EP3942016A1 - Nouvelles souches de bacteries lactiques favorisant l'absorption du calcium - peptides et produits associes - Google Patents

Nouvelles souches de bacteries lactiques favorisant l'absorption du calcium - peptides et produits associes

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EP3942016A1
EP3942016A1 EP20725858.3A EP20725858A EP3942016A1 EP 3942016 A1 EP3942016 A1 EP 3942016A1 EP 20725858 A EP20725858 A EP 20725858A EP 3942016 A1 EP3942016 A1 EP 3942016A1
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EP
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peptides
seq
milk
strain
identity
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Pending
Application number
EP20725858.3A
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Benoit Cudennec
François COUTTE
Pascal Dhulster
Djamel Drider
Christophe FLAHAUT
Marc Fremont
Cyril RAVESCHOT
Maxime VAEREMANS
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Original Assignee
Vf Bioscience
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to novel strains of lactic acid bacteria as well as isolated peptides and mixtures of peptides derived from b-casein and produced by these strains. These peptides are active either as ACE inhibitors or as an agent to promote calcium absorption.
  • the present also relates to a food or pharmaceutical composition as well as associated products.
  • Insufficient absorption of calcium can lead to various symptoms or pathologies such as osteoporosis, high blood pressure or metabolic syndrome. Indeed, calcium is involved whatever the age of the patient, in the formation of bones, the solidification of the skeleton, the rigidity of the teeth, muscle contraction and therefore cardiac contraction, the transmission of nerve impulses at the level synapses, learning and memorization, salivary secretion, cell growth and proliferation. Calcium activates many enzymes, releases several hormones, clots the blood, and helps balance body weight.
  • hypocalcemia is also linked to various rare pathologies such as autoimmune hypoparathyroidism, vitamin-D dependent hypocalcemic rickets, progressive bone heteroplasia, isolated hypoparathyroidism, syndromic hypoparathyroidism, pseudo-hypoparathyroidism and hypo-rachitias. more generally diseases caused by an abnormality in the regulation of calcium levels due to the dysfunction of the parathyroid hormone, the absorption of vitamin D or the functioning of the calcium receptor.
  • An aim of the present invention is to provide a strain of lactic acid bacterium resistant to gastrointestinal digestion and capable of acting in the intestine by acidifying the medium, thus making the calcium soluble, in order to facilitate its absorption and its passage to through the intestinal wall.
  • Another object of the present invention is to provide a strain of lactic acid bacteria resistant to gastrointestinal digestion and capable of stimulating the absorption of calcium by the intestinal cells, by acting directly or indirectly on the latter.
  • Another aim of the present invention is to provide a strain of lactic acid bacteria which has greater growth than certain known lactic acid bacteria and / or which allows greater acidification of the fermentation medium, in particular of milk.
  • Another aim of the present invention is to provide a strain of lactic acid bacteria capable of producing new phosphorylated peptides capable of promoting the absorption of calcium in the intestine.
  • Another aim of the present invention is to provide at least one peptide, or even a mixture of peptides, which exhibits an ACE inhibitory activity which is greater than the activity of the IPP and VPP peptides.
  • Another aim of the present invention is to provide a pharmaceutical or food composition capable of treating hypocalcemia and therefore the pathologies which result therefrom.
  • the invention relates to a strain of Lactobacillus helveticus exhibiting the prtH2 and prtH3 genes and capable of reducing, by anaerobic fermentation, the pH of milk, in particular of cows and in particular of skimmed cow's milk to a value substantially equal to or less than 3.36, especially equal to 3.32 after 48 hours of fermentation at 37 ° C.
  • the strain allows the dissolution of compounds containing calcium, making the latter absorbable through the intestinal wall.
  • the present invention also relates to the strain of Lactobacillus helveticus VF45A deposited at the CNCM under the order number CNCM-I-5300, its mutants and variants having at least 80% identity, preferably at least 90%. % identity, preferably at least 95% identity with the genome of said strain VF45A and capable of producing at least one peptide corresponding to the sequences SEQ ID 1 to SEQ ID NO 43 and / or capable of reducing by anaerobic fermentation the pH of the milk, in particular cow's milk and in particular skimmed cow's milk at a value substantially equal to or less than 3.36, in particular equal to 3.32 after 48 hours of fermentation at 37 ° C.
  • the invention also relates to the aforementioned strains with reference to the first aspect for their use as a medicament and in particular as a medicament for the treatment of hypocalcemia or in the treatment of a pathology caused by a deficiency.
  • the present invention also relates to an isolated peptide which can be obtained by fermentation of milk, in particular of cow's milk, by at least one strain according to the first aspect of the invention and chosen from the peptides corresponding to the sequences SEQ ID 1 to SEQ ID NO 43, peptides exhibiting at least 80% identity, in particular at least 90% identity, in particular at least 95% identity with said peptides corresponding to sequences SEQ ID 1 to SEQ ID NO 19 and capable of inhibiting ACE and peptides exhibiting at least 80% identity, in particular at least 90% identity, in particular at least 95% identity with said peptides corresponding to the sequences SEQ ID 20 to SEQ ID NO 43 and capable of increasing the intestinal absorption of calcium.
  • the Applicant has in fact demonstrated either the ACE inhibitory activity of the aforementioned peptides - which activity is also linked to good bone health - or the activity of improving the absorption of calcium through the intestinal wall. due to some of the above peptides.
  • the peptides of the invention act on bone health via the absorption of calcium through the intestinal wall, and / or via the inhibition of ACE.
  • the present invention also relates to a mixture of peptides chosen from the mixtures comprising or consisting of all peptides of sequence SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 43, mixtures comprising or consisting of said peptides of sequence SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5, the mixtures comprising or consisting of 5 peptides of sequence SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5 and at least one peptide chosen from the peptides corresponding to the sequences SEQ ID 20 to SEQ ID NO 43, preferably mixtures containing or consisting of 5 peptides of sequence SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5 and peptides of sequences SEQ ID 20 to SEQ ID NO 43 and mixtures comprising or consisting of peptides of sequence SEQ ID 20 to SEQ ID 43.
  • the present invention also relates to the aforementioned isolated peptides and the aforementioned mixtures for their use as a medicament and in particular as a medicament in the treatment of hypocalcemia or in the treatment of a pathology caused by a deficiency in calcium absorption.
  • hypocalcaemia induced by a pathology chosen from autoimmune hypoparathyroidism, vitamin-D dependent hypocalcemic rickets, progressive bone heteroplasia, isolated hypoparathyroidism, syndromic hypoparathyroidism, pseudo-hypoparathyroidism and hypo-deficiency rickets, diseases caused by an abnormality in the regulation of calcium levels due to dysfunction of the parathyroid hormone, absorption of the vitamin D or the functioning of the calcium receptor, in a subject, in particular a mammal and particularly a human having such a need.
  • the present invention also relates to a food or pharmaceutical composition which contains at least one pharmaceutically acceptable excipient or a medium suitable for ingestion and as active ingredient at least one peptide chosen from the aforementioned isolated peptides with reference to first aspect and / or a mixture of peptides as mentioned above with reference to the first aspect and / or a strain according to the first aspect of the invention and in particular the VF45A strain.
  • the food or pharmaceutical composition comprises, at least or only as active peptides, the 5 peptides corresponding to the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5.
  • active peptides are the most active as ACE inhibitors. They are more active than the tripeptides VPP and IPP of the prior art.
  • the food or pharmaceutical composition according to the first aspect of the invention contains as active ingredient or consists of the fermentate obtained by anaerobic fermentation of possibly skimmed cow's milk by means of 'a strain according to the first aspect of the invention, said fermentate having optionally undergone ultrafiltration at a cut-off threshold of 10 kDa or it contains or consists of the fermentate obtained by anaerobic fermentation and optionally after ultrafiltration at a cut-off threshold of 10 kDa a protein substrate chosen from protein substrates of plant origin originating from at least one cereal and / or at least one pea and / or at least one fungus and / or at least one tree nut , mixtures of at least two protein substrates of plant origin, milks of animal origin optionally thermally sterilized, and / or at least partially skimmed, in particular the cow, goat or sheep milk with the exception of yak milk for the non-ultrafiltered fermentate at a cut-off threshold of 10kDa,
  • the fermentate as mentioned above obtained by anaerobic fermentation and ultrafiltration at a cut-off threshold of 10 kDa is part of the fermentates according to the first aspect of the invention, including the ultrafiltered fermentate obtained from yak milk.
  • the fermentate obtained from cow's milk it is advantageously obtained according to the temperature and duration conditions indicated in the part relating to the experimental results.
  • the protein substrate of plant origin can be chosen from vegetable milks such as oat milk, almond milk, rice milk, soy milk, spelled milk, hazelnut milk and mixtures of these milks. Whatever the milk, it can be thermally sterilized before fermentation by the bacteria according to the invention.
  • the food or pharmaceutical composition contains as an active ingredient the peptide (s) and / or the strain. It can also, advantageously also comprise calcium and / or vitamin D.
  • performing ultrafiltration on the fermentate separates the peptides produced by the strain from the proteins.
  • the ultrafiltered fermentate therefore no longer contains proteins.
  • the filtrate obtained by ultrafiltration of the fermentate is found to be more active when it is ingested and digested due to the absence of interference by the peptides resulting from the digestion of the proteins.
  • the food or pharmaceutical composition according to the first aspect of the invention contains a concentration of at least one of said strains and preferably of one of said strains, in particular the Lactobacillus helveticus VF45A strain equal to or greater at 10 7 CFU per gram and / or a concentration of peptides which are identical or different and chosen from peptides of sequence SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 43, greater than or equal to 18 mg per gram.
  • the peptides are the peptides contained in the aforementioned fermentate with reference to the first aspect and in particular the peptides of the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID No 43.
  • the present invention also relates to a product chosen in particular from food products, in particular fermented milks, juices of fruit (s) and / or of optionally fermented vegetable (s), vegetables and / or fermented fruits, fermented mushrooms, cold meats, food preparations based on fish (s) and dairy products obtained from possibly skimmed milk, in particular from cow, goat, sheep and with the exception of yak milk, or of a mixture of milks.
  • food products in particular fermented milks, juices of fruit (s) and / or of optionally fermented vegetable (s), vegetables and / or fermented fruits, fermented mushrooms, cold meats, food preparations based on fish (s) and dairy products obtained from possibly skimmed milk, in particular from cow, goat, sheep and with the exception of yak milk, or of a mixture of milks.
  • this product contains at least one strain according to the first aspect and / or at least one peptide according to the first aspect and / or at least one mixture of peptides according to the first aspect of the invention and / or or a food or pharmaceutical composition according to the first aspect of the invention.
  • the invention also relates to a food supplement suitable for a subject, in particular a human or an animal in particular chosen from cats, dogs, poultry, sheep, goats, cattle, reptiles, in particular.
  • a food supplement suitable for a subject, in particular a human or an animal in particular chosen from cats, dogs, poultry, sheep, goats, cattle, reptiles, in particular.
  • iguana which characteristically comprises at least one strain according to the first aspect and / or at least one peptide according to the first aspect and / or at least one mixture of peptides according to the first aspect and / or a food or pharmaceutical composition according to the first aspect.
  • the food / pharmaceutical composition or the food supplement can be in the form of a powder, of a solution in particular aqueous, of a tablet, of a capsule containing the strain under lyophilized form and / or the peptide or mixture of peptides in powder or solution form.
  • the capsule may have an outer shell capable of withstanding gastrointestinal digestion so as to deliver its contents into the patient's intestine.
  • the strain can also be, for example, microencapsulated with a lipid coating and be in the form of an ingestible powder.
  • the tablet, the capsule or any other unit form of daily dosage preferably contains at least 0.6 g of active peptides and / or 10 7 CFU of strain according to the first appearance, possibly in a mixture.
  • the pharmaceutical composition may preferably be adapted for oral administration.
  • the dairy product is not limited according to the invention. It can be a milk drink, fermented milk, kefir, yogurt, a product based on milk coagulated by adding acid or a fresh or yeast cheese, for example.
  • the present invention relates to a strain of Lactobacillus helveticus exhibiting the prtH1 gene and capable of reducing by anaerobic fermentation the pH of milk, in particular of cow's milk, to a value substantially equal to or less than 3.45 and in particular equal to 3, 43 after 48 hours at 37 ° C and exhibiting a parietal hydrophobicity of 40% and resistant to acidity and / or capable of increasing the absorption of calcium by the intestinal cells.
  • the present invention relates to the strain of Lactobacillus helveticus VFH049 deposited at the CNCM under the order number CNCM-l-5403 and its mutants and variants having at least 80% identity, preferably at least 90%. identity, preferably at least 95% identity with the genome of said strain VFH049 and capable of producing at least one peptide corresponding to the sequences SEQ ID 44 to SEQ ID NO 86 and / or capable of reducing the pH by anaerobic fermentation milk, in particular from cow's milk, at a value substantially equal to or less than 3.45 and in particular equal to 3.43 after 48 hours at 37 ° C. and / or capable of increasing the absorption of calcium by the intestinal cells.
  • This strain has been shown to be able to form acids which may make calcium soluble in the gut of a host / patient. It is also able to produce, by proteolysis of b-casein, peptides active as an ACE inhibitor or allowing better intestinal absorption of calcium. The strain itself resists digestion and, when in contact with the intestinal cells, allows better absorption of calcium by the latter.
  • the present invention also relates to the strains cited with reference to the second aspect and in particular the strain VFH049 or its mutants or variants for its use as a medicament and in particular as a medicament in the treatment of hypocalcemia or in the treatment of a pathology caused by a deficiency in calcium absorption and in particular chosen from arterial hypertension, metabolic syndrome, osteoporosis or in the treatment of hypocalcemia induced by a pathology chosen from autoimmune hypoparathyroidism , vitamin-D dependent hypocalcemic rickets, progressive bone heteroplasia, isolated hypoparathyroidism, syndromic hypoparathyroidism, pseudo-hypoparathyroidism and hypo-deficiency rickets, diseases caused by an abnormality in the regulation of calcium levels due to the dysfunction of the parathyroid hormone, absorption of vitamin D or the functioning of the calcium receptor, in a subject, especially a mammal and particularly a human having such a need.
  • the present invention also relates to an isolated peptide which can be obtained by fermentation of milk, in particular cow's milk, by at least one strain according to the second aspect of the invention and chosen from the peptides corresponding to the sequences SEQ ID 44 to SEQ ID NO 86, the peptides having at least 80% identity, in particular at least 90% identity, in particular at least 95% identity with said peptides corresponding to the sequences SEQ ID 44 to SEQ ID NO 74 and capable of inhibiting ACE and peptides exhibiting at least 80% identity, in particular at least 90% identity, in particular at least 95% identity with said peptides corresponding to the sequences SEQ ID 75 to SEQ ID NO 86 and capable of increasing intestinal absorption of calcium.
  • the invention also relates to a mixture of peptides chosen from mixtures of peptides containing or consisting of all the peptides of sequence SEQ ID 44 to SEQ ID 86, the mixtures comprising or consisting of peptides of sequence SEQ ID NO 44 to SEQ ID NO 58, the mixtures consisting of peptides of sequence SEQ ID NO 44 to SEQ ID NO 58 and of at least one of the peptides of sequence SEQ ID NO 75 to SEQ ID NO 86, mixtures comprising or consisting of peptides of sequence SEQ ID NO 44 to SEQ ID NO 58 and peptides of sequence SEQ ID NO 75 to SEQ ID NO 86 and mixtures containing or consisting of peptides of sequence SEQ ID NO 75 to SEQ ID NO 86.
  • the invention also relates to an isolated peptide of the second aspect or the mixture according to the second aspect for its use as a medicament and in particular as a medicament in the treatment of hypocalcemia or of a pathology caused by a calcium absorption deficiency and in particular chosen from arterial hypertension, metabolic syndrome, osteoporosis or for the treatment of hypocalcemia induced by a pathology chosen from autoimmune hypoparathyroidism, hypocalcemic rickets vitamin-D dependent, progressive bone heteroplasia, isolated hypoparathyroidism, syndromic hypoparathyroidism, pseudo-hypoparathyroidism and hypo-deficiency rickets, diseases caused by an abnormality in the regulation of calcium levels due to dysfunction of the parathormone, absorption of vitamin D, or calcium receptor function, in a subject, especially a mammal, particularly a human having such a need.
  • the present invention also relates to a food or pharmaceutical composition which contains at least one pharmaceutically acceptable excipient or at least one medium capable of being ingested and, as active ingredient, at least one peptide corresponding to the peptides isolated according to the second aspect of the invention, and / or a mixture of peptides according to the second aspect of the invention, and / or a strain according to the second aspect of the invention, in particular the strain VFH049.
  • the food or pharmaceutical composition contains a mixture containing all the peptides of sequences SEQ ID NO 44 to SEQ ID NO 86 or a mixture containing at least or only the peptides corresponding to the sequences SEQ ID NO 44 to SEQ ID NO 58 and optionally peptides of sequence SEQ ID NO 75 to SEQ ID NO 86.
  • the food or pharmaceutical composition contains or consists of the fermentate obtained by anaerobic fermentation of possibly skimmed cow's milk by means of a strain according to the second aspect of the invention, said fermentate having optionally undergone ultrafiltration at a cut-off threshold of 10 kDa or contains or consists of the fermentate obtained by anaerobic fermentation and optionally after ultrafiltration at a cut-off threshold of 10 kDa of a protein substrate chosen from protein substrates of plant origin originating from at least one cereal and / or at least one pea and / or at least one fungus and / or at least one tree nut, including the almond, mixtures of at least two protein substrates of plant origin, milks of '' animal origin optionally thermally sterilized and / or at least partially skimmed, in particular cow's, goat's or sheep's milk with the exception of mare's milk for the non-ultrafil fermentate at a cut-off point of 10kDa, mixtures of at least two milks
  • This fermentate contains all the peptides of the second aspect of the invention; it is therefore active in promoting bone health, both as an ACE inhibitor and as an agent promoting the intestinal absorption of calcium.
  • the fermentate itself can be considered as a pharmaceutical or food composition.
  • the aforementioned food or pharmaceutical composition preferably contains a concentration of at least one of said strains and preferably one of said strains, in particular the strain Lactobacillus helveticus VFH049 equal to or greater than 10 7 CFU per gram and / or a concentration of peptides which are identical or different and chosen from peptides of sequence SEQ ID NO 44 to SEQ ID NO 86, greater than or equal to 6 mg per gram.
  • the invention also relates to a product chosen in particular from food products, in particular fermented milk, fruit juice (s) and / or vegetable juice (s) optionally fermented, vegetables and / or fermented fruits, fermented mushrooms, cold meats, food preparations based on fish (s) and dairy products obtained from possibly skimmed milk, with the exception of mare's milk, in particular from cow's milk, goat's milk, sheep or a mixture of milk, which contains at least one strain according to the second aspect of the invention and / or at least one peptide according to the second aspect of the invention and / or at least one mixture of peptides according to second aspect of the invention and / or a food or pharmaceutical composition according to the second aspect of the invention.
  • food products in particular fermented milk, fruit juice (s) and / or vegetable juice (s) optionally fermented, vegetables and / or fermented fruits, fermented mushrooms, cold meats, food preparations based on fish (s) and dairy products obtained from possibly skimmed milk
  • the invention also relates to a food supplement suitable for a subject, in particular a human or an animal in particular chosen from cats, dogs, poultry, sheep, goats, cattle, reptiles, in particular.
  • a food supplement suitable for a subject, in particular a human or an animal in particular chosen from cats, dogs, poultry, sheep, goats, cattle, reptiles, in particular.
  • the iguana which characteristically comprises at least one strain according to the second aspect of the invention and / or at least one peptide according to the second aspect of the invention and / or at least one mixture of peptides according to the second aspect of the invention the invention and / or a food or pharmaceutical composition according to the second aspect of the invention.
  • the pharmaceutical or food composition is in the form of a liquid, in particular of the aforementioned cow's milk fermentate.
  • a volume of 30 mL of this solution containing 0.2 g of the mixture of peptides of the invention is administered daily orally.
  • the present invention relates to a strain of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus exhibiting the prtB gene and capable of reducing by anaerobic fermentation the pH of milk, in particular from cows, to a value substantially equal to or less than 4.55 and in particular equal to 4.51 after 48 hours at 37 ° C and exhibiting a wall hydrophobicity of at least 35% and / or capable of increasing calcium absorption.
  • One such strain has been shown to be active in the gut and resistant to gastrointestinal digestion. It is able to increase the passage of calcium through the intestinal wall. The acids it produces also help to dissolve calcium.
  • the invention relates to the strain of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b deposited with the CNCM under the order number CNCM- 1-5316 and its mutants and variants having at least 80% identity, preferably at least 90% identity, preferably at least 95% identity with the genome of said strain VF50b and capable of producing at least one peptide corresponding to the sequences SEQ ID 87 to SEQ ID NO 199 and / or capable of reducing by anaerobic fermentation the pH of milk, in particular from cows, to a value substantially equal to or lower at 4.55 and in particular equal to 4.51 after 48 hours at 37 ° C and / or capable of increasing the intestinal absorption of calcium.
  • the third aspect also relates to each of the strains as mentioned above for its use as a medicament, and in particular as a medicament in the treatment of hypocalcemia or in the treatment of a pathology caused by a deficiency in calcium absorption. and in particular chosen from arterial hypertension, metabolic syndrome, osteoporosis or in the treatment of hypocalcaemia induced by a pathology chosen from autoimmune hypoparathyroidism, vitamin-D dependent hypocalcemic rickets, progressive bone heteroplasia, isolated hypoparathyroidism, syndromic hypoparathyroidism, pseudo-hypoparathyroidism and hypo-deficiency rickets, diseases caused by an abnormality in the regulation of calcium levels due to the dysfunction of the parathyroid hormone, absorption of vitamin D or the functioning of the calcium receptor, in a subject, especially a mammal and particularly a human having such a need.
  • the present invention relates to an isolated peptide chosen from the peptides corresponding to the sequences SEQ ID 87 to SEQ ID NO 199, the peptides having at least 80% identity, in particular at least 90% identity, in particular at least 95% identity with said peptides corresponding to sequences SEQ ID 87 to SEQ ID NO 161 and capable of inhibiting ACE and peptides exhibiting at least 80% identity, in particular at least 90% identity, in particular at least 95% identity with said peptides corresponding to the sequences SEQ ID 162 to SEQ ID NO 199 and capable of increasing the intestinal absorption of calcium.
  • the invention also relates to a mixture of peptides chosen from mixtures containing or consisting of all peptides of sequence SEQ ID NO 87 to SEQ ID 199, mixtures containing or consisting of peptides of sequence SEQ ID 87 to SEQ ID 1 12, mixtures containing or consisting of peptides of sequence SEQ ID 87 to SEQ ID 1 12 and at least one of peptides of sequence SEQ ID NO 162 to SEQ ID NO 199 and mixtures containing or consisting of peptides of sequence SEQ ID NO 162 to SEQ ID NO 199.
  • the invention also relates to an isolated peptide cited with reference to the third aspect or to a mixture mentioned above with reference to the third aspect for its use as a medicament and in particular in the treatment in the treatment of hypocalcemia or of a pathology caused by a deficiency in calcium absorption and in particular chosen from arterial hypertension, metabolic syndrome, osteoporosis or for the treatment of hypocalcemia induced by a pathology chosen from autoimmune hypoparathyroidism, hypocalcemic rickets vitamin-D dependent, progressive bone heteroplasia, isolated hypoparathyroidism, syndromic hypoparathyroidism, pseudo-hypoparathyroidism and hypo-deficiency rickets, diseases caused by an abnormality in the regulation of calcium levels due to dysfunction of the parathormone, '' absorption of vitamin D or the functioning of the calcium, in a subject, in particular a mammal, in particular a human having such a need.
  • the invention also relates to a food or pharmaceutical composition which contains at least one pharmaceutically acceptable excipient or at least one medium capable of being ingested and, as active ingredient, at least one peptide isolated according to the third aspect of the invention and / or a mixture of peptides according to the third aspect.
  • the composition contains a mixture containing at least or only as peptides, the peptides corresponding to the sequences SEQ ID NO 87 to SEQ ID NO 161, or a mixture preferably containing all the peptides corresponding to the sequences SEQ ID 87 to SEQ ID NO 199 and / or a strain according to the third aspect.
  • the pharmaceutical or food composition according to the third aspect of the invention comprises or is constituted by the fermentate obtained by anaerobic fermentation of possibly skimmed cow's milk by means of a strain according to the third aspect of the invention, said fermentate having optionally undergone ultrafiltration at a cut-off threshold of 10 kDa or it contains or consists of the fermentate obtained by anaerobic fermentation and optionally after ultrafiltration at a cut-off threshold of 10 kDa of a protein substrate chosen from among the following: protein substrates of plant origin originating from at least one cereal and / or at least one pea and / or at least one fungus and / or at least one tree nut, mixtures of at least two protein substrates of plant origin, possibly thermally sterilized and / or at least partially skimmed milk, in particular cow's, goat or sheep's milk, with the exception of milk from e yak for said fermentate not ultrafiltered at a cut-off threshold of 10kDa, mixtures of at
  • the fermentate obtained by anaerobic fermentation of yak milk by a strain according to the first or the third aspect of the invention and ultrafiltered at a cutoff threshold of 10 kDa is respectively part of the fermentates according to the first and the third aspect of the invention.
  • the fermentate obtained by anaerobic fermentation of mare's milk and ultrafiltered at a cut-off threshold of 10 kDa is part of the fermentates according to the second aspect of the invention.
  • said food or pharmaceutical composition according to the third aspect of the invention contains a concentration of at least one of said strains and preferably only one of said strains, in particular the strain Lactobacillus delbrueckii ssp.
  • bulgaricus VF50b equal to or greater than 10 7 CFU per gram and / or a concentration of peptides which are identical or different and chosen from peptides of sequence SEQ ID NO 87 to SEQ ID NO 199, greater than or equal to 4 mg per gram.
  • the present invention also relates to a product chosen in particular from food products, in particular fermented milks, juices of fruit (s) and / or vegetable (s) optionally fermented, vegetables and / or fermented fruits, fermented mushrooms, cold meats, food preparations based on fish (s) and dairy products obtained from possibly skimmed milk, in particular from cow, goat, sheep with the exception of yak milk, or from a mixture of milks, which characteristically contains at least one strain according to the third aspect of the invention and / or at least one peptide according to the third aspect and / or at least one mixture of peptides according to the third aspect and / or one food or pharmaceutical composition according to the third aspect of the invention.
  • food products in particular fermented milks, juices of fruit (s) and / or vegetable (s) optionally fermented, vegetables and / or fermented fruits, fermented mushrooms, cold meats, food preparations based on fish (s) and dairy products obtained from possibly skimmed milk, in particular from
  • the present invention also relates to a food supplement suitable for a subject, in particular a human or an animal in particular chosen from cats, dogs, poultry, sheep, goats, cattle, reptiles, in particular.
  • the iguana which characteristically comprises at least one strain according to the third aspect and / or at least one peptide according to the third aspect and / or at least one mixture of peptides according to the third aspect and / or a food or pharmaceutical composition according to the third aspect of the invention.
  • the food or pharmaceutical composition is in the form of a liquid. A volume of 30 ml of this composition containing 0.2 g of peptides are administered daily, orally.
  • the present invention relates to a mixture of at least two strains chosen from the strains of Lactobacillus helveticus exhibiting the prtH2 and p rtH3 genes and capable of reducing the pH of milk, in particular cow's milk, by anaerobic fermentation.
  • bulgaricus exhibiting the prtB gene in particular the strain of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b deposited with the CNCM under the order number CNCM-l-5316, capable of reducing by anaerobic fermentation the pH of milk, in particular of cow's milk to a value substantially equal to or less than 4.55 and in particular equal to 4.51 after 48 hours at 37 ° C and exhibiting a parietal hydrophobicity of at least 35% and / or capable of increasing the absorption of calcium by the intestinal cells and in particular the mixtures of the three strains VF45A, VFH049 and VF50b.
  • the invention relates to a mixture of peptides chosen from mixtures comprising peptides of sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 199, mixtures containing peptides of sequence SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 5, peptides of sequence SEQ ID NO 44 to SEQ ID NO 86 and peptides of sequence SEQ ID NO 87 to SEQ ID NO 1 12.
  • the invention also relates to an isolated peptide chosen from the peptides of sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 199 or a mixture according to the fourth aspect of the invention for its use as a medicament and in particular in the treatment of hypocalcemia or in the treatment of a pathology caused by a deficiency in calcium absorption and in particular chosen from arterial hypertension, metabolic syndrome, osteoporosis or in the treatment of hypocalcemia induced by a pathology chosen from autoimmune hypoparathyroidism, vitamin-D hypocalcemic rickets dependent, progressive bone heteroplasia, isolated hypoparathyroidism, syndromic hypoparathyroidism, pseudo-hypoparathyroidism and hypo-deficiency rickets, diseases caused by an abnormality in the regulation of calcium levels due to dysfunction of the parathyroid hormone, absorption of vitamin D or how the calcium receptor works.
  • the invention relates to a food or pharmaceutical composition which contains a pharmaceutically acceptable excipient or a medium suitable for ingestion and at least one peptide as mentioned above or a mixture of peptides according to the fourth aspect of the invention and / or a mixture of strains according to the fourth aspect of the invention.
  • the invention also relates to a product chosen from food products, in particular fermented milks, fruit juice (s) and / or vegetable juice (s) optionally fermented, vegetables and / or fermented fruits, fermented mushrooms, cold meats, food preparations based on fish (s) and dairy products obtained from possibly skimmed milk, cow, goat, sheep or a mixture of milk which contains a mixture of strains according to the fourth aspect of the invention and / or at least one mixture of peptides according to the fourth aspect of the invention and / or a food or pharmaceutical composition according to the fourth aspect of the invention.
  • a product chosen from food products in particular fermented milks, fruit juice (s) and / or vegetable juice (s) optionally fermented, vegetables and / or fermented fruits, fermented mushrooms, cold meats, food preparations based on fish (s) and dairy products obtained from possibly skimmed milk, cow, goat, sheep or a mixture of milk which contains a mixture of strains according to the fourth aspect of the invention and
  • the food or pharmaceutical composition contains a concentration of said strains equal to or greater than 10 7 CFU per gram of product and / or a concentration of peptides which are identical or different greater than or equal to 4 mg per gram.
  • milk in the absence of precision, refers to cow's milk.
  • yogurt refers to a dairy product produced by fermentation by adding lactic acid bacteria Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
  • milk refers to a dairy product obtained by coagulation of caseins following the addition of a lactic acid ferment to milk.
  • fertilizate designates the supernatant obtained at the end of the fermentation.
  • increase calcium absorption refers to the ability of the strain or peptides to increase the overall passage of calcium through the intestinal wall of a mammal (between cells of the latter due to increased expression of the cld-2 gene, for example), or to increase fluorescence in Caco-2 cells as indicated in the experimental part (greater passage of calcium through the cells of the intestinal wall) or to increase the expression of at least one gene chosen from trpv6, and vdr in intestinal cells as indicated in the experimental part of the present application (better absorption by the cells themselves).
  • the terms “acid resistant” refer to class 3 indicated in the experimental part of this application with reference to the acidity resistance.
  • the term “probiotic” refers to a microorganism capable of surviving in the intestine of a host, especially a human, and of interacting with the cells of the intestinal wall and / or of interacting with other microorganisms living in it. intestine of the host and exert a beneficial effect on the health of the host.
  • hypocalcaemia refers to a concentration of calcium in the blood, corrected with the level of albumin less than 2.20 mmol / L.
  • active ingredient means that the ingredient considered (peptide, mixture of peptides and / or strain) is contained in a quantity / concentration making it possible to obtain a technical effect at least in vitro on the inhibition of ACE and / or on calcium absorption.
  • subject refers to a human or an animal, especially a mammal (in particular, a dog, a cat, a poultry, a sheep, a bovine, a goat or a reptile).
  • treatment encompasses both preventive (prophylactic) treatment and treatment allowing improvement of at least one symptom of the pathology in question.
  • Percent identity refers to the percentage of identical amino acid residues between the sequence to be compared and the reference sequence, aligning the entire sequence compared to the reference sequence.
  • the protein sequence which has a% identity with the reference sequence can thus comprise insertions or deletions.
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical amino acid residue is observed for the two sequences compared, then dividing the number of positions for which there is identity between the two nucleic bases, or between the two amino acid residues, by the total number of positions in the comparison window, then by multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage identity in nucleotides or in amino acids of the two sequences between them.
  • the peptides defined by their% identity can thus comprise one or more deletions and / or one or more substitutions, the insertion or the substitution with a dextrorotatory amino acid, the replacement of the terminal carboxylic acid group and / or of the terminal amine group.
  • a protective group for example, the introduction of a retro-type bond (that is to say a peptide bond -NH-CO- resulting from the reaction between the amine function of the first amino acid in the sequence with the carboxylic acid function of the next amino acid in the same sequence) or the introduction of a retro-inverso type bond (that is to say the introduction of a peptide bond of the aforementioned retro type with a amino acid in the reverse configuration than that of the amino acid in the reference sequence) or have a longer chain of amino acids.
  • a retro-type bond that is to say a peptide bond -NH-CO- resulting from the reaction between the amine function of the first amino acid in the sequence with the carboxylic acid function of the next amino acid in the same sequence
  • a retro-inverso type bond that is to say the introduction of a peptide bond of the aforementioned retro type with a amino acid in the reverse configuration than that of the amino acid in the reference sequence
  • peptides may or may not be phosphorylated.
  • a pharmaceutical composition is defined as being a composition containing an active ingredient and a pharmaceutically acceptable excipient and in particular chosen from water, oils, alcohols, in particular ethyl alcohol, vegetable oils, cyclodextrins, starch, maltodextrin, lactose, sucrose, propylene glycol and physiological saline.
  • peptide when it is used with reference to one or more peptides indicates that the mixture or the composition contains as peptide (s) only the peptides mentioned with the exception of other peptides but other compounds or constituents. such as solvents, vitamins, proteins or the like may be present.
  • a "suitable for ingestion medium” means any mixture or substance regardless of its physical phase which can be ingested and digested without causing any problem to the digestive tract.
  • the pharmaceutically acceptable excipients and in particular the examples cited in the present application are media capable of being ingested. Throughout the present application, the sequences are conventionally indicated in the direction of their N terminal end towards their C-terminal end.
  • strain VFH049 can also be called VF49d.
  • strain refers without distinction to the living strain, that is to say capable of developing in a suitable nutrient medium and to the inactivated strain, that is to say dead. and therefore unable to develop in an environment suitable for its development.
  • FIG. 1 shows electron microscopic photographs of each of the three strains of the invention; the leftmost photograph represents the VF45A strain, the middle one the VFH049 strain and the right one the VF50b strain.
  • FIG. 2 represents the map obtained by PCR which evaluates the correlations between the proteolytic activity on agar-milk, the growth during a fermentation in liquid medium (milk), the pH at the end of the fermentation, the quantity of peptides produced and 5 other criteria linked to the analysis of the chromatographic profiles of the peptides produced by the strains (distribution in apparent molecular weights);
  • FIG. 3 represents the IC 50 in mg / mL for the ACE inhibitory activity of the control and of the crude fermentates obtained by fermentations of the strains VF45A and VFH049;
  • FIG. 4 represents the IC 50 in mg / mL for the ACE inhibitory activity of the control and of the fermentates obtained by fermentations of the strains VF45A and VFH049 and having undergone an ultrafiltration;
  • FIG. 5 represents the calcium absorption rate (ratio of fluorescence emission / basal emission) of the control and crude fermentates obtained by fermentations of strains VF45A and VFH049;
  • FIG. 6 represents the calcium absorption rate (ratio of fluorescence emission / basal emission) of the control and of the fermentates obtained by fermentations of strains VF45A and VFH049 and having undergone ultrafiltration;
  • FIG. 7 represents the level of mRNA of the trpv6 gene relative to that of the PBS condition of the crude fermentates obtained by fermentations of the VF45A and VFH049 strains
  • FIG. 8 represents the level of mRNA of the trpv6 gene relative to that of the PBS condition of the fermentates obtained by fermentations of the VF45A and VFH049 strains and having undergone an ultrafiltration
  • FIG. 9 represents the percentages of wall hydrophobia obtained for the strains tested according to their acid tolerance class.
  • FIG. 10 represents the level of mRNA relative to the control of the vdr, trpv6 and cld-2 genes obtained after 24 hours of contact with the VFH049 strain and the VF50b strain with HT-29 MTX cells.
  • the three strains of the invention were extracted from different dairy products.
  • Samples of each dairy product are collected in sterile tubes, kept at 4 ° C for a maximum of two days before analysis.
  • the samples are subjected to a series of dilutions in saline buffer (0.85% NaCl solution), then spread on MRS-agar plates (De Man, Rogosa and Sharpe).
  • the plates are incubated for 48 hours at 37 ° C. in an anaerobic medium.
  • the morphologically distinct colonies are separated, subcultured onto plates of the same medium for purification. In order to ensure the purity of the isolates, the re-plating is repeated at least three times.
  • Table 1 below shows the dairy products from which the strains were extracted. All of these dairy products come from Mongolia and were prepared in the fall. Optical microscope observations are made to determine the shape of bacteria. These observations are visible in Fig. 1.
  • the Gram of each strain is determined in a conventional manner by the Gram staining technique and observation under a microscope.
  • the test for catalase is carried out for each strain in a conventional manner by removing each strain from an agar medium and bringing it into contact with hydrogen peroxide.
  • the Lactobacillus helveticus VF45A strain was deposited by the Applicant on March 29, 2018 with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms), at 25 rue du Dondel ROUX 75724 Paris Cedex 15 under the order number CNCM-l- 5300 (deposit according to the Budapest Treaty).
  • the Lactobacillus helveticus VFH049 strain was deposited by the Applicant on February 19, 2019 with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms), at 25 rue du Dondel ROUX 75724 Paris Cedex 15 under the order number CNCM-l- 5403 (deposit according to the Budapest Treaty). In the remainder of the application, this strain is also called VF49d.
  • strain Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b was deposited by the Applicant on April 20, 2018 with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms), at 25 rue du Dondel ROUX 75724 Paris Cedex 15 under the order number CNCM-l-5316 (deposit according to the Budapest Treaty).
  • VF45A and VFH049 strains are indeed strains of the species Lactobacillus helveticus.
  • VF50b strain is indeed a strain of the species Lactobacillus. delbrueckii ssp. bulgaricus.
  • the identification of the parietal proteases present in the selected strains is carried out by PCR detection of the genes encoding these enzymes.
  • the bacterial cells are recovered from the cultures in skimmed milk, the bacterial DNA is then isolated using a wizard genomic DNA purification kit (Promega, Madison, United States).
  • the CNRZ32 CIRM-BIA 103 strain of Lactobacillus helveticus (supplied by the International Center for Microbial Resources - Bacteria of Food Interest, CIRM-BIA, INRA, Rennes, France) was used as a control for the genes of Lactobacillus helveticus.
  • This strain (CNRZ32) is known to have the 4 prtH genes (prtH1 to prtH4).
  • Each strain is tested for 5 pairs of primers corresponding to 5 different genes, namely, prtB, prtH1, prtH2, prtH3 and prtH4.
  • the primers described by Hou et al., 2015 are used for the detection of prtB in Lactobacillus delbrueckii. Concerning the strains of Lactobacillus helveticus, the primers described by Genay et al., 2009 are used for the detection of the prtH1 and prtH2 genes and finally those described by Broadbent et al., 201 1 for the detection of prtH3 and prtH4.
  • the PCR reactions are carried out in a final volume of 25 mL comprising 12.5 mL of PCR Master Mix (2x) (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA), 2 mL of each primer (12.5 pM), 2 mL of Bacterial DNA extracted (approximately 200 ng.mL -1 ) and 6.5 mL of H2O.
  • the PCR cycles are carried out in a thermocycler labcycler (SensoQuest, Gôttingen, Germany).
  • the results are shown in Table 2 below.
  • the prtB gene is detected for the VF50b strain of Lactobacillus delbrueckii but not in the VF45A and VFH049 strains of Lactobacillus helveticus.
  • the prtH1 gene is detected for Lactobacillus helveticus strain VFH049 and in the control.
  • other strains (not shown) were tested and it turns out that all Lactobacillus helveticus strains exhibiting the prtH1 gene were isolated from fermented mare's milk.
  • the prtH2 and prtH3 genes are detected in Lactobacillus helveticus strain VF45A and in the control.
  • the prtH4 gene is detected in the control, but not in the strains tested.
  • the tests used cover both fermentation capacity (speed of growth, acidification) and proteolytic activity (ability to hydrolyze proteins).
  • the two aspects are largely related, the ability of bacteria to grow depends on their ability to hydrolyze proteins (since they need the amino acids released during hydrolysis to ensure their growth). It is also already known that the acidification of the medium and the hydrolysis of proteins are correlated.
  • the strain is cultivated in MRS medium (Man, Rogosa, Sharpe agar) liquid for 48 h at 37 ° C under anaerobic condition.
  • MRS medium Man, Rogosa, Sharpe agar
  • the bacterial cells are then washed twice in MRS medium and then finally re-suspended in a volume of MRS medium making it possible to obtain an ODeoo equal to 1 (Prim spectrophotometer, Secomam, Groupe Aqualabo, Champigny, France).
  • a volume of 20 mL of the bacterial suspension is placed in the milk agar wells.
  • the inoculated plates are then incubated for 72 hours at 37 ° C. under anaerobic conditions.
  • the proteolytic activity of the strains is quantified by measuring the diameter (expressed in mm) of the halos appearing around the wells after incubation.
  • a pre-culture of 5 mL is carried out in a medium composed of 100% UHT skimmed milk (Cora, Paris, France), for 72 hours at 37 ° C, in anaerobic condition .
  • the strain is then inoculated into a final volume of 30 mL of the same medium, with an initial OD 600 of 0.3.
  • the cultures take place for 48 hours at 37 ° C. in anaerobic condition.
  • NI Milk uninoculated milk medium
  • the acidity of the medium is evaluated by measuring the pH with a pH meter (Mettler Toledo, G accommodatesee, Switzerland).
  • the peptides produced during the fermentation of the strains are analyzed by two methods.
  • the peptide concentrations are evaluated first by assaying with the Folin-Ciocalteu reagent (FC); peptides are also analyzed according to their apparent molecular weight distribution by size exclusion chromatography (SEC).
  • FC Folin-Ciocalteu reagent
  • SEC size exclusion chromatography
  • a 4 mL sample is taken and then mixed with a volume of 400 mL of a solution of trichloroacetic acid (TCA) at a concentration of 10% (m / v) to reach a final concentration in TCA of 1%.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the addition of such a concentration of TCA allows the precipitation of high molecular weight proteins. After centrifugation at 10,000 rpm for 10 min, the supernatant containing the peptides is recovered.
  • the peptides are then purified from the supernatant in order to remove the TCA, the sugars, and the salts.
  • the purification is carried out by a solid phase extraction (SPE), the principle of this method is a separation of the compounds of a mixture by selective adsorption on a solid phase.
  • Bond Elut C 18 1000 mg
  • micro-columns Align Technologies, Santa Clara, USA
  • Bond Elut C 18 1000 mg
  • micro-columns Alent Technologies, Santa Clara, USA
  • these are columns composed of a solid phase of silica grafted with C 18 groups allowing the retention of hydrophobic compounds.
  • the columns are equilibrated by passing a minimum volume of 10 mL of a 100% acetonitrile (ACN) solution supplemented with 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) (v / v). After rinsing the column with an H 2 O solution containing 0.1% TFA (v / v), a volume of 4 ml of supernatant containing the extracted peptides is then loaded onto the column. A new rinse with I ⁇ 2O supplemented with 0.1% TFA makes it possible to elute all compounds not retained by the column.
  • ACN acetonitrile
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptides retained are finally eluted in a volume of 2 ml of an ACN solution at 80% (v / v), 20% H 2 O (v / v) and containing 0.1% TFA.
  • the samples are then stored at -20 ° C until analysis.
  • the extracted peptides are quantified by an assay with the Folin-Ciocalteu reagent (FC). It is a solution of sodium tungstate and molybdate prepared in phosphoric and hydrochloric acids. The complex of phosphotungstic acid and phosphomolybdic acid of yellow color is reduced by residues of tyrosine, tryptophan, cysteine or by peptide bonds in an alkaline medium to give a blue color. The appearance of the blue color, proportional to the peptide concentration, is followed by spectrophotometry.
  • FC Folin-Ciocalteu reagent
  • the reaction is carried out in a final volume of 800 mL comprising 200 mL of extracted peptides, 500 mL of a 500 mM sodium carbonate solution (NaHCOa) and 100 mL of Folin-Ciocalteu reagent (Sigma- Aldrich, St Louis, USA).
  • the reaction is incubated at 37 ° C. in the dark for 30 min, then the OD at 750 nm of the mixture is measured by a Prim spectrophotometer (Secomam, Groupe Aqualabo, Champigny, France).
  • the blank is produced from the solution used to elute the peptides from the SPE columns (80% ACN, 20% H 2 O, 0.1% TFA).
  • the concentration in the samples is determined by a standard range of a commercial peptide solution (peptide digest assay standard, ThermoFisher Scientific, Waltham, USA).
  • SEC size exclusion chromatography
  • a volume of 25 mL of sample is eluted isocratically in a solvent composed of 30% ACN (v / v), 70% H 2 O (v / v) and 0.1% TFA (v / v), at a flow rate of 0.5 m L / min for 60 min.
  • a UV detector at 214 nm allows the detection of peptide bonds.
  • the amount of peptides in the samples is analyzed by integration profiles obtained by SEC. Two ranges of molecular weights were chosen for the integrations, the first for peptides with an apparent molecular weight greater than 1,700 Da (called PHPM, high molecular weight peptides) and the second for peptides with an apparent molecular weight less than 1.
  • PBPM low molecular weight peptides
  • the quantity of peptides belonging to each size class is expressed either as a percentage of the total area of the chromatogram (% PHPM and% PBPM), or as a percentage of the area of the chromatogram obtained for the uninoculated milk control condition (% PHPM / NI Milk and% PBPM / NI Milk).
  • Lactobacillus helveticus VF45A strain is one of the most effective strains with a final peptide concentration greater than 6 g / L (see Table 3 below).
  • the molecular weight of the peptides generated was analyzed by SEC as mentioned above.
  • the quantity of peptides belonging to each size class (less than or greater than 1 .700 Da) is expressed either as a percentage of the total area of the chromatogram (% PHPM and% PBPM), or as a percentage of the area of the chromatogram obtained for the non-inoculated milk control condition (% PHPM / Milk NI and% PBPM / Milk NI). Inoculation and fermentation lead to an increase in low molecular weight peptides compared to the control (1.5 times on average for strains of Lactobacillus delbrueckii, 4.2 times on average for Lactobacillus helveticus).
  • PCA Principal component analyzes
  • PCR analysis took into account 9 quantitative parameters: the proteolytic activity on agar-milk, the growth during fermentation in a liquid medium (milk), the pH at the end of the fermentation, the quantity of peptides produced, and 5 other criteria related to the analysis of the chromatographic profiles of the peptides (distribution in apparent molecular weights.
  • Fig. 2 shows the map obtained.
  • the principal components Dim1 and Dim2 represent 60.82% and 23.56% of the total variance, respectively.
  • a correlation positive is observed between the pH value and high molecular weight peptides.
  • growth is correlated with a series of variables related to the production of peptides (quantification by FC reagent,% PBPM,% PBPM / NI Milk) and the diameter of the proteolysis halo pH value and high molecular weight peptides are negatively correlated with variables such as growth, proportion of PBPM and halo of proteolysis.
  • Each strain is cultivated in a 500 mL bioreactor (MiniBio 500, my-Control, Applikon Biotechnology, Delft, the Netherlands).
  • the medium consists of skimmed milk (10 g / L (see previous paragraph), autoclaved for 30 min at 110 ° C.
  • the strain is inoculated with an OD 600 equal to 0.3.
  • the fermentation is carried out for 72 hours at a constant temperature of 40 ° C. with stirring at 300 rpm in a final volume of 330 mL.
  • the anaerobic condition is obtained by injecting N2 into the bioreactor at a flow rate of 20 mL / min.
  • the bacterial pellet is resuspended in 1 ml of PBS buffer for measurement of the DOooo in order to evaluate the bacterial growth. After 72 hours of fermentation, all of the fermentate is recovered and then centrifuged at 10,000 rpm for 10 min, the supernatant is then stored at -20 ° C until analysis. The concentration of dry matter in the fermentates is measured in a desiccator (XM60, Précisa, Poissy, France) and is always equal to 100 g / L. In order to be able to confirm the impact of bacterial fermentation on the properties of the final product, a control is carried out (CTLF). This is the fermentation medium incubated under the same conditions but not inoculated. After 72 hours of incubation, this medium is centrifuged and stored like the other fermentations. Identification of peptides produced during fermentation at controlled pH
  • part of the crude fermentate is fractionated by means of an ultrafiltration membrane.
  • the membrane is a Hydrosart® cassette (Sartocon® Slice Hydrosart® Cassette, Sartorius, Gôttingen, Germany) of 0.1 m 2 with a cutoff threshold of 10 kDa connected to a Sartocon® Slice 200 Hôlder system (Sartorius, Göttingen, Germany ).
  • the fermentate is fed by a peristaltic pump and the pressure of the retentate is maintained at approximately 1 bar during filtration.
  • the ultrafiltration permeate (UFP) containing molecules less than 10 kDa is separated from the retentate (UFR).
  • the two sub-fractions are then stored at -20 ° C until analysis.
  • the ultrafiltration permeates are dried to 10% of the initial volume by centrifugal evaporation (miVac, Gene Vac, Ipswich, United Kingdom) for 15 h at 40 ° C.
  • the concentration of dry matter in the products is then measured in a desiccator (XM60, Précisa, Poissy, France).
  • the peptides purified by SPE from the culture supernatants are dried by centrifugal evaporation (miVac, Gene Vac, Ipswich, United Kingdom) for 2 h at 40 ° C then resuspended in 100 mL of H 2 O containing 0.1% TFA (v / v) and centrifuged for 10 min at 8,000 rpm.
  • Ten microliters of sample are injected onto a C 18 -Kinetex column (150 x 4.6 mm, 2.6 miti, 100 A, Phenomenex, Torrance, USA), connected to an Ultra Performance Liquid Chromatography chromatography system. (UPLC) Acquity (Waters, Manchester, United Kingdom).
  • a linear gradient of ACN containing 0.1% formic acid (FA) (v / v) is used (from 5 to 15% ACN for 30 min, then from 15 to 30% ACN for 60 min , from 30 to 50% ACN for 10 min and finally from 50 to 95% ACN for 10 min) with a flow rate of 500 mL.min -1 .
  • the UPLC eluents are sprayed directly by electrospray at a voltage of 3 kV, the desolvation is carried out by using dinitrogen (N2) at a flow rate of 600 Lh -1 at a temperature of 300 ° C.
  • N2 dinitrogen
  • the chromatographic system is coupled to a Synapt-G2-Si mass spectrometer (Waters, Manchester, UK).
  • MS measurements are made in data depend mode (data depend analysis, DDA) and the data are recovered in a mass range from 100 to 2000 m / z.
  • a maximum of 15 precursor ions with an intensity threshold of 10,000 are selected for fragmentation by the collision-induced dissociation (CID) method at a power of 8 to 9 V for low masses and a power of 40 to 90 V for the high masses.
  • MS / MS spectra are recovered in a mass range from 100 to 2000 m / z.
  • the spectra are processed by Mass Lynx software (version 4.1.) (Waters, Manchester, United Kingdom). Analysis of the control sample (CTLF) allowed the basic heterogeneity to be defined.
  • CID collision-induced dissociation
  • 596 peptides from 22 milk proteins (as-i-casein, b-casein, as2-casein, GLYCAM1, k-casein, BTN1 A1, b-lactoglobulin, FGFBP, lactoperoxidase, osteopontin, perilipine, collagen a2, TRIP6, NPT2B , acylCoA desaturase, dysferlin, COG8, B4GT1, PSME4, DHX9, RALYL and apolipoprotein A2) were identified in this sample. 32% of them come from b-casein. By comparison, between 150 and 722 peptides were identified in the samples fermented by the different strains tested.
  • ⁇ -casein peptides represent 44-67% of all sequences identified. Due to the preponderance of b-casein peptides among the identified peptides, and the natural abundance of b-casein in milk, only peptides derived from b-casein will be studied. The peptides produced by the strains of the invention are therefore all derived from the proteolysis of b-casein in cow's milk.
  • the database search is carried out using Peaks Studio software (version 7.0.) (Bioinformatics Solutions, Waterloo, Canada) using the UniProt database (May 15, 2017) restricted to the complete proteome of the species Bos taurus.
  • the tolerance thresholds for the masses of precursor ions and fragments are defined at 35 ppm and 0.2 Da.
  • the peptide sequences identified by the software are filtered according to a false discovery rate strictly less than 1%. For all the strains, the peptides identified come from the fermentate which has not undergone ultrafiltration. These same peptides should also be found in view of their mass in the ultrafiltered fermentate.
  • Table 4 groups together the non-phosphorylated peptides considered to be new which are produced by the strain VF45A according to the fermentation method indicated above at pH 6.
  • Table 5 groups together the phosphorylated peptides considered to be new which are produced by the strain VF45A according to the fermentation method indicated above at pH 6.
  • Table 6 below groups together the non-phosphorylated peptides considered to be new which are produced by the strain VFH049 according to the fermentation method indicated above at pH 6.
  • Table 7 groups together the phosphorylated peptides considered to be new which are produced by the strain VFH049 according to the fermentation method indicated above at pH 6.
  • Table 8 groups together the non-phosphorylated peptides considered to be new which are produced by the VF50b strain according to the fermentation method indicated above at pH 6.
  • Table 9 groups together the phosphorylated peptides considered to be new which are produced by the strain VF50b according to the fermentation method indicated above at pH 6.
  • Fermentates (before and after ultrafiltration) were tested for two biological activities, namely ACE inhibition and the ability to modulate calcium absorption. Furthermore, the toxicity of the hydrolysates was evaluated. For the analyzes, the various samples are diluted in I ⁇ 2O at a concentration of 15 g / L of dry matter.
  • the aim of this experiment is to test the possible toxicity of fermentates towards intestinal cells.
  • Cell viability is measured by the use of the CCK-8 reagent (Cell Counting Kit-8), this method is based on the reduction of a tetrazolium salt by cellular dehydrogenases producing formazan, the formation of which is followed at 450 nm .
  • the Caco-2 cells are seeded in a 96-well plate at a density of 8,000 cells per well in a volume of 200 mL of complete DMEM medium, and cultured for 7 days at 37 ° C., 5% CO2.
  • the fermentates are diluted in complete DMEM medium at a concentration of 5 and 10 g / L.
  • PBS buffer also diluted in DMEM medium (same dilution factor as the samples) is used as a control.
  • a volume of 150 mL of sample is placed in each well, followed by incubation for 7 or 24 hours at 37 ° C., 5% CO2. After incubation, the Caco-2 cells are washed twice with PBS buffer then a volume of 150 ml of complete DMEM medium supplemented with 5% (v / v) of CCK-8 reagent (Sigma-Aldrich, St Louis, United States ) is added to each well.
  • the plate is then incubated for 2 h at 37 ° C., 5% CO2 in the dark, then read at 450 nm with a Xenius XC spectrofluorimeter (Safas Monaco, Monaco, France). Cell viability is calculated relative to the absorbance obtained for the control wells (corresponding to 100% viable cells).
  • a concentration of 5 g / L the crude fermentates (unfiltered) of each of the strains of the invention exhibit no toxicity towards the Caco-2 cells even after 24 hours of contact. The same observation is made for a concentration of 10 g / L of dry matter.
  • the ultrafiltered fermentates of each of the strains also do not exhibit cytotoxicity.
  • the aim is to study the inhibitory potential of fermentates towards CEA. It is based on the use of a fluorescent substrate, o-aminobenzoyl-Gly-p-nitro-L-Phe-Pro (Abz-Gly-Phe (NO2) -Pro). Hydrolysis of this substrate by ACE generates the Abz-Gly fluorophore moiety which can be followed by excitation and emission wavelengths of 355-375 nm and 400-430 nm respectively. The samples, the enzyme and the substrate are prepared and diluted in Tris-HCl buffer (150 mM) at pH 8.3 to the desired concentrations.
  • Tris-HCl buffer 150 mM
  • the hydrolysis reaction is carried out in a 96-well plate in a final volume of 300 mL comprising 50 mL of sample or Tris-HCl buffer (for the negative inhibition control), 50 mL of an ACE solution ( 0.05 U / mL) (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) and 200 mL of Abz-Gly-Phe (NC> 2) -Pro (0.45 mM) substrate (Bachem, Bubendorf, Switzerland). A control not containing enzyme (replaced by Tris-HCl buffer) is also produced.
  • the plate is then incubated at 37 ° C for 1 h, fluorescence measurement takes place every 2 min with excitation and emission wavelengths of 365 and 415 nm respectively by a Xenius XC spectrofluorimeter (Safas Monaco, Monaco, France) equipped with a water bath at 37 ° C.
  • the percentages of inhibition and the IC50s of the different samples tested are calculated based on the negative inhibition control.
  • the crude fermentates exhibit IC 50 ranging from 12.76 mg / mL for the crude control fermentate to 0.56 mg / mL for the fermentate produced by the VF45A strain.
  • the IC 50 of the crude fermenta is 0.76 mg / mL.
  • the IC 50 are 8 mg / mL for the control, 0.47 mg / mL for the fermentate produced by the strain VF45A and 1.7 mg / mL for the fermenta produced by the strain VFH049.
  • the VF45A and VFH049 strains very significantly improve the capacity of the fermentates to inhibit ACE compared with the control. The same effect is obtained with ultrafiltered fermentates. Molecules of interest are therefore produced by the strains during fermentation and exhibit ACE inhibiting activity.
  • the QSAR approach used to determine the IC 50 of our peptides was used on the VPP and IPP peptides of the prior art. Their IC 50 is 26 mM, while some of the peptides of the invention exhibit an IC 50 value below 20 mM (up to 8.7 mM for the most active), and are therefore a priori more effective.
  • the QSAR approach used to determine the I C50 of the peptides of the invention was used on the VPP and IPP peptides described in the prior art. Their IC50 is 26 mM, while some of our peptides are below 20 mM (up to 8.7 mM for the most active), and are therefore a priori more effective.
  • Transcellular calcium transport is an active transport involving the incorporation of calcium into the intestinal cells by a transporter called TRPV6. Calcium is subsequently transported and excreted at the basal pole of the cell in the intestinal mucosa.
  • TRPV6 transporter
  • the ability of the fermentates to modulate the absorption of calcium was evaluated using Caco-2 cells.
  • the test consists of bringing the fermentates (concentration of 10 g / L) into contact with the Caco-2 cells for 7 hours. After contact, the incorporation of calcium by the cells is evaluated by using an intracellular probe capable of emitting fluorescence in the presence of calcium. After rinsing the Caco-2 cells, the FluoForte® probe is added following the instructions of the FluoForte® calcium assay kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, United States), the plate is then incubated at room temperature for 1 h, time to penetration of the probe.
  • the fluorescence emission is then monitored by a Xenius XC spectrofluorimeter (Safas Monaco, Monaco, France) with an excitation wavelength at 490 nm for emission followed at 525 nm.
  • the emission is measured for 30 sec with an injection of 25 mL of a 250 mM CaCL solution between 9 and 10 sec kinetics by means of an injector module coupled to the spectrofluorimeter.
  • This injection causes a sudden entry of calcium into the intestinal cells which leads to an increase in fluorescence emission.
  • the ability of bacterial strains to modulate the incorporation of calcium into cells is determined by this increase in fluorescence after injection of calcium.
  • the results are thus expressed for each well relative to the mean fluorescence measured between 0 and 9 sec of kinetics, considered as the basal fluorescence of a well. An increase in fluorescence ratio, for the various contact conditions, is therefore obtained.
  • the effect of the fermentates obtained with the VF45A and VFH049 strains is compared with that of the PBS buffer and that of the control fermentate.
  • the results show that the crude fermentates obtained with these two strains are capable of positively modulating the incorporation of calcium with respect to the PBS buffer and to the control (FIG. 5).
  • the ratio of fluorescence emission to basal emission is 1.08 for PBS, 1.23 for the control fermentate, 1.3 for the fermentate produced by the VF45A strain and 1.31 for the fermentate produced by the strain VFH049.
  • the effect is less pronounced for strain VF45a than for VF49d (Fig. 6). Nevertheless, a tendency towards increased absorption is observed for both strains.
  • the objective of this part is to evaluate the capacity of fermentates to modulate the expression of the trpv6 gene by intestinal cells.
  • An RT-qPCR approach is conducted using Caco-2 cells as a template.
  • the Caco-2 cells are seeded in a 24-well plate at a density of 40,000 cells per well in a final volume of 500 mL of complete DMEM medium and incubated for 15 days at 37 ° C, 5% CO2 with a change of medium every. the two days after 7 days of culture.
  • the fermentates are diluted in complete DMEM medium at a concentration of 10 g / L of dry matter. PBS buffer diluted in DMEM medium (same dilution factor as for samples) is used as a control.
  • RNA samples are first treated with DNase to remove any DNA fragments co-extracted and / or remaining following the extraction.
  • a volume of 8 mL containing 1000 ng of RNA is mixed with 1 mL of DNase, and 1 mL of DNase buffer (ThermoScientific, Waltham, United States).
  • the reaction takes place at 37 ° C for 30 min, it is stopped by adding 1 mL of 50 mM EDTA solution (ThermoScientific, Waltham, United States) followed by incubation at 65 ° C for 10 minutes. Subsequently, the samples were back-transcribed into cDNA using the RevertAid H minus first strand cDNA synthesis kit (ThermoScientific, Waltham, USA), according to the instructions provided. For the qPCR reaction, the cDNA samples are diluted (1/16) in H 2 O.
  • one cycle comprises denaturation at 95 ° C for 15 sec, hybridization of 58 or 60 ° C depending on the pair of primers used for 30 sec and an elongation at 72 ° C for 30 sec.
  • the realization of a melting curve ends the reaction.
  • the gene studied is the gene encoding the calcium transporter (transient receptor potential selective for calcium) (trpv6) also called CaT 1 (calcium transporter 1).
  • trpv6 transient receptor potential selective for calcium
  • CaT 1 calcium transporter 1
  • ppiA peptidylprolyl isomerase A
  • the fermentate samples were contacted with Caco-2 cells and changes in expression of the trpv6 gene were then studied by qPCR.
  • the fermentates obtained with the VF45A and VFH049 strains are capable of positively modulating the expression of the gene. More particularly, the fermentate produced by the strain VFH049 causes an overexpression of the gene 20 times greater than the control (Fig. 7). The effect of ultrafiltered fermentations is less pronounced, not significant even if a tendency to induce the gene is clearly visible for the two strains (Fig. 8). The fermentations produced by the two strains are therefore capable of modulating both the incorporation of calcium and the expression of trpv6 relative to unfermented milk. Study of probiotic characteristics
  • the significance of the results is assessed by a one-way analysis of variance (ANOVA) followed by a Tukey's test for multiple comparison of means.
  • ANOVA analysis of variance
  • Tukey's test for multiple comparison of means.
  • the post-ANOVA test is Dunn’s test resulting in a comparison to the mean of the control condition. The difference between the means is considered significant for a p value ⁇ 0.05.
  • the statistical tests were carried out under the R software (R core team, 2016, Vienna, Austria), on the R Commander package.
  • the principle of this test is based on the comparison of the survival of a bacterial strain between an incubation of 2 hours at pH 2 and an incubation at the pH of the MRS medium (pH 6.2).
  • each strain in the collection was cultured in liquid MRS medium for 24 hours at 37 ° C. in anaerobic condition.
  • a volume of 200 mL of culture was then diluted (1/10) either in the same MRS medium at pH 6.2 (called tube A), or in MRS medium adjusted to pH 2 with hydrochloric acid (HCl ) (called tube B).
  • Tubes A and B were incubated at 37 ° C. for 2 h then 10 ml of each tube were plated on MRS agar.
  • the inoculated dishes were incubated for 48 hours at 37 ° C. in anaerobic condition.
  • Acidity tolerance was assessed by comparing the number of colonies between plates A and B.
  • the strains were divided into different acid tolerance classes according to the result of the B / A ratio.
  • Class 0 includes strains that are not tolerant to acidity (no colony on box B).
  • class 3 corresponds to acid-tolerant strains (box B shows more than 80% of the colonies in box A).
  • strains were divided into 4 tolerance classes ranging from class 0 (non-tolerant strains) to class 3 (tolerant strains).
  • the objective of this test is to evaluate the hydrophobic character of the wall of the different strains.
  • a simple test has already been developed to assess this criterion, it is the MATS (Microbial Adhesion To Solvents) test. It consists in measuring the affection of a bacterial strain for an apolar hydrocarbon (most often n-hexadecane) in order to estimate the hydrophobicity of the wall.
  • MATS Microbial Adhesion To Solvents
  • the cells are then washed twice by successively repeating a centrifugation step at 10,000 rpm for 10 min, followed by a step of resuspending the cells in a phosphate buffered saline (PBS) buffer, pH 7.4.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Optical Density OD at 630nm ( initial OD 630nm ) was determined with an ELx808 spectrophotometer (BioTek Instruments Inc., Vermont, USA).
  • a volume of 1 mL of suspension was then mixed with 100 mL of n-hexadecane. (Acros Organics, Geel, Belgium) by creating a vortex in the mixture for 1 min.
  • the solution was then left to stand at room temperature for 15 min then 100 mL of the aqueous phase were recovered for a new determination of the OD at 630 nm (final OD 630nm ).
  • the wall hydrophobicity of the strains was calculated according to the following formula:
  • Fig. 9 represents the percentages of wall hydrophobia obtained for the strains tested according to their acidity tolerance class.
  • Fig. 9 we note that the VF50b strain does not tolerate acidity, which is not the case with the VFH049 strain.
  • This test makes it possible to evaluate the capacity of the strains to aggregate together in a liquid medium. It is based on the comparison of the bacterial concentration above a suspension at time 0 with the bacterial concentration of the same suspension incubated for a given time without any agitation. Strains capable of strong self-aggregation will aggregate between them, thus increasing their sedimentation rate.
  • the strains are cultured in MRS for 24 h at 37 ° C. then washed and resuspended in PBS buffer at an OD at 600 nm of 1. A volume of 4 mL of suspension is stirred so as to form a vortex for 10 sec and then incubated at room temperature without stirring.
  • The% aggregation of the VFH049 strain is 5.38% ⁇ 5.24 after 2.5 hours and 67.44% ⁇ 6.99 after 5 hours.
  • the% aggregation is 33.33% ⁇ 14.8 after 2.5 hours and 66.67% ⁇ 17.97 after 5 hours. The strains are therefore able to adhere to intestinal cells.
  • the bacterial cells are washed twice and then resuspended in PBS buffer at a concentration of 10 9 CFU / ml.
  • the buccal phase is simulated by adding 8 mL of PBS, adjusted to pH 6.8, to 1 mL of the bacterial suspension. The mixture is incubated with constant agitation at 200 rpm for 5 min at 37 ° C.
  • the gastric phase is simulated by adding 12 mL of PBS at pH 3 supplemented with bovine pepsin (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) at 1.56 mg / mL. The suspension is incubated for 2 hours at 37 ° C. with stirring at 200 rpm.
  • the pH of the solution is maintained between 3 and 3.5 by the addition of hydrochloric acid (HCl) (1 M) or sodium hydroxide (NaOH) (1 M).
  • HCl hydrochloric acid
  • NaOH sodium hydroxide
  • 1 M sodium carbonate 1 M sodium carbonate (NaHCO3) is added to the mixture in order to raise the pH to about 7 and inactivate the pepsin.
  • a sample of 100 mL of the reaction mixture is taken, thus for the same digestion, 4 samples are obtained comprising the sample of the mother tube (TM), of the salivary phase (S), of the gastric phase after 2 hours of incubation (G2), and finally that after 2 hours of intestinal phase (I2).
  • Each sample is then diluted (1/10) successively in PBS buffer.
  • 100 mL of the appropriate dilutions are spread on an MRS agar. The seeded plates are then incubated at 37 ° C. for 48 hours in anaerobic condition. After incubation, the count of CFUs allows the determination of the bacterial concentration in the samples.
  • the results are expressed in CFU / mL.
  • the initial number of viable bacterial cells is 10 9 CFU / mL in the salivary phase.
  • the quantity of bacteria decreases more or less depending on the strain, the gastric phase being the most deleterious for all the strains.
  • the VFH049 strain is present in an amount of 10 7 8 CFU / mL while the VF50b strain is present in an amount equal to 10 7 2 CFU / mL. Strains VFH049 and VF50b therefore tolerate gastrointestinal digestion.
  • the objective of this test is to assess the possible toxicity of the strains with respect to the intestinal barrier.
  • Caco-2 and HT-29 MTX cells are used for this purpose.
  • the cells are seeded in a 96-well plate at a density of 8,000 cells per well in a volume of 150 ml of medium and cultured for 7 days at 37 ° C., 5% CO 2.
  • the Intestinal cells are washed twice with PBS buffer.
  • the bacterial strains, for their part, are cultured as described above and suspended in DMEM medium without addition at a concentration of 10 7 CFU / ml. For each well, 150 mL of bacterial suspension is added.
  • PBS buffer diluted with DMEM without addition as for the strains, is used as negative control.
  • Contact between bacterial strains and intestinal cells takes place for 24 h at 37 ° C, 5% C02.
  • the strains are contacted with both Caco-2 cells and HT-29 MTX cells independently. Determination of intestinal cell mortality is used here to assess the possible toxicity of bacterial strains.
  • the mortality of the cells is evaluated by assaying the activity of lactate dehydrogenase (LDH). This activity is assayed by the LDH activity assay kit (Sigma-Aldrich, St Louis, United States).
  • this kit is based on the reduction reaction of oxidized Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) in its reduced form (NADH) by lactate dehydrogenase, NADH can be detected at 450 nm. After contact, 50 ml of supernatant are taken from each well and the LDH activity is assayed according to the kit protocol. The absorbance of the plate is read at 450 nm by a Xenius XC spectrofluorimeter (Safas Monaco, Monaco, France). The mortality of the intestinal cells is calculated as a percentage of the mean of the absorbances of the control condition (the proportion of LDH released in this condition is taken as a reference to 100%). For strains VFH049 and VF50b, the results show a lack of significant toxicity towards the two cell lines, which suggests that under these experimental conditions, the selected bacterial strains are not deleterious for the intestinal cells.
  • NAD oxidized Nicotinamide Adenine Dinucleotide
  • the objective of this test is to assess the ability of strains to adhere to intestinal cells. It is based on the comparison between the amount of bacterial cells adhering to the Caco-2 cell monolayer versus the amount of bacteria initially added.
  • the strains are cultivated and prepared as described above, a suspension in DMEM medium without addition is prepared at a concentration of 10 7 CFU / ml.
  • the Caco-2 cells are inoculated in 24-well plates at a concentration of 40,000 cells per well in a volume of 500 ml of complete DMEM. After incubation for 7 days at 37 ° C, 5% CO 2, the cells are washed twice with PBS buffer.
  • a volume of 300 mL of bacterial suspension is added to each well, the plate is then incubated at 37 ° C, 5% of C02, for 2 hours.
  • the bacterial suspension used is stored for determining the CFU concentration.
  • the Caco-2 cells are washed twice with PBS buffer in order to remove the non-adherent bacteria.
  • the intestinal cells are then lysed by adding 100 ml of PBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Triton X-100. After incubation for 15 min at room temperature, the lysate and the stock suspension used are successively diluted (1/10) in PBS, then spread on MRS agar. The inoculated plates are incubated for 48 hours at 37 ° C.
  • the percentage of adherent bacterial cells is calculated relative to the concentration obtained in the stock suspension representing the quantity of bacteria added at the start of the experiment (set at 100%).
  • The% of cells adhering to Caco-2 cells is 1.48 ⁇ 0.41 for the VFH049 strain and 0.18 ⁇ 0.13 for the VF50b strain. Strain VFH049 is much more adherent to intestinal cells which suggests that it is more likely to have a probiotic action.
  • This contact protocol is used for each technique used in this part.
  • the bacterial strains are cultured in MRS for 24 hours at 37 ° C. in anaerobic condition.
  • the cells are recovered by centrifugation at 10,000 rpm for 10 min and then resuspended in PBS buffer, this step is repeated a second time to wash the bacterial cells.
  • a bacterial suspension is finally prepared with DMEM medium without addition at a concentration of 10 7 CFU / mL.
  • the HT-29 MTX cells are inoculated in a 24-well plate at a concentration of 40,000 cells per well in a volume of 500 ml of complete DMEM.
  • the Caco-2 cells are seeded in a 96-well plate at a concentration of 8,000 cells per well in a volume of 200 mL of complete DMEM medium.
  • the Caco-2 cells are seeded on inserts placed in a 12-well plate (polyester membrane, 0.4 ⁇ m, Costar®, Corning, New-York, United States) on the apical side in a volume of 500 mL. of complete DMEM medium, a volume of 1,500 mL of this same medium is added to the basal side of the insert.
  • All the cell cultures are cultivated for 15 days with a renewal of the medium every 2 days during the second week of cultivation.
  • the intestinal cells are washed twice with PBS buffer before contact with the bacterial strains.
  • a volume of 150 ml of bacterial suspension is added to each well for a culture in a 96-well plate, and a volume of 300 ml is added for a contact in a 24-well plate or in inserts on a 12-well plate. In all cases, contact takes place for 24 h at 37 ° C, 5% C02.
  • the negative control used is a PBS buffer diluted in complete DMEM medium.
  • Total calcium transport is defined as the part of calcium passing from the apical pole to the basal pole by crossing the epithelial barrier. This transport is evaluated by the variation of the calcium concentration at the basal pole of the cell barrier over time.
  • Caco-2 cells cultured in inserts in a 12-well plate are used for this experiment.
  • 10 mL of a 250 mM solution of calcium chloride (CaCL) are added on the apical side of the insert.
  • 100 mL samples are taken from the basal side of the insert at 30 min, 7 and 24 h of contact. The samples are stored at -20 ° C until analysis.
  • TEER transepithelial electrical resistance
  • This resistance is measured by a MilliCell Electrical Resistance System volt / ohmmeter (Merck Millipore, Burlington, USA). An empty insert without cells is used as a blank to achieve cell barrier resistance. The resistance (in W) measured for each well is then multiplied by the area of the insert (equal to 1, 12 cm 2 for the insert used) to give a resistance in W.cm -2 . The results are expressed as a percentage of the value obtained at 30 min of contact (set at 100%) for each well.
  • an assay of the calcium concentration is carried out in the samples taken at the basal pole of the membrane of Caco-2 cells during contact.
  • the determination of the calcium concentration is carried out using the calcium colorimetry assay kit (Sigma-Aldrich, St Louis, United States). This kit is based on the colorimetric reaction between calcium ions and ortho-cresolphthalein forming a color complex that can be detected at 575 nm.
  • the assay is carried out using 25 mL of samples diluted (1/2) in I ⁇ 20 Milli-Q®, following the kit protocol.
  • the measurement of the absorbance of the samples at 575 nm is carried out by a Xenius XC spectrofluorimeter (Safas Monaco, Monaco, France).
  • the results show that the TEER increases over the incubation time with the strains as well as under the control condition (PBS buffer).
  • the strains of the invention do not make it possible to significantly modulate the absorption after 7 hours of contact compared to the PBS buffer.
  • the calcium concentration decreases in the basal compartment for the control condition, while a significant increase in the amount of calcium is observed for the VFH049 and VF50b strains.
  • RNA extraction is then carried out using the TRIzol TM reagent (Sigma-Aldrich, St Louis, United States). The RNA samples were first treated with DNase to remove any DNA fragments co-extracted and / or remaining following the extraction. A volume of 8 mL containing 1000 ng of RNA is mixed with 1 mL of DNase, and 1 mL of DNase buffer (ThermoScientific, Waltham, United States).
  • the reaction takes place at 37 ° C for 30 min in a Mastercycler gradient thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Germany), it is stopped by adding 1 mL of 50 mM EDTA solution (ThermoScientific, Waltham, USA). United) followed by incubation at 65 ° C for 10 min. Subsequently, the samples were back-transcribed into cDNA using the RevertAid H minus first strand cDNA synthesis kit (ThermoScientific, Waltham, USA), according to the instructions provided. For the qPCR reaction, the cDNA samples are diluted (1/16) in I ⁇ 20.
  • qPCR mixture For a volume of 2 mL of sample, 18 mL of qPCR mixture is added containing 10 mL of Power SYBR® Green PCR Master Mix (2x) (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, USA), 0.6 mL of each primer (10 mM) and 6.8 mL of H2O. Fluorescence is monitored during the reaction in a CFX Connect Real Time Detection System thermocycler (Bio-Rad, Hercules, USA).
  • the results are shown in Fig. 10.
  • the expression of the gene encoding the vitamin D receptor (vdr) is significantly increased in the presence of the VF50b strain; it is increased by 1.8 times relative to the PBS buffer.
  • the VFH049 strain it causes an increase in the expression of the gene encoding the calcium transporter (trpv6) at least 3 times greater than the control.
  • the VF50b strain is the only strain causing a 2.8-fold greater increase in expression of the cld-2 gene compared to the PBS buffer.
  • the growth and acidification properties of the VF50b strain are superior to those of other strains of the same species, which makes it a particularly interesting strain for the artisanal or industrial production of fermented dairy products (use as a fermentation starter) .
  • Table 15 compares the properties of the VF50b strain with those of other strains of the same species (tests carried out with cow's milk):
  • Strain VF50b can be used for making yogurt, for example.

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Abstract

La présente invention concerne la souche de Lactobacillus helveticus VF45A déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCM-l-5300, ses mutants et variants présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec le génome de ladite souche VF45A et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C. La présente invention concerne également des peptides isolés pouvant être obtenu par fermentation du lait, notamment de vache par la souche précitée. La présente invention concerne également la souche de Lactobacillus helveticus VFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCM-l-5403 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec le génome de ladite souche VFHD49 et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86 et/ou capables d'augmenter l'absorption intestinale du calcium. La présente invention concerne également un peptide isolé, un mélange de peptides et des produits et composition associés et la souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b déposée à la CNCM sous le numéro d'ordre CNCM-l-5316 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec le génome de ladite souche VF50b et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199 et/ou capables d'augmenter l'absorption intestinale du calcium. La présente invention concerne également un peptide isolé, un mélange de peptides et des compositions pharmaceutique et alimentaire associées.

Description

NOUVELLES SOUCHES DE BACTERIES LACTIQUES FAVORISANT L’ABSORPTION DU CALCIUM - PEPTIDES ET PRODUITS ASSOCIES
La présente invention concerne de nouvelles souches de bactéries lactiques ainsi que des peptides isolés et des mélanges de peptides issus de la b-caséine et produits par ces souches. Ces peptides sont actifs, soit en tant qu’inhibiteurs de l’ACE, soit comme agent favorisant l’absorption du calcium.
La présente concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique ainsi que des produits associés.
Le document WO 2007/096498 A1 décrit une nouvelle souche de bactérie lactique, plus précisément de Lactobacillus helveticus capable de produire par fermentation du lait deux tripeptides ayant des propriétés d’inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE). Ces deux peptides de séquences IPP et VPP sont connus pour inhiber l’ACE et permettent donc de réduire la pression sanguine et de lutter ainsi contre l’hypertension et les pathologies qui en découlent.
D’autre part, la publication intitulée « Bioactive peptide : production and functionality » de H. Korhonen et al et publiée dans International Dairy Journal vol 16, page 945 à 960 en 2006 passe en revue les peptides obtenus par hydrolyse des protéines laitières par des bactéries lactiques, et possédant une activité biologique ; cette publication décrit plusieurs peptides différents des peptides I PP et VPP, mais également connus en tant qu’inhibiteurs de l’ACE.
Par ailleurs, il est connu qu’outre son rôle dans la régulation de la pression sanguine, l’ACE est également impliquée dans les mécanismes de résorption/formation osseuse. En effet, l’article intitulé « Inhibition of angiotensin-converting enzyme exerts bénéficiai effects on trabecular bone in orchidectimozed mice » de X-F Chen, publié dans la revue Pharmacological reports 70, page 705-71 1 en 2018, indique qu’un inhibiteur de l’ACE, à savoir le captopril présente une activité de préservation osseuse.
S’agissant de l’absorption du calcium, la publication précitée de H. Korhonen cite des caseino-phospho-peptides connus pour améliorer l’absorption du calcium et du zinc. Elle cite notamment le produit de marque Capolac® qui contient un caseino-phospho- peptide (CPP) connu pour améliorer l’absorption des minéraux. S’agissant du mécanisme d’action, il semble que ces phospho-peptides sont connus pour se lier au calcium, le rendant ainsi biodisponible. Le document JP H0641 191 A décrit une souche de Lactobacillus helveticus qui produit des peptides, lesquels augmentent la solubilité du calcium. En revanche, ce document ne décrit aucune activité biologique des peptides pour l’absorption du calcium sur cultures cellulaires intestinales.
Par ailleurs, la publication « Recent advances in microbial fermentation for dairy and health » de D. Hill et al, publiée le 26 mai 2017 dans la revue in F 1000 Research fait également état de bactéries capables de produire par protéolyse des peptides bioactifs en tant qu’inhibiteur d’ACE. Elle indique de plus qu’un fructo-oligosaccharide peut être utilisé à titre préventif contre l’ostéoporose. Le mécanisme d’action de ce fructo- oligosaccharide est le suivant : dans le ventre du sujet, le fructo-oligosaccharide génère par fermentation des petites molécules d’acide, lesquelles diminuent le pH in vivo et entraînent la dissolution de phosphates de calcium qui seraient ainsi biodisponibles.
Une absorption insuffisante du calcium (hypocalcémie) peut conduire à différents symptômes ou pathologies telles que l'ostéoporose, l’hypertension artérielle ou le syndrome métabolique. En effet, le calcium est impliqué quel que soit l’âge du patient, dans la formation des os, la solidification du squelette, la rigidité des dents, la contraction musculaire et donc la contraction cardiaque, la transmission de l’influx nerveux au niveau des synapses, l’apprentissage et la mémorisation, la sécrétion salivaire, la croissance et la prolifération cellulaire. Le calcium permet d’activer de nombreuses enzymes, de libérer plusieurs hormones, de coaguler le sang et participe à l’équilibre du poids corporel. L’hypocalcémie est également liée à diverses pathologies rares telles que les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels et plus généralement les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium.
A ce jour, l’ostéoporose n’est pas traitée de manière efficace. Ainsi, les bisphophonates qui sont le traitement le plus utilisé, s’avèrent peu efficaces dans le cas de patientes qui présentent un faible risque de fracture. La prévention à travers la pratique régulière d’une activité physique, une alimentation équilibrée et la limitation du tabac et de l’alcool s’avère être plus efficace. Le document WO 2007/096498 A1 décrit une souche particulière de lactobacillus helveticus capable de produire des tripeptides inhibiteurs de l’ACE. La publication “characterization of angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of fermented milk produced by Lactobacillus helveticus” de Yongfu Chen publiée dans la revue J. Dairy Sci en 2015 décrit une souche de Lactobacillus helveticus dont le fermentat obtenu dans d’autres conditions de fermentation que celles utilisées pour la souche de l’invention inhibe l’ACE.
La publication intitulée “Peptide profiles and angiotensin-l-converting enzyme inhibitory activity of fermented milk products: effect of bacterial strain, fermentation pH and storage time” de Nielsen et al et publiée dans la revue « International Dairy Journal », indique qu’il est possible d’obtenir par fermentation d’une souche particulière de Lactobacillus helveticus d’obtenir un fermentat qui inhibe l’ACE. Ce document indique aussi que l’activité inhibitrice de l’ACE dépend grandement du pH obtenu à la fin de la fermentation.
La publication intitulée“Technological and probiotic potential of BGRA43 a natural isolate of Lactobacillus helveticus” de Ivana Strahinic publiée dans la revue « frontiers in microbiology » indique qu’une souche de Lactobacillus helveticus isolée à partir de l’intestin humain permet de fermenter le lait. Le lait fermenté permet de réduire les cytokines proinflammatoires.
La publication intitulée « proteolytic activity of probiotic strain Lactobacillus helveticus M92 » de Jasna Beganovic et al, publiée dans la revue « Anaerobe » décrit la souche M92 qui a un ecativité protéolytique particulière.
La publication intitulée « Fermentation characteristics and angiotensin l-converting enzyme-inhibitory activity of Lactobacillus helveticus isolate H9 in cow milk, soy milk and mare milk” de Wang et publiée dans la revue J. Dairy Sci. en 2015 indique que la souche H9 qui est une souche de Lactobacillus helveticus est capable de fermenter différents laits et de produire des tripeptides inhibiteurs de l’ACE.
La publication intitulée «Production of angiotensin-l-converting enzyme inhibitory peptides in fermented milk fermented by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SS1 and Lactobacillus lactis subsp. cremoris FTA D1” publiée dans la revue Applied Environmental Microbiology en septembre 2000 décrit une souche particulière de Lactobacillus delbrueckii qui par fermentation dans des conditions particulières produit des peptides inhibiteurs de l’ACE mais pas d’activité sur l’absorption du calcium. Le document EP 2 735 616 A cite une souche de Lactobacillus delbrueckii qui par fermentation dans des conditions particulières produit des peptides utiles pour les maladies causées par la réduction de l’activité cérébrale.
Le document WO 2008/002484 décrit une souche de Lactobacillus delbrueckii capable de produire par fermentation des peptides utiles pour le traitement des maladies inflammatoires du colon telles que la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique, le syndrome de l’intestin irritable et la diarrhée.
Un but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique résistante à la digestion gastro-intestinale et susceptible d’agir dans l’intestin en acidifiant le milieu, rendant ainsi le calcium soluble, afin de faciliter son absorption et son passage à travers la paroi intestinale.
Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique résistante à la digestion gastro-intestinale et susceptible de stimuler l’absorption du calcium par les cellules intestinales, en agissant directement ou indirectement sur celles-ci.
Un autre but de la présente invention est de fournir une souche de bactérie lactique qui a une croissance plus importante que certaines bactéries lactiques connues et/ou qui permet une acidification plus importante du milieu de fermentation, notamment du lait.
Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique susceptible de produire de nouveaux peptides phosphorylés susceptibles de favoriser l’absorption du calcium au niveau intestinal.
Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique susceptible de produire de nouveaux peptides ayant une activité inhibitrice de l’ACE. Un autre but de la présente invention est de proposer au moins un peptide, voire un mélange de peptides qui présente une activité inhibitrice de l’ACE et/ou favorise l’absorption intestinale du calcium et qui de préférence, soit non toxique pour les cellules intestinales.
Un autre but de la présente invention est de proposer au moins un peptide, voire un mélange de peptides qui présente une activité inhibitrice de l’ACE qui soit supérieure à l’activité des peptides IPP et VPP.
Un autre but de la présente invention est de proposer une composition pharmaceutique ou alimentaire apte à traiter l’hypocalcémie et donc les pathologies qui en découlent. Premier aspect
Selon un premier aspect, l’invention concerne une souche de Lactobacillus helveticus présentant les gènes prtH2 et prtH3 et capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C. En réduisant le pH, la souche permet la dissolution des composés contenant du calcium, rendant ce dernier absorbable par la paroi intestinale. Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également la souche de Lactobacillus helveticus VF45A déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I- 5300, ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VF45A et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C.
Selon ce premier aspect, l’invention concerne également les souches précitées en référence au premier aspect pour leur utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament pour le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également un peptide isolé pouvant être obtenu par fermentation du lait, notamment de vache par au moins une souche selon le premier aspect de l’invention et choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 19 et capables d’inhiber l’ACE et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium. La Demanderesse a en effet mis en évidence soit l’activité inhibitrice de l’ACE des peptides précités- laquelle activité est également liée à la bonne santé osseuse- soit l’activité d’amélioration de l’absorption du calcium à travers la paroi intestinale due à certains des peptides précités. Ainsi, les peptides de l’invention agissent sur la santé osseuse via l’absorption du calcium à travers la paroi intestinale, et/ou via l’inhibition de l’ACE.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges comprenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, les mélanges comprenant ou constitués desdits peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, les mélanges comprenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et d’au moins un peptide choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43, de préférence les mélanges contenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et des peptides de séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 20 à SEQ ID 43.
Ces mélanges s’avèrent être actifs sur l’inhibition de l’ACE et/ou pour l’amélioration de l’absorption intestinale du calcium.
La présente invention concerne également les peptides isolés précités et les mélanges précités pour leur utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif au moins un peptide choisi parmi les peptides isolés précités en référence au premier aspect et/ou un mélange de peptides tel que précité en référence au premier aspect et/ou une souche selon le premier aspect de l’invention et notamment la souche VF45A.
Avantageusement, selon un premier mode de réalisation du premier aspect, la composition alimentaire ou pharmaceutique comprend, au moins ou seulement en tant que peptides actifs, les 5 peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5. Ces peptides sont les plus actifs entant qu’inhibiteurs de l’ACE. Ils sont plus actifs que les tripeptides VPP et IPP de l’art antérieur.
Selon ce premier aspect et selon un second mode de réalisation, la composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect de l’invention contient en tant qu’ingrédient actif ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon le premier aspect de l’invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou elle contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits d’origine animale éventuellement stérilisés thermiquement, et/ou au moins partiellement écrémés, en particulier le lait de vache, de chèvre ou de brebis à l’exception du lait de yak pour le fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d’au moins deux laits d’origine animale et les mélanges d’au moins un substrat protéique d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale.
Le fermentat tel que précité obtenu par fermentation anaérobie et ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa fait partie des fermentats selon le premier aspect de l’invention, y compris le fermentat ultrafiltré obtenu à partir du lait de yak. S’agissant du fermentat obtenu à partir du lait de vache, il est avantageusement obtenu selon les conditions de température et de durée indiquées dans la partie relative aux résultats expérimentaux.
Dans toute la présente demande, le substrat protéique d’origine végétale peut être choisi parmi les laits végétaux tels que le lait d’avoine, le lait d’amande, le lait de riz, le lait de soja, le lait d’épeautre, le lait de noisette et les mélanges de ces laits. Quel que soit le lait, il peut être stérilisé thermiquement avant fermentation par la bactérie selon l’invention.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit fermentat est obtenu par fermentation de la souche précitée en référence au premier aspect, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé et/ou stérilisé thermiquement, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement également soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa à l’issue de la fermentation. Le fermentat ultrafiltré ou non s’avère actif pour l’inhibition de l’ACE et/ou pour l’absorption du calcium.
Dans tous les aspects de l’invention, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient en tant qu’ingrédient actif, le ou les peptides et/ou la souche. Elle peut également comprendre, avantageusement également du calcium et/ou de la vitamine D.
Dans tous les aspects de l’invention, le fait d’effectuer une ultrafiltration sur le fermentat permet de séparer les peptides produits par la souche des protéines. Le fermentat ultrafiltré ne contient donc plus de protéines. Lorsque le fermentat ultrafiltré est soumis à une digestion gastro-intestinale, il n’y a pas génération d’autres peptides, du fait de l’absence de protéines. Le filtrat obtenu par ultrafiltration du fermentat s’avère plus actif lorsqu’il est ingéré et digéré du fait de l’absence d’interférences par les peptides issus de la digestion des protéines.
Selon un mode de réalisation particulier de la composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect de l’invention, elle contient une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une desdites souches, notamment la souche Lactobacillus helveticus VF45A égale ou supérieure à 107 CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, supérieure ou égale à 18 mg par gramme. De préférence, les peptides sont les peptides contenus dans le fermentat précité en référence au premier aspect et notamment les peptides des séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID N° 43.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également un produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, en particulier de vache, de chèvre, de brebis et à l’exception du lait de yak, ou d’un mélange de laits. Selon le premier aspect de l’invention, ce produit contient au moins une souche selon le premier aspect et/ou au moins un peptide selon le premier aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le premier aspect de l’invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect de l’invention.
Selon ce premier aspect, l’invention concerne également un complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane, lequel de manière caractéristique comprend au moins une souche selon le premier aspect et/ou au moins un peptide selon le premier aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le premier aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect.
Quel que soit l’aspect de l’invention, la composition alimentaire/pharmaceutique ou le complément alimentaire peut être sous la forme d’une poudre, d’une solution notamment aqueuse, d’un comprimé, d’une gélule contenant la souche sous forme lyophilisée et/ou le peptide ou le mélange de peptides sous forme de poudre ou de solution. La gélule peut comporter une coque externe apte à résister à la digestion gastro-intestinale de manière à délivrer son contenu dans l’intestin du patient. La souche peut également être, par exemple, microencapsulée par un enrobage lipidique et se présenter sous la forme d’une poudre ingérable.
Dans le cas d’un complément alimentaire selon le premier aspect, le comprimé, la gélule ou tout autre forme unitaire de dosage journalier contient de préférence, au moins 0,6 g de peptides actifs et/ou 107 CFU de souche selon le premier aspect, éventuellement en mélange.
La composition pharmaceutique peut être de préférence adaptée à une administration par voie orale. Dans toute la demande, le produit laitier n’est pas limité selon l’invention. Il peut s’agir d’une boisson lactée, d’un lait fermenté, de kéfir, d’un yaourt, d’un produit à base de lait coagulé par ajout d’acide ou d’un fromage frais ou à pâte levée, par exemple.
Deuxième aspect
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne une souche de Lactobacillus helveticus présentant le gène prtH1 et capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale de 40 % et résistante à l’acidité et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium par les cellules intestinales.
Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne la souche de Lactobacillus helveticus VFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-l-5403 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VFH049 et capable de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86 et/ou capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et/ou capables d’augmenter l’absorption du calcium par les cellules intestinales.
Cette souche s’est avérée capable de former des acides qui sont susceptibles de rendre soluble le calcium dans l’intestin d’un hôte/patient. Elle est également capable de produire, par protéolyse de la b-caséine, des peptides actifs en tant qu’inhibiteur de l’ACE ou permettant une meilleure absorption intestinale du calcium. La souche elle- même résiste à la digestion et permet lorsqu’elle est en contact avec les cellules intestinales une meilleure absorption du calcium par ces dernières.
Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne également les souches citées en référence au deuxième aspect et notamment la souche VFH049 ou ses mutants ou variants pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne également un peptide isolé pouvant être obtenu par fermentation du lait, notamment du lait de vache, par au moins une souche selon le deuxième aspect de l’invention et choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 74 et capables d’inhiber l’ACE et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 75 à SEQ ID NO 86 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
Selon ce deuxième aspect, l’invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges de peptides contenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID 44 à SEQ ID 86, les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58, les mélanges constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et d’au moins un des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86, les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86 et les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86. Les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 sont les plus actifs en tant qu’inhibiteur de l’ACE. Selon ce deuxième aspect, l’invention concerne également un peptide isolé du deuxième aspect ou le mélange selon le deuxième aspect pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou pour le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère, en particulier un humain ayant un tel besoin.
Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif, au moins un peptide correspondant aux peptides isolés selon le deuxième aspect de l’invention, et/ou un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l’invention, et/ou une souche selon le deuxième aspect de l’invention, en particulier la souche VFH049. De préférence, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient un mélange contenant tous les peptides de séquences SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86 ou un mélange contenant au moins ou seulement les peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et éventuellement les peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86.
Selon ce deuxième aspect, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon le deuxième aspect de l’invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque dont l’amande, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits d’origine animale éventuellement stérilisés thermiquement et/ou au moins partiellement écrémés, notamment le lait de vache, de chèvre ou de brebis à l’exception du lait de jument pour le fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d’au moins deux laits et les mélanges d’au moins un substrat d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale.
Selon un mode de réalisation particulier du deuxième aspect de l’invention, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie de la souche VFH049 ou d’une souche telle que précitée, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa. Ce fermentat contient tous les peptides du deuxième aspect de l’invention ; il est donc actif pour favoriser la santé osseuse, à la fois en tant qu’inhibiteur de l’ACE et en tant qu’agent favorisant l’absorption intestinale du calcium.
Quel que soit le mode de réalisation, le fermentat lui-même, ultrafiltré ou non peut être considéré comme une composition pharmaceutique ou alimentaire.
Selon ce deuxième aspect, la composition alimentaire ou pharmaceutique précitée contient, de préférence une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une desdites souches, notamment la souche Lactobacillus helveticus VFH049 égale ou supérieure à 107 CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86, supérieure ou égale à 6 mg par gramme.
Selon ce deuxième aspect, l’invention concerne également un produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, à l’exception du lait de jument, en particulier à partir de lait de vache, de chèvre, de brebis ou d’un mélange de laits, qui contient au moins une souche selon le deuxième aspect de l’invention et/ou au moins un peptide selon le deuxième aspect de l’invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l’invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le deuxième aspect de l’invention.
Selon ce deuxième aspect, l’invention concerne également un complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane qui de manière caractéristique comprend au moins une souche selon le deuxième aspect de l’invention et/ou au moins un peptide selon le deuxième aspect de l’invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l’invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le deuxième aspect de l’invention.
A titre d’exemple, selon le deuxième aspect de l’invention, la composition pharmaceutique ou alimentaire se présente sous la forme d’un liquide, notamment du fermentat de lait de vache précité. Un volume de 30 mL de cette solution contenant 0,2 g du mélange de peptides de l’invention est administré quotidiennement, par voie orale.
Troisième aspect
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus présentant le gène prtB et capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale d’au moins 35% et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium. Une telle souche s’est avérée être active dans l’intestin et résistante à la digestion gastro-intestinale. Elle est capable d’augmenter le passage du calcium à travers la paroi intestinale. Les acides qu’elle produit permettent également de solubiliser le calcium.
Selon ce troisième aspect, l’invention concerne la souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM- 1-5316 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VF50b et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et/ou capable d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
Le troisième aspect concerne également chacune des souches les telles que précitées pour son utilisation en tant que médicament, et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Selon ce troisième aspect, la présente invention concerne un peptide isolé choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 161 et capables d’inhiber l’ACE et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 162 à SEQ ID NO 199 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
Selon ce troisième aspect, l’invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges contenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID 199, les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 87 à SEQ ID 1 12, les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 87 à SEQ ID 1 12 et d’au moins un des peptides de séquence SEQ ID NO 162 à SEQ ID NO 199 et les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 162 à SEQ ID NO 199.
Selon le troisième aspect, l’invention concerne également un peptide isolé cité en référence au troisième aspect ou un mélange précité en référence au troisième aspect pour son utilisation en tant que médicament et notamment dans le traitement dans le traitement de l’hypocalcémie ou d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou pour le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère, en particulier un humain ayant un tel besoin.
Selon ce troisième aspect, l’invention concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif, au moins un peptide isolé selon le troisième aspect de l’invention et/ou un mélange de peptides selon le troisième aspect.
De préférence, la composition contient un mélange contenant au moins ou seulement en tant que peptides, les peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 161 , ou un mélange contenant de préférence tous les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199 et/ou une souche selon le troisième aspect.
Selon un mode de réalisation préféré de la composition pharmaceutique ou alimentaire selon le troisième aspect de l’invention, elle comprend ou est constituée par le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon le troisième aspect de l’invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou elle contient ou est constitué du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits éventuellement stérilisés thermiquement et/ou au moins partiellement écrémés, notamment le lait de vache, de chèvre ou de brebis, à l’exception du lait de yak pour ledit fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d’au moins deux laits et les mélanges d’au moins un substrat protéique d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale
Le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de yak par une souche selon le premier ou le troisième aspect de l’invention et ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa fait partie respectivement des fermentats selon le premier et le troisième aspect de l’invention. Le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de jument et ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa fait partie des fermentats selon le deuxième aspect de l’invention. Avantageusement, ladite composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l’invention contient une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une seule desdites souches, notamment la souche Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b égale ou supérieure à 107 CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 199, supérieure ou égale à 4 mg par gramme.
La composition alimentaire ou pharmaceutique comprend de préférence, le fermentat obtenu par fermentation anaérobie de la souche selon le troisième aspect de l’invention, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa.
Selon ce troisième aspect, la présente invention concerne également un produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, notamment de vache, de chèvre, de brebis à l’exception du lait de yak, ou d’un mélange de laits, lequel de manière caractéristique contient au moins une souche selon le troisième aspect de l’invention et/ou au moins un peptide selon le troisième aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le troisième aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l’invention. Selon ce troisième aspect, la présente invention concerne également un complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane, lequel comprend de manière caractéristique au moins une souche selon le troisième aspect et/ou au moins un peptide selon le troisième aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le troisième aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l’invention. Selon ce troisième aspect, par exemple, la composition alimentaire ou pharmaceutique se présente sous la forme d’un liquide. Un volume de 30 mL de cette composition contenant 0,2 g de peptides sont administrés quotidiennement, par voie orale.
Quatrième aspect Selon un quatrième aspect de l’invention, la présente invention concerne un mélange d’au moins deux souches choisies parmi les souches de Lactobacillus helveticus présentant les gènes prtH2 et p rtH3 et capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C et notamment la souche de Lactobacillus helveticus VF45A déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-l-5300, les souches de Lactobacillus helveticus présentant le gène prtH1, notamment la souche de Lactobacillus helveticus VFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM- I-5403, capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale de 40% et résistante à l’acidité et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium et les souches de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus présentant le gène prtB, notamment la souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-l-5316, capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale d’au moins 35% et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium par les cellules intestinales et notamment les mélanges des trois souches VF45A, VFH049 et VF50b.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne un mélange de peptides choisi parmi les mélanges comprenant les peptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 199, les mélanges contenant les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86 et les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 1 12.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne également un peptide isolé choisi parmi les peptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 199 ou un mélange selon la quatrième aspect de l’invention pour son utilisation en tant que médicament et notamment dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne une composition alimentaire ou pharmaceutique qui comprend au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et au moins un mélange de souches selon le quatrième aspect de l’invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l’invention et/ou au moins le fermentat obtenu par fermentation du mélange de souches selon le quatrième aspect de l’invention, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et au moins un peptide tel que précité ou un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l’invention et/ou un mélange de souches selon le quatrième aspect de l’invention.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne également un produit choisi parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, de vache, de chèvre, de brebis ou d’un mélange de laits qui contient un mélange de souches selon le quatrième aspect de l’invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l’invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le quatrième aspect de l’invention.
Avantageusement, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient une concentration desdites souches égale ou supérieure à 107 CFU par gramme de produit et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents supérieure ou égale à 4 mg par gramme.
Définitions
Le terme « lait », en l’absence de précision fait référence à du lait de vache. Le terme « yaourt » fait référence à un produit laitier élaboré par fermentation par ajout de bactéries lactiques Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
Le terme « lait fermenté » fait référence à un produit laitier obtenu par coagulation des caséines suite à l’ajout d’un ferment lactique dans le lait.
Le terme « fermentat » désigne le surnageant obtenu à la fin de la fermentation.
Les termes « augmenter l’absorption du calcium » et autres termes relatifs font référence à la capacité de la souche ou des peptides à augmenter le passage global du calcium à travers la paroi intestinale d’un mammifère (entre les cellules de cette dernière du fait de l’augmentation de l'expression du gène cld-2, par exemple), ou à augmenter la fluorescence dans des cellules Caco-2 comme indiqué dans la partie expérimentale (passage plus important du calcium à travers les cellules de la paroi intestinale) ou à augmenter l’expression d’au moins un gène choisi parmi trpv6, et vdr chez les cellules intestinales comme indiqué dans la partie expérimentale de la présente demande (meilleure absorption par les cellules elles-mêmes).
Les termes « résistante à l’acidité » font référence à la classe 3 indiquée dans la partie expérimentale de la présente demande en référence à la résistance à l’acidité. Le terme « probiotique » fait référence à un microorganisme susceptible de survivre dans l’intestin d’un hôte, notamment un humain et d’interagir avec les cellules de la paroi intestinale et/ou d’interagir avec les autres microorganismes vivant dans l’intestin de l’hôte et d’exercer un effet bénéfique pour la santé de l’hôte.
Le terme « hypocalcémie » désigne une concentration en calcium dans le sang, corrigée avec le taux d’albumine inférieure à 2,20 mmol/L.
Le terme « ingrédient actif » signifie que l’ingrédient considéré (peptide, mélange de peptides et/ou souche) est contenu dans une quantité/concentration permettant d’obtenir un effet technique au moins in vitro sur l’inhibition de l’ACE et/ou sur l’absorption du calcium.
Le terme « sujet » fait référence à un humain ou un animal, notamment un mammifère (en particulier, le chien, le chat, une volaille, un ovin, un bovin, un caprin ou un reptile). Le terme « traitement » englobe à la fois le traitement préventif (prophylactique) et le traitement permettant d’obtenir une amélioration d’au moins un symptôme de la pathologie considérée.
Le pourcentage d’identité fait référence au pourcentage de résidus d’acides aminés identiques entre la séquence à comparer et la séquence de référence, en alignant la totalité de la séquence comparée à la séquence de référence. La séquence protéique qui présente un % d’identité avec la séquence de référence peut ainsi comprendre des insertions ou des délétions. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un résidu d’acide aminé identique, est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions pour lesquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux résidus d’acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d’obtenir le pourcentage d’identité en nucléotides ou en acides aminés des deux séquences entre elles.
Les peptides définis par leur % d’identité peuvent ainsi comprendre une ou plusieurs délétion et/ou une ou plusieurs substitutions, l’insertion ou la substitution par un acide aminé dextrogyre, le remplacement du groupe terminal acide carboxylique et/ou du groupe terminal amine par un groupement protecteur, par exemple, l’introduction d’une liaison de type rétro (c’est-à-dire une liaison peptide -NH-CO- issue de la réaction entre la fonction amine du premier acide aminé dans la séquence avec la fonction acide carboxylique de l’acide aminé suivant dans la même séquence) ou l’introduction d’une liaison de type rétro-inverso (c’est-à-dire l’introduction d’une liaison peptidique de type rétro précité avec un acide aminé dans la configuration inverse que celle de l’acide aminé de la séquence de référence) ou comprendre une plus longue chaîne d’acides aminés.
Quel que soit l’aspect de l’invention, les peptides peuvent être phosphorylés ou non. Une composition pharmaceutique est définie comme étant une composition contenant un ingrédient actif et un excipient pharmaceuticalement acceptable et notamment choisi parmi l’eau, les huiles, les alcools, notamment l’alcool éthylique, les huiles végétales, les cyclodextrines, l’amidon, la maltodextrine, le lactose, saccharose, le propylène glycol et le sérum physiologique.
Le terme « constitué » quand il est utilisé en référence à un ou des peptides indique que le mélange ou la composition contient en tant que peptide(s) uniquement les peptides cités à l’exception d’autres peptides mais d’autres composés ou constituants tels que des solvants, vitamines, protéines ou autres peuvent être présents.
Un « milieu apte à être ingéré » désigne tout mélange ou tout substance quelle que soit sa phase physique qui peut être ingéré et digéré sans causer de problème au tractus digestif. Les excipients pharmaceuticalement acceptables et notamment les exemples cités dans la présent demande sont des milieux aptes à être ingérés. Dans toute la présente demande, les séquences sont indiquées classiquement dans le sens de leur extrémité N terminale vers leur extrémité C-terminale.
Dans toute la présente demande, la souche VFH049 peut également être dénommée VF49d.
Dans toute l’invention, le terme « souche » fait référence sans distinction à la souche vivante, c’est-à-dire capable de se développer dans un milieu nutritif adapté et à la souche inactivée, c’est-à-dire morte et donc incapable de se développer dans un milieu adapté à son développement.
Figures
[Fig. 1] : la Fig. 1 représente des photographies au microscope électronique de chacune des trois souches de l’invention ; la photographie la plus à gauche représente la souche VF45A, celle du milieu la souche VFH049 et celle de droite la souche VF50b.
[Fig. 2] : la Fig. 2 représente la carte obtenue par ACP qui évalue les corrélations entre l’activité protéolytique sur gélose-lait, la croissance lors d’une fermentation en milieu liquide (lait), le pH à la fin de la fermentation, la quantité de peptides produits et 5 autres critères liés à l’analyse des profils chromatographiques des peptides produits par les souches (répartition en poids moléculaires apparents) ;
[Fig. 3] : la Fig. 3 représente les IC50 en mg/mL pour l’activité inhibitrice de l’ACE du contrôle et des fermentats bruts obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 ;
[Fig. 4] : la Fig. 4 représente les IC50 en mg/mL pour l’activité inhibitrice de l’ACE du contrôle et des fermentats obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 et ayant subi une ultrafiltration ;
[Fig. 5] : la Fig. 5 représente le taux d’absorption du calcium (ratio d’émission de fluorescence/émission basale) du contrôle et des fermentats bruts obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 ;
[Fig. 6] : la Fig. 6 représente le taux d’absorption du calcium (ratio d’émission de fluorescence/émission basale) du contrôle et des fermentats obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 et ayant subi une ultrafiltration ;
[Fig. 7] : la Fig. 7 représente le taux d’ARNm du gène trpv6 par rapport à celui de la condition PBS des fermentats bruts obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 ; [Fig. 8] : la Fig. 8 représente le taux d’ARNm du gène trpv6 par rapport à celui de la condition PBS des fermentats obtenus par fermentations des souches VF45A et VFH049 et ayant subi une ultrafiltration ;
[Fig. 9] : La Fig. 9 représente les pourcentages d’hydrophobie pariétale obtenus pour les souches testées en fonction de leur classe de tolérance à l’acidité.
[Fig. 10] : La Fig. 10 représente le taux d’ARNm par rapport au contrôle des gènes vdr, trpv6 et cld-2 obtenu après 24 heures de mise en contact avec la souche VFH049 et la souche VF50b avec des cellules HT-29 MTX.
Partie expérimentale
Isolation et caractérisation des souches
Les trois souches de l’invention ont été extraites de produits laitiers différents.
Les échantillons de chaque produit laitier sont collectés dans des tubes stériles, gardés à 4°C pendant maximum deux jours avant l’analyse. Les échantillons sont soumis à une série de dilutions dans un tampon salin (solution 0,85% NaCI), puis étalés sur plaques MRS-agar (De Man, Rogosa and Sharpe). Les plaques sont incubées pendant 48 heures à 37°C en milieu anaérobie. Les colonies morphologiquement distinctes sont séparées, repiquées sur des plaques du même milieu pour purification. Afin de s’assurer de la pureté des isolats, le ré-étalement sur plaque est répété au moins trois fois.
Le Tableau 1 ci-dessous indique les produits laitiers d’où ont été extraites les souches. Tous ces produits laitiers proviennent de Mongolie et ont été préparés à l’automne. Des observations au microscope optique sont effectuées afin de déterminer la forme des bactéries. Ces observations sont visibles sur la Fig. 1 . Le Gram de chaque souche est déterminé de manière classique par la technique de coloration de Gram et observation au microscope. La recherche de la catalase est effectuée pour chaque souche de manière classique par prélèvement de chaque souche sur un milieu gélosé et mise en contact avec de l’eau oxygénée.
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 ci-dessous.
[Table 1 ]
Dépôt des souches
La souche Lactobacillus helveticus VF45A a été déposée par la Demanderesse, le 29 mars 2018 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), ois au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d’ordre CNCM-l-5300 (dépôt selon le traité de Budapest).
La souche Lactobacillus helveticus VFH049 a été déposée par la Demanderesse, le 19 février 2019 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), ois au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d’ordre CNCM-l-5403 (dépôt selon le traité de Budapest). Dans la suite de la demande, cette souche est également dénommée VF49d.
La souche Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b a été déposée par la Demanderesse, le 20 avril 2018 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), ois au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d’ordre CNCM-l-5316 (dépôt selon le traité de Budapest).
Séquence du génome codant pour l’ARN ribosomique 16S
La détermination de la séquence codant pour l’ARN ribosomique 16S des souches a confirmé que les souches VF45A et VFH049 sont bien des souches de l’espèce Lactobacillus helveticus.
De même, l’analyse du génome à confirmer que la souche VF50b est bien une souche de l’espèce Lactobacillus. delbrueckii ssp. bulgaricus.
Détection par PCR des gènes codant pour les protéases pariétales
L’identification des protéases pariétales présentes chez les souches sélectionnées est réalisée par détection PCR des gènes codant pour ces enzymes. Les cellules bactériennes sont récupérées des cultures en lait écrémé, l’ADN bactérien est ensuite isolé par utilisation d’un kit wizard genomic DNA purification (Promega, Madison, Etats-Unis). La souche CNRZ32 CIRM-BIA 103 de Lactobacillus helveticus (fournie par le Centre International de Ressources Microbiennes - Bactéries d’intérêts Alimentaires, CIRM-BIA, INRA, Rennes, France) a été utilisée comme contrôle pour les gènes de Lactobacillus helveticus. Cette souche (CNRZ32), est connue pour posséder les 4 gènes prtH (prtH1 à prtH4).
Chaque souche est testée pour 5 couples d’amorces correspondant à 5 gènes différents à savoir, prtB, prtH1, prtH2, prtH3 et prtH4. Les amorces décrites par Hou et al., 2015 sont utilisées pour la détection de prtB chez Lactobacillus delbrueckii. Concernant les souches de Lactobacillus helveticus, les amorces décrites par Genay et al., 2009 sont utilisées pour la détection des gènes prtH1 et prtH2 et enfin celles décrites par Broadbent ét al., 201 1 pour la détection de prtH3 et prtH4.
Les réactions PCR sont conduites dans un volume final de 25 mL comprenant 12,5 mL de PCR Master Mix (2x) (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis), 2 mL de chaque amorce (12,5 pM), 2 mL d’ADN bactérien extrait (environ 200 ng.mL-1) et 6,5 mL d’H20. Les cycles PCR sont réalisés dans un thermocycler labcycler (SensoQuest, Gôttingen, Allemagne). Après une première dénaturation à 95°C pendant 5 min, 30 cycles de PCR sont répétés successivement, un cycle se compose d’une dénaturation à 95°C pendant 30 sec, d’une hybridation pendant 1 min à la température d’hybridation requise pour chaque amorce et d’une élongation à 72°C pendant 30 sec (4 min pour le gène prtH4). Une dernière élongation à 72°C pendant 10 min a lieu après les 30 cycles PCR. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % (m/v) préparé dans un tampon TBE (Tris, Borate, EDTA). La révélation des fragments d’ADN est réalisée par l’ajout dans le gel de 0,008 % (v/v) de GeIRed® (10.000c) (Biotium, Fremont, Etats-Unis). Dix mL de produits PCR sont mélangés avec 4 mL de tampon de charge (6x) (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) avant d’être déposé sur le gel d’agarose. Le mélange O’GeneRuler DNA Ladder Mix (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) est utilisé comme marqueur de taille. La migration a lieu pendant 45 min à un voltage constant de 100 V. Les produits d’amplification sont révélés au Gel Doc™ (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis).
Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Le gène prtB est détecté pour la souche VF50b de Lactobacillus delbrueckii mais pas chez les souches VF45A et VFH049 de Lactobacillus helveticus. Le gène prtH1 est détecté pour la souche VFH049 de Lactobacillus helveticus et dans le contrôle. De manière intéressante, d’autres souches (non représentées) ont été testées et il s’avère que toutes les souches de Lactobacillus helveticus présentant le gène prtH1 ont été isolées à partir de lait de jument fermenté. Les gènes prtH2 et prtH3 sont détectés chez la souche VF45A de Lactobacillus helveticus et dans le contrôle. Le gène prtH4 est détecté dans le contrôle, mais pas dans les souches testées.
[Table 2]
Détermination de l’activité protéolytique et fermentaire des souches
Les tests utilisés couvrent à la fois la capacité fermentaire (rapidité de croissance, acidification) et l’activité protéolytique (capacité à hydrolyser les protéines). En fait, les deux aspects sont largement liés, la capacité des bactéries à croître dépend en effet de leur capacité à hydrolyser les protéines (puisqu’elles ont besoin des acides aminés libérés lors de l’hydrolyse pour assurer leur croissance). Il est aussi déjà connu qu’acidification du milieu et hydrolyse des protéines sont corrélées.
1) Echelle du laboratoire - fermentation sans contrôle de pH
Détermination de l’activité protéolytique selon la méthode des géloses au lait Chaque souche est cultivée dans des puits de gélose-lait ; l’apparition d’un halo autour du puits témoigne d’une protéolyse. La mesure du diamètre du halo permet d’évaluer les capacités protéolytiques de la souche. La gélose-lait est préparée en mélangeant dans l’eau une poudre de lait écrémé (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à une concentration de 5 % (m/v) supplémenté d’agar à 1 ,5 % (m/v). Après stérilisation à 1 10°C pendant 10 min, le lait est coulé dans des boites de Pétri. Des puits de 4 mm de diamètre sont ensuite formés dans la gélose. La souche est cultivée en milieu MRS (Gélose de Man, Rogosa, Sharpe) liquide pendant 48 h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules bactériennes sont ensuite lavées deux fois dans du milieu MRS puis finalement re suspendues dans un volume de milieu MRS permettant d’obtenir une DOeoo égale à 1 (spectrophotomètre Prim, Secomam, Groupe Aqualabo, Champigny, France). Un volume de 20 mL de la suspension bactérienne est déposé dans les puits de gélose-lait. Les plaques inoculées sont ensuite incubées pendant 72h à 37°C en conditions anaérobies. L’activité protéolytique des souches est quantifiée en mesurant le diamètre (exprimé en mm) des halos apparus autour des puits après incubation.
Cultures en lait écrémé : croissance, pH
A partir d’une culture bactérienne en milieu MRS liquide, une pré-culture de 5 mL est réalisée dans un milieu composé à 100 % de lait écrémé UHT (Cora, Paris, France), pendant 72h à 37°C, en condition anaérobie. La souche est ensuite inoculée dans un volume final de 30 mL du même milieu, avec une DO600 initiale de 0,3. Les cultures ont lieu pendant 48h à 37°C en condition anaérobie. En tant que contrôle, le même milieu lait non inoculé (Lait NI) est incubé dans les mêmes conditions. A la fin de la fermentation, l’acidité du milieu est évaluée en mesurant le pH par un pH mètre (Mettler Toledo, Greifensee, Suisse). Pour l’évaluation de la croissance bactérienne, une mesure directe de la DO ne peut être réalisée à cause de l’opacité du milieu. Le phénomène de coagulation des caséines après fermentation est également un problème, les caséines précipitant dès que le pH est inférieur à 4,6. Un protocole préalable de récupération des cellules bactériennes à partir de la culture lait est donc réalisé. Un volume de 1 mL de culture est dilué (1 /10) dans une solution d’EDTA 2 % (m/v) à pH 12, ceci afin de re suspendre complètement les caséines précipitées. Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation à 13.400 rpm pendant 10 min. Ce protocole est répété une seconde fois et le culot bactérien obtenu est re suspendu dans 1 mL de tampon PBS. La mesure de DOeoo est réalisée à partir de cette suspension, le blanc est obtenu en réalisant le même protocole avec du lait non inoculé.
La croissance cellulaire et le pH ont été mesurés après 48h d’incubation en lait écrémé. Les souches de Lactobacillus helveticus présentent une croissance très rapide, atteignant une ODeoo moyenne de 2.7 alors que les souches de Lactobacillus delbrueckii atteignent seulement 0.85 en moyenne. L’acidification du lait inoculé a été comparée à celle du contrôle (Lait NI). Le pH initial du lait non inoculé était de 6.5, il a atteint 6.45 après 48h d’incubation. Dans presque tous les cas les souches de Lactobacillus helveticus ont conduit à une diminution du pH de 3 unités, atteignant une moyenne de 3.68, alors que le pH des échantillons inoculés avec la souche de Lactobacillus delbrueckii a diminué de 2 unités pH au maximum, atteignant une moyenne de 4.57. Dans tous les cas, la fermentation a abouti à la coagulation du lait car les caséines précipitent lorsque le pH descend en dessous de 4,6.
Mesure des quantités de peptides produits et de leur répartition en poids moléculaire
Les peptides produits au cours de la fermentation des souches sont analysés par deux méthodes. Les concentrations en peptides sont évaluées d’abord par dosage au réactif de Folin-Ciocalteu (FC) ; les peptides sont également analysés en fonction de leur répartition en poids moléculaire apparent par chromatographie d’exclusion stérique (SEC).
A partir des cultures en lait écrémé, un prélèvement de 4 mL est réalisé puis mélangé à un volume de 400 mL d’une solution d’acide trichloroacétique (TCA) à une concentration de 10 % (m/v) pour atteindre une concentration finale en TCA de 1 %. L’ajout d’une telle concentration de TCA permet la précipitation des protéines de haut poids moléculaire. Après une centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min, le surnageant contenant les peptides est récupéré.
Les peptides sont ensuite purifiés à partir du surnageant afin d’éliminer le TCA, les sucres, et les sels. La purification est réalisée par une extraction en phase solide (SPE), le principe de cette méthode est une séparation des composés d’un mélange par adsorption sélective sur une phase solide. Des micro-colonnes Bond Elut C18 (1000 mg) (Agilent Technologies, Santa Clara, Etats-Unis) sont utilisées. ; il s’agit de colonnes composées d’une phase solide de silice greffée avec des groupements C18 permettant la rétention de composés hydrophobes. Les colonnes sont équilibrées en passant un volume minimum de 10 mL d’une solution d’acétonitrile (ACN) 100 % supplémenté de 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA) (v/v). Après un rinçage de la colonne par une solution d’H2O contenant 0,1 % de TFA (v/v), un volume de 4 mL de surnageant contenant les peptides extraits est ensuite chargé sur la colonne. Un nouveau rinçage à IΉ2O supplémenté de 0,1 % de TFA permet d’éluer tous les composés non retenus par la colonne. Les peptides retenus sont finalement élués dans un volume de 2 mL d’une solution d’ACN à 80 % (v/v), 20 % d’H2O (v/v) et contenant 0,1 % de TFA. Les échantillons sont ensuite stockés à -20°C jusqu’à analyse.
Dosage au réactif de Folin-Ciocalteu
Les peptides extraits sont quantifiés par un dosage au réactif de Folin-Ciocalteu (FC). Il s’agit d’une solution de tungstate et molybdate de sodium préparés dans les acides phosphorique et chlorhydrique. Le complexe d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique de couleur jaune est réduit par des résidus de tyrosine, tryptophane, cystéine ou encore par des liaisons peptidiques en milieu alcalin pour donner une couleur bleue. L’apparition de la couleur bleue, proportionnelle à la concentration en peptides, est suivie par spectrophotométrie. Pour le dosage, la réaction est réalisée dans un volume final de 800 mL comprenant 200 mL de peptides extraits, 500 mL d’une solution de carbonate de sodium (NaHCOa) à 500 mM et 100 mL de réactif de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). La réaction est incubée à 37°C à l’obscurité pendant 30 min, puis la DO à 750 nm du mélange est mesurée par un spectrophotomètre Prim (Secomam, Groupe Aqualabo, Champigny, France). Le blanc est réalisé à partir de la solution servant à éluer les peptides des colonnes SPE (80 % ACN, 20 % H2O, 0,1 % TFA). La concentration dans les échantillons est déterminée par une gamme étalon d’une solution commerciale de peptides (peptide digest assay standard, ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats- Unis).
Analyse par chromatographie d’exclusion stérique
Le but de la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) est la séparation des composés d’un mélange en fonction de leurs tailles ou volumes hydrodynamiques. Dans cette étude, la SEC permet d’analyser la répartition en poids moléculaire apparent des peptides extraits après fermentation. La colonne utilisée pour la séparation des peptides est une Superdex Peptide 10/300 GL (10 c 300-310 mm, 13 mm, GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni) branchée sur un système de purification AKTA Protein (GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni). Un volume de 25 mL d’échantillon est élué en condition isocratique dans un solvant composé de 30 % d’ACN (v/v), 70 % d’H2O (v/v) et 0,1 % de TFA (v/v), à un débit de 0,5 m L/min pendant 60 min. Un détecteur UV à 214 nm permet la détection des liaisons peptidiques. La quantité de peptides dans les échantillons est analysée par intégration des profils obtenus par SEC. Deux gammes de poids moléculaires ont été choisies pour les intégrations, la première concerne les peptides de poids moléculaire apparent supérieurs à 1 .700 Da (appelée PHPM, peptides de haut poids moléculaire) et la deuxième les peptides de poids moléculaire apparent inférieurs à 1 .700 Da (appelée PBPM, peptides de bas poids moléculaire). La quantité de peptides appartenant à chaque classe de taille est exprimée soit en pourcentage de l’aire totale du chromatogramme (% PHPM et % PBPM), soit en pourcentage de l’aire du chromatogramme obtenu pour la condition contrôle lait non inoculé (% PHPM/Lait NI et % PBPM/Lait NI).
Les mesures de concentration à l’aide du réactif FC ont montré une augmentation de la quantité de peptides après 48 h, avec des concentrations supérieures à 4 g/L dans tous les cas, contre 2/06 g/L dans l’échantillon non inoculé.
La souche Lactobacillus helveticus VF45A est l’une des souches les plus efficaces avec une concentration finale en peptides supérieure à 6 g/L (voir Tableau 3 ci- dessous).
Le poids moléculaire des peptides générés a été analysé par SEC comme précité. La quantité de peptides appartenant à chaque classe de taille (inférieure ou supérieure à 1 .700 Da) est exprimée soit en pourcentage de l’aire totale du chromatogramme (% PHPM et % PBPM), soit en pourcentage de l’aire du chromatogramme obtenu pour la condition contrôle lait non inoculé (% PHPM/Lait NI et % PBPM/Lait NI). L’inoculation et la fermentation conduisent à une augmentation des peptides de bas poids moléculaire par rapport au contrôle (1 .5 fois en moyenne pour les souches de Lactobacillus delbrueckii, 4.2 fois en moyenne pour les Lactobacillus helveticus).
Les résultats obtenus pour chaque souche sont regroupés dans le tableau 3 ci- dessous.
[Table 3]
Les analyses en composantes principales (ACP) sont réalisées avec le logiciel R (R core team, 2016, Vienne, Autriche), sur le package R Commander et son plug-in FactorMineR.
Une analyse ACP a pris en compte 9 paramètres quantitatifs : l’activité protéolytique sur gélose-lait, la croissance lors d’une fermentation en milieu liquide (lait), le pH à la fin de la fermentation, la quantité de peptides produits, et 5 autres critères liés à l’analyse des profils chromatographiques des peptides (répartition en poids moléculaires apparents. La Fig. 2 montre la carte obtenue. Les composantes principales Dim1 et Dim2 représentent 60.82% et 23.56% de la variance totale, respectivement. Une corrélation positive est observée entre la valeur du pH et les peptides de haut poids moléculaire. De plus, la croissance est corrélée à une série de variables liées à la production de peptides (quantification par réactif FC, %PBPM, %PBPM/Lait NI) et au diamètre du halo de protéolyse. La valeur du pH et les peptides de haut poids moléculaire sont corrélés négativement avec des variables comme la croissance, la proportion de PBPM et le halo de protéolyse.
2) Production des peptides à pH contrôlé, ultrafiltration, identification des peptides
Fermentation en bioréacteur
Chaque souche est cultivée en bioréacteur de 500 mL (MiniBio 500, my-Control, Applikon Biotechnology, Delft, Pays-Bas). Le milieu est constitué de lait écrémé (10 g/L (voir paragraphe précédent), autoclavé 30 min à 1 10°C. La souche est inoculée à une DO 600 égale à 0,3. La fermentation est conduite pendant 72h à une température constante de 40°C avec une agitation de 300 rpm dans un volume final de 330 mL. La condition anaérobie est obtenue par injection de N2 dans le bioréacteur à un débit de 20 mL/min. Tout au long de l’expérience, le pH est maintenu à 6 grâce à des solutions d’HCI (1 M) et de NaOH (3 M), l’approvisionnement est réalisé au moyen de deux pompes péristaltiques localisées sur l’unité de contrôle du bioréacteur. Des prélèvements d’environ 5 mL sont réalisés en condition d’asepsie à 0, 2, 17, 24, 41 , 48, 65 et 72h de fermentation pour analyse de la croissance des souches bactériennes ainsi que de l’évolution de la concentration en peptides. Cette dernière est évaluée par un dosage au réactif FC après une précipitation au TCA. Un volume de 1 mL de fermentât est dilué (1 /10) dans une solution d’EDTA 2 % (m/v) à pH 12 puis centrifugé à 13.400 rpm pendant 10 min, et 25 mL de surnageant sont analysés par SEC. Le culot bactérien est re suspendu dans 1 mL de tampon PBS pour mesure de la DOeoo afin d’évaluer la croissance bactérienne. Après 72h de fermentation, l’intégralité du fermentat est récupérée puis centrifugée à 10.000 rpm pendant 10 min, le surnageant est ensuite stocké à -20°C jusqu’à analyse. La concentration en matière sèche dans les fermentats est mesurée au dessiccateur (XM60, Précisa, Poissy, France) et est toujours égale à 100 g/L. Afin de pouvoir confirmer l’impact de la fermentation bactérienne sur les propriétés du produit final, un contrôle est réalisé (CTLF). Il s’agit du milieu de fermentation incubé dans les mêmes conditions mais non inoculé. Après 72h d’incubation, ce milieu est centrifugé et stocké comme les autres fermentations. Identification des peptides produits lors de la fermentation à pH contrôlé
Afin d’éliminer les protéines non hydrolysées, une partie du fermentat brut est fractionnée au moyen d’une membrane d’ultrafiltration. La membrane est une cassette Hydrosart® (Sartocon® Slice Hydrosart® Cassette, Sartorius, Gôttingen, Allemagne) de 0,1 m2 avec un seuil de coupure de 10 kDa branchée sur un système Sartocon® Slice 200 Hôlder (Sartorius, Göttingen, Allemagne). L’alimentation du fermentat est réalisée par une pompe péristaltique et la pression du rétentat est maintenue à environ 1 bar pendant la filtration. Ainsi, le perméat d’ultrafiltration (UFP) contenant les molécules inférieures à 10 kDa est séparé du rétentat (UFR). Les deux sous-fractions sont ensuite conservées à -20°C jusqu’à analyse. Les perméats d’ultrafiltration sont séchés jusqu’à 10 % du volume initial par évaporation centrifuge (miVac, Gene Vac, Ipswich, Royaume-Uni) pendant 15h à 40°C. La concentration en matière sèche dans les produits (fermentat et fermentat ultrafiltre) est ensuite mesurée au dessiccateur (XM60, Précisa, Poissy, France).
Les peptides purifiés par SPE à partir des surnageants de culture (non ultrafiltrés) sont séchés par évaporation centrifuge (miVac, Gene Vac, Ipswich, Royaume-Uni) pendant 2h à 40°C puis re suspendus dans 100 mL d’H2O contenant 0,1 % de TFA (v/v) et centrifugés pendant 10 min à 8.000 rpm. Dix microlitres d’échantillon sont injectés sur une colonne C18-Kinetex (150 x 4,6 mm, 2,6 miti, 100 A, Phenomenex, Torrance, Etats- Unis), branchée sur un système chromatographique d’Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) Acquity (Waters, Manchester, Royaume-Uni). Un gradient linéaire d’ACN contenant 0,1 % d’acide formique (AF) (v/v) est utilisé (de 5 à 15 % d’ACN pendant 30 min, puis de 15 à 30 % d’ACN pendant 60 min, de 30 à 50 % d’ACN pendant 10 min et enfin de 50 à 95 % d’ACN pendant 10 min) avec un débit de 500 mL.min-1. Les éluants d’UPLC sont directement pulvérisés par électrospray à un voltage de 3 kV, la désolvatation est réalisée par utilisation de diazote (N2) à un débit de 600 L.h-1 à une température de 300°C. Le système chromatographique est couplé à un spectromètre de masse Synapt-G2-Si (Waters, Manchester, Royaume-Uni). Les mesures MS sont faites en mode data dépendent (data dépendent analysis, DDA) et les datas sont récupérées dans une gamme de masse allant de 100 à 2000 m/z. Un maximum de 15 ions précurseurs avec un seuil d’intensité de 10.000 sont sélectionnés pour fragmentation par la méthode de dissociation induite par collision (CID) à une puissance de 8 à 9 V pour les faibles masses et une puissance de 40 à 90 V pour les masses élevées. Les spectres MS/MS sont récupérés dans une gamme de masse allant de 100 à 2000 m/z. Les spectres sont traités par le logiciel Mass Lynx (version 4.1 .) (Waters, Manchester, Royaume-Uni). L’analyse de l’échantillon contrôle (CTLF) a permis de définir l’hétérogénéité de base. 596 peptides provenant de 22 protéines de lait (as-i -caséine, b-caséine, as2-caséine, GLYCAM1 , k-caséine, BTN1 A1 , b- lactoglobuline, FGFBP, lactoperoxidase, ostéopontine, périlipine, collagène a2, TRIP6, NPT2B, acylCoA désaturase, dysferline, COG8, B4GT1 , PSME4, DHX9, RALYL et apolipoprotéine A2) ont été identifiés dans cet échantillon. 32% d’entre eux proviennent de la b-caséine. Par comparaison, entre 150 et 722 peptides ont été identifiés dans les échantillons fermentés par les différentes souches testées. Dans ces échantillons, les peptides de b-caséine représentent 44 à 67% de toutes les séquences identifiées. En raison de la prépondérance des peptides de b-caséine parmi les peptides identifiés, et de l’abondance naturelle de la b-caséine dans le lait, seuls les peptides issus de la b-caséine seront étudiés. Les peptides produits par les souches de l’invention sont donc tous issus de la protéolyse de la b-caséine du lait de vache. La recherche en banque de données est réalisée via le logiciel Peaks Studio (version 7.0.) (Bioinformatics Solutions, Waterloo, Canada) en utilisant la base de données UniProt (le 15 Mai 2017) restreinte au protéome complet de l’espèce Bos taurus. Les seuils de tolérance des masses des ions précurseurs et fragments sont définis à 35 ppm et 0,2 Da. Les séquences peptidiques identifiées par le logiciel sont filtrées selon un taux de faux positif (false discovery rate) strictement inférieur à 1 %. Pour toutes les souches, les peptides identifiés proviennent du fermentat qui n’a pas subi d’ultrafiltration. Ces mêmes peptides devraient également se retrouver au vu de leur masse dans le fermentat ultrafiltré.
Il est à noter que lors de l’identification des peptides, les peptides pouvant provenir de la levure ont été considérés. Après analyse par spectrométrie de masse, la Demanderesse a constaté en utilisant les bases de données, qu’aucun peptide provenant de la levure n’était présent dans le fermentat ultrafiltré ou non.
Le tableau 4 regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF45A selon la méthode de fermentation indiquée ci- dessus à pH 6.
Le tableau 5 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF45A selon la méthode de fermentation indiquée ci- dessus à pH 6.
[Table 4]
[Table 5]
Le tableau 6 ci-dessous regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VFH049 selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6.
Le tableau 7 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VFH049 selon la méthode de fermentation indiquée ci- dessus à pH 6.
II est connu que les peptides phosphorylés peuvent être actifs dans l’absorption du calcium (confère la publication intitulée « Casein phosphopeptide promotion of calcium uptake in HT-29 cells - Relationship between biological activity and supramolecular structure» de Gravaghi, C., et al. publié en 2007, FEBS J. 274, 4999-5011. doi :10.1111/j.1742-4658.2007.06015.x.
[Table 6]
[Table 7]
Le tableau 8 ci-dessous regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF50b selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6.
Le tableau 9 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF50b selon la méthode de fermentation indiquée ci- dessus à pH 6.
[Table 8]
[Table 9]
Activités biologiques des fermentats et des peptides
Les fermentats (avant et après ultrafiltration) ont été testés pour deux activités biologiques, à savoir l’inhibition de l’ACE et la capacité à moduler l’absorption du calcium. Par ailleurs, la toxicité des hydrolysats a été évaluée. Pour les analyses, les différents échantillons sont dilués dans IΉ2O à une concentration de 15 g/L de matière sèche.
Test de cytotoxicité
Le but de cette expérience est de tester l’éventuelle toxicité des fermentats envers les cellules intestinales. La viabilité cellulaire est mesurée par l’utilisation du réactif CCK- 8 (Cell Counting Kit-8), cette méthode est basée sur la réduction d’un sel de tétrazolium par des déshydrogénases cellulaires produisant du formazan dont la formation est suivie à 450 nm. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 96 puits à une densité de 8.000 cellules par puits dans un volume de 200 mL de milieu DMEM complet, et cultivées pendant 7 jours à 37°C, 5 % de CO2. Les fermentats sont dilués dans du milieu DMEM complet à une concentration de 5 et 10 g/L. Un tampon PBS également dilué dans du milieu DMEM (même facteur de dilution que les échantillons) est utilisé en tant que contrôle. Un volume de 150 mL d’échantillon est déposé dans chaque puits, suivi d’une incubation pendant 7 ou 24h à 37°C, 5 % de CO2. Après incubation, les cellules Caco-2 sont lavées deux fois par du tampon PBS puis un volume de 150 mI_ de milieu DMEM complet supplémenté avec 5 % (v/v) de réactif CCK-8 (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) est ajouté dans chaque puits. La plaque est ensuite incubée pendant 2h à 37°C, 5 % de CO2 à l’obscurité, puis lue à 450 nm au spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La viabilité cellulaire est calculée par rapport à l’absorbance obtenue pour les puits contrôles (correspondant à 100 % de cellules viables). A une concentration de 5 g/L, les fermentats bruts (non filtrés) de chacune des souches de l’invention ne présentent aucune toxicité envers les cellules Caco-2 même après 24h de contact. La même observation est faite pour une concentration de 10 g/L de matière sèche. Les fermentats ultrafiltrés de chacune des souches ne présentent pas non plus de cytotoxicité.
Inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine
Le but est d’étudier le potentiel inhibiteur des fermentats envers l’ACE. Il repose sur l’utilisation d’un substrat fluorescent, le o-aminobenzoyl-Gly-p-nitro-L-Phe-Pro (Abz- Gly-Phe(NO2)-Pro). L’hydrolyse de ce substrat par l’ACE génère le groupement fluorophore Abz-Gly pouvant être suivi par des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 355-375 nm et de 400-430 nm respectivement. Les échantillons, l’enzyme et le substrat sont préparés et dilués dans un tampon Tris-HCI (150 mM) à pH 8,3 aux concentrations désirées. La réaction d’hydrolyse est conduite en plaque 96 puits dans un volume final de 300 mL comprenant 50 mL d’échantillon ou de tampon Tris-HCI (pour le témoin négatif d’inhibition), 50 mL d’une solution d’ACE (0,05 U/mL) (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) et 200 mL de substrat Abz-Gly-Phe(NC>2)-Pro (0,45 mM) (Bachem, Bubendorf, Suisse). Un témoin ne contenant pas d’enzyme (remplacée par du tampon Tris-HCI) est également réalisé. La plaque est ensuite incubée à 37°C pendant 1 h, une mesure de la fluorescence a lieu toutes les 2 min avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 365 et 415 nm respectivement par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France) équipé d’un bain-marie à 37°C. Les pourcentages d’inhibition et les IC50 des différents échantillons testés sont calculés en fonction du témoin négatif d’inhibition.
Pour l’analyse des activités biologiques (de toutes les activités biologiques testées dans la présente demande), la significativité des résultats est évaluée par une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur suivi d’un test de Tukey pour la comparaison multiple des moyennes. La différence entre les moyennes est considérée comme significative pour une p value < 0,05. Les tests statistiques ont été conduits sous le logiciel R (R core team, 2016, Vienne, Autriche), sur le package R Commander.
Pour démontrer l’intérêt de la fermentation au niveau des activités biologiques étudiées, les activités sont comparées à celles du fermentat contrôle (CTLF), milieu de fermentation incubé sans inoculation.
Les échantillons ont été testés à différentes concentrations en matière sèche, ceci afin de pouvoir calculer la concentration inhibant la moitié de l’activité enzymatique (IC50). Les résultats sont représentés sur les Fig. 3 et 4.
Les fermentats bruts présentent des IC50 allant de 12,76 mg/mL pour le fermentat contrôle brut à 0,56 mg/mL pour le fermentat produit par la souche VF45A. Pour la souche VFH049, l’IC50 du fermenta brut est de 0,76 mg/mL. Pour les fermentats ultrafiltrés, les IC50 sont de 8 mg/mL pour le contrôle, 0,47 mg/mL pour le fermentat produit par la souche VF45A et de 1 ,76 mg/mL pour le fermenta produit par la souche VFH049. Les souches VF45A et VFH049 améliorent très significativement la capacité des fermentats à inhiber l’ACE par rapport au contrôle. Le même effet est obtenu avec les fermentats ultrafiltrés. Des molécules d’intérêt sont donc produites par les souches au cours de la fermentation et présentent une activité d’inhibition de l’ACE.
Prédiction de l’activité d’inhibition de l’ACE par modèle QSAR ; comparaison avec les peptides de l’art antérieur
Afin de prédire l’activité inhibitrice de l’ACE de chacun des peptides identifiés (peptides non phosphorylés), un modèle statistique QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) a été utilisé. Ce modèle a été développé par Pripp et al., (2004), en utilisant comme descripteurs des acides aminés les z-scores (z1 , z2 et z3), décrit par Hellberg et al., (1987). La prédiction est basée sur les caractéristiques physico chimiques des deux derniers acides aminés des peptides (en position C terminal) permettant d’obtenir via l’équation du modèle une valeur d’IC50 prédictive. L’approche QSAR utilisée pour déterminer l’IC50 de nos peptides a été utilisée sur les peptides VPP et IPP de l’art antérieur. Leur IC50 est de 26 mM, alors que certains des peptides de l’invention présentent une valeur d’IC50 en dessous de 20 mM (jusqu’à 8.7 mM pour les plus actifs), et sont donc à priori plus efficaces.
Les résultats sont regroupés dans les tableaux 10 à 12 ci-dessous. [Table 10]
[Table 11]
[Table 12]
L’approche QSAR utilisée pour déterminer l’I C50 des peptides de l’invention a été utilisée sur les peptides VPP et IPP décrits dans l’art antérieur. Leur IC50 est de 26 mM, alors que certains de nos peptides sont en dessous de 20 mM (jusqu’à 8.7 mM pour les plus actifs), et sont donc à priori plus efficaces.
Modulation de l’absorption du calcium
La majorité du calcium consommé est absorbée au niveau intestinal, deux voies de transport du calcium ont été identifiées dans l’intestin, la voie paracellulaire et la voie transcellulaire. Le transport paracellulaire du calcium est une diffusion passive de cet élément du lumen à la muqueuse intestinale, selon le gradient formé entre ces deux compartiments. Deux protéines sont impliquées dans ce transport, les claudines 2 et 12 (CLD-2 -12) qui font partie des jonctions serrées entre les cellules et agissant comme des canaux calciques (Fujita et al., 2008). Le transport transcellulaire du calcium est un transport actif impliquant l’incorporation du calcium au sein des cellules intestinales par un transporteur appelé TRPV6. Le calcium est par la suite transporté et excrété au pôle basal de la cellule dans la muqueuse intestinale. Ces deux voies de transport du calcium sont régulées par la vitamine D, une hormone qui, une fois fixée à son récepteur nucléaire le VDR (Vitamin D Receptor) agit comme un facteur de transcription contrôlant les gènes des CLD-2 -12 et de TRPV6.
Sur cellules Caco-2, mesure de l’incorporation du calcium
La capacité des fermentats à moduler l’absorption du calcium a été évaluée en utilisant les cellules Caco-2. Le test consiste à mettre en contact les fermentats (concentration de 10 g/L) avec les cellules Caco-2 pendant 7h. Après contact, l’incorporation du calcium par les cellules est évaluée par utilisation d’une sonde intracellulaire capable d’émettre une fluorescence en présence de calcium. Après rinçage des cellules Caco- 2, la sonde FluoForte® est ajoutée en suivant les instructions du kit FluoForte® calcium assay (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Etats-Unis), la plaque est ensuite incubée à température ambiante pendant 1 h, temps de pénétration de la sonde. L’émission de fluorescence est ensuite suivie par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France) avec une longueur d’onde d’excitation à 490 nm pour une émission suivie à 525 nm. L’émission est mesurée pendant 30 sec avec une injection de 25 mL d’une solution de CaCL à 250 mM entre 9 et 10 sec de cinétique au moyen d’un module d’injecteurs couplé au spectrofluorimètre. Cette injection provoque une entrée brutale de calcium au sein des cellules intestinales ce qui conduit à une augmentation de l’émission de fluorescence. La capacité des souches bactériennes à moduler l’incorporation du calcium dans les cellules est déterminée par cette augmentation de fluorescence après injection du calcium. Les résultats sont ainsi exprimés pour chaque puits par rapport à la moyenne de fluorescence mesurée entre 0 et 9 sec de cinétique, considérée comme la fluorescence basale d’un puits. Un ratio d’augmentation de fluorescence, pour les différentes conditions de contact, est donc obtenu.
L’effet des fermentats obtenus avec les souches VF45A et VFH049 est comparé avec celui du tampon PBS et celui du fermentat contrôle. Les résultats montrent que les fermentats bruts obtenus avec ces deux souches sont capables de moduler positivement l'incorporation du calcium par rapport au tampon PBS et au contrôle (Fig. 5). Ainsi, le ratio d’émission de fluorescence sur l’émission basale est de 1 ,08 pour le PBS, de 1 ,23 pour le fermentat contrôle, de 1 ,3 pour le fermentat produit par la souche VF45A et de 1 ,31 pour le fermentat produit par la souche VFH049. Lorsque les fermentats ultrafiltrés sont testés, l’effet est cependant moins prononcé pour la souche VF45a que pour la VF49d (Fig. 6). Néanmoins, une tendance à l’augmentation de l’absorption est observée pour les deux souches.
Modulation de l’expression du gène trpv6 chez les cellules Caco-2
L’objectif de cette partie est d’évaluer la capacité des fermentats à moduler l’expression du gène trpv6 par les cellules intestinales. Une approche par RT-qPCR est conduite en utilisant les cellules Caco-2 comme modèle. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 24 puits à une densité de 40.000 cellules par puits dans un volume final de 500 mL de milieu DMEM complet et incubées pendant 15 jours à 37°C, 5 % de CO2 avec un changement du milieu tous les deux jours après 7 jours de culture. Les fermentats sont dilués en milieu DMEM complet à une concentration de 10 g/L de matière sèche. Le tampon PBS dilué dans le milieu DMEM (même facteur de dilution que pour les échantillons) est utilisé en tant que contrôle. Après incubation, les cellules sont lavées deux fois par du tampon PBS, puis un volume de 300 mL de chaque échantillon est déposé dans les puits. La plaque est ensuite incubée pendant 7h à 37°C, 5 % de CO2. Après contact entre les cellules Caco-2 et les échantillons, les puits sont rincés deux fois avec du tampon PBS puis une extraction des ARN par le réactif TRIzol™ est réalisée. Les échantillons d’ARN sont d’abord traités à la DNase pour éliminer les éventuels fragments d’ADN co-extrait et/ou restant suite à l’extraction. Un volume de 8 mL contenant 1 .000 ng d’ARN est mélangé avec 1 mL de DNase, et 1 mL de tampon DNase (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis). La réaction a lieu à 37°C pendant 30 min, elle est stoppée par l’ajout d’1 mL de solution d’EDTA à 50 mM (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis) suivi d’une incubation à 65°C pendant 10 min. Par la suite, les échantillons ont été rétro-transcrits en ADNc en utilisant le kit RevertAid H minus first strand cDNA synthesis (ThermoScientific, Waltham, Etats- Unis), selon les instructions fournies. Pour la réaction de qPCR, les échantillons d’ADNc sont dilués (1 /16) dans l’H2O. Pour un volume de 2 mL d’échantillon, 18 mL de mélange qPCR sont ajoutés contenant 10 mL de Power SYBR® Green PCR Master Mix (2x) (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, Etats-Unis), 0,6 mL de chaque amorce (10 pM) et 6,8 mL d’H2O. La fluorescence est suivie pendant la réaction dans un thermocycler CFX Connect Real Time Détection System (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis). Après une étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min, 40 cycles de PCR sont réalisés successivement, un cycle comprend une dénaturation à 95°C pendant 15 sec, une hybridation de 58 ou 60°C en fonction du couple d’amorces utilisé pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 30 sec. La réalisation d’une courbe de fusion (melting curve) termine la réaction.
Le gène étudié est le gène codant pour le transporteur du calcium (transient receptor potential sélective for calcium) ( trpv6 ) également appelé CaT 1 (calcium transporter 1 ). L’expression de ce gène est normalisée par rapport à celle du gène codant pour la peptidylprolyl isomerase A ( ppiA ). Les couples d’amorces utilisés, ainsi que leurs températures d’hybridation, sont présentés ci-dessous dans le tableau 13 ci-dessous : [Table 13]
Les échantillons de fermentat ont été mis en contact avec les cellules Caco-2 et les variations de l’expression du gène trpv6 ont ensuite été étudiées par qPCR.
Les fermentats obtenus avec les souches VF45A et VFH049 sont capables de moduler positivement l’expression du gène. Plus particulièrement, le fermentat produit par la souche VFH049 entraîne une surexpression du gène 20 fois supérieure au contrôle (Fig. 7). L’effet des fermentais ultrafiltrés est moins prononcé, non significatif même si une tendance à l’induction du gène est clairement visible pour les deux souches (Fig. 8). Les fermentais produits par les deux souches sont donc capables de moduler à la fois l’incorporation du calcium et l’expression de trpv6 par rapport au lait non fermenté. Etude des caractères probiotiques
La significativité des résultats est évaluée par une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur suivi d’un test de Tukey pour la comparaison multiple des moyennes. Concernant l’expérience de transport du calcium au travers d’une membrane de cellules Caco-2, le test post-ANOVA est un test de Dunn aboutissant à une comparaison à la moyenne de la condition contrôle. La différence entre les moyennes est considérée comme significative pour une p value < 0,05. Les tests statistiques ont été conduits sous le logiciel R (R core team, 2016, Vienne, Autriche), sur le package R Commander.
Test de la tolérance à l’acidité
Le principe de ce test repose sur la comparaison de la survie d’une souche bactérienne entre une incubation de 2h à pH 2 et une incubation au pH du milieu MRS (pH 6,2). Pour cette expérience, chaque souche de la collection a été cultivée en milieu MRS liquide pendant 24h à 37°C en condition anaérobie. Un volume de 200 mL de culture a ensuite été dilué (1 /10) soit dans le même milieu MRS à pH 6,2 (appelé tube A), soit dans un milieu MRS ajusté à pH 2 par de l’acide chlorhydrique (HCl) (appelé tube B). Les tubes A et B ont été incubés à 37°C pendant 2h puis 10 mL de chaque tube ont été étalés sur gélose MRS. Les boites ensemencées ont été incubées pendant 48h à 37°C en condition anaérobie.
La tolérance à l’acidité a été évaluée en comparant les nombres de colonies entre les boites A et B. Les souches ont été réparties en différentes classes de tolérance à l’acidité selon le résultat du ratio B/A. La classe 0 regroupe les souches non tolérantes à l’acidité (aucune colonie sur la boite B). La classe 1 correspond aux souches faiblement tolérantes (boite B = 0 à 30 % des colonies sur la boite A). La classe 2 regroupe les souches présentant une tolérance à l’acidité modérée (boite B = 30 à 80 % des colonies sur la boite A). Enfin la classe 3 correspond aux souches tolérantes à l’acidité (boite B présente plus de 80 % des colonies de la boite A).
Les souches ont été réparties en 4 classes de tolérance allant de la classe 0 (souches non tolérantes), à la classe 3 (souches tolérantes).
Détermination de l’hydrophobie pariétale des souches L’objectif de ce test est d’évaluer le caractère hydrophobe de la paroi des différentes souches. Un test simple a déjà été mis au point pour évaluer ce critère, il s’agit du test MATS (Microbial Adhesion To Solvents). Il consiste à mesurer l’affection d’une souche bactérienne pour un hydrocarbure apolaire (le n-hexadécane le plus souvent) afin d’estimer l’hydrophobie de la paroi. Pour l’expérience, les souches de la collection ont été cultivées en milieu MRS liquide pendant 24h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules sont ensuite lavées deux fois en répétant successivement une étape de centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min, suivi d’une étape de resuspension des cellules dans un tampon Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4. La Densité Optique (DO à 630 nm (DO630nm initiale) a été déterminée au spectrophotomètre ELx808 (BioTek Instruments Inc., Vermont, Etats-Unis). Un volume de 1 mL de suspension a ensuite été mélangé avec 100 mL de n-hexadécane (Acros Organics, Geel, Belgique) en créant un vortex dans le mélange pendant 1 min. La solution a ensuite été mise au repos à température ambiante pendant 15 min puis 100 mL de la phase aqueuse ont été récupérés pour une nouvelle détermination de la DO à 630 nm (DO630nm finale). L’hydrophobie pariétale des souches a été calculée selon la formule suivante :
[Math. 1 ]
Avec %H : le pourcentage d’hydrophobie pariétale, DO630nm initiale : la DO initiale de la suspension et DO630nm finale : la DO mesurée après ajout et mélange de la suspension avec le n-hexadécane.
Les résultats des tests de résistance à l’acidité et d’hydrophobie pariétale sont représentés sur la Fig. 9 laquelle représente les pourcentages d’hydrophobie pariétale obtenus pour les souches testées en fonction de leur classe de tolérance à l’acidité. Sur la Fig. 9, on remarque que la souche VF50b ne supporte pas l’acidité ce qui n’est pas le cas de la souche VFH049.
Test d’auto-agrégation
Ce test permet d’évaluer la capacité des souches à s’agréger entre elles dans un milieu liquide. Il repose sur la comparaison de la concentration bactérienne au-dessus d’une suspension au temps 0 avec la concentration bactérienne de la même suspension incubée pendant un temps donné sans aucune agitation. Les souches capables d’une forte auto-agrégation vont s’agréger entre elles augmentant ainsi leur vitesse de sédimentation. Les souches sont cultivées en MRS pendant 24h à 37°C puis lavées et re suspendues dans un tampon PBS à une DO à 600 nm de 1 . Un volume de 4 mL de suspension est agité de manière à former un vortex pendant 10 sec puis incubé à température ambiante sans agitation. Après 2,5 et 5h d’incubation, 100 mL de milieu sont soigneusement prélevés à la surface de la suspension. Les échantillons prélevés sont ensuite dilués (1 /10) dans du tampon PBS pour une mesure de la DO à 600 nm. Le pourcentage d’auto-agrégation des souches (%A) est ensuite calculé selon la relation :
[Math. 2]
Avec A0 : l’absorbance à 600 nm initiale de la suspension, mesurée au début de l’expérience (et égale à 1 ) et At : l’absorbance à 600 nm mesurée à 2,5 ou 5h d’incubation. Le % d’agrégation de la souche VFH049 est de 5,38% ± 5,24 au bout de 2,5 heures et de 67,44% ± 6,99 au bout de 5 heures. Pour la souche VF50b, Le % d’agrégation est de 33,33% ± 14,8 au bout de 2,5 heures et de 66,67% ± 17,97 au bout de 5 heures. Les souches sont donc aptes à adhérer aux cellules intestinales.
Evaluation de la tolérance à la digestion gastro-intestinale
Afin d’évaluer la survie des souches pendant et après leur passage au sein du tube digestif, un modèle de digestion statique a été utilisé (Belguesmia et al. 2016). Ce modèle simule les 3 compartiments principaux du tube digestif à savoir la bouche, l’estomac et l’intestin de façon séquentielle. Chaque compartiment est simulé par l’ajout d’un fluide mimant les conditions physiologiques de cette étape. L’ensemble de la digestion est réalisé en condition stérile, tous les fluides sont autoclavés à 121 °C pendant 20 min avant l’expérience, l’ajout des enzymes a lieu après stérilisation et est suivi d’une filtration stérilisante (à 0,2 pm). Les souches sont cultivées dans un milieu MRS pendant 24h à 37°C. Les cellules bactériennes sont lavées deux fois puis re suspendues dans un tampon PBS à une concentration de 109 CFU/mL. Pour la digestion, la phase buccale est simulée par l’addition de 8 mL de PBS, ajusté à pH 6.8, à 1 mL de la suspension bactérienne. Le mélange est incubé sous une agitation constante à 200 rpm pendant 5 min à 37°C. La phase gastrique est simulée par l’ajout de 12 mL de PBS à pH 3 supplémenté de pepsine bovine (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à 1 ,56 mg/mL. La suspension est incubée 2h à 37°C en agitation à 200 rpm. Durant l’incubation, le pH de la solution est maintenu entre 3 et 3,5 par l’addition d’acide chlorhydrique (HCl) (1 M) ou d’hydroxyde de sodium (NaOH) (1 M). Pour la phase intestinale, 1 mL de carbonate de sodium (NaHCO3) à 1 M est ajouté au mélange afin de remonter le pH à environ 7 et inactiver la pepsine. Un volume de 12 mL de PBS à pH 8,2 supplémenté des enzymes pancréatiques bovines (Sigma- Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à 0,28 mg/mL, puis un volume de 6 mL de PBS à pH 8,1 contenant 60 g/L d’Ox-bile (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) sont ajoutés au mélange afin de simuler les conditions intestinales. Cette étape se déroule pendant 2h à 37°C en agitation à 200 rpm en maintenant le pH entre 7 et 7,5. A la fin de chaque étape de la digestion, un prélèvement de 100 mL du mélange réactionnel est réalisé, ainsi pour une même digestion, 4 échantillons sont obtenus comprenant le prélèvement du tube mère (TM), de la phase salivaire (S), de la phase gastrique après 2h d’incubation (G2), et enfin celui après 2h de phase intestinale (I2). Chaque prélèvement est ensuite dilué (1 /10) successivement dans un tampon PBS. Pour la détermination de la concentration bactérienne dans les échantillons, 100 mL des dilutions adéquates sont étalés sur une gélose MRS. Les plaques ensemencées sont ensuite incubées à 37°C pendant 48h en condition anaérobie. Après incubation, le dénombrement des CFU permet la détermination de la concentration bactérienne dans les échantillons. Les résultats sont exprimés en CFU/mL. Le nombre initial de cellules bactériennes viables est de 109 CFU/mL dans la phase salivaire. Au cours de la DGI, la quantité de bactéries diminue plus ou moins selon les souches, la phase gastrique étant la plus délétère pour toutes les souches. A la fin de cette phase, la souche VFH049 est présente en une quantité de 107 8 CFU/mL tandis que la souche VF50b est présente en une quantité égale à 107 2 CFU/mL. Les souches VFH049 et VF50b tolèrent donc la digestion gastro-intestinale.
Test de cytotoxicité
Ce test a pour objectif d’évaluer l’éventuelle toxicité des souches vis-à-vis de la barrière intestinale. Les cellules Caco-2 et HT-29 MTX sont utilisées dans ce but. Pour le test de cytotoxicité, les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits à une densité de 8.000 cellules par puits dans un volume de 150 mL de milieu et cultivées pendant 7 jours à 37°C, 5 % de C02. Avant l’ajout des souches bactériennes, les cellules intestinales sont lavées deux fois avec du tampon PBS. Les souches bactériennes quant à elles, sont cultivées comme décrit précédemment et suspendues dans le milieu DMEM sans ajout à une concentration de 107 CFU/mL. Pour chaque puits, 150 mL de suspension bactérienne sont ajoutés. Du tampon PBS, dilué avec du DMEM sans ajout tout comme pour les souches, est utilisé comme contrôle négatif. Le contact entre les souches bactériennes et les cellules intestinales a lieu pendant 24 h à 37°C, 5 % de C02. Les souches sont mises en contact à la fois avec les cellules Caco-2 et les cellules HT-29 MTX de façon indépendante. La détermination de la mortalité des cellules intestinales est utilisée ici pour évaluer l’éventuelle toxicité des souches bactériennes. La mortalité des cellules est évaluée par dosage de l’activité de la lactate dehydrogenase (LDH). Cette activité est dosée par le kit LDH activity assay (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). , ce kit est basé sur la réaction de réduction du Nicotinamide Adénine Dinucléotide oxydé (NAD) en sa forme réduite (NADH) par la lactate déhydrogénase, le NADH pouvant être détecté à 450 nm. Après contact, 50 mL de surnageant sont prélevés dans chaque puits et l’activité de la LDH est dosée en suivant le protocole du kit. L’absorbance de la plaque est lue à 450 nm par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La mortalité des cellules intestinales est calculée en pourcentage de la moyenne des absorbances de la condition contrôle (la proportion de LDH libérée dans cette condition est prise pour référence à 100 %). Pour les souches VFH049 et VF50b, les résultats montrent une absence de toxicité significative envers les deux lignées cellulaires, ce qui suggère que dans ces conditions d’expérience, les souches bactériennes sélectionnées ne sont pas délétères pour les cellules intestinales.
Evaluation de l’adhésion des souches aux cellules intestinales
L’objectif de ce test est d’évaluer la capacité des souches à adhérer aux cellules intestinales. Il est basé sur la comparaison entre la quantité de cellules bactériennes adhérentes à la monocouche de cellules Caco-2 par rapport à la quantité de bactéries initialement ajoutée. Les souches sont cultivées et préparées comme décrit précédemment, une suspension en milieu DMEM sans ajout est préparée à une concentration de 107 CFU/mL. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaques 24 puits à une concentration de 40.000 cellules par puits dans un volume de 500 mL de DMEM complet. Après incubation pendant 7 jours à 37°C, 5 % de C02, les cellules sont lavées deux fois avec un tampon PBS. Un volume de 300 mL de suspension bactérienne est ajouté dans chaque puits, la plaque est ensuite incubée à 37°C, 5 % de C02, pendant 2h. La suspension bactérienne utilisée est conservée pour détermination de la concentration en CFU. Après 2h de contact, les cellules Caco-2 sont lavées deux fois avec du tampon PBS afin de retirer les bactéries non adhérentes. Les cellules intestinales sont ensuite lysées par l’ajout de 100 mL de tampon PBS supplémenté avec du Triton X-100 à 0,1 % (v/v). Après incubation pendant 15 min à température ambiante, le lysat et la suspension mère utilisée sont dilués successivement (1 /10) en PBS, puis étalés sur une gélose MRS. Les plaques ensemencées sont incubées 48h à 37°C en condition anaérobie. Après dénombrement et détermination de la concentration bactérienne en CFU/mL, le pourcentage de cellules bactériennes adhérentes est calculé par rapport à la concentration obtenue dans la suspension mère représentant la quantité de bactéries ajoutée au début de l’expérience (fixée à 100 %). Le % de cellules adhérentes aux cellules Caco-2 est de 1 ,48 ±0,41 pour la souche VFH049 et de 0,18 ±0,13 pour la souche VF50b. La souche VFH049 est beaucoup plus adhérente aux cellules intestinales ce qui tend à indiquer qu’elle est davantage susceptible d’avoir une action probiotique.
Activités biologiques des souches sur l’absorption du calcium
Protocole général de contact entre les souches bactériennes et les cellules intestinales
Ce protocole de contact est utilisé pour chaque technique employée dans cette partie. Les souches bactériennes sont cultivées en MRS pendant 24h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules sont récupérées par centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min puis re suspendues dans un tampon PBS, cette étape est répétée une seconde fois pour laver les cellules bactériennes. Une suspension bactérienne est finalement préparée avec du milieu DMEM sans ajout à une concentration de 107 CFU/mL.
Les cellules HT-29 MTX sont ensemencées en plaque 24 puits à une concentration de 40.000 cellules par puits dans un volume de 500 mL de DMEM complet. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 96 puits à une concentration de 8.000 cellules par puits dans un volume de 200 mL de milieu DMEM complet. Pour une autre expérience, les cellules Caco-2 sont ensemencées sur inserts placés en plaque 12 puits (membrane en polyester, 0,4 pm, Costar®, Corning, New-York, Etats-Unis) côté apical dans un volume de 500 mL de milieu DMEM complet, un volume de 1 .500 mL de ce même milieu est ajouté du côté basal de l’insert. Toutes les cultures cellulaires sont cultivées pendant 15 jours avec un renouvellement du milieu tous les 2 jours lors de la deuxième semaine de culture. Les cellules intestinales sont lavées deux fois avec du tampon PBS avant le contact avec les souches bactériennes. Un volume de 150 mL de suspension bactérienne est ajouté dans chaque puits pour une culture en plaque 96 puitss, et volume de 300 mL est quant à lui ajouté pour un contact en plaque 24 puits ou en inserts sur plaque 12 puits. Dans tous les cas, le contact a lieu pendant 24 h à 37°C, 5 % de C02. Le contrôle négatif utilisé est un tampon PBS dilué dans du milieu DMEM complet.
Mesure du transport total du calcium
Le transport total du calcium est défini comme étant la part de calcium passant du pôle apical au pôle basal en traversant la barrière épithéliale. Ce transport est évalué par la variation de la concentration en calcium au pôle basal de la barrière cellulaire au cours du temps. Les cellules Caco-2 cultivées en inserts en plaque 12 puits sont utilisées pour cette expérience. Au début du contact avec les souches bactériennes (t = Oh), 10 mL d’une solution de chlorure de calcium (CaCL) à 250 mM sont ajoutés côté apical de l’insert. Durant le contact, des prélèvements de 100 mL sont réalisés du côté basal de l’insert à 30 min, 7 et 24h de contact. Les échantillons sont conservés à -20°C jusqu’à analyse. Au moment des différents prélèvements, une mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER) est réalisée pour vérifier l’intégrité de la barrière de cellules Caco-2. Cette résistance est mesurée par un voltmètre/ohmmètre MilliCell Electrical Résistance System (Merck Millipore, Burlington, Etats-Unis). Un insert vide sans cellules est utilisé comme blanc pour obtenir la résistance de la barrière cellulaire. La résistance (en W) mesurée pour chaque puit est ensuite multipliée par l’aire de l’insert (égale à 1 ,12 cm2 pour l’insert utilisé) pour donner une résistance en W.cm-2. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la valeur obtenue à 30 min de contact (fixée à 100 %) pour chaque puits. Afin de mesurer le transport total du calcium, un dosage de la concentration en calcium est réalisé dans les prélèvements réalisés au pôle basal de la membrane de cellules Caco-2 au cours du contact. La détermination de la concentration en calcium est réalisée en utilisant le kit calcium colorimétrie assay (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). Ce kit est basé sur la réaction colorimétrique entre les ions calcium et l’ortho-crésolphtaléine formant un complexe coloré pouvant être détecté à 575 nm. Le dosage est réalisé à partir de 25 mL d’échantillons dilués (1 /2) dans IΉ20 Milli-Q®, en suivant le protocole du kit. La mesure de l’absorbance des échantillons à 575 nm est réalisée par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La concentration en calcium dans les échantillons est déterminée au moyen d’une gamme étalon de CaCI2, elle est ensuite exprimée en fonction du ratio de la concentration à l’instant t sur la concentration au temps t = 30 min de contact.
Les résultats montrent que la TEER augmente au cours du temps d’incubation avec les souches ainsi que dans la condition contrôle (tampon PBS). Ainsi, pour la souche VFH049, la TEER passe de 100% à t=0 à 245% au bout de 24h de manière quasi linéaire. Pour la souche VF50b, la TEER passe de 100% à t=0 à 231 % au bout de 24h de manière quasi linéaire. Par ailleurs, on constate que les souches de l’invention ne permettent pas de moduler significativement l’absorption après 7h de contact par rapport au tampon PBS. Cependant, après 24h d’incubation, la concentration en calcium diminue dans le compartiment basal pour la condition contrôle, tandis qu’une augmentation significative de la quantité de calcium est observée pour les souches VFH049 et VF50b. Ainsi, pour la souche VFH049, le ratio concentration à t=2h / concentration à t=0 atteint la valeur de 1 ,08 tandis que pour la souche VF50b, le même ratio est de 1 ,05.
Etude de l’expression de différents gènes impliqués dans le métabolisme du calcium et de la vitamine D
Dans cette partie, les changements dans l’expression de plusieurs gènes après contact de 24h entre les souches bactériennes et les cellules FIT-29 MTX ont été étudiés. Le contact a eu lieu en plaque 24 puits comme décrit précédemment. Après contact, les cellules HT-29 MTX sont rincées deux fois avec du tampon PBS. L’extraction des ARN est ensuite réalisée par le réactif TRIzol™ (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). Les échantillons d’ARN ont d’abord été traités à la DNase pour éliminer les éventuels fragments d’ADN co-extrait et/ou restant suite à l’extraction. Un volume de 8 mL contenant 1 .000 ng d’ARN est mélangé avec 1 mL de DNase, et 1 mL de tampon DNase (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis). La réaction a lieu à 37°C pendant 30 min dans un thermocycler Mastercycler gradient (Eppendorf, Hambourg, Allemagne), elle est stoppée par l’ajout d’1 mL de solution d’EDTA à 50 mM (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis) suivi d’une incubation à 65°C pendant 10 min. Par la suite, les échantillons ont été rétro-transcrits en ADNc en utilisant le kit RevertAid H minus first strand cDNA synthesis (ThermoScientific, Waltham, Etats- Unis), selon les instructions fournies. Pour la réaction de qPCR, les échantillons d’ADNc sont dilués (1 /16) dans IΉ20. Pour un volume de 2 mL d’échantillon, 18 mL de mélange qPCR sont ajoutés contenant 10 mL de Power SYBR® Green PCR Master Mix (2x) (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, Etats-Unis), 0,6 mL de chaque amorce (10 mM) et 6,8 mL d’H20. La fluorescence est suivie pendant la réaction dans un thermocycler CFX Connect Real Time Détection System (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis). Après une étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min, 40 cycles de PCR sont réalisés successivement, un cycle comprend une dénaturation à 95°C pendant 15 sec, une hybridation de 58 à 61 °C en fonction du couple d’amorces utilisé pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 30 sec. La réalisation d’une courbe de fusion (melting curve) termine la réaction. Dans cette partie, 4 gènes sont étudiés, il s’agit d’un gène codant pour la Claudine 2 ( cld-2 ), impliquée dans les jonctions serrées et agissant comme un canal pour le passage du calcium. Le gène codant pour le récepteur à la vitamine D (vdr) et enfin le gène codant pour le transporteur du calcium ( trpv6 ). L’expression de ces gènes est normalisée par rapport à celle du gène codant pour la peptidylprolyl isomerase A ( ppiA ) pris pour référence. Les couples d’amorces utilisés pour les gènes étudiés, ainsi que leurs températures d’hybridation, sont présentés dans le tableau ci-dessous :
[Table 14]
Les résultats sont représentés sur la Fig. 10. L’expression du gène codant pour le récepteur à la vitamine D ( vdr ) est significativement augmentée en présence de la souche VF50b ; elle est augmentée de 1 ,8 fois par rapport au tampon PBS. S’agissant de la souche VFH049, elle entraîne une augmentation dans l’expression du gène codant pour le transporteur du calcium ( trpv6 ) d’au moins 3 fois supérieure au contrôle. La souche VF50b est la seule souche entraînant une augmentation d’expression de 2,8 fois supérieure du gène cld-2 par rapport au tampon PBS.
Capacité de fermentation de la souche VF50b
Les propriétés de croissance et d’acidification de la souche VF50b sont supérieures à celles d’autres souches de la même espèce, ce qui en fait une souche particulièrement intéressante pour la production artisanale ou industrielle de produits laitiers fermentés (utilisation comme starter de fermentation).
Le tableau 15 ci-dessous compare les propriétés de la souche VF50b à celles d’autres souches de la même espèce (tests réalisés avec du lait de vache) :
[Table 15]
On constate une croissance plus importante (densité optique supérieure) et une acidification plus efficace (pH inférieur).
La souche VF50b peut être utilisée pour la fabrication de yaourt, par exemple.
Il est à la portée de l’Homme du métier d’envisager l’étude des peptides inverses et des peptides dextrogyres correspondant aux séquences des peptides de l’invention afin de déterminer si ces peptides ont un effet sur l’ACE et/ou l’absorption du calcium.

Claims

Revendications
1 . Souche de Lactobacillus helveticus VF45A déposée à la CNCM sous le
numéro d’ordre CNCM-l-5300, ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VF45A et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C.
2. Souche selon la revendication 1 , pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo- carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
3. Peptide isolé choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 19 et capables d’inhiber l’enzyme de conversion de l’angiotensine et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
4. Mélange de peptides caractérisé en ce qu’il est choisi parmi les mélanges comprenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, les mélanges comprenant ou constitués desdits peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, les mélanges comprenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et d’au moins un peptide choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43, de préférence les mélanges contenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et des peptides de séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 20 à SEQ ID 43.
5. Peptide isolé selon la revendication 3 ou mélange de peptides selon la revendication 4, pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
6. Composition alimentaire ou pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif, au moins une souche selon la revendication 1 et/ou au moins un peptide selon la revendication 3 et/ou un mélange de peptides selon la revendication 4.
7. Composition alimentaire ou pharmaceutique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu’elle contient en tant qu’ingrédient actif ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon la revendication 1 , ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou en ce qu’elle contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits d’origine animale éventuellement stérilisés thermiquement, et/ou au moins partiellement écrémés, en particulier le lait de vache, de chèvre ou de brebis à l’exception du lait de yak pour ledit fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa , les mélanges d’au moins deux laits d’origine animale et les mélanges d’au moins un substrat protéique d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale.
8. Composition alimentaire ou pharmaceutique selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce qu’elle contient une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une desdites souches, notamment la souche Lactobacillus helveticus VF45A égale ou supérieure à 107 CFU par gramme de produit et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, supérieure ou égale à 18 mg par gramme.
9. Produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, en particulier de vache, de chèvre, de brebis, à l’exception du lait de yak, ou d’un mélange de laits, caractérisé en ce qu’il contient au moins une souche selon la revendication 1 et/ou au moins un peptide selon la revendication 3 et/ou au moins un mélange de peptides selon la revendication 4 et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon l’une des revendications 6 à 8.
10. Complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal choisi en particulier parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane caractérisé en ce qu’il comprend au moins une souche selon la revendication 1 et/ou au moins un peptide selon la revendication 3 et/ou au moins un mélange de peptides selon la revendication 4 et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon l’une des revendications 6 à 8.
1 1 . Souche de Lactobacillus helveticus VFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-l-5403 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VFH049 et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86 et/ou capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium par les cellules intestinales.
12. Souche selon la revendication 1 1 pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou pour le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium chez un sujet notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
13. Peptide isolé choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 74 et capables d’inhiber l’enzyme de conversion de l’angiotensine et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 75 à SEQ ID NO 86 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
14. Mélange de peptides choisi parmi les mélanges des peptides contenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID 44 à SEQ ID 86, les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58, les mélanges constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et d’au moins un des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86 les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et des peptides de séquence SEQ ID 75 à SEQ ID 86 et les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86.
15. Peptide isolé selon la revendication 13 ou mélange de peptides selon la revendication 14, pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou pour le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
16. Composition alimentaire ou pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif, au moins une souche selon la revendication 1 1 et/ou au moins un peptide selon la revendication 13 et/ou au moins un mélange de peptides selon la revendication 14.
17. Composition pharmaceutique ou alimentaire selon la revendication 16, caractérisée en ce qu’elle contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon la revendication 1 1 , ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou en ce qu’elle contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque dont l’amande, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits d’origine animale éventuellement stérilisés thermiquement et/ou au moins partiellement écrémés, notamment le lait de vache, de chèvre ou de brebis à l’exception du lait de jument pour le fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d’au moins deux laits et les mélanges d’au moins un substrat d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale.
18. Composition alimentaire ou pharmaceutique selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce qu’elle contient une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une desdites souches, notamment la souche Lactobacillus helveticus VFH049 égale ou supérieure à 107 CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86, supérieure ou égale à 6 mg par gramme.
19. Produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, notamment de vache, de chèvre, de brebis à l’exception du lait de jument, ou d’un mélange de laits, caractérisé en ce qu’il contient au moins une souche selon la revendication 1 1 et/ou au moins un peptide selon la revendication 13 et/ou au moins un mélange de peptides selon la revendication 14 et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon l’une des revendications 16 à 18.
20. Complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal choisi en particulier parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane caractérisé en ce qu’il comprend au moins une souche selon la revendication 1 1 et/ou au moins un peptide selon la revendication 13 et/ou au moins un mélange de peptides selon la revendication 14 et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon l’une des revendications 16 à 18.
21 . Souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-l-5316 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VF50b et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et/ou capable d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
22. Souche selon la revendication 21 pour son utilisation en tant que médicament notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou pour le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
23. Peptide isolé choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 161 et capables d’inhiber l’enzyme de conversion de l’angiotensine et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 162 à SEQ ID NO 199 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
24. Mélange de peptides choisi parmi les mélanges contenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID 199, les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 87 à SEQ ID 1 12, les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 87 à SEQ ID 1 12 et d’au moins un des peptides de séquence SEQ ID NO 162 à SEQ ID NO 199 et les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 162 à SEQ ID NO 199.
25. Peptide isolé selon la revendication 23 ou mélange de peptides selon la revendication 24 pour son utilisation en tant que médicament notamment en tant que médicament, dans le traitement de l’hypocalcémie ou d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou pour le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère, en particulier un humain ayant un tel besoin.
26. Composition alimentaire ou pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif, au moins un peptide selon la revendication 23 et/ou un mélange de peptides selon la revendication 24 et/ou une souche selon la revendication 21 .
27. Composition alimentaire ou pharmaceutique selon la revendication 26, caractérisée en ce qu’elle comprend ou est constituée par le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon la revendication 21 , ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou en ce qu’elle contient ou est constitué du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits éventuellement stérilisés thermiquement et/ou au moins partiellement écrémés, notamment le lait de vache, de chèvre ou de brebis, à l’exception du lait de yak pour ledit fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d’au moins deux laits et les mélanges d’au moins un substrat protéique d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale.
28. Composition alimentaire ou pharmaceutique selon la revendication 26 ou 27, caractérisée en ce qu’elle contient une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une desdites souches, notamment la souche Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus VF50b égale ou supérieure à 107 CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 199, supérieure ou égale à 4 mg par gramme.
29. Produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, notamment de vache, de chèvre, de brebis à l’exception du lait de yack, ou d’un mélange de laits, caractérisé en ce qu’il contient au moins une souche selon la revendication 21 et/ou au moins un peptide selon la revendication 23 et/ou au moins un mélange de peptides selon la revendication 24 et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon l’une des revendications 26 à 28.
30. Complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un
animal choisi en particulier parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane caractérisé en ce qu’il comprend au moins une souche selon la revendication 21 et/ou au moins un peptide selon la revendication 23 et/ou au moins un mélange de peptides selon la revendication 24 et/ou une composition alimentaire ou
pharmaceutique selon l’une des revendications 26 à 28.
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