. Während eines einzelnen Druckvorganges können mehrere 3D-Gerüste, auch mit unterschiedlichen Formen, gleichzeitig erzeugt werden.Since the framework according to the invention enables the combination of different cell types to form a 3D cell culture construct, it is particularly suitable for the production of artificial organs. Such artificial organs can be, for example, miniaturized model objects of a naturally occurring organ, in particular a naturally occurring organ of a person or an animal, such as a mammal or a rodent. It is also possible to combine plastic polymers and biopolymers so that very stable structures can be produced in which the biological cells are embedded. During one single printing process, several 3D frameworks, even with different shapes, can be created at the same time.

Damit der Anwender das erfindungsgemäße getrocknete 3D-Gerüst zur Besiedlung mit biologischen Zellen verwenden kann, wird das 3D-Gerüst rehydratisiert. Dafür wird das 3D-Gerüst vorzugsweise über einen Zeitraum von 60 s bis 60 min vorzugsweise in Wasser, einer Salzlösung, einem Puffer, Zellmedium oder einer ähnlichen physiologisch verträglichen Flüssigkeit eingelegt. Idealerweise erfolgt diese Handlung in einer Petrischale oder Ähnlichem unter sterilen Bedingungen. Hierdurch gewinnt das Gerüst wieder seine ursprüngliche Größe, Festigkeit und Beschaffenheit zurück.So that the user can use the dried 3D framework according to the invention for colonization with biological cells, the 3D framework is rehydrated. For this purpose, the 3D framework is preferably placed in water, a saline solution, a buffer, cell medium or a similar physiologically compatible liquid for a period of 60 s to 60 min. Ideally, this action takes place in a Petri dish or the like under sterile conditions. As a result, the framework regains its original size, strength and texture.

Zur Besiedlung des Gerüsts mit biologischen Zellen wird vorzugsweise eine Suspension aus biologischen Zellen und einem gewünschten Lösungsmittelgemischt. Als Lösungsmittel können alle mit Zellen kompatiblen Lösungen eingesetzt werden. Das umfasst alle wässrigen Lösungen, die das Überleben von Zellen gewährleisten. Für gewöhnlich werden Stoffe zum Einstellen eines neutralen pH-Wertes (pH 7.4) und eines isotonischen Milieus eingesetzt, um mit den Lösungen den Flüssigkeiten im menschlichen Körper (z.B. Blut) nahe zu kommen. Die Konzentration der biologischen Zellen in dem Lösungsmittel liegt dabei vorzugsweise in einem Bereich von 100.000 bis 300.000.000 Zellen pro Milliliter. Für die Besiedlung des 3D-Gerüsts wird die Zellsuspension vorzugsweise über die Einfüllöffnung in das Gerüst eingebracht. Es ist dabei bevorzugt, dass das Gesamtvolumen der einzufüllenden Zellsuspension maximal so groß wie das Volumen des Hohlraums des 3D-Gerüsts ist. Wenn die gewünschte Zellkonzentration eingestellt ist, kann der Anwender das Volumen beispielsweise mit Hilfe einer Pipette in das Gerüst einspülen. Es ist bevorzugt, dass das 3D-Gerüst beim Einfüllen der Zellsuspension bereits mit einer Flüssigkeit gefüllt ist, die dann über optionale Auslassöffnungen ausströmen kann. Im Idealfall wird das Gerüst aber zum Einfüllen der Zellsuspension aus dem für die Rehydratisierung verwendeten Medium entfernt.In order to colonize the framework with biological cells, a suspension of biological cells and a desired solvent is preferably mixed. All solutions compatible with cells can be used as solvents. This includes all aqueous solutions that ensure cell survival. Usually substances are used to set a neutral pH value (pH 7.4) and an isotonic environment in order to get close to the fluids in the human body (e.g. blood) with the solutions. The concentration of the biological cells in the solvent is preferably in a range from 100,000 to 300,000,000 cells per milliliter. For the colonization of the 3D framework, the cell suspension is preferably introduced into the framework via the filling opening. It is preferred that the total volume of the cell suspension to be filled is at most as large as the volume of the cavity of the 3D framework. When the desired cell concentration has been set, the user can rinse the volume into the framework, for example with the help of a pipette. It is preferred that when the cell suspension is filled in, the 3D framework is already filled with a liquid which can then flow out via optional outlet openings. In the ideal case, however, the framework is removed from the medium used for rehydration in order to fill in the cell suspension.

Mögliche Säulen, Gitter oder Querstreben in dem Hohlraum des 3D-Gerüsts können bei der Besiedlung mit biologischen Zellen als Anker oder Rückhalt für die biologischen Zellen dienen, so dass sie - bei adhärenten Zellen - an dem 3D-Gerüst anhaften können, oder - bei Suspensionszellen - frei schwimmend im 3D-Gerüst kultiviert werden können.Possible columns, grids or cross struts in the cavity of the 3D framework can serve as an anchor or restraint for the biological cells when colonizing with biological cells, so that - in the case of adherent cells - they can adhere to the 3D framework, or - in the case of suspension cells - Can be cultivated floating freely in the 3D framework.

Nachdem die Zellsuspension in das 3D-Gerüst eingefüllt wurde, kann das jetzt zellhaltige Konstrukt weiter kultiviert werden. Je nach innerem Konstrukt des Hohlraums kann sich jetzt ein neues 3D-Zellkulturmodell ausbilden. Bei adhärenten Zellen adhärieren die biologischen Zellen an alle verfügbaren Strukturen und sich selbst, so dass eine 3D-Struktur in der Form des Hohlraums des 3D-Gerüsts entsteht.After the cell suspension has been poured into the 3D framework, the now cell-containing construct can be further cultivated. Depending on the inner construct of the cavity, a new 3D cell culture model can now develop. In the case of adherent cells, the biological cells adhere to all available structures and to themselves, so that a 3D structure in the shape of the cavity of the 3D framework is created.

Auf diesem Weg entsteht kontrolliert ein 3D-Zellkulturmodell/-konstrukt. Sollte das 3D-Gerüst beispielsweise mit Tumorzellen besiedelt werden, entsteht ein 3D-Tumormodell. Wird das Modell mit Suspensionszellen, wie T-Zellen oder B-Lymphozyten, besiedelt, entsteht ein lymphknotenähnliches Modell oder ein diffuses B-Zelllymphom. Ist der Hohlraum oder auch das Porenvolumen der Matrix des 3D-Gerüsts vollständig besiedelt, können die Zellen das 3D-Gerüst beispielsweise über die optionale(n) Auslassöffnung(en) verlassen. Auf diesem Weg können sich z. B. kleine Sphäroide aus Zellen abschnüren.In this way, a controlled 3D cell culture model / construct is created. If the 3D framework is to be colonized with tumor cells, for example, a 3D tumor model is created. If the model is colonized with suspension cells such as T cells or B lymphocytes, a lymph node-like model or a diffuse B cell lymphoma is created. If the cavity or the pore volume of the matrix of the 3D framework is completely populated, the cells can leave the 3D framework, for example via the optional outlet opening (s). In this way, z. B. pinch off small spheroids from cells.

Mit dem erfindungsgemäßen 3D-Gerüst können komplexe biologische 3D-Zellkulturkonstrukte als Modelle erzeugt werden, um beispielsweise Zell-Zell-Interaktionen, die Organbiogenese, Krankheiten oder Organfunktionen darzustellen und zu untersuchen. Ein derartiges 3D-Zellkulturkonstrukt hat gegenüber der klassischen zweidimensionalen Zellkultur deutliche Vorteile, insbesondere, wenn es um die Modellierung des Zusammenspiels mehrerer Zelltypen geht. Denn die Komplexität von Zell-Zell-Interaktionen, die Funktion einer natürlichen Barriere und die Modellierung von Krankheiten oder Organen können mit den klassischen zweidimensionalen Zellkulturen nicht hinreichend abgebildet werden.With the 3D framework according to the invention, complex biological 3D cell culture constructs can be generated as models in order, for example, to represent and examine cell-cell interactions, organ biogenesis, diseases or organ functions. Such a 3D cell culture construct has clear advantages over the classic two-dimensional cell culture, especially when it comes to modeling the interaction of several cell types. The complexity of cell-cell interactions, the function of a natural barrier and the modeling of diseases or organs cannot be adequately represented with classic two-dimensional cell cultures.

Darüber hinaus ermöglicht das erfindungsgemäße 3D-Gerüst die Erstellung miniaturisierter Modelle in besonders einfacher Art und Weise. Derartige miniaturisierte Modelle wurden bislang teilweise von Hand aufgebaut. Der hierfür erforderliche Aufwand ist sehr hoch; zudem ist langjährige Erfahrung notwendig.In addition, the 3D framework according to the invention enables miniaturized models to be created in a particularly simple manner. Such miniaturized models have so far been partially built by hand. The effort required for this is very high; Many years of experience are also required.

Schließlich kann mit der Zellbesiedlung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts eine hohe Reproduzierbarkeit unterschiedlicher Exemplare des gleichen 3D-Zellkulturkonstrukts gewährleistet werden. Die Verwendung eines 3D-Gerüsts ermöglicht zudem den gerichteten Aufbau einer 3D-Zellkultur. Folglich lässt sich durch die Verwendung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts nicht nur die Herstellung gegenüber anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren beschleunigen, vielmehr weisen die erzeugten 3D-Zellkulturkonstrukte auch stets die gleiche Qualität auf. Eine derart hohe Reproduzierbarkeit ist in der Biotechnologie besonders vorteilhaft. Denn bei der Analyse und Entwicklung neuer pharmazeutischer Produkte reduziert ein Test an stets gleich bleibenden dreidimensionalen Zellkulturen die Entwicklungskosten erheblich. Wenn derart komplexe dreidimensionale Strukturen hingegen per Hand aufgebaut werden, sind individuelle Schwankungen unvermeidlich. Damit wird es aber praktisch unmöglich, reproduzierbare Testergebnisse zu erhalten. Demgegenüber liefert die Verwendung des erfindungsgemäßen 3D-Gerüsts 3D-Zellkulturkonstrukte, die für die Erzeugung reproduzierbarer Testergebnisse hervorragend geeignet sind.Finally, with the cell colonization of the 3D framework according to the invention, a high level of reproducibility of different specimens of the same 3D cell culture construct can be ensured. The use of a 3D framework also enables the targeted construction of a 3D cell culture. Consequently, by using the 3D framework according to the invention, not only can the production be accelerated compared to other methods known from the prior art, but the 3D cell culture constructs generated also always have the same quality. Such a high reproducibility is particularly advantageous in biotechnology. Because when analyzing and developing new pharmaceutical products, a test on three-dimensional cell cultures that always remain the same reduces development costs considerably. When such complex three-dimensional structures are built by hand, however, individual fluctuations are inevitable. However, this makes it practically impossible to obtain reproducible test results. In contrast, the use of the 3D framework according to the invention provides 3D cell culture constructs which are extremely suitable for generating reproducible test results.

Die vorliegende Erfindung weist folgende Vorteile auf: Bisher waren keine Gerüste mit Hinterschnitten oder komplexen Architekturen möglich, die von einem Anwender selbst besiedelt werden können. Das 3D-Gerüst fungiert selbst als Hohlkörper, dessen Herstellung ohne Multimaterial-Stereolithographie bis jetzt nicht möglich gewesen wäre. Die komplexe Architektur, mit der auf das Verhalten der Zellen Einfluss genommen wird, wäre so nicht abzubilden. Durch den erfindungsgemäßen Herstellungsweg kann eine hohe Reproduzierbarkeit und Parallelität gewährleistet werden. Das 3D-Gerüst lässt sich trotz komplexer Architektur mit einer millimetergenauen Präzision reproduzieren. Darüber hinaus erlaubt das System erstmals die Kultivierung von Suspensionszellen in einem 3D-Konstrukt, oder die Herstellung von vaskulären Strukturen. Dabei muss das System nicht aktiv geschüttelt werden, wie sonst in einer klassischen Schüttelkultur. Die Zellen verbleiben lebend im Gerüst. Durch den Einfluss des Systems lassen sich deutlich längere Kultivierungszeiten erreichen. So kann das besiedelte System beispielsweise über Zeiträume von mehreren Wochen kultiviert werden, so dass es Einsatz als Ersatzprodukt für Tierversuche finden kann. Kultivierungszeiträume von mehreren Wochen waren für manche Zelltypen bislang nicht möglich. Des Weiteren lässt sich das Verhalten der Zellen online verfolgen, da das System für sichtbares Licht vorzugsweise transparent ist. Eine kontinuierliche Messung durch optische Methoden ist gewährleistet. Zusammenfassend stellt das Gerüst durch seine Form, Architektur, Methode der Anwendung, physikalische Parameter eine Neuerung dar.The present invention has the following advantages: So far, no frameworks with undercuts or complex architectures have been possible that can be populated by a user himself. The 3D framework itself functions as a hollow body, the manufacture of which would not have been possible until now without multi-material stereolithography. The complex architecture with which the behavior of the cells is influenced could not be represented in this way. The production method according to the invention can ensure a high level of reproducibility and parallelism. Despite the complex architecture, the 3D framework can be reproduced with millimeter precision. In addition, the system allows for the first time the cultivation of suspension cells in a 3D construct or the production of vascular structures. The system does not have to be actively shaken, as is otherwise the case in a classic shaking culture. The cells remain alive in the scaffold. Due to the influence of the system, significantly longer cultivation times can be achieved. For example, the populated system can be cultivated over periods of several weeks so that it can be used as a substitute for animal experiments. Cultivation periods of several weeks have not been possible for some cell types up to now. Furthermore, the behavior of the cells can be tracked online, since the system is preferably transparent to visible light. Continuous measurement using optical methods is guaranteed. In summary, the structure is a novelty due to its shape, architecture, method of application and physical parameters.

Die vorliegende Erfindung soll nun anhand von konkreten Ausführungsformen veranschaulicht werden, die in den folgenden Figuren gezeigt sind:

1: 1 zeigt eine Ansicht eines erfindungsgemäßen unbesiedelten 3D-Gerüsts einer CAD-Datei mit einem zentralen überdachten Hohlkörper, einer Einfüllöffnung an der Oberseite und mehreren seitlichen Auslassöffnungen.
2: 2 zeigt eine fotographische Aufnahme in der Draufsicht auf ein durch lithographischen 3D-Druck hergestelltes erfindungsgemäßes 3D-Gerüst nach der CAD-Datei der 1.
3: 3 zeigt eine fotographische Aufnahme in der Draufsicht auf ein mit Tumorzellen aus einem Neuroblastom besiedeltes erfindungsgemäßes 3D-Gerüst nach 2.

The present invention will now be illustrated with the aid of specific embodiments which are shown in the following figures:

1 : 1 shows a view of an uninhabited 3D framework according to the invention of a CAD file with a central roofed hollow body, a filling opening on the top and several lateral outlet openings.
2 : 2 FIG. 13 shows a top view of a photographic image of a 3D framework according to the invention produced by lithographic 3D printing according to the CAD file of FIG 1 .
3 : 3 shows a top view of a photographic image of a 3D framework according to the invention that is populated with tumor cells from a neuroblastoma 2 .

1 zeigt ein in einer CAD-Datei erstelltes Modell eines 3D-Gerüsts 1, das erfindungsgemäß verwendet werden kann. Das 3D-Gerüst 1 weist vorzugsweise einen zentral angeordneten, größtenteils überdachten Hohlraum 2 auf. Der Hohlraum 2 ist vorzugsweise über eine als Einfüllstutzen ausgebildete Einfüllöffnung 3 zugänglich. Die Einfüllöffnung 3 bzw. der Einfüllstutzen befindet sich vorzugsweise an der Oberseite des 3D-Gerüsts 1. Die Einfüllöffnung 3 ist vorzugsweise mittig an der Oberseite des 3D-Gerüsts 1 angeordnet. Die Fläche über dem Hohlraum 2 ist vorzugsweise mit Säulen 5 innerhalb des Hohlraums 2 abgestützt. Das 3D-Gerüst 1 kann eine Auslassöffnung 4 aufweisen, die vorzugsweise an der Fläche seitlich zur Oberseite angeordnet ist. Wie in 1 gezeigt, kann das 3D-Gerüst auch mehrere Auslassöffnungen 4 aufweisen, die vorzugsweise alle an der Fläche seitlich zur Oberfläche angeordnet sind. Die Auslassöffnung(en) ist/sind vorzugsweise über (einen) Auslasskanal/Auslasskanäle mit dem Hohlraum 2 verbunden. Sind mehrere Auslasskanäle/Auslassöffnungen 4 vorhanden, sind diese vorzugsweise sternförmig in dem vorzugsweise zentral angeordneten Hohlraum 2 angeordnet. 1 shows a model of a 3D framework created in a CAD file 1 which can be used in the present invention. The 3D framework 1 preferably has a centrally arranged, largely roofed cavity 2 on. The cavity 2 is preferably via a filler opening designed as a filler neck 3 accessible. The filling opening 3 or the filler neck is preferably located on the top of the 3D framework 1 . The filling opening 3 is preferably in the middle of the top of the 3D framework 1 arranged. The area above the cavity 2 is preferably with pillars 5 inside the cavity 2 supported. The 3D framework 1 can be an outlet port 4th have, which is preferably arranged on the surface laterally to the top. As in 1 shown, the 3D framework can also have multiple outlet openings 4th have, which are preferably all arranged on the surface laterally to the surface. The outlet opening (s) is / are preferably via (an) outlet channel (s) with the cavity 2 connected. Are multiple outlet ducts / outlet openings 4th present, these are preferably star-shaped in the preferably centrally arranged cavity 2 arranged.

2 zeigt eine fotographische Aufnahme eines 3D-Gerüsts 1, das mit Hilfe eines lithographischen 3D-Druckverfahrens auf Basis der CAD-Datei nach 1 hergestellt ist. Deutlich zu erkennen sind der obere Einfüllstutzen 3, die seitlichen Kanäle 4 sowie die Säulen 5 im Hohlraum 2. Das in 2 gezeigte 3D-Gerüst wird durch folgende Verfahrensschritte hergestellt:

1.) Erstellung des CAD-Files und Berechnung der Druckvorlage;
2.) Rüsten des Druckers mit zu verwendenden photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten;
3.) Kalibrieren des Druckers, der Achsen und des Druckkopfs;
4.) Ausführung des Druckes, Druckplattform senkt sich auf die erste Druckebene für die erste photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit;
5.) Druck eines ersten Polymers aus der ersten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit für Architekturen bestehend aus Polymer 1 für die erste Schichthöhe des zu druckenden Konstrukts; dabei wird der berechnete Bauplan des ersten Polymers für die erste Schichthöhe des Konstrukts auf die Druckebene projiziert, in der sich der Druckkopf befindet; hierbei können ein oder mehrere Konstrukte gleichzeitig hergestellt werden, je nach Wunsch und Planung des Anwenders; begrenzender Faktor ist dabei die Größe der Druckplattform bzw. des Bauraums;
6.) Wenn nötig, Waschschritt des Druckers um ein Verschleppen von dem ersten Polymer in eine zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und umgekehrt zu verhindern - optional (sofern ein zweites Polymer benötigt wird);
7.) Wenn nötig, Druck des zweiten Polymers für Architekturen bestehend aus dem zweiten Polymer für die erste Schicht - optional (sofern ein zweites Polymer verwendet wird);
8.) Wiederholung der Schritte sechs und sieben wenn ein drittes Polymer verwendet wird;
9.) Veränderung der Druckebene um die zweite Schichthöhe drucken zu können;
10.) Druck des ersten Polymers für Architekturen bestehend aus dem ersten Polymer für die zweite Schichthöhe des zu druckenden Konstrukts;
11.) Wenn nötig, Waschschritt des Druckers um ein Verschleppen von des ersten Polymers in die zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und umgekehrt zu verhindern - optional (sofern zweites Polymer verwendet wird);
12.) Wenn nötig, Druck des zweiten Polymers aus einer zweiten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit für Architekturen bestehend aus dem zweiten Polymer für die zweite Schicht - optional (sofern ein zweites Polymer verwendet wird);
13.) Wiederholung der Schritte 11 und 12 wenn ein drittes Polymer benötigt wird;
14.) Veränderung der Druckebene um die dritte Schichthöhe drucken zu können;
15.) Wiederholung der Schritte fünf bis acht bis die vollständige Architektur gedruckt wurde;
16.) Nach Abschluss des Druckes wird die Druckplattform in die Ausgangsebene gefahren und das erhaltene 3D-Gerüst entfernt;
17.) Im Anschluss kann das 3D-Gerüst getrocknet oder sofort verwendet werden.
18.) Wird das 3D-Gerüst getrocknet, findet dies in einer sterilen Atmosphäre statt; hierbei wird dem 3D-Gerüst sämtliches Wasser entzogen, so dass ein trockenes Polymergerüst entsteht;
19.) Nach dem Trocknen kann das 3D-Gerüst unter sterilen Bedingungen gelagert werden.

2 shows a photograph of a 3D framework 1 using a lithographic 3D printing process based on the CAD file 1 is made. The upper filler neck can be clearly seen 3 who have favourited the side channels 4th as well as the pillars 5 in the cavity 2 . This in 2 The 3D framework shown is produced using the following process steps:

1.) Creation of the CAD file and calculation of the print template;
2.) equipping the printer with photopolymerizable or photocrosslinkable liquids to be used;
3.) Calibrate the printer, the axes and the printhead;
4.) Execution of the print, the print platform is lowered to the first print level for the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid;
5.) Printing a first polymer from the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid for architectures consisting of polymer 1 for the first layer height of the construct to be printed; the calculated construction plan of the first polymer for the first layer height of the construct is projected onto the printing plane in which the print head is located; one or more constructs can be produced at the same time, depending on the wishes and planning of the user; the limiting factor is the size of the printing platform or the installation space;
6.) If necessary, wash the printer to prevent carryover of the first polymer in prevent a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and vice versa - optional (if a second polymer is required);
7.) If necessary, printing of the second polymer for architectures consisting of the second polymer for the first layer - optional (if a second polymer is used);
8.) Repeat steps six and seven if a third polymer is used;
9.) Change of the print level in order to be able to print the second layer height;
10.) Printing the first polymer for architectures consisting of the first polymer for the second layer height of the construct to be printed;
11.) If necessary, washing step of the printer to prevent the first polymer from being carried over into the second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and vice versa - optional (if the second polymer is used);
12.) If necessary, printing the second polymer from a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid for architectures consisting of the second polymer for the second layer - optionally (if a second polymer is used);
13.) Repeat steps 11 and 12 if a third polymer is required;
14.) Change of the print level to be able to print the third layer height;
15.) Repeat steps five through eight until the complete architecture has been printed;
16.) After the printing is complete, the printing platform is moved to the starting level and the 3D framework obtained is removed;
17.) The 3D framework can then be dried or used immediately.
18.) If the 3D framework is dried, this takes place in a sterile atmosphere; all water is withdrawn from the 3D framework, so that a dry polymer framework is created;
19.) After drying, the 3D framework can be stored under sterile conditions.

Konkrete Bedingungen und Parameter für die Herstellung des 3D-Gerüsts nach 2: Äußerer Durchmesser 3D-Gerüst: 6 mm Höhe 3D-Gerüst: 2 mm Volumen Hohlraum: 9,9 mm³ Innendurchmesser Einfüllöffnung: 1,6 mm Querschnitt seitliche Kanäle (eckig) und Auslassöffnungen: 0,4 mm x 0,4 mm Concrete conditions and parameters for the production of the 3D framework 2 : External diameter of the 3D framework: 6 mm Height of the 3D framework: 2 mm Volume cavity: 9.9 mm ³ Inner diameter filling opening: 1.6 mm Cross-section of lateral channels (angular) and outlet openings: 0.4mm x 0.4mm

Zusammensetzung der photovernetzbaren Flüssigkeit:

Lösungsmittel:: RPMI 1640 + 25 mM HEPES (Biochrom FG 1383), Phosphatebuffered Saline
Photovernetzbare Substanz:: Gelatine-Methacrylat, 50 g/kg; Polyethylenglycol-Diacrylat, 50 g/L
Weitere Additive:: Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat, 5 g/kg; Tartrazin, 2 mM;

Composition of the photocrosslinkable liquid:

Solvent:: RPMI 1640 + 25 mM HEPES (Biochrom FG 1383), phosphate-buffered saline
Photocrosslinkable substance:: Gelatin methacrylate, 50 g / kg; Polyethylene glycol diacrylate, 50 g / L
Other additives:: Lithium phenyl 2,4,6-trimethylbenzoyl phosphinate, 5 g / kg; Tartrazine, 2 mM;

Aus der photovernetzbaren Flüssigkeit wird das gesamte 3D-Gerüst gedruckt. Durch Zusatz des Photoblockers Tartrazin in der photovernetzbaren Flüssigkeit wird die Penetrationstiefe des zur Polymerisation verwendeten Lichts reguliert, sodass die Herstellung des überdachten Hohlraums ermöglicht wird. Alternativ könnten zur Herstellung des überdachten Hohlraums Opfertinten (eingesetzt in einer weiteren photovernetzbaren Flüssigkeit; z.B. 15 g/kg Hyaluronsäure gelöst in RPMI + 5 g/kg Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat gedruckt und anschließend mit Hyaluronidase verdaut, um den Hohlraum zu erzeugen) verwendet werden, die nach Abschluss des Drucks hydrolytisch oder durch enzymatisches Verdauen aufgelöst werden.The entire 3D framework is printed from the photocrosslinkable liquid. By adding the photoblocker tartrazine to the photocrosslinkable liquid, the depth of penetration of the light used for polymerization is regulated so that the covered cavity can be created. Alternatively, sacrificial inks (used in another photocrosslinkable liquid; e.g. 15 g / kg hyaluronic acid dissolved in RPMI + 5 g / kg lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate) could be printed and then digested with hyaluronidase to close the cavity to produce the covered cavity generate), which are hydrolytically or enzymatically digested after the printing is complete.

3 zeigt eine fotographische Aufnahme eines 3D-Gerüsts 1 nach 2, das mit Neuroblastomzellen besiedelt wurde. Dazu werden folgende weitere Verfahrensschritte durchgeführt:

20.) Es wird eine Zellsuspension mit einer vom Anwender vorher eingestellten Konzentration über den Einfüllstutzen in ein gemäß 1.) bis 19.) hergestellten 3D-Gerüst pipettiert; dabei wird ein Zellsuspensionsvolumen verwendet, das maximal dem Volumen des Hohlraums des 3D-Gerüsts entspricht; wird das 3D-Gerüst in Schritt 18.) getrocknet, muss es zuvor zur erneuten Verwendung vom Anwender wieder hydratisiert werden; hierzu eignet sich ein steriles Medium, wie Wasser, PBS, Zellkulturmedium oder ähnliches;
21.) Durch das Einpipettieren wird die Suspension innerhalb des 3D-Gerüsts verteilt und die Zellen können innerhalb des 3D-Gerüsts kultiviert werden;

3 shows a photograph of a 3D framework 1 to 2 colonized with neuroblastoma cells. The following additional process steps are carried out for this purpose:

20.) A cell suspension with a concentration previously set by the user is pipetted via the filler neck into a 3D framework produced according to 1.) to 19.); a cell suspension volume is used that corresponds at most to the volume of the cavity of the 3D framework; If the 3D framework is dried in step 18.), it must first be rehydrated by the user before it can be used again; a sterile medium such as water, PBS, cell culture medium or the like is suitable for this;
21.) By pipetting in, the suspension is distributed within the 3D framework and the cells can be cultivated within the 3D framework;

Zur Besiedlung des Hohlraums mit Neuroblastomzellen (SK-N-BE(2)) wird eine Zellsuspension (Lösungsmittel: DMEM high glucose + 10% FCS + 1% Penicillin/Streptomycin; Zellkonzentration: 150 x 10⁶ Zellen/mL) hergestellt. 6 µL dieser Suspension werden über den Einfüllstutzen in den Hohlraum des 3D-Gerüsts pipettiert. Anschließend wird das Konstrukt bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert.A cell suspension (solvent: DMEM high glucose + 10% FCS + 1% penicillin / streptomycin; cell concentration: 150 x 10 ⁶ cells / mL) is prepared to colonize the cavity with neuroblastoma cells (SK-N-BE (2)). 6 µL of this suspension are pipetted into the cavity of the 3D framework via the filler neck. The construct is then cultivated at 37 ° C. and 5% CO _2.

BezugszeichenlisteList of reference symbols

11: 3D-Gerüst3D framework
22: Hohlraumcavity
33: EinfüllöffnungFilling opening
44th: AuslassöffnungOutlet opening
55: Säulencolumns

Claims

3D-Gerüst (1) aus biokompatiblem Polymer, das Folgendes aufweist: (a) einen zumindest teilweise überdachten Hohlraum (2) im Inneren des 3D-Gerüsts (1); (b) eine Einfüllöffnung (3), die so ausgebildet ist, dass der Hohlraum (2) mit einer Flüssigkeit befüllbar ist; (c) mindestens eine Auslassöffnung (4), die so ausgebildet ist, dass beim Befüllen des Hohlraums (2) mit Flüssigkeit bereits vorhandene Flüssigkeit aus dem Hohlraum (2) verdrängt wird und austritt.3D framework (1) made of biocompatible polymer, comprising: (a) an at least partially covered cavity (2) inside the 3D framework (1); (b) a filling opening (3) which is designed such that the cavity (2) can be filled with a liquid; (c) at least one outlet opening (4) which is designed in such a way that when the cavity (2) is filled with liquid, liquid already present is displaced from the cavity (2) and exits.

3D-Gerüst (1) nach Anspruch 1, wobei der Hohlraum (2) Säulen, Gitter oder Querstreben aufweist.3D framework (1) Claim 1 , wherein the cavity (2) has columns, grids or cross braces.

3D-Gerüst (1) nach Anspruch 1 oder 2, wobei das 3D-Gerüst (1) aus einem ersten biokompatiblen Polymer und mindestens einem weiteren biokompatiblen Polymer aufgebaut ist, das von dem ersten biokompatiblen Polymer verschieden ist.3D framework (1) Claim 1 or 2 , wherein the 3D framework (1) is constructed from a first biocompatible polymer and at least one further biocompatible polymer that is different from the first biocompatible polymer.

3D-Gerüst (1) nach Anspruch 3, wobei der den Hohlraum (2) umgebende Bereich des 3D-Gerüsts (1) das mindestens eine weitere biokompatible Polymer aufweist.3D framework (1) Claim 3 , wherein the region of the 3D framework (1) surrounding the cavity (2) has the at least one further biocompatible polymer.

3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Einfüllöffnung (3) an der Oberseite des 3D-Gerüsts (1), vorzugsweise in der Form eines Einfüllstutzens, angeordnet ist.3D framework (1) according to one of the Claims 1 to 4th , wherein the filling opening (3) is arranged on the upper side of the 3D framework (1), preferably in the form of a filler neck.

3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die mindestens eine Auslassöffnung (4) seitlich an dem 3D-Gerüst (1) angeordnet ist.3D framework (1) according to one of the Claims 1 to 5 , wherein the at least one outlet opening (4) is arranged on the side of the 3D framework (1).

3D-Gerüst (1) nach Anspruch 6, wobei die mindestens eine Auslassöffnung (4) über einen Kanal mit dem Hohlraum (2) verbunden ist, der sich im Wesentlichen horizontal erstreckt.3D framework (1) Claim 6 wherein the at least one outlet opening (4) is connected to the cavity (2) via a channel which extends essentially horizontally.

3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das zumindest im Bereich des sichtbaren Lichts transparent ist.3D framework (1) according to one of the Claims 1 to 7th that is transparent at least in the range of visible light.

3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das mithilfe eines lithographischen 3D-Druckverfahrens erhältlich ist.3D framework (1) according to one of the Claims 1 to 8th which is available using a 3D lithographic printing process.

3D-Gerüst (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Hohlraum (2) zumindest teilweise mit biologischen Zellen besiedelt ist.3D framework (1) according to one of the Claims 1 to 9 , wherein the cavity (2) is at least partially populated with biological cells.

Verfahren zur Herstellung eines 3D-Gerüsts gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 durch Aushärten einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanz durch Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung in einer Fokusebene, in der die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz vorliegt.Method for producing a 3D framework according to one of the Claims 1 to 10 by curing a photopolymerizable or photocrosslinkable substance by focusing electromagnetic radiation in a focal plane in which the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is present.

Verwendung eines 3D-Gerüsts (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Besiedeln des Hohlraums (2) mit biologischen Zellen.Use of a 3D framework (1) according to one of the Claims 1 to 9 for colonizing the cavity (2) with biological cells.